1.

Nejistoty a testování hypotéz v analytické chemii

1.1. Co je to validace?
 Je potvrzení zkoumáním a opatření objektivního důkazu o tom, že jsou plněny určité
požadavky pro uvažované použití
= Proces, při němž se určuje vhodnost použití dané analytické metody pro získání
reprezentativních dat
 Při validaci se sleduje, zda jsou parametry analytické metody srovnatelné s požadavky na analytická data
 Posuzovaná podle vztahu mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi analytické metody
 Závisí na limitním množství analytu, které chceme stanovit
1.2. Vyjmenujte alespoň 5 důležitých charakteristik analytické metody.
 Preciznost, přesnost, pracovní rozsah a linearita, citlivost, LOD, LOQ, robustnost,
selektivita
1.3. Charakterizujte alespoň 2 charakteristiky analytické metody.
PŘESNOST
= těsnost souhlasu mezi výsledek zkoušky a přijatelnou referenční hodnotou
PRECIZNOST
= těsnost souhlasu mezi nezávislými výsledky zkoušky za předem stanovených podmínek
PRACOVNÍ A LINEÁRNÍ ROZSAH
= koncentrační rozsah, ve kterém lze dosáhnout přijatelné preciznosti a jeho podoblast
lineární kalibrační závislosti
linearita - lineární v oblasti pracovního rozsahu
MEZ DETEKCE = LOD
= nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě detekováno
MEZ STANOVISTELNOSTI = LOQ
= nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě stanoveno jako exaktní
hodnota

SELEKTIVITA
= schopnost rozlišit chemické nebo fyzikální vlastnosti jednotlivé složky (analytu) ve směsi
jiných složek
 ROBUSTNOST
= necitlivost metody vůči malým odchylkám od vlastního operačního postupu
Citlivost metody
- velikost změny analytického signálu na změnu koncentrace; směrnice kalibrační závislosti
(kalibrační závislost = závislost signálu na známé koncentrace analytu)
1.4. Jaký je rozdíl mezi LOD a LOQ?
 LOD (limit of detection) - nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být spolehlivě
detekováno; je roven trojnásobku výběrové směrodatné odchylky (či trojnásobku šumu)
o 𝑳𝑶𝑫 = (𝒀𝑳𝑶𝑫 − 𝒃𝒐 )/𝒃𝟏
o 𝒀𝑳𝑶𝑫 = 𝒀𝒃𝒍𝒂𝒏𝒌 + 𝟑. 𝒔𝒃𝒍𝒂𝒏𝒌
 LOQ (limit od quantification) - nejmenší množství analytu ve vzorku, které může být
spolehlivě stanoveno jako exaktní hodnota; je roven deseti násobku výběrové směrodatné
odchylky (či desetinásobku šumu)
o 𝑳𝑶𝑸 = (𝒀𝑳𝑶𝑫 − 𝒃𝒐 )/𝒃𝟏
o 𝒀𝑳𝑶𝑸 = 𝒀𝒃𝒍𝒂𝒏𝒌 + 𝟏𝟎. 𝒔𝒃𝒍𝒂𝒏𝒌
1.5. Rozdíl mezi chybou a nejistotou?
 Chyba měření = rozdíl mezi naměřenou hodnotou a referenční (skutečnou) hodnotou (CRM)
měřené veličiny
 Nejistota měření => charakterizuje jakost výsledku měření a umožňuje porovnávat výsledky
 Není číslo ale interval, ve kterém s určitou pravděpodobností se nachází skutečná hodnota
1.6. Co je standartní nejistota typu A; B?
Typ A = standartní nejistota určena výběrovou směrodatnou odchylkou -> předpokládá se
normalizované (normální; Gaussovo) rozšíření
Typ B = standartní nejistota vyhodnocena jinak než výběrovou směrodatnou odchylkou
(statistickou analýzou), jiné druhy rozdělení (rovnoměrné, trojúhelníkové)

1.7. Uveďte definici zákona o šíření nejistot.

 Šířením nejistot se rozumí efekt jednotlivých vlivů nejistot proměnných pocházející
z dané funkce měření. Znalostí těchto nejistot lze určit kombinovanou nejistotu měření
𝒎
o Např. rovnice měření -> 𝒄𝒂𝒏𝒂𝒍𝒚𝒕 = 𝑴.𝑽
o Na nejistotě koncentrace se podílejí 3 parametry (každý vlastní nejistotou) - zisk kombinované
nejistoty (hmotnost, molární hmotnost a objem (na nejistotě objemu se podílejí další
parametry - teplotní roztažnost, opakovatelnost, kalibrace)
1.8. Jak souvisí hladina významnosti a spolehlivost u testování hypotéz? Oba pojmy vysvětlit.
Hladina významnosti = (α) pravděpodobnost, že se zamítne nulová hypotéza, ačkoliv
platí
 Určuje interval, který s pravděpodobností p odděluje od kritických intervalů <ap, bp>
Interval -> prakticky možných hodnot
Hladina spolehlivosti = (1-α) je pravděpodobnost, že se nezamítne nulová hypotéza,
nulová hypotéza platí

1.9. Jaký test zvolíte při testu shody dvou výsledků analýzy, jaké při testu tří výsledků?
a) Test shody dvou výsledků analýzy - dvouvýběrový studentův t- test
 určení testovacího kritéria

|𝑥1 − 𝑥2 | 𝑛1 𝑛2 (𝑛1 + 𝑛2 − 2)
𝑡= ∗√
√𝑛1 𝑠12 + 𝑛2 𝑠22 𝑛1 + 𝑛2

 určení kritické hodnoty tkrit

 pokud je hodnota testovacího kritéria větší než hodnota kritická nulovou hypotézu Ho s
(1-α) zamítáme
 Existuje α.100% pravděpodobnost zamítnutí nulové hypotézy, i když platí = chyba I.
druhu (viz. Otázka 8.)

b) Test shody tří výsledků - Analýza rozptylu (ANOVA)

 Více než dva výsledky porovnání
 Určení tzv. F testovacího kritéria; porovná s kritickou hodnotou Fkrit
 pokud je hodnota testovacího kritéria větší než hodnota kritická nulovou hypotézu Ho s
(1-α) zamítáme
1.10. Definujte chybu I. druhu a II. druhu a sílu testu
Chyba I. druhu - nulová hypotéza platí, přesto jí zamítneme (falešně pozitivní výsledek)
Chyba II. druhu - nulová hypotéza neplatí, přesto jí nezamítneme (falešně negativní
výsledek)
Síla testu - je číslo od 0 do 1 udává pravděpodobnost, že při neplatnosti nulové hypotézy
dojde k jejímu zamítnutí, neboli o odhalení neplatnosti nulové hypotézy. Čím vyšší číslo,
tím lépe - s vyšší pravděpodobností lze neplatnost nulové hypotézy zamítnout
2. Vibrační spektrometrie II

2.1. Co jsou charakteristické vibrace funkčních skupin v IR spektrech?

 Slouží k interpretaci IR spekter -> nalezení strukturního motivu a funkčních skupin
 K interpretaci slouží tabulky charakteristických funkčních skupin
 Při interpretaci je dobré se držet pár základních pravidel ….
 Jednotlivé funkční skupiny se ve spektru projevují různě, a tak lze rozborem IR spektra zjisti
přítomnost jistých funkčních skupin v molekule nebo vyloučit přítomnost jistých skupin
 Tabulky charakteristických funkčních skupin
 Vibrace skupiny nebo vazby jsou pak ovlivňovány pouze v malé míře ostatními atomy v molekule.
Proto se poloha absorpčních pásů a jejich intenzita, kterými se fuknční skupiny projeví v IR spektru,
příliš neliší je-li vázaná v různých molekulách
2.2. Jak vypadá schéma FT-IR v NIR a MIR?

NIR FT-IR (1250-4000 cm-1 / 800-2500 nm) MIR FT-IR (4000-400 cm-1 / 2500-5000 nm)
 Zdroj: wolframová žárovka  Zdroj: žhavená tyčinka (SiC)
 Dělič paprsku: CaF2  Dělič paprsku: KBr
 Detektor: DTGS  Detektor: DTGS
 Disperzní spketromety s dirakční  Disperzní – dnes se nepoužívají
mřížkou

2.3. Jak je v reflexních technikách definována reflektivita?

 Závisí na polarizovatelnosti (polarizaci záření)
2.4. Jaké skupenství lze měřit DRIFT technikou?
 Pevné (práškové) vzorky -> vyžadují minimální přípravu vzorku
 Příliš absorbují -> nutné hodně naředit
2.5. Jaké je schéma DRIFT spektrometru?

