RNK svet – prvi život na planeti Zemlji

Hipoteza RNK sveta

Prvi “molekuli života” na planeti
Zemlji – RNK – sposobnost
replikacije i katalitičke funkcije

Tokom evolucije
... RNK “prepustili”
– čuvanja informacije →
molekulu DNK – stabilniji
– katalitičke funkcije →
proteinima – razvnovrsniji
katalizatori
Genomi nekih virusa su molekuli
RNK – RNK virusi

HIV

Katalitička funkcija RNK – ribozimi

 rRNK – formiranje peptidne veze
tokom sinteze proteina
 snRNK – reakcije trensesterifikacije
tokom iskrajanja introna i spajanja
egzona
 Genom

Transkriptom

Proteom
The Encyclopedia
of DNA Elements
 Novi RNK svet
Molekuli RNK su nastavili da
evoluiraju uporedo sa DNK i
proteinima

Danas znamo da najdelikatnije

funkcije regulacije ekspresije i
stabilnosti genoma obavlja čitav
niz regulatornih molekula RNK
 RNK obavlja različite funkcije u ćeliji

Prvi “molekul života”

Verni otisak gena

Dekodirajući molekul
Strukturni molekul
Katalitički molekul
Nosilac genetičke informacije

Regulatorni molekuli
 Genom

Transkriptom

Proteom

Skriveni jezik RNK

 male nekodirajuće RNK

 duge nekodirajuće RNK

Duge nekodirajuće RNK

Inaktivirani
X hromozom

 Epigenetička regulacija
 Transkripciona i post-transkripciona regulacija
 Post-translaciona
 Strukturna uloga
 Male nekodirajuće RNK

• Mašineriju za utišavanje ekspresije gena- RISC,

usmeravaju ka ciljnoj RNK kroz
komplemantarno sparivanje baza

• Mehanizam utišavanja ciljnih RNK ili gena koji

su komplementarni sa malim regulatornim
molekulima RNK - RNK interferencija

• Ključne efektorne komponente RISC - proteini

familije Argonaut (AGO i PIWI),
 RNK interferencija
Prekursor – dvolančana
RNK (dsRNK)

Dicer – seče dsRNK

na parčiće (siRNK)
Antisense lanac
siRNK se udružuje sa
RISC
RISC prepoznaje ciljnu
RNK komplementarnim
Ubrizgavanje dsRNK za protein sparivanjem siRNK i
miofilament u gonade C. elegans reprimira ciljne RNK
njegovu ekspresiju, što se kod potomaka Argonaut iz RISC “seče”
ispoljava kao trzanje ciljnu RNK, koja se dalje
degraduje
RNKi je prirodan fenomen
Vrste malih regulatornih RNK
 siRNK (male interferirajuće RNK)
 miRNK (mikro RNK)
 piRNK (RNK koje stupaju u
interkaciju sa PIWI proteinima)

Prekursori malih regulatornih RNK

 endogeno sintetisani (miRNK,
endo siRNK, piRNK)
 virusne RNK
 egzogeno unete dsRNK

Mehanizmi delovanja
 Degradacija ciljne RNK
 Utišavanje translacije
 Epigenetička regulacija
RNKi reguliše razne ćelijske procese

Odbrambeni sistem od virusa (siRNK )

Stabilnost genoma – utišavanje

“unutrašnjih neprijatelja” –
transpozona (piRNK – sisari, endo
siRNK)

Translacija i razviće (miRNK regulišu

polovinu gena)

Epigenetička regulacija i utišavanje

transkripcije

Eksperimantalna alatka za utišavanje

gena

Novi pristup za genetičke terapije

 Mikro RNK

 Posttranskripcioni regulatori
ekspresije gena

 Regulišu 1/2 gena za proteine

 Jedna iRNK – regulacija sa više
miRNK
 Jedna miRNK – na stotine i hiljade
ciljnih iRNK
 Regulišu brojne biološke procese
 Geni za mikroRNK

• Geni nezavisno raspoređeni u genomu

• Delovi gena za
 Proteine (introna, netranslatirajućih
i kodirajućih regiona)
 Nekodirajuće RNK
 Transpozone
 Obrađene pseudogene

• Kod biljaka mogu sadrže introne,

alternativno se splajsuju i poliadeniluju
 Geni za mikroRNK

• U prepisanom tanskriptu deo koji je

prekursor miRNK formira karaktrističnu
sekundarnu strukturu ukosnice

• Jedna ili obe "ručice" iz pre-miRNK daju

zrele molekule miRNK, od kojih svaka
ima svoje ciljne iRNK
 Geni za mikroRNK

• Identifikovanje novih miRNK i njihovih

ciljnih gena - bioinformatičke predikacije
(miR)

• miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)

• 21264 prekursora miRNK, koje

eksprimiraju 21643 zrele miRNK kod 193
vrsta

• Potvrda da je predviđena sekvenca

ćelijska miRNK - identifikovanje u
ćelijama i utvrđivanje da ekspresija
ciljnog gena zavisi od njenog prisustva
(preko 300 u genomu čoveka)
 Biogeneza miRNK
• Prekursori imaju strukturu ukosnice

• Pri-miRNK – susptrat za Drosha-DGCR8

u nukleusu

• Pre-miRNK – supstrat za Dicer-TRBP u

citoplazmi

• Zrela miRNK

• Funkcionalna miRNK sa proteinima –

utišavajući kompleks miRISC (miRNP)

• Alternativni put biogeneze – mirtron –

supstrat za spajsozom
 Drosha i Dicer

• Endonukleaze iz familije RNaza III

• Prepoznaju karaktrističnu strukturu

• Specifične za dvolančane RNK (dsRBD)
supstrata
• Seku oba lanca i ostavljaju jednolančani
• Mesto sečenja selektuju merenjem
3'-kraj dužine 2 nt
nezavisno od sekvence
dsRBD

• Nalaze se u kompleksu sa proteinima

koji vezuju dsRNK – DGCR8 i TRBP
• Pri-miRNK – ukosnica
• Dvolančana drška dugačka 33 bp –
donji deo drške dužine 11 bp i
gornji deo drške dužine 22 bp
• Petlja različite dužine (10 nt)

• Drosha-DGCRB8
• Uvodi dva prekida u pri-miRNK
oslobađajući samu strukturu
ukosnice – pre-miRNK
• Neophodna je jednolančani region
RNK koji ograničava 5' i 3'-krajeve
drške
• Prekidi se uvode na mestima koja
su po 11 bp udaljena od granice
jednolančane i dvolančane RNK u
pri-miRNK
 Pre-miRNK

• Dugačka oko 65 do 70 nukleotida

• Izgrađena iz
• drške (dvolančanog regiona dužine
22 bp)
• petlje
• jednolančanog 3'-kraja dužine 2
nukleotida
• Mirtroni - introni kod C. elegans, D.
melanogaster i sisara koji sadrže gen za
miRNK koji u potpunosti odgovara
pre-miRNK

• Obrada mirtrona ne zahteva učešće

kompleksa Drosha-DGCR8

• Pre-miRNK se transportuje u citoplzmu

pomoću eksportina 5 kod životinja, gde
dolazi do druge reakcije kidanja RNK
katalizovanom kompleksom Dicer-TRBP
 Dicer-TRBP

• Dicer ima oblik sekirice:

• Kraj drške - PAZ - formira vezivni
džep za jednolančani 3' kraj
dvolančane RNK
• Drška sekirice - domen sa
pozitivno naelektrisanom vezivnom
površinom za RNK
• Sečivo – RNazni domeni
raspoređeni kao simetričan dimer

• Dicer deluje samo na dvolančanu RNK,

bez obzira na njenu sekvencu, i kida je
na udaljenosti od 22 nukleotida od
njenog kraja
 miRNK

• Rezultat aktivnosti proteina Drosha i

Dicer je dvolančana miRNK dužine oko
22 bp (odnosno od 21 do 25 bp) koja
ima jednolančane 3'-krajeve dužine 2
nukleotida

