Ebook Cardiovascular Engineering A Protective Approach PDF Full Chapter PDF

Cardiovascular Engineering: A
Protective Approach - eBook PDF

Visit to download the full and correct content document:
https://ebooksecure.com/download/cardiovascular-engineering-a-protective-approach
-ebook-pdf/
Cardiovascular
Engineering
Dedicated
to my wife Yu Hua and
children Diana, David,
Charley, Juni, Annie, and Axel.
Cardiovascular
Engineering
AProtective Approach
ShuQ. Liu
Biomedical Engineering Department
Northwestern University
Evanston, IL, USA
New York Chkago San Francisco

Athens London Madrid
Mexico City Milan New Delhi
Singapore Sydney Toronto
Copyright© 2020 McGraw Hill LLC. All rights reserved. Except as permitted under the United States Copyright Act of 1976, no
part of this publication may be reproduced or distributed in any form or by any means, or stored in a database or retrieval system,
without the prior written permission of the publisher.
ISBN: 978-1-26-045765-0
MHID: 1-26-045765-6
The material in this eBook also appears in the print version of this title: ISBN: 978-1-26-045764-3, MHID: 1-26-045764-8.
eBook conversion by codeMantra

Version 1.0
All trademarks are trademarks of their respective owners. Rather than put a trademark symbol after every occurrence of a trade-
marked name, we use names in an editorial fashion only, and to the benefit of the trademark owner, with no intention of infringe-
ment of the trademark. Where such designations appear in this book, they have been printed with initial caps.
McGraw-Hill Education eBooks are available at special quantity discounts to use as premiums and sales promotions or for use in
corporate training programs. To contact a representative, please visit the Contact Us page at www.mhprofessional.com.
Information contained in this work has been obtained by McGraw-Hill from sources believed to be reliable. However, neither
McGraw-Hill nor its authors guarantee the accuracy or completeness of any information published herein, and neither McGraw-
Hill nor its authors shall be responsible for any errors, omissions, or damages arising out of use of this information. This work
is published with the understanding that McGraw-Hill and its authors are supplying information but are not attempting to render
engineering or other professional services. If such services are required, the assistance of an appropriate professional should be
sought.
TERMSOFUSE
This is a copyrighted work and McGraw-Hill Education and its licensors reserve all rights in and to the work. Use of this work
is subject to these terms. Except as permitted under the Copyright Act of 1976 and the right to store and retrieve one copy of the
work, you may not decompile, disassemble, reverse engineer, reproduce, modify, create derivative works based upon, transmit,
distribute, disseminate, sell, publish or sublicense the work or any part ofit without McGraw-Hill Education's prior consent. You
may use the work for your own noncommercial and personal use; any other use of the work is strictly prohibited. Your right to
use the work may be terminated if you fail to comply with these terms.
THE WORK IS PROVIDED "AS IS." McGRAW-HILL EDUCATION AND ITS LICENSORS MAKE NO GUARANTEES
OR WARRANTIES AS TO THE ACCURACY, ADEQUACY OR COMPLETENESS OF OR RESULTS TO BE OBTAINED
FROM USING THE WORK, INCLUDING ANY INFORMATION THAT CAN BE ACCESSED THROUGH THE WORK VIA
HYPERLINK. OR OTHERWISE, AND EXPRESSLY DISCLAIM ANY WARRANTY, EXPRESS OR IMPLIED, INCLUD-
ING BUT NOT LIMITED TO IMPLIED WARRANTIES OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR
PURPOSE. McGraw-Hill Education and its licensors do not warrant or guarantee that the functions contained in the work will
meet your requirements or that its operation will be uninterrupted or error free. Neither McGraw-Hill Education nor its licensors
shall be liable to you or anyone else for any inaccuracy, error or omission, regardless of cause, in the work or for any damages
resulting therefrom. McGraw-Hill Education has no responsibility for the content of any information accessed through the work.
Under no circumstances shall McGraw-Hill Education and/or its licensors be liable for any indirect, incidental, special, punitive,
consequential or similar damages that result from the use of or inability to use the work, even if any of them has been advised of
the possibility of such damages. This limitation of liability shall apply to any claim or cause whatsoever whether such claim or
cause arises in contract, tort or otherwise.
Contents
Preface....................................................... xv
1 Introduction . . • • . . . . . . . • • . . . . . . . • • . . . . . . . • • . . . . . . . • • . . . . . . . • • . 1
llighlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Overview..................................................... 2
Foundations of Protective Engineering........................ ... . 3
Pathogenic causes and processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Naturally occurring protective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Regional protective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Distant protective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Protective Engineering Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Molecular protective engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Enhancing protective impacts by protein administration
and gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Suppressing adverse gene expression. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Gene editing-mediated control of gene expression. . . . . . . . . . . . . . 9
Cell-based protective engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Tissue-level protective engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Part I Foundations of Cardlovascular Protective Engineering

2 Development of the Heart, Blood Vessels, and Blood cells . . . . . . • • • 17
llighlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Early Embryonic Development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Overview of embryonic processes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Fertilization-union of the sperm and ovum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Cleavage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Formation of blastocyst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Gastrulation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Development of the Heart. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Origin and fate of cardiogenic cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Regulation of heart development. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Formation of the heart tube . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Processes of heart tube formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Regulation of heart tube formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Cardiac chamber formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Processes of cardiac chamber formation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
y
Yi Contents
Regulation of cardiac chamber formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Development of the cardiac conduction system . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Processes of cardiac conduction system development . . . . . . . . . . 30
Regulation of conduction system development . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Development of the Vascular System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Origin of vascular cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Vasculogenesis and angiogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Regulation of vascular formation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Formation of smooth muscle cells and fibroblasts . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Development of Blood Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3 Stem Cells and Regeneration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Highlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Em.bryonic Stem Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Induced Pluripotent Stem Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Somatic Stem Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Bone marrow stem cells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Hematopoietic stem cells.................................... 55
Mesenchymal stem cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Resident cardiac stem cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
MDRl-positive resident cardiac stem cells..................... 57
Sca-1-positive resident cardiac stem cells.............. ...... .. 58
Isll-positive cardiac stem cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4 Structure and Function of the Heart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Highlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Structure of the Heart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Cardiac chambers and great vessels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Cardiac vasculature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Cardiac cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Function of the Heart. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Excitation-contraction coupling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Cardiac contractile activities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Regulation of cardiac performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
5 Structure and Function of Blood Vessels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Highlights ....................................................... 81
Structure of Blood Vessels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Functions of Vascular Cells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Functions of endothelial cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Barrier function...................................... .... .. 84
Ion transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Protein transport......................................... 95
Ca nt ent s vii
Amino acid transport. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

Glucose transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Routes of substance transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Evaluation of endothelial transport function. . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Regulation of pro- and anti-blood coagulation processes . . . . . . . . 103
Regulation of vascular contractility. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Regulation of cell proliferative activities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Regulation of inflammatory processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Generation of extracellular matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Angiogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Functions of smooth muscle cells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Contraction and relaxation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Regulation of vascular cell proliferative activities. . . . . . . . . . . . . . . 117
Generation of extracellular matrix...................... ..... . 117
Functions of fibroblasts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Regulation of Blood Flow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Regulation of Systemic Blood Pressure. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 121
Baroreceptors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Chem.oreceptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Renin-angiotensin-aldosterone system. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Vasopressin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Nitric oxide................................................. 123
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
6 Cytokines and Growth Factors in Cardiovascular Disease. . . . . . . • • . 127
Highlights ...................................................... 127
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
Cytoldnes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
Interleukins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
Interferons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Chemoldnes........................................... ..... . 137
Tumor necrosis factor superfamily factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
Transforming growth factor ~ family proteins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Hematopoietins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Growth Factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Epidermal growth factor and heparin-binding EGF-like
growth factor.......................................... ..... . 146
Fibroblast growth factors...................................... 148
Insulin-like growth factor 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
Platelet-derived growth factors , ................ , , . . . . . . . . . . . . . 150
Vascular endothelial growth factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
7 Mechanisms of Disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Highlights . , , ................ , , ................ , , . . . . . . . . . . . . . 161
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
Etiology and Pathogenic Mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
viii Contents
External environmental factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

Microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
Pathogenic viruses....................................... 167
Pathogenic bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
Pathogenic fungi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
Pathogenic parasites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Physical factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
Mechanical forces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Radiation............................................... 196
Body teinperature........................................ 197
Ovemutrition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Protein overconsumption................................. 199
Lipid and carbohydrate overconsumption . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
Chemical substances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Cigarette smoke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Heavy metals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
Alcohol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
Hypoxia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Biological factors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Antigens. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Prions.................................................. 205
Mental stress.............................................. 207
Genetic defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Chromosomal defects ...................................... 208
Addition of a single chromosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Chromosomal deletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Addition of a complete haploid set of chromosomes . . . . . . . . . 209
Simple gene mutations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Autosomaldominantdisorders .................... .... .... 210
Autosomal recessive disorders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
X-linked disorders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Y-linked disorders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
Multiple gene mutations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
Senescence.................................................. 214
Pathology and Pathophysiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
8 Systems Protective Mechanisms. . • • . . . . . . . • • . . . . . . .. .. . . . . . .. • . . 225
llighlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
Regional Cardioprotective Mechanisms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
Early regional protective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
Late regional protective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
Protective inflammatory responses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
Distant Protective Mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
Distant protective factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
Contents ix
Discovery and characterization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

Induction of distant protective factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
Actions of distant protective factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
Significance of distant protective factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
Distant cell mobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
Bone marrow cell mobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
Splenic cell mobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
Hepatic cell mobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
Mechanisms of hepatic cell mobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
Protective actions of mobilized hepatic cells . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
The Concept of Core Distant Protective Mechanisms. . . . . . . . . . . . . . . . 243
The Concept of Protectome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Evolution of Protective Mechanisms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Systems Protective Engineering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
9 Protective Engineering Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Highlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Understanding Pathogenic and Protective Mechanisms . . . . . . . . . . . . . 258
Identifying mutant or malfunctioned genes by gene profiling. . . . . . 258
Constructing recombinant genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260
Gene amplification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
Testing the function of the gene of interest. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
Molecular Protective Engineering Technologies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
Gene transfer technologies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
V:rrus-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
Retrovirus-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
Adenovirus-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Adeno-associated viruses as gene carriers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264
Receptor-mediated gene transfer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264
Liposome-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264
Calcium phosphate-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
Electroporation-mediated gene transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
Assessing the expression level of the transferred gene. . . . . . . . . . . 266
Assessing the function of the transferred gene . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
Gene editing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
Gene editing by zinc finger nucleases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Gene editing by transcription-activator like effector nucleases . . . 269
Gene editing by the CRISPR/ Cas system. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
Epigenetic modifications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
DNAmethylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
Histone modifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
Histone acetylation................................. ...... 274
Histone methylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
Post-transcriptional modifications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
x Contents
Small interfering RNA-based mRNA modifications. . . . . . . . . . . . . 276

MicroRNA-based mRNA modifications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
Differences between siRNAs and miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
Anti-sense oligonucleotide repression of mRNA . . . . . . . . . . . . . . . 279
Cell-Based Protective Engineering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
Tissue-Level Protective Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282
Part II Appllcatlons of Cardlovascular Protective Engineering

10 Systemic Hypertension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
llighlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Primary hypertension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Renovascular hypertension. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
Endocrine hypertension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
Conventional Treatment Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
Molecular Protective Engineering Strategies for Primary Hypertension . 298
Boosting vasodilator gene expression. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299
Nitric oxide synthase gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299
Natriuretic peptide precursor A gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Kallikrein and kininogen genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Suppressing vasoconstrictor genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Renin-angiotensin-aldosterone system genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Endothelin gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
Adrenergic receptor genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
11 Atherosclerosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
llighlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
Gene mutations responsible for atherogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
Lipid metabolism regulatory genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
Low-density lipoprotein receptor (LDLR) gene . . . . . . . . . . . . . . 307
Low-density lipoprotein genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
LDLR regulatory genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
Blood pressure regulatory genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
Renin-angiotensin system genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
Sodium regulatory genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309
Atrial natriuretic factor gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310
Adrenergic system genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310
Endothelin genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312
Nitric oxide synthase genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313
Contents xi
Inflammation regulatory factor genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313

Genes regulating vascular cell proliferation and
migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313
Atherogenic environmental factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
Lipid-rich diets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
Exposure to cigarette smoke and toxins....................... 316
Regional mechanical factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316
Antioxidant deficiency................................ .... .. 318
Superoxide free radical o;-................................ 319
Reactive nitrogen species . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319
Transition metal ions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319
Redox regulatory enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320
Antioxidants. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320
Sedentary lifestyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
Atherogenic disorders........................................ 321
Obesity. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
Hypercholesterolemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
Hypertension. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
Pathogenic processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Lipid retention . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Inflammatory responses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325
Cell proliferation and migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
Pathological changes during the initial stage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
Pathological changes during the developing stage. . . . . . . . . . . . . . . . 327
Pathological changes during the advanced stage . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
Anti-hyperlipidemia agents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328
Anti-smooth muscle cell proliferative agents. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328
Alleviating angina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
Relieving cardiac workload . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
Angioplasty. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
Stent placement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
Arterial reconstruction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
Molecular Protective Engineering Strategies....................... 331
siRNA-mediated silencing of inflammatory and mitogenic
genes................................................. ..... . 331
Anti-inflammatory and anti-proliferative gene therapy . . . . . . . . . . . 332
Gene editing-based anti-atherogenic strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
Cell- and Tissue-level Protective Engineering Strategies. . . . . . . . . . . . . 333
Cell-integrated extracellular matrix constructs................... 334
Cell-integrated polymeric vascular constructs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
Development of arterial constructs in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
Mechanical modifications of arterial constructs . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
xii Contents
12 Arterial Aneurysms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345

Highlights . ' ' ................ ' ' ................ ' ' . . . . . . . . . . . . . 345
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
Biomechanics of Arterial Aneurysms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
Protective Engineering Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
Molecular protective engineering strategies ..... , . . . . . . . . . . . . . . . 351
Cell-based protective engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353
Tissue-level protective engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
References .......................................... ......... . 355
13 Coronary- Heart Disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
Highlights . ' ' ................ ' ' ................ ' ' . . . . . . . . . . . . . 359
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
Coronary artery thrombosis . , ................. , . . . . . . . . . . . . . . . 361
Coronary artery atherosclerosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
Coronary artery embolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362
Pathology and Pathophysiology , , ................ , , . . . . . . . . . . . . . 362
Acute myocardial infarction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362
Impairment of myocardial function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364
Forms of cardiomyocyte death ................. ,........ ....... 364
Necrotic cell death......................................... 365
Apoptosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366
Autophagy .............. , , ................ , , . . . . . . . . . . . . . 367
Acute inflammatory responses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368
Fibrosis and angiogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368
Therapeutic and Adverse Impacts of Blood Reperfusion. . . . . . . . . . . . . 368
Naturally Occurring Mechanisms of Myocardial Protection. . . . . . . . . . 369
Cardioprotective Engineering Strategies ........... , , . . . . . . . . . . . . . 370
Molecular cardioprotective engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . . 370
Protection against cardiomyocyte death....................... 372
Regional cardioprotective factors ........... , , . . . . . . . . . . . . . 372
Distant cardioprotective factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
Protection against oxidative stress injury. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
lschemic preconditioning .. , , ................ , , . . . . . . . . . . . . . 375
Ischemic post-conditioning.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 376
Enhancing angiogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 376
Cell-based protective engineering strategies ..... , . . . . . . . . . . . . . . . 376
Tissue-level cardioprotective engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . 377
References.................................................... 377
14 Cardiomyopath.ies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Highlights . ' ' ................ ' ' ................ ' ' . . . . . . . . . . . . . 381
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Ca nt ent s xiii
Dilated Cardiomyopathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382

Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Pathology. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383
Pathophysiology and clinical features. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
Conventional treatment strategies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
Hypertrophic Cardiomyopathies................................. 385
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
Pathology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
Conventional treatment strategies.............................. 389
RestrictiveCardiomyopathies ............................. ..... . 389
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
Pathology. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy. . . . . . . . . . . . . . . . 392
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392
Pathology. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392
Conventional treatment strategies....................... .... ... 393
Heart Failure.................................................. 394
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
Pathology and pathophysiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
Clinical features . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395
Molecular Protective Engineering Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 396
Modification of mutant genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397
Management of ventricular arrhythmia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 398
Prevention of heart failure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
Cell-Based Protective Engineering Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
Cell-mediated delivery of cardiomyocyte supporting factors. . . . . . . 400
Stem cell-based cardiomyocyte regeneration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
Tissue-Level Protective Engineering Strategies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
15 Congenital Heart Defects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407

Highlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
Pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
Chromosomaldefects ........................................ 408
Single gene mutations........................................ 410
Environmental factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
Disorders causing congenital heart defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412
Left to right heart shunts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413
Atrial septum defects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413
xiv Contents
Ventricular septum defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414

