1.

Nejistoty a testování hypotéz v analytické chemii

1.1. Co je to validace?

= je potvrzení zkoumáním a opatření objektivního důkazu o tom, že jsou plněny určité požadavky pro
uvažované použití
 proces, při němž se určuje vhodnost použití dané analytické metody pro získání reprezentativních dat
 při validaci posuzujeme, zda jsou parametry analytické metody srovnatelné s požadavky na analytická data (tedy
na výsledky)
 posuzovaná podle vztahu mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi analytické metody
 závisí na limitním množství analytu, které chceme stanovit

1.2. Vyjmenujte alespoň 5 důležitých charakteristik analytické metody.

Preciznost, přesnost, pracovní a lineární rozsah, citlivost, LOD, LOQ, robustnost, selektivita

1.3. Charakterizujte alespoň 2 charakteristiky analytické metody.

PŘESNOST = těsnost souhlasu mezi výsledek zkoušky a přijatelnou referenční hodnotou

PRECIZNOST = těsnost souhlasu mezi nezávislými výsledky zkoušky za předem stanovených

podmínek

PRACOVNÍ A LINEÁRNÍ ROZSAH = koncentrační rozsah, ve kterém lze dosáhnout přijatelné

preciznosti a jeho podoblast lineární kalibrační závislosti (linearita – lineární v oblasti pracovního
rozsahu)

MEZ DETEKCE (LOD = limit of detection) = nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být
spolehlivě detekováno

MEZ STANOVISTELNOSTI (LOQ = limit of quantification) = nejnižší množství analytu ve vzorku, které
může být spolehlivě stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou spolehlivostí

SELEKTIVITA (metody, reakce, činidla) = schopnost rozlišit chemické nebo fyzikální vlastnosti
jednotlivé složky (analytu) ve směsi jiných složek
 skupinové, selektivní, specifické
ROBUSTNOST = necitlivost metody vůči malým odchylkám od standardního operačního postupu
CITLIVOS METODY = podíl změny analytického signálu a odpovídající změny měřené veličiny
(směrnice kalibrační závislosti y=f(c), dy/dc)

1.4. Jaký je rozdíl mezi LOD a LOQ?

 LOD (limit of detection) - nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě
detekováno; je roven trojnásobku výběrové směrodatné odchylky (či trojnásobku šumu)
Y LOD =Y blank +3 s blank
LOD=(Y LOD −b 0)/b 1

 LOQ (limit od quantification) - nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být
spolehlivě stanoveno jako exaktní hodnota; je roven deseti násobku výběrové směrodatné
odchylky (či desetinásobku šumu)
Y LOQ=Y blank +10 s blank

LOQ=(Y LOQ −b 0)/b1

1.5. Rozdíl mezi chybou a nejistotou?

 chyba měření = rozdíl mezi výsledkem měření a skutečnou (referneční) hodnotou měřené
veličiny
 nejistota měření = charakterizuje jakost výsledku měření a umožňuje porovnávat výsledky
Není číslo, ale interval, ve kterém se s určitou pravděpodobností nachází skutečná hodnota.

1.6. Co je standartní nejistota typu A; B?

Typ A = standartní nejistota určena výběrovou směrodatnou odchylkou  předpokládá se
normalizované (normální; Gaussovo) rozdělení

Typ B = standartní nejistota vyhodnocena jinak než výběrovou směrodatnou odchylkou, jiné druhy
rozdělení (rovnoměrné, trojúhelníkové)

1.7. Uveďte definici zákona o šíření nejistot.

Šířením nejistot se rozumí efekt jednotlivých vlivů nejistot proměnných pocházející z dané funkce
měření. Znalostí těchto nejistot lze určit kombinovanou nejistotu měření.
 např. rovnice měření: 𝒄𝒂𝒏𝒂𝒍𝒚𝒕 = 𝒎/𝑴𝑽
 na nejistotě koncentrace se podílejí 3 parametry (každý vlastní nejistotou) - zisk kombinované nejistoty
  hmotnost, molární hmotnost a objem (na nejistotě objemu se podílejí další parametry – teplotní
roztažnost, opakovatelnost, kalibrace)

1.8. Jak souvisí hladina významnosti a spolehlivost u testování hypotéz? Oba pojmy vysvětlit.
 Hladina významnosti (α) = pravděpodobnost, že se zamítne nulová hypotéza, ačkoliv platí
Určuje interval, který s pravděpodobností odděluje od kritických intervalů <ap, bp> (interval prakticky možných
hodnot)

 Hladina spolehlivosti (1-α) = je pravděpodobnost, že se nezamítne nulová hypotéza, nulová

hypotéza platí

1.9. Jaký test zvolíte při testu shody dvou výsledků analýzy, jaké při testu tří výsledků?

a) Test shody dvou výsledků analýzy – dvouvýběrový studentův t-test

 určení testovacího kritéria
 určení kritické hodnoty tkrit
 pokud je hodnota testovacího kritéria větší než hodnota kritická, nulovou hypotézu H o s (1-
α).100% zamítáme
 existuje α.100 % pravděpodobnost zamítnutí nulové hypotézy Ho, i když platí = chyba I. druhu

b) Test shody tří výsledků - Analýza rozptylu (ANOVA)

 více než dva výsledky porovnání
 určení tzv. F testovacího kritéria
 porovná s kritickou hodnotou Fkrit
 pokud je hodnota testovacího kritéria větší než hodnota kritická, nulovou hypotézu H o s (1-
α).100 % zamítáme

1.10. Definujte chybu I. druhu a II. druhu a sílu testu

Chyba I. druhu - nulová hypotéza platí, přesto jí zamítneme (falešně pozitivní výsledek)
Chyba II. druhu - nulová hypotéza neplatí, přesto jí nezamítneme (falešně negativní výsledek)

Síla testu – je číslo od 0 do 1 a udává pravděpodobnost, že při neplatnosti nulové hypotézy dojde k
jejímu zamítnutí (odhalení neplatnosti nulové hypotézy). Čím vyšší je číslo, tím lépe – s vyšší
pravděpodobností lze neplatnost nulové hypotézy zamítnout.
2. Vibrační spektrometrie II

2.1. Co jsou charakteristické vibrace funkčních skupin v IR spektrech?

 slouží k interpretaci IR spekter  nalezení strukturního motivu a funkčních skupin

 k interpretaci slouží tabulky charakteristických funkčních skupin

 Jednotlivé funkční skupiny se ve spektru projevují různě, a tak lze rozborem IR spektra zjistit
přítomnost jistých funkčních skupin v molekule nebo vyloučit jejich přítomnost.

 Vibrace skupiny nebo vazby jsou pak ovlivňovány pouze v malé míře ostatními atomy v
molekule. Proto se poloha absorpčních pásů a jejich intenzita, kterými se funkční skupiny
projeví v IR spektru, příliš neliší je-li vázaná v různých molekulách.