• Lanac “vodič” - funkcionalna

jednolančana zrela miRNK
• Lanac “putnik” – degraduje se
 miRNP ili miRISC

• Kratka dvolančana RNK nastala

aktivnošću Dicera, inkorporira se u
miRISC

• Dvolančana miRNK denaturiše kako bi

nastao lanac "vodič“
• Lanac "putnik" ili biva degradovan
proteinom AGO ili se kompletan
otklanja iz kompleksa RISC i zatim
degraduje
 miRNP ili miRISC

• AGO proteini – ključne komponente

miRISC

• Dodatni proteini – efktori ili regulatori

 Argonaut proteini – specijalizovani za
vezivanje malih RNK
AGO proteini – subfamilija proteina
Argonaut

• Ključne komponente kompleksa RISC

• Domen PAZ - vezivno mesto za

dvolančanu RNK koje specifično
prepoznaje 3'-kraj lanca “vodiča”

• Domen MID – vezuje 5’-kraj miRNK

• Domen PIWI ima RNaznu aktivnost sličnu

RNazi H (ne kod svih članova)
 Argonaut proteini – specijalizovani za
vezivanje malih RNK
AGO proteini – subfamilija proteina
Argonaut

• Domen PIWI ima RNaznu aktivnost sličnu

RNazi H

• Samo neki proteini AGO su

endonukleolitički kompetentni (kod
čoveka samo AGO2 )
 miRNP ili miRISC

• Kompleks miRISC sa lancem vodičem

je spreman da prepozna ciljnu RNK i
pokrene njenu:
• Endonukleolitičku degradaciju
• Degradaciju iRNK posredovanu
deadenilacijom
• Represiju translacije

• Efekat zavisi od stepena

komplmentarnosti miRNK i iRNK i tipa
AGO proteina, ali i drugih proteina iz
miRISC kompleksa i fizioloških uslova
Interakcije miRNK i iRNK kod metazoa

• Neperfektno sparivanje sa određenim pravilima

• Perfektno i kontinuirao bazno sparivanje regiona miRNK između nukleotida 2 i 8

("seme“) sa ciljnom iRNK

• Pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu
dupleksa miRNK-iRNK

• Postojanje razumne komplementarnosti u 3' polovini miRNK, kako bi se

interakcija sa iRNK stabilizovala
Mesta vezivanja miRNK u iRNK - MRE

• Mesta vezivanja za miRNK kod metazoa nalaze se uglavnom u 3'-UTR-u, ali i 5’-UTR-u i
kodirajućim regionima

• Višestruka vezivna mesta za istu ili različite miRNK neophodna su za efikasnu

represiju

• Kada se nalaze blizu jedno drugom (na udaljenosti od 10 do 40 nukleotida) ispoljavaju

kooperativno delovanje, što znači da njihov zajednički efekat prevazilazi sumu
pojedinačnih efekata.
 Modeli utišavanja gena sa miRNK

 Uslovljen stepenom komplementarnosti miRNK sa ciljnom iRNK

 Endonukleolitička degradacija
 Destabilizacija iRNK (deadenilacija i egzonuklolitička degradacija)
 Utišavanje translacije (inhibicijom inicijacije ili elongacije translacije, ili proteolizom
rastućeg polipeptida)
 AGO proteini i endonukleolitička
degradacija iRNK

• Svi AGO koji dovode do degradacije iRNK

imaju PIWI domen koji može preseći iRNK u
centru perfektnog dupleksa si/miRNK-iRNK
(AGO2 kod sisara)

• Uglavnom kod biljaka, retko kod metazoa

 Modeli utišavanja kod meatazoa – uloga GW 182

• Kod životinja, najveći broj miRNK je delimično komplementaran ciljnim iRNK

• Proteini AGO nisu dovoljni da sami posreduju u utišavanju iRNK i zahtevaju interakciju
sa proteinima familije GW 182

• Kompleksi AGO-GW 182 posreduju u utišavanju gena kroz narušavanje kružne

strukture iRNK i kroz destabilizaciju iRNK indukcijom deadenilacije
 Podsetnik – kružna struktura iRNK i PABPC1

