Άσκηση 5η: Φωτομετρική Ανάλυση

Θέμα: Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με τη μέθοδο της διουρίας

Ουσίες που περιέχουν τουλάχιστον δύο πεπτιδικούς δεσμούς, σχηματίζουν σε αλκαλικό

περιβάλλον σύμπλοκα με ιόντα χαλκού (Cu2+), που έχουν έντονη ιώδη ή ερυθροϊώδη χροιά.
Η αντίδραση αυτή ονομάζεται αντίδραση διουρίας, γιατί η απλούστερη ουσία που τη δίνει
θετική είναι η διουρία:

Να σημειωθεί ότι η διουρία δε βρίσκεται στους ζωντανούς οργανισμούς, αλλά απλώς δίνει
την ίδια αντίδραση, όπως και ένα απλό πεπτίδιο. Τα φάσματα απορρόφησης των συμπλόκων
διαφόρων πρωτεϊνών με χαλκό είναι παρόμοια, αλλά όχι και πανομοιότυπα. Έτσι, μπορούμε
να χρησιμοποιήσουμε την καζεΐνη του γάλακτος, ως πρότυπο για όλες τις συνηθισμένες
πρωτεΐνες, χωρίς να έχουμε σφάλμα μεγαλύτερο του 10% κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό
της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών.

Πειραματική διαδικασία
Ετοιμάστε μια σειρά από 5 δοκιμαστικούς σωλήνες με αυξανόμενες ποσότητες διαλύματος
καζεΐνης *(2,5 mg/mL σε 4 mM NaOH) και 4mM NaOH σύμφωνα με τον πίνακα:

Καζεΐνη Αντιδραστήριο
Αριθμός 4mM NaOH
2,5mg/mL διουρίας**
σωλήνα (mL)
(mL) (mL)
1 0,0 5,0 3,0
2 1,0 4,0 3,0
3 2,0 3,0 3,0
4 4,0 1,0 3,0
5 5,0 0,0 3,0

*Merck 102244, Casein for biochemistry, solubility 20,1g/L (250C) (experimental)

**Biuret reagent according to Gornall et al. (1949)
1. Weigh 1.50 g of cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5 H2O) with 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate
(NaKC4H4O6 4 H2O).
2. Dissolve in 500 ml of H2O.
3. Add 300 ml of 10% NaOH.
4. Make up to total volume of 1 liter. Store in a plastic bottle protected from light.
(Gornall, A.G., Bardawill, C. J. and David, M. M. (1949)
Determination of Serum Proteins by means of the Biuret Reaction., J. Biol. Chem. 177; 751)

Προσθέστε τελευταίο το αντιδραστήριο της διουρίας και ανακατέψτε καλά το περιεχόμενο

των σωλήνων. Το χρώμα αναπτύσσεται στη μεγαλύτερη του ένταση μέσα σε 20 λεπτά και
είναι σταθερό για 1 ώρα. Ο σωλήνας 1 είναι το τυφλό (το δείγμα αναφοράς που περιέχει όλα
τα αντιδραστήρια εκτός από την πρωτεΐνη).
Τοποθετήστε στο φασματοφωτόμετρο τον επιλογέα μήκους κύματος σε 540 nm και
μηδενίστε την κλίμακα της διαπερατότητας με το τυφλό στη θέση μετρήσεως. Προσδιορίστε
την διαπερατότητα του περιεχομένου των σωλήνων 2-5.

Κατασκευάστε πρότυπη καμπύλη από τη γνωστή περιεκτικότητα των σωλήνων σε πρωτεΐνη

και τις αντίστοιχες απορροφήσεις.

Με βάση την καμπύλη αυτή θα μπορέσετε να προσδιορίσετε τη συγκέντρωση σε πρωτεΐνη

οποιουδήποτε διαλύματος με άγνωστη συγκέντρωση πρωτεΐνης.