MİKROSKOPLAR

Doç. Dr. İlknur KESKİN

Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Yunanca’da “mikrós” “küçük”,
“skopeîn” ise “bakmak, görmek”
demektir. Mikroskop çıplak gözle
görülemeyecek kadar küçük olan
cisimleri gözlemede kullanılan bir
alettir.
Niçin Mikroskop Kullanıyoruz?

Cevap: MERAK !
İnsanoğlu her zaman daha fazla detay görmeyi arzular
 Mikroskoplar değişik teknik özellikler göstermelerine rağmen sonuçta
amaçları aynı olup incelenecek objeye ait görüntünün gözün retinasına, bir
fotoğraf plağına veya bir ekrana iletilmesi esasına dayanır.
 Mikroskoplar kullanılan ışık kaynağına göre iki başlık altında
sınıflandırılabilir:
1.Kullanılan ışık gözle görülebilen mikroskoplar
b)Işık mikroskobu
c)Polarizasyon mikroskobu
d)Faz kontrast mikroskobu
e)Karanlık saha mikroskobu
6.Işık kaynağı gözle görülemeyen elektromanyatik dalga ya da
elektron olan mikroskoplar
g)Fluoresan mikroskobu
h)Ultraviole mikroskobu
i)Elektron mikroskobu
 IŞIK MİKROSKOBU

TARİHÇESİ VE
GELİŞİMİ
 İlk basit mikroskop; Hollandalı Hans ve oğlu
Zacharias Janssen tarafından 1590’lerde yapıldı.
Mikroskop isminin ilk defa Giovanni Faber (botanikçi)
tarafından 1625’te kullanıldığı düşünülmektedir. Faber bu
ismi Galileo Galilei’nin kullandığı ve Galileo’nun
“occhiolino” yani “gözcük” dediği alet için kullanmıştır.
Antony van Leeuwenhoek (1632–1723)

animalculus 1674’de
Leeuwenhook,
“animalculus” olarak
isimlendirdiği
mikroskopla ilk defa
biyolojik materyalleri
(protozoon, bakteri,
bitkiler ve böcekler)
inceleniyor.
 Robert Hooke (1635–1703)

Robert Hooke geliştirdiği bileşik mikroskobuyla

biyolojik varlıkları incelemiş ve gözlemlerini
“Mikrographia” adlı kitabında toplamıştır. Hooke
şişe mantarının küçük boşluklardan oluştuğunu
görmüş ve ilk kez “cellula-hücre” sözcüğünü
kullanmıştır.
Nuremberg, John
Cuff (1750)
J.Paul
Robinson
19. yy sonu ve 20. yy.da mikroskoplar
Mikroskobun gelişimi:
1831 Robert Brown bitki hücrelerinde çekirdek (Nukleus) tanımını yapıyor.
1838-39 ilk hücre tanımı ortaya atılıyor (Schwann). Çekirdek ve sitoplazmaya; protoplazma
adı veriliyor.
1861 hayvan hücresi inceleniyor. İlk canlı hücre Zernik tarafından faz kontrast
mikroskobunda inceleniyor.
1933 ilk elektron mikroskobu yapıldı.
1938’de EM yardımı ile ince ayrıntılara girildi. EM ile gözlenen yapılara ince yapı (fine
structure ya da ultrastructure) terimi kullanılmaya başlandı.
 Işık Mikroskobu
• İnsanın gözü 0.2 mm civarında iki
noktayı ayırt edebilir.
• Işık mikroskobu ile 100 -1276 defa
yapıyı büyütebiliriz.
• Bu da 0.2 µm kadar birbirine yakın iki
noktayı ayırt etmek demektir.
• Ancak 100 defa büyütmeden sonra
immersiyon yağı kullanmak gerekir.
Aksi taktirde ışık kırılmaları
önlenemez ve görüntü elde edilemez.
 Işık Mikroskobu

➢ Mekanik bölüm
• Mikroskop ayağı ➢ Optik bölüm
• Mikroskobun kolu / gövdesi • Işık kaynağı
• Preparat tablası • Kondansör–Diyafram
• Makro ve mikro vidalar • Objektifler
• Objektiflerin takıldığı tabla / revolver • Oküler
• Objektiflerin takıldığı tüp
Işık kaynağı

●Gün ışığı
(Aynalı)

●Düşük voltajlı
elektrik lambaları
(halojen)
Aynalı Lambal
ı
Stereo mikroskop
Preparat tablası
 Oküler
Fonksiyonu:
● Objektif ile koordineli çalışır. Objektif
tarafından oluşturulan ara görüntüyü kendi
büyütme oranı kadar büyüterek göze ulaştırır.

● Genellikle okülerlerde büyütme oranı 10X’dır.