2.2. Jak vypadá schéma FT-IR v NIR a MIR?

2.3. Jak je v reflexních technikách definována reflektivita?

 reflektivita (odrazivost) = je optická vlastnost materiálu, která popisuje, jaké množství světla
se od materiálu odrazilo v poměru k množství, které na materiál dopadlo
 závisí na:
o polarizaci záření
o materiálu (chemickém složení)
o struktuře
o vlnové délce dopadajícího a odraženého světla

2.4. Jaké skupenství lze měřit DRIFT technikou?

 pevné/práškové vzorky, silně absorbující vzorky (nutné vysoké ředění)
 vyžaduje minimální přípravu vzorku

2.5. Jaké je schéma DRIFT spektrometru?

2.6. Jaké typy pásů lze pozorovat v NIR a MIR?
NIR
 spektra obsahují málo intenzivní přechody
 kombinační pásy a svrchní tóny (tzv. vyšší harmonické přechody = overtony)
 Δν= 2;3;4 ,…
MIR
 charakteristické vibrace funkčních skupin + oblast otisku palce
 molekulární vazby – valenční, deformační
 spektra obsahují převážně signály odpovídající normálním (fundamentálním) přechodům
 Δν=1

2.7. Pro jaký typ analýzy (kvalitativní/kvantitativní) je NIR spektrometrie vhodná?

 vhodná pro kvalitativní analýzu
o rychlost analýzy během sekund; nedestruktivní analýza, možná i ve skleněných obalech
o kontinuální třídič plastového odpadu; zemědělství; farmaceutický či petrochemický průmysl

 nevhodná pro stopovou analýzu

2.8. Pomocí diagramu energetických hladin popište vznik Ramanova spektra, a vysvětlete Stokesův
a anti-Stokesův rozptyl.

RAMANOVO SPEKTRUM
 vznik Ramanova spektra je důsledkem přechodu mezi vibračním stavem a virtuální hladinou
 jedná se o změnu polarizace molekuly při neelastickém rozptylu záření (změna en. – změna vln. délky)
 ozáření vzorku monochromatickým zářením (VIS/NIR) z laserového zdroje  měření odezvy molekul
vzorku, záření rozptýlené vzorkem a změny vlnové délky (kmitočet, vlnočet)
Ramanova interakce (neelastický rozptyl) vede ke dvěma možným jevům:

a) Materiál absorbuje energii a emitovaný foton má nižší energii než foton absorbovaný. Tato
možnost je označována jako Stokesův rozptyl. Foton emitovaný má větší vlnovou délku.

b) Materiál ztratí energii a emitovaný foton má vyšší energii než foton absorbovaný. Tato možnost je
označována jako anti-Stokesův rozptyl.

Rozdíl energií mezi absorbovaným a emitovaným fotonem koresponduje s energii mezi dvěma
rezonančními stavy materiálu a je nezávislý na absolutní energii fotonu.

2.9. Jaká podmínka musí být splněna, aby vibrace byla aktivní v Ramanově spektru?
 v Ramanově spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou polarizovatelnosti molekuly
 v IR spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou dipólového momentu molekuly

da
≠ 0 → Ramanovo spektrum
dQ
dμ
≠ 0 → IČ spektrum
dQ
Q – normální souřadnice, a - polarizovatelnost molekuly, µ - dipólový moment

2.10. Jaký je rozdíl mezi normálním a rezonančním Ramanově spektru?

 na rozdíl od normálního Ramanova spektra je rezonanční Ramanovo spektrum odlišné od
polohy virtuální hladiny
 virtuální hladina je položena v energetickém diagramu výše
 energeticky podobné excitovanému stavu elektronových přechodů
 výhoda: zesílení intenzity Ramanových pásů – rezonanční rozptyl
 nevýhoda: emise energie fluorescencí
 charakteristická emisní intenzita Ramanova spektra dovoluje pracovat s koncentrací 10-6
mol/l

2.11. Jak lze potlačit fluorescenci v Ramanově spektru?

 volbou vhodné vlnové délky zdroje záření  použití λ v NIR  nestačí na excitaci
fluorescence
 několik typů laserů – výběr optimálního
 důležité je při měření odstranit excitační záření – Rayleighův rozptyl – prostřednictvím tzv.
notch filtru (odfiltruje jen exitační linii); hranový filtr (odfiltruje anti-Stokesovy linie)
3. NMR spektrometrie 2

3.1. Pomocí diagramu vysvětlete pulzní sekvenci jednoduchého NMR experimentu.

 nejjednodušší možná pulzní sekvence obsahuje pouze jeden pulz a je vhodná pro měření
libovolného jádra bez ozařování jiných jader. Při akumulaci spekter se tato pulzní sekvence stále
opakuje a FIDy získané při každé akvizici (snímání dat) se sčítají.

Vývoj spinového systému v průběhu tří částí této sekvence:

1. Přípravná perioda d1 (s), působení vnějšího magnetického pole
2. 90° pulz označený obdélníkem, protéká proud s frekvencí tvořící další
mag. pole, magnetizace jednotlivých sloučení rotují kolem osy z
3. Snímání dat (akvizice), označuje se trojúhelníkem, rotující mag. momenty
jader indukují v měřící cívce elektrický proud, detekce FID

3.2. Jakou informaci je možné získat ze spin-spinové interakce?

= vzájemná interakce magnetických momentů hybnosti μ různých neekvivalentních vodíků (mluvíme-li o H-NMR)

 lze vyčíst informaci o štěpení signálu – umožňuje identifikovat, jak jsou jednotlivé funkční
skupiny rozmístěny v analyzované molekule (vzájemně se štěpí jen sousední atomy)

 důležité informace o struktuře analyzované látky

 přenášené vazebnými elektrony
Interakce spinů vede ke štěpení signálů na multiplety (poměr intenzit – Pascalův trojúhelník)
3.3. Pro dané molekuly měřené 1H-NMR uveďte: a) počet signálů; b) relativní integrální intenzity;
c) multiplicitu všech signálů

3.4. Kolik signálů výše/níže uvedených látek je možné pozorovat v 13C spektrech s protonovým
dekaplinkem?
 POČET SIGNÁLŮ
POČET DIGNÁLŮ 13C S MULTIPLICITA
NÁZEV STRUKTURA
1H PROTONOVÝM
DEKAPLINGEM

ethylfenylacetát 4 7 S, tr,kva, arom s

methylpropionát 3 4 S, tr,kva

vinylacetát 4 4 S, 4x dub, kva

2-chlropropan 2 2 Kvi, dub

1,3,5 – trimethylbenzen 2 3 2x s

S, arom podle
1-chlor-2- methoxybenzen 5 6
polohy ortho

S, arom podle
1-chlor-3- methoxybenzen 5 7
polohy metha

S, arom podle
1-chlor-4- methoxybenzen 3 5
polohy para

3.5. Vysvětlete rozdíl mezi podélnou (spin-mřížkovou) a příčnou (spin-spinovou) relaxací. Jakými
parametry jsou charakterizovány?

Podélná (spin-mřížková) relaxace

 podstata: obnovení rovnovážného stavu přenosem energie excitovaného stavu do atomů a molekul, které
dané jádro obklopují
 obnovení velikosti magnetizace v ose z
 na počátku měření koná jádro precesní pohyb (lze si představit rotaci kolem osy z)
 pohyb se dá popsat vektory, na počátku měření je velikost vektoru Mo maximální
  při aplikaci RF pulzu dojde ke zmenšení tohoto vektoru 1) díky vektorům o stejné velikosti, ale
orientovaných v opačném směru, po dokončení pulzu dochází k relaxaci jader 2) až 3) do původního
vektoru Mo

Příčná (spin-spinová) relaxace

 dipól-dipól interakce mezi jednotlivými jadernými spiny, kdy dochází k postupné dekoherenci (soudržnost)
precesních pohybů vektorů magnetizace jednotlivých jader
 vektory orientovány do jednoho směru, zde popsány v ose y (Mo je na začátku experimentu minimální, při
aplikaci RF pulze naopak maximální)
 později dochází k relaxaci jader, návrat vektorů do různých směrů - výslednice Mo nulová

3.6. Vysvětlete techniky „návrat po inverzi“ a „spinové echo“

Návrat po inverzi
 slouží k měření relaxačního času T1
 s rostoucí teplotou a koncentrací roste rychlost relaxace (kratší T1)

 počátek experimentu  excitace pulzem převrácení o 180°

 navrácení relaxace  následný pulz převrácení o 90° (výhodné měření)

Spinové echo
 měření času T2
 dochází k rozšíření čas – linie jsou rozšířeny nespektrálními jevy, které je nutné odfiltrovat

 excitace o 90°  dekoherence vektorů

 převráceno pulzem o 180°(měření času)
 dohasínání

3.7. Jakou informaci o systému s probíhající chemickou výměnou lze získat?

Informace, které lze získat

o rychlostní konstanty, termodynamické konstanty (entalpie, Gibbsova energie, entropie, změna
konformace – vaničková, židličková; apod)
4. Hmotností spektrometrie 2