• PABPC1 služi kao platforma za vezivanje različitih proteina uključenih u regulaciji

translacije i degradacije iRNK
 DEGRADACIJA IRNK ZAVISNA OD DEADENILACIJE

• Glavni put degradacije iRNK

 Familija proteina GW 182 i PABPC1

• Dva regiona proteina GW 182 imaju esencijalnu

uloge u utišavanju iRNK:
• domen koji sadrži ponovke GW na N-kraju
(vezuje AGO)
• bipartitni domen za utišavanje, koji se sastoji
iz središnjeg (Mid) i C-terminalnog regiona sa
ponovljenim motivima GW (vezuje PAPBC1)
 Modeli utišavanja kod meatazoa – uloga GW 182

• Bipartitni domen za utišavanje proteina GW 182 stupa u interakciju sa N- i sa

C-terminalnim domenima proteina PABPC1, interferirajući sa funkcijom PABPC1 u
translaciji i stabilizaciji iRNK preko dva različita mehanizma:
• PAM1 (GW 182) – RRM (PABPC1) interkacija – interferencija sa vezivanjem eIF4G
za PABPC1 (utiče na cirkularizaciju iRNK i smanjuje efikasnost translacije)
• PAM2 (GW 182) – MLLE (PABPC1) interkacija – redukuje afinitet PABPC1 za poli(A)
rep, tako da bi interakcija GW 182 bi mogla stvoriti platformu za vezivanje
kompleksa za deadenilaciju i dalju egzonuklolitičku degraciju u smeru 5’3’
 Modeli utišavanja kod meatazoa – drugi modeli translacione
represije - nivo ciljnih iRNK utišanih sa miRNK može biti skoro nepromenjen –
translaciono utišavanje bez značajnije degradacije iRNK

• Ometanje inicijacije translacije

• struktura 5'-kape esencijalna za translaciono utišavanje sa miRNK – AGO
kompetira sa eIF4E za vezivanje za 5’-kapu – potreba za većim brojem miRISC da
bi se postigla značajna represija pomoću miRNK
• sprečavanjem vezivanja velike subjedinice ribozoma (60S)
 Modeli utišavanja kod meatazoa – drugi modeli translacione
represije

• miRISC koprecipitira sa polizomima

• Ometanje elongacije translacije: usporavanjem elongacije ili spadanje ribozoma
 Modeli utišavanja kod meatazoa – drugi modeli translacione
represije

• Asocijacija reprimiranih iRNK sa translaciono kometnentnim ribozomima

• Proteolitička degradacija rastućeg polipeptida – nezavisna od proteazoma

 miRNK kao aktivatori trasnlacije

• U specifičnim uslovima translacija određenih iRNK može biti stimulisana sa miRNK

• miRNK sa dvostrukom funkcijom – regulišu translaciju zavisno od stanja ćelijskog

ciklusa uslovljenog fiziološkim uslovima: kada se ćelija normalno deli imaju funkciju
represora, a kada je zarobljena u G1 fazi imaju funkciju aktivatora
• Stimulacija translacije uključuje promenu proteina koji se regrutuju na iRNK pomoću
kompleksa miRNK-AGO kao posledica izmenjenih fizioloških uslova
 Stimulacija transalcije
vezivanjem za 5’UTR

• miRNK onemogućava vezivanje

represornog regulatornog proteina
i time stimuliše translaciju

• Aktivacija translacije različitim

miRNK - dešava se na specifičnim
iRNK i pod određenim uslovima u
ćeliji, što ukazuje da je reč o
specijalizovanom i regulisanom
procesu
 Regulacija RNKi posredovane sa miRNK

• Regulacija ekspresije miRNK

• Prostorno i vremenski regulisana
• Glavni modulatori ekspresije – proteini ADAR
• Regulacija nivoa efektornih miRNKu citoplazmi - kompetirajuće endogene RNK
(iRNK, transkripti pseudogena, lncRNK, kružnim RNK), koje deluju kao "endogeni"
sunđeri za miRNK

• Regulacija aktivnosti proteina miRISC - posttrasnlacione modifikacije

• Sortiranje miRNK u odnosu na AGO proteine