● Büyütme oranını arttırmak için oküler
büyütmesini arttırmak önerilmez.
● Genel kural olarak küçük büyütmeli objektiflerle
büyük büyütmeli oküler, büyük büyütmeli
objektifle küçük büyütmeli oküler kullanılır.
Oküler üzerinde büyütme gücünü (X6.3, 10, 15, 20, 30), görüş çapını
belirleyen rakamlar (18, 20, 22, 26.5) ile bazı tanımlayıcı harfler (UW, SWF)
bulunur.
SW ya da SWF “Super Wide-Field” super geniş alanı gösterir. H, HE ya da
“High Eyepoint” okülerin gözlükle kullanılabileceğini gösterir.
Genel olarak okülerlerden birinde diyoptri ayarı yapmaya olanak sağlayan
bir mekanizmada eşlik eder. Okülerlerden gözün uzaklığını belirleyen ve
oda ışığının yansımasını engelleyecek bir lastik çerçeve bulunur.
Tüp
 Mechanica
tl ube length
= 160 mm
Object to
Image
Distance
= 195 mm

Focal length
of objective
= 45 mm
Monoküler mikroskoplar

Aynalı Lambal
ı
Binoküler mikroskop
Trinoküler mikroskop
Objektif tablası

REVOLVER
4-6 objektif takılabilir.
Objektifler

Objeden gelen ışık

demetlerini toplamak ve
büyümüş gerçek görüntü
oluşturmaktır.
Objektifler
Mikroskobun optik kalitesini
belirleyen en önemli parçalarıdır.
Mikroskopta ilk büyütmeyi yapan
optik kısımdır.
Çok sayıda merceğin uygun
düzende biraraya getirilmesi ile
oluşur.
mikrofotografi için en ideal
objektifler plan apokromatlardır
 Tablaya takılan
Yapımcısı uç

Alan Renk
düzeltmesi düzeltmesi

Büyütme gücü Sayısal açıklık

Optik İmmersiyon ortamı

özelliği
Çalışma aralığı
Tüp uzunluğu
Büyütme renk kodu
Lamel kalınlığı
Retraksiyon
stoperi
● Büyütme gücü:
Obje / Görüntü oranı
1:1 , 1:5 , 1:10 , 1:20 , 1:40 , 1:100
5X , 10X , 20X , 40X , 100X

● Numerik apartür (Sayısal açıklık)

Belli bir mesafede sabit duran bir objektifin ışığı
olabildiğince çok içeri alabilme ve en iyi
çözünürlüğü gösterebilme kabiliyeti
Sayısal açıklık (NA)

NA= (n) sin(µ)

n:Lamelle objektif arasındaki

ortamın kırılma indeksi
r µ: Merceğin optik ekseni ile
merceğe giren en dış ışık
ışını arasındaki açı

nhava: 1.00
nsu: 1.30
nimmersiyon yağı: 1.50

NA değeri ne kadar büyükse ayırdetme gücü o kadar artar.

 Resolving Power
[ÇÖZÜNÜRLÜK]
Birbirine çok yakın, iki cisim arasında, görülebilir
olan minimum uzaklık değeri
Bir objektifin içindeki iki cismin birbirine ne kadar
yakın olduğunda iki ayrı yapı olarak görebilme
özelliğidir.
• İnsan gözü 0.2mm (25 cm’de)
• Bu noktadan sonra ancak örnek boyu artarsa detay
çözülebilir. Bu da optik cihazlarla mümkündür
(büyüteç, ışık mikroskop, elek. mikroskop vb.).
5 µm
Çözünürlük
 ÇÖZÜNÜRLÜK (REZOLÜSYON)

NA değeri ne kadar
büyükse,
ayırdetme gücü
(REZOLÜSYON)
o kadar artar.
Bir Mikroskobun
Büyütme Değeri
Objektif büyütmesi X Oküler büyütmesi
40 X 10 = 400

Fotomikrograflarda:
Obj. X Oküler X Ara faktör = Total Magnification

40 X 10 X 1.25 = 500
 Kondansör
● Fonksiyonu:
● Işığı obje üzerinde odaklamak
ve yoğunlaştırmaktır.
● Böylece ışığın dağılarak
görüntüyü bozması önlenir ve
rezolüsyon artar.
● Sıcak lambayı optik
bölümlerden ve kullanıcıdan
uzak tutar.
 Diyafram
• Işık kaynağından gelen ışık
demetinin çapını kontrol etmek
için kullanılır.
• Işık kaynağının üstünde ya da
kondansörün altında yerleşiktir.
• Işığın şiddetini azaltmak için
değil, en iyi kontrast ve
rezolüsyon elde edilecek ışık
çapını ayarlamak için kullanılır.
İnvert (inverted/ters)mikroskop

Canlı dokuların ve
parazitlerin
incelenmesi gibi
çalışmalarda
kullanılır
 Upright Scope