4.1. Proč pracují hmotností separátory ve vakuu?

Dochází k „naředění“ iontů a nedochází ke kolizím a vzájemné výměně energií

4.2. Jaký je princip ionizace FAB?

FAB = Fast Atom Bombardment / Bombardování rychlými atomy

 polární analyt v polární kapalné matrici (vhodná pro větší molekuly, které nelze převést do
plynného stavu – peptidy, proteiny, mastné kyseliny, surfaktanty, polysacharidy)
 ionizace absorpcí energie proudu urychlených atomů vzácného plynu (Xe, Ar, Ne)
 rychlené atomy se získají kolizí s primárně vytvořenými ionty téhož prvku
 vzorek je jako tenký film na kovové podložce

 Nejdříve se proudem elektronů generují ionty vzácného plynu. Ty jsou elektrostatickým polem urychleny – předání
elektroneutrálním atomům (stejného prvku) - vysoká energie = bombardován vzorek

4.3. Jaké znáte techniky ionizace za atmosférického tlaku? Jednu vysvětlete.

 elektrosprej (ESI)
 chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI – atmospheric pressure chemical ionization)
 fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI – atmospheric pressure photoionization)
 indukčně vázaná plazma

4.4. Jakým způsobem dochází k ionizaci vzorku metodou APCI?

 ionizace rozpouštědla (nejčastěji vody) koronovým výbojem
 přenos protonu nebo náboje na analyt (analyt je jako roztok přiváděn do rozprašovače
s dusíkem)
 vznik iontů s nábojem +1/-1 (např. H3O+)
4.5. Nakreslete schéma TOF s reflektronem a vysvětlete důvod použití reflektronu.
TOF = Time Of Flight = Průletový separátor
 ionty jsou urychleny v iontovém zdroji – různě velké ionty stejného náboje mají různou rychlost)
 pulzní vstup iontů do separátoru, bez omezení rozsahu m/z

a) Lineární
- průchodnost až 90%
- ionty vstupují s distribucí kinetické energie, což zhoršuje hmotnostní rozlišení

b) S reflektronem
- průlet iontů do elektrostatického pole reflektronu, změna směru dráhy, sjednocení kinetické energie
iontů stejného náboje
-zlepšení hmotnostního rozlišení

4.6. Jaké síly působí na ionty v orbitrapu?

 elektrostatický separátor
 oscilace iontů daná rovnováhou mezi odstředivou a dostředivou silou elektrostatického pole

4.7. Jaké měřící módy jsou možné v MSn?

Vícestupňová analýza MSn je separace vybraných iontů následovaná řízenou fragmentací a analýzou
vzniklých sekundárních fragmentů.

Měřící módy
1) měření produktových iontů (product ion scan): detekce F+ - strukturní analýza iontů P+
2) měření prekurzorových iontů (precursor ion scan): detekce všech P+, které dávají vybraný F+ -
hledání fragmentu typického pro určitou skupinu látek (methylestery m/z=74, alkylaromáty
m/z=91 apod.)
 3) měření neutrálních ztrát (neutral loss scan): měření všech P+, které svou fragmentací poskytují
určitou neutrální ztrátu
4) měření vybraného přechodu reakce (selected reaction monitoring): registrace vybraných P+ a
F+; umožňuje snížit LOD

4.8. Popište konstrukci spektrometru pohyblivosti iontů.

IMS = Ion Mobility Spectrometry

4.9. Vysvětlete princip spektrometru pohyblivosti iontů.

IMS = Ion Mobility Spectrometry
 ionizace analytu následovaná separací v trubici s elektrostatickým polem, kterou v opačném směru
proudí kolizní plyn
 pulzní vstup iontů z iontového zdroje
 kolizemi s neutrálními molekulami plynu se rychlost pohybu iontů směrem k detektoru snižuje.
 separace podle náboje, velikosti a tvaru iontů
 výsledkem opakované akcelerace a zpomalení (vlivem kolizí) je rovnoměrný pohyb iontů směrem k
detektoru
 5. Spřažené techniky I
5.1. Jakým typem gradientu se nejčastěji řídí eluce látek v GC a jakým v LC?
GC
Nastavením teploty izotermální/teplotní gradient
 teplota je důležitá proměnná v plynové chromatografii
 pokud je teplota kolony během analýzy vzorku konstantní, jedná se o isotermální analýzu
 pro analýzu vzorku multikomponentních směsí látek s rozdílnými body varu je vhodné použít teplotního
gradientu, kdy se teplota kolony během analýzy bude měnit podle vytvořeného teplotní programu
 výhodou použití teplotního gradientu je zlepšení tvaru chromatografických píků (zúžení signálu, vyšší
citlivost) a výrazné zkrácení doby analýzy

LC
Řízení eluce pomocí izokratické/gradientové eluce

 Izokratická – koncentrace (složení) mobilní fáze se nemění

 Gradientová – koncentrace (složení) mobilní fáze se mění (změna složení mobilní fáze usnadňuje eluci látek)

5.2. Proč při spojení GC-MS se používá jako mobilní fáze helium spíše než vodík a dusík?
 na volbě nosného plynu závisí separační účinnost chromatografické kolony, helium zajišťuje dobrou
užitečnost při analýze, na druhou stranu je nákladnější než ostatní nosné plyny
 nedochází k ionizaci He v iontovém zdroji

5.3. Jaké ionizační techniky lze použít u GC-MS a u LC-MS? Stručně je popište.

GC-MS
 ionizace v plynné fázi
 elektronová ionizace (tvrdá)
o nejpoužívanější
o energie elektronů 70 eV
o knihovny spekter
o založena na principu předávání energie letících  elektrosprej (ESI)
elektronů molekulám analytu
o nejčastěji získáváme kladně nabitý radikál
molekuly a jeho bohaté fragmentační spektrum
 chemická ionizace (měkká)
o nejprve je ionizován reakční plyn (CH 4 CH5+;
NH3 NH4+)
+ +
o pseudomolekulární ionty (M+1) , (M-1) , adukty,
negativní ionty
o menší stupeň fragmentace
LC-MS
 rozhraní s nekonečným pásem (Moving Belt Interface)
 rozhraní s proudem částic (Particle Beam Interface)
 kontinuální FAB
 chemická ionizace za atmosférického tlaku
 fotoionizace za atmosférického tlaku
o poměrně univerzální
o ionizace od středně polárních molekul až po ionty
o ionizace probíhá aplikací silného elektrického pole
na elektrodu za atmosferického tlaku
o tvorba nabitých kapiček – aerosolu na hrotu
elektrody
5.4. Jaké tři režimy sběru dat se užívají ve spojení GC-MS nebo LC-MS?

1) skenování: záznam spektra ve vybraném rozsahu m/z

 nižší rychlost – lepší LOD i citlivost
 chromatogram jako časová závislost celkového proudu (TIC, total ion current)
 rekonstruovaný chromatogram (RIC, reconstructed ion current)
2) sledování vybraného iontu (SIM, selective ion monitoring))
 zvýšení selektivity, lepší LOD i citlivost
3) sledování vybrané reakce (SRM)
 v kombinaci s vícenásobnou MSn analýzou

5.5. Vysvětlete pojem hmotností kalibrace v MS.

 kalibrační látky používané v MS  slouží jako standardy k seřízení kalibračního rozsahu, jakož i
relativní intenzity MS od nízké k vysoké hmotnosti látek
 zvláště důležité pro MS v kombinaci s kvadrupólem
 nejpoužívanější kalibrační sloučenina je FC-43, známá také jako Perflourotributylamin

5.6. Jak je realizováno spojení GC-IR s průtočnou celou?

 identifikace a kvantifikace těkavých látek ve složitých směsích

 rychlé měření FTIR spekter v průtočné cele
 10–20 (40) cm – délka
 vnitřní průměr cca 1-3 mm
 Vyhřívané
 IR propustná okénka na koncích
 pozlacené boční stěny – světlovodný systém
 měření spektra par – rotačně-vibrační spektrum
 možno změřit desítky ng analytu
6. Spřažené techniky II

