2021

Pedem se omlouvám za chyby a peklepy :)

Analytická chemie II.
 OBSAH
1. Nejistoty a testování hypotéz v analytické chemii..............................................................................................................2
2. Vibrační spektrometrie II....................................................................................................................................................6
3. NMR spektrometrie 2.........................................................................................................................................................9
4. Hmotností spektrometrie 2..............................................................................................................................................11
5. Spřažené techniky I...........................................................................................................................................................12
6. Spřažené techniky II..........................................................................................................................................................13
7. Povrchová analýza I.......................................................................................................................................................... 15
8. Povrchová analýza II.........................................................................................................................................................16
9. Analýza chirálních látek....................................................................................................................................................18
10. Kinetické metody..............................................................................................................................................................18
11. Radioanalytické metody.................................................................................................................................................126
12. Bioanalytické metody..................................................................................................................................................... 128
13. Chemické senzory a biosenzory......................................................................................................................................130
14. Procesní analytická chemie.............................................................................................................................................132
 1.Nejistoty a testování hypotéz v analytické
chemii
1.1 Co je to validace?
 Proces, při němž se určuje vhodnost použití dané analytické metody pro získání spolehlivých dat (aby metoda dala
relevantní odpovědi k dané otázce)
 Posuzujeme, zda jsou parametry analytické metody srovnatelné s požadavky na výsledky
 Vhodnost se posoudí podle vztahu mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi analytické metody (požadavky x
schopnosti metody)

1.2 Vyjmenujte alespoň 5 důležitých charakteristik analytické metody,

jednu z nich definujte.
 Preciznost, přesnost, pracovní a lineární rozsah, citlivost, LOD, LOQ, robustnost, selektivita

1.3 Charakterizujte alespoň 2 charakteristiky analytické metody.

(citlivost-selektivita, mez detekce-mez stanovitelnosti, přesnost-preciznost, citlivost-robustnost, lineární rozsah-nejistota)

PŘESNOST
 těsnost souhlasu mezi výsledek zkoušky a
přijatelnou referenční hodnotou
PRECIZNOST
 těsnost mezi nezávislými výsledky zkoušky za
předem stanovených podmínek
PRACOVNÍ A LINEÁRNÍ ROZSAH
 Pracovní – koncentrační rozsah, ve kterém lze
dosáhnout přijatelné preciznosti a přesnosti
 Lineární – je jeho podoblast lineární kalibrační
závislosti
MEZ DETEKCE = LOD (LIMIT OD DETECTION)
 nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě detekováno
MEZ STANOVISTELNOSTI = LOQ (LIMIT OF QUANTIFICATION, LIMIT OF DETERMINATION)
 nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být
spolehlivě stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou
spolehlivostí
SELEKTIVITA
 schopnost rozlišit chemické nebo fyzikální vlastnosti
jednotlivé složky (analytu) ve směsi jiných složek
 skupinové, selektivní (analyt ve vymezené směsi), specifické
(analyt v libovolné směsi)
ROBUSTNOST
 necitlivost metody vůči malým odchylkám od
standardního operačního postupu
 testuje se úmyslným zanášením těchto odchylek a
srovnáním výsledků analýz s výsledky získanými
postupem zcela odpovídajícímu standardnímu
operačnímu postupu
CITLIVOST METODY
 Podíl změny analytického signálu a odpovídající
změny měřené veličiny
 Směrnice kalibrační závislosti y=f(c), tj: ∂ y /∂ c
NEJISTOTA
 Přiřazujeme ji ke střední hodnotě výsledků (kterou aproximujeme např aritmetickým průměrem)

1.4 Jaký je rozdíl mezi LOD a LOQ?

 LOD (limit of detection) – nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě detekováno
 je roven trojnásobku výběrové směrodatné odchylky (či trojnásobku šumu)
o Y LOD =Y blank +3. s blank
 LOQ (limit of quantification) – nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě stanoveno jako exaktní
hodnota; je roven deseti násobku výběrové směrodatné odchylky (či desetinásobku šumu)
o Y LOQ=Y blank +10. s blank

1.5 Rozdíl mezi chybou a nejistotou?

 CHYBA MĚŘENÍ = rozdíl mezi naměřenou hodnotou a skutečnou hodnotou měřené veličiny
 NEJISTOTA MĚŘENÍ = charakterizuje jakost výsledku měření a umožňuje porovnávat výsledky
o Není číslo ale interval, ve kterém s určitou pravděpodobností se nachází skutečná hodnota – x ± U
o Interval nejistoty tvořen násobkem kombinované nejistoty a koeficientu rozšíření k (obvykle k=2 pro 95%
interval) = interval spolehlivosti průměrné hodnoty

1.6 Co je standartní nejistota typu A; B?

 TYP A = standartní nejistota určena výběrovou směrodatnou odchylkou (z nějakého počtu opakování), předpokládá se
normální rozdělení
u ( x )=s(x )

√∑
n
s= ¿¿ ¿ ¿ ¿ ¿
i=1
 TYP B = standardní nejistota vyhodnocena jinak než statistickou analýzou, jiné druhy rozdělení (rovnoměrné,
trojúhelníkové)

1.7 Uveďte definici zákona o šíření nejistot.

 Šířením nejistot se rozumí efekt jednotlivých vlivů nejistot proměnných pocházející z dané funkce měření.
 Znalostí těchto nejistot lze určit kombinovanou nejistotu měření (= součet nejistot jednotlivých parametrů x i, který je
každý vážený citlivostí = parc. derivace y podle konkrétního parametru x i:

u ( y )= √ ∑ ¿ ¿ ¿ ¿… pokud jsou všechny parametry nezávislé

1.8 Jak souvisí hladina významnosti a spolehlivost u testování hypotéz?

Oba pojmy vysvětlit.
 Statistické testy jsou založeny na stanovení nulové hypotézy H0 = určitý předpokladu, který učiníme (samy si
nadefinujeme – např. výsledek metody měření, konstanta)
 K ní definujeme alternativní hypotézu H1
H 0 : μ=μ 0
 H 1 : μ ≠ μ0
 Na základě předepsaného postupu tuto hypotézu na dané hladině významnosti buď potvrdíme, nebo vyvrátíme
pomocí vhodného statistického testu
 HLADINA VÝZNAMNOSTI = (α) pravděpodobnost, že se zamítne nulová hypotéza, ačkoliv platí
 HLADINA SPOLEHLIVOSTI = (1 – α) pravděpodobnost, že se nezamítne nulová hypotéza, přičemž nulová hypotéza platí

1.9 Jaký test zvolíte při testu shody dvou výsledků analýzy, jaké při
testu tří výsledků?
a) Test shody dvou výsledků analýzy – dvouvýběrový Studentův T-test
 Porovnání hodnoty dvou hodnot
H 0 : μ=μ 0
H 1 : μ ≠ μ0
b) Test shody tří výsledků – Analýza rozptylu (ANOVA)
 Porovnání více než dvou hodnot
H 0 : μ1=μ2=μ 3=…
H 1 : μ 1 ≠ μ2 ≠ μ3 ≠ …

1.10 Definujte chybu I. druhu a II. druhu a sílu testu

 CHYBA I. DRUHU = nulová hypotéza platí, přesto jí zamítneme (falešně pozitivní výsledek) … α
o tato chyba je obvykle malá, odpovídá právě hladině významnosti testu
o pravděpodobnost, že nastane = hladina významnosti α (obvykle α = 0,05)
 CHYBA II. DRUHU = nulová hypotéza neplatí, přesto jí nezamítneme (falešně negativní výsledek) … β
o Velikost chyby II. druhu obvykle neznáme, často může být vyšší, než je hladina významnosti testu α
o Souvisí s počtem opakování a jak se mění hodnota α
 SÍLA TESTU – je číslo od 0 do 1 udává pravděpodobnost zamítnutí neplatné nulové hypotézy (tj. potvrzuje alternativní
hypotézu)
o čím vyšší číslo, tím lépe – s vyšší pravděpodobností lze neplatnost nulové hypotézy zamítnout
o počítá se na základě β … 1 – β
 2.Vibrační spektrometrie II

2.1 Co jsou charakteristické vibrace funkčních skupin v IR spektrech?

 Slouží k interpretaci IR spekter -> nalezení strukturního motivu a funkčních skupin
 Energie fotonů v IR nepostačuje pro excitaci elektronů → pouze změna vibračního stavu/rotačního stavu molekuly
 Amplitudy výchylek jednotlivých atomů molekuly jsou pro jednotlivé vibrace různé, často můžeme vibrační pohyb
molekuly ztotožnit s určitou funkční skupinou/vazbou
 Takové vibrace skupiny jsou ostatními atomy v molekule ovlivněny málo
 Proto se poloha absorpčních pásů a jejich intenzita, kterými se funkční skupina projeví v infračerveném spektru, příliš
neliší podle toho, je-li tato funkční skupina vázána v různých molekulách
 Tato skutečnost umožnila sestavit tabulky vlnočtů charakteristických vibrací důležitých skupin a vazeb (knihovny
spekter)
 Oblast otisku prstů – identifikace chemické struktury

2.2 Jak vypadá schéma FT-IR1 v NIR a MIR?

MIR FT-IR (Mid IR - 4000-400 cm-1 / 2500-5000 nm)
 Zdroj záření (polychromatické): žhavená keramická tyčinka (SiC)
 Dělič paprsku: KBr
 Detektor: DTGS
 Spektrometry – disperzní (dnes se nepoužívají), FT-IR

NIR FT-IR (Near IR - 12500-4000 cm-1 / 800-2500 nm)

 Zdroj záření: wolframová žárovka
 Dělič paprsku: CaF2
 Detektor: DTGS
 Spektrometry: Disperzní s difrakční mřížkou, FT-NIR s interferometrem

2.3 Jak je v reflexních technikách

definována reflektivita?
 poměr intenzit odraženého a dopadajícího záření
IR
R=|r |=
2
I0
 reflektivita R vyjadřuje externí reflexi
 Závisí na polarizovatelnosti (polarizaci záření)

2.4 Jaké skupenství lze měřit DRIFT technikou?

 Pevné a práškové vzorky -> vyžadují minimální přípravu vzorku (mletí pevného vzorku)
 Silně absorbující vzorky
 U speciálních technik i horké vzorky

2.5 Jaké je schéma DRIFT spektrometru?

 DRIFT = Difuse-Reflectance Fourier Transform Spectrometry
 Výhody:
o Minimální příprava vzorku
o Analýza pevných a práškových vzorků, silné
absorbující vzorky
1
Infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací
 o Speciální techniky – horké vzorky, volba atmosféry (plyny, vakuum), spojené s TLC (chromatografie na
tenké vrstvě)

2.6 Jaké znáte typy pásů? Které lze pozorovat v MIR a jaké v NIR?
MIR
 Charakteristická oblast vibrace funkčních skupin a oblast otisku palce (1500 – 200 cm -1), která je dána celkovou
strukturou molekuly
 Molekulární vazby – valenční, deformační
 Spektra obsahují převážně signály odpovídající normálním (fundamentálním) přechodům – tzn. Δν=1

NIR
 Spektra obsahují málo intenzivní přechody
 Převážně signály odpovídající kombinačním přechodům a svrchním tónům (tzv. vyšší harmonické přechody overtony)
 Lze vymezit oblasti, kde jsou dominantní pásy kombinačních přechodů (cca 4000 – 5300 cm -1), první overtony (cca
4600 – 7300 cm -1), druhé overtony (cca 6000 – 10000 cm -1) a třetí overtony (cca 8800 – 14500 cm -1)

2.7 Pro jaký typ analýzy (kvalitativní/kvantitativní) je NIR

spektrometrie vhodná?
 Vhodná pro kvalitativní analýzu i kvantitativní analýzu
 Kvantitativní – Lambertbeerův zákon
o Problém, že pološířka pásu je v NIR výrazně větší než v MIR, spektrum tvořeno několika slně překrytými
pásy -> při daném vlnočtu dochází k absorpci několika různých složek
o Nutné kombinovat s vícerozměrnými statistických metodami (měření při několika vlnočtech a statistické
vyhodnocení, které pásy jsou citlivé, na jaký vlnočet)
o Instrumentace jednodušší než pro MIR (to je pohlcováno sklem,
nutná příměs halogenů)
 Kvalitativní – hodně překryvů, takže není jednoduché používat k důkazu
přítomnosti látek
o Při kombinaci s vícerozměrnými metodami jde (najdou, které pásy
charakteristické, pro jaký typ látek)
o Využití v malé skupině látek (například rozlišení polymerů v plastech)
 Rychlá, nedestruktivní analýza, vzorky ve skleněných obalech, vhodné pro vzorky
s vysokým obsahem vody
 Nevhodný pro stopovou analýzu

2.8 Pomocí diagramu energetických hladin popište vznik Ramanova

spektra, a vysvětlete Stokesův a anti-Stokesův rozptyl.
 Vznik Ramanova spektra je důsledkem přechodu mezi vibračním stavem a virtuální hladinou (pomůcka)
 Jedná se o změnu polarizace molekuly při neelastickém rozptylu záření (= při vzájemné interakci molekuly s fotonem
došlo k výměně energie – změna vlnové délky)
 Elastický pohyb (bez změny energie) – foton (z monochromatického zdroje) interagují s molekulou na -> foton
nepředá molekule žádnou energii (tj. molekula skončí na stejné molekule energie – nic se nestalo) a emitovaný foton
bude mít stejnou energii jako na začátku = Rayleigho rozptyl
 Většina fotonů rozptýlena elasticky (nic se nestane)
 Neelastický rozptyl (se změnou energie) – foton (z excitačního zdroje = laser) si vymění energii s molekulou -> předá
energii molekule, která přejde ze základního stavu do jiného excitovaného stavu (fundamentální přechod) = Ramanův
rozptyl
 Ramanova interakce (neelastický rozptyl) vede ke dvěma možným jevům:
o Materiál absorbuje energii a emitovaný foton má nižší energii než foton absorbovaný. Tato možnost je
označována jako STOKESŮV ROZPTYL. Foton emitovaný má větší vlnovou délku.
 o Materiál ztratí energii a emitovaný foton má vyšší energii než foton absorbovaný. Tato možnost je
označována jako ANTI-STOKESŮV ROZPTYL.
 Rozdíl energií mezi absorbovaným a emitovaným fotonem koresponduje s energii mezi dvěma rezonančními stavy
materiálu a je nezávislý na absolutní energii fotonu.

2.9 Jaká podmínka musí být splněna, aby vibrace byla aktivní
v Ramanově spektru?
 V Ramanově spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou polarizovatelnosti molekuly
o -> Podmínka, že při vibraci musí dojít k polarizaci
 V IR spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou dipólového momentu molekuly

Q …. Normální souřadnice
α …. polarizovatelnost molekuly

2.10 Jaký je rozdíl mezi normálním a rezonančním Ramanově spektru?

REZONANČNÍ RAMANŮV ROZPTYL
 Energie virtuální hladiny podobná excitovanému stavu
elektronových přechodů
 Nastane, když frekvence použitého excitačního laseru
odpovídá frekvenci záření potřebného na přechod
elektronu do excitovaného stavu valenčních elektronů
v molekule

REZONANČNÍ SPEKTRUM – Virtuální hladina je položena v

energetickém diagramu výše

 Výhoda – zesílení intenzity Ramanových pásů – rezonanční

rozptyl
 Nevýhoda – emise energie fluorescencí
o Energie virtuální hladiny je podobná excitovanému stavu elektronových přechodů => emise fluorescence
(zhatí snahu – fluorescence často široká a zakryje Ramanovy pásy)
o Zesílení intenzity Ramanových pásů => nárůst polarizovatelnosti a při excitační energii laseru odpovídající
přechodu do excitované elektronové hladiny

2.11 Čím se liší princip vzniku fluorescence a Ramanova rozptylu?

FLUORESCENCE – přechod mezi základním stavem a vyšší excitovanou vibrační hladinou
 absorpce energie z fotonů (přechod do excitovaného stavu), pak emise záření ve formě jiných fotonu (nejdřív
absorpce 1 fotonu, pak emise druhého)
 RAMANŮV ROZPTYL – přechodu mezi vibračním stavem a virtuální hladinou
 absorbovaný foton si při přechodu na vibrační hladinu vymění energii s molekulou -> předá energii molekule, která
přejde ze základního stavu do jiného excitovaného stavu na základní hladině (fundamentální přechod) = Ramanův
rozptyl

2.12 Nakresl
ete schéma

disperzního Ramanova spektrometru. Popište jednotlivé části.

 Disperzní spektrometry s monochromátorem
 Základní geometrie – 90°, ale lze i 180°
 Filtrace Rayleighova záření – vlnově selektivní zrcadlo („notch“ filtr)

LASER – zdroj monochromatického záření

 Buzené výbojem: He-Ne (632,8 nm), Ar+(488,0; 513,5), Kr+ (568,2;
647,1; 752,5)
 Optické buzení diodou – Nd-YAG (532; 1064)
 Polovodičové laserové diody – laser dopovaný GaAs (780; 785)
 Optické buzení – barvivové lasery (360 – 750)
MONOCHROMÁTOR – propouští jen úzkou část spektra
SPEKTROMETR – Ramanův s Fourierovou transformací
 excitace v NIR
 Paprsek ze vzorku je na děličem paprsků rozděleno na dvě části ->
na pohyblivé a nepohyblivé zrcadlo (odražené paprsky rozdílné
optické dráhy) -> interference odražených paprsků v různých fází
(konstruktivní/destruktivní)

DETEKTOR – převedení interferometru na spektrometr Fourierovou

transformací

2.13 Jak lze potlačit fluorescenci v Ramanově spektru?

 Očištění vzorku – tato metoda je vhodná pro vzorky, kde fluorescence pochází od nečistot
 Laser o vhodné excitační vlnové délce – použití vlnové délky z oblasti NIR → foton má menší energii a vznik
fluorescence je tak méně pravděpodobný
 Photo-bleaching – ozáření vzorku intenzivním světlem, které odbourává fluorescenční molekuly (pro pevné vzorky,
kde fluorescence pochází od nečistot)
 3.NMR spektrometrie 2
3.1 Pomocí diagramu vysvětlete pulzní sekvenci jednoduchého NMR
experimentu.
Abychom mohli detekovat příčné složky magnetizace v čase, musíme nějakým způsobem vychýlit magnetické momenty z
rovnovážné polohy. K tomuto účelu slouží střídavé magnetické pole B1, které aplikujeme kolmo na pole B0. Součástí
každého pulzního NMR experimentu je aplikace jednoho nebo několika excitačních pulzů, které způsobí sklopení jaderné
magnetizace (sklopení magnetického vektoru M0) o zvolený uhel (většinou 90°). Následně se pozoruje návrat do základního
stavu

3.2 Jakou informaci je možné získat ze spin-spinové interakce?

= vzájemná interakce magnetických momentů hybnosti µ různých neekvivalentních vodíků (mluvíme-li o H-NMR)
 Informace o štěpení signálu
 Interakce spinů vede ke štěpení signálů na multiplety (poměr intenzity čar multipletu dán Pascalovým trojúhelníkem)
– umožňuje identifikovat, jak jsou jednotlivé funkční skupiny rozmístěny v analyzované molekule (vzájemně se štěpí
jen sousední atomy)
 Podmínky:
o ekvivalentní vodíky se vzájemně neštěpí
o skupina o n vodících (neekvivalentních) štěpí signál na sousedním uhlíku na n+1 čar
o Dochází ke vzájemnému štěpení signálu neekvivalentních vodíků na jednom uhlíku nebo na sousedních.
o štěpení nelze pozorovat mezi vodíky přes tři sigma vazby (výjimkou je aromatika)

3.3 Pro dané molekuly měřené 1H-NMR uveďte: a) počet signálů; b)

relativní integrální intenzity; c) multiplicitu všech signálů
3.4 Kolik signálů výše/níže uvedených látek je možné pozorovat v 13C
spektrech s protonovým dekaplinkem?
POČET SIGNÁLŮ
POČET DIGNÁLŮ 13C
NÁZEV STRUKTURA
1H S PROTONOVÝM
DEKAPLINGEM
2, singlet
2, 3, triplet
triplet 2, kvartet
ethylfenylacetát 2, 6 8
1,
dublet
triplet

methylpropionát 3 4

vinylacetát 3 4

2-chlropropan 2 2
 1,3,5 – trimethylbenzen 2 3

1-chlor-2-methoxybenzen 5 6

1-chlor-3-methoxybenzen 5 7

1-chlor-4-methoxybenzen 3 5

 Počet signálů – počet neekvivalentních skupin vodíků

 Relativní integrální intenzita – intenzity závisí na počtu jader (kolik protonů je schovaný pod 1 signálem)
 Multiplicita – informace o počtu uhlíků v sousedních skupinách

3.5 Vysvětlete rozdíl mezi podélnou (spin-mřížkovou) a příčnou (spin-

spinovou) relaxací. Jakými parametry jsou charakterizovány?
 relaxace spinů – informace o vzájemné konektivitě uvnitř molekuly
 Pulzní technika -> excitace pulzem do excitovaného stavů spinu -> sledujeme obnovení do základního rovnovážného
stavu (sleduje se závislost proudu na čase)
PODÉLNÁ (= LONGITUDINÁLNÍ, SPIN-MŘÍŽKOVÁ) RELAXACE (T1)
 Sleduje se velikost průmětu vektoru M0 do osy z (po 90°pulzu průmět do osy z 0, ale s časem probíhá relaxace ->
narůstá a obnovuje se původní stav na ose z)
 Je charakterizována návratem vektoru Mz do ustáleného stavu → přenos energie mezi excitovanými atomy a okolím
(mřížkou)
 Souvisí s překlopením spinů
 Průběh = exponenciální funkce
 Charakterizuje ji relaxační čas T1 (hodnota relaxačního času spin-mřížkové relaxace)
PŘÍČNÁ (= TRANSVERSÁLNÍ, SPIN-SPINOVÁ) RELAXACE (T2):
 Excitací pulzu dojde k synchronizování spinů (krouží stejně kolem osy) -> maximální průmět do hodnoty xy
 Dochází k dipol-dipolové interakci mezi jadernými spiny → dekoherence (desynchronizace) precesního pohybu2
jednotlivých spinů (ztráta synchronizace pohybu jader – vzájemnou interakcí některá dřív, některá později) → zánik
magnetizace
 M0 míří nahoru, ale u každého jádra jinam, vektory jdou proti sobě -> součet je nula (zánik magnetizace)
 Průběh = exponenciální funkce
 Charakterizuje ji doba T2, která popisuje rychlost zániku magnetizace Mxy

Vnější magnetické pole působící ve směru osy

z, excitačním radiofrekvenčním pulzem
sklopíme magnetický vektor M0 do jiné osy a
pak se sleduj relaxace (do původního stavu)