2.6. Jaké typy pásů lze pozorovat v NIR a MIR?

MIR
 Charakteristické vibrace funkčních skupin + oblast otisku palce
o Molekulární vazby – valenční, deformační
 Spektra obsahují převážně signály odpovídající normálním (fundamentálním
přechodům) tzn. Δν=1
NIR
 Spektra obsahují málo intenzivní přechody
 Kombinační pásy a svrchní tóny (tzv. vyšší harmonické přechody = overtony) a molekulární
vibrace ?
 Δν= 2;3;4 ,…
 Jestliže fundamentální přechod nastává při vlnové délce λ0; první harmonický přechod nastane při 𝜆1 ≈ 𝜆0 ⁄2
2.7. Pro jaký typ analýzy (kvalitativní/kvantitativní) je NIR spektrometrie vhodná?
 Vhodná pro kvalitativní analýzu
o Rychlost analýzy (během sekund), nedestruktivní analýza, možná i ve skleněných obalech
o Kontinuální třídič plastového odpadu; zemědělství; farmaceutický či petrochemický průmysl
 Nevhodný pro stopovou analýzu
2.8. Pomocí diagramu energetických hladin popište vznik Ramanova spektra, a vysvětlete Stokesův
a anti-Stokesův rozptyl.
 Vznik Ramanova spektra je důsledkem přechodu mezi vibračním stavem a virtuální hladinou
 Jedná se změnu polarizace molekuly při neelastickém rozptylu záření (změna energie - změna
vlnové délky)
 Ozáření vzorku monochromatickým zářením (VIS nebo NIR) z laserového zdroje - měření odezvy
molekul vzorku - záření rozptýlené vzorkem a změny vlnové délky (kmitočet, vlnočet)

Stokesův a anti-Stokesův rozptyl:

  Ramanova interakce (neelastický rozptyl) vede ke dvěma možným jevům:
a) Materiál absorbuje energii a emitovaný foton má nižší energii než foton absorbovaný.
Tato možnost je označována jako Stokesův rozptyl. Foton emitovaný má větší vlnovou
délku.
b) Materiál ztratí energii a emitovaný foton má vyšší energii než foton absorbovaný. Tato
možnost je označována jako anti-Stokesův rozptyl.
 Rozdíl energií mezi absorbovaným a emitovaným fotonem koresponduje s energii mezi
dvěma rezonančními stavy materiálu a je nezávislý na absolutní energii fotonu.
2.9. Jaká podmínka musí být splněna, aby vibrace byla aktivní v Ramanově spektru?
 V Ramanově spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou polarizovatelnosti molekuly
 V IR spektru se projeví vibrace, které jsou spojeny se změnou dipólového momentu molekuly

Q …. Normální souřadnice
α ….. polarizovatelnost molekuly
µ

Polarizibilita => míra obtížnosti s níž se vychylují náboje elektrickým polem

2.10. Jaký je rozdíl mezi normálním a rezonančním Ramanově spektru?

Rezonanční Ramanovo spektrum
 Na rozdíl od normálního Ramanova spektra je rezonanční Ramanovo spektrum odlišné
od polohy virtuální hladiny
 Virtuální hladina je položena (v energetickém diagramu výše)
 Energeticky podobné excitonovanému stavu elektronových přechodů
 Výhoda - zesílení intenzity Ramanových pásů - rezonanční rozptyl
 Nevýhoda - emise energie fluorescencí
 Energie virtuální hladiny je podobná excitovanému stavu elektronových přechodů => emise
fluorescence
 Zesílení intenzity Ramanových pásů => nárůst polarizovatelnosti a při excitační energii laseru
odpovídající přechodu do excitované elektronové hladiny
 Charakteristická emisní intenzita Ramanova spektra dovolují pracovat s c = 10-6 mol/l

2.11. Jak lze potlačit fluorescenci v Ramanově spektru?

 Volbou vhodné vlnové délky zdroje záření => použití λ v NIR => nestačí na excitaci
fluorescence
 Několik typů laserů - výběr optimálního
 Důležité je při měření odstranit excitační záření - Rayleighův rozptyl - prostřednictvím tzv. notch
filtru (odfiltruje jen exitační linii); hranový filtr (odfiltruje anti-Stokesovy linie)
3. NMR spektrometrie 2
3.1. Pomocí diagramu vysvětlete pulzní sekvenci jednoduchého NMR experimentu.

3.2. Jakou informaci je možné získat ze spin-spinové interakce?

= vzájemná interakce magnetických momentů hybnosti µ různých neekvivalentních vodíků (mluvíme-li o H-NMR)
 Lze vyčíst informaci o štěpení signálu - umožňuje identifikovat, jak jsou jednotlivé funkční
skupiny rozmístěny v analyzované molekule (vzájemně se štěpí jen sousední atomy)
=> důležité informace o struktuře analyzované látky
=> přenášené vazebnými alektrony
 Interakce spinů vede ke štěpení signálů na multiplety (poměr intenzit - Pascalův trojúhelník)

Podmínky:
1) ekvivalentní vodíky se vzájemně neštěpí
2) skupina o n vodících (neekvivalentních) štěpí signál na sousedním uhlíku na n+1 čar
3) Dochází ke vzájemnému štěpení signálu neekvivalentních vodíků na jednom uhlíku nebo na
sousedních.
4) štěpení nelze pozorovat mezi vodíky přes tři sigma vazby
5) vyjímkou je aromatika - lze pozorovat štěpení mezi vodíky vzdálenými p více než 3 sigma vazby
 3.3. Pro dané molekuly měřené 1H-NMR uveďte: a) počet signálů; b)relativní integrální intenzity;
c) multiplicitu všech signálů
3.4. Kolik signálů výše/níže uvedených látek je možné pozorovat v 13C spektrech s protonovým
dekaplinkem?

POČET SIGNÁLŮ
POČET DIGNÁLŮ 13C
NÁZEV STRUKTURA MULTIPLICITA
1H S PROTONOVÝM
DEKAPLINGEM

O
ethylfenylacetát 6 8 z cvičení ;)
O

O
methylpropionát 3 4
O

O
vinylacetát 3 4
O

Cl

2-chlropropan 2 2

1,3,5 –
2 3
trimethylbenzen

Cl
1-chlor-2- O
5 7?
methoxybenzen

Cl
1-chlor-3-
5 7
methoxybenzen
O
Cl

1-chlor-4-
3 5
methoxybenzen

O
3.5. Vysvětlete rozdíl mezi podélnou (spin-mřížkovou) a příčnou (spin-spinovou) relaxací. Jakými
parametry jsou charakterizovány?

Podélná (spin-mřížková) relaxace

 Podstatou je obnovení rovnovážného stavu přenosem energie excitovaného stavu do atomů a molekul,
které dané jádro obklopují
 Obnovení velikosti magnetizace v ose z
 Na počátku měření koná jádro precesní pohyb (lze si představit rotaci kolem osy z

 Pohyb se dá popsat vektory, na počátku měření je velikost vektoru M o maximální

 Při aplikaci RF pulzu dojde ke zmenšení tohoto vektoru 1) díky vektorům o stejné velikosti, ale
orientovaných v opačném směru
 Po dokončení pulzu dochází k relaxaci jader 2) až 3) do původního vektoru Mo

Podélná (spin-mřížková) relaxace

 Dipól-dipól interakce mezi jednotlivými jadernými spiny, kdy dochází k postupné dekoherenci
(soudržnost) precesních pohybů vektorů magnetizace jednotlivých jader
 Vektory orientovány do jednoho směru, zde popsány v ose y (Mo je na začátku experimentu minimální,
při aplikaci RF pulze naopak maximální)
 Později dochází k relaxaci jader, návrat vektorů do různých směrů - výslednice Mo nulová
 o U spin-mřížkové interakce se měří relaxační čas T1
o U spin-spinové interakce se měří relaxační čas T2
3.6. Vysvětlete techniky „návrat po inverzi“ a spinové echo

Návrat po inverzi
 Slouží k měření relaxačního času T1
 S rostoucí teplotou a koncentrací roste rychlost relaxace (kratší T1)

 Počátek experimentu -> excitace pulzem převrácení o 180°

 Navrácení relaxace -> následný pulz převrácení o 90° (výhodné měření)

Spinové echo
 Měření času T2
 Dochází k rozšíření čas - linie jsou rozšířeny nespektrálními jevy, které je nutné odfiltrovat

 Excitace o 90°-> dekoherence vektorů

 Převráceno pulzem o 180°(měření času)
 dohasínání

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/97/GWM_HahnEchoDecay.gif
3.7. Jakou informaci o systému s probíhající chemickou výměnou lze získat?

Informace, které lze získat

o rychlostní konstanty, termodynamické konstanty (entalpie, Gibbsova energie, entropie,
změna konformace - vaničková, židličková; apod)

Probíhající procesy
 Intramolekulární procesy  Intermolekulární procesy:
 Konformační rovnováhy  Protonace/deprotonace
 Tautomerizace  Izotopová výměna
 Změny konformace NuA  Interakce hostitel-hos
4. Hmotností spektrometrie 2
4.1. Proč pracují hmotností separátory ve vakuu?
 Dochází k „naředění“ iontů a nedochází ke kolizím a vzájemné výměně energií
4.2. Jaký je princip ionizace FAB?