6.1. Které částice se účastní ionizace plazmatem v technice ICP? Které tři mechanismy probíhají?

6.2. Jak jsou ionty převáděny z ICP do MS?

ICP MS

vzorkování = soustava vzorkovací a odběrové clony – zachovává složení proudu iontů, omezuje jejich
distribuci kinetické energie a omezuje vznik polyatomických iontů
fokusace = před vstupem do MS – prostřednictvím iontové optiky, musí zabránit rozptylu iontů (jsou stejné
polarity, mají tendenci se odpuzovat)
separace = kvadrupólový separátor (MS)

6.3. Jaké znáte zdroje spektrálních interferencí v ICP – MS

1) isobarické ionty = ionty se stejnou nominální hmotou, ale odlišené látky N2, CO, C2H4
2) dvojnásobně nabité ionty
3) polyatomické ionty
6.4. Popište kroky korekce spektrální interference pomocí známého poměru přirozeného zastoupení
dvou izotopů.
 vzájemná relativní četnost (intenzita) izotopů prvků vyskytujících se v přírodě je konstantní

6.5. Vysvětlete roli kolizní cely užívané v ICP-MS.

 eliminace spektrálních interferencí, jenž zhoršují meze detekce některých prvků

1. chladné plasma – plasma generováno při nižší energii (čím nižší teplota, tím méně polyatomických
sloučenin argonu) – obtížně optimalizovatelné, problémy s matricí
2. kolizní/reakční cela – reakční nebo kolizní disociace polyatomických částic reakcí s kolizním plynem
(H2, He nebo NH3)

3. diskriminace kinetickou energií – polyatomické ionty se sráží častěji než jednoduché ionty, jejich E kin
klesá rychleji

6.6. Co je principem eliminace interferencí v kolizní cele s diskriminací kinetickou energií?

6.7. Krátce vysvětlete princip ionizace v cele s doutnavým výbojem.

GD-MS
 doutnavý výboj (glow dischrage) u povrchu katody v prostředí s inertním plynem o nízkém tlaku
 na povrch katody je fixován tuhý vzorek
 kolizním plynem je Ar o tlaku 1,3 – 1,6 kPa a proud 0,1 – 0,2 A
 geometrie GD zdroje: jehlová katoda / plošná katoda
 páry vzorku vstupují do zóny výboje, kde dochází k ionizaci
 ionizace elektrony a Penningova ionizace
 analýza povrchu tuhých vzorků (lze analyzovat tuhé i kapalné vzorky)
 vysoce stabilní iontový zdroj
 kvantifikace – matricový element jako vnitřní standard
 vytvořené kladné ionty, které vznikli kolizemi s elektrony odprašují povrchové atomy vzorku
 následuje hmotností spektrometrie (detekce ionizovaných atomů vzorku)

6.8. Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu těkavé metaloorganiky v atmosféře?
Vysvětlete proč.
Jelikož se jedná o těkavou složku, preferovala bych separaci pomocí plynové chromatografie (GC) a
následně s koncovkou (MS) - elektronová ionizace = její výhoda je v tom, že tato spektra lze snadno
analyzovat prostřednictvím knihoven spekter
GC-MS (přesnější GC-ICP-MS)

6.9. Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu metaloproteinů ve vzorku buněčné kultury?
Vysvětlete proč.
Permaeční chromatografie (SEC) na izolace frakce metaloproteinů; (ICP -MS) lze sledovat atomy, které
jsou cílem naší analýzy = vyskytujících se v metaloproteinech (Fe, Cu, Zn, … )
Lze použít u (ICP -MS) standardy metaloproteinů (s daným prvkem) o známých koncentracích
SEC-ICP-MS
7. Povrchová analýza I

7.1. Jaké techniky patří do skupiny fotoelektronové spektrometrie? U jedné z nich vysvětlete princip
emise fotoelektronů.
 rentgenová fotoelektronová spektrometrie (XPS)
o analýza tuhých, kapalných i plynných vzorků
o fotoelektrony neuniknou z hloubky větší než 1-5 nm
o spektrometr měří kinetickou energii emitovaných elektronů
o kinetická energie elektronů má vztah k vazebné energii elektronů nebo energii potřebné
k odstranění elektronu z jeho orbitalu (vyšší vazebné energie znamenají pevnější vazbu)
o fotoelektrony jsou separovány podle své kinetické energie, detektor registruje počet elektronů
dané energie
o aby povrch vzorku zůstal čistý je třeba ultra vysoké vakuum (až 10-8 Pa)
 excitace fotony, detekce elektronů
 analýza pevných tuhých vzorků (vzorky ve vysokém vakuu)
 ultrafialová fotoelektronová spektrometrie (UPS)
 elektronová spektrometrie pro chemickou analýzu (ESCA)

7.2. Jak se liší UPS od XPS?

 UPS: používá UV záření o energiích 10-45 eV  analýza valenčních elektronů
 XPS: používá rentgenové záření o energiích 200-2000 eV  analýza elektronů z vnitřních slupek

7.3. Nakreslete Bohrův diagram sodíku (jádro a všechny elektrony). Pokud dojde k interakci
rentgenového záření s jedním elektronem 1s, vysvětlete vznik píku ve fotoleketronové a Augerově
spektrometrii.

Fotoelektron sloužící k excitaci

 následuje zaplnění elektronu z vyšší hladiny (rentgenová fluorescence), detekce charakteristické
energie rentgenového záření hν
 nebo může nastat zaplění elektronu z vyšší hladiny, vzniklá energie se využije na vyražení dalšího
elektronu (Augerův elektron)
Spektrum:
  Rentgenová fluorescence: fotoelektrony jsou detekovány podle své kinetické energie, měřená závislost:
intenzita = f (vazebné energie) - čím silněji vázaný elektron (jako ten 1s např.) je potřeba vyšší vazebné
energie na excitaci
 Augerův elektron = projeví se ve stejném spektru, typický je spíše pro atomy s nižším atomovým číslem.
Nicméně, energie Augerova elektronu nezávisí na energii zdroje. Snadno odlišitelný od signálu XPS. Projeví
se ve spektru jako extrapík. U Sodíku očekáváme signály pro vazebné energie elektronů 1s,2s,2p,3s. Přesto
má ale 5 signálů.

7.4. Které tři procesy probíhají po vyražení vnitřního elektronu? Pomocí diagramů energetický hladin
vysvětlete všechny tři.

Excitace fotony i elektrony – vyražení vnitřního elektronu

 Relaxační konkurující mechanismy
o zaplnění elektronu z vyšší slupky = rentgenová fluorescence
o vznik Augerova elektronu – vzniklá energie se využije na vyražení jiného elektronu
 dojde ke stabilizaci

7.5. Jak lze identifikovat signály Augerových elektronů ve spektrech XPS? Uveďte vzorec popisující
kinetickou energii fotoelektronů a Augerových elektronů.
 XPS spektra obsahují i signály Augerových elektronů
 lze je snadno identifikovat použitím jiného zdroje záření než při naměření původního spektra
 porovnáním spekter lze Augerovy elektrony identifikovat: zatímco signály (energie) Augerových
elektronů se nezmění, energie ostatních fotoelektronů se posunou
 𝐸𝑘𝑖𝑛=𝐸𝐾−𝐸𝐿1−𝐸𝐿2,3  rozdíly energetických hladin jednotlivých slupek

7.6. Jak energie Augerových elektronů závisí na atomovém čísle? Zakreslete do diagramu.
 konkurující proces rentgenové fluorescence
  emise Augerových elektronů převažuje u nízkých atomových čísel (Z)
 energie Augerova elektronu nezávisí na energii zdroje

7.7. Jaké vlastnosti mohou být pomocí ESCA identifikovány? Jinými slovy, jaké chemické vlastnosti
ovlivňují chemický posun v ESCA spektru?
ESCA = více rozlišená XPS
 umožňuje získat informace o chemickém stavu (např. lze pozorovat čtyři různé vazebné energie
elektronu uhlíku 1s1 u 291 eV)
 pokud se mění rozložení elektronové hustoty v blízkosti valenčních elektronů vlivem tvorby
chemických vazeb, mění se elektrostatický potenciál (a tudíž vazebná energie) elektronů daného
atomu
 signály v XPS spektrech charakterizují jednotlivé atomové a molekulové orbitaly
 jevy způsobující chemické posuny: oxidační stav, chemická vazba, elektronegativita sousedních
atomů