2
Vektor magnetizace daného jádra M0 – vykonává procesní pohyb (pohyb po kružnici dokola osy) -> dohromady daný vektor M0
3.6 Vysvětlete techniky „návrat po inverzi“ (inversion recovery) a
spinového echa. Diagramem popište příslušnou pulzní sekvenci.
 zjišťováno instrumentálními experimenty
NÁVRAT PO INVERZI
 Měření relaxačního času T1 (pro každé spektrum)
 Naměření série spekter, v pulzní sekvenci měníme prodlevu mezi dvěma pulzy, které předcházejí vlastnímu měření
signálu (které pak převádíme na spektrum)
 stejné impulzy jako spin echo, ale v opačném pořadí
 Nejprve se aplikuje 180° pulz kolem osy x → převrátí všechny přebytečné protony proti směru B0 (otočí o 180 °C)
 V důsledku podélné relaxace T1 dochází k postupnému návratu jader do rovnovážného stavu
 Čekáme jen nějakou dobu (nejdřív krátce, pak déle) – po nějaké chvíli pustíme 90° pulz (čtecí impulz – spustíme
měření) → překlopí vektor Mz do roviny x–y → měřitelný signál (začne se vracet)

SPINOVÉ ECHO
 Měření relaxačního času T2 – přímo ovlivňuje šířku píku v polovině výšky ve
spektru (z toho ale nelze přímo vyčíst)
 Vysílán vysokofrekvenční 90° RF pulz -> sklopení o osy xy → podélná
magnetizace vymizí a objeví se magnetizace příčná
 po skončení tohoto pulzu přestanou protony vykonávat synchronní pohyb →
ubývá příčná magnetizace → snižování úrovně měřitelného signálu → nechá se
uplynout čas TE/2 → vyšle se druhý RF pulz (180°) → překlopení na druhou
stranu → začnou se zbíhat -> nárůst signálu, který pak postupně vyhasíná

3.7
Ja

kou informaci o systému s probíhající chemickou výměnou lze

získat?
 Chemická výměna = přechod jádra mezi dvěma nebo více různými prostředími, ve kterých se liší svými NMR
parametry (Chemickým posunem, relaxačními časy …)
 Informace, které lze získat:
o rychlostní konstanty, termodynamické konstanty (entalpie, Gibbsova energie, entropie, změna konformace -
vaničková, židličková…)
PROBÍHAJÍCÍ PŘECHODY
 Intramolekulární procesy
o Konformační rovnováhy
o Tautomerizace
o Změny helikální konformace nukleových kyselin, pohyby proteinových řetězců
 Intermolekulární procesy
o Protonace/deprotonace
o Izotopová výměna
o Interakce hostitel-host
 4.Hmotností spektrometrie 2
4.1 Proč pracují hmotností separátory ve vakuu?
 Dochází k „naředění“ iontů -> nedochází ke kolizím a vzájemné výměně energií (zabrání to tomu)
 Čím větší analyzátory, tím třeba více vakuua

4.2 Jaký je princip ionizace FAB?

FAB = Fast Atom Bombardment / Bombardování rychlými atomy
 Polární analyt v polární kapalné matrici
 Vhodná pro větší molekuly, které nelze převést do plynného stavu (peptidy, proteiny, mastné kyseliny, surfaktanty,
polysacharidy)
 Používané matrice: glycerol, 1-thioglycerol, 3-nitrobenzylalkohol
 Ionizace vzorku smíchaného s matricí nárazem proudu urychlených atomů vzácného plynu (Xe, Ar, Ne)
 Urychlené atomy se získají kolizí s primárně vytvořenými ionty téhož prvku
 Vzorek je jako tenký film na kovové podložce

4.3 Jaké znáte techniky ionizace za atmosférického tlaku? Jednu

vysvětlete.
ELEKTROSPREJ
 využívá k ionizaci kapaliny proudící tenkou kovovou kapilárou
 silné elektrostatické pole
 náboj se usazuje na kapičkách (vznik kapiček s vysokým nábojem)
 náboj se usazuje na kapičkách, ty se postupně odpařuji (vyhřívání), až zůstane jen nabitá částice (zmenšuje se povrch
kapiček -> náboj je na tak malou kapku moc velký -> roztrhne ji a vnikají ionty)
CHEMICKÁ IONIZACE (ACPI)
 viz další otázka
FOTOIONIZACE (APCI)
 vhodná pro látky, které nejsou polární -> špatná ionizace elektrosprejem nebo ACPI
 ionizace fotonem (absorpce UV záření)
 přímá fotoionizace nebo přenos náboje z pomocné látky (aceton, toluen)
INDUKČNĚ VÁZANÉ PLAZMA

4.4 Jakým způsobem dochází k ionizaci vzorku metodou APCI?

 APCI = atmospheric pressure chemical ionization (ionizace za atmosférického tlaku)
 Ionizace rozpouštědla (nejčastěji vody) koronovým výbojem (jev, ke kterému dochází, když je mezi elektrodami velký
rozdíl potenciálů a jedna z elektrod je ostrá jehla -> kolem povrchu jehly ionizace plynné fáze)
 Následuje přenos protonu nebo náboje na
molekuly analytu -> ionizace molekul analytu
 Analyt je jako roztok přiváděn do rozprašovače
s přiváděným dusíkem (tvorba aerosolu)
 Kapky aerosolu procházejí vyhřívanou trubicí, kde
dochází k částečné desolvataci proudu molekul
analytu a zbytku solventu vstupují do prostoru
s elektrodou
 Vznik iontů s nábojem +1 nebo -1

4.5 Nakreslete schéma TOF s reflektorem a vysvětlete důvod použití

reflektonu.
 TOF = Time Of Flight = Průletový separátor iontů
 Ionty jsou urychleny v urychlovači napětí -> různě velké ionty stejného náboje mají různou rychlost
 Zaznamenává se doba průletu

 Dva typy – lineární a s reflektorem

TOF S REFLEKTOREM
 Reflektor = soustava kladně nabitých elektrod s rostoucím potenciálem
 Průlet iontů do elektrostatického pole reflektoru, změna směru dráhy, sjednocení kinetické energie iontů stejné
velikosti (ionty, které by náhodou neměli stejnou rychlost, i když by měli -> do detektoru dorazí stejně)
 Zlepšení hmotnostního rozlišení v důsledku prodloužení dráhy letu


4.6 Jaké síly působí na ionty v orbitrapu?

 Ionty oscilují kolem středové elektrody
 Stabilní trajektorie iontů je daná rovnováhou mezi odstředivou silou (odpudivou) rychle letících iontů pohybujících se
kolem elektrody a přitažlivou sílou elektrostatického pole generovanou elektrodou.

4.7 Jaké měřící módy jsou možné ve vícestupňové MS (MSn)?

 Vícestupňová analýze MSn je separace vybraných iontů následovaná řízenou fragmentací (další ionizace) a analýzou
vzniklých sekundárních fragmentů (fragmentace iontů nejsou náhodné – mají pravidla -> další ionizací se dozvíme víc
informací o struktuře iontů, zajistíme vyšší selektivitu)

MĚŘÍCÍ MÓDY
 Měření produktových iontů (product ion scan) = strukturní analýza prekurzorového iontu P+ a detekce jeho
fragmentů, které z něj vznikají F+
 Měření prekurzorových iontů (precursor ion scan) – detekce všech P+, které dávají jeden jediný vybraný F+
o Hledání fragmentu typického pro určitou skupinu látek (methylestery m/z = 74, alkylaromáty m/z = 91,
….)
 Měření neutrálních ztrát (neutrallossscan) – měření dvojce P+ a F+, která svou fragmentací poskytuje určitou
neutrální ztrátu
 Měření vybraného přechodu reakce (selectedreaction monitoring) – registrace vybraných P+ a F+ (sledujeme
konkrétní P+ které dávají konkrétní F+) -> umožňuje snížit LOD

4.8 Popište konstrukci spektrometru pohyblivosti iontů.

IMS = Ion Mobility Spectrometry
 Iontový zdroj – pulzní vstup iontů
 Vstupní mřížka s vloženým napětím -> Ionty letí skrz ni do
kolizní cely
 Kruhové elektrody – vložen rostoucí potenciál, který
vytváří elektrické pole pro migraci iontů
 Detektor – opačně nabitá elektroda

4.9 Vysvětlete princip spektrometru

pohyblivosti iontů.
 Při letu iontů v trubici (od zdroje pohybovány vlivem elektrostatického pole) dojde ke kolizi s neutrálním plynem
proudící v opačném směru
 Kolizemi s neutrálními molekulami plynu se rychlost pohybu iontů směrem k detektoru snižuje
 Díky kolizím separace iontů i podle tvaru – kompaktněji balená molekula méně často koliduje -> její doba letu je kratší
než objemnější molekuly

4.10 Jak je definovaná iontová pohyblivost ve spektrometrii

pohyblivosti iontů?
 Iontová mobilita K = rychlost vztažená na hodnotu
elektrické intenzity

5.Spřažené techniky I
 Separace (GL, LC, CE) – charakterizace frakcí (MS, IR, NMR)

5.1 Jakým typem gradientu se nejčastěji řídí eluce látek v GC a jakým

v LC?
GC (PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE)
 Nastavením teplotního gradientu (separace při různých teplot -> postupně se zvyšuje) izokratická/gradientová
LC (KAPALNÁ CHROMATOGRAFIE
 Pomocí gradientu polarity
 Izokratická– konstantní složení MF
 Gradientová– složení MF se plynule mění (narůstá eluční schopnost MF zvyšováním obsahu polárnějšího rozpouštědla
– kontrola retence)
5.2 Proč při spojení GC-MS se používá jako mobilní fáze helium spíše
než vodík a dusík?
 Helium zajišťuje dobrou užitečnost při analýze – ve spojení s hmotnostní spektrometrií se jakožto inertní plyn
neionizuje

5.3 Jaké ionizační techniky lze použít u GC-MS a u LC-MS? Stručně je

popište.
GC-MS
 Elektronová ionizace – tvrdá ionizace (molekulu ionizuji, disociuje, rozpadá se na fragmenty)
o Elektrony ze žhavené katody na molekulu -> vznikají molekulové ion-radikály, které se pak rozpadají
(fragmentace – může dál pokračovat)
- chemická ionizace (měkké ionizace – původní molekula jen ionizovaná, už se dál nerozpadá –nemá tak velkou energii)
o molekuly ionizovány prostřednictvím chemické reakce
o Nejdřív ionizace reakčního plyn (CH4 -> CH5+; NH3 -> NH4+), následně přenos náboje (ionizace)
O Vznikají pseudomolekulární ionty (M+1)+; (M-1)+ (o maličko posunutá hmotnost, kterou detekujeme)
LC-MS
 ESI = elektrosprej
o Kapalina prochází tenkou kapilárou = 1 elektroda
o rozprašuje se mobilní fáze, která vytéká z kolony, zapojené vysoké napětí
o náboj se usazuje na kapičkách, ty postupně odpařuji (vyhřívání), až zůstane jen nabitá částice (zmenšuje
se povrch kapiček -> náboj je na tak malou kapku moc velký -> roztrhne ji a vnikají ionty
 Chemická ionizace za atmosférického tlaku (ACPI)
 Fotoionizace za atmosférického tlak (APCI)
o Viz dřív

5.4 Jaké tři režimy sběru dat se užívají ve spojení GC-MS nebo LC-
MS?
1. SKENOVÁNÍ: záznam spektra ve vybraném rozsahu m/z
 Nižší rychlost – lepší LOD i citlivost
 Chromatogram jako časová závislost celkového proudu (TIC,
total ion current)
 Rekonstruovaný chromatogram (RIC, reconstructed ion
current) – umělá rekonstrukce chromatogramu se signály látek,
které produkují konkrétní ion (identifikování, které signály patří
konkrétnímu fragmentu)
1. SLEDOVÁNÍ VYBRANÉHO IONTU = SIM (selective ion
monitoring)
 Zvýšení selektivity, lepší LOD i citlivost
 Pro dobrou identifikaci látek (zlepšuje parametry)
 SIC, single ion chromatogram
2. SLEDOVÁNÍ VYBRANÉ REAKCE = SRM (SINGLE), MRM (MORE)
 Ještě větší selektivita (možné různé struktury jednoho iontu)
 V kombinaci s vícenásobnou MSn analýzou

5.5 Vysvětlete pojem hmotností

kalibrace v MS.
 K seřízení kalibračního rozsahu MS – kontrola, že funguje detekce správných
přesných hodnot m/z
 Kalibrační standardy
 Nejpoužívanější kalibrační sloučenina je FC-43, známý také jako Perfluor-terc-butylamin (mz 69, 131, 219, 264, 414,
502

5.6 Jak je realizováno spojení GC-IR s průtočnou celou?

 Průtočná cela, kterou prochází paprsek z infračerveného spektrometru (nejčastěji NIR)
 Celou prochází páry unášené mobilní fází
a) Vyhřívaná multireflexní průtočná cela – opakovaný odraz paprsku uvnitř cely -> naroste dráha paprsku v cele -> zvýší
se intenzita signálu
b) Chlazený disk (ZnSe) pro depozici a spektrální analýzu – používán dřív

6.