Patent ductus arteriosus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414
Heart valve defects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Mitral valve defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Tricuspid valve defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Aortic and pulmonary valve defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
Complex defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
Left-to-right heart shunts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418
Heart valve defects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
Complex defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
Engineering-Based Interventions. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
Biomaterial-based heart valves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
Biological tissue-based heart valves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
Cell engineering-based heart valves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
Materials used for cell engineering-based heart valves . . . . . . . . . . 421
Cell types used for heart valve engineering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422
Improving the performance of engineered heart valves . . . . . . . . . 423
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
16 Ischemic Stroke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
Highlights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430
Pathogenesis.................................................. 431
Naturally Occurring N europrotective Mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . 434
Regional neuroprotective mechanisms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435
Distant neuroprotective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
Naturally occurring neuronal regeneration................ ...... 441
Neuroprotective Engineering Strategies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
Molecular neuroprotective engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . . . 442
Modulating cell survival signaling mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . 442
Modulating cell death signaling mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
Preventing secondary injury........................... ...... 444
Inducing neural resident stem cell differentiation . . . . . . . . . . . . . . 445
Preventing fibrosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
Engineering distant neuroprotective mechanisms . . . . . . . . . . . . . . 446
Ischemic preconditioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447
Cell-based engineering strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
In.dex . . . . . . . . • . . . . . . . . • . . . . . . . . • . . . . . . . . • . . . . . . . . • . . . . . . . . • . . 453
Preface
he theme of this book is Protective Engineering, an emerging bioengineering disci-
T pline aiming to develop engineering strategies and technologies for inducing and
optimizing bio-protective processes and thereby facilitating recovery from injury
and disorders. The concept of protective engineering stems largely from the naturally
occurring protective mechanisms established against genetic defects and environmen-
tal insults through evolution. Although the natural protective mechanisms are critical
to the life of organisms, not all these mechanisms are optimized in promptness and
effectiveness, supporting the necessity of engineering-based modulations for enhanc-
ing protection.
Various protective engineering strategies, such as gene transfer, gene editing, gene
silencing, cell transplantation, and tissue reconstruction, have been designed and used
to induce and modify protective processes and correct natural deficiencies for thera-
peutic purposes in experimental and clinical research. To date, there is a large amount
of information about the naturally occurring protective mechanisms as well as protec-
tive engineering strategies in literature with an increasing clinical impact, prompting
the establishment of Protective Engineering as a discipline. This book is designed to
introduce to students and scientists the principles, foundations, and strategies of pro-
tective engineering by using cardiovascular disorders as models.
This book includes two parts-Foundations and Applications of Cardiovascular
Protective Engineering. The first part covers development of the cardiovascular sys-
tem, stem cells and regeneration, structure and function of the cardiovascular system,
signaling processes of cytokines and growth factors in cardiovascular disease, mecha-
nisms of disease, naturally occurring systems protective mechanisms, and general pro-
tective engineering strategies. These aspects are the bases of cardiovascular protective
engineering. The second part highlights application of protective engineering to several
prevalent cardiovascular disorders, including hypertension, atherosclerosis, arterial
aneurysms, coronary heart disease, cardiomyopathies, congenital heart disease, and
ischemic stroke. The author hopes that this book helps readers understand the concept
of cardiovascular protective engineering.
This book cannot be established without the support of the investigators who have
made contributions to the field of protective engineering. The author would like to
xv
xvi Preface
express sincere appreciation and gratitude to these investigators. The author would also like
to thank Dr. Y. C. Fung, who brought the author to the field of Bioengineering and taught him
how to become a teacher and a scientist.
ShuQ. Liu
July 31, 2019
Evanston, Illinois, USA
CHAPTER 1
Introduction
Hlghllghts
• Cardiovascular engineering is a broad subject addressing the modulation of the
structure and function of the heart and blood vessels at the molecular, cellular,
tissue, and organ levels to prevent and treat cardiovascular disease. This book
focuses on Gardiovascu/ar Protective Engineering, an emerging discipline of car-
diovascular engineering, aiming to understand the naturally occurring protective
mechanisms against injury and disorders and developing engineering strategies
for inducing and optimizing protective processes, thereby facilitating recovery
from disease.
• The naturally occurring protective mechanisms are the foundation of protective
engineering. There are two types of protective mechanism-regional and distant
mechanisms, both activated in response to environmental insults and/or genetic
defects. The regional protective mechanisms are those occurring within the
disordered organ; whereas the distant protective mechanisms are those
activated in remote organs to protect the disordered organ from structural and
functional failure. Regional protective mechanisms include disorder-activated
expression and/or release of paracrine protective factors (e.g., adenosine,
growth factors, and cytokines), inflammatory responses, and resident stem cell
differentiation into functional cells. Distant protective mechanisms include
upregulation and secretion of endocrine protective proteins and mobilization of
distant cells to the disordered organ to discharge protective factors. Both
regional and distant mechanisms are collectively defined as systems protective
mechanisms.
• Protective engineering strategies can be developed and used to optimize and
induce protective processes at three levels with currently available technologies-
molecular, cellular, and tissue levels. Molecular protective engineering is to
induce and promote protective gene expression, suppress adverse gene
expression, and control signaling processes to facilitate recovery from injury and
disorders. Cell-based protective engineering is to provide needed cell types for
targeted delivery of protective factors and regeneration of functional cells.
Tissue-level protective engineering is to provide structural and functional
supports to an injured or disordered organ to facilitate recovery and prevent
organ failure.
1
2 Chapter One
Overview
Cardiovascular engineering is a broad subject addressing the modulation of the struc-
ture and function of the heart and blood vessels at the molecular, cellular, tissue, and
organ levels by using engineering strategies to prevent and treat cardiovascular dis-
ease. This book focuses on Cardiovascular Protective Engineering, an emerging discipline
of cardiovascular engineering, aiming to understand the naturally occurring protec-
tive mechanisms against cardiovascular disorders and developing engineering strat-
egies for optimizing and inducing protective processes, thereby facilitating recovery
from disorders. All organisms possess protective mechanisms against genetic defects
and environmental insults. These mechanisms develop during evolution at all struc-
tural levels-molecular, cellular, organ, and system levels (Liu et al., 2015; Liu, 2019).
Examples of molecular protective mechanisms include homologous recombination for
repairing double-strand DNA breaks induced by irradiation and chemical agents ijasin
and Rothstein, 2013; Cannan and Pederson, 2016) and protective gene expression in
response to injury (Liu et al., 2015; Llu, 2019). Cellular protective mechanisms include
cell proliferation and differentiation to prevent organ failure in injury and disorders
(Llu, 2007; Llu et al., 2015). At the organ and systems levels, inflammatory responses
are a representative example for preventing microorganism infections, stimulating cell
regeneration and extracellular matrix generation, and facilitating repairing processes
(Rock and Kono, 2008; Chen et al., 2018). However, naturally occurring protective
mechanisms are not all optimized in promptness and effectiveness. In selected cases,
injured cells and organs cannot be completely regenerated and repaired, resulting in
organ failure. For instance, lethal gene mutations occur, causing genetic disorders, in
spite of the presence of gene repair mechanisms; the expression of protective genes
often lags behind injury, missing the early period of optimal protection (Llu et al., 2015);
vital cells, such as the neuron and cardiomyocyte, possess a limited capacity of protec-
tion and are largely replaced with fibrotic tissue in the event of injury and death; and
inflammatory responses are generally over-activated to cause excessive extracellular
matrix production and fibrosis, imposing adverse effects on cell and organ functions
(Rock and Kono, 2008; Liu et al., 2015). Protective engineering is developed to correct
these natural deficiencies by inducing and optimizing protective processes, thereby
maximizing the capacity of protection.
Protective engineering is closely related to another bioengineering discipline--
regenerative engineering (Liu, 2007; Gardiner, 2018; Laurencin and Khan, 2018).
Protective engineering is to prevent cells from death in injury and disorders, whereas
regenerative engineering is to reproduce cells after cell death. In nature, protection and
regeneration are two continuous, collaborative mechanisms that prevent detrimental
consequences in harsh environments, ensuring the survival of disordered cells, organs,
and ultimately the entire organism. In a broader sense, regenerative engineering is
protective-to protect organs and the organism from death by reproducing cells and
tissues. Thus, regenerative engineering can be considered an integral part of protective
engineering. The ultimate goals of protective engineering are to alleviate cell injury,
support cell survival, promote and control cell regeneration, and restore the structure
and function of disordered organs to their natural forms. Protective engineering strate-
gies and technologies can be designed and used to achieve such goals. In this book, the
cardiovascular system is used to demonstrate the principles and applications of protec-
tive engineering.
Chapter One 3
Cardiovascular disease is the leading cause of human morbidity and mortality. A

variety of protective and regenerative engineering strategies and technologies have been
established for cardiovascular disorders, such as atherosclerosis, arterial aneurysms,
coronary heart disease, and cardiomyopathies. Protective engineering-based interven-
tions, such as protein and gene therapies, cell transplantation, and arterial stenting
and reconstruction, have been proven effective in experimental and clinical investiga-
tions. This book addresses the foundations, strategies, technologies, and application
of protective engineering to cardiovascular disorders. The foundations, strategies,
and technologies of protective engineering will be discussed in Chapters 1 through 9,
and protective engineering applications will be covered in Chapters 10 through 16.
Here, the foundations and general strategies of cardiovascular protective engineering
are outlined by using myocardial ischemia-reperfusion injury as a model.
Foundations of Protective Engineering

The foundations of protective engineering are the etiology, pathology, and pathophysi-
ology of disease, including the naturally occurring protective mechanisms against dis-
orders. It is essential to understand the pathogenic processes, pathological changes, and
protective actions in disorders for the development of protective engineering strategies.
In response to a pathogenic cause or process, natural protective mechanisms are acti-
vated to protect cells from injury and death, thereby reducing the impact of the disor-
der. Protective engineering strategies can be designed based on the natural protective
mechanisms and used to induce and optimize protective actions, thereby suppressing
pathogenic processes and facilitating recovery from the disorder.
Pathogenic causes and processes

Adisorderoccursinresponsetopathogeniccause(s),includinggenemutation(s)and/or
environmental insult(s). Identifying the pathogenic cause(s) and understanding the
pathogenic mechanisms are the first tasks for designing protective engineering strat-
egies. For instance, ischemic myocardial injury is caused largely by coronary artery
atherosclerosis and/ or embolism that block coronary blood flow. Once occurring, a
coronary intervention, such as coronary angioplasty, stent placement, or reconstruc-
tion, can be used to remove the blockade and reperfuse the ischemic myocardium,
an effective approach to rescue the ischemic myocardium from infarction. When
myocardial injury occurs, preventing cardiomyocyte death becomes the priority of
treatment. Various tumor necrosis factor superfamily genes are upregulated in inflam-
matory responses to ischemia, contributing to cardiomyocyte death. Thus, suppressing
the expression of these genes by RNA interference can reduce cardiomyocyte death.
Concurrently, growth factors, such as epidermal growth factors (EGFs), fibroblast
growth factors (FGFs), and hepatocyte growth factor (HGF), can be used to prevent
cardiomyocyte death by activating cell survival signaling networks. When myocardial
infarction occurs, the priority of treatment is to induce and promote cardiomyocyte
regeneration to replenish the lost myocardium by applying regenerative factors to
stimulate the differentiation of cardiac resident stem cells and transplanting exogenous
stem cells to boost cardiomyocyte formation. These examples emphasize an important
point-understanding the pathogenic causes and processes is the basis for developing
protective engineering strategies.
4 Chapter One
Naturally accunlng protective mechanisms

There exist a variety of natural protective m.echanisms in mammalian systems, as dem-
onstrated through the book, serving as foundations for developing protective engineer-
ing strategies. Natural protective m.echanisms evolve in response to genetic defects
and environmental insults. Here, myocardial ischemia-reperfusion injury is used as
an example to demonstrate how the natural protective m.echanisms act agalnst car-
diomyocyte death. Myocardial ischemia causes myocardial infarction, but can also
activate innate protective m.echanisms to prevent ca.rdi.omyocyte death. Two types of
such mechanism have been identified-regional and distant protective mechanisms
(Liu et al., 2015; Liu, 2019), which are collectively defined as systems protective mecha-
nisms (Fig. 1.1). The regional mechanisms include upregulation and release of paracrine
protective factors, leukocyte activation and infiltration, resident stem cell activation
Distant
protective
I"'-+ mechanisms +--
Kidney
Lung
~-~
' Spleen
Intestines
' Bone marrow
F11uR! 1.1 Naturally occurring systems protective mechanisms, including regional protective
mechanisms In the lschemlc heart and distant protective mechanisms from non·lnjured organs.
The outer oval shows the coverage of cytoklnes and endocrine factors released from the lschemlc
cardiac cells and activated leukocytes; the center vertical oval indicates the coverage of distant
protective mechanisms, involving endocrine factors and cells mobilized from distant organs: and
the top small oval indicates the coverage of regional protective mechanisms from the ischemic
heart. The thick arrows represent distant protective mechanisms from organs confirmed In
experimental tests, and the thin arrows indicate potential distant protective mechanisms from
organs that have not been experimentally confinned. (From Liu, 2019, by permission.)
Chapter One 5
and differentiation, and fibroblast proliferation and extracellular matrix production

(Liu et al., 2015; Liu, 2019). The distant mechanisms include upregulation and release
of endocrine protective factors and mobilization of protective cells from the bone mar-
row, spleen, liver, and potentially other organs (Swirski et al., 2009; Liu et al., 2015; Liu,
2019). Both regional and distant cardioprotective mechanisms act in coordination and
synergy to protect cardiomyocytes from death and facilitate recovery from ischemic
myocardial injury.
Regional protective mechanisms

Various protective mechanisms are present within each organ and can be activated to
protect cells from injury and death. In the heart, for instance, one mechanism is the
expression and release of paracrine protective factors from injured cells, including ade-
nosine, opioids, bradykinin, hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor
(ILGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin 6 (IL6), and stromal cell-
derived factor 1 (SDF1), in response to ischemic myocardial injury (Banai et al., 1994;
Liu et al., 2011a; Yellon and Downey, 2003; Granfeldt et al., 2009; Vmten-Johansen and
Shi, 2011). Based on the time of action, these factors are divided into two classes: early
and late cardioprotective factors. Early factors include adenosine, opioids, and bradyki-
nin that are released from injured cardiac cells during the first several hours following
ischemic myocardial injury without the involvement of de novo gene expression, and
the others are considered late factors that are produced and released within several
days, requiring de novo gene expression (Yellon and Downey, 2003; Vinten-Johansen
and Shi, 2011; Liu et al., 2015). The time-dependent actions of these multiple factors pro-
vide a wide timeframe of protection. However, the ischemic myocardium may not be
well protected during the early period prior to the release and action of the protective
factors, and not all protective factors can reach optimal levels for effective protection
(Yellon and Downey, 2003; Liu et al., 2015; Liu, 2019). Correction of these deficiencies is
a major task of cardioprotective engineering.
Distant protective mechanisms

Distant protective mechanisms include expression and release of endocrine factors and
mobilization of protective cells from distant organs in response to a regional injury or
disorder. In ischemic myocardial injury, for instance, endocrine protective factors can
be expressed and released from the liver and adipose tissue (Liu et al., 2012, 2013). The
liver-derived protective factors include al-acid glycoprotein type 2 (AGP2), bone mor-
phogenetic protein-binding endothelial regulator (BMPER), fibroblast growth factor 21
(FGF21), neuregulin 4 (NRG4), and trefoil factor 3 (TFF3) (Liu et al., 2012), whereas the
adipose tissue expresses and releases FGF21 (Liu et al., 2013). These factors are able
to reach the ischemic cardiomyocytes via the circulatory system when the endothelial
permeability is increased in ischemia-induced inflammation, supporting the cardio-
myocyte survival (Liu et al., 2012, 2015; Liu, 2019). Administering each of these factors
reduces the rate of myocardial infarction, and administration of all these factors in com-
bination further boosts the impact of these factors, supporting the cardioprotective role
of the liver- and adipose tissue-derived endocrine factors (Liu et al., 2012).
Cell mobilization from non-injured organs is another distant protective mecha-
nism activated in response to injury. Ischemic myocardial injury has been used as a
model to study this type of mechanism. Several organs can mobilize their cells into
the circulatory system, including the bone marrow (Ripa et al., 2006; Fazel et al., 2008),
6 Chapter One
(
. ""\
IL6
~~
HepaUc cells Leukocytes
F11uRE 1.2 Regulatory mechanisms of hepatic cell moblllzatJon In response to lschemlc

myocardial injury.
spleen (Swirski et al., 2009), and liver (Liu et al, 2011b, 2015), in experimental ischemic
myocardial injury. The mobilized cells are can e:ngraft to the .isc:hemic myocardium,
exerting cardioprotective actions. From the bone marrow, hematopoietic: stem cells and
endothelial progenito.rs can be mobilized in isc:hemic myocardial injury an!L once reach-
ing the ischemic: myocardium, can release c:ytokines and growth factors, reducing myo-
cardial infarction (Ripa et al., 2006; Fazel et al., 2008). Bone marrow-derived endothelial
proge:nito.r cells can dllfere:ntiate into endothelial cells, facilitating angiogenesis (Shintani
et al., 2001). Ischemic myocardial injury can also cause mobilization of splenic mo.nocytes
to the circu.latory system and ischemic myocardium to regulate inflammatory .responses
and promote recovery from i.schemic: myocardial injury (Sw.irski et al, 2009). Jn addi-
tion, the liver can mobilize cells to the c:U:culatory system in response to ischemic myo-
cardial injury (Liu et al, 2011b, 2015). Major cell types mobilized include hepatocytes
and biliary epithelial cells (Liu et al., 2011b, 2015). The mobilized hepatic cells can enter
the ischemic: myocardium, contributing to myocardial protection and repair by express-
ing and releasing cardioprotective proteins, as discussed previously (Fig. 1.2). With the
understanding of the distant protective mechanisms, protective engineering strategies
can be developed and used to modify non-injured organs to maximize the protective
impact, an approach. to avoid intervention-induced injury of the ischemic heart.
Protective Engineering Strategies

Protective engineering strategies can be developed and used to induce protecti.vepnxesses
and optimize protective impacts at three levels with currently available technologies-
molecular, cellular, and tissue levels (Fig. 1.3). Molecular protective engineering is to
modify the types, levels, activation timing, and coordination of protective facto.rs by
controlled protein delivery, gene transfer, gene editinSt RNA interference, and/ or other
molecular modulation strategies, thereby boosting cell protection. Cellular protective
engineering is to provide needed cell types for targeted delivery of protective factors
Chapter One 7
Molecular Cellular
Protein delivery
Fibroblasts
~
Gene transfer
I
0
Gene editing
~~
Esc~;esc,
Tissue
Guide RNA
RNA interference
F11uRE 1.3 Molecular, cellular, and tissue-level protective engineering strategies. The protein
structure presented in the Molecular column represents vascular endothelial growth factor
(RCSB PDB # 2VPF) (Muller et al., 1997). PAM: Protospacer adjacent motif. RISC: RNMnduced
sllenclng complex. slRNA: Small Interfering RNA.ESCs: Embryonic stem cells. IPSCs: Induced
pluripotsnt stem cells.
and regeneration of functional cells. Tissue-level protective engineering is to provide

structural and functional support to an injured or disordered organ to facilitate recov-
ery and prevent organ failure. Overall, these molecular, cellular, and tissue-level engi-
neering strategies can be designed and used for the precise control of the types, levels,
timing, and coordination of systems protective actions, thereby optimizing the pro-
tective meclumisms, minimizing cell death, and facilitating recovery from injury and
disease.
Molecular protective engineering