7.8. Popište SIMS.

Hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů = SIMS (Secondary-ion mass Spectrometry)
 informace o elementárním a chemickém složením
 excitace a detekce: ionty
 působíme primárními ionty a vznikají jiné ionty, které analyzujeme MS
 vzorky – perfektně hladké, leštěné povrchy

Primární ionty
 zdrojem je iontové dělo
 paprsek iontů fokusován do bodu na povrchu vzorku
 akcelerační energie> 10 keV

Sekundární ionty
 povrchové atomy jsou odprašovány od povrchu nebo implantovány hlouběji
 malá část atomů je ionizovaná
  odprášené atomy jsou zachyceny, urychleny a fokusovány do hmotnostního analyzátoru

7.9. Popište dva možné zdroje spektrálních interferencí v SIMS spektru.

 interference molekul (C4H9 a 57Fe)
o interference molekul o stejném atomovém čísle
o jedná se o naprosto odlišná chemická individua (molekula organická X atom)
 izobarické interference (48Ca a 48Ti)
 iontové klastry (40Ca2+ a 80Se+)
 dvojnásobně nabité ionty se signálem u poloviční hmotnosti (28Si2+)
 primární ionty iontového děla
8. Povrchová analýza II

8.1. Difrakční limit optické mikroskopie – jaká je jeho velikost a jaký parametr ho určuje?
 fyzikální vlastnost optického přístroje určující teoretické rozlišení, které nemůže být překonáno
 optická mikroskopie patří mezi mikroskopie „vzdáleného pole“ – laterální rozlišení je maximálně
asi 200 nm (objekty o velikosti nižší než 200 nm nelze v optickém mikroskopu pozorovat)
 určuje ho vlnová délka a NA

8.2. Vysvětlete princip konfokální mikroskopie.

 ozáření bodu v rovině zaostření, detekce pouze záření odraženého (nebo emitovaného při
fluorescenci) pouze z ozářeného bodu, světlo z ostatních míst je potlačeno
 výsledný obraz vzniká skenováním přes celý vzorek a rekonstrukcí obrazu v počítači

8.3. Popište rozdíl mezi SEM a TEM – princip měření, příprava vzorku.

SEM = skenovací elektronová mikroskopie (řádkovací elektronová mikroskopie)

 pracuje tak, že je na preparát směřován tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na
všechna místa vzorku
 preparát: 2-3 cm tlustý, 15 cm dlouhý, musí být kvalitně pokoven, zaostřený svazek elektronů
musí po povrchu rastrovat společně s detektorem

TEM = transmisní elektronová mikroskopie (prozařovací elektronová mikroskopie)

 viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, prošlým studovaným
vzorkem
 preparát musí být elektricky vodivý – pokován, tenký vz.

Konfokální mikroskop
 8.4. Jaký druh elektronů vytváří nejčastěji obraz TEM a SEM? Vysvětlete princip vzniku těchto
elektronů.
 různé interakce primárních elektronů se vzorkem (8 typů)
SEM  dochází k pěti interakcím, TEM  dochází ke třem druhům interakcí

SEM
1) Zpětněodražené (primární) elektrony
cca 30 keV
Odraz způsobený kolizí primárních elektronů dopadajících kolmo na
rovinu vzorku, tj. úhel odrazu je 180o .
Intenzita zpětně odražených elektronů je úměrná atomovému číslu
atomů vzorku (atomy s vyšším Z se jeví světlejší).
Elektrony jsou odráženy z širšího okolí kolem místa fokusace
elektronů na povrch – omezení rozlišovací schopnosti SEM.
2) Sekundární elektrony
cca 5 eV
Vznikají interakcí primárního elektronu s elektronem atomu, v jehož
blízkosti prochází; část energie primárního elektronu způsobí emisi
elektronu z atomové slupky (obvykle K).
Sekundární elektron opouští vzorek s nízkou kinetickou energií (cca 5
eV).
Interakce primárního elektronu vede ke vzniku několika sekundárních
elektronů.
Tvorba sekundárních elektronů úzce souvisí s topografií povrchu
vzorku; jejich nízká energie znamená, že lze detekovat pouze
bezprostředně u povrchu.
TEM
1) Nerozptýlené elektrony
Primární elektrony prochází vzorkem bez vzájemné interakce.
Kontrast obrazu vzniká na základě množství prošlých elektronů –
tlustší částí vzorku se jeví tmavší, tenčí světlejší.
Prvky s vyšším atomovým číslem brání průchodu elektronů více.
2) Elasticky rozptýlené elektrony
Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem elasticky
rozptýleny (bez ztráty energie).
Protože všechny primární e mají stejnou energii a dopadají kolmo
na vzorek, budou rozptýleny pod stejným úhlem odpovídajícím
meziatomové vzdálenosti (Braggova rovnice).
Analýza magnetickými čočkami umožňuje získat informaci o
orientaci, uspořádání atomů a fází přítomných ve vzorku.
3) Neelasticky rozptýlené elektrony
Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem rozptýleny a ztrácí
energii (neelastický rozptyl).
Dvě možnosti využití: Spektroskopie ztráty energie elektronů
(EELS), Kakuchiho pásy.

3) Augerovy elektrony
10 eV - 2 keV SEM
Způsobené relaxací ionizovaného atomu po emisi sekundárního
elektronu.
Charakteristická energie Augerových elektronů umožňuje elementární
analýzu.
Augerovy elektrony mají obvykle nízkou energii, jsou emitovány pouze
z povrchové vrstvy vzorku o tloušťce desetin nanometrů.

4) Emise rentgenové fluorescence

Způsobena relaxací ionizovaného atomu po emisi sekundárního

elektronu.
Emitované rentgenované záření má energii (vlnovou délku)
charakteristickou pro daný prvek.
Umožňuje mapování elementárního složení na povrchu vzorku

5) Katodoluminiscence

Způsobená párem elektron-díra, který vzniká při interakci (primárních)

elektronů s některými materiály.
Při rekombinaci tohoto páru může dojít k emisi záření od UV po IR; TEM
intenzita bývá poměrně nízká.
Katodoluminiscenci vzorku způsobují obvykle nečistoty v jinak
homogenním materiálu nebo mřížkové defekty v krystalu.
Využití pro forenzní analýzu skel, rozlišení anatasu od rutilu.
 8.5. Popište následující techniky STM, AFM, SNOM.

STM = rastrovací tunelová mikroskopie (Scanning Tunneling Microscopy)

 metoda umožňující vytvořit topografický obraz povrchu v atomárním rozlišení
 zařízení využívá tunelového jevu pro určení vzdálenosti hrotu od povrchu vzorku
 vzorek: vodivý, s malými nerovnostmi
 mikroskop rastruje nad povrchem velmi ostrým vodivým hrotem a pomocí tunelového proudu
určuje vzdálenost od povrchu.

 tunelový jev = kvantově-chemický jev spojený s uvězněním elektronu

v prostoru (model potenciálové jámy)

Kladný potenciál na vzorku  tunelovací proud

vzniká přechodem elektronů z obsazených hladin
sondy do prázdných hladin vzorku

Záporný potenciál na vzorku  tunelovací proud

vzniká přechodem elektronů z obsazených hladin
vzorku do prázdných hladin sondy

AFM = mikroskopie atomárních sil (Atomic Force Microscopy)

 měření sil působících mezi sondou a povrchem; síly mohou být atomární, laterální, magnetické
atd.
 snímání pozice sondy (hrot na konci pružného nosníku)
 pomocí laserového paprsku a diodového pole je zkoumáno prohnutí nosníku
 k detekci však neslouží elektrický proud, ale vzájemná meziatomová přitažlivost
 zobrazení i nevodivých vzorků

SNOM

SNOM = Mikroskopie v blízkém optickém poli (Scannine Near-fielf Optical Microscopy)

 optická mikroskopie v nanoměřítku

 rozlišení menší než difrakční limit (pomocí vlastností tlumených vln)
  hrot sondy musí být velmi blízko povrchu vzorku (5-50 nm)
9. Analýza chirálních látek
9.1. Vysvětlete pojem chiralita, optická aktivita, racemát, enantiomerní čistota.