Spřažené techniky II
6.1 Které částice se účastní ionizace plazmatem v technice ICP? Které
tři mechanismy probíhají?
 Stanovení prvků (kovů i nekovů) v nízkých koncentracích
 vhodná metoda pro screening (jaké prvky jsou přítomny a jejich řádové množství)
 Účastní se elektrony a ionty argonu z plazmatu a metastabilní stav Argonu (stabilnější excitovaný stav) -> interagují
s analytem
 Argonové plazma = AR + Ar+ + e-,
MECHANISMY:
 Ionizace elektrony
¿ −¿¿
−¿→ M + e2 ¿
M +e 1
−¿ ¿
−¿ +e ¿
+ ¿+ e2 3
¿
−¿→ M ¿
M +e 1 −¿ ¿
¿ +¿ +e ¿
−¿→ M 2
¿
+¿+e1 ¿
M ¿ −¿ ¿
−¿→M +e 2 ¿
+¿+2 e ¿
M 
1

 Ionizace ionty argonu

¿+ ¿¿
+ ¿+ M → Ar + M ¿
Ar
 Ionizace argonem v metastabilním stavu
−¿¿

Ar m+ M → Ar + M ¿+¿+e ¿

m +¿¿
Ar + M → Ar + M


6.2 Jak jsou ionty převáděny z ICP do MS?

 Vzorkování = soustava vzorkovací a odběrové clony umožňují převedení iontů z oblast plazmatu při atmosférickém
tlaku do zón s nižším tlakem; zachovává složení proudu iontů, omezuje jejich kinetické energie a omezuje vznik
polyatomických částic
 Fokusace = před vstupem do MS – prostřednictvím iontové optiky, hl. cíl nahnat všechny ionty do úzkého paprsku
(brání rozptylu iontů, který mají přirozenou tendenci se rozptylovat), který potom vstupuje do analyzátoru
 Separace = kvadrupólový separátor (MS)

6.3 Ja
k
é

znáte zdroje spektrálních

interferencí v ICP-MS
 Při použití indukčně vázaného plazmatu vznikají ionty různého složení -> ke spektrálních interferencí (ve spektru vedle
signálů analytu signály i interferentů)
1) isobarické ionty = ionty se stejnou nominální hmotou (na spektru 40Ca pozorujeme i 40Ar, 40K)
2) Dvojnásobně nabité ionty
3) Polyatomické ionty – hmotnostní překryvy (39K překryt 38Ar1H)

6.4 Popište kroky korekce spektrální interference pomocí známého

poměru přirozeného zastoupení dvou izotopů.
 Vzájemná relativní četnost (intenzita) izotopů prvků vyskytujících se v přírodě je konstantní -> při výběru jiného
izotopu v MS prvku s jiném hmotnostním číslem už nebude k interferencím docházet
 U izotopu, kde nedochází k interferenci se změří intenzita, a na základě přirozeného poměru izotopů se vypočítá jejich
intenzita v oblasti interference
 Podle zjištěné intenzity se udělá korekce sledovaného analytu -> odečtením intenzity interferentů zjistím reálnou
intenzitu analytu

6.5
D

efinujte pojem „chemická specie“.

 Specifická forma prvku definovaná izotopovým složením, elektronovým nebo oxidačním stavem nebo molekulovou
strukturou
 Molekula o daném vzorci

6.6 Vysvětlete roli kolizní cely užívané v ICP-MS.

 Eliminace spektrálních interferencí (vhodné hlavně pro polyatomické interferentů)
 Spektrální interference zhoršují meze detekce některých prvků
1. Chladné plasma – plasma generováno při nižší energii (čím nižší teplota, tím méně polyatomických sloučenin argonu)
– obtížně optimalizovatelné, problémy s matricí
2. Kolizní-reakční cela – reakční nebo kolizní disociace polyatomických částic reakcí s kolizním plynem (H2, He nebo NH3)
– polyatomická částice reaguje s plynem, analyt ne
3. Diskriminace kinetickou energií – polyatomické ionty se sráží častěji než jednoduché ionty, jejich Ekin klesá rychleji

6.7 Co je principem eliminace interferencí v kolizní cele s diskriminací

kinetickou energií?
 Slouží k eliminaci polyatomických interferentů
 Kolizní cela s heliem
 Kolizemi dochází pouze ke snížení kinetické energie
 Po vstupu do cely dochází k interakci s plynem (např. He) – ztráta energie souvisí s velikostí iontů -> ztráty větší u
polyatomických iontů
 výrazně četnější srážky polyatomických iontů -> výraznější zpomalování -> ztrácí kinetickou energii potřebnou
k opuštění elektrického pole uvnitř cely (zůstanou tam, funguje to jako filtr)
 Ionty analytu výrazně menší -> mají dostatečně vysokou kinetickou energii, aby mohli celu opustit

6.8 Krátce vysvětlete princip ionizace v cele s doutnavým výbojem.

 = GD-MS
 Doutnavý výboj (glow dischrage) u povrchu katody v prostředí s inertním plynem o nízkém tlaku
 Na povrch katody je fixován tuhý vzorek
 Doutnavý výboj vzniká mezi dvěma elektroda v prostředí plynu o nízkém tlaku (Ar)
 Vznikají elektrony a ionizovaný Ar -> uvolňují analyt z katody -> pak dochází k jeho ionizace
 Šetrnější způsob
 V kombinaci s MS se zjednodušují spektra (nejsou spektrální interference)

6.9 Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu těkavé

metaloorganiky v atmosféře? Vysvětlete proč.
 GC-MS (přesnější GC-ICP-MS)
 Jelikož se jedná o těkavou složku -> separaci pomocí plynové chromatografie (GC) a následně připojení na ICP-MS
(indukčně vázané plazma MS) -> plyn nahnán do plazmové hlavice, ke je ionizován a poslán do MS
6.10 Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu metaloproteinů
ve vzorku buněčné kultury? Vysvětlete proč.
 Permaeční chromatografie (SEC) na izolace frakce metaloproteinů; (ICP -MS) lze sledovat atomy, které jsou cílem naší
analýzy = vyskytujících se v metaloproteinech (Fe, Cu, Zn, …)
 Lze použít u (ICP-MS) standardy metaloproteinů (s daným prvkem) o známých koncentracích
 SEC-ICP-MS

7.Povrchová analýza I
7.1 Jaké techniky patří do skupiny fotoelektronové spektrometrie? U
jedné z nich vysvětlete princip emise fotoelektronů.
 RENTGENOVÁ FOTOELEKTRONOVÁ SPEKTROMETRIE = PES (XPS = rentgenová fluorescence, ESCA = rentgenová
fotoelektronová spektrometrie, UPS =Ultrafialová fotoelektronová spektrometrie)
 Emisní technika
 Excitace fotony (X-Ray/UV), detekce elektronů
 Ozařování povrch vzorku excitačním záření (RTG záření) -> vyražení elektronu z povrchu – analýza daného elektronu
 Analýza pevných tuhých vzorků (vzorky ve vysokém vakuu)
 Získáme informace o elementárním složení, empirický vzorec, chemické složení, elektronové stavy
XPS
 Vzorek ozařován rentgenovým zářením -> emise elektronů (z vnitřních slupek atomu) -> detekce intenzity elektronů
dané energie
 Analýza tuhých, kapalných i plynných vzorků
 Princip – vnější fotoelektrický jev -> zářením je vyražen elektron, který se zaznamenává na detektoru a analyzuje
 Fotoelektrony neuniknou z povrchu z hloubky vyšší než 1-5 nm -> analýza povrchu
 Spektrometr měří kinetickou energii emitovaných elektronů
 Kinetická energie elektronů má vztah k vazebné energii elektronů nebo energii potřebné k odstranění z jeho orbitalu
 Fotoelektrony jsou separovány podle své kinetické energie,
detektor registruje počet elektronů dané energie
ESCA
 Aplikace XPS pro identifikaci prvků vzorku, chemického složení
včetně oxidačních stavů prvků s možností stanovení jejich
množství, na co jsou molekuly vázané
UVS
 Vzorek ozařován ultrafialovým zářením -> vyražením elektronů
z vnějších (valenčních) orbitalů
 Analýza valenčních a vazebných elektronů

7.2 Jak se liší UPS od XPS?

XPS
 používá rentgenového záření o energiích 200-2000 eV => analýza elektronů
z vnitřních slupek
UPS (= rentgenová fotoelektronová spektrometrie)
 použití UV záření o energiích 10-45 eV = analýza valenčních a vazebných elektronů
7.3 Nakreslete Bohrův diagram sodíku (jádro a všechny elektrony). Pokud dojde
k interakci rentgenového záření s jedním elektronem 1s, vysvětlete
vznik píku ve fotoelektronové a Augerově spektrometrii.
 Fotoelektron sloužící k excitaci
 Následuje zaplnění elektronu z vyšší hladiny Rentgenová fluorescence detekce charakteristické energie rentgenového

záření hν
 Nebo může nastat zaplnění elektronu z vyšší hladiny, vzniklá energie se využije na vyražení dalšího elektronu Augerův
elektron
 Spektrum:
 Rentgenová fluorescence = fotoelektrony jsou detekovány podle své kinetické energie, měřená závislost XPS Intenzita = f
(vazebné energie) - čím silněji vázaný elektron (jako ten 1s např.) je potřeba vyšší vazebné energie na excitaci
 Augerův elektron = Projeví se ve stejném spektru, typický je spíše pro atomy s nižším atomovým číslem. Nicméně, energie
Augerova elektronu nezávisí na energii zdroje. Snadno odlišit od signál XPS. Projeví se ve spektru jako extrapík. U Sodíku
očekáváme signály pro vazebné energie elektronů 1s,2s,2p,3s. Přesto 5 signálů

7.4 Které tři procesy probíhají po vyražení vnitřního elektronu? Pomocí

diagramů energetický hladin vysvětlete všechny tři.
 Excitace fotony i elektrony -> vyražení
vnitřního elektronu -> nabitý atom
 Relaxační mechanismy (dojde ke
stabilizaci):
1) zaplnění elektronu z vyšší elektronové
slupky – uvolněná energie se vyzáří ve
formě atomu (Rentgenová fluorescence)
2) Vznik Augerova elektronu – vzniklá energie se
využije na vyražení dalšího elektronu
3) Relaxační mechanismy si konkurují