FAB = Fast Atom Bombardment / Bombardování rychlými atomy

 Polární analyt v polární kapalné matrici
 Vhodná pro větší molekuly, které nelze převést do plynného stavu (peptidy,
proteiny, mastné kyseliny, surfaktanty, polysacharidy)
 Používané matrice: glycerol, 1-thioglycerol, 3-nitrobenzylalkohol
 Ionizace absorpcí energie proudu urychlených atomů vzácného plynu (Xe, Ar, Ne)
 Urychlené atomy se získají kolizí s primárně vytvořenými ionty téhož prvku
 Vzorek je jako tenký film na kovové podložce

 Nejdříve se proudem elektronů generují ionty vzácného plynu. Ty jsou elektrostatickým polem
urychleny - předání elektroneutrálním atomům (stejného prvku) - vysoká energie = bombardován
vzorek
4.3. Jaké znáte techniky ionizace za atmosférického tlaku? Jednu vysvětlete.
4.4. Jakým způsobem dochází k ionizaci vzorku metodou APCI?
 Elektrosprej = ESI
 Ionizace v plynné fázy: El (), Cl ()
o Chemická ionizace za atmosférického tlaku = APCI
o Fotoionizace za atmosférického tlaku = APPI
 Ionizace v kapalné fázy: FAB = bombardování rychlými atomy
 Ionizace v tuhé fázy: desorpčně ionizační techniky (MALDI)

 Ionizace rozpouštědla (nejčastěji vody) následované přenosem protonu nebo náboje na molekuly
analytu
 Analyt je jako roztok přiváděn do rozprašovače s přiváděným dusíkem
 Kapky aerosolu procházejí vyhřívanou trubicí, kde dochází k částečné desolvataci proudu molekul
analytu a zbytku solventu vstupují do prostoru s elektrodou
 Korónový výboj - ionizace vody - molekuly analytu jsou ionizovány ionty vody H3O+
Indukčně vázané plazma
4.5. Nakreslete schéma TOF s reflektonem a vysvětlete důvod použití reflektonu.

TOF = Time Of Flight = Průletový separátor

 Ionty jsou urychleny v iontovém zdroji
 Různě velké ionty stejného náboje mají různou rychlost

a) Lineární
- Průchodnost až 90%
- Ionty vstupují s distribucí kinetické energie -> což zhoršuje hmotnostní rozlišení
b) S reflektorem
- Průlet iontů do elektrostatického pole reflektoru, změna směru dráhy, sjednocení
kinetické energie iontů stejného náboje (= sjednocení iontů o stejném m/z ??)
 Zlepšení hmotnostního rozlišení

4.6. Jaké síly působí na ionty v orbitrapu?

 Elektrostatický separátor
 Oscilace je daná rovnováhou mezi odstředivou silou rychle letících iontů pohybujících se
kolem elektrody a přitažlivou silou elektrostatického pole generovanou elektrodou.

Charakteristické frekvence oscilací:

o Frekvence kolem středové elektrody
o Frekvence radiální oscilace
o Frekvence axiální oscilace
4.7. Jaké měřící módy jsou možné v MSn?
 Vícestupňová analýze MSn je separace vybraných iontů následovaná řízenou fragmentací a
analýzou vzniklých sekundárních fragmentů
Měřící módy
 Měření produktorových iontů (product ion scan) = detekce F+ - strukturní analýza P+
 Měření prekurzorových iontů (precursor ion scan)
 detekce všeech P+, které dávají vybraný F+
 Hledání fragmentu typického pro určitou skupinu látek (methylestery m/z =
74, alkylaromáty m/z = 91,….)
 Měření neutrálních ztrát (neutral loss scan)
 měření všech P+, které svou fragmentací poskytují určitou neutrální ztrátu
 Měření vybraného přechodu reakce (selected reaction monitoring)
 registrace vybraných P+ a F+ -> umožňuje snížit LOD
4.8. Popište konstrukci spektrometru pohyblivosti iontů.

IMS = Ion Mobility Spectrometry

 Ionizace analytu následovaná separací v trubici s elektrostatickým polem, kterou v opačném
směru proudí kolizní plany (10-1 Pa)
 Pulzní vstup iontů z iontového zdroje

4.9. Vysvětlete princip spektrometru pohyblivosti iontů.

 Metoda založená na ionizaci plynného analytu a separaci vzniklých iontů v letové trubici
 Směřuje do kolizní cely (proti kolizní plyn) - zde generováno elektrostatické pole
 Kolizemi s neutrálními molekulami plynu se rychlost pohybu iontů směrem k detektoru snižuje.
 Výsledkem opakované akcelerace a zpomalené vlivem kolizí je rovnoměrný pohyb iontů směrem
k detektoru

Iontová mobilita K

- pro m >> M a konstantní N, T a M, závisí K pouze na q a Ω

5. Spřažené techniky I
5.1. Jakým typem gradientu se nejčastěji řídí eluce látek v GC a jakým v LC?
GC
 Nastavením teploty izokratická/gradientová
 Teplota je důležitá proměnná v plynové chromatografii
 Pokud je teplota kolony během analýzy vzorku konstantní, jedná se o isotermální analýzu
 Pro analýzu vzorku multikomponentních směsí látek s rozdílnými body varu je vhodné použít
teplotního gradientu, kdy se teplota kolony během analýzy bude měnit podle vytvořeného
teplotní programu
 Výhodou použití teplotního gradientu je zlepšení tvaru chromatografických píků (zúžení
signálu, vyšší citlivost) a výrazné zkrácení doby analýzy
LC
 Řízení eluce pomocí izokratická/gradientové eluce
 Izokratická - koncentrace (složení) mobilní fáze se nemění
 Gradientová - koncentrace (složení) mobilní fáze se nemění
 Změna složení mobilní fáze usnadňuje eluci látek
5.2. Proč při spojení GC-MS se používá jako mobilní fáze helium spíše než vodík a dusík?
 Helium zajišťuje dobrou užitečnost při analýze, na
druhou stranu je nákladnější než ostatní nosné plyny
 Volba nosného plynu je podle Van-Deemterova modelu:

5.3. Jaké ionizační techniky lze použít u GC-MS a u LC-MS? Stručně je popište.
GC-MS
o Ionizace v plynné fázi

o Elektronová ionizace

o Chemická ionizace
 Reakční plyn (CH4 -> CH5+; NH3 -> NH4+)
 Pseudomolekulární ionty (M+1)+; (M-1)+, adukty, negativn ionty
 Menší stupěň fragmentace
 LC-MS
o Rozhraní s nekonečným pásem (Moving Belt Interface)
o Rozhraní s proudem částic (Particle Beam Interface)
o kontinuální FAB
o ESI = elektrosprej

o Chemická ionizace za atmosférického tlaku

o Fotoionizace za atmosférického tlaku

5.4. Jaké tři režimy sběru dat se užívají ve spojení GC-MS nebo LC-MS?

GC-MS
1) skenování: záznam spektra ve vybraném rozsahu m/z
 Nižší rychlost – lepší LOD i citlivost
 Chromatogram jako časová závislost celkového proudu (TIC, total ion current)
 Rekonstruovaný chromatogram (RIC, reconstructed ion current)
2) Sledování vybraného iontu = SIM
 Zvýšení selektivity
 Lepší LOD i citlivost
 SIC, single ion chromatogram
3) Sledování vybrané reakce = SRM
 V kombinaci s vícenásobnou MSn analýzou
5.5. Vysvětlete pojem hmotností kalibrace v MS.
 Kalibrační látky používané v MS -> slouží jako standardy k seřízení MS kalibračního rozsahu,
jakož i relativní intenzity MS od nízké k vysoké hmotnosti látek
 Zvláště důležité pro MS v kombinaci s kvadrupólem
 Nejpoužívanější kalibrační sloučenina je FC-43, známý také jako
Perflourotributylamin
5.6. Jak je realizováno spojení GC-IR s průtočnou celou?
a) Vyhřívaná multireflexní průtočná cela
b) Chlazený disk (ZnSe) pro depozici a spektrální analýzu
6. Spřažené techniky II
6.1. Které částice se účastní ionizace plazmatem v technice ICP? Které tři mechanismy probíhají?
- Topografie rozložení teploty v plasmatu

- Cílem ICP-MS je maximalizovat množství monovalentních iontů a minimalizovat

množství iontů s vyšším nábojem

6.2. Jak jsou ionty převáděny z ICP do MS?

Vzorkování = soustava vzorkovací a odběrové clony - zachovává složení proudu iontů, omezuje jejich distribuci kinetické
energie a omezuje vznik polyatomických iontů
Fokusace = před vstupem do MS - prostřednictvím iontové optiky, musí zabránit rozptylu iontů (jsou stejné polarity,
mají tendenci se odpuzovat)
Separace = kvadrupólový separátor (MS)