There are several molecular strategies for protective engineering-protein admin-
istration, gene transfer, gene editing, and RNA interference. Proteins can be directly
delivered to target cells to initiate rapid protective actions (within seconds) and are
comm.only used immediately following the onset of an injury or disorder. Gene transfer
is an approach to introduce a gene into target cells to boost and sustain gene expres-
sion. Gene editing is a method to modify gene structures and introduce an exogenous
8 Chapter One
gene into the genome to replace a malfunctioned target gene, resulting in a permanent
replacement of the target gene. RNA interference is to temporarily suppress mRNA
translation to proteins. These strategies can be used to boost or suppress gene expres-
sion and cell activities, depending on the functions of the target genes and the nature of
the disorder. Fundamental engineering procedures include mRNA isolation from a cell
source, target gene identification by mRNA profiling, mRNA conversion into cDNAs,
establishment of recombinant genes, recombinant gene amplification, gene function
tests in vitro, gene modifications by gene transfer, gene editing, or RNA interference,
and gene function tests in vivo.
Enhancing protectire impacts by protein administtation and gene ttansfer

Protein administration and gene transfer represent treatment strategies for initiating
prompt protective actions and sustaining protective gene expression, thereby reduc-
ing cell death, enhancing cell regeneration, and facilitating recovery from an injury or
disorder (Dunbar et al., 2018; Liu, 2019). In ischemic myocardial injury, for instance, a
number of protective genes are upregulated and released, including the VEGF, HGF,
EGF, and FGF genes (Nakamura et al., 2000; House et al., 2005; Messadi et al., 2014;
Folino et al., 2018). Whereas these genes contribute to cardioprotection, their expression
(within 1-2 days) lags behind the onset of cardiomyocyte injury and death (within min-
utes to hours, depending on the degree of injury) and does not reach optimal levels for
effective protection. These natural deficiencies can be overcome by targeted delivery of
protective proteins immediately following an insult, an approach initiating protective
actions prior to cell injury and death, and by transferring genes encoding the protec-
tive proteins into injured or disordered cells, an approach sustaining the expression
and release of protective proteins. The biological foundation of gene transfer is that
mammalian cells are capable of endocytosing genes and the endocytosed genes can be
expressed once reaching the nucleus (Liu, 2007; Dunbar et al., 2018). However, the rate
of gene endocytosis is low. Thus, plain gene transfer is not effective to produce suffi-
cient proteins for protection.
A number of methods have been developed and used to facilitate gene transfer into
target cells in vivo, including virus-, liposome-, and receptor-mediated gene transfers
(Dunbar et al., 2018; Liu, 2019). Vrruses are the most effective mediators for gene trans-
fer because they are naturally equipped with machineries for host cell infection and
viral gene integration into the host genome. Protective genes can be integrated into the
viral genome by recombinant biotechnology and introduced to target cells via virus
infection. Liposomes are phospholipid vesicles that can bind DNA fragments and fuse
into target cells to facilitate gene transfer. Selected protein ligands, such as transferrins,
can form complexes with gene fragments via linkers and bind to cognate receptors to
cause ligand-gene-receptor internalization and facilitate gene transfer. Protective gene-
containing carriers can be delivered into a target tissue and organ by direct injection or
mediation of various carriers, such as nanoparticles, capsules, gel patches, biological
matrix, or synthetic polymer scaffolds. The carrier-mediated approach can be used to
provide controlled and sustained release of proteins and genes.
The effectiveness of molecular protective engineering strategies depends on the
types, levels, timing, and coordination of protective factors and genes selected for
delivery. In principle, genes that are activated in response to an injury or disorder and
directly involved in natural protective processes are the candidates of choice. These
genes can be identified by a systematic differential gene expression profiling approach
Chapter One 9
such as RNA sequencing (RNA-seq). A challenge for this approach, however, is the
cumbersome analysis of a large amount of information with a large number of injury-
altered genes from a gene profiling test. An important task is to identify the most effec-
tive genes that can be used for protective therapies. One practical approach is to classify
the upregulated or downregulated genes into functional categories, such as secreted
protective protein genes (for instance, growth factor and cytokine genes), receptor
genes, protein kinase genes, transcription factor genes, and others. The next step is to
screen the genes of a selected category by using functional assays in vitro or in vivo. For
in vitro assays, each selected gene can be introduced to cultured cells subjected to an
insult; and the protective impact is evaluated based on the rate of cell survival or death
under a given insult. The most effective protective genes can be selected by comparison
analyses between different genes. For in vivo assays, a disorder model such as ischemic
myocardial injury can be induced in an animal model, and a similar protocol can be
used to identify the most effective protective genes based on various measures, such
as the fraction of myocardial infarction, the rate of cardiac cell death, and the relative
activities of caspases 3, 8, and 9. Proteins encoded by the selected genes can also be used
for these tests with or without concurrent gene transfer.
Supptessint adverse dflne expression

A disorder causes expression and release of not only protective genes, but also adverse
genes. For instance, ischemic myocardial injury causes expression of not only growth
factor genes for cell protection, but also tumor necrosis factor superfamily genes
responsible for cell death induction, a mechanism to facilitate the death of severely
injured cells that cannot be rescued. An important task of protective engineering is to
control the expression of the adverse genes to inhibit their cell death-inducing activities.
The RNA interference method by using small interfering RNAs (siRNAs) can be used
to silence adverse genes (Xia et al., 2002; Watts and Corey, 2012). An siRNA is a double-
stranded RNA sequence about 21-22 base pairs in length, originally discovered in the
plant petunias (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990) and the nematode worm
C. elegens (Gu et al., 2012). siRNAs are capable of recognizing and interacting with
specific target mRNAs based on the complementary principle, cleaving or blocking
the target mRNAs, and thereby knocking down the synthesis of corresponding pro-
teins (Novina and Sharp, 2004). These features have made RNA interference a useful
approach for post-transcriptional silencing of selected target genes. An siRNA can be
constructed based on the sequence of a selected gene and delivered to target cells for
gene silencing. Once inside the cell, a double-stranded siRNA can form a complex with
a protein structure known as RNA-induced silencing complex (RISC). The RISC can
separate the two siRNA strands, reject the sense strand, and keep the anti-sense strand.
The latter can bind to a target mRNA, and the associated RISC can cleave the target
mRNA into small fragments, thereby preventing protein translation.
Gene editint-mediated control of dene expression

Gene editing is another potential engineering approach that can be used to enhance the
expression of protective genes and suppress the expression of adverse genes. A repre-
sentative gene editing process is CRISPR/Cas-based gene editing, originally found in
bacteria and archaea for protection against viral and plasmid infection (Horvath and
Barrangou, 2010). This mechanism can be used to edit the genome of mammalian cells.
The principle of action is to cause double strand DNA breaks by a CRISPR/Cas system,
10 Chapt er One
a process activating homologous recombination and causing insertion of an exogenous

gene into the host genome. The CRISPR/Cas9 system has been developed and used
for such a purpose (Deltcheva et al., 2011; Jinek et al., 2012). This system consists of
three basic elements----CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (trRNA), and
Cas9 Oinek et al., 2012). crRNA is able to recognize a target gene to be edited; trRNA is
a sequence partially complementary to the crRNA required for Cas9 action Oinek et al.,
2012); and Cas9 is an enzyme causing double strand DNA breaks Ginek et al., 2012).
Gene editing can be initiated by simply introducing crRNA, trRNA, and Cas9 into the
target cells to induce double-strand DNA breaks on a target gene at sites recognized
by the gene-specific crRNA (Jinek et al., 2012). In the presence of an exogenous gene
(introduced into cells together with CRIPR/Cas9), double strand DNA breaks activate
the homologous recombination mechanisms, causing substitution of the introduced
exogenous gene for the target gene (Gong et al., 2005; Overballe-Petersen et al., 2013). In
the absence of an exogenous gene, double strand DNA breaks cause non-homologous
DNA end joining to repair the damage. By using these mechanisms, a protective gene
with enhanced expression capacity (induced by using a stronger gene promoter) can
be introduced to a specified target gene locus by CRISPR/Cas editing to boost cardio-
protective gene expression. A gene imposing an adverse impact on protection can be
replaced by a modified gene with reduced expression capacity. Thus, CRISPR/Cas edit-
ing is a potentially effective method for molecular protective engineering.
Cell-based protective engineering

Cell-based protective engineering strategies can be designed and used to induce and
promote cell regeneration and deliver protective factors to target cells. Fundamental
engineering procedures include cell identification, isolation from a source structure,
expansion in vitro, engineering modifications for expression of selected genes, struc-
tural and functional tests in vitro, transplantation into a target organ, and structural
and functional tests in vivo. In ischemic myocardial injury, for instance, a fundamental
method of cell-based protective engineering is cell transplantation into the ischemic
myocardium. Several cell types can be used for cardiac cell protection and regeneration-
embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, and somatic stem cells. For myo-
cardial regeneration, embryonic and induced pluripotent stem cells are the candidates
of choice. Somatic cardiomyocytes are not usually used because these cells have a lim-
ited capacity of regeneration and are not able to survive the transplantation procedures
and host environment. For myocardial protection, pluripotent stem cells and somatic
cells, such as bone marrow progenitor cells, skeletal muscle progenitor cells, and
hepatic cells, can be engineered to over-express selected protective gene(s) and trans-
planted to the ischemic myocardium for regional delivery of protective factors. The
effectiveness of cell-based engineering therapies has been demonstrated in numbers of
previous investigations (Abdel-Latif et al., 2007; Martin-Rendon et al., 2008; Carvalho
et al., 2015).
Tissue-level protective engineering

Tissue-level protective engineering strategies can be developed and used to support
organ structures and assist in organ performance, preventing organ failure. Fundamental
engineering procedures include construction of a biological matrix or synthetic polymer
scaffold with the composition, structure, porosity, shape, dimensions, and mechanical
Chapter One 11
properties conforming to the tissue or organ to be replaced; preparation, expansion,

and seeding of selected stem or somatic cells into the scaffold; development of the cell-
seeded scaffold into a functional construct; evaluation of the construct function in vitro;
implantation of the construct into a target organ; and evaluation of the construct func-
tion in vivo. For instance, in ischemic myocardial injury, the most important tasks of
tissue-level protective engineering are to strengthen the ischemic myocardium for pre-
venting myocardial rupture and support the myocardial contractile performance for
preventing heart failure. A sheet-like extracellular matrix or synthetic polymer scaffold
can be constructed and applied to the external surface of the ischemic myocardium to
enhance its strength (Kaiser and Coulombe, 2015; Domenech et al., 2016; Mannhardt
et al., 2016; Wang et al., 2018). To assist in myocardial performance, it is necessary to
establish a myocardium-mimicking construct integrated with functional cardiomyo-
cytes possessing synchronized contractile activities. The construct can be implanted
onto the epicardium to enhance the contractile function of the ischemic myocardium
(Kaiser and Coulombe, 2015; Domenech et al., 2016; Mannhardt et al., 2016; Wang
et al., 2018). A scaffold can also be used to deliver protective and regenerative factors.
To do so, an extracellular matrix or synthetic polymer scaffold can be integrated with
cells engineered to express selected genes and implanted onto the exterior surface of
the ischemic myocardium. This approach provides controlled and sustained release of
protective and regenerative factors from the cells of the implant.
Perspectives
Nature has established various mechanisms for cell protection and regeneration in
injury and disease; however, not all mechanisms are optimized in promptness and
effectiveness. Protective engineering is developed and used to induce and optimize
protective processes, thereby correcting natural deficiencies and maximizing the capac-
ity of protection. Various protective engineering strategies have been developed at
the molecular, cellular, and tissue levels and used in experimental and clinical inves-
tigations for protection against injury and disease; however, not many strategies have
exerted a significant clinical impact. The most effective, but not perfect, strategies are
those at the tissue level, including ventricular assist device placement, angioplasty, arte-
rial stenting, and arterial reconstruction for the cardiovascular system. Most molecular
and cell-level engineering strategies, although effective in experimental tests, have not
been successfully used in clinical investigations.
One potential obstacle for clinical applications is the lack of complete understanding
of the naturally occurring systems protective mechanisms (Llu et al., 2015; Liu, 2019).
Most clinical treatment strategies are not designed based on the natural mechanisms of
protection (Hausenloy et al., 2017; Reusch, 2017; Davidson et al., 2019). Whereas time-
dependent multiple protective molecules and cell types are required for the natural form
of protection (Llu et al., 2012; Llu, 2019), a single "protective agent'' targeting a selected
molecule or pathogenic process is commonly used in clinical tests, a potential problem
for the failure of most protective clinical trials (Davidson et al., 2019; Hausenloy et al.,
2017; Reusch, 2017). This point is supported by the observation that the activation of
multiple protective factors by a preconditioning injury represents the most effective and
reproducible treatment strategy for protection against a subsequent injury (Llu et al.,
2015; Hausenloy et al., 2017; Reusch, 2017; Davidson et al., 2019). However, a list of
12 Chapter One
naturally occurring protective factors remains incomplete and their mechanisms of

