VIỆN KHOA HỌC V CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

Tài liệu hướng dẫn thực tập

CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN

( Dùng cho học viên cao học)

Phụ trách thực tập:

CN. Đỗ Thị Tuyến

ThS. Diệp Quỳnh Như
ThS.Nguyễn thị Như Quỳnh

Tp.HCM, 03/2010
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

1. MỤC ĐÍCH - YÊU CẦU

Nội dung bài thực tập này giúp sinh viên hiểu được:
o Phương pháp trích ly và thu nhận enzyme bromelin từ thực vật
o Phương pháp tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel
o Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease và xác định một số thông số tối ưu
cho hoạt động của enzyme protease.
o Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Lowry, từ đó xác định được hoạt tính
riêng của enzyme.

2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

[1] Thu nhận bromelin từ dứa: Trích ly, tủa enzyme và sấy phun thu nhận
bromelin ở dạng bột
[2] Tinh sach Enzyme bromelin bằng sắc ký lọc gel
[3] Xác định hoạt tính thủy phân cơ chất casein của enzyme protease theo hãng
Amano, pH 7,0.
[4] Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease
[5] Xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease
[6] Xác định hàm lượng protein theo Lowry, từ đó xác định hoạt tính riêng của
enzyme protease.
3. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
- Xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
- Xác định được hoạt tính bromelin/gam nguyên liệu & hoạt tính riêng của enzyme
bromelin.
- Hiệu suất tinh sạch bromelin sau sắc ky
KỸ THUẬT TRÍCH LY THU NHẬN ENZYME BROMELIN
TỪ DỨA ( Ananas conosus L)

NGUYÊN LIỆU: ngọn (đỉnh sinh trưởng), vỏ quả, thịt và lõi dứa
Quy trình trích ly và thu nhận bromelin dạng thô
Nguyên liệu được xay nhỏ, trích trong nước cất tỷ lệ 1:3 (w/w) , riêng đối với thịt quả
dứa được ép lấy nước lọc qua vải màn thu dịch E thô, bỏ cặn ly tâm 2000rpm
trong 5 phút- thu dịch lọc. Dịch lọc được tủa cồn 96% tỷ lệ 3V cồn:1 V dịch lọc
hoặc tủa bằng (NH4)2SO4 70% bão hòa ( dịch E và dung môi tủa phải được để lạnh
trước khi trộn và để tủa), thời gian để tủa khoảng 45 phút. Khi quan sát thấy cặn tủa-
 ly tâm 5000 rpm, 10 phút ở 50C. Thu cặn tủa- Sấy phun thu Bromelin dạng bột thô
KỸ THUẬT SẤY PHUN

Trang 2
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

Sấy phun là kỹ thuật làm chuyển từ một dung dịch, huyền phù hay nhủ hoá thành dạng
bột. Nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: thự phẩm, dược, hoá
học, vật liệu và công nghệ nano.
1. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Quá trình sấy phun trải qua 4 bước cơ bản sau:

o Mẫu dạng lỏng được phân phối thành dạng phun sương
o Các hạt phun sương tiếp xúc với khí nóng
o Làm khô các hạt phun sương
o Tách sản phẩm (ở dạng bột) khỏi luồng khí

Hình 1: Sơ đồ cơ bản của một hệ thống sấy phun

Mẫu được bơm từ một bình chứa mẫu qua 1 vòi phun – spray nozzle (2) bằng
bơm lưu chất – fluid pump (1). Không khí từ máy nén khí được kiểm soát bởi một vale
kim – needle vale (3) và chuyển qua vòi phun, hoà trộn với mẫu ở đầu vòi phun. Sau đó,
quá trình sấy mẫu diễn ra trong buồng sấy – drying chamber (7). Lúc này, mẫu được
chuyển thành dạng các hạt chất lỏng với đường kính 20 um và có diện tích bề mặt lên
đến 3.000 cm2/ ml.
Không khí được hút vào thiết bị bằng máy hút – aspirator (10) và được làm nóng
đến nhiệt độ đã chọn (nhiệt độ set) bằng bộ gia nhiệt – heater (5). Luồng khí nóng này
được hút vào buồng sấy mẫu và tiếp xúc với các hạt mẫu, làm khô nó ngay lập tức. Do
diện tích bề mặt của mẫu quá lớn, hơn 90% hơi nước được làm bay hơi bằng luồng
khí nóng liên tục trong buồng sấy.