Chiralita
 vlastnost objektu – chirální objekt není ztotožnitelný se svým zrcadlovým obrazem
 nemá střed ani rovinu symetrie, může ale mít rotační rovinu symetrie

Optická aktivita
 je schopnost chirálních látek stáčet rovinu polarizovaného světla.

Racemát
 směs enantiomerů v molárním poměru 1:1
 k separaci dochází, pokud interakcí s chirálním selektorem vznikne diastereomerní pár, který lze
separovat

Enantiomerní čistota
 vyjádření obsahu jednotlivého enantiomeru (100 % pouze jeden enantiomer x 0 % racemát)

9.2. Nakreslete a popište schéma polarimetru. Vysvětlete princip měření.

 přístroj měřící úhel rotace (neboli změnu polarizovaného světla)
 stáčení roviny lineárně polarizovaného světa
 enantiomery mají různé indexy lomu (pravo- a levotočivé polarizované složky lineárně
polarizovaného záření (nR se nerovná nL)
9.3. Vysvětlete princip spektrometrie cirkulárního dichroismu. Jaká veličina je zde měřena?
 z cirkulárně (kruhově) polarizovaného záření dostáváme průchodem vzorku elipticky polarizované
záření
 rozdílné absorpční koeficienty levo- a pravotočivě kruhově polarizovaného záření
 měří se rozdíl absorbance L-CPL a R-CPL chirální molekulou: ΔA=AL-AR

9.4. Vysvětlete princip spektrometrie Ramanovy optické aktivity. Jaká veličina je zde měřena?
 založeno na principu Ramanova neelastického rozptylu
 chirální molekuly rozptylují kruhově polarizované záření (ICP) či lineárně polarizované záření (SCP)
 sledujeme rozdíl 𝐼𝑅−𝐼𝐿≠0
 měří se rozdíl intenzit vpravo a vlevo cirkulárně polarizované složky rozptýlené záření vlivem
interakce s chirální molekulou

9.5. Vysvětlete princip enantioselektivní interakce.

 enantioselektivní interakce = pro tuto interakci je nutné minimálně tří odlišných interakcí
o vytvoří se komplex – může být i kovalentní/nekovalentní vazba

 chirální rozpoznávání = schopnost SCP tvořit různou měrou s jedním a druhým enantiomerem
diastereomerní komplexy (podmínka minimálně tří interakcí)
o vodíková vazba, 𝜋−𝜋 interakce, Van der Waalsovy interakce nebo stérické interakce

9.6. Uveďte alespoň dva příklady chirálních selektorů užívaných v chromatografii. Vysvětlete princip
chirální separace.
 chirální separace = interakce chirálního analytu (dva analyzované enantiomery) s chirálním
selektorem
 pouze neztotožnitelné objekty mají možnost tvořit (ne)kovalentní interakce
 enantiomery + S-izomer (selektor) = diastereoizomery
 podmínka min. 3 odlišných interakcí
 separace prostřednictvím chirální stacionární fáze
10. Kinetické metody

10.1. Napište diferenciální a integrální tvar rychlostní rovnice prvního řádu.

10.2. Stručně popište a srovnejte následující rychlostní metody:

1) Metoda počáteční rychlosti

 využívají se diferenciální tvary rovnic
 určuje se rychlost reakce na jejím počátku, která odpovídá tečně k naměřené křivce v daném
bodě
 rychlosti reakcí jsou odečteny pro kalibrační roztoky v daném čase
 z proložené kalibrační křivky lze pak odečíst koncentraci analytu v neznámém vzorku
 koncentrace analytu je úměrná pozorované reakční rychlosti
 VÝHODY: vysoká citlivost metody
 NEVÝHODY: krátký čas na dokonalé promísení činidel

2) Metoda střední rychlosti

 určuje se rychlost reakce po jejím částečném proběhnutí, která odpovídá tečně k naměřené
křivce v bodě (závislost (A) = f(t) v daném bodě v = -ΔA/Δt)
 VÝHODY: většinou dostatek času na úplné promíchání reakční směsi

10.3. Vysvětlete princip průtokové vstřikovací analýzy (FIA), nakreslete a popište schéma zařízení.
FIA = průtoková vstřikovací analýza (Flow Injection Analysis)
 reakce probíhá za chodu přístroje
 malý objem vzorku je opakovaně injektorem nastřikován do nosného plynu
 reprodukovatelné chování toku kapaliny v prostředí dané geometrie a konstantním průtoku
 spolehlivá a rychlá metoda, snadná automatizace, jednoduchá konstrukce
 POUŽITÍ: procesní analytická chemie, klinické laboratoře

10.4. Vysvětlete princip sekvenční vstřikovací analýzy (SIA), nakreslete a popište schéma zařízení.
SIA = sekvenční vstřikovací analýza (Sequential Injection Analysis)
 obdoba FIA, obrácení směru nosného proudu
 lepší promíchání reakční směsi, jednodušší instrumentální uspořádání než FIA, účinnější využití
činidel, omezení odpadu, flexibilita, robustnost
ANALYZÁTOR SIA – jednokanálový

10.5. Vysvětlete pojem disperze vzorku ve vstřikovacích analýzách. Jak je matematicky definován?
Jaké druhy (příčiny) disperze znáte?
Disperze vzorku:
 je funkcí času
 jedná se o rozšiřování zón signálu
 roste s délkou reaktoru a kapilár; klesá s rostoucím objemem nastřikovaného vzorku a rostoucím
průtokem
 detekovaný signál je rozšiřován z různých příčin
 matematicky definováno jako disperze analytu: 𝑫= 𝑪𝒐/𝑪𝒎𝒂𝒙 (Co = počáteční koncentrace analytu,
Cmax = detekovaná koncentrace analytu )

Příčiny disperze vzorku:

1. Fyzikální – disperze (rozšiřování) zóny v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny a kapaliny),
různý rychlostní profil toku turbulentní x laminární
2. Chemická – dána kinetikou reakce analytu s činidlem
3. Molekulová difúze v MF a SF (chromatografie) - molekulová difúze v MF závisí na lineární rychlosti
MF; molekulová difúze v SF je daná různým prostupem (hloubkou prostupu) složky do vrstvy SF na nosiči
a různém zadržení ve SF
11. Radioanalytické metody

11.1. Jaké druhy detektorů ionizujícího záření znáte? Stručně popište jeden z nich

Nespektrometrické detektory
 základní detekce částic nebo fotonů, měří pouze intenzitu záření
o filmové a termoluminiscenční dozimetry, ionizační komory včetně Geiger-Müllerova detektoru
 ionizační komora
o anoda a katoda umístěná v inertním plynu (argon) s vloženým napětím (150 – 200V); působením
záření dochází k ionizaci a k protékání proudu; lineární odezva v širokém rozsahu intenzit záření

Spektrometry ionizujícího záření

 měří intenzitu v závislosti na energii záření
o scintilační detektory, polovodičové detektory, magnetické spektrometry, detektor Čerenkovova
záření (analogie ke scintilačním detektorům)
Zobrazovací detektory
 kamery – zobrazují prostorové rozložení intenzity záření
o fotografický film, luminiscenční stínítka, multidetektorové systémy
Dráhové detektory částic
 zviditelňují či vyhodnocují dráhy pohybu jednotlivých částic v prostoru

Radiometry (alfa, beta, gama)

11.2. Vysvětlete princip scintilačního detektoru

 po absorpci záření vhodným materiálem (scintilátorem) dochází ke vzniku světelných záblesků
(scintilací)
 nejpoužívanější scintilátor: monokrystal jodidu sodného aktivovaný thalie: NaI(Tl)
 kapalné scintilátory: toluenový roztok 2,5-difenyl-1,3oxazol / 1,3,4-oxadiazol
 záblesky se detekují fotonásobiči
 analogie: detektor Čerenkova záření