action have not been fully understood. To develop protective engineering strategies
that maximize the capacity of cell protection, it is necessary to identify naturally occur-
ring systems protective factors and understand the underlying mechanisms of action.
Such information can be used to identify and correct the deficiencies of the naturally
occurring protective mechanisms and maximize the capacity of protection by engineer-
ing optimization of the types, levels, timing, and coordination of protective actions in
injury and disease.
References
Abdel-Latif, A., Holli, R., Tleyjeh, l.M., Montori, V.M., Perin, E.C., Hornung, C.A., Zuba-
Surma, E.K. "Adult Bone Marrow-derived Cells for Cardiac Repair. A Systematic
Review and Meta-analysis." Arch Intern Med 167: 989-997, 2007.
Banai, S., Shweiki, D., Pinson, A., Chandra, M., Lazarovici, G., Keshet, E. "Upregulation
of Vascular Endothelial Growth Factor Expression Induced by Myocardial Ischaemia:
Implications for Coronary Angiogenesis." Cardiovasc Res 28: 1176-1179, 1994.
Cannan, W.J., and Pederson, D.S., "Mechanisms and Consequences of Double-strand
DNA Break Formation in Chromatin." JCell Physiol 231: 3-14, 2016.
Carvalho, E., Verma, P., Hourigan, K., Banerjee, R., "Myocardial Infarction: Stem Cell
Transplantation for Cardiac Regeneration." Regen Med 10: 1025-1043, 2015.
Chen, L., Deng, H., Cui, H., Fang, J., Zuo, Z., Deng, J., Li, Y., Wang, X., Zhao, L.
"Inflammatory Responses and Inflammation-Associated Diseases in Organs."
Oncotarget. 9: 7204-7218, 2018.
Davidson, S.M., Ferdinandy, P., Andreadou, I., Betker, H.E., Heusch, G., Ibanez, B., Ovize,
M., Schulz, R., Yellon, D.M., Hausenloy, D.J., and Garcia-Dorado, D. on behalf of
the European Union CARDIOPROTECTION COST Action (CA16225). "Multitarget
strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury." J Am Coll Cardiol 73:
89-99, 2019.
Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C. M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z. A., Eckert,
M. R., Vogel, J., and Charpentier, E. "CRISPR RNA Maturation by Trans-Encoded
Small RNA and Host Factor RNase III." Nature 471: 602-607, 2011.
Domenech, M., Polo-Corrales, L., Ramirez-Vick, J.E., Freytes, D.O. "Tissue Engineering
Strategies for Myocardial Regeneration: Acellular Versus Cellular Scaffolds?" Tissue
Eng Part B Rev 22: 438--458, 2016.
Dunbar, C.E., High, K.A., Joung, J.K., Kohn, D.B., Ozawa, K., Sadelain, M. "Gene Therapy
Comes of Age." Science 359: 175, 2018.
Fazel, S.S., Chen, L., Angoulvant, D., Li, S.H., Weisel, R.D., Keating, A., Li, R.K. 2008.
"Activation of c-kit is Necessary for Mobilization of Reparative Bone Marrow
Progenitor Cells in Response to Cardiac Injury." FASEB J22: 930-940, 2008.
Folino, A., Accomasso, L., Giachino, C., Montarolo, P.G., Losano, G., Pagliaro, P., and
Rastaldo, R. "Apelin-induced Cardioprotection against Ischaemia/Reperfusion
Injury: Roles of Epidermal Growth Factor and Src." Acta Physiol (Oxf) 222: 12924,
2018.
Gardiner, D.M. Regenerative Engineering and Developmental Biology: Principles and
Applications. In CRC Press Series Regenerative Engineering, lst Edition, Boca Raton,
FL: CRC Press, 2018.
Chapter One 13
Gong, C., Bongiorno, P., Martins, A., Stephanou, N. C., Zhu, H., Shuman, S., and
Glickman, M.S. "Mechanism of Nonhomologous End-Joining in Mycobacteria: a
Low-Fidelity Repair System Driven by Ku, Ligase D and Ligase C." Nat Struct Mol
Biol 12: 304-312, 2005.
Granfeldt, A., Lefer, D.J., Vinten-Johansen, J. "Protective Ischaemia in Patients:
Preconditioning and Postconditioning." Cardiovasc Res 83: 234-246, 2009.
Gu, s.,G., Pak, J., Guang, s., Maniar, J., M., Kennedy, s., Fire, A. IIAmplification of siRNA
in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone
H3 lysine 9 methylation footprint." Nature Genetics 44:157-164, 2012.
Hausenloy, D.J., Botker, H.E., Engstrom, T., Erlinge, D., Heusch, G., Ibanez, B., Kloner,
R.A., Ovize, M., Yellon, D.M., Garcia-Dorado, D. "Targeting Reperfusion Injury in
Patients with ST Segment Elevation Myocardial Infarction: Trials and Tribulations."
Eur Heart] 38: 935-941, 2017.
Heusch, G. "Critical Issues for the Translation of Cardioprotection." Circ Res 120: 1477-
1486, 2017.
Horvath, P., and Barrangou, R. "CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and
Archaea." Science 327: 167-170, 2010.
House, S.L., Branch, K., Newman, G., Doetschman, T., and Schultz, J.J. "Cardioprotection
Induced by Cardiac-Specific Overexpression of Fibroblast Growth Factor-2 is Mediated
by the MAPK Cascade." Am JPhysiol Heart Circ Physi.ol 289: H2167-H2175, 2005.
Jasin, M., Rothstein, R. "Repair of Strand Breaks by Homologous Recombination." Cold
Spring Harb Perspect Biol 5: a012740, 2013.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., Charpentier, E.
"A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial
Immunity." Science 337: 816--821, 2012.
Kaiser, N.J., and Coulombe, K.L.K. "Physiologically Inspired Cardiac Scaffolds for
Tailored In Vivo Function and Heart Regeneration." Bi.omed Mater 10: 034003, 2015.
Laurencin, C.T., and Khan, Y. Regenerative Engineering. lst Edition, Boca Raton, FL: CRC
Press, 2018.
Liu, S.Q., Bioregenerative Engineering: Principles and Applicati.ons. Hoboken, New Jersey:
Wiley-Interscience, 2007.
Liu, S.Q., Tefft, B.J., Zhang, D., Roberts, D., Schuster, D.J., Wu, A. "Cardioprotective
Mechanisms Activated in Response to Myocardial Ischemia." MCB 8: 319-338, 201la.
Liu, S.Q., Tefft, B.J., Liu, C., Zhang, B., Wu, Y.H. "Regulation of Hepatic Cell Mobilization
in Experimental Myocardial Ischemia." Cell Mol Bioeng 4: 693-707, 2011b.
Liu, S.Q., Ren, Y.P., Zhang, L.-Q., Li, Y.C., Phillips, H., Wu, Y.H. "Cardioprotective Proteins
Upregulated in the Liver in Response to Experimental Myocardial Ischemia." Am J
Physiol Hearl Circ Physiol 303: H1446-1458, 2012.
Liu, S.Q., Roberts, D., Kharitonenkov, A., Li, Y.C., Zhang, L.-Q., Wu, Y.H . "Cardioprotective
Action of Fibroblast Growth Factor 21 Upregulated and Released from the Liver and
Adipose Tissue in Experimental Myocardial Ischemia." Sci Rep 3: 2767, 2013.
Liu, S.Q., Ma, X.L., Qin, G.J., Liu, Q.P., Li, Y.C., Wu, Y. H. "Trans-system Mechanisms
Against Ischemic Myocardial Injury." Comp Physiol 5: 167-192, 2015.
Liu, S.Q. "Cardiac Protective Engineering." JBiomech Eng 141: 090801-1, 2019.
Mannhardt, I., Breckwoldt, K., Letuffe-Breniere, D., Schaaf, S., Schulz, H., Neuber, C.,
Benzin, A., et al. "Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force."
Stem Cell Reports 7: 29--42, 2016.
14 Chapt er One
Martin-Rendon, E., Brunskill, S.J., Hyde, C.J., Stanworth, S.J., Mathur, A., Watt, S.M.
"Autologous Bone Marrow Stem Cells to Treat Acute Myocardial Infarction: A
Systematic Review." Eur Heart J29: 1807-1818, 2008.
Messadi, E., Aloui, Z., Belaidi, E., Vincent, M.P., Couture-Lepetit, E., Waeckel, L.,
Decorps, J., et al. "Cardioprotective Effect ofVEGF and Venom VEGF-Like Protein in
Acute Myocardial Ischemia in Mice: Effect on Mitochondrial Function."] Cardiovasc
Phannacol63:274-28l,2014.
Muller, Y.A., Christinger, H.W., Keyt, B.A., de Vos, A.M. "Vascular endothelial growth
factor refined to 1.93 angstroms resolution." Structure 5: 1325-1338, 1997.
Nakamura, T., Mizuno, S., Matsumoto, K., Sawa, Y., Matsuda, H., Nakamura, T.
"Myocardial Protection from Ischemia/Reperfusion Injury by Endogenous and
Exogenous HGF." J Clin Invest 106: 1511-1519, 2000.
Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. "Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase
Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes In
Trans." Plant Cell 2: 279-289, 1990.
Novina, C.D., and Sharp, P.A. "The RNAi Revolution." Nature 430: 161-164, 2004.
Overballe-Petersen, S., Harms, K., Orlando, L.A., Mayar, J.V., Rasmussen, S., Dahl, T. W.,
Rosing, M.T., et al. "Bacterial Natural Transformation By Highly Fragmented And
Damaged DNA." PNAS 110: 19860--19865, 2013.
Ripa, R.S., Jergensen, E., Wang, Y., Thune, J.J., Nilsson, J.C., S.0Ildergaard, L., Johnsen,
H.E. et al. "Stem Cell Mobilization Induced by Subcutaneous Granulocyte-Colony
Stimulating Factor to Improve Cardiac Regeneration after Acute ST-Elevation
Myocardial Infarction: Result of the Double-Blind, Randomized, Placebo-Controlled
in Myocardial Infarction (STEMMI) Trial." Circulation 113: 1983--1992, 2006.
Rock, K.L., and Kono, H. "The Inflammatory Response to Cell Death." Annu Rev Pathol
3: 99-126, 2008.
Shintani, S., Murohara, T., Ikeda, H., Ueno, T., Honma, T., Katoh, A., Sasaki, K., Shimada,
T., Oike, Y., and Imaizumi, T. "Mobilization of Endothelial Progenitor Cells in Patients
with Acute Myocardial Infarction." Circulation 103: 2776--2779, 2001.
Swirski, F.K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi,
P., Figueiredo, J.L., et al. "Identification of Splenic Reservoir Monocytes and their
Deployment to Inflammatory Sites." Science 325: 612-616, 2009.
van der Krol, A.R., Mur, L.A., Held, M., Moi, J.N.M., Stuitje A.R. "Flavonoid Genes in
Petunia: Addition of a Limited Number of Gene Copies May Lead to a Suppression
of Gene Expression.'' Plant Cell 2: 291-299, 1990.
Vinten-Johansen, J., and Shi, W. "Perconditioning and Postconditioning: Current
Knowledge, Knowledge Gaps, Barriers to Adoption, and Future Directions."
JCardiovasc Pharmacol Ther 16: 260-266, 2011
Wang, Z., Lee, S. J., Cheng, H-J., Yoo, J. J., Atala A. "3D Bioprinted Functional And
Contractile Cardiac Tissue Constructs." Acta Biamater 70: 48-56, 2018.
Watts, J.K., and Corey, D.R. "Gene Silencing by Simas and Anti.sense Oligonucleotides
in the Laboratory and the Clinic." JPathol 226: 365-379, 2012.
Xia, H., Mao, Q., Paulson, H.L., Davidson, B.L. "siRNA-mediated Gene Silencing In Vitro
And In Vivo." Nat Biotech 20: 1006--1010, 2002.
Yellon, D.M., and Downey, J.M. "Preconditioning the Myocardium: from Cellular
Physiology to Clinical Cardiology." Physial Rev 83: 1113--1151, 2003.
PART 1
Foundations of Cardiovascular
Protective Engineering
This page intentionally left blank
CHAPTER 2
Development of the Heart,
Blood Vessels, and
Blood cells
Hlghllghts
• Protective engineering strategies can be established based on the naturally
occurring protective mechanisms that evolve during embryogenesis and somatic
growth involving developmental processes. Cell regeneration, an integral part of
protective mechanisms, shares common regulatory processes with embryonic
cell generation. Thus, it is essential to understand developmental biology.
• A human individual develops through several processes-ovum fertilization,
embryonic cell cleavage, blastocyst formation, gastrulation, and organ formation
and maturation, and parturition. The blastocyst inner cell mass contains
embryonic stem cells that can be isolated, expanded in vitro, and transplanted
into injured or disordered organs to regenerate functional cells with the cell type
controlled by environmental factors. Gastrulation is a process generating three
germ layers-ectoderm, mesoderm, and endoderm; structures giving rise to
distinct cell types and organ systems.
• The heart, blood vessels, and blood cells develop from the mesoderm. The
mesoderm can also give rise to the skeletal muscle, bone, cartilage, and
connective tissue. The ectoderm is the origin of the central and peripheral nerve
system, skin, eyes, ears, nose, mouth, hair, and nails. The endoderm gives rise
to the lung, liver, stomach, intestines, kidney, and urinary bladder.
• Cardiac cells develop from two types of cardiogenic cell-the primary and
secondary heart field cardiogenic cells. The primary heart field cells give rise to
cardiac cell lineages that form the left and right ventricles, left and right atria, as
well as the atrioventricular canals. The secondary heart field cells contribute to
the formation of the inflow region (veins}, outflow tract (arteries}, as well as all
other cardiac structures except for the left ventricle.
• The heart forms via several major stages-creation of the cardiac crescent at
about two weeks from fertilization, formation of the heart tube at about three
weeks, heart looping at about four weeks, and establishment of the four cardiac
17
18 Part One
chambers at about eight weeks. Cyclic cardiac contractile activities occur in the
heart-tube stage.
• Vascular and blood cells develop from hemangioblasts simultaneously with
cardiac development. Hemangioblasts give rise to angioblasts and hematopoietic
stem cells. The former develops into vascular cells, including endothelial cells,
smooth muscle cells, and fibroblasts; whereas the latter form blood cells,
including erythrocytes, leukocytes, and platelets.
• Vascular development begins with capillary formation in the blood island from
endothelial cells during the early embryonic stage. While the majority of
capillaries are connected into networks, selected capillaries are expanded into
small arteries and veins by recruiting progenitor cells that give rise to smooth
muscle cells and fibroblasts. Selected small arteries and veins develop into
larger arteries and veins, respectively.
• Blood cell generation is a process continuing through the entire lifespan,
beginning in the blood island during the early embryonic stage. The blood-
generating site moves from the blood island to the aorta-gonad-mesonephroi
when blood vessels form in blood islands, moves to the liver when the
aorta-gonad-mesonephroi degenerate, and eventually settles in the bone marrow
during the late embryonic stage. The bone marrow is the permanent site of
hematopoiesis in adults.
Overview
Protective engineering strategies can be designed largely based on the naturally occur-
ring protective mechanisms that evolve in response to genetic defects and environ-
mental insults. As these natural mechanisms are established during embryogenesis
and somatic growth involving developmental processes, it is essential to understand
developmental biology. Furthermore, regenerative engineering, an integral part of pro-
tective engineering, is based on the natural mechanisms of cell regeneration in injury
and disease. Cell regeneration shares common regulatory mechanisms with embryonic
cell generation. We can learn cell regenerative control mechanisms from the generation
processes of embryonic cells and structures. For these reasons, the book starts with the
concept of cardiovascular development in humans.
Early Embryonic Development

Overview of embryonic processes
The life of humans begins with fertilization, a process involving fusion of a sperm cell
into an ovum to form a zygote. Fertilization initiates several embryonic processes--
embryonic cell cleavage, blastocyst formation, gastrulation, organ formation and matu-
ration, and parturition (Liu, 2007). Embryonic development can be divided into several
stages-the germinal stage from fertilization to gastrulation (about 2 weeks), organ
forming stage from gastrulation to organ formation (from 2 to 8 weeks), and the fetal
stage from organ formation to parturition (from 8 to 40 weeks) (Fig. 2.1). During the
germinal stage, a fertilized egg is divided continuously to increase the cell population
with a decrease in cell volume. When reaching the 16-cell stage, the embryonic cells
are prompted to form a ball-shaped structure known as blastocyst at about seven days.
Chapter Two 19
""~·\ T
Inner
cell
Mesoderm
'
Blastocyst
Fertilization formation Gastrulation Fetus formation
1week 2 weeks 8 weeks
FIGURE 2.1 Processes of early embryonic development.
The blastocyst further develops into a three-layered structure defined as gastrula, com-
posed of the ectoderm, mesoderm, and endoderm at about two weeks. The process
of gastrula formation is referred to as gastrulation. During the organ formation stage,
the ectoderm develops into the brain, spinal cord, ganglia, peripheral nerves, and
the epidermal layer of the skin, ears, nose, and teeth. The mesoderm gives rise to the
heart, blood vessels, blood cells, soft connective tissues, skeletal muscles, bones, and
cartilages. The endoderm develops into the lung, gastrointestinal tract, liver, pancreas,
and urinary bladder. During the organ formation and fetal stages, tissues and organs
develop rapidly and gain size and functionality. By the time of parturition, most tissues
and organs are ready to function.
Fertilization-union of the sperm and ovum

Fertilization is a process by which a sperm fuses into an ovum to develop into an
embryo (Liu, 2007). A sperm cell is composed of a haploid nucleus, a propulsion appa-
ratus, and protein enzymes, responsible for interactions with the ovum. Two sperm
structures, the acrosome and flagellum, are critical to sperm-ovum interactions. The
acrosome contains enzymes necessary for degrading the external layer zona pellucida
of the ovum, allowing union of the sperm with the ovum. The flagellum is responsible
for sperm movement, driven by the motile apparatus axoneme, a structure composed
of microtubules and the motor protein dynein. Dynein is attached to the microtubules
and contains an enzyme that hydrolyzes ATP, providing energy necessary for dynein
motility, flagellar propulsion, and sperm movement.
An ovum consists of a haploid nucleus and a large cytoplasm for storage of nutri-
ents to support the embryo growth. The ovum cell membrane is surrounded by an
extracellular matrix layer known as zona pellucida. Outside the zona pellucida, there
is a thick cellular structure defined as cumulus, composed of a large number of ovarian
20 Part One
follicular cells, which provide soluble factors and mechanical protection to the ovum.
When a female individual reaches maturity, ova develop from oocytes (developing ova)
through meiosis, a process starting at -13 years of age and ending at the age of -50.
About 400 eggs can be produced through the lifespan (Liu, 2007).
Fertilization involves several processes, including chemotactic attraction of sperm
cells to an ovum, penetration of a sperm cell through the exterior layers of the ovum,
sperm fusion into the ovum, and integration of two gamete nuclei. Sperm cells can be
attracted to an ovum in the oviduct by chemical gradient-directed cell movement, a
process known as chemotaxis. Ova are capable of expressing and releasing the sperm-
attracting protein resact that interacts with cognate receptors in sperm cells, causing
directed movement of sperm cells toward an ovum. This process is species-dependent-
sperm cells can only move to the ovum of the same species because of the specificity of
chemotactic molecules (Liu, 2007).
Upon the interaction of sperm cells with the exterior layer of an ovum, the acro-
somal vesicle of the sperm is activated. A sperm cell can go through the follicular cell
layer of the ovum and release proteolytic enzymes when reaching the zona pellucida.
The enzymes are responsible for degrading the zona pellucida, allowing the sperm
approaching the ovum membrane. A zona pellucida protein known as zona protein
3 (ZP3) controls acrosomal vesicle exocytosis by activating the sperm membrane G
protein-coupled receptor galactosyltransferase-1. This process stimulates a signaling
process, causing calcium release into and elevation in the cytosol. Calcium in turn acti-
vates processes that cause acrosomal vesicle exocytosis, regulating sperm union with
an ovum. As all the regulatory ligands and receptors are animal species-specific, the
sperm-ovum union occurs only in the same species (Llu, 2007).
A sperm cell, when passing through the zona pellucida, can attach to the ovum
membrane, inducing membrane fusion of both cells, introducing the sperm contents
into the ovum. This process is controlled by several proteins, including CD9 and Izumo
protein. CD9 contributes to the regulation of sperm-ovum membrane fusion. Genetic
modifications of the CD9 gene result in impairment of the sperm-ovum interaction,
potentially causing infertility. Introduction of wild-type CD9 mRNA into ova with CD9
gene deficiency reverses the infertility. Izumo protein is responsible for regulating the
sperm-ovum membrane fusion. When the lzumo gene is deficient in the mouse, sperm
cells, while capable of growing to maturity and going across the zona pellucida, are not
able to fuse into an ovum (Liu, 2007).
Once sperm-ovum union occurs, the ovum becomes resistant to interactions with
other sperm cells. This activity is controlled by short- and long-term mechanisms. The
short-term mechanisms involve cell membrane potentials. A sperm cell can fuse into
an ovum at the normal resting membrane potential. The resting membrane potential
of ova is about -90 m V, a level allowing sperm-ovum interactions and union. Sperm-
ovum membrane fusion triggers rapid ovum cell membrane depolarization, reversing
the membrane potential to about 20 m V by opening the sodium channels and inducing
sodium flux into the ovum. The positive membrane potential prevents other sperm
cells from interaction with the ovum. Depolarization is a short process lasting about
a minute. The long-term preventive process is controlled by sperm-ovum interaction
proteins. The ovum is equipped with proteolytic enzyme-containing granules. Sperm-
ovum fusion causes calcium release and cytosolic calcium elevation, stimulating enzyme
release from the ovum granules into the zona pellucida. The released enzymes cleave
Chapter Two 21
the sperm-ovum interaction proteins, including zona pellucida glycoprotein 3 (ZP3),