6.3. Jaké znáte zdroje spektrálních interferencí v ICP - MS

1) isobarické ionty = ionty se stejnou nominální hmotou, ale odlišené látky N2, CO, C2H4
2) Dvojnásobně nabité ionty
3) Polyatomické ionty
6.4. Popište kroky korekce spektrální interference pomocí známého poměru přirozeného
zastoupení dvou izotopů.
- Vzájemná relativní četnost (intenzita) izotopů
prvků vyskytujících se v přírodě je konstantní

6.5. Vysvětlete roli kolizní cely užívané v ICP-MS.

 Eliminace spektrálních interferencí
 Spektrální interference zhoršují meze detekce některých prvků
1. Chladné plasma – plasma generováno při nižší energii (čím nižší
teplota, tím méně polyatomických sloučenin argonu) – obtížně
optimalizovatelné, problémy s matricí
2. Kolizní/reakční cela – reakční nebo kolizní disociace polyatomických částic reakcí s kolizním
plynem (H2, He nebo NH3)
3. Diskriminace kinetickou energií – polyatomické ionty se sráží častěji než jednoduché ionty, jejich
Ekin klesá rychleji

6.6. Co je principem eliminace interferencí v kolizní cele s diskriminací kinetickou energií?

 Slouží k eliminaci interferencí
- Kolizní cela s heliem
6.7. Krátce vysvětlete princip ionizace v cele s doutnavým výbojem.
= GD-MS
 Doutnavý výboj (glow dischrage) u povrchu katody v prostředí s inertním plynem o nízkém
tlaku
 Na povrch katody je fixován tuhý vzorek
 Kolizním plynem je Ar o tlaku 1,3 – 1,6kPa a proudu 0,1 – 0,2 A
 Geometrie GD zdroje jehlová katoda / plošná katoda
 Vytvořené kladné ionty, které vznikli kolizemi s elektrony odprašují
povrchové atomy vzorku
 Páry vzorku vstupují do zóny výboje, kde dochází k ionizaci
 Následuje hmotností spektrometrie (detekce ionizovaných atomů vzorku)

6.8. Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu těkavé metaloorganiky v atmosféře?
Vysvětlete proč.
 Jelikož se jedná o těkavou složku, preferoval bych separaci pomocí plynové chromatografie (GC) a
následně s koncovkou (MS) - elektronová ionizace = její výhoda je v tom, že tato spektra lze snadno
analyzovat prostřednictvím knihoven spekter
 GC-MS (přesnější GC-ICP-MS)

6.9. Jakou spřaženou techniku preferujete pro analýzu metaloproteinů ve vzorku buněčné kultury?
Vysvětlete proč.
 Permaeční chromatografie (SEC) na izolace frakce metaloproteinů; (ICP -MS) lze sledovat atomy, které
jsou cílem naší analýzy = vyskytujících se v metaloproteinech (Fe, Cu, Zn, … )
 Lze použít u (ICP -MS) standardy metaloproteinů (s daným prvkem) o známých koncentracích
 SEC-ICP-MS
7. Povrchová analýza I
7.1. Jaké techniky patří do skupiny fotoelektronové spektrometrie? U jedné z nich vysvětlete
princip emise fotoelektronů.
Rentgenová fotoelektronová spektrometrie = PES (XPS = rentgenová fluorescence, ESCA =
rentgenová fotoelektronová spektrometrie)
 Excitace fotony (X-Ray,/UV)
 Detekce elektronů
 Analýza pevných tuhých vzorků (vzorky ve vysokém vakuu)
o XPS
- Vzorek ozařován rentgenovým zářením -> emise elektronů (z vnitřních slupek
atomu) -> detekce intenzity elektronů dané energie
- Analýza tuhých, kapalných i plynných vzorků
- Fotoelektrony neuniknou z hloubky větší než 1-5 nm
- Spektrometr měří kinetickou energii emitovaných elektronů
- Kinetická energie elektronů má vztah k vazebné energii elektronů nebo energii
potřebné k odstranění z jeho orbitalu
 Fotoelektrony jsou separovány podle své kinetické
energie, detektor registruje počet elektronů dané
energie
 Aby povrch vzorku zůstal čistý je třeba ultravysoké
vakuum (až 10-8 Pa)
Ultrafialová fotoelektronová spektrometrie (UPS)
7.2. Jak se liší UPS od XPS?
o XPS
- používá rentgenového záření o energiích 200-2000 eV => analýza elektronů
z vnitřních slupek
o UPS (= rentgenová fotoelektronová spektrometrie)
- použití UV záření o energiích 10-45 eV = analýza valenčních elektronů
7.3. Nakreslete Bohrův diagram sodíku (jádro a všechny elektrony). Pokud dojde k interakci
rentgenového záření s jedním elektronem 1s, vysvětlete vznik píku ve fotoleketronové a
Augerově spektrometrii.

Fotoelektron sloužící k excitaci

 Následuje zaplnění elektronu z vyšší hladiny Rentgenová fluorescence detekce
charakteristické energie rentgenového záření hν
 Nebo může nastat zaplění elektronu z vyšší hladiny, vzniklá energie se využije na vyražení
dalšího elektronu Augerův elektron
 Spektrum:
 Rentgenová fluorescence = fotoelektrony jsou detekovány podle své kinetické energie, měřená
závislost XPS Intenzita = f (vazebné energie) - čím silněji vázaný elektron (jako ten 1s např.) je
potřeba vyšší vazebné energie na excitaci
 Augerův elektron = Projeví se ve stejném spektru, typický je spíše pro atomy s nižším atomovým
číslem. Nicméně, energie Augerova elektronu nezávisí na energii zdroje. Snadno odlišit od signál
XPS. Projeví se ve spektru jako extrapík. U Sodíku očekáváme signály pro vazebné energie
elektronů 1s,2s,2p,3s. Přesto 5 signálů

7.4. Které tři procesy probíhají po vyražení vnitřního elektronu? Pomocí diagramů energetický
hladin vysvětlete všechny tři.

As
o Excitace fotony i elektrony - Vyražení vnitřního elektronu
o Relaxační mechanismy - 1) zaplnění elektronu z vyšší slupky = Rentgenová
fluorescence x 2) Vznik Augerova elektronu - vzniklá energie se využije na vyražení
jiného elektronu
o Dojde ke stabilizaci
7.5. Jak lze identifikovat signály Augerových elektronů ve spektrech XPS? Uveďte vzorec popisující
kinetickou energii fotoelektronů a Augerových elektronů.
 XPS spektra obsahují i signály Augerových elektronů
 Lze je snadno identifikovat použitím jiného zdroje záření než při naměření původního
spektra
 Porovnáním spekter lze Augerovy elektrony identifikovat - Zatímco signály (energie)
Augerových elektronů se nezmění, energie ostatních fotoelektronů se posunou
 𝐸𝑘𝑖𝑛 = 𝐸𝐾 − 𝐸𝐿1 − 𝐸𝐿2,3 -> rozdíly energetických hladin jednotlivých slupek
7.6. Jak energie Augerových elektronů závisí na atomovém čísle? Zakreslete do diagramu.
 Konkurující proces rentgenová fluorescence
 Emise Augerových elektronů je dominující pro nízká atomová čísla (Z)
 Závislost kinetické energie Augerových elektronů na atomovém čísle
7.7. Jaké vlastnosti mohou být pomocí ESCA identifikovány? Jinými slovy, jaké chemické vlastnosti
ovlivňují chemický posun v ESCA spektru?
ESCA = více rozlišená XPS
 Lze získat informace o chemickém stavu (např. pozorování čtyř různých vazebných energií uhlíku 1s)
 Chemický posun ovlivňuje rozložení elektronové hustoty v blízkosti valenčních elektronů -
vlivem tvorby chemických vazeb = mění se elektrostatický potenciál
 Signály charakterizující atomové a molekulové orbitaly
 Jevy způsobující chemický posun: oxidační stav, chemická vazba, elektronegativita
sousedních atomů
 Povrchové mapování
7.8. Popište SIMS.
Hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů = SIMS (Secondary-ion ass Spectrometry)
 Informace o elementárním a chemickém složením
 Excitace a detekce: ionty
 Působíme primárními ionty a vznikají jiné ionty, které analyzujeme MS
Primární ionty
 Zdrojem je iontové dělo
 Paprsek iontů fokusován do bodu na
povrchu vzorku
 Energie > 10 keV
Sekundární ionty
 Povrchové atomy jsou odprašovány od
povrchu nebo implantovány hlouběji
 Malá část atomů je ionizovaná
 Odprášené atomy jsou zachyceny,
urychleny a fokusovány do
hmotnostního analyzátoru
7.9. Popište dva možné zdroje spektrálních interferencí v SIMS spektru.
 Interference molekul (C4H9 a 57Fe)
o Interference molekul o stejném atomovém čísle
o Jedná se ovšem a naprosto odlišné chemické individua (molekula organická
x atom)
 Izobarické interference ( 48Ca x 48Ti)
 Iontové klastry (40Ca2+ a 80Se+)
 Dvojnásobně nabité ionty dávají signál poloviční hmotnosti

