SPEKTROFOTOMETR II

Cel ćwiczenia: Wyznaczenie zależności absorbancji wodnych roztworów rodaminy od ich stężenia oraz
sprawdzenie słuszności prawa Lamberta-Beera.

Materiały i sprzęt: Spektrofotometr, roztwór fluoresceiny.

Zagadnienia: Formy energii wewnętrznej cząsteczek. Powstawanie widm absorpcyjnych,
prawdopodobieństwo absorpcji, reguły wyboru. Pojęcia absorbancja (A) i transmitancja i związek
między nimi. Prawo Lamberta – Beera, odstępstwa od tego prawa. Współczynnik ekstyncji – jednostki
i typowe wartości. Diagram stanów elektronowych Jabłońskiego (stany singletowe i trypletowe,
przekazywanie energii). Fluorescencja, widma emisji fluorescencji, zaniki fluorescencji, wydajność
kwantowa i czas życia. Przesunięcie Stokesa. Podstawowe jednostki energii w spektroskopii.
Przebieg ćwiczenia:
1. Zapoznać się ze schematem spektrofotometru. Włączyć spektrofotometr i poczekać około
15min na rozgrzanie urządzenia. Przygotować dwie puste kuwetki.

Spektrofotometr UV-Vis SEMCO S91E

Pokrętło zmiany
Cela pomiarowa długości fali

1
2. Z 0,1 mg/mL (co daje stężenie molowe rodaminy Cm=2,0910-4 mol/L [M]) roztworu rodaminy
sporządzić niżej przedstawione rozcieńczenia:

Kolejność w Objętość Objętość wody do Otrzymane

jakiej roztwory Numer roztworu rozcieńczania stężenie
powinny być roztworu rodaminy [mL] rodaminy
mierzone [mL] [M]
9 1 4 1 1,610-4
8 2 3 2 1,210-4
7 3 2 3 8,010-5
6 4 1 4 4,010-5
5 5 0,8 4,2 3,210-5
4 6 0,6 4,4 2,410-5
3 7 0,4 4,6 1,610-5
2 8 0,2 4,8 8,010-6
1 9 0,1 4,9 4,010-6

2. Do pierwszej kuwety wlać pierwszy roztwór rodaminy (o najniższym stężeniu). Do drugiej

kuwetki (referencyjnej) nalać wody destylowanej do 3/4 jej wysokości.
3. Pomiary dla każdego roztworu przeprowadzamy w zakresie długości fal λ = 450–625 nm, co
10 nm, w celu uzyskania widma absorpcji dla roztworów o danym stężeniu. Do ustawienia
żądanej długości fali służy pokrętło znajdujące się na przedniej ścianie aparatu
4. Nastawić minimalną długość fali (450 nm) dla której wykonywane będą pomiary. Po ustawieniu
odpowiedniej długości fali, kuwetę z wodą należy umieścić w celi pomiarowej. Na rysunku
zaznaczono drogę optyczną wiązki światła (biała strzałka).

5. Po zamknięciu celi pomiarowej należy wcisną przycisk ENT, a następnie szybko ZERO na
przednim panelu. Na wyświetlaczu „WYNIK” pojawią się cztery małe kółeczka, a w okienku
KOMUNIKATY pojawi się napis Autokalibracja.

2
 6. Urządzenie jest gotowe do pracy gdy w okienku WYNIK pojawią się cztery zera, a w okienku
KOMUNIKATY pojawi się napis ABS.
7. Wprowadzić w bieg promieni światła kuwetę z roztworem badanym (o najmniejszym stężeniu)
i odczytać wartość absorpcji. Sprawdzić wskazania spektrofotometru przy zadanej długości fali
λ w zakresie od 450 nm do 625 nm. Dane umieścić w Tabeli 1.
8. Narysować na papierze milimetrowym zależność absorbancji (A) od długości fali (λ) przy której
dokonano pomiaru (widmo absorpcji) przy której prowadzono pomiar. Na podstawie wykresu
określić analityczną długość fali λmax dla rodaminy, przy której zarejestrowano najwyższą
wartość absorpcji.

Tabela 1. Wartość absorbancji dla roztworu rodaminy w zależności od długości fali.

[nm] 450 455 460 465 470 475 480 485 490 495 500 505
Absorbancja
[nm] 510 515 520 525 530 535 540 545 550 555 560 565
Absorbancja
[nm] 570 575 580 585 590 595 600 605 610 615 620 625
Absorbancja

9. Następnie dokonać pomiarów absorbancji przy max dla roztworu rodaminy w różnych
stężeniach molowych. Zmierzyć absorbancję roztworu o nieznanym stężeniu przy tej samej
długości fali. Wyniki zestawić w Tabeli 2.
10. Dla otrzymanych wartości absorbancji w zależności od stężenia roztworu znajdujemy, z
wykorzystaniem programu komputerowego, zależność liniową (równanie prostej,
współczynnik nachylenia prostej i współczynnik korelacji). Bierzemy pod uwagę tylko te
punkty z zakresu niskich stężeń spełniające prawo Lamberta-Beera (punkty tworzące prostą).
11. Korzystając z wyliczonego współczynnika nachylenia prostej oraz równania A =  L Cm , gdzie
L = 1 cm (długość drogi optycznej w cm) wyznaczamy molowy współczynnik absorpcji ε dla
rodaminy, a następnie określamy stężenie roztworu w kuwecie oznaczonej X na podstawie
otrzymanego równania prostej.
Wyliczenie molowego współczynnika absorpcji dla roztworu rodaminy

3
Otrzymane równanie: y = ..................................

Wartość molowego współczynnika absorpcji  [M-1cm-1]: …………………………

Wartość współczynnika korelacji R2 = .....................................
Obliczona wartość stężenia nieznanego – Cx: …………………………………..
12. Na podstawie uzyskanych wyników wyciągnij wnioski pod kątem dopasowania funkcji linowej
do punktów pomiarowych. Wiedząc, że wartość współczynnika molowego absorpcji podana w
literaturze dla rodaminy w rozpuszczalnikach polarnych wynosi 106000 cm-1M-1 przeprowadź
analizę porównawczą z uzyskanym w doświadczeniu wynikiem. Zaproponuj przyczynę
uzyskania innej wartości niż literaturowa.