thereby preventing other sperm cells from entering the sperm-fused ovum (Liu, 2007).
Sperm-ovum union triggers several processes-DNA synthesis, mitosis, protein
synthesis, and plasma membrane formation. Calcium is an important ion involved in
the regulation of these processes with the activity depending on its cytosolic level. In
WlStimulated cells, the concentration of cytosolic calcium is about 0.0001 mM. Sperm
interaction with an ovum causes rapid elevation in cytosolic calcium, a process regu-
lated by a G protein-coupled receptor signaling system. The presence of sperm cells
activates zona protein 3 (ZP3) in the ovum. ZP3 can bind to cognate G protein-coupled
receptors in the sperm, causing activation of G protein and subsequently phospholi-
pase C. Phospholipase C is an enzyme capable of cleaving phosphatidylinositol biphos-
phate (PIP2) to form inositol triphosphate (IP3 ) and diacylglycerol. IP3 causes calcium
release from the endoplasmic reticulum to the cytosol by opening the calcium ion chan-
nels. Calcium in turn triggers signaling processes leading to mitosis, DNA synthesis,
protein synthesis, and membrane generation. Diacylglycerol is able to activate protein
kinase C, a key signaling molecule participating in the regulation of DNA and protein
syntheses-essential processes for the development of a fertilized ovum. These regu-
latory processes eventually result in the degradation of the sperm mitochondria and
flagellum, migration of the sperm nucleus to the ovum nucleus, and fusion of the sperm
and ovum nuclei (Liu, 2007).
Cleavage
Cleavage is zygote division accomplished by karyokinesis (mitotic nucleus division)
and cytokinesis (cytoplasmic division). Karyokinesis occurs immediately after sperm-
ovum union followed by cytokinesis, generating two nucleated cells defined as blasto-
meres. These blastomeres divide further in a symmetrical manner to form morula-a
solid ball-like structure containing blastomeres. Occasionally, asymmetric cleavage
may occur, but it is not well understood how the cleavage pattern is controlled. Early
embryonic cleavage is regulated by a protein known as mitosis-promoting factor
(MPF), which is activated in response to sperm-ovum union. The level of MPF changes
periodically during embryonic mitosis-increasing during the M phase and decreasing
during the S phase. Blastomere divisions are controlled by cyclic changes in the level of
MPF (Liu, 2007).
Formation of blastocyst
The blastocyst is an early embryonic structure developed from the morula within about
a week following fertilization. This structure consists of the inner cell mass and tro-
phoblast. The inner cell mass is composed of about 30 cells defined as embryonic stem
cells, which give rise to all specified functional cells. The trophoblast is a single layer
of cells that encloses the inner cell mass and develops into the chorion and the pla-
centa that support and protect the embryo. The formation of the blastocyst is consid-
ered a milestone of embryogenesis as the embryonic stem cells of the inner cell mass
are the origin of all cells, tissues, and organs of an individual. During the short life of
the blastocyst, about one week, the embryonic stem cells of the inner cell mass undergo
dynamic asymmetrical differentiation, generating specified stem cells for the formation
of distinct organ systems (Liu, 2007). It is interesting to note that the inner cell mass
22 Part One
embryonic stem cells all appear identical in morphology during the blastocyst stage
and are capable of differentiating to structurally and functionally distinct cells within
several days. It remains poorly understood how such a process occurs and what signal-
ing mechanisms are involved.
Gastrulatlon
Gastrulation is a process by which the inner cell mass of the blastocyst grows into three
distinct layers-the ectoderm, mesoderm, and endoderm within about two weeks
from fertilization (Fig. 2.2). These layers eventually give rise to specified organ sys-
tems. Several intermediate structures develop during gastrulation. The inner cell mass
first gives rise to epiblast and hypoblast. The former develops into the embryonic epi-
blast and amniotic ectoderm, and the latter develops into extraembryonic endoderm.
The embryonic epiblast is the primitive form of the three germ layers. It gives rise to
the embryonic ectoderm and primitive streak, a short-lived structure that is rapidly
transformed into embryonic endoderm and mesoderm. The amniotic ectoderm from
the epiblast forms the amnion, a membrane enclosing the embryo. The extraembryonic
endoderm from the hypoblast develops into the yolk sac, which contains nutrients for
embryo growth. The trophoblast is the origin of the extraembryonic chorion and pla-
centa that are located outside the amnion (Liu, 2007).
The epiblast-derived ectoderm, mesoderm, and endoderm give rise to specified
tissues and organs during the remaining embryonic period. The ectoderm develops
into an intermediate structure consisting of the surface ectoderm, neural crest, and
neural tube. The surface ectoderm is the origin of the epidermis, nails, hair, sebaceous
glands, mucous membrane of the mouth and anus, tooth enamel, lens and cornea,
and anterior pituitary. The neural crest develops into the peripheral ganglia, Schwann
cells, and sympathetic and parasympathetic nerves, adrenal medulla, melanocytes,
and tooth dentine. The neural tube gives rise to the brain, spinal cord, retina, and inner
ear (Liu, 2007).
The mesoderm is the origin of the heart, blood vessels, blood cells, skeletal muscle,
bone, cartilage, connective tissue, lymphatic system, kidney, and gonads. From the
beginning of gastrulation, the mesoderm develops into a structure with four distinct
regions--the notochord, paraxial mesoderm, intermediate mesoderm, and lateral
plate mesoderm. The notochord is a transient structure mediating the formation of the
neural tube, determining the anterior-posterior axis of the embryo, and contributing
A B Mesoderm
Trophoblast Ectoderm Endoderm
F111uRE 2.2 Embryonic blastocyst {A) and germ layers--ectoderm, mesodenm, and endoderm (B).
Chapter Two 23
to the formation of the endodermal primitive gut. The paraxial mesoderm is orga-
nized into two parallel columns along the lateral sides of the neural tube and is the
origin of the somites (segmented blocks). These somites give rise to dermis, skeletal
muscle, ribs, and vertebrae. The intermediate mesoderm participates in the forma-
tion of the kidney, ureter, bladder, urethra, and reproductive system. The lateral plate
mesoderm consists of the somatic mesoderm and splanchnic mesoderm. The somatic
mesoderm is adjacent to the ectoderm and the splanchnic mesoderm is next to the
endoderm. These mesodermal structures develop into the heart, blood vessels, and
blood cells. There is a gap between the somatic and splanchnic mesoderm layers,
which is defined as the coelom-the origin of the pleural, pericardia!, and peritoneal
cavities (Liu, 2007).
The endoderm is the layer that gives rise to the epithelial cell-based structures of
the lung, airways, gastrointestinal tract, liver, and pancreas. The respiratory, digestive,
and hepatic systems develop from an early endodermal structure known as primitive
gut. In the human, the primitive gut forms at about 16 days following the concep-
tion and is composed of three parts during the early stage: the foregut, midgut, and
hindgut. At about 22 days, the liver bud forms from the foregut and is the presump-
tive structure for the formation of the liver. At about 28 days, the anterior end of the
foregut forms the oral opening, which is the presumptive structure of the mouth. The
foregut also gives rise to the pharynx, esophagus, thyroid bud, lung bud, and stomach
at about the same time. The midgut and hindgut are the presumptive structures for
the formation of the small and large intestines. The endodermal cells also regulate the
formation of mesoderm-derived tissues and organs by secreting soluble mediating
factors (Liu, 2007).
The liver develops from the liver bud that sprouts from the foregut of the endoder-
mal primitive gut. The liver bud grows into the surrounding mesodermal tissue, which
produces and releases regulatory factors to stimulate liver bud cell differentiation into
hepatocytes and ductular epithelial cells. Mesoderm-derived vascular endothelial cells
proliferate and migrate into the primitive liver, forming the hepatic vascular system,
an essential process for liver development. The removal of vascular endothelial cells
results in the failure of liver formation. Gallbladder, an affiliated structure of the liver,
develops from the hepatic drainage duct (Liu, 2007).
The pulmonary system develops from the lung rudiment sprouted from the fore-
gut. The lung rudiment first grows into the trachea, which bifurcates into the left and
right bronchi, subsequently establishing the left and right lungs. During the lung
development, endodenn-derived epithelial cells work together with mesodermal cells
to form an integrated respiratory and circulatory system, establishing the structural
basis for gas exchange. It is interesting to note that, when embryonic tracheal epithe-
lial cells are cultured in the absence of mesodermal cells, the epithelial cells will not
develop into airway structures. In contrast, airway-like structures develop when lung
epithelial cells are cultured in the presence of mesodermal cells. Thus, mesodennal
cells play a role in regulating the differentiation of endoderm-derived pulmonary
epithelial cells. Regional differences in the structure and function of the mesodermal
cells may determine the specification of pulmonary cells and control lung formation.
During the embryonic stage, although the pulmonary system is established, it is not
functional for gas exchange. The embryo and fetus obtain oxygen and remove carbon
dioxide via the placenta. The lung initiates the gas exchange function immediately after
birth (Liu, 2007).
24 Part One
Development of the Heart

Origin and fate of canliogenic cells
The heart is the first organ to develop following gastrulation because of the necessity of
blood circulation for the growing embryo (Liu, 2007). Cardiac development undergoes
four major stages-creation of the cardiac crescent at about two weeks, formation of the
heart tube at about three weeks, heart looping at about four weeks, and establishment
of the four cardiac chambers at about eight weeks (Fig. 2.3). The heart is composed of
various cell types, including cardiomyocytes, endocardial cells, epicardial cells, fibro-
blasts, valvular cells, vascular endothelial cells, and smooth muscle cells. These cardiac
cells originate from a set of embryonic progenitor cells known as cardiogenic cells or
presumptive cardiac cells in the mesoderm. There are two types of cardiogenic cells
defined on the basis of their origins and lineage specifications: primary and secondary
heart field cardiogenic cells (Buckingham et al., 2005; Chien et al., 2008). The primary
heart field cardiogenic cells arise from the primitive streak and migrate to the anterior
lateral mesoderm to form two cardiogenic mesodermal clusters symmetrically with ref-
erence to the primitive streak. The two cardiogenic cell clusters move toward each other
and form two endocardial primordia, the initial form of the heart. Cells from the endo-
cardial primordia extend across the midline of the embryo and form a crescent-shaped
structure, known as the cardiac crescent, at about embryonic day 14. The primary heart
field cells in the cardiac crescent give rise to cardiac cell lineages that form the left and
right ventricles, left and right atria, as well as the atrioventricular canals. The second-
ary heart field cardiogenic cells arise from the pharyngeal and splanchnic mesoderm,
migrate and merge into the primary heart field structures, and contribute to the forma-
tion of the inflow region (veins), outflow tract (arteries), as well as all other cardiac
structures except for the left ventricle (Buckingham et al., 2005; Laugwitz et al., 2005;
Martin-Puig et al., 2008). Overall, the left and right atria, right ventricle, aortic root, and
pulmonary trunk develop from both the primary and secondary heart fields, whereas
the left ventricle arises from the primary heart field.
IV
Cardiac crescent Cardiac tube Cardiac loop Cardiac chambers
2 weeks 3weeks 4 weeks Sweeks
F1auRE 2.3 The four stages of heart development. AS: Aortic sac; RA: Right atrium; LA: Left
atrium; RV: Right ventricle; LV: Left ventricle; SV: Superior vena cava; IV: Inferior vena cava;
AO: Aorta; PA: Pulmonary artery.
Chapter Two 25
Regulatlon of heart development

The development of the cardiac cell lineages is regulated by signaling molecules
expressed in a time- and location-dependent manner. The early cardiogenic cells
express several transcription factors, including mesoderm posterior protein 1 (MESPl)
and mesoderm posterior protein 2 (MESP2) (Kitajima et al., 2003). Both MESPl and
MESP2 have been shown to regulate the specification of early cardiogenic cells. MESPl
is a class C basic helix-loop-helix protein (268 amino acids, -29 kDa) and can induce
expression of a secretary protein known as dickkopf-related protein-1 (Dkk-1, 266
amino acids, -29 kDa). Dkk-1 inhibits the activity of the Wnt (wingless-type M:MTV
integration site family member) signaling pathway, which negatively regulates car-
diogenesis. Thus, MESPl stimulates cardiogenic cell specification by suppressing the
activity of the Wnt inhibitory signaling pathway (David et al., 2008). MESP2 is also a
class C basic helix-loop-helix protein (397 amino acids, -42 kDa). This molecule works
in coordination with MESPl in the regulation of cardiogenesis (Kitajima et al., 2003).
The determination of the early cardiogenic cell lineages is regulated by paracrine
factors that change in the level of expression temporarily and spatially. While a com-
plete list of signaling factors is not available, several extracellular soluble protein
ligands have been implicated in regulating the fate of cardiogenic cells. Major soluble
protein ligands include bone morphogenetic proteins (BMPs), fibroblast growth factors
(FGFs), and Wnt proteins (Mummery et al., 2012). BMPs and FGFs serve as cues for the
specification of the primary heart field cardiogenic cells and induce activation of the
transcription factor Nkx-2.5 (NK2 transcription factor- related, 324 amino acids, -35
kDa) (Brand, 2003; Buckingham et al., 2005). Nkx-2.5 controls the formation of the car-
diac crescent from the primary heart field cardiogenic cells. Nkx-2.5 mutations induce
early impairment of cardiogenesis (Lyons et al., 1995, Tanaka et al., 1999), resulting
in congenital heart abnormalities, such as atrial septal defects (Reamon-Buettner and
Barlak, 2004; Hirayama-Yamada et al., 2005), ventricular septal defects (Benson et al.,
1999; Zhu et al., 2000), atrioventricular conduction abnormalities (Schott et al., 1998),
and tetralogy of Fallot (I'OF) (Benson et al., 1999; Goldmuntz et al., 2001), a disorder
characterized by right ventricular hypertrophy, ventricular septal defect, dextroposi-
tion of the aorta, and pulmonary stenosis. In contrast to the BMP and FGF signaling
pathways, the Wnt signaling pathway exerts an inhibitory effect on the activity of Nkx-
2.5 (Brand, 2003; Buckingham et al., 2005). Coordinated interaction of the BMP- and
FGF-dependent stimulatory pathways with the Wnt-mediated inhibitory pathway pos-
sibly determines the morphogenesis of the cardiac crescent. The signaling pathways
involving BMPs, FGFs, Nkx-2.5, and Wnt are also responsible for the regulation of the
morphogenic activities of the secondary heart field cells (Kelly et al., 2001; Cai, 2003).
Another important factor that regulates the specification of cardiogenic cells is
GATA4 (GATA-binding protein 4, 442 amino acids, -45 kDa), a member of the GATA
family of zinc-finger transcription factors (White et al., 1995). GATA4 recognizes and
binds to the sequence 5'-AGATAG-3' present in the promoter region of target genes.
This molecule is expressed in the pre-cardiogenic cells in the splanchnic mesoderm and
has been known to regulate the differentiation of cardiogenic cells to various cardiac
cell lineages in coordination with Nkx-2.5 (Molkentin et al., 1997). The secreted proteins
BMPs and FGFs regulate the activity of GATA4 (Buckingham et al., 2005). A missense
mutation of GATA4, a type of point mutation with replacement of a single nucleotide,
resulting in a change in a single amino acid (G296S, or glycine-to-serine substitution
26 Part One
at site 296 due to G-to-A transition on nucleotide 886), causes impairment of GATA4
interaction with T-box protein-5 (Tbx5, 518 amino acids, -58 kDa), a transcription factor
involved in the regulation of cardiac development (Garg et al., 2003). Such impairment
negatively influences GATA4 binding to target genes responsible for cardiac develop-
ment. These GATA4 mutation-induced changes often result in cardiac septal defects
(Garg et al., 2003). Another type of GATA4 gene mutation, E359del or glutamic acid
deletion at site 359, results in the loss of GATA4 transcription function, causing cardiac
septal defects (Garg et al., 2003).
While the primary heart field cardiogenic cells are known to generate functional
cells in most cardiac compartments, these cardiogenic cells have been poorly character-
ized and their downstream cell lineages have not been clearly identified. In contrast,
there is considerable information about the developmental lineages of the secondary
heart field, containing multipotent cardiogenic cells characterized by the expression
of the LIM-homeodomain transcription factor Isletl (Isll), an insulin gene enhancing
protein (Cai, 2003; Laugwitz et al., 2005). These cardiogenic cells can develop into vari-
ous cell lineages, including Isll +/TNT+ (troponin T), Isll +/ smMHC+ (smooth muscle
myosin heavy chain), and Isll + /HCN4+ (hyperpolarization activated cyclic nucleotide-
gated eation channel 4) progenitor cells. The Isll +/TNT+ progenitor cells can give rise
to cardiomyocytes, the Isll+I smMHC+ cells develop into smooth muscle cells, whereas
the Isll+/HCN4+ progenitor cells form conduction system cells (Cai, 2003; Laugwitz
et al., 2005). The expression of the muscular marker TNT is indicative of the specifica-
tion of cardiogenic cells to cardiomyocyte progenitors. Similarly, the expression of the
smooth muscle marker smMHC and the conduction cell marker HCN4 indicates the
differentiation of cardiogenic cells to smooth muscle and conductive cell progenitors,
respectively.
Formation of the heart tube

Proce55es of heart tube formation
Following the formation of the cardiac crescent from the primary heart field, cells from
the cardiac crescent are specified to form a linear tube structure known as the heart tube
through crescent fusion at about embryonic day 21 (Fig. 2.3) (Srivastava and Olson,
2000). The heart tube consists of an inner endothelial cell layer and an outer myocardial
layer with extracellular matrix between the two layers (Baldwin, 1996; Brand, 2003).
These layers are derived from cardiac crescent progenitor cells. A subset of cardiogenic
cells differentiates to endothelial cells, whereas others give rise to cardiomyocytes. The
endothelial cells further develop into the endocardium, as well as several other struc-
tures, including the endocardial cushions (giving rise to the cardiac valves) and the
membrane portions of the atrial and ventricular septum (Abu-Issa and Kirby et al., 2007).
The myocardial layer of the heart tube gives rise to the ventricular and atrial walls. The
endocardial cells play an important role in regulating the formation of the trabecular
myocardium (Wagner and Siddiqui, 2007; Stankunas et al., 2008) and differentiation
of cardiomyocytes to Purkinje fiber cells (Srivastava and Olson, 2000). At about three
weeks, the cardiac tube displays peristaltic contraction activities in the human embryo.
Regulation of heart tube formation

The formation of the heart tube is controlled by complicated molecular signaling pro-
cesses. Although it remains incompletely understood how heart tube development is
Chapter Two 27
regulated, the transcription factor GATA4-based signaling pathways play a critical role.
GATA4 is known to regulate the migration and morphogenesis of the mesodermal pre-
cardiogenic cells, processes critical to the formation of the heart tube. In homozygous
GATA4 null mice, the primitive myocardial tube can no longer be established during
embryogenesis (Molkentin et al., 1997). When the GATA4 gene is knocked out (GATA4-1-)
in mice, the embryo dies from 8.5 to 10.5 days post coitum (Kuo et al., 1997). GATA4-
deficient embryos exhibit a lack of the linear myocardial tube and pericardia! cavity. In
these embryos, although cardiogenic cells are able to form cardiomyocytes expressing
contractile proteins, cardiomyocytes are not able to form a heart tube (Kuo et al., 1997).
These observations suggest that GATA4 is a critical transcription factor for regulating
the morphogenesis of the heart tube.
An important process for cardiac development is heart looping, by which the lin-
ear heart tube undergoes rightward bending and twisting, forming a C-shaped cardiac
loop at about four weeks (Manner 2000). This process results in a change in the left-right
symmetrical heart tube into a left-right asymmetrical structure suitable for establishing
the four cardiac chambers (Fig. 2.3). Prior to heart looping, the primitive cardiac tube is
positioned in the anterior-posterior direction with the outflow tract/ventricular region
at the anterior pole and the inflow tract/ atrial region at the posterior pole. During heart
looping, the posterior atrial region bends rightward and gradually moves to the top of
the ventricular region. Following heart looping, the heart tube develops into a structure
with several distinct regions, including the primitive atrium, left ventricle, and right
ventricle. The primitive atrium is connected at the top to the inflow region (sinus veno-
sus), which eventually gives rise to the vena cava and pulmonary veins. The primitive
right ventricle is connected to the outflow tract (aortic sac), which develops eventually
to the aortic root and pulmonary trunk. Between these structures, there are four rings,
including the sinoatrial ring, the atrioventricular ring or canal, the primary ring or fold,
and ventriculoarterial ring.
Heart looping is regulated by complex signaling pathways. Whereas the exact sig-
naling and biomechanical mechanisms for heart looping remain to be investigated, it
has been hypothesized that location-dependent differential cell proliferation, migration,
and death, along with non-uniformly developed biomechanical factors, such as intersti-
tial pressure and myocardial tension, may contribute to the asymmetrical morphogenic
process of heart looping (Taber et al., 1995; Manner 2000). Asymmetrical expression
and activities of signaling molecules may contribute to the regulation of heart loop-
ing. As demonstrated in investigations by using the chick model system, the signaling
molecules activin-(3B, activin receptor, and bone morphogenetic protein (BMP) 4 are
asymmetrically expressed in the early embryonic structures, Hensen's node, and peri-
nodal area, thus playing a role in regulating asymmetrical heart looping (Levin et al.,
1995). Activin-[3B and activin receptor are predominantly expressed in the right side of
the Hensen's node. Activin-f3B (15.2 kDa), a TGFf3 protein superfamily member, forms
a homodimer (activin BB) with another activin-(3B or a heterodimer (activin AB) with
activin-f3A by a single covalent disulfide bond, and acts on its receptors to regulate car-
diac development (Schmelzer et al., 1990). Activated activin-[38 inhibits the expression
of sonic hedgehog (462 amino acids, -50 kDa), a morphogen expressed symmetrically
around the Hensen's node. This action restrains sonic hedgehog expression to the left
side of the Hensen's node (Hoyle et al., 1992; Levin et al., 1995). Sonic hedgehog partici-
pates in the regulation of cell activities during heart looping, inducing left-side expres-
sion of the Nodal gene in the lateral plate mesoderm, from which the heart develops.
Another random document with
no related content on Scribd:
hänen aseenkantajiansa vastaan, mutta hän teki kiertoliikkeitä ja sai
enemmistön kannatuksen.
Samalla kuulin, että talo vihdoinkin oli asuttavassa kunnossa.