8. Povrchová analýza II
8.1. Difrakční limit optické mikroskopie - jaká je jeho velikost a jaký parametr ho určuje?
𝜆
 Popsán Rayleighovým vztahem 𝑑 = 0,61 (𝑁𝐴)
d … vzdálenost dvou objektů, které lze rozlišit
λ … vlnová délka světla
NA … numerická apertura čočky –( n*sin(α)) -> míra schopnosti
objektivu soustředit paprsky a rozlišit jemné detaily vzorku při
stejné pozorovací vzdálenosti
  Optická mikroskopie patří mezi mikroskopie „vzdáleného pole“ – laterální rozlišení je
maximálně asi 200 nm
 Objekty o velikosti nižší než 200 nm nelze v optickém mikroskopu pozorovat
 Mikroskopické techniky „blízkého pole“ umožňují difrakční limit překročit, vlákno se
světelným kanálem <100 nm se pohybuje v bezprostřední blízkosti povrchu vzorku
 SNOM (Scanning Near-field Optical Microscopy) -> studium nanoobjektů, rozlišení až 30nm
8.2. Vysvětlete princip konfokální mikroskopie.
 Ozáření bodu v rovině zaostření -> detekce pouze záření odraženého (nebo emitovaného při
fluorescenci) v ozářeném bodu -> světlo z ostatních míst je potlačeno
 Výsledný obraz vzniká skenováním přes celý vzorek -> rekonstrukce obrazu v počítači
Výhody:
 Větší hloubka ostrosti
 Vyšší kontrast (chybí zobrazení míst mimo rovinu ostrosti)
 Vyšší poměr signál/šum (pro jeden bod; měření celého obrazu je časově náročné)
 Lepší efektivní rozlišení
8.3. Popište rozdíl mezi SEM a TEM - princip měření, příprava vzorku.
SEM = skenovací (rastrovací) elektronový mikroskop -> řádkovací
 Pracuje tak, že je na preparát směřován tenký svazek elektronů, který dopadá
postupně na všechna místa vzorku
 Preparát = 2-3 cm tlustý, 15 cm dlouhý. Musí být kvalitně pokoven. Zaostřený
svazek elektronů musí po povrchu rastrovat společně s detektorem
TEM = transmisní elektronový mikroskop -> prozařovací
 Viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, prošlým
studovaným vzorkem
 preparát musí být elektricky vodivý - pokován

8.4. Jaký druh elektronů vytváří nejčastěji obraz TEM a SEM? Vysvětlete princip vzniku těchto
elektronů.
 Různé interakce primárních elektronů se vzorkem (8 typů)
 SEM -> dochází k pěti interakcím, TEM -> dochází ke
třem druhům interakcí
SEM
1) Zpětněodražené (primární) elektrony
 Cca 30 keV
 Odraz způsobený kolizí primárních elektronů
dopadajících na vzorek pod úhlem 1800
 Intenzita zpětně odražených elektronů je úměrná
atomovému číslu atomů vzorku
 Elektrony jsou odráženy z širšího okolí kolem místa
fokusace elektronů na povrch vzorku -> omezení
rozlišovací schopnosti SEM
2) Sekundární elektrony
 Cca 5eV
 Vznikají interakcí primárního elektronu s elektronem atomu, v jehož blízkosti prochází, část
energie primárního elektronu způsobí emisi elektronu z atomové slupky (obvykle K)
 Sekundární elektron opouští vzorek s nízkou kinetickou energií
 Interakce primárního elektronu vede ke vzniku několika sekundárních elektronů
 Tvoření sekundárních elektronů úzce souvisí s topografií povrchu -> díky jejich ízké energii
se detekují pouze bezprostředně u povrchu
3) Augerovy elektrony
 10 eV - 2 keV
 Způsobené relaxací ionizovaného atomu po emisi sekundárního elektronu
 Charakteristická energie Augerových elektronů umožňuje elementární analýzu
 Nízká energie; emitovány pouze z nanometrové tloušťky povrchu
4) Emise rentgenové fluorescence
 Relaxace ionizovaného atomu po emisi sekundárního elektronu
 Emitované rentgenované záření má energii (λ) charakteristickou pro daný prvek
 Mapování elementárního složení na povrchu analyzovaného vzorku

5) Katodoluminiscence
 Způsobená párem elektron-díra, vznikající interakcí primárních elektronů s některými
materiály
 Při rekombinaci tohoto páru může dojít k emisi záření od UV po IR -> intenzita bývá nízká
 Způsobují ji obvykle nečistoty v homogenním vzorku nebo mřížkové defekty v krystalu
 analýza skel, …
TEM
1) Nerozptýlené elektrony
 Primární elektrony prochází vzorkem bez vzájemné interakce
 Prvky s vyšším atomovým číslem brání průchodu elektronů
 Kontrast obrazu vzniká na základě množství prošlých elektronů -> tlustší částí vzorku se jeví
tmavší -> tenčí světlejší
2) Elasticky rozptýlené elektrony
 Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem elasticky rozptýleny (bez ztráty energie)
 Primární e mají stejnou energii a dopadají kolmo na vzorek - jsou rozptýleny pod stejným
úhlem odpovídající meziatomové vzdálenosti => Braggova rovnice - informace: uspořádání
atomů, orientace a fáze atomů ve vzorku
3) Neelasticky nerozptýlené elektrony
 Primární elektrony jsou při průchodu vzorkem rozptýleny a ztrácí energii (neelastický rozptyl)
 Využití: Spektroskopie ztráty energie elektronů, Kakuchiho pásy
8.5. Popište následující techniky STM, AFM, SNOM.

STM = Rastrovací tunelová mikroskopie (Scanning Tunneling Microscopy)

Tunelový jev
- Kvantově-chemický jev spojený s uvězněním elektronu v prostoru (model potenciálové
jámy)
Kladný potenciál na vzorku
 Tunelovací proud vzniká přechodem elektronů
z obsazených hladin sondy do prázdných hladin
vzorku
Záporný potenciál na vzorku
 Tunelovací proud vzniká přechodem elektronů
z obsazených hladin vzorku do prázdných hladin
sondy
Tunelovací proud
- Díky exponencionální závislosti proudu na vzdálenosti d je vysoká
citlivost měření výškového profilu povrchu vzorku
- Sonda se připravuje řezáním a elektrochemickým leptáním

AFM = mikroskopie atomárních sil (Atomic Force Microscopy)

- Měří síly působící mezi sondou a povrchem, síly mohou být
atomární, laterální, magnetické, …

SNOM = Mikroskopie v blízkém optickém poli (Scannine Near-fielf Optical Microscopy)

- Optická mikroskopie v nanoměřítku (desítky nanometrů)
- Hrot sondy musí být velmi blízko povrchu vzorku (5-50 nm)
9. Analýza chirálních látek
9.1. Vysvětlete pojem chiralita, optická aktivita, racemát, enantiomerní čistota.
Chiralita
 Vlastnost objektu - chirální objekt není ztotožnitelný se svým zrcadlovým obrazem
 Nemá střed ani rovinu symetrie, může ale mít rotační rovinu symetrie
Optická chiralita
 je schopnost chirálních látek stáčet rovinu polarizovaného světla.
Racemát
 Směs enantiomerů v molárním poměru 1:1
 Separují se, pokud interakcí s chirálním selektorem vznikne diastereomerní pár, který lze
separovat
Enantiomerní čistota
 Vyjádření obsahu jednotlivého enantiomery (100% pouze jeden enantiomer x 0% racemát)
[𝑆]−[𝑅]
 𝑒𝑒(%) = [𝑆]+[𝑅] ∗ 100%
9.2. Nakreslete a popište schéma polarimetru. Vysvětlete princip měření.
 Přístroj měřící úhel rotace (neboli změnu polarizovaného světla)
 Stáčení roviny lineárně polarizovaného světa
 Enantiomery stáčejí roviny polarizovaného světla doprava/doleva v důsledku odlišných
indexů lomu