7.5 Jak lze identifikovat

signály Augerových
elektronů ve spektrech XPS? Uveďte vzorec popisující kinetickou
energii fotoelektronů a Augerových elektronů.
 XPS spektra obsahují i signály Augerových elektronů
 Lze je snadno identifikovat použitím jiného zdroje záření než při naměření původního spektra (např vyměnění jednoho
prvku v rentgence)
 Porovnáním spekter lze Augerovy elektrony identifikovat – Zatímco signály (energie) Augerových elektronů se
nezmění (závislé pouze na energii odpovídající rozdílu energii jednotlivých elektronů atomu), energie ostatních
fotoelektronů se posunou (jsou závislé na energii vstupujícího záření) -> augerovy elektrony zůstanou na jednom
místě
 E Kin=hv −Ev −W
Ekin … kinetická energie vyraženého elektronu
W … výstupní práce pro „uvolnění“ elektronu z povrchu
EV … vazebná energie vyraženého elektronu (i
energie AO závisí na chemickém okolí, který
působí malý chemický posun)

E fotoelektron=h v2 =E K (základní hladiny)−E L1
(vyšší hladina)
 E Au=E Kin −EL 1−E L2 ,3

7.6 Jak energie Augerových

elektronů závisí na
atomovém čísle?
Zakreslete do diagramu.
 Konkurující proces rentgenová fluorescence
 Emise Augerových elektronů je dominující pro nízká atomová čísla (Z)
 Závislost kinetické energie Augerových elektronů na atomovém čísle

7.7 Jaké vlastnosti mohou být pomocí ESCA identifikovány? Jinými

slovy, jaké chemické vlastnosti ovlivňují chemický posun v ESCA
spektru?
 ESCA = více rozlišená XPS
 Umožňuje získat informace o chemickém stavu (např. lze pozorovat čtyři různé stavy vazebné energie elektronu
uhlíku)
 Chemický posun (analogie k NMR, ale citlivější) ovlivňuje rozložení elektronové hustoty v blízkosti valenčních
elektronů – vlivem tvorby chemických vazeb = mění se elektrostatický potenciál
 Signály charakterizující atomové a molekulové orbitaly
 Jevy způsobující chemický posun: oxidační stav (identifikace), chemická vazba, elektronegativita sousedních
atomů
 Kvantitativní informace o prvkovém složení – moc se nepoužívá, ale lze

7.8 Popište SIMS.

 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE SEKUNDÁRNÍCH IONTŮ = SIMS (Secondary-ion ass Spectrometry)
 Studium povrchu elektrony
 Informace o elementárním a chemickém složením
 Excitace a detekce: ionty
 Působíme primárními ionty a vznikají jiné ionty, které analyzujeme MS

PRIMÁRNÍ IONTY
 Elektrony, které působí na vzorek (pronikají až do 10 nm)
 Zdrojem je iontové dělo
 Paprsek iontů fokusován do bodu na povrchu vzorku
 Informace zkresleny hloubkou -> nepoužívají se
 Energie > 10 keV

SEKUNDÁRNÍ IONTY
 Vyrážejí je primární elektrony (to samé jako fotoelektron, ale jiný princip vzniku)
 Do hloubky 5-50 nm
 Povrchové atomy jsou odprašovány od povrchu nebo implantovány hlouběji
 Malá část atomů je ionizovaná (proud dopadajících primárních iontů generuje teplo)
 Odprášené atomy jsou zachyceny, urychleny a fokusovány do hmotnostního analyzátoru – dojde k analýze
sekundárních iontů separátorem MS (intenzita sekundárních iontů v závislosti na jejich poměr m/z)

7.9 P
o
p
i
š
t
e

dva možné zdroje spektrálních interferencí v SIMS spektru.

 Často u analyzátorů s nižším rozlišením
 Interference molekul (C4H9 a 57Fe)
o Interference molekul o stejném atomovém čísle
o Jedná se ovšem a naprosto odlišná chemické individua (molekula organická x atom)
 Izobarické interference (48Ca x 48Ti)
 Iontové klastry (40Ca2+ a 80Se+)
 Dvojnásobně nabité ionty dávají signál poloviční hmotnosti (mají stejné signály jako o polovinu lehčí prvky)
 Interference primárních iontů iontového děla
 8.Povrchová analýza II
8.1 Difrakční limit optické mikroskopie – jaká je jeho velikost a jaký
parametr ho určuje?
 Popsán RAYLEIGHOVÝM VZTAHEM (čím menší, tím lepší
rozlišení)
λ
d=0 ,61 ( )
NA
 d … vzdálenost dvou objektů, které lze rozlišit
 λ … vlnová délka světla
 NA … numerická apertura čočky – (NA = n*sinα) -> míra
schopnosti objektivu soustředit paprsky a rozlišit jemné detaily vzorku při stejné
pozorovací vzdálenosti (vyšší NA -> lepší rozlišení a zvětšení)
 Optická mikroskopie patří mezi mikroskopie „vzdáleného pole“ – laterální rozlišení
je maximálně asi 200 nm
 Objekty o velikosti nižší než 200 nm nelze v optickém mikroskopu pozorovat
 Mikroskopické techniky „blízkého pole“ umožňují difrakční limit překročit (vlákno se
světelným kanálem se pohybuje v bezprostřední blízkosti povrchu vzorku -> překonáme difrakční limit)

8.2 Vysvětlete princip konfokální mikroskopie.

 Ozáření pouze jediného bodu v rovině zaostření -> detekce pouze záření odraženého (nebo emitovaného při
fluorescenci) v ozářeném bodu -> světlo z ostatních míst je potlačeno
 Výsledný obraz vzniká skenováním přes celý vzorek -> rekonstrukce obrazu v počítači (složení obrazů dohromady)
 Skenování lze jak v jedné rovině (2D), tak ve více rovinách (3D)
VÝHODY:
 Větší hloubka ostrosti (překonání difrakčního limitu)
 Vyšší kontrast (chybí zobrazení míst mimo rovinu ostrosti)
 Vyšší poměr signál/šum (pro jeden bod; měření celého obrazu je časově náročné)
 Lepší efektivní rozlišení

8.3 Popište rozdíl mezi SEM a TEM – princip měření, příprava vzorku.
SEM = skenovací (rastrovací) elektronový mikroskop -> řádkovací
 Svazek paprsků veden na vzorek, kde se odráží a jsou snímány, měřit jdou i vyražené sekundární elektrony ze vzorku a
fotony uvolněné během toho
 Pracuje tak, že je na preparát směřován tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku ->
odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz
 Preparát tlustý (aby se odrazilo dostatečné množství e-), musí být vodivý (kvalitně pokoven)
 Zaostřený svazek elektronů musí po povrchu rastrovat společně s detektorem (nelze změřit najednou -> posouvání
spolu po povrchu)

TEM = transmisní elektronový mikroskop -> prozařovací

 Svazek elektronů prochází skrz vzorek -> výsledný obraz se promítá na stínítko nebo na fotografické desce/filmu
 preparát musí být velmi tenký (1 um) – aby paprsky prošel, nesmí nepohlcovat e-

8.4 Jaký druh elektronů vytváří nejčastěji obraz TEM a SEM?

Vysvětlete princip vzniku těchto elektronů.
 Různé interakce primárních elektronů se vzorkem (8 typů)
 SEM -> dochází k pěti interakcím
 TEM -> dochází ke třem druhům interakcí

SEM

1. Zpětněodražené (primární) elektrony

 Velká energie (řádově desítky keV)
 Odraz způsobený kolizí primárních elektronů dopadajících kolmo
na vzorek
 Intenzita zpětně odražených elektronů je úměrná
atomovému číslu atomů vzorku (atomy s vyšším Z se jeví
světlejší)
 Elektrony jsou odráženy z širšího okolí kolem místa fokusace
elektronů na povrch vzorku -> omezení rozlišovací
schopnosti SEM
2. Sekundární elektrony
 Cca 5 eV
 Vznikají interakcí primárního elektronu s elektronem atomu, v jehož
blízkosti prochází, část energie primárního elektronu způsobí emisi elektronu z atomové slupky (obvykle K)
 Sekundární elektron opouští vzorek s nízkou kinetickou energií
 Interakce primárního elektronu vede ke vzniku několika sekundárních elektronů
 Tvoření sekundárních elektronů úzce souvisí s topografií povrchu -> díky jejich úzké energii se detekují pouze
bezprostředně u povrchu
3. Augerovy elektrony
 10 eV - 2 keV
 Způsobené relaxací ionizovaného atomu po emisi sekundárního elektronu
 Charakteristická energie Augerových elektronů umožňuje elementární analýzu
 Nízká energie; emitovány pouze z nanometrové tloušťky povrchu
4. Emise rentgenové fluorescence
 Relaxace ionizovaného atomu po emisi sekundárního elektronu
 Emitované rentgenované záření má energii (λ) charakteristickou pro daný prvek
 Mapování elementárního složení na povrchu analyzovaného vzorku
5. Katodoluminiscence
 Způsobená párem elektron-díra (vzniklým na zlomu), který vzniká interakcí primárních elektronů s některými materiál
 Při rekombinaci tohoto páru může dojít k emisi záření od UV po IR -> intenzita bývá nízká
 Způsobují ji obvykle nečistoty v homogenním vzorku nebo mřížkové defekty v krystalu, nějaké hrany vzorku

TEM

1. Nerozptýlené elektrony
 Primární elektrony prochází vzorkem bez vzájemné interakce
 Prvky s vyšším atomovým číslem brání průchodu elektronů
 Kontrast obrazu vzniká na základě množství prošlých elektronů -> tlustší částí vzorku se jeví tmavší -> tenčí světlejší
2. Elasticky rozptýlené elektrony
 Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem elasticky rozptýleny (bez ztráty energie)
 Primární elektrony mají stejnou energii a dopadají kolmo na vzorek – jsou rozptýleny pod stejným úhlem
3. Neelasticky nerozptýlené elektrony
 Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem rozptýleny (změní se úhel) a ztrácí energii (neelastický rozptyl)
 Využití: Spektroskopie ztráty energie elektronů, Kakuchiho pásy

8.5 Popište následující techniky STM, AFM, SNOM.

 mikroskopie skenovací sondou

STM = SKENOVACÍ TUNELOVÁ MIKROSKOPIE (SCANNING TUNNELING MICROSCOPY)

 Dochází k tunelovému jevu – přenos elektronů z hrotu na vzorek nebo naopak
 Kvantově-chemický jev spojený s uvězněním elektronu v prostoru (model
potenciálové jámy)
 Kladný potenciál na vzorku – tunelovací proud vzniká přechodem
elektronů z obsazených hladin sondy do prázdných hladin vzorku
 Záporný potenciál na vzorku – Tunelovací proud vzniká přechodem
elektronů z obsazených hladin vzorku do prázdných hladin sondy
 Díky exponenciální závislosti tunelového proudu na vzdálenosti d -> Vysoká
citlivost měření výškového profilu povrchu vzorku

AFM = MIKROSKOPIE ATOMÁRNÍCH SIL (ATOMIC FORCE MICROSCOPY)

 Měří síly působící mezi sondou a povrchem (síly mohou být atomární,
laterální, magnetické)
 Snímání pozice sondy (hrotu na konci pružného nosníku) -> držík
zajišťuje posun v rovině x-y po povrchu vzorku
 Pomocí laserového paprsku a diodového pole je snímáno prohnutí
nosníku (podle toho, kde hrot je a jak je natočen můžeme zjistit, kde se
nachází)

SNOM = MIKROSKOPIE V BLÍZKÉM OPTICKÉM POLI (SCANNINE NEAR-FIELF OPTICAL MICROSCOPY)

 Optická mikroskopie v nanoměřítku (desítky nanometrů)

 Hrot sondy musí být velmi blízko povrchu vzorku (5-50 nm) -> překonání difrakčního limitu
 Princip jako AMF, ale používá se světlovodný hrot