Trang 3
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

Hình 3: đầu phun của máy sấy phun

Mẫu đã được làm khô, ở dạng bột mịn, tiếp tục được làm khô và chuyển qua một
ống xoáy đặc biệt – cyclone (8), tất cả hơi nước được tách ra ở đó và được thu hồi vào
bình chứa sản phẩm – product vessel (9). Quá trình làm khô này thường mất khoảng 0,5
giây hoặc ít hơn. Vì các hạt mẫu luôn được bao quanh bởi hơi nước, nên nhiệt độ xung
quanh các hạt nhỏ này sẽ không thể tăng cao hơn nhiệt độ của hơi nước.
Các mẫu nhạy với nhiệt, chẳng hạn enzyme, có thể được chuyển thành dạng bột
mà chỉ mất một phần rất nhỏ hoạt tính, với một nhiệt độ tương đối cao (800C).
Hỗn hợp hơi nước và không khí sẽ được hút ra ngoài qua máy hút.
Chế độ nhiệt của quá trình vận hành sẽ được hiển thị trên khung điều khiển
bằng cách kiểm soát nhiệt độ đầu vào – inlet và đầu ra – outlet, thông qua các sensor.
Nếu mẫu dính vào đầu vòi phun, khí nén sẽ thổi vào đầu phun ở bộ phận phân
phối – distributor (6) bằng cách mở và điện từ – electromagnetic vale (4) để loại bỏ
mảng dính đó. Nếu cần thiết, không khí có thể được cho vào buồng sấy bằng cách tháo
nắp – cap (11) ở bean hông ra.
2. CÁC BƯỚC VẬN HÀNH
1. Bật nút ON (CP) ở phía sau của máy
2. Bật công tắc ON (1)
3. Bật công tắc máy hút (2)
4. Điều chỉnh luồng khí vào buồng sấy mẫu bằng cách chỉnh núm số máy hút (3)
Điều chỉnh nhiệt độ
5. Chọn chế độ kiểm soát INLET hoặc OUTLET (5). Nhiệt độ inlet tối đa là 230 0C.
Nhiệt độ outlet tối đa là 1400C.
6. Chỉnh đèn set nhiệt độ (SV) (16) bằng cách ấn nut PV/SV (21).
7. Set giá trị nhiệt độ cần thiết bằng nút Up (23) hoặc Down (20). Khi đạt được giá trị
cần set, ấn nút Enter (22). Bật ON của công tắc gia nhiệt (4).
8. Xem nhiệt độ hiện thời bằng nút PV/SV (21).
9. Khi đèn kiểm soát nhiệt (18) nhấp nháy và sự dao động nhiệt chậm lại chính là lúc
nhiệt độ hiện tại PV đã được thiết lập.
10. Trong quá trình vận hành, muốn tăng nhiệt độ thì nhấn nút PV/SV (21), rồi tiếp tục
theo các bước 6, 7 và 8 như trên.
11. Nếu nhiệt độ outlet hiển thị (7) vượt quá nhiệt độ cần thiết (nhiệt độ set),
thì mở vale kim (14) để chỉnh áp suất vào vòi sấy.