Lähdettiin katsomaan uutta kotia. Kaikki oli vielä mullin mallin ja
keskeneräistä. Vaikea oli uskoa taloa siksi, joka meille oli esiintynyt
niin ruusuisessa valossa. Luvattuja mukavuuksia ei näkynyt: turhaan
haki hissiä ja kylpyhuonetta. Katri huokasi raskaasti ja sanoi, että
kylpyhuone olisi ollut välttämätön. Kun katsoin häntä tarkemmin,
ymmärsin liiankin hyvin, mitä hän tarkoitti…
Vaikka pettymyksemme olikin suuri, ei meillä ollut aikaa sitä

vaikeroida. Olihan se sittenkin kauan kaivattu oma koti, jonka
luomiseen olimme hikemme ja väkemme uhranneet! Jahka kaikki
saataisiin järjestykseen, niin tulisi kyllä mukavaa ja hauskaa. Sirkan
huone sisustettiin hänen oman makunsa mukaan. Hän otti osaa
keväällä pidettäviin ylioppilaskirjoituksiin, ja minä olin iloinen
kyetessäni nyt valvomaan, etteivät kaikenlaiset herrankekkaleet
saaneet viekoitella tyttöä kahvilaan ja automobiiliretkille.
Uudessa kodissa saatoin taas paremmin antautua

laulunopetukseen, koska Sirkan soittokone oli käytettävissäni. Se oli
tärkeänä eränä tuloarviossani. Niin paljon kun olinkin ahertanut kynä
kädessä, oli siitä kuitenkin hyvin vähän kertynyt kukkaroon.
Hääpäiväämme lukuunottamatta oli elämämme hauskin hetki se,

jolloin muutimme uuteen kotiin. Sirkka auttoi muuttopuuhissa.
Madonnankuvan nähdessään hän alkoi uteliaasti tarkastaa sitä,
katsoi Katria ja sanoi:
"Ei, mutta Katri! Kuva on sinun näköisesi."

Minä sanoin tehneeni saman huomion, mutta se oli varmaan
paljasta kuvittelua.
"Jos istuisit tuossa asennossa lapsi sylissä, olisit ihan ilmetty

madonna", väitti Sirkka uudelleen.
Katri punehtui ja sanoi:
"Minulla ei ole lasta… Enkä minä ole mikään madonna…
"Annappa Sirkan lukea se kaunis laulusi", pyysin minä.
"Onko Katri kirjoittanut laulun?" ihastui Sirkka ja alkoi heti vaatia

sitä lukeakseen. Eikä hän hellittänyt ennen kuin voitti. Luettuaan hän
sanoi:
"Voi, jos osaisin säveltää, kirjoittaisin lauluun musiikin. Siitä tulisi

erinomainen. Kuka olisi uskonut, että sinä osaat runoilla. Mutta
ihmekös se, kun on runoilijan kanssa naimisissa! Jospa minäkin
saisin runoilijan! Ei sentään, he ovat niin juroja ja kömpelöitä eivätkä
välitä vähääkään ulkonaisesta esiintymisestään."
"Mikä mies sinun sulhasesi on?" kysyi Katri.
Sirkka punastui ja alkoi katsella madonnankuvaa.
"Enon pitää sepittää sävellys tähän lauluun! Enohan on opiskellut

musiikin teoriaa", sanoi tyttö.
"Voisihan sitä koettaa, kun pääsisi muuttopuuhista", lupasin

saadakseni hänet kimpustani.
Kun madonna sitte vietiin muun romun mukana ullakolle, unohtui

koko asia.
Jos talo oli kehno, olivat vuokrat sitä komeammat. Emme olleet
uskoa silmiämme! Keskikaupungilla olisi helpommalla asunut. Mitä
jäisi meille enää ruokaan ja vaatteisiin! Katri laski kumminkin, että
liika huone tuottaisi 40—50 markkaa, mikä vähentäisi vuokraa
tuntuvasti. Sirkka puolestaan lupasi ottaa asuintoverin, jos saisi
siistin naisen, joka olisi päivät poissa. Se ei häiritsisi hänen
opintojansa, ja se voisi tuottaa 15—20 markkaa kuussa.
Aloimme ahkerasti ilmoittaa lehdissä, mutta pitkiin aikoihin ei

kukaan ottanut sitä huomioonsa. Siihen oli syynä matkan pituus ja
talon kehnous. Ilmeisesti oli myöskin huoneita enemmän kuin
kysyjiä.
Eräänä aamuna tuli vihdoin nuori, hienosti puettu neiti, kädessään

sanomalehti, toisessa hatturasia. Hän hyväksyi huoneen ja lupasi
muuttaa heti. Uusi asukas oli hyvin puhelias, kertoi omistavansa
suuren muotiliikkeen. Tavarat olivat tulipalossa joutuneet hukkaan,
mutta hän oli saanut korvauksen yhtiöltä. Tulipa hän siveellisellä
kuohumuksella maininneeksi siitäkin, että kaupungilla oli iltasin
vaarallinen liikkua hävyttömien herrojen tähden, jotka eivät antaneet
naisten kulkea rauhassa.
Olimme iloisia, kun saimme Sirkalle vakavahenkisen

huonekumppanin, ja kun nainen lisäksi vaikutti sivistyneeltä, ei meillä
ollut mitään häntä vastaan. Vuokran hän lupasi suorittaa
kuukausittain tai viikottainkin, miten vain halusimme.
Käydessäni ensi kertaa vuokraa maksamassa huomautin

tirehtöörille, ettei talo ollut lupausten arvoinen ja että kauhea vuokra
saattaisi varattoman osakkaan perikatoon. Hän nauroi: talo oli joka
suhteessa uudenaikainen, mutta jos tahdoin nähdä huonon talon, piti
minun mennä katsomaan sille ja sille kadulle sitä ja sitä taloa. Hissi
kyllä puuttui, mutta minä olin nuori kiipeämään. Mitä
kylpyhuoneeseen tuli, niin oli Helsingissä riittävästi saunoja, eikä siis
likaisena tarvinnut olla. Huoneiden kylmyyttä oli kovasti moitittu,
mutta se tuli siitä, että keskuslämmitys alussa toimi
epäsäännöllisesti; se vika kyllä korjaantuisi. Vuokrat eivät
isännöitsijän mielestä olleet korkeat, ja ne vielä alenisivatkin pian.
Lopputuloksena oli siis, että talossa asui kuin ruhtinas palatsissaan.
Ei muuta kuin maksaa vuokransa täsmällisesti, silloin kaikki menee
kuin rasvattu.
Samassa tilaisuudessa jouduin todistajaksi välikohtaukseen, joka

herätti minussa pahoja aavistuksia. Olin aikeissa lähteä, kun sisään
tuli mies, jonka kiihtyneestä puheesta eroitin sanoja sellaisia kuin
"keinottelu", "huijaus", "petkutus". Samassa hän veti tukun papereita
taskustaan ja heitti ne tirehtöörille vasten naamaa huutaen: "Tuossa
ovat roskapaperinne!" Tirehtööri ei ollut toipunut hämmästyksestään,
kun mies jo huusi ovelta: "Kaikkien roistojen kanssa pitää joutua
tekemisiin!"
"Tämä juttu ratkaistaan raastuvanoikeudessa!" uhkasi tirehtööri.
Mutta mies oli jo hävinnyt. Katselin hänen hylkäämiänsä papereita

ja huomasin ne kauhukseni kaivosyhtiön osakkeiksi. En malttanut
olla kysymättä, olivatko kaivososakkeet arvottomia, kun mies oli ne
pois heittänyt. Hän vastasi nauraen, että räyhääjä oli mielipuoli.
Kysyin osinkoa; tirehtööri selitti, ettei ollut vielä päätetty,
maksettaisiinko kymmenen vai viisitoista prosenttia. Hän oli
ehdottanut kahtakymmentä.
Sirkan asuintoveri oli ollut meillä pari viikkoa, ja yhä

salaperäisemmältä hän alkoi tuntua. Hän oli iltasin myöhään ulkona,
toisinaan koko yön. Hän pyysi anteeksi, liikkeessä tehtiin ylityötä.
Eräänä päivänä hänen hattukotelonsa äkkiä katosi. Aloimme pelätä
pahaa, ja kun ei häntä toisenakaan päivänä kuulunut, soitin
liikkeeseen, jossa hänen piti työskennellä. Sain vastaukseksi, ettei
siellä ollut mitään tietoa sennimisestä henkilöstä.
Pian selvisi, mikä otus vuokralaisemme oli. Sirkka kertoi, että

nainen eräänä yönä oli aikonut tulla kotiin humalaisen herrasmiehen
seurassa, mutta kääntynyt takaisin huomatessaan hänen olevan
hereillä. Kuinka me kauhistuimmekaan saadessamme tietää, miten
läheisessä kosketuksessa Sirkka oli ollut katunaisen kanssa!
Vähemmän merkitsi se, että hän hyväsydämisyydessään oli
lainannut mokomalle neljäkymmentä markkaa muka aivan
tilapäiseen tarpeeseen.
"Kylläpä olemme tulleet nenästä vedetyiksi! Mutta kuka siitä

naisesta olisi uskonut sellaista!" päivitteli Katri.
"Siitä näet, että ulkonäkö pettää. Olkoon tämä opiksi! Paras on

vaatia asukkailtamme vuokra etukäteen, niinkuin itsekin maksamme
yhtiölle."
Vielä ikävämpää oli, että minä en saanut oppilaita, niinkuin olin

toivonut. Matka oli liian pitkä.
Siunatuksi lopuksi ilmoitti Katri salaisuuden: saisin valmistautua

vastaanottamaan iloista tapausta.
Syystä kyllä kaipasi Katri kylpyhuonetta!

KOLMASTOISTA LUKU.
Kurjuus astuu kynnyksen yli.
Herra tirehtöörillä oli omissa nimissään suuri, komea huoneusto

talossa, ja uusia hienoja huonekaluja tuotiin monta kuormallista.
Niin pian kuin isännöitsijä muutti taloon, jouduimme me muut

kovan komennon alaisiksi. Tirehtöörin vanha vältti oli: "Tämä juttu
jatkuu raastuvanoikeudessa". Etenkin hän valvoi ankarasti, ettei
talossa saanut asua huonomaineisia, epäsiveellisyyttä harjoittavia
henkilöitä — itse hän tietysti oli sen lain yläpuolella.
Ei kuitenkaan hänenkään olonsa Onnelassa ruusuilla tanssimista

ollut. Mustasukkainen rakastajatar pani toimeen kohtauksia, ja
naapurien yörauha tuli usein mitä ikävimmin häirityksi.
Me emme hakeneet Sirkalle uutta toveria, mutta toisen huoneen

vuokrasimme eräälle työläisperheelle. Tällä kertaa menettelimme
varovammin: vaadimme vuokran etukäteen. Pian kuitenkin mies
joutui työttömäksi lakon takia. Emme julenneet heitä häätää, etenkin
kun tiesimme, että työläiset yleensä rehellisesti maksavat parempien
aikojen tultua.
Jokainen päivä lisäsi meille vaikeuksia. Sirkka alkoi sairastella. Se
johtui vilustumisesta. Huoneemme olivat kosteat ja kylmät kuin
kellari.
Keväällä piti Sirkan saada kauan uneksimansa lyyry.
Katri oli käynyt ostamassa kimpun vereksiä kukkia, ja kun ensi

parvi "vastaleivottuja" riemuhuudoin ja valkolakkiansa heilutellen kiiti
alas yliopiston korkeita rappusia, lähdimme etsimään häntä. Kesti
kauan ennenkuin löysimme hänet, sillä senaatintori oli kuin kuohuva,
valkea meri. Sitte tulivat toverit ja ihailijat, ja pian oli tyttö kukissa
kiireestä kantapäähän. Katrin kukat aivan hukkuivat noihin loistaviin
ruusu- ja orvokkikimppuihin, mutta Sirkka sanoi, että ne olivat
kaikista rakkaimmat.
Koska tyttö oli rasittunut ja levon tarpeessa, aloimme hommata

häntä maalle.
Kesänviettomme oli kuitenkin vaikeasti järjestettävissä.

Huoneustostamme oli vuokra maksettava, asuimmepa maalla tai
kaupungissa. Olimme pitkin talvea ilmoittaneet, mutta emme
onnistuneet saamaan sopivaa kesäasukasta.
Paljon kiusaa ja tappiota koitui meille asukkaistamme. Vaimo

sairasteli, mies oli yhä työtönnä — ja monen kuukauden vuokra
maksamatta. Heidät oli sanottava irti, mutta en tiedä, miksi se tuntui
niin vaikealta.
Kun ei minulla ollut luontoa tehdä sitä muutoin, turvauduin

hätävalheeseen. Sanoin, että olimme vuokranneet huoneuston
kokonaisuudessaan. Meillä olisi ollut oikeus pidättää huonekalut
vuokrasta, mutta pidimme mieluummin vahingon hyvänämme. Katri
sanoi katkerasti naurahtaen:
"Tällainen vuokralaisten pitäminen vie meidät vararikkoon."
"Sitä minäkin pelkään. Ei saisi olla sydäntä — ainoastaan kylmä,

omaa etuansa laskeva järki."
Hädin saimme kokoon sen verran, että saatoimme maksaa oman

vuokramme yhtiölle, sillä siltä ei ollut armoa odotettavissa.
Kesän viettoa painostivat raskaat huolet ja synkät aavistukset

tulevaisuuden suhteen. Ennen muuta tuotti Sirkan asia vaikeuksia.
Hänen oli määrä syksyllä lähteä ulkomaille. Mutta hänpä sanoikin
jättävänsä soitto-opinnot ja ryhtyvänsä laulua harjoittamaan. Tiesin
hänellä olevan hyvän lauluäänen, mutta asetuin kuitenkin
vastustavalle kannalle, koska hän jo oli peräti pitkällä
piaanonsoitossa. Mutta naisen itsepäisyyttä vastaan on hyödytön
taistella — ja lopuksi täytyi minun taipua. Nyt kuitenkin puuttui
kaikkein välttämättömin — raha. Perintö oli sijoitettu osakkeihin.
Kuka muuttaisi ne takaisin rahaksi? Yritin ottaa osakkeita vastaan
lainan, mutta rahamiehet eivät huolineet niitä vakuudeksi. Eikä
niiden myymistä kannattanut ottaa puheeksikaan.
Kiusaannuksissani menin tirehtöörin luo ja kerroin, mitä muut

ajattelivat hänen suurta voittoa tuottavista arvopapereistaan. Hän
antoi lyhyitä, kiertäviä vastauksia ja päästäkseen eroon minusta
asettui itse hyökkäävälle kannalle.
"Teillä on monen kuukauden vuokra suorittamatta. Maksakaa se

ensi tilassa, muuten…"
Hän ei sanonut loppuun, vaan jätti minulle täydentämisen
tilaisuuden.
Parin päivän perästä ilmoitti isännöitsijä, että koska minä en ollut

maksanut vuokraani, oli yhtiö päättänyt periä sen laillista tietä. Tämä
uhkaus sai minut suunniltani. Katrin tila oli nyt sellainen, että hänen
oli pitänyt jättää toimensa. Minun täytyi jälleen vedota setäni
avuliaisuuteen, mutta hän sanoi jo kylliksi uhranneensa minun
tähteni —, jota en parhaalla tahdollanikaan voinut kieltää.
"Enkö minä pahaa pelännyt! Sinun on heti myytävä osakkeet, jos

se vielä on mahdollista."
Raskain mielin lähdin kotiin. Katri ei tahtonut kuulla puhettakaan

osakkeiden myynnistä. Hetikö taas pitäisi lähteä omasta kodista
toisten nurkissa elää kituuttamaan? Ei! Niin pian kuin hän tulee
entiselleen, tekee hän työtä yöt päivät, jotta saataisiin asua omassa
kodissa.
Olin pyytänyt yhtiötä ottamaan huomioon vaikean tilani ja

odottamaan. Mutta eräänä aamuna tuli haastemies. Minä seisoin
kuin puulla päähän lyötynä. Koetin salata koko asiaa Katrilta, mutta
hän loukkaantui ja kysyi, miksi minä en luottanut häneen.
Menin vielä kerran isännöitsijän luo ja pyysin järjestää asian, mutta