11.3. Jaké signály lze gama spektrometrií pozorovat ve spektru radionuklidu, jenž při rozpadu emituje
záření gama jediné energie?
Gama spektrum vzorku
 závislost četnosti emitovaných fotonů na jejich energii
 radionuklid charakterizován energiemi vyzařovaného gama záření a jeho relativní intenzitou 
kvantitativní a kvalitativní analýza

Sekundární interakce:
1) fotoelektrický jev: úplná absorpce gama fotonu; gama foton vyrazí z látky silně vázaný elektron z vnitřní
slupky; zpětné zaplnění elektronem z vyšší hladiny uvolní rentgenové záření (příp. Augerův elektron);
intenzita klesá s rostoucí energií gama záření
 2) Comptonův rozptyl: interakce gama fotonu a elektronu slabě vázaného v atomu  gama foton změní svůj
směr šíření a část své energie předá elektronu; vytváří ve spektru spojité pozadí; intenzita klesá s rostoucí
energií gama záření

3) vznik elektron-pozitronového páru: nastává při průletu fotonu v dosahu Coulombické síly jádra; pozitron
anhiluje s jiným elektronem  vzniká dvojice gama fotonů o energii 511 keV, které se šíří v přesně
navzájem opačném směru

11.4. Nakreslete a popište schéma gama spektrometru

Scintilátor – materiál absorbující záření, vznik světelných

záblesků

Fotonásobič = dopad kvanta na dynodu vyvolává emisi

většího počtu elektronů (tzv. sekundární emise), jejímž
výsledkem je znásobení počtu elektronů. Po sérii zesílení
proud elektronů dopadá na anodu = měření optického
signálu

Zesilovač – zesílí signálu

Vícekanálový analyzátor – čítač napěťových pulzů

vyvolaných fotonu. Jednotlivé kanály detekují pulzy určité
amplitudy. Výsledkem je histogram počtu pulzů v
jednotlivých kanálech, číslo kanálu je úměrné energii fotonu

11.5. Proč lze naměřit absorpci gama záření pouze u pevných vzorků?
 gama paprsky procházejí pevným vzorkem a dochází k sekundární interakci, která se projeví v
naměřených spektrech
 absorpce či emise gama záření volných jader je spojena s hybností jader, kapalné a plynné prvky
poskytují alfa nebo beta

11.6. Popište princip M𝐨̈ssbauerovy spektrometrie.

 rezonanční gama spektrometrie
 zaznamená velmi malé změny v energetických hladinách jader atomů v závislosti na jeho
okolním prostředí (oxidační stav, chemická vazba, …)
 PRINCIP: pevný vzorek je vystaven gama záření, měří se intenzita záření prošlá vzorkem, zdroj
musí obsahovat stejné izotopy, jako jsou atomy v analyzovaném materiálu, které jsou cílem
analýzy
12. Bioanalytické metody

12.1. Jaké detekční techniky používají bioanalytické metody? Stručně popište princip jedné z nich.
1) detekce průběhu reakce  analýza uvolněného nebo spotřebovaného plynu
2) spektrofotometrická detekce  používá se pro sloučeniny s odlišnou absorpční oblastí v UV, VIS, IR
3) fluorescenční detekce
4) chemiluminiscenční detekce
5) polarimetrická detekce
6) elektrochemická detekce  potenciometrie, amperometrie, coulometrie, polarografie
7) radiometrická detekce

12.2. Popište princip spektrofotometrické metody používající ke stanovení enzymů s kofaktory

Fluorescenční detekce

 primární enzymatická rce produkuje substrát

pro spřaženou reakci s dehydrogenázou
 rychlost změny poměru NADH/NAD+ je určena
obsahem analytu reagujícího primární
enzymatickou reakcí
 např. přeměna kofaktoru NAD na NADH
+

dehydrogenázou (oxidoreduktáza)
 měří absorpce při vlnové délce 340 nm, kde
selektivně absorbuje NADH než NAD+

12.3. Jaký je princip radioimunoalanýzy? Jaké detektory se používají?

RIA
 PRINCIP: kompetice (soupeření) radioaktivně značených antigenů a antigenů ve vzorku
 na dané protilátky se váží kompetitivně radioaktivní či vzorkové antigeny
 následně se měří radioaktivita  radioaktivita je nepřímo úměrná koncentraci antigenu ve vzorku
 STANOVENÍ: peptidy, bílkoviny, enzymy, nukleoproteiny, MO, hapteny
Detektory:
 detektory záření – určují intenzitu záření, počet kvant záření, bez informací o druhu záření:
filmové a termoluminiscenční dozimetry, ionizační komory, G.-M.
 spektrometry – měří intenzitu, počet kvant a energie záření (scintilační detektory, polovodičové
detektory)

12.4. Vysvětlete princip následujících technik ELISA: (ne)přímá, (ne)kompetitivní

Přímá ELISA
 Reakce antigenu imobilizovaného na pevný povrch s protilátkou značenou enzymem, který
následně reaguje například s chromogenním substrátem za vzniku měřitelné barevné změny.
Nepřímá ELISA
 Druhou a nejvíce využívanou možností, ve kterém se kromě primární protilátky používá také
sekundární protilátka značená enzymem.

Sendvičová (kompetitivní) ELISA

 Charakteristické je použití dvou protilátek specifických na různé epitopy jednoho antigenu.
Jedna z protilátek je navázána na povrch jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku. Druhá
protilátka značená enzymem slouží k detekci tohoto antigenu. Antigen je tedy mezi protilátkami
jako plátek masa mezi houskami v sendviči.

Nekompetitivní ELISA
 K měření koncentrace antigenu se zde využívá interference signálů. Jakékoli z prvních tří
uspořádání může být adaptováno na kompetitivní. Referenční antigen je imobilizován na
povrchu jamek. Vzorek je nejprve smíchán s protilátkou a poté přidán do jamky. Po ustanovení
rovnováhy se analyzovaný vzorek z destičky vymyje. Následně bude přidána sekundární značená
protilátka. Čím více primární protilátky bude vyvázáno antigenem ze vzorku, tím slabší bude
detekovaný signál.
12.5. Nakreslete a popište kalibrační závislost pro přímou a nepřímou ELISA.

Ag [mol/l]

12.6. Vysvětlete princip diagnostických testů založených na laterální chromatografii.

Imunochromatografie  podélný tok
 analyt ze vzorku nanesen na destičku (membránu)
 pokud je analyt ve vzorku  v další části interaguje s barevně značenými protilátky (specifická interakce
antigen-protilátka)
 kapilární tok zajišťuje migraci analyt (antigen) - značená protilátka
 následují v pořadí testovací linie (linie protilátek) a kontrolní linie (linie anti-IgG protilátek)
 pokud je test pozitivní (antigen (analyt) - barevná protilátka se naváží na pozitivní linii = barevný pruh +
vazba barevně značených protilátek s negativní linií) = výsledkem jsou tedy dvě line = pozitivní
 jedna linie (negativní linie) = test negativní
13.Chemické senzory a biosenzory

13.1. Co je to chemický senzor? Jaký je rozdíl mezi chemickým senzorem a biosenzorem?

 malé zařízení, které převádí chemický stav na elektrický signál

 převodník, který poskytuje přímo informaci o chemickém složení svého okolí (je tvoře fyzikálním
převodníkem a chemicky citlivou vrstvou)

 CHEMICKÝ SENZOR
o mikrostruktura povrchové anorganické vrstvy nebo organické „receptory“ – synteticky
vyrobené molekuly schopné selektivní interakce s analytem (např. porfyriny, kalixareny,
korunkové ethery, cyklodextriny, ionofory, bipyridiny)
o VÝHODA: vyšší odolnost ke změnám podmínek měření
 BIOSENZOR
o makromolekuly poskytující afinitní interakce s analytem (enzymy, lektiny, protilátky,
úseky nukleových kyselin, polypeptidy)
o VÝHODA: vyšší selektivita

13.2. Popište jednotlivé části chemického senzoru. Uveďte příklad optického nebo elektrochemického
senzoru – popište princip jeho funkce.