Trang 4
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

12. Bật ON công tắc bơm (10) và (11). Sau đó, chuyển một lượng thích hợp dịch vào
sấy. Nếu mẫu dùng nước làm dung môi, thì nên dùng nước tinh khiết (nước cất hay
nước khử ion).
13. Khi nhiệt độ outlet đạt giá trị cần thiết, điều chỉnh tốc độ dòng khí, lượng mẫu và
áp suất khí nén tương ứng sao cho phù hợp với các điều kiện yêu cầu.
Chú ý:
• Nếu nhiệt độ inlet vẫn không thay đổi, thì theo các yếu tố ảnh hưởng đến
nhiệt độ outlet như sau:
• Tốc độ dòng chất lỏng mẫu cao Nhiệt độ outlet thấp
• Tốc độ dòng khí sấy cao Nhiệt độ outlet cao
• Độ đặc (yếu tố nội tại) cao Nhiệt độ outlet cao
• Nếu áp suất khí nén tăng, thì mẫu sẽ được sấy thành các hạt mịn hơn.
14. Khi các yếu tố biến động trên đã được set đến giá trị cần thiết (đã ổn định),
thay nước cất bằng mẫu cần sấy. Lúc này nhiệt độ outlet có thể dao động nhẹ.
Nếu cần, điều chỉnh tốc độ bưm mẫu và các yếu tố liên quan.
15. Khi lượng bột cần thiết đã được thu hồi trong bình sản phẩm, dừng cho mẫu vào
và thay bằng nước cất trở lại. Lúc này, giảm nhẹ tốc độ bơm.
16. Tắt gia nhiệt (4).
17. Khi nhiệt độ inlet hạ xấp xỉ 1000C, tắt bơm (10) và (11). Đóng vale kim để
ngừng phun.
18. Chỉnh nút của máy hút (3) về 0 một cach từ từ và tắt máy hút (2).
19. Tắt công tắt của máy chính (1).
20. Tháo bình sản phẩm ra. Đôi khi mẫu đã được sấy dính vào ống cyclone, vì
vậy, cần lấy ra cẩn thận.
21. Tắt CP, khoá máy nén khí và rút day khỏi nguồn điện.
3. PHƯƠNG PHÁP VỆ SINH VÀ BẢO TRÌ MÁY
1. Tháo các bộ phận của buồng sấy mẫu và ống cyclone (đều làm bằng thuỷ tinh) cẩn
thận và rửa dưới vòi nước máy.
2. Rửa tất cả các khu vực mà bột mẫu có thể bám vào như: bộ phận phân phối mẫu,
sensor nhiệt outlet, ống hút khí,…
3. Loại bỏ các vết bẩn trong ống bơm mẫu bằng cách bật nút ON của công tắc bơm
(10) và (11). Sau đó, bơm với nước cất.
4. Vòi phun mẫu nên được rửa bằng bể rửa siêu âm. Cần rửa bộ phận phun mẫu thật
cẩn thận, vì máy sẽ không hoạt động được nếu còn bất kỳ vết dơ nào trong vòi
phun.
5. Rửa màng lọc khí ở đầu khí vào của ống khí. Tháo nắp ở phía trên và kéo ống khí
ra. Lấy màng lọc khí và rửa như sau:
• Đặt màng dưới vòi nước chảy, sau đó sấy khô
• Thổi bụi bằng khí nén
• Làm sạch bằng máy hút chân không
• Nếu không thể làm sạch màng thì có thể thay màng mới.

Trang 5
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

6. Làm sạch màng lọc của máy hút (khí xả)

Loại các bụi bẩn dính vào đầu ra của máy hút
• Mở cửa sổ gắn với máy hút ở phía dưới máy chính
• Tháo nắp ở trên, tháo ốc gắn máy hút
• Tháo máy hút ra và gỡ ống gắn với máy hút
• Kéo máy hút sang một bên
• Tháo nắp ở trên máy hút. Lấy màng lọc ra
• Làm sạch màng lọc giống như bước 5 ở trên
• Lắp ráp trở lại theo trình tự ngược lại. Để lắp màng lọc, đặt bề mặt mềm
ra phía người dùng.