9.Analýza chirálních látek

9.1 Vysvětlete pojem chiralita, optická aktivita, racemát, enantiomerní
čistota.
CHIRALITA
 Vlastnost objektu – chirální objekt není ztotožnitelný se svým zrcadlovým obrazem
 Nemá střed ani rovinu symetrie, může ale mít rotační rovinu symetrie
 Různé chování v živých systémech – samy také chirální (různá vůně, chuť, toxicita, terapeutický efekt)
 Stereoizomery – n chirálních center (2n)
 Enantiomery – liší se na všech chirálních místech
 Diastereomer – liší se alespoň na jednom centru, ale ne na všech (rozlišitelné -> Jiné fyzchem. vlastnosti)
OPTICKÁ CHIRALITA
 je schopnost chirálních látek stáčet rovinu polarizovaného světla.
RACEMÁT
 Směs enantiomerů v molárním poměru 1:1
 Separují se, pokud interakcí s chirálním selektorem vznikne diastereomerní pár, který lze separovat
ENANTIOMERNÍ ČISTOTA
 Vyjádření obsahu jednotlivého enantiomery (100 % pouze jeden enantiomer x 0% racemát)
[ S ]− [ R ]
ee ( % )= ∗100 %
[ S ]+ [ R ]

9.2 Nakreslete a popište schéma polarimetru. Vysvětlete princip měření.

 Přístroj měřící úhel rotace (neboli změnu polarizovaného světla) – Stáčení roviny polarizovaného světa (z
nepolarizovaného záření, které kmitá do všech stran na polarizované záření kmitající v jedné rovině)
 Enantiomery stáčejí roviny polarizovaného světla doprava/doleva v důsledku odlišných indexů lomu -> změření, jak se
světlo otočí
 Měří se úhel stočení lineárně
polarizovaného záření α

9.3 Vysvětlete
princip
spektrometrie
cirkulárního
dichroismu. Jaká
veličina je zde
měřena?
 Používá se cirkulárně (kruhově) polarizované záření, z kterého dostáváme průchodem vzorku elipticky polarizované
záření
 Enantiomery vykazují rovněž různé absorpční koeficienty pro enantiomery stačící rovinu doleva/doprava
 Měří se rozdíl absorbance L-CPL a R-CPL (levo a pravotočivá kruhová polarizace) chirální molekulou => ΔA =
AL-AR
 Důležitá podmínka je nutnost, aby látka absorbovala dané použit vlnové délky záření -> látka musí obsahovat chirální
chromofor (tj. látku, která absorbuje)

9.4 Vysvětlete princip spektrometrie Ramanovy optické aktivity. Jaká

veličina je zde měřena?
 Zaleženo na principu Ramanova neelastického rozptylu (studuje posun energií rozptýlených fotonů)
 Chirální molekuly rozptylují kruhově polarizované záření (ICP = incident circular polarization) či lineárně polarizované
záření (SCP = scatterd cirkular polarization)
 Měří se rozdíl intenzit vpravo a vlevo cirkulárně polarizované složky rozptýleného záření vlivem interakce s chirální
molekulou
o sledujeme rozdíl I R −I L ≠ 0, kdy I jsou intenzity rozptýleného R-CPL nebo L-CPL
I R−I L
o ∆= => ∆ je v řádu 10−3
I R+ I L
 Geometrie spektrometru – zpětný rozptyl
9.5 Vysvětlete princip enantioselektivní interakce.
 ENANTIOSELEKTIVNÍ INTERAKCE = pro tuto interakci je nutné minimálně tří odlišných interakcí (tříbodový model)
 Vytvoří se komplexy s konkrétním umístění molekul – při interakci s chirálním selektorem rozlišní enantiomer (jeden
enantiomer pasuje, druhý ne -> rozlišení)

 CHIRÁLNÍ ROZPOZNÁVÁNÍ – schopnost chirální stacionární fáze tvořit různou měrou s jedním a druhým
enantiomerem diastereomerní komplexy (podmínka minimálně tří interakcí) např.:
o Vodíková vazba
o π−π interakce
o Van der Waalsovy interakce
o Sférické interakce

9.6 Uveďte alespoň dva příklady chirálních selektorů užívaných

v chromatografii. Vysvětlete princip chirální separace.
CHIRÁLNÍ SEPARACE
 Chromatografie
 Schopnost chirální stacionární fáze tvořit různou měrou s jedním a druhým enantiomerem diastereomerní komplexy
(podmínka minimálně tří interakcí) např.:
o Vodíková vazba
o π−π interakce
o Van der Waalsovy interakce
o Sférické interakce
 Podle síly interakce se enantiomery zdrží na koloně
 Pro analýzu, jaké enantiomery jsou ve vzorku, kontrolní analýzy (průkaz, že druhý enantiomer je ve vzorku hodně
málo), pro vlastní izolaci enantiomerů
CHIRÁLNÍ SELEKTORY použití

 polysacharidy  Univerzální použití

 Pirklovy báze
 makrocyklická antibiotika
 cyklodextriny
 proteinové fáze
 Specifická aplikace -> rozhoduje rozpustnost v používané
MF; SFC
 Specifická aplikace -> rozhoduje rozpustnost v používané
MF; SFC

 Biologické vzorky, aromatické drogy
 10.Kinetické metody
10.1 Napište diferenciální a integrální tvar rychlostní rovnice prvního
řádu.
DIFERENCIÁLNÍ TVAR

−d [ A ]
v= =k [ A ]
dτ
INTEGRÁLNÍ TVAR

ln
( )
[ Aτ ]
[ Ao]
=kτ

[ A τ ]=[ A o ] e−kτ
10.2 Stručně popište a srovnejte následující rychlostní metody:
METODA POČÁTEČNÍ RYCHLOSTI
 Využívá diferenciální tvar rovnic
o Určuje se rychlost reakce na počátku, odpovídající směrnici křivky v daném bodě
o Rychlosti reakcí jsou odečteny pro kalibrační roztoky v daném čase -> z proložené kalibrační křivky se poté
odečtou koncentrace analytu v neznámém vzorku
o Koncentrace analytu je úměrná pozorované reakční rychlosti
 Vysoká citlivost (rychlost reakce je nejvyšší na začátku reakce a časem klesá)
 Na začátku reakce se dá průběh závislosti koncentrace analytu na čase aproximovat na přímku (zhruba do 2 %
zreagovaného analytu) -> požadovaná hodnota rychlosti se poté odečte jako směrnice dané přímky
 V Průběhu reakce může docházet i k dalším vedlejším reakcím = interference
- Krátký čas na promíchání činidel
METODA STŘEDNÍ RYCHLOSTI
 Určuje se rychlost reakce po jejím částečném proběhnutí, která odpovídá tečně k naměřené křivce v daném bodě
(směrnice křivky – závislost (A) = f(t) v daném bodě v= -ΔA/Δt)
 Na rozdíl od A) je výhodou této metody dostatečný čas na promíchání činidel

10.3 Vysvětlete princip průtokové vstřikovací analýzy (FIA), nakreslete

a popište schéma zařízení.
 FIA = PRŮTOKOVÁ VSTŘIKOVACÍ ANALÝZA (Flow Injection Analysis)
 Reakce probíhá za chodu přístroje -> snadná automatizace, jednoduchá konstrukce, spolehlivé a snadné
 Malý objem vzorku je v pravidelných intervalech nastřikován do proudu nosného plynu
 Měřený signál je výsledkem dvou fyzikálních procesů:
 1. FYZIKÁLNÍHO – DISPERZE – parametr, který hodnotí účinnost, popisuje mísení
o Poměr počáteční koncentrace analytu a detekované koncentrace analytu
o rozšiřování zóny v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny a kapaliny) = různý rychlostní profil toku
(turbulentní x laminární)
 2. CHEMICKÉHO – Daná kinetikou reakce činidel s analyty
 Spolehlivá, rychlá a snadno automatizovaná metoda
10.4 Vysvětlete princip
průtokové vstřikovací
analýzy (SIA), nakreslete
a popište schéma zařízení.
 SIA = Průtoková vstřikovací analýza (Sequential
Injection Analysis)
 Obdoba FIA (úprava)
 Využívá se obousměrného pohybu kapaliny systémem – v zařízení ventily, které umožňují nadávkovat vzorek, a
nakonec puštění chtěného analytu na detektor
 Obrácení směru nosného proudu

 Lepší promíchání reakční směsi

 Jednodušší instrumentální zařízení
 Flexibilita a robustnost
- Omezení množství činidel

10.5 Vysvětlete pojem disperze vzorku ve vstřikovacích analýzách. Jak

je matematicky definován? Jaké druhy (příčiny) disperze znáte?
 Matematicky definováno jako disperze analytu:

Co  Co = počáteční koncentrace analytu

D=  Cmax= Detekovaná koncentrace analytu
C max

 DISPERZE VZORKU:
 Je funkcí času
 Jedná se o rozšiřování zón signálu v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny a kapaliny) = různý rychlostní profil
toku (turbulentní x laminární
 Detekovaný signál je rozšiřován z různých příčin
 PŘÍČINY DISPERZE VZORKU:
1. Fyzikálního – disperze (rozšiřování) zóny v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny a kapaliny) = různý
rychlostní profil toku turbulentní x laminární
2. Chemického – Daná kinetikou reakce činidel s analyty
3. Molekulová difúze v MF a SF (chromatografie) - molekulová difúze v MF závisí na lineární rychlosti MF;
molekulová difúze v SF je daná různým prostupem (hloubkou prostupu) složky do vrstvy vázaní SF na nosiči a
různém zadržení v SF
 11.Radioanalytické metody
11.1 Jaké druhy detektorů ionizujícího záření znáte? Stručně
popište jeden z nich
 Radiometry – detektory ionizujícího záření
NESPEKTROMETRICKÉ DETEKTORY
 základní detekce částic nebo fotonů, měří pouze intenzitu záření (neřekne, o jaké částice se jedná,
jakou mají energii
 filmové a termoluminiscenční dozimetry, ionizační komory včetně Geiger-Müllerova detektoru,
dráhové dozimetry (sledují tok záření)
SPEKTROMETRY IONIZUJÍCÍ ZÁŘENÍ
 měří intenzitu v závislosti na energii záření (tj říkají, o jakou částici se jedná, jakou má energii)
 ionizační detektory s plynovou náplní -> ionizací plynu zářením vzniká proud elektronů, který se
zaznamenává
 scintilační detektory, polovodičové detektory, magnetické spektrometry

ZOBRAZOVACÍ DETEKTORY
 kamery – zobrazují prostorové rozložení intenzity záření
 fotografický film, luminiscenční stínítka, multidetektorové systémy

DRÁHOVĚ DETEKTORY ČÁSTICE

 zviditelňují či vyhodnocují dráhy pohybu jednotlivých částic v prostoru (včetně zakřivené
v magnetickém poli)
 získávají se informace o vlastnostech elementárních částic, jaderných a částicových interakcí

11.2 Vysvětlete princip scintilačního detektoru

 měří intenzitu v závislosti na energii záření
 Ionizující záření dopadá na scintilátor:
o Anorganický – monokrystal jodidu sodného aktivovaný thaliem (NaI (Tl))
o Organický (kapalný) – 2,5-difenyl-1,3-oxazol, 1,3,4-oxadiazol
 po absorpci záření vhodným materiálem (scintilátorem) dochází ke vzniku světelných záblesků
(scintilací) -> Dochází k excitaci a následné deexcitaci -> Energie se uvolní ve formě fotonů = záblesky
 záblesky se detekují na fotonásobiči
11.3 Jaké signály lze gama spektrometrií pozorovat ve spektru
radionuklidu, jenž při rozpadu emituje záření gama jediné
energie?
 Gama záření vzniká deexcitací vzbuzeného jádra (např. při předchozí jaderné reakci) nebo
izometrickým přechodem metastabilního jádra (mění se jen vnitřní energie jádra)
 Měření energií gama záření emitovaného radionuklidy přítomnými ve zkoumaném vzorku (např.
geologickém)