Epi-
illumination
Source

Image from Nikon

promotional materials
Brightfield
Source
 Inverted Microscope

Brightfield
Source

Image from Nikon

Epi-
promotional materials
illumination
Source
 Karanlık alan
mikroskobu
● Dark-field (D) özellik
normal aydınlık alan
mikroskop kondanserine
eklenmiş bir halka ile
yapılır.
● Işığı kıran kısımlar siyah
bir zeminde parlak cisimler
olarak görülür.
● Beraber faz kontrast da
eklenebilir.
 Bu durum karanlık bir odada yandan kuvvetle gelen ışıkta aydınlıkta
görülemeyen toz taneciklerinin görünür olmasına benzer. Doku kültürlerinde
canlı hücreler, çekirdekcik, çekirdek zarı mitekondri ve lipid damlacıkları
parlak zemini oluşturan sitoplazma ise karanlık olarak görülür.
Örnek parlak gözükür ancak derin detay alınamaz

Preparatın temiz toz’suz olması esastır

çünkü toz parlar
 Faz Kontrast (PH) Mikroskop
• 1950’lerde
geliştirildi.
• Canlı incelemelerde
kullanılır.
• Boyasız
preparatlarda
yalancı 3D
görüntüler sağlanır.
• Daha ilerisi Hoffman
ve DIC (diferensial
interferans
kontrast)
objektiflerdir.
• Kondanser (PH) ve
objektif buna uygun
olmalıdır.
• Yaygın kullanılır.
Dr. Frits Zernike, 1953
Nobel ödülü
Faz kontrast mik.
Işık transparan bir
cisme çarptığında
kırılan ışınlar ve
direkt ışınlar
ortaya çıkar.

FAZ kontrast
mikroskop bunu
amplifiye eder
DIC. MİK.

FAZ MİK.
Time-lapse (zaman aralıklı görüntüleme) cell-
observing system
 Polarizasyon mikroskobu
● Daha çok
mineralojide
(kristal yapıları
incelemede)
kullanılır.
● Biyolojide ışığı çift
kıran (bifraction)
bazı yapılar
(kollajen, kemik
lamelleri) gibi
incelenir.
● Bir polarizer ve
analizer eklenmiş
özel bir ışık
mikroskobudur.
● Çok yaygın değildir.
Fluoresan
mikroskop
● Işık kaynağı olarak daha parlak-
kuvvetli beyaz ışık veren civa
buharlı veya xenon lambalar
kullanılır.
● Bir uyarma (exitasyon) ve bir
yayma (emisyon) filtresi ve
dikroik ayna eklenmiş özel bir
mikroskoptur.
● Yaygın kullanılır.
Bazı maddeler kısa dalga boyundaki ışığı absorblayarak uzun
dalga boyunda ışığa çevirir. Bu olaya fluoresan adı verilir.
Böylece fluoresan veren yapılar görülür. Doğal fluoresan
maddeler A, B12, Ca++ dur. Doğal fluoresan bu maddelerin
kendi özelliğidir.
Yapay fluoresanda, taze ya da tespit edilmiş dokuya fluoresan
yapabilen maddeler çöktürülür. Fluoresan boyaların oturduğu
bölgeler, bu boyaların fluoresan özelliği ile görülür.

En çok kullanılan boya

akridin orange'dır.
Fluoresan maddeye
göre sarı, yeşil ve mavi
renkler izlenebilir.
 Epitel kültürü 3’lü boyama: nucleus (blue-
floressein), microtubules (green-DAPI), and actin
(red-rodamin).
Aktin için rodamin bağlı phalloidin
DNA için sytox-green
Konfokal
Mikroskop
● Işık kaynağı olarak
lazer kullanılır
(helyum, neor, argon).
● Bunlar belli dalga
boyunda kuvvetli ışık
verirler.
● Kalın kesitlerde ince
optik-fokal kesit
görüntüleri alınabilir.
● Bilgisayar destekli 3D
animasyon görüntüler
sağlanabilir.
Scanning Electron Microscope
(SEM)
Transmission Electron Microscope
(TEM)
TEM
 “ATOMIC FORCE” MİKROSKOP
• AFM yüzey topografisini angtrom seviyesinden 100 microna kadar
ölçebilen bir metoddur. Çok duyarlı yüzeyi taramasıyla Atomik
seviyedeki kuvvetleri (nN)ölçebilir.
• En büyük avantajı örneğin iletken olmasını gerektirmemesidir. Bu
yüzden biyolojik örneklerin incelenmesinde rahatça kullnılabilir.
Yüzey işleme ve malzeme problemlerinin çözülmesinde geniş
kullanım bulmaktadır.
• Elektron mikroskoplarının aksine hava ve sıvı içinde örneklere
bakabilir.

kollajen
seeing is believing !