4. CÁC CHÚ Ý KHI VẬN HÀNH

1. Các điều kiện sấy tối ưu thay đổi tuỳ thuộc vào mẫu cần sấy.
2. Một số nguyên nhân khiến lượng lớn mẫu dính vào thành của buồng sấy là: mẫu có
nồng độ cao, nhiệt độ đầu vào thấp, áp suất khí nén quá cao hay quá thấp và tốc độ
bơm mẫu quá cao. Do đó, cần chỉnh các điều kiện thật phù hợp.
3. Khi hướng phun mẫu thay đổi do mẫu dính vào đầu phun, cần bật ON nút pulse jet
(12) để thổi sạch vết bám. Nếu điều này không làm sạch được thì tháo vòi phun ra
và lau sạch bằng khăn giấy.
4. Nguyên nhân làm kết dính mẫu vào bình cyclone là do hơi nước quá bão hoà gây ra,
hoặc có thể do tính chất của mẫu (độ tan chảy thấp, có khả năng kết bám,…). Để
giảm lượng nước trong bột mẫu thì cần tăng nhiệt độ của mẫu. Tăng nhiệt độ đầu
vào hoặc đầu ra hoặc tốc độ khí sấy hoặc giảm tốc độ bơm mẫu. Điều này làm
giảm sự chênh lệch nhiệt độ đầu vào và đầu ra của ống cyclone. Nếu nguyên nhân
do đặc tính của mẫu thì cần thêm vào một số chất phù hợp.
5. Khi bột mẫu có tính giữ ẩm cao, nó có thể trở nên ướt trong bình thu sản phẩm. Có
thể khắc phục theo phương pháp đề cập ở mục 4, hoặc gia nhiệt bình đựng mẫu
nếu cần.
6. Vòi phun chuẩn có kích thước đường kính là 406 um, nhưng nếu sấy mẫu với các
hạt rắn lớn thì có thể dùng các vòi phun lớn hơn: 508 hoặc 711 um để tránh bị
nghẽn đầu phun. Do sự khác nhau về kích thước của các đầu phun, nên các điều
kiện sấy cũng khác nhau. Hình 5 cho thấy mối tương quan giữa áp suất và tốc độ
dòng khí phun đối với vòi phun chuẩn 406 um (được hiệu chuẩn so với áp suất khí
quyển).
7. Thỉnh thoảng, một số hạt mẫu rất mịn nên không thể được thu nhận bởi ống
cyclone, do đó, nó bị hút ra ngoài cùng với hơi nước. Nếu bột mẫu quá mịn thì cần
giảm tốc độ dòng khí sấy, hoặc giảm áp suất của dòng khí. Bột mẫu càng mịn nếu
mẫu càng loãng. Do đó, cần điều chỉnh độ đặc cảu mẫu cho phù hợp.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH PROTEASE

A.. Xác định hàm lượng protein theo Lowry

Trang 6
 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein

A.1. Nguyên tắc

Hầu hết các protein đều chứa hai amino acid là Tyrosin và Tryptophan, hàm lượng
của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại
với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid này như nhau.
Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu,
màu này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (Hàm lượng protein). Vì thế ta có thể
dùng phương pháp so màu và xác định được hàm lượng protein.
A.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
A.2.1.Hóa chất
Na2CO3
Citrate Natri 1%
NaOH 0,1M
Albumin tinh khiết
Thuốc thử Folin
Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1 g Albumin, pha loãng với nước cất
thành 100 ml dung dịch.
Dung dịch A: Cân 2 g Na2CO3, hòa tan trong NaOH 0,1N thành 100 ml.
Dung dịch B: Cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong Citrate Natri 1% thành
100 ml.
Dung dịch C: Pha hỗn hợp dung dịch A và B theo tỷ lệ 49:1 (Chỉ pha để dùng
ngay trong ngày).
A.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm
Máy đo quang phổ UV-Vis
Bình định mức 50 ml; 100 ml
Pipet 1 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml
A.3. Các bước tiến hành
A.3.1. Dựng đường chuẩn Albumin
Pha dung dịch Albumin để đạt các nồng độ: 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700
µg/ml theo bảng sau:

Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7

Hàm lượng protein µ g/ml 0 100 200 300 400 500 600 700

Dung dịch Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 6 7

Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 4 3

Hút 0,5 ml dung dịch Albumin 0,1% có các nồng độ theo thứ tự 0; 100; 200; 300;
400; 500; 600; 700 µg/ml cho vào các ống nghiệm sạch và sấy khô đã đánh số sẵn. Thêm
vào đó 2 ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm
vào 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo
độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm.

Trang 7