hän sanoi sen jo menevän laillista latuansa. Minä sain syyttää
itseäni; miksen maksanut ajoissa?
Kun minulla ei ollut varoja asianajajan palkkaamiseen, oli minun

itse lähdettävä vastaamaan asiastani. Katrille en ilmoittanut mitään,
sillä olin varma, että hän siinä tapauksessa tulisi oikeuteen minua
rohkaisemaan.
Eräänä aamuna otti korkea oikeus jutun käsitelläkseen. Tirehtööri
oli itse vetäytynyt kulissien taakse ja antanut jutun Jutkun ja Metkun
asianajotoimiston huostaan.
Raastuvanoikeuden puheenjohtaja, pieni, kuivettunut, kärtyisen

näköinen herra, käännähti tuolillaan, jotta se narahti pahaenteisesti.
Hän rykäisi virallisen kuivasti, sijoitti lasit nokalleen, jonka väri oli
sinipunainen, ja alkoi selailla pöydällä olevia papereita. Lopuksi hän
aivasti ja niisti nenänsä peloittavalla ankaruudella. Minä luin
kaikessa tuossa varoituksen: "arvonantoa, herraseni, te, joka olette
hävyttömästi jättänyt vuokranne maksamatta".
Pöydän kummallakin sivulla istuivat neuvosherrat ikävystyneinä ja

haukottelivat. Tuntui siltä kuin olisi heidät siirretty pikkutunneilta
suoraan oikeuden istuntoon. Heidän elottomilla kasvoillaan saattoi
lukea minulle osoitetun paheksumislausunnon: "miksette hyvällä
maksanut vuokraanne, ettei meidän olisi joutavan jutun takia
tarvinnut hauskasta seurasta lähteä?"
Puheenjohtaja suvaitsi kääntyä minun vaivaisen syntisen puoleeni

ja kysyä, olinko haastekirjassa mainittu henkilö. Vastasin, että
minulla oli kunnia olla se mies. Mutta selvästi näki, ettei sitä minään
kunniana pidetty. Ja totta puhuen hävetti itseänikin olla omissa
housuissani. Sata kertaa mieluummin olisin ollut joku muu henkilö —
yksi noista, jotka tähän aikaan luovivat jotakin ravintolaa kohti
tilatakseen maukkaan aamiaisen.
Herra puheenjohtaja alkoi ruotsiksi murtaen lukea haastekirjaa —

nähtävästi minun laskuuni, vaikka minä osasin koko sepitelmän
ulkoa sekä etu- että takaperin. Musertavan taidepaussin jälkeen hän
kysyi, oliko minulla mitään sen johdosta sanottavaa.
Minä rykäisin — minäkin vuorostani. Mutta se ei tehnyt toivottua
vaikutusta. Siltä puuttui virkamahtia. Sitte minä sanoin, että minulla
oli asiakirjan johdosta yhtä ja toista sydämelläni.
Korkea oikeus osoitti hiukan vilkkautta ja asettui odottavalle

kannalle. Mutta tuskin olin päässyt alkuun yhtiön perättömistä
lupauksista, kun puheenjohtaja kysyi kärsimättömästi, mitä se asia
tähän kuului. Vastasin, että se hipaisi jokseenkin läheltä, ja jatkoin
esitystäni.
Puheenjohtaja kysyi sitte kantajalta, mitä hän arveli minun

puolustuspuheestani. Siihen sanoi Jutkun ja Metkun mies julkeasti,
että heidän nähdäkseen se ei vaikuttanut mitään itse asiaan. Hän
vaati juttua heti päätettäväksi.
Lyhyen neuvottelun jälkeen julisti korkea oikeus päätöksen, joka

meni siihen suuntaan, että minun piti heti mukisematta maksaa
yhtiölle korkojen kanssa, mitä olin sille maksava, sekä oikeuskuluja
niin ja niin paljon.
Kun minä maahan lyötynä ja musertuneena tulin kotiin, riensi Katri

vastaani ja sanoi olevansa aivan varma, että minä olin suoriutunut
voittajana. Hän ei ymmärtänyt, että lakimiehet pitelevät lakipykäliä
kuin etevä peluri sakkinappuloita.
"Katri-kulta", sanoin, "mitäs minä mahdoin yksin kokonaista yhtiötä

vastaan. Jos olisin voinut palkata ovelan asianajajan, olisin ehkä
voittanut."
Asia jatkui laillista kulkuansa. Eräänä aamuna, kun Sirkka oli

lähtenyt opistoon, tuli pari hienoa herrasmiestä, joista toisella oli
salkku kainalossa. Toinen luki oikeuden päätöksen. Häikäilemättä
tulivat he sisään, ja alkoivat merkitä huonekaluja, liimaten kuhunkin
keltaisen lapun.
Ryöstöherrojen mentyä kiitin sydämestäni Jumalaa, ettei Katri ollut

tätä murhenäytelmää näkemässä — hän oli päivää ennen siirtynyt
synnytyslaitokseen.
Puuttui vielä viimeinen näytös: omaisuutemme myynti

pakkohuutokaupalla.
Sattui sadepäivä, ja saattoi pitää varmana, että omaisuutemme

menisi polkuhintaan. Märkinä viruivat huonekalumme, nuo meille niin
tutut ja rakkaat. Sirkan pianiino oli kolhittu naarmuille.
Koko omaisuudestamme kertyi tuskin sen vertaa, että yhtiön

saatava tuli kuitatuksi.
Kun Sirkka kotiin tultuaan näki huoneensa tyhjänä, jäi hän alussa
aivan sanattomaksi. Minun täytyi ilmaista kaikki; mitäpä olisi
hyödyttänytkään salata totuutta.
"Minä yksin olen syyllinen. Säästä Katria!"
Hän oli kauan vaiti ja sanoi sitte:
"Pitää vuokrata soittokone."
Lupasin järjestää asian parhaani mukaan, ja hän oli taas iloinen

kuten ennenkin.
Vihdoin tuli Katri kotiin kantaen jotakin, jota hän piteli kuin olisi
siinä ollut helposti särkyvä esine. Hän laski sen sänkyyn, oikaisihe ja
sanoi veitikkamaisesti hymyillen:
"Olen hankkinut vuokralaisen!"
Olin niin raskasmielinen, etten ymmärtänyt leikkiä. Sanoin:
"Kiitos, Katri-kulta! Sinä saat aina jotakin aikaan."
"Älä minua kiitä", sanoi hän nauraen. "Se on yhtä paljon sinun
ansiotasi."
Kun hän sitte katsoi ympärilleen ja näki, että huone oli tyhjä,
säikähti hän niin että pelkäsin hänen pyörtyvän ja otin hänestä kiinni.
Mutta hän sanoi:
"Ei mitään, se menee kyllä ohi. Ymmärrän kaikki…"
"Anna anteeksi, Katri rakas!" rukoilin. "Minä olen syypää

kaikkeen."
Hän istahti sängyn laidalle — ryöstömiehet olivat vieneet tuolit.

Hän oli kalpea ja vapisi.
"Täällä on kylmä! Se paleltuu, lapsi-raukka."
Hän otti pienokaisen sängystä ja suuteli sitä sanoen:
"Lapsi-parka! Pahaan aikaan sinä tulit maailmaan!"
Ja hän puristi sitä rintaansa vasten aivan kuin olisi tahtonut

sydänverellään sitä lämmittää…
NELJÄSTOISTA LUKU.
Oman kodin unelma särkyy.
"Mutta mitä sanoo setä, kun saa kuulla, että meille onkin tullut
poika!" nauroi Katri eräänä aamuna kylvettäessään lasta keittiön
astiasoikossa.
"Sanos muuta! Luonnollisesti hän peruuttaa lahjoituksensa."
Samassa tuli Sirkka nuottilaukku kädessä musiikkiopistoon

lähteäkseen.
"Joko olet pitkällä äänenmuodostuksessa?" kysyin.
"Harjoituksia minä laulan ja vokaliisejä. Piakkoin saan aarian."
Katri kuivasi lapsen ja lopetti kylvyn suutelemalla sitä.
"Annas kun koetan, paljonko se painaa!" pyysi Sirkka.
"Sinä pudotat."
"Enkä pudota." — Ja hän otti lapsen varovasti käsivarrelleen.

"Mikä sen nimeksi tulee?"
"Matti", sanoin minä.
"Matti! Mikä nimi se on!" huusivat naiset yhdestä suusta.
"Rehellinen suomalainen nimi", ilmoitin minä.
Mutta Katri väitti, että lapsi oli hänen, hän antaa sille nimen. Minä
huomautin vaatimattomasti, että poika oli hiukan niinkuin minunkin.
Sitä puhetta ei otettu kuuleviin korviin. Myöhemmin heillä oli pitkä ja
perinpohjainen neuvottelu lapsen nimestä. Koko almanakka tutkittiin
kannesta kanteen.
"Moosesko siitä tulee?" kysyin minä.
"Ei, kuin Kullervo", sanoi Sirkka.
"Kullervo on niin traagillinen nimi", yhtyi Katri.
"No, olkoon vaikka Kalervo! En puutu koko juttuun."
Nähdessäni, millä sanomattomalla rakkaudella Katri katseli

esikoistaan, tunsin suurta iloa, mutta samalla syvää surua
sydämessäni. Tulevaisuus näytti nyt synkemmältä kuin milloinkaan.
Katrin oli täytynyt jättää paikkansa voidakseen hoitaa lastaan.
Lauluoppilaani olivat huvenneet olemattomiin. Olin tarjonnut erästä
näytelmääni teatterille, mutta pitkien neuvottelujen jälkeen se
hylättiin. Emme edes olleet onnistuneet saamaan vuokralaista
tyhjään huoneesemme, vaikka olimme panneet suuret rahat
ilmoituksiin. Kuin uhkaava Damokleen miekka häilyi vuokravelka
yllämme, eikä ollut armoa odotettavissa.
Kaikkein pahimmin painoi kuitenkin Sirkan kohtalo minua. Hänen
kehutut osakkeensa eivät tuottaneet mitään. Minussa vakaantui yhä
enemmän se käsitys, että niiden arvo oli tuottonsa mukainen.
Pankkiosakkeet myin nimellisarvosta erään liiketoimiston välityksellä.
Setä väitti, että minua oli taaskin hävyttömästi kynitty, sillä
osakkeiden arvo oli pörssissä kolminkertainen.
Eräänä päivänä kutsui isännöitsijä minut puheilleen —

vuokravelan takia tietenkin. Hän kohteli minua kylmästi, sanoen
minua huonoksi yhtiömieheksi ja kehoittaen minua myymään
osakkeeni; muussa tapauksessa myyttäisi yhtiö ne
pakkohuutokaupalla. Minä käytin tilaisuutta ja kysyin, miten niiden
kaivososakkeiden laita oli. Hän vastasi, ettei hän nyt joutanut
enempiin keskusteluihin. Mutta minä päätin pysyä lujana ja sanoin:
"En aio poistua, ennenkuin asia on perinpohjin selvitetty."
Tirehtööri kääntyi hermostuneena minuun ja kysyi:
"Mitä te siis tahdotte?"
"Tahdon tietää, onko osakkeilla mitään arvoa vai ovatko ne

roskapaperia."
Hän naurahti halveksivasti ja sanoi yli olkain:
"Turha on sitä teille selittää. Te ette ole mikään liikemies ettekä

ymmärrä osakkeiden arvoa."
Syntyi hiljaisuus. Minä kokosin viimeiset voimani

loppurynnäkköön.
"Jos teissä on rahtunen rehellisyyttä, niin myöntäkää, että
osakkeet ovat paljasta, käärepaperia."
Hän oli hetken ääneti ikäänkuin olisi arvioinut vastustajansa voimia

ja sanoi sitten:
"No, jos tahdotte, niin olkoon sanottu, että kaivosyhtiö juuri jättää
vararikkoanomuksen, mutta me muodostamme uuden yhtiön."
Tunsin, miten veri kuohahti koskena aivoihini.
"Mitä minulla on siitä iloa?"
"Voitte ottaa osakkeita uudessa yhtiössä."
"Entä vanhat?"
"Jaa, vanhatko osakkeet? Ne ovat tietysti arvottomia."
Maailma musteni silmissäni, mutta koetin säilyttää malttini ja

sanoin:
"Se on ainakin suoraa puhetta. Entä ne muut osakkeet?"
Tirehtööri katsoi ovea kohti, mutta minä en ollut sitä huomaavinani.
"Jaa, nekö kasvisvoi-osakkeet! Ne ovat parhaita, mitä yleensä on

olemassa."
"Totuus esiin!" huusin minä sellaisella voimalla, että tirehtööri otti

askeleen takaperin.
Hän haki sanoja vastaukseen, mutta minä kuulin vain epäselvää

mutinaa.
Se riitti minulle.
"Siis kaikki mennyttä! Sisarentyttäreni koko perintö menetetty!"
Tirehtööri hymähti:
"Vähänkös sellaista sattuu! Liike-elämä on arpajaispeliä. Te teette

panoksen, mutta sattuu tyhjä arpa. No, mitä siitä. Toisella kertaa
voitte voittaa."
Moinen kiemurteleminen viilsi minua kuin olisin saanut

puukonpiston.
Astuin uhkaavana tirehtööriä kohti ja sanoin:
"Mutta minulla ei ole rahoja uuteen panokseen. Sitäpaitsi olen

vastuunalainen sisarentyttäreni rahoista, jotka olivat uskotut hoitooni,
tietäkää se!"
"Mitä minulla on teidän sisarentyttärenne kanssa tekemistä!"

murahti hän olkapäitään ylenkatseellisesti kohauttaen.
Nyt en voinut enää hillitä itseäni. Vihasta vavisten huusin:
"Petturi! Rosvo!"
Tirehtööri nauroi. Hän näytti pikemmin iloitsevan kuin

loukkaantuneen sanoistani.
"Hyvä että huusitte niin kovaa, että kuulivat sen viereisessä

huoneessa. Juttu jatkuu raastuvanoikeudessa!"
Olin siinä määrin kiihtynyt, etten ensinkään oivaltanut, mitä uhkaus

tarkoitti.
Kotiin tultuani olin aivan näännyksissä ja huokasin:
"Katri rakas! Jumala meitä armahtakoon! Sirkan perintö on

menetetty!"
"Menetetty! Laupias taivas!" parkaisi Katri.
Kerroin koko asian. Hän puhkesi itkemään.
"Sirkka-raukka! Mitä hän nyt sanoo! Ja sinä onneton! Mikset

ottanut tarkempaa selkoa asiasta?"
Mutta nyt oli katumus myöhäinen. Itku ja valitus ei auttanut. Mikä

oli menetetty, se oli hukassa. Pyysin häntä olemaan puhumatta
Sirkalle onnettomuudesta ainakin toistaiseksi.
*****
Huijari ei ollut turhia uhannut. Muutaman päivän päästä sain

haasteen, jossa vaadittiin edesvastausta kunnianloukkauksesta.
Lakimies-lurjukset Jutku ja Metku olivat uudelleen kimpussani.
Epätoivoisena menin kertomaan sedälle kaikki. Hän piti varmana,

että olin joutunut veijarien saksiin. Kun sanoin, että Sirkan perintö oli
menetetty, suuttui hän yhä enemmin.
"Kas sillä lailla! Sinä olet oivallinen holhooja, sinä!"
Tämä moite sattui minuun niin kipeästi, etten voinut pidättää

itkuani.
"Mistä minä tiesin, että se mies sellainen konna oli!"
Setä pahastui yhä enemmän.

"Elä sinä syytä muuta kuin omaa tyhmyyttäsi! Huijari on menetellyt
liikemiehen tavoin. Myyjä kehuu aina tavaraansa; ostajan asia on
katsoa, ettei tule petetyksi."
"Setä näkyy puolustavan sitä roistoa! Sitä en toki olisi odottanut",

sanoin loukattuna.
"Minä en puolusta, mutta yhtä vähän voin hyväksyä sinun

menettelyäsi."
Vaikka tuntui siltä, että setä ei ymmärtänyt minua, kerroin hänelle

kunnianloukkausjutusta.
"Yhä parempaa!" sanoi hän. "Menet lörpöttelemään roskaa ja

sotket itsesi vielä pahemmin sen heittiön verkkoihin. On parasta, että
menet pyytämään häneltä anteeksi."
"Anteeksi! En ikänä! Minä päinvastoin todistan, että hän on se,

miksi häntä sanoin."
"Millä sinä sen todistat? Hänellä on ovela asianajaja, joka pistää

sinut pussiin."
"Niinpä hankin minäkin lakimiehen", sanoin itsepäisesti ja jätin

pahoillani sedän. Olin mennyt siinä toivossa, että hän auttaisi minua,
mutta sen sijaan hän olikin soimannut. Ja ylpeydessäni minä päätin,
etten enää ikinä käänny setäni puoleen, käyköön miten tahansa.
Niinpä lähdinkin Hodon ja Ahmatin asianajotoimistoon. Herrat

lupasivat ottaa jutun ajaakseen ja vakuuttivat varmasti voittavani.
Mutta kun kysyin palkkiota, määräsivät he niin mahdottoman
summan, että lupasin hakea helpomman edustajan. Sanoin hyvästi,
mutta lakiherra huomautti kohteliaasti:
"Neuvottelu maksaa 10 markkaa!"
Maksoin ja menin Puntin ja Pykälän lakiasiaintoimistoon. Täällä

harjoitti kaksi herrasmiestä nyrkkeilyä jonkun häväistysjutun vuoksi.
Lakimies seisoi syrjässä odottaen vesissä suin, että saisi edellisen
lisäksi pahoinpitelyjutun ajaakseen. Tappelijat kuitenkin erosivat
vaihtaen nimityksiä sellaisia kuin "aasi" ja "sika" sekä muita
kohteliaisuuksia. Kutsuttuna esiin kerroin asiani. Hekin vakuuttivat,
että voitto varmasti kuului minulle, ja jos kuitenkin menettäisin, niin
he vetoaisivat hovioikeuteen, vaikkapa senaattiin asti.
Kun juttu ensi kerran huudettiin esille, toi huijari koko

