ΑΣΚΗΣΗ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ

ΤΙΤΛΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΝΙΝΥΔΡΙΝΗΣ

ΣΚΟΠΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: Πιστοποίηση αμινοξέων-πρωτεινών

Αρχή: Αμινοξέα με ελεύθερη -NH2 και πρωτεϊνες που περιέχουν ελεύθερες αμινομάδες
αντιδρούν με τη νινυδρίνη και δίνουν ένωση που έχει χρώμα μπλε.

Πορεία:

ΣΩΛΗΝΑΣ 1 ΣΩΛΗΝΑΣ 2 ΣΩΛΗΝΑΣ 3 ΣΩΛΗΝΑΣ 4 ΣΩΛΗΝΑΣ 5

15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες
(γλυκίνη) (Ωοαλβουμίνη) (καζεϊνη) (τυροσίνη) (ζελατίνη)
2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v

5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες

Αντίδραση Αντίδραση Αντίδραση Αντίδραση Αντίδραση
νινυδρίνης νινυδρίνης νινυδρίνης νινυδρίνης νινυδρίνης

1% w/v 1% w/v 1% w/v 1% w/v 1% w/v

ΒΡΑΣΜΟΣ
5’ 5’ 5’ 5’ 5’
ΧΡΩΜΑ

Ποια από τις ουσίες αυτές φέρει θετικό αποτέλεσμα;

Παρατηρήσεις:
ΤΙΤΛΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΞΑΝΘΟΠΡΩΤΕΙΝΗΣ
ΣΚΟΠΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: Πιστοποίηση αρωματικών αμινοξέων

Αρχή:
Χαρακτηριστική αντίδραση πρωτεϊνών που περιέχουν φαινυλικούς δακτυλίους.
Πυκνό νιτρικό οξύ αντιδρά με τους φαινυλικούς δακτυλίους και δίνει ένωση χρώματος κίτρινου.
Πρόσθεση αλκαλίων σ’ αυτό το σημείο θα δώσει πιο βαθύ χρώμα, πορτοκαλί.
Τα κίτρινα σημάδια στο δέρμα, που προκαλούνται λόγω κακού χειρισμού, από το νιτρικό οξύ είναι
αποτέλεσμα της αντίδρασης ξανθοπρωτεΐνης.

Πορεία:

ΣΩΛΗΝΑΣ 1 ΣΩΛΗΝΑΣ 2 ΣΩΛΗΝΑΣ 3 ΣΩΛΗΝΑΣ 4 ΣΩΛΗΝΑΣ 5

15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες
(γλυκίνη) (Ωοαλβουμίνη) (καζεϊνη) (τυροσίνη) (ζελατίνη)
2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v

ΗΝΟ3 10 ΗΝΟ3 10 ΗΝΟ3 10 ΗΝΟ3 10 ΗΝΟ3 10

Σταγόνες Σταγόνες Σταγόνες Σταγόνες Σταγόνες

ΘΕΡΜΑΝΣΗ
ΧΡΩΜΑ

Παρατηρήσεις:
ΤΙΤΛΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: ΚΑΘΙΖΗΣΗ
ΣΚΟΠΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ : Απομάκρυνση πρωτεϊνών

• Προσθήκη Αναμίξιμων Διαλυτών (Οργανικοί διαλύτες αναμίξιμοι στο ύδωρ) Πχ. μεθανόλη,
αιθανόλη, ακετόνη, αιθέρας
Αρχή:
Μειώνουν τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών (παράγουν ένυδρα προϊόντα με αποτέλεσμα την
αφυδάτωσή τους – μειώνουν τη διηλεκτρική σταθερά με αποτέλεσμα τη μείωση της δύναμης
απώθησης μεταξύ των φορτισμένων πρωτεϊνικών μορίων και προκαλούν την καθίζησή τους.

• Προσθήκη ουδέτερων αλάτων (Salting-Out)

Πχ. NH2, SO4, [NH4]2SO4, άλατα μαγνησίου, άλατα φωσφόρου
Αρχή: Μειώνουν τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών (προκαλούν αφυδάτωσή τους)

• Παρασκευή αδιάλυτων αλάτων

Αρχή: Η καθίζηση των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο διάλυμά τους
κατακρημνιστικών, ανιονικών και κατιονικών ενώσεων.