GAMA SPEKTRUM VZORKU = závislost četnosti emitovaných fotonů na jejich energii

 Radionuklid je charakterizován energiemi vyzařovaného gama záření a relativní intenzitou ->
kvantitativní a kvalitativní analýza
 Spektrální čáry jsou velice úzké -> jejich šířka je omezena rozlišovací schopností použitého
spektrometru
 Gama paprsky (γ ¿ prochází vzorkem a dochází k sekundárním interakcím, které se ve spektrech
projeví
137 ¿137 −¿¿
 Cs =Ba + β
¿137 137
 Ba = Ba + γ
 SEKUNDÁRNÍ INTERAKCE:
 Fotoelektrický jev (E < 100 keV)
o Detekce vznikajícího rentgenového záření (popř píky Augerových elektronů)
 Comptonův rozptyl (0,1 MeV < E < 1 MeV)
o Vytváří spojité pozadí spektra
 Vznik elektron-pozitronového páru (E > 1,022 MeV)

11.4 Vysvětlete princip fotoelektrického jevu, Comptonova

rozptylu a páru elektron-pozitron. Čím se poslední z nich
projevuje?
 Sekundární interakce gama záření
FOTOELEKTRICKÝ JEV (E < 100 keV)
 Úplná absorpce gama fotonu
 Gama foton vyrazí z látky silně vázaná
elektron z vnitřní slupky
 Zpětné zaplnění z vyšší slupky
rentgenová fluorescence x vznik
Augerova elektronu
 Vznik fotopíků a píků Augerova
COMPTONŮV ROZPTYL (0,1 MeV < E <
1 MeV)
 Srážka gama fotonu a elektronu slabě
vázaného v atomu
 Gama foton mění směr a část své energie předá elektronu = nižší energie gama fotonu (nepružný
rozptyl)
 Vytváří ve spektru spojité pozadí
VZNIK ELEKTRON-POZITRONOVÉHO PÁRU (E > 1,022 MeV)
 Průlet gama fotonu v dosahu Coulombické síly jádra (v blízkosti jádra)
 Anihilace = zánik gama fotonu (E= 1,022 MeV) a vznik dvou částic pozitron a elektron
 Následně pozitron anihiluj s jiným elektronem –> vzniká dvojice gama fotonů, které se šíří opačným
směrem stejným rychlostmi (hybnost je nulová) -> hybnost se předá zbylému jádru

11.5 Nakreslete a popište schéma gama spektrometru

 SCINTILÁTOR – princip viz. 2.
 FOTONÁSOBIČ = Dopad kvanta na diodu vyvolává emisi
většího počtu elektronů (tzv. sekundární emise), jejímž
výsledkem je znásobení počtu elektronů. Po sérii zesílení
proud elektronů dopadá na anodu = měření optického
signálu
 ZESILOVAČ – zesílí signálu
 VÍCEKANÁLOVÁLOVÝ ANALYZÁTOR – čítač napěťových
pulzů vyvolaných fotony. Jednotlivé kanály detekují pulzy
určité amplitudy. Výsledkem je histogram počtu pulzů
v jednotlivých kanálech, číslo kanálu je úměrné energii
fotonu

11.6 Proč lze naměřit absorpci gama záření pouze u pevných

vzorků?
 Gama paprsky procházejí pevným vzorkem a dochází sekundární interakci, která se projeví
v naměřených spektrech
 Při emisi vzorku je nutné zachovat hybnost ->
 Pevný vzorek se nehýbe, emitovaný gama foton se hýbe (má hybnost) -> ZZH -> musí se pohnut i
vyzářený gama foton
 Krystalická mříž -> hybnost se disipuje do mříže a nedojde k pohybu atomu -> ztráta energie ve
formě fononů -> nedojde k zpětnému rázu
 Atom v plynném stavu -> část hybnosti dopadajícího gama fotonu se předá molekulám plynu
(nejsou v pevné struktuře) -> energie emitovaného gama fotonu už není dostačující na excitaci
do vyššího stavu
 Tedy při absorpci a emitaci záření identickými volnými jádry (plyn) nepozorujeme takřka žádný
překryv spekter

11.7 Popište princip Mössbauerovy spektrometrie.

 Rezonanční gama spektrometrie (převážně pro kovy)
 Zaznamená velmi malé změny v energetických hladinách jader atomů (excitace protonů a neutronů
do vyšších stavů) v závislosti na jeho okolí (oxidační stav, chemická vazba, náboj atomu…)
 Velmi citlivá metoda – schopná rozlišit malé změny energie v jádru
 Pevný vzorek je vystaven gama záření -> dochází k excitaci jádra (absorpce a emitace jádra) -> Měří se
intenzita záření prošlá vzorkem -> projeví se záporným píkem
 Zdroj musí obsahovat stejné izotopy, jako jsou atomy v analyzovaném materiálu
 Emise nebo absorpce gama záření vede ke změně hybnosti daného jádra
 JADERNÉ INTERAKCE MOHOU ZPŮSOBOVAT:
o Izomerní posun = analogie k chemickému posunu u NMR (různá hustota elektronů
v okolí emitujícího a absorbujícího jádra)
o Kvadrupólové štěpení = u jader s kulově nesymetrickým rozložením náboje, štěpení
hladin v závislosti na jaderném magnetickém spinovém čísle
o Magnetické (hyperjemné) štěpení = interakcí s vnějším magnetickým pólem (zeemanův
efekt)
 Výhody:
 Lze sledovat změny v oxidačním stavu
 Efekty různých ligandů
 Magnetické okolí vzorku
 Nevýhody:
 Omezené množství gama zářič
 Možnost analyzovat pouze pevné vzorky
 Použití: (geologie = identifikace vzorků obsahující železo; biochemie = analýza metaloproteinů
obsahující železo (oxidační stav a množství přítomného železa)
 12.Bioanalytické metody
12.1 Jaké detekční techniky používají Bioanalytické metody?
Stručně popište princip jedné z nich.
DETEKCE PRŮBĚHU REAKCE
 Manometrické metody – dnes se téměř nepoužívají
 analýza uvolněného nebo spotřebovaného plynu (např CO2 při použití oxidoreduktas, CO2 nebo NH3
při použití lyas)

SPEKTROFOTOMETRICKÁ DETEKCE
 Používá se pro substráty či produkty s odlišnou absorpční oblastí v UV, VIS, IR
 Lepší je měřit nárůst koncentrace než její pokles (měření přímé metody)
 Vybírat vlnovou délku odpovídající maximální absorpci jedné složky
 Často ke sledování kofaktorů NAD+ (NADH absorbuje při 340 nm, NAD+ ne)

FLUORESCENČNÍ DETEKCE

 Založena na tvorbě fluoreskujících sloučenin v enzymové reakci

 citlivější

CHEMILUMINISCENČNÍ DETEKCE

 stanovení emitovaného záření z molekuly v excitovaném stav, který vznikl jako důsledek chemické
reakce
 A k 1 B k 1 X + hv
→ →

POLARIMETRICKÁ DETEKCE

 využití různé otáčivosti substrátů

 Využití u reakcí v oblasti cukerného metabolismu

ELEKTROCHEMICKÁ DETEKCE

 Potenciometrie, ampérometrie, coulombometrie, polarografie

RADIOMETRICKÁ DETEKCE

 Sledování radioaktivně označeného substrátu nebo produktu -> označené prvky se začlení o struktury

12.2 Popište princip libovolné spektrofotometrické metody

používající ke stanovení enzymů s kofaktory
 Enzym produkuje substrát pro spřaženou dehydrogenasovou reakci (popř. rovnou stanovení analytu,
který podléhá dehydrogenase)
 sledování oxidoredukčního kofaktoru NAD+ přímou
spektrofotometrickou metodou
 redukovaná forma NADH silně absorbuje při 340nm, zatímco
oxidovaná forma NAD+ nikoliv
 Nebo vodík z NADH předán na bezbarvou tetrazoliovou sůl, která se tím přemění na intenzivně
zbarvený formazán → proměření ve VIS
 Při stanovení laktátu je tedy možno buď proměřovat nárůst absorbance při 340nm, nebo se měření
převede do viditelné oblasti přidáním tetrazoliové soli a PMS a měří se intenzita zbarvení
 V obou případech je nárůst absorbance mírou původní koncentrace laktátu.

laktát + NAD+⃗
laktatdehydrogenasa pyruvát + NADH + H+

NADH + tetrazoliová sůl⃗

fenazinmethosulfat +diaforasa NAD+ + formazan

12.3 Jaký je princip radioimunoalanýzy? Jaké detektory se

používají?
 Princip vychází z kompetice (soupeření) radioaktivně značených antigenů a antigenů ze vzorku
 Na dané protilátky váží kompetitivně radioaktivní či vzorkové antigeny
 Následně se měří radioaktivita => ta je nepřímo úměrná koncentraci antigenu ve vzorku
 Vysoká selektivita -> imunochemické stanovení
 Vysoká citlivost – umožňují stanovení nižších množství antigenu nebo protilátky
 Detektory: nespektrometrické detektory, spektrometry ionizující záření, zobrazovací detektory,
Dráhově detektory částice

12.4 Vysvětlete princip následujících technik ELISA:

(ne)přímá,
(ne)kompetitivní
 Princip – značení antigenu enzymem -> tvorba
kovalentní vazby s protilátkou nebo
antigenem bez vnější změny enzymové
aktivity
 Heterogenní provedení – na spodu destičky se
imobilizuje antigen/protilátka

NEKOMPETITIVNÍ

 Na imobilizovanou protilátku se váže antigen

ze vzorku -> promytí systému -> na zachycený
antigen se váže enzymem značená protilátka -
> enzym katalyzuje reakci v roztoku ->
stanovení
 Stanovení antigenů s vysokou molekulovou
hmotností

KOMEPETITIVNÍ

 imobilizovaná protilátka -> přidání antigenu značeného enzymem a antigenu ve vzorku -> kompetice
 stanovení hormony a léky
12.5 Nakreslete a popište kalibrační závislost pro přímou a
nepřímou ELISA.
??? No idea

12.6 Vysvětlete princip diagnostických testů založených na

laterální chromatografii.
 Jednoduché a rychlé stanovení (výsledek rozlišitelný okem)
 Imunochromatografie -> podélný tok
 analyt vázán na částice – uhlíkaté, zlaté, křemičité
 Protilátka na membráně
 Vzorek se nanáší na podložku pro nanášení vzorku → vzorek vzlíná na konjugační zónu, kde se nachází
protilátka imobilizovaná na barevné nanočástici (např. zlaté, uhlíkové) → vzniká komplex antigen-
značená primární protilátka → komplex vzlíná k testovací linii
 Pokud vzorek obsahuje analyt, váže se tam na imobilizované primární protilátky (protilátky na analyt)
→ testovací linie se zbarví
 Kontrolní linie (KL) je tvořena
imobilizovanými sekundárními
protilátkami proti primárním
protilátkám → sekundární
protilátky vytváří komplex s
primárními označenými
protilátkami pocházející z
konjugační oblasti a vznikají tak dvě
linie (TL a KL) = pozitivní.
 Jedna linie (negativní linie) = test
negativní (reaguje jen kontrolní linie
s primárními protilátkami)
 13.Chemické senzory a biosenzory
13.1 Co je to chemický senzor? Jaký je rozdíl mezi
chemickým senzorem a biosenzorem?
 Zařízení převádějící nějaký chemický signál (složení vzorku, obsah přítomných analytů) na analyticky
využitelný signál
 například se jedná o vztah koncentrace analytu ve vzorku a měření libovolné optické závislosti
(absorbance, emise, rozptyl, …)
 Rozdíl mezi chemickým senzorem a biosenzorem je hlavně v použití různých selektorů:

CHEMICKÝ SENZOR
 Obsahuje chemosenzor = synteticky vyrobené nízkomolekulární látky schopné selektivní interakce
s analytem
 VÝHODA: vyšší odolnost ke změnám podmínek měření
 Porfyriny, kalixareny, korunkové ethery, cyklodextriny

BIOSENZOR
 Makromolekuly poskytující afinitní interakce s analytem
 VÝHODA: vyšší selektivita
 Enzymy, lektiny, protilátky, úseky nukleových kyselin, polypeptidy, aptamer (synteticky vytvořené
vlákno RNA či ssDNA), protilátky (poly, monoklonální), enzymy

13.2 Popište jednotlivé části chemického senzoru. Uveďte

příklad optického nebo elektrochemického senzoru –
popište princip jeho funkce.
CHEMICKÝ SENSOR
 Zařízení převádějící chemickou informaci (složení vzorku, obsah přítomných analytů) na analyticky
využitelný signál
 Aktivní vrstva = Molekulový/iontový selektor – interakce se sledovaným analytem -> fyzikálně-
chemická interakce (změna zabarvení, lomu světla, fluorescenční emise, náboj, vodivost …) -> projev
změny posílá signál
 Převodník – na základě dané fyzikálně-chemické interakce převádí chemický signál (změny) na signál
analyticky měřitelný signál.
 Procesor – zpracování signálu
TYPY SENZORŮ:

 Optické senzory – absorbance, reflektance, rozptyl, fluorescence

 Optická vlákna:
o Prostřednictvím optických vláken (světlovody) je optický signál veden na delší vzdálenost
(využití totální odraz)
o Měření systémů, které nejsou běžně přístupné
o Analýza vzorku – průchodem paprsku vzorkem nebo využití evanescentní vlny (ATR)
o Převedení na elektrický signál
o Například stanovení pH -> barva se mění podle kyselosti/zásaditosti -> mění se absorpční
schopnosti -> absorbuje se jiné záření procházející optickým vláknem
 Elektrochemické senzory – Voltametrické či potenciometrické měření, využití tranzistorů řízených
polem s chemickou vrstvou, plynové senzory
 Potenciometrie:
o Využití elektrod 1. druhu (kov ponořený do iontů svého kovu) -> napětí je přímo úměrné
logaritmu zinečnatých iontů -> změna koncentrace vyvolá přímo odezvu na napětí
systému
o Využití elektrod 2. druhu (prvek obalena nerozpustnou solí svého kovu, celé ponořeno do
roztoku proti iontů) -> napětí úměrné koncentraci proti iontů
o ISE (elektrody s potahovaným drátkem) -

13.3 Jak lze skleněnou elektrodu využít jako biosenzor?

 Stejně tak jako běžná skleněná elektroda měří koncentraci H+ iontů = pH
 Skleněnou elektrodu lze využít i jako biosenzor – sledujeme enzymatickou reakci při které se
mění pH
 Enzym se aplikuje na elektrodu a měří se za změny pH při průběhu reakce
 Imobilizace enzymů na elektrodách může být různá:
 Upevnění naneseného enzymu dialyzační membránou
 Fyzikální zachycení na povrch (polymerace gelu s enzymem na nylonové či silonové síťce
– snadná výměna sítěk)
 Přímá polymerace gelu s enzymem na elektrodě
13.4 Popište konstrukci a princip Clarkova čidla pro stanovení
kyslíku. V jakých aplikacích ho lze
využití?
 Řadí se mezi amperometrické senzory (detekce protékajícího
elektrického proudu)
 Měření závislosti protékajícího proudu mezi dvěma elektrodami při
konstantním napětí na množství elektroaktivního analytu (I = f(množství
analyty); U = konst.)
 Elektroaktivní analyt je v kapalné fázi
 U Clarkova čidla na (stanovení O2) se používá kovová elektroda (Au, Pt, Ag) překryta membránou o
určité permeabilitě kyslíku
Fd
P=
A∆ p
P = permeabilita plynu; F = objemový průtok plynu; d = tloušťka
membrány, A = plocha membrány; Δp = rozdíl tlaků na jedné a druhé
straně membrány
 Při stanovení kyslíku je mezi pracovní a referentní elektrodu vloženo
napětí U= 0,65 V
 Probíhá katodická redukce kyslíku na vodu = zaznamená protékající
proudu závislý na koncentraci O2
c ( O2 )
I =kzAP
d
K = konstanta; z = počet vyměněných elektronů (4); A = plocha měřící
katody; P = permeabilita plynu; d = tloušťka membrány

APLIKACE:

 Čidlo na stanovení O2
 Čidlo pokryté polyamidem se zakotveným enzymem (peroxidasa) =
měření glukosy, cholesterolu, močoviny, …
 Obdobné amperometrické senzory: Lambda sonda (měřící koncentraci
oxidů vzniklých při spalování v motoru aut); měření adrenalinu – enzym
polyfenoloxidasa

13.5 Vysvětlete, jakým způsobem ovlivňují

redukující plyny odezvu plynových senzorů Figaro (TGS
senzory)?
 Patří mezi amperometrické senzory
 K detekci reaktivních hořlavých, výbušných, jedovatých plynů (průmysl, doprava, bezpečnostní
systémy)
 Stanovení – H2, CH4, C3H6, CO, NOx, H2S, AsH3, SO2, NH3,
 Princip – pokles napětí na rozhraní sintrovaného SnO2 v přítomnosti redukujících plynů
 Na zúžených místech vrstvy SnO2 narůstá odpor prostředí, při absorpci redukujícího plynu se snižuje
bariéra (zmenšuje se odpor) -> systém se stává vodivý
 Měření závislosti protékajícího proudu na vloženém napětí (dochází k poklesu napětí na rozhraní
sintrovaného SnO2 v přítomnosti redukujícího plynu)

13.6 Popište princip elektronických nosů a jazyků.

 Na principu voltampérometrie
 Multikomponentní analýza – sada různě selektivní elektrod/elektrod z různého materiálu (senzorová
pole)
 Sleduje se změna proudu v závislosti na nastavovaném potenciálu
 Využití elektrodových polí pro vzorky plynné (nosy) a kapalné (jazyky) -> systém sady elektrod každý
s jinou odezvou, po kalibraci může přiřazovat vzorky analytu (např. druh piva)
 Vzniklé analytické signály jsou dále zpracovány (vyhodnoceny) prostřednictvím vícerozměrné analýzy
 14.Procesní analytická chemie
 Specifická oblast pro sledování procesů (analýza vstupů, meziproduktů i produktů v průběhu jejich
výroby)
 Speciální techniky, algoritmy vyhodnocení dat i způsoby vzorků

14.1 Vyjmenujte a charakterizujte typy procesní analýzy,

vyjmenujte jejich hlavní výhody a nevýhody.
OFF-LINE
 Vzorky transportovány do laboratoře -> ruční vzorkování
 V dávkovém zpracování, je-li počet vsádek malý a příprava vzorku či analýza obtížně
automatizovatelná, specializovaná
 Sofistikované přístroje, školený personál
 Prodlení spojené s dopravou vzorku, manuální vzorkování, nízká vzorkovací
frekvence

AT-LINE

 Přístroj umístěn v provozu (někde poblíž linky je laboratoř -> odebereme vzorek a
přeneseme do laboratoře) -> ruční vzorkování
 Jestliže částečná automatizace nevyžaduje zvláštní dovednosti, analýza na místě je
preferovaná
 Odpadají problémy transportu vzorku, přístroj upraven podle konkrétních potřeb
 Vyžaduje školený personál, agresivní prostředí, výsledky často nedostatečně aktuální,
manuální vzorkování, nízká vzorkovací frekvence

ON-LINE
 Automatický odběr vzorků přímo z výroby
 Vysoká vzorkovací frekvence
 Cena potřebného připojení, poruchy vzorkovacího systému

IN-LINE

 Bez odběru vzorku z procesu (nevzorkovat) -> měří se přímo z linky, reaktoru, procesu
(sondy)
 Odpadá odběr a příprava vzorku
 Významná úspora času, robustnost, přátelskost užití (možnost záměny
pracovníků), méně náchylná k poruchám, velmi vysoká vzorkovací frekvence
 Obtížná kalibrace, zanášení vzorků usazeninami

14.2 Vyjmenujte požadavky kladené na procesní analyzátory.

 Robustnost vzhledem k charakteru pracovního prostředí, teploty, vlhkosti, …
 Schopnost vzorkovat a analyzovat materiály za vysokého tlaku/teploty
 Materiály různého charakteru (viskózní či práškový), pracovat s nevodným prostředím, často
v agresivním prostředí
 Automatický sběr a zpracování dat, bez dohledu dny i týdny
 Stabilní dlouhodobá kalibrace, schopnost autokalibrace
 Obvykle méně univerzální, upravené pro určité měření
 Výroba z trvanlivých prvků, co nejméně pohyblivých prvků -> jednoduchost

14.3 Vyjmenujte prvky procesního analyzátoru a stručně jej

charakterizujte.
VZORKOVACÍ SYSTÉM (REPREZENTATIVNÍ VZOREK)
 Nutnost zabránit kontaminaci vzorku
 Přednost odběru vzorku v pohybu (kapaliny, plyny prostřednictvím ventilů u tuhých látek přímo
z transportéru)
 Velikost vzorků není libovolná (ovlivněna zrnitostí, homogenitou, obsahem analytu, …)
 Plyny => plynová pipeta
 Kapalné látky => odběr z více míst, hloubek a následné spojení do reprezentativního vzorku
 Tuhé látky => u nehomogenních odběr 2% celkové hmotnosti – následuje mletí, kvartace, …

SYSTÉM PŘÍPRAVY VZORKU A SYSTÉM ÚPRAVY VZORKU PRO PODMÍNKY PŘIJATELNÉ ANALYZÁTOREM
 Filtrace, ředění, úprava pH nebo teploty (předúpravy filtrací)
 Řídí se specifiky a požadavky každého jednotlivého stanovení a použité analytické koncovky

ANALYZÁTOR ČI SENZOR (ANALÝZA)

 Měření odpovídající fyzikálním a chemickým vlastnostem analytu, skupenství a chování
 Plyny:
o Elektrochemické metody – analýza plynů (Clarkovo čidlo)
o Spektrofotometrické metody – UV, VIS, IR
 Kapaliny (často měření in-line):
o Elektrochemické metody – Potenciometrie, ISE, skleněná elektroda, Voltamperometrie,
Amperometrie
o Spektroskopické metody – pomocí vláknové optiky: transmisní měření, ATR měření (IR),
fluorescence, reflektance
o Nepřímé měření pomocí vstřikovacích analýz: průtoková injekční analýza (FIA), sekvenční
injekční analýza (SIA), kontinuální průtoková analýza (CFA) segmentovaná průtoková
analýza (SFA)

VÝSTUP DAT DO ŘÍDICÍHO SYSTÉMU

 Kalibrace
 Zpracování dat z různých metod prostřednictvím datových softwarů

14.4 Jaké analytické metody lze použít v procesních

analyzátorech:
 Elektrochemické metody: Potenciometrické (ISE (fluoridy); skleněná elektroda (pH),
potenciometrická titrace), amperometrické = analyzátory plynů (plynové senzory FIGARO),
voltametrické = Clarkovo čidlo (O2)
 Spektrofotometrické: Měření v UV, VIS, IR – transmisní měření, ATR, fluorescence, reflektance
 Nepřímé měření vzorků kapalin pomocí vstřikovacích analýz: průtoková injekční analýza (FIA),
sekvenční injekční analýza (SIA), kontinuální průtoková analýza (CFA) segmentovaná průtoková
analýza (SFA)