konttorihenkilökuntansa todistamaan, että minä olin häntä,
kunniallista miestä, sanonut rosvoksi. Asianajajani pyysi lykkäystä
näyttääkseen toteen, että rosvon nimi oli sangen sattuva miehestä,
joka oli puhaltanut turvattoman orpotytön perinnön.
Sillävälin sattui seikka, joka loi uutta valoa huijarin elämään.
Sirkka viipyi eräänä iltana tavallista myöhempään ulkona. Hän tuli

ilman saattajaa, mikä tapahtui hyvin harvoin. Pihalta oli valaistus jo
sammutettu. Pimeässä tunsi tyttö jonkun käyvän käsivarteensa.
Säikähtäen kapaisi hän rappuja ylös. Löytämättä heti avaimen reikää
alkoi hän kovasti röykyttää ovea. Hyppäsin ylös, avasin oven ja
laskin tytön eteiseen. Näin tumman haamun, joka aikoi livistää
tiehensä.
"Seis!" huusin minä.
"Täälläkö se tyttö asuu!" sanoi haamu, joka ei ollut sen vähempi

henkilö kuin itse herra tirehtööri.
"Millä oikeudella te ahdistatte turvatonta tyttöä?"
Huijari jäi hetkeksi vaiti, mutta pääsi pian tasapainoon ja sanoi:
"Isännöitsijänä olen velvollinen valvomaan, ettei huonoja naisia

asu talossa."
Moinen katala solvaus sai minut suunniltani.
"Tämän tytön kunniallisuudesta vastaan minä. Mutta jos tahdotte

epäsiveellisyyttä vastustaa, niin asuu täällä eräs Esa Ansio niminen
heittiö, jonka elämä jättää siinä suhteessa melkoisen paljon
toivomisen varaa."
Mies aikoi vetäytyä portaita alas, mutta minä sanoin hänen omilla
sanoillaan:
"Tämä juttu jatkuu raastuvanoikeudessa."
Sirkka kertoi saman miehen häntä ennenkin vahtineen ja

houkutelleen luoksensa.
Hykersin käsiäni ilosta. Nyt oli lurjus käsissäni! Tytön holhoojana

en ollut ainoastaan oikeutettu, vaan velvollinenkin vetämään veijarin
tilille kunniallisen tytön ahdistamisesta epäsiveellisessä
tarkoituksessa. Eikä sata saivartajaa pystyisi pesemään häntä
puhtaaksi.
Mutta kun puhuin asiasta naisille, pyysi Sirkka, ettei siitä puhuttaisi
enempää. Tulisi poliisitutkinto ja oikeudenkäynti, ja hän saisi hävetä.
Katri oli samaa mieltä. Nuoren tytön maine siitä kärsisi, niin syytön
kuin hän olikin.
Minua suututti heidän itsepäisyytensä.
"Katsotaanko siis läpi sormien tuollaista konnantyötä! Mies, joka

on tehnyt meille niin paljon pahaa, ryöstänyt Sirkan perinnönkin
viimeistä penniä myöten!"
"Minunko perintöni!" huudahti Sirkka ja katsoi minuun suu auki.
Olin paljastanut koko salaisuuden. Peruuttaminen oli mahdotonta.
"Niin juuri. En aikonut sitä vielä sanoa, mutta on parasta, että

tiedät, millainen heittiö sinun ahdistajasi on."
Olin varma, että hän nyt muuttaisi mielipiteensä. Mutta hän sanoi
lempeästi:
"Olkoon, että se mies on tehnyt väärin meitä kohtaan. Mutta me

emme saa pahaa pahalla kostaa."
Katsoin liikutettuna, melkein kyynelsilmin tyttöä, joka noin saattoi

antaa anteeksi. Ajattelin samalla itseäni. Minäkin olin tehnyt väärin
Sirkkaa kohtaan, olin saattanut hänet kurjuuteen, eikä hän ollut
minuakaan syyttänyt.
*****
Mutta sitä katkerampaa vihaa kantoi huijari minua kohtaan. Niin

pian kuin tuli hiukankin vuokravelkaa, antoi hän haasteen. Asia meni
laillista menoansa: oikeudenkäynti, tuomio, ulosmittaus. Mutta kun
meillä ei enää ollut mitään otettavaa, vaativat ryöstöherrat
ullakkokonttorin avaimia. Siellä oli madonnankuva pölyttyneenä
nurkassaan. Toinen potkaisi Kristus-lasta otsaan, johon tuli tahra, ja
sanoi:
"Ska' vi ta den där?"
"Va' ska' vi göra me' så'nt skräp!" nauroi toinen.
Alas tullessaan kysyivät asunto-osakkeita. Sanoin, etten aio niitä

luovuttaa. He uhkasivat mennä neuvottelemaan isännöitsijän
kanssa. Parin päivän perästä ilmestyi lehtiin näin kuuluva ilmoitus:
4 asunto-osaketta
osakeyhtiössä Onnela, å 1,000 markkaa, myydään — ellei

maksua tai muuta laillista estettä tule — julkisella täkäläisessä
huutokauppakamarissa pidettävällä pakkohuutokaupalla.
Ostohinnasta on puolet heti maksettava ja loput viikon kuluessa.

Muuten annetaan lähempiä tietoja myyntitilaisuudessa.
Synkässä alistuvaisuudessa katsoin tulevaisuuteen. Kuin hukkuva

oljenkorteen, tartuin siihen ajatukseen, että setä tulisi ja huutaisi
osakkeeni. Mutta hän ei tullut.
Osakkeista tarjottiin 100 markkaa kappaleelta. Yhtiön sääntöjen

mukaan oli entisillä osakkailla etuoikeus niiden lunastamiseen.
Seuraavana päivänä lähetti huijari sanan, että minun oli heti

muutettava, koska asunto oli hänen.
Sinä yönä emme saaneet unta silmäämme. Meidän ei auttanut

muuta kuin lähteä etsimään huonetta, mihin voimme siirtää vähät
kapistuksemme. Satoi, ja kaikki tuli likomäräksi. Sirkka huolehti
lapsesta sillaikaa kun me kuletimme tavaroitamme käsikärryillä,
koska meillä ei ollut varaa ottaa ajuria. Pihalla hyöriessämme huusi
huijari ikkunastaan talonmiehelle:
"Pääsemme vihdoinkin roskaväestä, joka ei maksa vuokraa."
Kuinka ne sanat viilsivätkään sydäntäni, sillä vaikka olimmekin

köyhiä, oli ylpeyteni vielä lannistumaton.
Illan hämärtyessä lähdimme viimeisen kerran katsomaan rakasta

kotiamme. Juuri kun aioimme lähteä sieltä vaipui Katri maahan ja itki
niin toivottomasti, että luulin hänen kuolevan.
"Miksi, miksi piti näin käydä!" nyyhki hän ja väänteli käsiänsä.
"Katri rakas! Jumala koettelee, mutta Hän ei vielä ole hyljännyt

meitä.
Kaikki vielä kääntyy hyväksi."
Näin sanoen nostin hänet ylös. Viimeisen kerran painoin tutun

oven kiinni. Oli tullut pimeä. Muistin madonnankuvan unohtuneen
ullakolle ja lähdin sitä hakemaan. Katri lupasi odottaa kadulla.
Palatessani huomasin katulyhdyn valossa miehen, joka läheni

Katria ja tarttui julkeasti häntä käsivarteen. Salaman nopeudella
hyökkäsin huijaria vastaan ja iskin häntä kaikin voimin vasten
naamaa, niin että hän tupertui maahan.
"Rosvo!" huusin minä. "Kaikki veit minulta, aiotko lopuksi ryöstää

vaimoni!"
Heittiö jupisi jotain käsittämätöntä.
"Konna!" huusin, ja uusi isku sattui samoille seuduille.
Mies kömpi jaloilleen ja otti puolustusasennon.
"Roisto!" huusin ja annoin kolmannen iskun kaupantekijäisiksi.

Huijari tointui hämmästyksestään.
"Mitä tämä merkitsee! Tässä maassa on laki ja oikeus."
"Valitettavasti ei ole lakia ja oikeutta huijareita ja naisten

häväisijöitä vastaan", sanoin minä ja tartuin Katrin käsivarteen.
"Juttu jatkuu raastuvanoikeudessa!" sanoi huijari ja haki lakkinsa

katuojasta.
"Sitä minä sydämeni pohjasta toivon."
Ja me lähdimme. Tultuamme jonkun matkaa päähän kääntyi Katri

ja jäi synkkänä katsomaan. Hänen näkyi olevan mahdoton käsittää,
että meidän oli iäksi jätettävä kotimme, jossa olimme niin paljon
suurta uneksineet. Ja suuret kyynelkarpalot putoilivat pitkin hänen
laihtuneita, kalpeita poskiaan.
"Elä itke, armaani! Jumala kyllä auttaa meitä. Rakkaus rakensi

kodin — ja rakkautemme on meillä jälellä", koetin lohduttaa
onnetonta, itsekin taistellen itkua vastaan.
Hän pyyhki silmiään ja sanoi kyyneltensä takaa hymyillen:
"Rakkaus meille jäi — kaikki muu on riistetty."
"Kun paras jäi, miksi suremme sitä, mikä on vähempiarvoista?"

sanoin minä.
Hän tarttui käteeni lujasti, luottavana, uskollisena. Ja me

kävelimme käsi kädessä tukien toisiamme synkkää tulevaisuutta
kohti, jota ei yksikään toivon säde näyttänyt valaisevan.
VIIDESTOISTA LUKU.
Kuninkuus ja hirttonuora.
Sanotaan, että kun puute astuu sisään yhdestä ovesta, menee

rakkaus ulos toisesta.
Katrin ja minun suhteen tämä väite joutui häpeään. Meidän

rakkautemme varttui ja vahvistui vastoinkäymisissä. Luonnollisesti
meidänkin kesken tuli erimielisyyttä ja väärinymmärrystä, mutta ne
unohtuivat pian. Myrskyä seurasi tyven, ja rakkauden lempeä
päiväpaiste hajoitti murheen mustat pilvet.
Kun me unettoman, raskaan yön jälkeen heräsimme ahtaassa,

pimeässä asunnossamme, tuntui alussa siltä kuin ei enää
kannattaisi nousta jatkamaan elämää. Me olimme kuin haaksirikosta
pelastuneet. Vähät tavaramme olivat sateen ryvettämät ja naarmuja
täynnä; osa oli mennyt kiireessä rikki. Ilma huoneessa oli
ummehtunut, seinäpaperien raoissa vilisi syöpäläisiä. Ehkä oli
tästäkin viheliäisestä hökkelistä joku onneton perhe häädetty
vuokravelan takia.
Emme olleet vielä pukeutuneet, kun tultiin ilmoittamaan, että ensi
kuun vuokra olisi maksettava etukäteen.
"Sellaista se on, kun on köyhä. Ei kukaan luota", sanoin minä ja

istahdin raskaasti huoahtaen takaisin sängyn laidalle.
Katri katseli minua ääneti, tarttui äkkiä päähäni ja veti sitä

puoleensa säälitellen:
"Harmaita hiuksia!"
"Ei suinkaan", väitin minä, sillä kukapa kernaasti myöntäisi

olevansa vanha. Katsahdin peiliin ja näin, että niin kuitenkin oli laita.
Ja raskas huokaus kohosi rinnastani.
Entä Katri? Hän oli kuin haamu, surkea jäännös ennen niin
kauniista ja iloisesta olennosta. Suuret, kirkkaat silmät olivat syvällä
kuopissaan, äsken niin verevä iho oli lakastunut kalpeaksi.
Sydäntäni vihloi katsellessani häntä. Tunsin katkeraa soimausta
sisimmässäni. Pidin itseäni syyllisenä hänen onnettomuuteensa.
Hän nousi ja kävi ripeästi järjestämään uutta kotiamme.
"Meidän täytyy kaikista huolimatta elää — lapsemme tähden",

sanoi hän päättävästi.
Ja hän otti lapsen ja istuutui imettämään sitä. Nähdessään

masennukseni hän jatkoi:
"Arvaanpa, mitä mietiskelet. Kadut, että menit naimisiin."
"Rakas Katri, kuinka voit sellaista ajatella", sanoin minä

loukkaantuneena.
"Ainakin pahoittelet sitä, että otit vaimoksesi köyhän tytön."
"Kadun sitä, että olen saattanut sinut kärsimyksiin, joihin minä

yksin olen syypää."
Katrin silmät kävivät himmeiksi, suupielet alkoivat värähdellä.
"Ei sinun sitä tarvitse katua. Vapaasti olen kohtaloni valinnut, ei

minua ole kukaan pakoittanut."
Minä istahdin hänen viereensä, silitin hänen päätänsä ja suutelin

kalpeata poskea.
Hän hymyili hiljaisesti, entinen iloisuus kirkasti hetkeksi hänen

piirteitään, ja hän sanoi:
"Ei nyt ole aikaa suutelemiseen. Meillä on tärkeämpää tehtävää."
"Kuulehan, Katri! Tahdotko kuulla, mitä minä aamulla vuoteellani

sepitin."
"Onko se pitkä ja sekava?"
"Ei, se on lyhyt ja selvä."
Ja minä lausuin hänelle runon:
KUNINGAS.
Kun nälkä suolissani kurnuttaapi, ja reiät irvistävät

vaatteissain, kun vaimo vieressäni jurnuttaapi, ja kuolo
kummittelee aatteissain,
ma kuningasta silloin kuvittelen ja herkkupöydän laitan
linnassain, ja juhlavieraitani huvittelen, ministereitä virast'
erottain.
Mun onhan laulun, aatteen valtakunta, jot' itsevaltiaana

hallitsen, Sun kanssas, kuningatar, näämme unta, ja
onnemme on suuri, ikuinen.
"Niin minäkö kuningatar! Luulen, että hänen korkeutensa

perintöruhtinas on sairas; se oli levoton koko yön", sanoi Katri ja
viihdytti lasta, joka oli ruvennut itkemään.
"Mutta sanohan, Katri, eikö ole ihmeellistä, että ihminen voi

ajatuksissaan luoda aivan uuden maailman, jossa kaikki on sellaista
kuin hän toivoo ja tahtoo?"
"Kyllähän se on kaunista, mutta nälkäinen vatsa ei tule toimeen

kuvitteluilla, eikä talon isäntä huoli sinun runojasi vuokran maksuksi",
sanoi Katri. Hänen pilassaan oli totta toinen puoli — ehkä vähän
runsaamminkin.
Sirkka astui samassa sisään. Nähdessään kaiken sen surkeuden,

jonka keskellä olimme, tuli hänen muotonsa kovin murheelliseksi.
Huomasimme, miten hän koko sydämellään otti osaa
onnettomuuteemme. Hän istahti puulaatikon syrjälle ja katseli ääneti
ympärilleen. Äkkiä hän näki jotakin nurkassa ja sanoi:
"Madonna on tuolla! Madonna ja lapsi!" jatkoi hän ja silmäsi

veitikkamaisesti Katria.
Katri punehtui ja painoi päänsä alas.
"Joko eno on säveltänyt sen laulun?" kysyi Sirkka.

Ebook Cardiovascular Engineering A Protective Approach PDF Full Chapter PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Ebook Cardiovascular Engineering A Protective Approach PDF Full Chapter PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Cardiovascular Engineering: A

Protective Approach - eBook PDF

New York Chkago San Francisco

eBook conversion by codeMantra

Part I Foundations of Cardlovascular Protective Engineering

Regulation of cardiac chamber formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Amino acid transport. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

External environmental factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

Discovery and characterization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

Small interfering RNA-based mRNA modifications. . . . . . . . . . . . . 276

Part II Appllcatlons of Cardlovascular Protective Engineering

Inflammation regulatory factor genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313

12 Arterial Aneurysms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345

Dilated Cardiomyopathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382

15 Congenital Heart Defects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407

Ventricular septum defects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414

Cardiovascular disease is the leading cause of human morbidity and mortality. A

Foundations of Protective Engineering

Pathogenic causes and processes

Naturally accunlng protective mechanisms

and differentiation, and fibroblast proliferation and extracellular matrix production

Regional protective mechanisms

Distant protective mechanisms

F11uRE 1.2 Regulatory mechanisms of hepatic cell moblllzatJon In response to lschemlc

Protective Engineering Strategies

and regeneration of functional cells. Tissue-level protective engineering is to provide

Molecular protective engineering

Enhancing protectire impacts by protein administtation and gene ttansfer

Supptessint adverse dflne expression

Gene editint-mediated control of dene expression

a process activating homologous recombination and causing insertion of an exogenous

Cell-based protective engineering

Tissue-level protective engineering

properties conforming to the tissue or organ to be replaced; preparation, expansion,

naturally occurring protective factors remains incomplete and their mechanisms of

Early Embryonic Development

FIGURE 2.1 Processes of early embryonic development.

Fertilization-union of the sperm and ovum

the sperm-ovum interaction proteins, including zona pellucida glycoprotein 3 (ZP3),

Development of the Heart

Regulatlon of heart development

Formation of the heart tube

Regulation of heart tube formation

Samalla kuulin, että talo vihdoinkin oli asuttavassa kunnossa.

Vaikka pettymyksemme olikin suuri, ei meillä ollut aikaa sitä

Uudessa kodissa saatoin taas paremmin antautua

Hääpäiväämme lukuunottamatta oli elämämme hauskin hetki se,

"Ei, mutta Katri! Kuva on sinun näköisesi."

"Jos istuisit tuossa asennossa lapsi sylissä, olisit ihan ilmetty

Katri punehtui ja sanoi:

"Minulla ei ole lasta… Enkä minä ole mikään madonna…

"Annappa Sirkan lukea se kaunis laulusi", pyysin minä.

"Onko Katri kirjoittanut laulun?" ihastui Sirkka ja alkoi heti vaatia

"Voi, jos osaisin säveltää, kirjoittaisin lauluun musiikin. Siitä tulisi

"Mikä mies sinun sulhasesi on?" kysyi Katri.

Sirkka punastui ja alkoi katsella madonnankuvaa.

"Enon pitää sepittää sävellys tähän lauluun! Enohan on opiskellut

"Voisihan sitä koettaa, kun pääsisi muuttopuuhista", lupasin

Kun madonna sitte vietiin muun romun mukana ullakolle, unohtui

Aloimme ahkerasti ilmoittaa lehdissä, mutta pitkiin aikoihin ei

Eräänä aamuna tuli vihdoin nuori, hienosti puettu neiti, kädessään

Olimme iloisia, kun saimme Sirkalle vakavahenkisen

Käydessäni ensi kertaa vuokraa maksamassa huomautin