9.3. Vysvětlete princip spektrometrie cirkulárního dichroismu. Jaká veličina je zde měřena?
 Používá se cirkulárně (kruhově) polarizované záření, z kterého dostáváme průchodem
vzorku elipticky polarizované záření
 Enantiomery vykazují rovněž různé absorpční koeficienty pro enantiomery stačící rovinu doleva/doprava
 Měří se rozdíl absorbance L-CPL a R-CPL chirální molekulou => ΔA=AL-AR
 Graf: osa x = vlnová délka; osa y = elipticita, molární elipticita, cirkulární dichroismus
 Metody měření: Electronic CD; Vibrational CD
9.4. Vysvětlete princip spektrometrie Ramanovy optické aktivity. Jaká veličina je zde měřena?
 Zaleženo na principu Ramanova neelastického rozptylu
 Chirální molekuly rozptylují kruhově polarizované záření (ICP) či lineárně polarizované záření (SCP)
 ICP a SCP - cirkulárně polarizované záření po rozptylu, sledujeme rozdíl 𝐼𝑅 − 𝐼𝐿 ≠ 0
 Měří se rozdíl intenzit vpravo a vlevo cirkulárně polarizované složky rozptýlené záření vlivem
interakce s chirální molekulou
𝐼𝑅 −𝐼𝐿
 ∆= => ∆ 𝑗𝑒 𝑣 řá𝑑𝑢 10−3
𝐼𝑅 +𝐼𝐿
9.5. Vysvětlete princip enantioselektivní interakce.
Enantioselektivní interakce = pro tuto interakci je nutné minimálně tří odlišných interakcí
 Vytvoří se komplex - může být i kovalentní vazba, mnohem častěji se ale vyskytuje
nekovalentní
Chirální rozpoznávání: schopnost CSP tvořit různou měrou s jedním a druhým enantiomerem
diastereomerní komplexy (podmínka minimálně tří interakcí) např.:
 Vodíková vazba
 𝜋 − 𝜋 interakce
 Van der Waalsovy interakce
 Stérické interakce
9.6. Uveďte alespoň dva příklady chirálních selektorů užívaných v chromatografii. Vysvětlete
princip chirální separace.
Chirální separace
- Interakce chirálního analytu (dva analyzované enantiomery) x chirální selektor. Pouze
neztotožnitelné objekty mají možnost tvořit (ne)kovalentní interakce. Enantiomery + S-
izomer (selektor) = diastereoizomery. Podmínka min. 3 odlišných interakcí - separace
prostřednictvím chirální stacionární fáze
Chirální selektory použití
polysacharidy Univerzální použití; SFC
Pirklovy báze Specifická aplikace -> rozhoduje rozpustnost v používané
MF; SFC
makrocyklická antibiotika Specifická aplikace -> rozhoduje rozpustnost v používané
MF; SFC
cyklodextriny
proteinové fáze Biologické vzorky, aromatické drogy
10. Kinetické metody
10.1. Napište diferenciální a integrální tvar rychlostní rovnice prvního řádu.

Diferenciální tvar:
𝑑[𝐴]
𝑣=− = 𝑘[𝐴]
𝑑𝜏

Integrální tvar:
[𝐴𝜏 ]
ln ( ) = 𝑘𝜏
[𝐴𝑜 ]

10.2. Stručně popište a srovnejte následující rychlostní metody:

A) Metoda počáteční rychlosti
 Využívá diferenciální tvar rovnic
 Určuje se rychlost reakce na počátku, odpovídající směrnici křivky v daném bodě
(směrnice křivky - závislost (A) = f(t) v daném bodě v= -ΔA/Δt)
 Rychlosti reakcí jsou odečteny pro kalibrační roztoky v daném čase -> z proložené
kalibrační křivky se poté odečtou koncentrace analytu v neznámém vzorku
 Koncentrace analytu je úměrná pozorované reakční rychlosti
 Vysoká citlivost (rychlost reakce je nejvyšší na začátku reakce a časem klesá)
 Na začátku reakce se dá průběh závislosti koncentrace analytu na čase aproximovat na
přímku (zhruba do 2% zreagovaného analytu) -> požadovaná hodnota rychlosti se poté odečte
jako směrnice dané přímky
- V Průběhu reakce může docházet i k dalším vedlejším reakcím = interference
- Krátký čas na promíchání činidel
B) Metoda střední rychlosti
 Určuje se rychlost reakce po jejím částečném proběhnutí
(směrnice křivky - závislost (A) = f(t) v daném bodě v= -ΔA/Δt)
 Na rozdíl od A) je výhodou této metody dostatečný čas na promíchání činidel

10.3. Vysvětlete princip průtokové vstřikovací analýzy (FIA), nakreslete a popište schéma
zařízení.
FIA = Průtoková vstřikovací analýza (Flow Injection Analysis)
 Reakce probíhá za chodu přístroje
 Malý objem vzorku je v pravidelných intervalech nastřikován do proudu nosného plynu
- Měřený signál je výsledkem dvou fyzikálních procesů:
1. Fyzikálního - disperze (rozšiřování) zóny v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny
a kapaliny) = různý rychlostní profil toku turbulentní x laminární
2. Chemického -Daná kinetikou reakce činidel s analyty
 Spolehlivá, rychlá a snadno automatizovaná metoda
10.4. Vysvětlete princip průtokové vstřikovací analýzy (SIA), nakreslete a popište schéma
zařízení.
SIA = Průtoková vstřikovací analýza (Sequential Injection Analysis)
 Obdoba FIA
 Obrácení směru nosného proudu

 Lepší promíchání reakční směsi

 Jednodušší instrumentální zařízení
 Flexibilita a robustnost
- Omezení množství činidel
10.5. Vysvětlete pojem disperze vzorku ve vstřikovacích analýzách. Jak je matematicky
definován? Jaké druhy (příčiny) disperze znáte?
Matematicky definováno jako disperze analytu:
𝑪𝒐 Co = počáteční koncentrace analytu
𝑫=
𝑪𝒎𝒂𝒙 Cmax= Detekovaná koncentrace analytu

Disperze vzorku:
 Je funkcí času
 Jedná se o rozšiřování zón signálu
 Detekovaný signál je rozšiřován z různých přičin
Příčiny disperze vzorku:
1. Fyzikálního - disperze (rozšiřování) zóny v důsledku různých rychlostí toku tekutin (plyny a
kapaliny) = různý rychlostní profil toku turbulentní x laminární
2. Chemického -Daná kinetikou reakce činidel s analyty
3. Molekulová difúze v MF a SF (chromatografie) - molekulová difúze v MF závisí na lineární
rychlosti MF; molekulová difúze v SF je daná různým prostupem (hloubkou prostupu) složky
do vrstvy vázaní SF na nosiči a různém zadržení v SF
11. Radioanalytické metody
11.1. Jaké druhy detektorů ionozizujícího záření znáte? Stručně popište jeden z nich

Nespektrometrické detektory
 základní detekce částic nebo fotonů, měří pouze intenzitu záření
 filmové a termoluminiscenční dozimetry, ionizační komory včetně Geiger-Müllerova
detektoru
 ionizační komora
- anoda a katoda umístěná v inertním plynu (argon) s vloženým napětím (150 – 200V)
- působením záření dochází k ionizaci a k protékání proudu (10-16 – 10-9 A)
- lineární odezva v širokém rozsahu intenzit záření

 Geiger-Müllerův detektor
 proporcionální detektor

Spektrometry ionizující záření

 měří intenzitu v závislosti na energii záření
 scintilační detektory, polovodičové detektory, magnetické spektrometry
 scintilační detektory
- po absorpci záření vhodným materiálem (scintilátorem) dochází ke vzniku světelných záblesků
(scintilací)
- nejpoužívanější scintilátor je monokrystal jodidu sodného aktivovaný thaliem (NaI(Tl))
- nebo kapalné scintilátory: toluenový roztok 2,5-difenyl-1,3-oxazol nebo 1,3,4-oxadiazol
- záblesky se detekují na fotonásobiči

 detektor Čerenkovova záření

- analogie ke scintilačním detektorům

Zobrazovací detektory
 kamery – zobrazují prostorové rozložení intenzity záření
 fotografický film, luminiscenční stínítka, multidetektorové systémy
Dráhově detektory částice
 zviditelňují či vyhodnocují dráhy pohybu jednotlivých částic v prostoru

11.2. Vysvětlete princip scintilačního detektoru

 měří intenzitu v závislosti na energii záření
 scintilační detektory polovodičové detektory, magnetické spektrometry
 scintilační detektory
- po absorpci záření vhodným materiálem (scintilátorem) dochází ke vzniku světelných záblesků
(scintilací)
- nejpoužívanější scintilátor je monokrystal jodidu sodného aktivovaný thaliem (NaI(Tl))
- nebo kapalné scintilátory: toluenový roztok 2,5-difenyl-1,3-oxazol nebo 1,3,4-oxadiazol
- záblesky se detekují na fotonásobiči

Postup:
 Primární kvantum (hv) - dopad/Absorbce materiálem - ionizace a vyražení elektronu - excituje další molekulu - ta
deexcituje za uvolnění scintilačního fotonu = detekován

11.3. Jaké signály lze gama spektrometrií pozorovat ve spektru radionuklidu, jenž při rozpadu
emituje záření gama jediné energie?
 Měření energií gama záření emitovaného radionuklidy přítomnými ve zkoumaném vzorku
(např. geologickém)

Gama spektrum vzorku = závislost četnosti emitovaných fotonů na jejich energii

 Radionuklid je charakterizován danou energiemi vyzařovaného gama záření a relativní
intenzitou intenzitou -> kvantitativní a kvalitativní analýza
 Spektrální čáry jsou velice úzké -> jejich šířka je omezena rozlišovací schopností použitého
spektrometru
 Gama paprsky (𝜸) prochází vzorkem a dochází k sekundárním interakcím, které se ve
spektrech projeví
𝑪𝒔𝟏𝟑𝟕 = 𝑩𝒂∗𝟏𝟑𝟕 + 𝜷−
𝑩𝒂∗𝟏𝟑𝟕 =𝑩𝒂𝟏𝟑𝟕 + 𝜸
Sekundární interakce:
1) Fotoelektrický jev (E<100 keV)
 Úplná absorbce gama fotonu
 Gama foton vyrazí z látky silně vázaná elektron z vnitřní slupky
 Zpětné zaplnění z vyšší slupky rentgenová fluorescence x vznik Augerova elektronu
2) Comptonův rozptyl (0,1MeV<E<1 MeV)
 Interakce gama fotonu a elektronu slabě vázaného v atomu
  Gama foton mění směr, zvýšení vlnové délky = nižší energie gama fotonu
 Ve spektru spojité pozadí
3) Vznik elektron-pozitronového páru (E >1,022 MeV)
 Průlet gama fotonu v dosahu Coulombické síly jádra
 Anhilace = zánik gama fotonu (E= 1,022 MeV) a vznik dvou částic pozitron a elektron
 Následné anhliace pozitron s jiným elektronem - vzniká dvojice gama fotonů, které se šíří
opačným směrem (oba o energii E=0,511 keV) = polovina E=1,022 MeV)

11.4. Nakreslete a popište schéma gama spektrometru

Scintilátor - princip viz. 2.

Fotonásobič = Dopad kvanta na dynodu vyvolává emisi většího počtu elektronů (tzv. sekundární emise), jejímž
výsledkem je znásobení počtu elektronů. Po sérii zesílení proud elektronů dopadá na anodu = měření optického
signálu
Zesilovač - zesílí signálu
Vícekanáloválový analyzátor - čítač napěťových pulzů vyvolaných fotonu. Jednotlivé kanály detekují pulzy určité
amplitudy. Výsledkem je histogram počtu pulzů v jednotlivých kanálech, číslo kanálu je úměrné energii fotonu

11.5. Proč lze naměřit absorpci gama záření pouze u pevných vzorků?
 Gama paprsky procházejí pevným vzorkem a dochází sekundární interakci, která se projeví
v naměřených spektrech
- absorpce či emise gama záření volných jader je spojena s hybností jader
 - Jádro může v klidovém stavu emitovat gama záření, které je ale nižší než je energie daného
přechodu (základní stav - excitovaný stav) a absorbované záření musí mít vyšší energii než je
energie daného přechodu. (energie přechodu je větší o energii zpětného rázu - změna hybnosti)
- Jaderná rezonance = emise a absorbce stejného gama záření identickými jádry
 Je nepozorovatelná! U volných jader
- Řešení: Fixace jader v krystalové mřížce
- Nemůžou podléhat zpětnému rázu
- Emise a absorbce gama záření vede ke ztrátě energie ve formě fononů = částice šířící kvantum
v krystalové mřížce
- Počet fononů libovolný, včetně nuly = nedojde k zpětnému rázu
- Změna hybnosti celého krystal

11.6. Popište princip M𝐨̈ ssbauerovy spektrometrie.

 Rezonanční gama spektrometrie
 Zaznamená velmi malé změny v energetických hladinách jader atomů v závislosti na jeho okolí
(oxidační stav, chemická vazba, …)
 Pevný vzorek je vystaven gama záření
 Měří se intenzita záření prošlá vzorkem
 Zdroj musí obsahovat stejné izotopy, jako jsou atomy v analyzovaném materiálu

Jaderné interakce mohou způsobovat:

 Izomerní posun = analogie k chemickému posunu u NMR
 Kvadrupólové štěpení = (u jader s kulově nesymetrickým rozložením náboje, štěpení
hladin v závislosti na jaderném magnetickém spinovém čísle)
 Magnetické (hyperjemné) štěpení =interakcí s vnějším magnetickým pólem
Výhody:
 Lze sledovat změny v oxidačním stavu
 Efekty různých ligandů
 Magnetické okolí vzorku
Nevýhody:
 Omezené množství gama zářič
 Možnost analyzovat pouze pevné vzorky
Použití: (geologie = identifikace vzorků obsahující železo; biochemie = analýza
metaloproteinů obsahující železo (oxidační stav a množství přítomného železa)
12. Bioanalytické metody
12.1. Jaké detekční techniky používají Bioanalytické metody? Stručně popište princip jedné
z nich.

1. Detekce průběhu reakce

o Manometrické metody – dnes se téměř nepoužívají
 analýza uvolněného nebo spotřebovaného plynu
2. Spektrofotometrická detekce
 Používá se pro substráty či produkty s odlišnou absorpční oblastí v UV, VIS, IR
 Lepší je měřit nárůst koncentrace než její pokles
 Vybírat vlnovou délku odpovídající maximální absorpci jedné složky

3. Fluorescenční detekce
4. Chemiluminiscenční detekce
5. Polarimetrická detekce
6. Elektrochemická detekce
o Potenciometrie, amperometrie, coulometrie, polarografie
7. Radiometrická detekce

12.2. Popište princip spektrofotometrické metody používající ke stanovení enzymů s kofaktory

Fluorescenční detekce
 Např. přeměna kofaktoru NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid) na NADH
dehydrogenázou (oxidoreduktáza)
 Princip tohoto měření vychází z toho, že lze měřit substrát, který se red/ox
systém NAD+/NADH oxiduje = následně se měří absorpce při vlnové délce 340
nm, kde selektivně absorbuje NADH než NAD+

12.3. Jaký je princip radioimunoalanýzy? Jaké detektory se používají?

RIA
 Princip vychází z kompetice (soupeření) radioaktivně značených antigenů a antigenů ve
vzorku
 Na dané protilátky váží kompetitivně radioaktivní či vzorkové antigeny
 Následně se měří radioaktivita => ta je nepřímo úměrná koncentraci antigenu ve vzorku
 Vysoká selektivita -> imunochemické stanovení
 Vysoká citlivost
 Detektory:
12.4. Vysvětlete princip následujících technik ELISA: (ne)přímá, (ne)kompetitivní

ELISA
PŘÍMÁ NEKOMPETITIVNÍ
- Interakce imobilizovaného antigenu a značené protilátky - promytí - substrát - spektrofotometrie

PŘÍMÁ KOMEPETITIVNÍ
- Interakce imobilizované protilátky a antigenu značeného x antigen ze vzorku - promytí. Dochází
ke kompeticím mezi vazebnými místy protilátky a konkurujícím typy antigenů - spektrofotometrie

NEPŘÍMÁ NEKOMPETITIVNÍ
- Imobilizovaná protilátka - promytí - antigen - protilátka proti antigenu (sendvičové uspořádání) -
promytí - protilátka (kozí protilátka s křenovou peroxidázou) proti konstantní oblasti protilátky -
promyti - substrát – spektrofotometrie
 NEPŘÍMÁ KOMPETITIVNÍ

12.5. Nakreslete a popište kalibrační závislost pro přímou a nepřímou ELISA.

Přímá ELISA

Nepřímá ELISA
12.6. Vysvětlete princip diagnostických testů založených na laterální chromatografii.
 Imunochromatografie -> podélný tok
 Analyt ze vzorku nanesen na destičku (membránu)
 Pokud je analyt ve vzorku - v další části interaguje s barevně značenými protilátky (specifická interakce
antigen-protilátka)
 Kapilární tok zajišťuje migraci analyt (antigen) - značená protilátka
 Následují v pořadí pozitivní linie (linie protilátek) a kontrolní linie (linie anti-IgG protilátek)
 Pokud je test pozitivní (antigen (analyt) - barevná protilátka se naváží na pozitivní linii = barevný pruh
+ vazba barevně značených protilátek s negativní linií) = výsledkem jsou tedy dvě linii = pozitivní
 Jedna linie (negativní linie) = test negativní
13. Chemické senzory a biosenzory
13.1. Co je to chemický senzor? Jaký je rozdíl mezi chemickým senzorem a biosenzorem?
 Zařízení převádějící nějaký chemický signál na analyticky využitelný signál, například se jedná o
vztah koncentrace analytu ve vzorku a měření libovolné optické závislosti (absorbance, emise, rozptyl, …)
 Rozdíl mezi chemickým senzorem a biosenzorem je hlavně v použití různých selektorů:

Chemický senzor:
 Mikrostruktura povrchové anorganické vrstvy nebo organické „receptory“ – synteticky
vyrobené molekuly schopné selektivní interakce s analytem
 VÝHODA: vyšší odolnost ke změnám podmínek měření
 Porfyriny, kalixareny, korunkové ethery, cyklodextriny

Biosenzor:
 Makromolekuly poskytující afinitivní interakce s analytem
 VÝHODA: vyšší selektivita
 Enzymy, lektiny, protilátky, úseky nukleových kyselin, polypeptidy
 aptamer (synteticky vytvořené vlákno RNA či ssDNA), protilátky (poly, monoklonální), enzymy

13.2. Popište jednotlivé části chemického senzoru. Uveďte příklad optického nebo
elektrochemického senzoru - popište princip jeho funkce.

Chemický sensor
- Zařízení převádějící chemickou informaci (složení vzorku, obsah přítomných analytů) na
analyticky využitelný signál
Molekulový (iontový selektor) - selektivita interakce analyt x selektor je založena různých principech (
velikost částic, bioafinitivní interakce, nekovalentní interakce). Typy chemických senzorů (ionofory,
cyklodextriny, kalixareny, bipyridiny, a další)
Převodník - na základě různé fyzikálně-chemické interakce (změna koncentrace - elektroda, změna teploty
- termistor, změna hmotnosti - piezokrystal) převádí chemický signál na signál analyticky měřitelný signál.
Typy senzorů:

Optické senzory
 Absorbance, reflektance, rozptyl, fluorescence
 Prostřednictvím optických vláken je optický signál veden na delší vzdálenost (totální
odraz)
 Paprsek může při analýze a) procházet vzorkem nebo b) využití evanescentní vlny (ATR)
 Převedení na elektrický signál

Elektrochemické senzory
 Voltametrické či potenciometrické měření
13.3. Jak lze skleněnou elektrodu využít jako biosenzor?
 Stejně tak jako běžná skleněná elektroda měří koncentraci H+ iontů = pH
 Skleněnou elektrodu lze využít i jako biosenzor aplikací enzymů na elektrodu a měření
změny pH při průběhu reakce
 Imobilizace enzymů na elektrodách může být různá:
 Upevnění naneseného enzymu dialyzační membránou
 Fyzikální zachycení na povrch (polymerace gelu s enzymem na nylonové či silonové
síťce - snadná výměna sítěk)
 Přímá polymerace gelu s enzymem na elektrodě

13.4. Popište konstrukci a princip Clarkova čidla pro stanovení kyslíku. V jakých aplikacích ho lze
využití?

Clarkovo čidlo
 Řadí se mezi amperometrické senzory
 Měření závislosti protékajícího proudu mezi dvěma elektrodami při konstantním napětí na
množství elektroaktivního analytu ( I=f(množství analyty); U=konst.)
 Elektroaktivní analyt je v kapalné fázi
 U Clarkova čidla se používá kovová elektroda (Au,Pt, Ag) překryta membránou o určité
permeabilitě kyslíku
𝐹𝑑
𝑃=
𝐴∆𝑝
P = permeabilita plynu; F = objemový průtok plynu; d = tloušťka membrány, A = plocha membrány; Δp = rozdíl
tlaků na jedné a druhé straně membrány
 Při stanovení kyslíku je mezi pracovní a referentí elektrodu vloženo napětí U= 0,65 V Probíhá
katodická redukce kyslíku na vodu = zaznamená protékajícího proudu
𝑐(𝑂2 )
𝐼 = 𝑘𝑧𝐴𝑃
𝑑
K = konstanta; z = počet vyměněných elektronů (4); A = plocha měřící katody; P = permeabilita plynu; d = tloušťka
membrány
Aplikace:
- Čidlo pokryté polyamidem se zakotveným enzymem (peroxidasa) = měření glukosy,
cholesterolu, močoviny, …
 - Obdobné senzory amperometrické: Lambda sonda (měřícící koncentraci oxidů vzniklých
při spalování v motoru aut); měření adrenalinu - enzym polyfenoloxidasa
Konstrukce:

13.5. Vysvětlete, jakým způsobem ovlivňují redukující plyny odezvu plynových senzorů Figaro
(TGS senzory)?
 Patří mezi voltametrické senzory
 K detekci reaktivních hořlavých, výbušných, jedovatých plynů (průmysl, doprava,
bezpečnostní systémy)
 Měření závislosti protékajícího proudu na vloženém napětí (dochází k poklesu napětí na
rozhraní sintrovaného SnO2 v přítomnosti redukujícího plynu)
 Tato závislost = voltametrická křivka někdy také jako polarizační křivka

13.6. Popište princip elektronických nosů a jazyků.

 Využití elektrodových polí pro vzorky plynné (nosy) a kapalné (jazyky)
 Senzorové pole - kombinace senzorů o různé selektivitě, každý nemusí být maximálně
selektivní
 Vzniklé analytické signály jsou déle zpracovány (vyhodnoceny) prostřednictvím
vícerozměrné analýzy:
 Lineárními modely (LDA, PCA, PCR, PLS), klastrovou analýzou, neuronovými sítěmi
14. Procesní analytická chemie
14.1. Vyjmenujte a charakterizujte typy procesní analýzy, vyjmenujte jejich hlavní výhody a
nevýhody.

OFF-LINE
- Vzorky transportovány do laboratoře
- V dávkovém zpracování, je-li počet vsádek malý a příprava vzorku či
analýza obtížně automatizovatelná
 Sofistikované přístroje, školený personál
 Prodlení spojené s dopravou vzorku, manuální vzorkování, nízká vzorkovací
frekvence

AT-LINE
- Přístroj umístěn v provozu
- Jestliže částečná automatizace nevyžaduje zvláštní dovednosti, analýza
na místě je preferovaná
 Odpadají problémy transportu vzorku, přístroj upraven podle
konkrétních potřeb
 Vyžaduje školený personál, agresivní postředí, výsledky často nedostatečně
aktuální, manuální vzorkování, nízká vzorkovací frekvence

ON-LINE
- Automatický odběr vzorků přímo z výroby
 Vysoká vzorkovací frekvence
 Cena potřebného připojení, poruchy vzorkovacího systému

IN-LINE
- Bez odběru vzorku z procesu
- Odpadá odběr a příprava vzorku
 Významná úspora času, robustnost, přátelskost užití (možnost
záměny pracovníků), méně náchylná k poruchám, velmi vysoká
vzorkovací frekvence
 Obtížná kalibrace, zanášení vzorků usazeninami

14.2. Vyjmenujte požadavky kladené na procesní analyzátory.

- Robustnost vzhledem k charakteru pracovního prostředí, teploty, vlhkosti, …
- Schopnost vzorkovat a analyzovat materiály za vysokého tlaku/teploty
- Materiály různého charakteru (viskózní či práškový), pracovat s nevodným prostředím,
často v agresivním prostředí
- Automatický sběr a zpracování dat, bez dohledu dny i týdny
- Stabilní dlouhodobá kalibrace, schopnost autokalibrace
- Obvykle méně univerzální, upravené pro určité měření
- Výroba z trvanlivých prvků, co nejméně pohyblivých prvků -> jednoduchost
14.3. Vyjmenujte prvky procesního analyzátoru a stručně jej charakterizujte.
Základní prvky procesního analyzátoru:
1) Vzorkovací systém (reprezentativní vzorek)
 Nutnost zabránit kontaminaci vzorku
 Přednost odběru vzorku v pohybu (kapaliny, plyny prostřednictvím ventilů u tuhých
látek přímo z transportéru)
 Velikost vzorků není libovolná (ovlivněna zrnitostí, homogenitou, obsahem analytu, …)
 Plyny => plynová pipeta
 Kapalné látky => odběr z více míst, hloubek a následné spojení do reprezentativního vzorku
 Tuhé látky => u nehomogenních odběr 2% celkové hmotnosti - následuje mletí, kvartace, …
2) Systém přípravy vzorku (např. filtrace)
3) Systém úpravy vzorku pro podmínky přijatelné analyzátorem (např. ředění)
 Spojené s bodem 2)
 Filtrace, ředění, úprava pH nebo teploty
4) Analyzátor či senzor
 Senzory viz 13. Přednáška
Plyny:
o Elektrochemické metody - analýza plynů (Clarkovo čidlo)
o Spektrofotometrické metody - UV,VIS, IR
Kapaliny:
o Elektrochemické metody - Potenciometrie, ISE, skleněná elektroda, Voltamterie,
Amperometrie
o Spektroskopické metody - pomocí vláknové optiky: transmisní měření, ATR
měření (IR), fluorescence, reflektance
o Nepřímé měření pomocí vstřikovacích analýz: průtoková injekční analýza (FIA),
sekvenční injekční analýza (SIA), kontinuální průtoková analýza (CFA) segmentovaná
průtoková analýza (SFA)
5) Výstup dat do řídicího systému
 Kalibrace
 Zpracování dat z různých metod prostřednictvím datových softwarů

14.4. Jaké analytické metody lze použít v procesních analyzátorech:

 Elektrochemické: Potenciometrické (ISE (fluoridy); skleněná elektroda (pH),
potenciometrická titrace), amperometrické = analyzátory plynů (plynové senzory
FIGARO), voltametrické = Clarkovo čidlo (O2)
 Spektrofotometrické: Měření v UV, VIS, IR - transmisní měření, ATR, fluorescence,
reflektance
 Nepřímé měření vzorků kapalin pomocí vstřikovacích analýz: průtoková injekční analýza
(FIA), sekvenční injekční analýza (SIA), kontinuální průtoková analýza (CFA) segmentovaná
průtoková analýza (SFA)

Jedna z variant 2.2.: 1.5, 3.1, 4.9, 6.5, 7.1, 11.6, 12.4, 13.5