Molekulový (iontový selektor) - selektivita interakce analyt x selektor je založena různých principech (velikost
částic, bioafinitivní interakce, nekovalentní interakce)

Převodník – na základě různé fyzikálně-chemické interakce (změna koncentrace – elektroda, změna teploty –
termistor, změna hmotnosti – piezokrystal) převádí chemický signál na signál analyticky měřitelný

Optické senzory
 absorbance, reflektance, rozptyl, fluorescence
 prostřednictvím optických vláken je optický signál veden na delší vzdálenost (totální odraz)
 paprsek může při analýze a) procházet vzorkem nebo b) využití evanescentní vlny (ATR)
 převedení na elektrický signál
Elektrochemické senzory
 voltametrické či potenciometrické měření
13.3. Jak lze skleněnou elektrodu využít jako biosenzor?
 stejně tak jako běžná skleněná elektroda měří koncentraci H+ iontů = pH
 skleněnou elektrodu lze využít i jako biosenzor aplikací enzymů na elektrodu a měření změny pH
při průběhu reakce
 imobilizace enzymů na elektrodách může být různá:
 upevnění naneseného enzymu dialyzační membránou
 fyzikální zachycení na povrch (polymerace gelu s enzymem na nylonové či silonové síťce –
snadná výměna sítěk)
 přímá polymerace gelu s enzymem na elektrodě

13.4. Popište konstrukci a princip Clarkova čidla pro stanovení kyslíku. V jakých aplikacích ho lze
využití?
 řadí se mezi amperometrické senzory
 měření závislosti protékajícího proudu mezi dvěma elektrodami při konstantním napětí na
množství elektroaktivního analytu ( I=f(množství analyty); U=konst.)
 elektroaktivní analyt je v kapalné fázi
 u Clarkova čidla se používá kovová elektroda (Au,Pt, Ag) překryta membránou o určité
permeabilitě kyslíku
Aplikace:
 čidlo pokryté polyamidem se zakotveným enzymem (peroxidasa) = měření glukosy,
cholesterolu, močoviny, …

13.5. Vysvětlete, jakým způsobem ovlivňují redukující plyny odezvu plynových senzorů Figaro (TGS
senzory)?
 patří mezi voltametrické senzory
 k detekci reaktivních hořlavých, výbušných, jedovatých plynů
 měření závislosti protékajícího proudu na vloženém napětí (dochází k poklesu napětí na rozhraní
sintrovaného SnO2 v přítomnosti redukujícího plynu)
 závislost – voltametrická křivka, někdy také jako polarizační křivka
 v případě, že se ve vzduchové atmosféře objeví redukční plyn, například methan, dochází za
určitých podmínek k jeho reakci s chemisorbovaným kyslíkem za vzniku plynných produktů –
oxidu uhličitého a vody  vodivost polovodiče se tím zvýší
 nárůst vodivosti je tím vyšší, čím vyšší je koncentrace a reaktivita redukčního plynu
13.6. Popište princip elektronických nosů a jazyků.
 využití elektrodových polí pro vzorky plynné (nosy) a kapalné (jazyky)
 senzorové pole – kombinace senzorů o různé selektivitě, každý nemusí být maximálně selektivní
 vzniklé analytické signály jsou déle zpracovány (vyhodnoceny) prostřednictvím vícerozměrné
analýzy
 lineárními modely (LDA, PCA, PCR, PLS), klastrovou analýzou, neuronovými sítěmi
14.Procesní analytická chemie

14.1. Vyjmenujte a charakterizujte typy procesní analýzy, vyjmenujte jejich hlavní výhody a nevýhody.
OFF-LINE
 vzorky transportovány do laboratoře
 POUŽITÍ: v dávkovém zpracování, je-li počet vsádek malý a příprava vz. či analýza obtížně automatizovatelná
 VÝHODY: sofistikované přístroje, školený personál
 NEVÝHODY: prodlení spojené s dopravou vzorku, manuální vzorkování, nízká vzorkovací frekvence

AT-LINE
 přístroj umístěn v provozu
 POUŽITÍ: jestliže částečná automatizace nevyžaduje zvláštní dovednosti, analýza na místě je preferovaná
 VÝHODY: odpadají problémy transportu vzorku, přístroj upraven podle konkrétních potřeb
 NEVÝHODY: vyžaduje školený personál, agresivní prostředí, výsledky často nedostatečně aktuální, manuální
vzorkování, nízká vzorkovací frekvence

ON-LINE
 automatický odběr vzorků přímo z výroby
 VÝHODY: vysoká vzorkovací frekvence
 NEVÝHODY: cena potřebného připojení, poruchy vzorkovacího systému

IN-LINE
 bez odběru vzorku z procesu
 VÝHODY: významná úspora času, robustnost, přátelskost užití (možnost záměny pracovníků), méně náchylná
k poruchám (odpadá odběr a příprava vzorku), velmi vysoká vzorkovací frekvence
 NEVÝHODY: obtížná kalibrace, zanášení vzorků usazeninami

14.2. Vyjmenujte požadavky kladené na procesní analyzátory.

 robustnost vzhledem k charakteru pracovního prostředí, teploty, vlhkosti, …
 schopnost vzorkovat a analyzovat materiály za vysokého tlaku/teploty
 materiály různého charakteru (viskózní či práškový), pracovat s nevodným prostředím, často v
agresivním prostředí
 automatický sběr a zpracování dat, bez dohledu dny i týdny
 stabilní dlouhodobá kalibrace, schopnost autokalibrace
 obvykle méně univerzální, upravené pro určité měření
 výroba z trvanlivých prvků, co nejméně pohyblivých prvků, jednoduchost
14.3. Vyjmenujte prvky procesního analyzátoru a stručně jej charakterizujte.

Základní prvky procesního analyzátoru:

1) vzorkovací systém (reprezentativní vzorek)
 nutnost zabránit kontaminaci vzorku
 přednost odběru vzorku v pohybu (u kapalin a plynů potrubí obsazeno ventily, u tuhých látek odebíráme
např. z transportéru)
 velikost vzorků není libovolná (ovlivněna zrnitostí, homogenitou, obsahem analytu, …)
 plyny: odběr nejčastěji plynovou pipetou
 kapaliny: odběr z různých míst, hloubek a následné mísení do reprezentativního vzorku
 tuhé látky: u nehomogenních látek odbíráme vzorek o hmotnosti cca 2% z celkové hmotnosti materiálu –
následuje mletí, kvartace, …
2) systém přípravy vzorku (např. filtrace)
3) systém úpravy vzorku pro podmínky přijatelné analyzátorem
 filtrace, ředění, úprava pH, teploty

4) analyzátor či senzor
Plyny:
o elektrochemické metody – analýza plynů (Clarkovo čidlo), senzory FIGARO, analyzátory plynů
o spektrofotometrické metody – UV, VIS, IR

Kapaliny:
o elektrochemické metody – potenciometrie, ISE, skleněná elektroda, voltametrie, amperometrie
o spektroskopické metody – pomocí vláknové optiky: transmisní měření, ATR měření (IR),
fluorescence, reflektance
o nepřímé měření pomocí vstřikovacích analýz: průtoková injekční analýza (FIA), sekvenční injekční
analýza (SIA), kontinuální průtoková analýza (CFA) segmentovaná průtoková analýza (SFA)
5) výstup dat do řídicího systému
 kalibrace
 zpracování dat z různých metod prostřednictvím datových softwarů

14.4. Jaké analytické metody lze použít v procesních analyzátorech:

 elektrochemické
o potenciometrické (ISE – fluoridy; skleněná elektroda – pH; potenciometrická titrace)
o amperometrické (analyzátory plynů, plynové senzory FIGARO)
o voltametrické (Clarkovo čidlo (O2))
 spektrofotometrické
o transmisní měření, ATR, fluorescence, reflektance (měření v UV, VIS, IR)
 nepřímá měření vzorků kapalin pomocí vstřikovacích analýz
o průtoková injekční analýza (FIA)
o sekvenční injekční analýza (SIA)
o kontinuální průtoková analýza (CFA)
o segmentovaná průtoková analýza (SFA)