Ανιονικοί Κατακρημνιστές: Βολφραμικό οξύ, τριχλωροξικό οξύ, υπερχλωρικό οξύ.

Οι ανιονικοί κατακρημνιστές σχηματίζουν αδιάλυτα πρωτεϊνικά άλατα με την κατιονική μορφή
των πρωτεϊνικών μορίων, με την προϋπόθεση ότι το pH του διαλύματος είναι κάτω από το
ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεϊνης. Ο δεσμός δημιουργείται με τις θετικά φορτισμένες
αμινομάδες.

Κατιονικοί Κατακρημνιστές: Zn2+, Hg2+, Fe3+, και Pb2+

Τα κατιόντα των βαρέων μετάλλων ενώνονται με την ανιονική μορφή των πρωτεϊνικών μορίων
και σχηματίζουν αδιάλυτα πρωτεϊνικά προϊόντα (proteinates). Ο δεσμός δημιουργείται με τις
αρνητικά φορτισμένες καρβοξυλικές ομάδες.
• καθίζηση με ανάμιξη Χλωροφορμίου
 Η καθίζηση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 0.25 όγκου CHCl 3 και 0.1 όγκου αμυλικής
αλκοόλης η οποία εμποδίζει την εμφάνιση αφρού.
Εμφανίζονται 2 στιβάδες – πάνω (υδατική), κάτω (CHCl3 – πρωτεϊνη – gel) – πιο κάτω (όταν
έχουμε πολύ χλωροφόρμιο).

Πορεία:

ΣΩΛΗΝΑΣ 1 ΣΩΛΗΝΑΣ 2 ΣΩΛΗΝΑΣ 3 ΣΩΛΗΝΑΣ 4 ΣΩΛΗΝΑΣ 5

Προσθήκη Προσθήκη Προσθήκη Καθίζηση με
Καθίζηση με
Αναμίξιμων Ουδέτερων Αδιάλυτων Ανάμιξη
Θέρμανση
Διαλυτών Αλάτων Αλάτων Χλωροφορμίου

2 ml πρωτεΐνη 5 ml πρωτεΐνη 5 ml πρωτεΐνη 5 ml πρωτεΐνη 5 ml πρωτεΐνη

5 ml θειικό 1 ml TCA
3 ml Αλκοόλη 0.5 ml Θέρμανση
αμμώνιο (τριχλωρο
95% Χλωροφόρμιο
(κεκόρ) οξικό οξύ)
ΙΖΗΜΑ (ΝΑΙ/ΟΧΙ)

Πού οφείλεται το ίζημα;

Σωλήνας 1:
Σωλήνας 2:
Σωλήνας 3:
Σωλήνας 4:
Σωλήνας 5:

Παρατηρήσεις:
ΤΙΤΛΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ : ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΙΟΥΡΙΑΣ (Biuret Test)
ΣΚΟΠΟΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: Πιστοποίηση πεπτιδικού δεσμού

Αρχή: Οι Πρωτεΐνες αντιδρούν με θειϊκό Χαλκό (II). Θετικό test συνιστά ο σχηματισμός
του συμπλέγματος χαλκού, που έχει χρώμα βιολετί.

Πορεία:

ΣΩΛΗΝΑΣ 1 ΣΩΛΗΝΑΣ 2 ΣΩΛΗΝΑΣ 3 ΣΩΛΗΝΑΣ 4 ΣΩΛΗΝΑΣ 5

15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες 15 Σταγόνες
(γλυκίνη) (Ωοαλβουμίνη) (καζεϊνη) (τυροσίνη) (ζελατίνη)
2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v 2% w/v

5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες 5 Σταγόνες

10% NaOH 10% NaOH w/v 10% NaOH 10% NaOH 10% NaOH
w/v w/v w/v w/v

3 Σταγόνες 3 Σταγόνες 3 Σταγόνες 3 Σταγόνες 3 Σταγόνες

10% CuSO4 10% CuSO4 w/v 10% CuSO4 10% CuSO4 10% CuSO4
w/v w/v w/v w/v

ΧΡΩΜΑ

Ποια από τις ουσίες αυτές δίνει θετικό αποτέλεσμα;

Παρατηρήσεις: