Ranunculales Medicinal Plants:

Biodiversity, Chemodiversity and

Pharmacotherapy Da-Cheng Hao
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rsity-and-pharmacotherapy-da-cheng-hao/
RANUNCULALES
MEDICINAL
PLANTS
Page left intentionally blank
RANUNCULALES
MEDICINAL
PLANTS
Biodiversity, Chemodiversity
and Pharmacotherapy
Da-Cheng Hao


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Publisher: John Fedor

Acquisition Editor: Glyn Jones
Editorial Project Manager: Naomi Robertson
Production Project Manager: Punithavathy Govindaradjane
Designer: Mark Rogers
Typeset by Thomson Digital
 Contents

About the Author vii 3.3 The Chemical Composition of Berberidaceae

Preface ix Plants 78
3.4 The Chemical Composition of
Menispermaceae 86
1. Genomics and Evolution 3.5 The Chemical Composition of Lardizabalaceae
and Circaeasteraceae Plants 95
of Medicinal Plants 3.6 The Chemical Composition of Papaveraceae
1.1 Introduction 1 and Eupteleaceae Plants 97
1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 2 3.7 Ethnopharmacology and Bioactivity 99
1.3 Mechanisms of Species Evolution and 3.8 Discussion and Conclusion 110
Diversification 17 References 112
1.4 Phenotype Evolution and Ecology 19
1.5 Pharmacophylogeny vs. 4. Drug Metabolism and Pharmacokinetic
Pharmacophylogenomics 21 Diversity of Ranunculaceae Medicinal
1.6 Conclusion and Prospects 28 Compounds
References 28
4.1 Introduction 126
2. Mining Chemodiversity 4.2 Absorption of Ranunculaceae
From Biodiversity: Pharmacophylogeny Compounds 127
of Ranunculaceae Medicinal 4.3 Distribution 133
4.4 Metabolism 134
Plants
4.5 Toxicity 160
2.1 Introduction 36 4.6 Pharmacokinetics and
2.2 Systematics of Ranunculaceae 36 Pharmacodynamics 162
2.3 The Chemical Composition of Ranunculoideae 4.7 Conclusion and Prospect 165
Plants 36 References 165
2.4 The Chemical Composition of Thalictroideae,
Coptidoideae, Hydrastidoideae, and 5. Drug Metabolism and Disposition
Glaucidioideae 45 Diversity of Ranunculales
2.5 Ethnopharmacology and Bioactivity 47 Phytometabolites
2.6 Discussion 56
2.7 Conclusion 64 5.1 Introduction 176
References 64 5.2 Absorption 183
5.3 Distribution 186
3. Mining Chemodiversity From 5.4 Metabolism 188
Biodiversity: Pharmacophylogeny of 5.5 Excretion and Elimination 204
Ranunculales Medicinal Plants (Except 5.6 Toxicity and Safety 206
Ranunculaceae) 5.7 Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics 207
3.1 Introduction 74 5.8 Conclusions and Prospect 212
3.2 Systematics and Evolution of Ranunculales 74 References 214

v
vi Contents

6. Anticancer Chemodiversity of 8. Biodiversity, Chemodiversity,

Ranunculaceae Medicinal Plants and Pharmacotherapy of Anemone
Medicinal Plants
6.1 Introduction 224
6.2 Cell Death Pathways 229 8.1 Introduction 298
6.3 MicroRNAs, DNA Damage, and Epigenetic 8.2 Ethnopharmacology 298
Regulation 239 8.3 Phytochemical Components 307
6.4 Oxidative Process and Metabolism 241 8.4 Bioactivities 329
6.5 Antiangiogenic and Antimetastatic 8.5 Taxonomy and Pharmacophylogeny 347
Effects 243 8.6 Transcriptomics, Proteomics, and
6.6 Immunomodulatory Activity 247 Metabolomics 349
6.7 Antiinflammatory Activity 247 8.7 Conclusion and Prospects 351
6.8 Structure-Activity Relationship 248 References 351
6.9 Genomics, Transcriptomics, Proteomics, and
Metabolomics 249 9. Biodiversity, Chemodiversity, and
6.10 Conclusion and Future Perspective 250
Pharmacotherapy of Ranunculus
References 251
Medicinal Plants
7. Biodiversity, Chemodiversity, and 9.1 Introduction 357
Pharmacotherapy of Thalictrum 9.2 Chemical Constituents 358
Medicinal Plants 9.3 Bioactivity 373
9.4 Phylogenetic Relationship 377
7.1 Introduction 261 9.5 Conclusion 381
7.2 Chemical Constituents 269 References 383
7.3 Bioactivity 277
7.4 Phylogeny 286 Index 387
7.5 Discussion and Conclusion 288
References 294


 About the Author
Da-Cheng Hao, Associate Professor/Prin-
ciple Investigator, School of Environment
and Chemical Engineering/Biotechnology
Institute, Dalian Jiaotong University, Dalian
116028, China. e-mail: hao@djtu.edu.cn.
Dr. Hao earned his bachelor’s degree in
medicine, master’s degree in science, and PhD
degree in biotechnology from Xi’an Jiaotong
University, National University of Singapore
and Chinese Academy of Sciences respectively.
He had postdoctoral training in the Institute of
Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chi-
nese Academy of Medical Sciences (CAMS),
under the supervision of Prof. Pei Gen Xiao and
Prof. Shi Lin Chen. He was a visiting scholar
of John Innes Centre, UK, for 1 year (2012–13),
supported by the Ministry of Education, China.
Studies of Dr. Hao are supported by
Liaoning Natural Science Fund (2015020663),
vii
Liaoning postgraduate education and teach-
ing reform project (2016), the Scientific
Research Foundation for ROCS, Ministry of
Education, China (2014), and more. Dr. Hao is
the editorial member of the Journal Chinese
Herbal Medicines at https://www.journals.
elsevier.com/chinese-herbal-medicines/ and
Biotechnology Bulletin at http://biotech.
caas.cn/.
Dr. Hao has published more than 70 SCI
papers and two books, Medicinal Plants: Chem-
istry, Biology and Omics (Elsevier/Woodhead)
and An Introduction of Plant Pharmacophylog-
eny (Chemical Industry Press, China). He is
the peer reviewer of scores of SCI journals,
Elsevier book proposals, and research grant
proposals of Poland National Science Centre
(NCN) and French National research Agency
(ANR).
Page left intentionally blank
 Preface
The history of medicinal plants is as long
as the origin of human beings. For a few
millennia, medicinal plants have contrib-
uted countless medicinal active ingredients,
which are widely used in traditional Chi-
nese medicine (TCM) and worldwide eth-
nomedicine. The current increasing interests
in plant-based medicinal resources promote
the upsurge in research and development,
and many useful compounds are found from
plants of different evolutionary levels, such as
steroidal saponins, alkaloids, terpenoids, and
glycosides. The expanded studies of chemo-
taxonomy, molecular phylogeny, and phar-
macological activity of medicinal plants are
gaining deeper insights. Pharmaphylogeny
(pharmacophylogeny) is about the study of
medicinal plant genetic relationships (chemi-
cal composition), efficacy (pharmacological
activity and traditional efficacy), and their
correlations, and is a basic tool for research
and development of Chinese medicine and
phytomedicine resources. In the framework
of pharmacophylogenetics, the plant taxa
and species genetic relationships are used as
the clue in this book, and the phytochemis-
try, chemotaxonomy, molecular biology, and
phylogenetic relationships of representative
medicinal tribes and genera, as well as their
relevance to therapeutic efficacy, are dis-
coursed systematically.
There are many disciplines related to phar-
macophylogeny. In the process of writing, a
lot of recent research literature is referenced.
In combination with the author’s own experi-
mental data, this book attempts to reflect the
latest progress in related fields and enrich the
ix
connotation of pharmacophylogeny research.
The author pays attention to novel concepts
and new technology, conforms to the global
trend of research and development, and
puts forward the concept of pharmacophy-
logenomics. The author advocates the com-
prehensive study of molecular phylogenetic
inferences and chemotaxonomic results,
­
taking into account the treatment outcome,
in order to understand the medicinal plant
genetic relationship. Full attention is paid not
only to the domestic medicinal species but also
to relevant foreign species. The ­ genomics/
metabolomics data should be fully used in
the inference. The contradiction between the
chemotaxonomy and the results of molecu-
lar phylogeny is discussed in a proper way.
Due to the limitation of space, the book is
only an introduction and a compendium. It is
intended to be a spur and enlighten thinking
and promote the cognition of related research-
ers on pharmacophylogeny; the develop-
ment of discipline itself and its application
in medical practice are hopefully promoted.
In the future, we must study more species of
medicinal groups under the guidance of phar-
macophylogeny in order to promote the sus-
tainable utilization of TCM resources and find
new compounds with potential therapeutic
value. The continuous integration of systems
biology and various omics concepts and tech-
niques has opened up a broad space for the
development of pharmacophylogeny.
Ranunculales is an order of flowering plants
and contains the families Ranunculaceae
(buttercup family), B­ erberidaceae, Menisper-
maceae, Lardizabalaceae, C ­ircaeasteraceae,
x Preface
Papaveraceae, and Eupteleaceae. Ranuncula-
les belongs to the basal eudicots. It is the most
basal clade in this group and is sister to the
remaining eudicots. Medicinal plants of this
order, for example, poppies and barberries
(Fig. 1), and buttercups, provide myriad phar-
maceutically active components, which have
been commonly used in TCM and worldwide
ethnomedicine since the beginning of civili-
zation. Increasing interest in Ranunculales
plant-based medicinal resources have led to
additional discoveries of many novel com-
pounds, such as alkaloids, saponins, terpe-
noids, glycosides, and phenylpropanoids, in
various species, and to extensive investiga-
tions on their chemodiversity, biodiversity,
and pharmacotherapy. Based on my studies
of plant pharmacophylogeny and my first
Elsevier book Medicinal Plants: Chemistry,
Biology and Omics, this book presents com-
prehensive commentary on the phytochemis-
try, chemotaxonomy, molecular biology, and
phylogeny of selected Ranunculales families
and genera and their relevance to drug effi-
cacy. Exhaustive literature searches are used
to characterize the global trend in the flexible
technologies being applied and fruitful data
therefrom. The interrelationship between
Chinese ­species and between Chinese ­species
FIGURE 1 Mahonia fortunei of Berberidaceae, taken in
Xi’an Botanical Garden, China.

and non-Chinese species is inferred by the
molecular phylogeny based on nuclear and
chloroplast DNA sequences. The conflict
between chemotaxonomy and molecular
phylogeny is revealed and discussed within
the context of drug discovery and devel-
opment. It is indispensable to study more
Ranunculales species for both the sustain-
able conservation/utilization of medicinal
resources and mining novel chemical entities
with potential clinical efficacy. Systems biol-
ogy and high-resolution omics technologies
(genomics, epigenomics, transcriptomics,
proteomics, metabolomics, etc.) will acceler-
ate the pharmaceutical research involving
bioactive compounds of Ranunculales.
FEATURES OF THIS BOOK
1. Offers the current perception of biodiver-
sity and chemodiversity of Ranunculales
medicinal plants.
2. Explains how the conceptual framework
of plant pharmacophylogeny benefits the
sustainable exploitation of Ranunculales
pharmaceutical resources.
3. Describes how Ranunculales medicinal
plants work from the chemical level
upward.
4. Discusses how polypharmacology of
Ranunculales compounds inspire new
chemical entity design and development
for improved treatment outcome.
The book is written as a reference for
graduate and senior undergraduate students,
researchers, and professionals in medici-
nal plant, phytochemistry, pharmacognosy,
molecular biology, biotechnology, and agri-
culture and pharmacy within the academic
and industrial sectors. Students and research-
ers in pharmacology, medicinal chemistry,
plant systematics, food and nutrition, clinical
medicine, evolution and ecology, as well as
professionals in pharmaceutical industries,
 Preface
might also be interested in the plants dis-
cussed in this book.
This book is supported by Academic
Publication Fund of Dalian Jiaotong Uni-
versity. Friends and colleagues in many
parts of the world lent support to this book.

xi
We would like to thank all those who have
published the findings that we cite in the
chapters. Special thanks go to the project
editor, Dr. Glyn Jones, from Elsevier and
his group for their interest, support, and
encouragement.
Page left intentionally blank
 C H A P T E R

1
Genomics and Evolution
of Medicinal Plants
O U T L I N E

1.1 Introduction 1 1.4 Phenotype Evolution

and Ecology 19
1.2 Evolution of Genome, Gene, and
Genotype 2 1.5 Pharmacophylogeny vs.
1.2.1 Genome Sequencing 2 Pharmacophylogenomics 21
1.2.2 Chloroplast Genome Evolution 4 1.5.1 Concept 21
1.2.3 Mitochondria (mt) Genome 1.5.2 Molecular Phylogeny and
Evolution 7 Therapeutic Utility 22
1.2.4 Nuclear Genome Evolution 8 1.5.3 Chinese Medicinal Plants 24
1.2.5 Transcriptome 12 1.5.4 Aconitum 26
1.2.6 Evolution and Population
1.6 Conclusion and Prospects 28
Genetics/Genomics 14
References 28
1.3 Mechanisms of Species Evolution
and Diversification 17

1.1 INTRODUCTION

There are more than 300,000 species of extant seed plants around the globe (Jiao
et al., 2011a,b). About 60% of plants have medicinal use in post-Neolithic human history. Now-
adays, people collect plants for medicinal use from not only wild environments but also arti-
ficial cultivation, which is an indispensable part of human civilization. There are over 10,000
medicinal plant species in China, accounting for c. 87% of the Chinese materia medica (CMM)
(Chen et al., 2010). Medicinal plants are also essential raw materials of many chemical drugs,
for example, the blockbuster drugs for antimalarial and anticancer therapies. Currently more
than one-third of clinical drugs are from botanical extracts and/or their derivatives. Unfor-
tunately, most medicinal plants have not been domesticated, and currently there is no toolkit
Ranunculales Medicinal Plants. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-814232-5.00001-0
Copyright © 2018 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1
2 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

FIGURE 1.1 Taxus cuspidata var. nana. Source: Taken in Dalian Jiaotong University, China.

to improve their medicinal attributes for better clinical efficacy. Immoderate harvesting has
led to a supply crisis of phytomedicine, exemplifying in taxane-producing Taxus plants (Hao
et al., 2012a) (Fig. 1.1). On the other hand, successful domestication and improvement are not
realistic without deeper insights into the evolutionary pattern of medicinal plant genomes.
Artificial selection can be regarded as an accelerated and targeted natural selection. Studies of
medicinal plant genome evolution are crucial to not only the ubiquitous mechanisms of plant
evolution and phylogeny but also plant-based drug discovery and development, as well as
the sustainable utilization of plant pharmaceutical resources. This chapter presents a prelimi-
nary examination of the recent developments in medicinal plant genome evolution research
and summarizes the benefits, gaps, and prospects of the current research topics.

1.2 EVOLUTION OF GENOME, GENE, AND GENOTYPE

1.2.1 Genome Sequencing

The genomic studies of medicinal plants lag behind those of model plants and important
crop plants. The genome sequences encompass essential information of plant origin, evolu-
tion, development, physiology, inheritable traits, epigenomic regulation, etc. These elements
are the premise and foundation of deciphering genome diversity and chemodiversity (espe-
cially various secondary metabolites with potential bioactivities) at the molecular level. The
high-throughput sequencing of medicinal plants could not only shed light on the biosynthetic
pathways of medicinal compounds, especially secondary metabolites (Boutanaev et al., 2015),
and their regulation mechanisms but also play a major role in the molecular breeding of high-
yield medicinal cultivars and molecular farming of transgenic medicinal strains.
A few principles should be considered when selecting medicinal plants for whole genome
sequencing projects. First, the source plants of well-known and expensive CMMs or impor-
tant chemical drugs that are in heavy demand have priority, for example, Panax ginseng
(Chen et al., 2011; Zhao et al., 2015) and Artemisia annua (Moses et al., 2015) (Fig. 1.2); second,
the representative plants whose pharmaceutical components are relatively unambiguous
and that have typical secondary metabolism pathways, for example, Salvia medicinal plants
(Hao et al., 2015a,b); third, the characteristic plants that are in the large medicinal genus/
family, such as Glycyrrhiza uralensis (Chinese liquorice; Fabaceae) (Hao et al., 2012b, 2015c)


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 3

FIGURE 1.2 Artemisia annua of Asteraceae. Source: Taken in Tashilunpo Monastery, Tibet, China.

and Lycium chinense (Chinese boxthorn; Solanaceae) (Yao et al., 2011); fourth, the medicinal
plants that are potential model plants and have considerable biological data; and last, the
medicinal plants whose genetic backgrounds are known, with reasonably small diploid
genomes and relatively straightforward genome structures, are preferred.
As there is a lack of comprehensive molecular genetic studies for most medicinal plants,
it is vital to have some preliminary genome evaluations before the whole genome sequenc-
ing. First, DNA barcoding techniques (Hao et al., 2012c) could be used to authenticate the
candidate species; second, karyotypes should be determined by observing metaphase
chromosomes; and last, flow cytometry and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) (Hao
et al., 2011b, 2015b) could be chosen to determine the ploidy level and genome size. For
example, flow cytometry was used to determine the genome size of four Panax species (Pan
et al., 2014), with Oryza sativa as the internal standard. Panax notoginseng (San Qi in traditional
Chinese medicine (TCM)) has the largest genome (2454.38 Mb), followed by P. pseudogin-
seng (2432.72 Mb), P. vietnamensis (2018.02 Mb), and P. stipuleanatus (1947.06 Mb), but their
genomes are smaller than the Pa. ginseng genome (∼3.2 Gb). A more reliable approach for
species without the reference genome is the genome survey via the whole genome shotgun
sequencing ­(Polashock et al., 2014). Such nondeep sequencing (30 × coverage), followed by
the bioinformatics analysis, is highly valuable in assessing the genome size, heterozygos-
ity, repeat sequence, guanine/cytosine (GC) content, etc., facilitating the decision-making of
the whole genome sequencing approaches. In addition, RAD-Seq (restriction-site associated
DNA sequencing; Fig. 1.3) (Rubin et al., 2012) could be chosen to construct a RAD library and
perform the low-coverage genome sequencing of reduced representation, which is an effec-
tive approach for assessing the heterozygosity of the candidate genome.
The whole genome sequencing platform is chosen based on the budgetary resources and
the preliminary evaluation of candidate genomes (Chen et al., 2010). GS FLX or Illumina HiSeq
2500 platforms might be suitable for the small simple genome. However, the majority of the
plant genomes belong to the complex genome, which refers to the diploid/polyploidy genome,
with >50% repeat sequences and >0.5% heterozygosity. Two or more sequencing platforms
could be combined for shotgun and paired-end sequencing, while large insert libraries, for
example, BAC (bacterial artificial chromosome) (Hao et al., 2015b), yeast artificial chromosome
(Noskov et al., 2011), and Fosmid (Hao et al., 2011b), can be constructed for sequencing, then


4 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

FIGURE 1.3 Technology roadmap of RAD-Seq and its utility in population evolution and genetic map. InDel,
Insertion and deletion; PCA, principal component analysis; PE, paired end; QC, quality control; QTL, quantitative
trait loci; SV, splice variant.

the s­ ophisticated bioinformatics softwares (Cai et al., 2015; Chalhoub et al., 2014; Denoeud
et al., 2014; Kim et al., 2014; Qin et al., 2014) can be used for sequence quality control and
assembly. For instance, GS FLX and shotgun sequencing can be used for the initial genome
assembly to generate 454 contigs, then the paired-end sequencing data from the Illumina
HiSeq or SOLiD platform can be used to determine the order and orientation of 454 contigs,
thus generating scaffolds. Next, Illumina HiSeq or SOLiD data are used to fill the gaps between
some contigs. These steps streamline the genome sequencing pipeline as a whole.
The genetic map and physical map are fundamental tools for the assembly of the complex
plant genome and functional genomics research. The genetic linkage map of Bupleurum chinense
(Bei Chai Hu in TCM) was constructed using 28 ISSR (intersimple sequence repeat) and 44 SSR
(microsatellite) markers (Zhan et al., 2010); 29 ISSRs and 170 SRAPs (sequence-related ampli-
fied polymorphisms) were mapped to 25 linkage groups of Siraitia grosvenorii (Luo Han Guo in
TCM) (Liu et al., 2011). These preliminary results are useful in metabolic gene mapping, map-
based cloning, and marker-assisted selection of medicinal traits. The high-throughput physical
map could be anchored via the BAC-pool sequencing (Cviková et al., 2015), which, along with
its integration with high-density genetic maps, could benefit from next generation sequencing
(NGS) and high-throughput array platforms (Ariyadasa and Stein, 2012). The development of
dense genetic maps of medicinal plants is still challenging, as the parental lines and their prog-
enies with the unambiguous genetic link are not available for most medicinal plants.

1.2.2 Chloroplast Genome Evolution

Chloroplast (cp) is responsible for photosynthesis, and its genome sequences have versatile
utility in evolution, adaptation, and robust growth of most medicinal plants. The substitution


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 5
rate of the cp nucleotide sequence is three to four times faster than that of the mitochondria
(mt) sequence (Zhao et al., 2015), implicating more uses of the former in inferring both inter-
specific and intraspecific evolutionary relationships (Ma et al., 2014; Malé et al., 2012; Qian
et al., 2013; Su et al., 2014; Wu et al., 2013; Xu et al., 2012; Zhao et al., 2015).
Pa. ginseng is a “crown” TCM plant and frequently used in health-promoting food and
clinical therapy. NGS technology provides insight into the evolution and polymorphism of
Pa. ginseng cp genome (Zhao et al., 2015). The cp genome length of Chinese Pa. ginseng culti-
vars Damaya (DMY), Ermaya (EMY), and Gaolishen (GLS) was 156,354 bp, while the genome
length was 156,355 bp in wild ginseng (YSS), which is smaller than Omani lime (C. auran-
tiifolia; 159,893 bp) (Su et al., 2014) and 12 Gossypium cp genomes (159,959–160,433 bp) (Xu
et al., 2012) but bigger than Rhazya stricta cp genome (154,841 bp) (Park et al., 2014). Gene
content, GC content, and gene order in DMY are quite similar to other strains, and nucleo-
tide sequence diversity of inverted repeat region (IR) is lower than that of large single-copy
region (LSC) and small single-copy region (SSC). The high-resolution reads were mapped to
the genome sequences to investigate the differences of the minor allele, which showed that
the cp genome is heterogeneous during domestication; 208 minor allele sites with minor allele
frequencies of ≥0.05 were identified. The polymorphism site numbers per kb cp genome of
DMY, EMY, GLS, and YSS were 0.74, 0.59, 0.97, and 1.23, respectively. All minor allele sites
were in LSC and IR regions, and the four strains showed the same variation types (substi-
tution base or indel) at all identified polymorphism sites. The minor allele sites of the cp
genome underwent purifying selection to adapt to the changing environment during domes-
tication. The study of medicinal plant cp genomes with particular focus on minor allele sites
would be valuable in probing the dynamics of the cp genomes and authenticating different
strains and cultivars.
The genus Citrus contains many economically important fruits that are grown worldwide
for their high nutritional and medicinal value. Due to frequent hybridizations among species
and cultivars, the exact number of natural species and the evolutionary relationships within
this genus are blurred. It is essential to compare the Citrus cp genomes and to develop suit-
able genetic markers for both basic research and practical use. A reference-assisted approach
was adopted to assemble the complete cp genome of Omani lime (Su et al., 2014), whose orga-
nization and gene content are similar to most rosid lineages characterized to date. Compared
with the sweet orange (Ci. sinensis), three intergenic regions and 94 simple sequence repeats
(SSRs) were identified as potentially informative markers for resolving interspecific relation-
ships, which can be harnessed to better understand the origin of domesticated Citrus and
foster the germplasm conservation. A comparison among 72 species belonging to 10 families
of representative rosid lineages also provides new insights into their cp genome evolution.
The monocot family Orchidaceae, evolutionarily more ancient than asterids and rosids,
is one of the largest angiosperm families, including many medicinal, horticultural, and
ornamental species. Orchid phytometabolites display antinociceptive (Morales-Sánchez
et al., 2014), antiangiogenic (Basavarajappa et al., 2014), and antimycobacterial (Ponnuchamy
et al., 2014) activities, etc. In South Asia, orchid bulb is used for the treatment of asthma,
bronchitis, throat infections, and dermatological infections and also used as a blood purifier
(Nagananda and Satishchandra, 2013). Sequencing the complete cp genomes of the medicinal
plant Dendrobium officinale (Tie Pi Shi Hu in TCM) and the ornamental orchid Cypripedium
macranthos reveals their gene content and order, as well as potential RNA-editing sites (Luo
et al., 2014). The cp genomes of these two species and five known photosynthetic orchids are


6 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

similar in structure as well as gene order and content, but the organization of the IR/SSC
junction and ndh gene is distinct. IRs flanking the SSC region underwent expansion or con-
traction in different Orchidaceae species. Fifteen highly divergent protein-coding genes were
identified and are useful in phylogenetic inference of orchids. Cp phylogenomic analysis can
be used to resolve the interspecific relationship that cannot be inferred by a few cp markers.
Bamboo leaves are used as a component in TCM for the antiinflammatory function (Koide
et al., 2011). Medicinal bamboo cupping therapy is applied to reduce fibromyalgia symptoms
(Cao et al., 2011). Bamboo extracts exhibit antioxidant effects (Jiao et al., 2011a,b) and are used
to treat chronic fever and infectious diseases (Wang et al., 2012). The whole cp genome data
sets of 22 temperate bamboos considerably increased resolution along the backbone of tribe
Arundinarieae (temperate woody bamboo) and afforded solid support for most relationships
regardless of the very short internodes and long branches in the tree (Ma et al., 2014). An
additional cp phylogenomic study, involving the full cp genome sequences of eight Olyreae
(herbaceous bamboo) and 10 Arundinarieae species, strengthened the soundness of the above
study and recovered monophyletic relationship between Bambuseae (tropical woody bamboo)
and Olyreae (Wysocki et al., 2015).
The monocot genus Fritillaria (Liliaceae) has about 140 species of bulbous perennial plants
that embraces taxa of both horticultural and medicinal importance. The bulbs of plants belong-
ing to the Fritillaria cirrhosa group have been used as antitussive and expectorant herbs in TCM
for thousands of years (Wu et al., 2015). The anticancer activity and cardiovascular effects of
­Fritillaria phytometabolites are well documented (Hao et al., 2015c). Fritillaria species have
attracted attention also because of their remarkably large genome sizes, with all values recorded
to date above 30 Gb (Day et al., 2014). A phylogenetic reconstruction, including the most cur-
rently recognized species diversity of the genus, was performed (Day et al., 2014). Three regions
of the cp genome were sequenced in 92 species (c. 66% of the genus) and in representatives of
nine other genera of Liliaceae. Eleven low-copy nuclear genes were screened in selected species,
but they had limited utility in phylogenetic reconstruction. Phylogenetic analysis of a com-
bined plastid data set supported the monophyly of the majority of presently identified subgen-
era. However, the subgenus Fritillaria, which is by far the largest subgenera and includes the
most important species used in TCM, is found to be polyphyletic. Clade, containing the source
plants of Chuan Bei Mu, Hubei Bei Mu, and Anhui Bei Mu, might be treated as a separate
subgenus (Hao et al., 2013a). The Japanese endemic subgenus Japonica, which contains the spe-
cies with the largest recorded genome size for any diploid plant, is sister to the largely Middle
Eastern and Central Asian subgenus Rhinopetalum, which is significantly incongruent with the
nuclear internal transcribed spacer (ITS) tree. Convergent or parallel evolution of phenotypic
traits may be a common cause of incongruence between morphology-based classifications and
the results of molecular phylogeny. While relationships between most major Fritillaria lineages
can be resolved, these results also highlight the need for data from more independently evolv-
ing loci, which is pretty perplexing given the huge nuclear genomes found in these plants.
Medicinal plant diversity, comprised of genetic diversity, medicinal species diversity,
ecological system diversity, etc. (Hao et al., 2014a), results from the intricate interactions
between medicinal plant and environment, and thus is profoundly influenced by the eco-
logical complex and the relevant versatile ecological processes. The effects of the evolution-
ary processes have to be taken into full consideration when explaining the link between
climatic/ecological factors and medicinal plant diversity, especially where there is strong,
uneven differentiation of species. A distinguished example is the “sky islands” of Southwest


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 7
China (He and Jiang, 2014), where the extraordinarily rich resources of medicinal plants
rose and thrived during the Quaternary Period. To date, many medicinal tribes and gen-
era, for example, Pedicularis (Eaton and Ree, 2013) (Fig. 1.4), Clematis (Hao et al., 2013b),
Aconitum (Hao et al., 2013c, 2015d,e), and Delphinium (Jabbour and Renner, 2012), are still
in the process of rapid radiation and dynamic differentiation. The cp genome sequence can
be regarded as the super-barcode of the organelle scale and thus can be used to probe the
intraspecific variations (Whittall et al., 2010) and phylogeographic patterns of the same spe-
cies in the disparate geographic locations (e.g., geoherb or Daodi medicinal materials) (Zhao
et al., 2012). The application of the cp genome sequence at the population level may provide
clues for the timing and degree of the intraspecific differentiation. Distilling the interpopu-
lation relationship from the cp data set can be considered a more detailed phylogenetic
reconstruction.

1.2.3 Mitochondria (mt) Genome Evolution

Some fundamental evolution concepts, such as lateral gene transfer, are bolstered by the
inquiry of the origin of mt, while plants are especially useful inelucidating the mechanisms of
cytonuclear coevolution. Although the gene order of the mt genome might evolve relatively
faster in land plants, the substitution rate of its nucleotide sequence is merely 1/100 that of its
animal sequence (Hao et al., 2014a). Therefore, the mt genome sequence is less useful than the
cp one in inferring the phylogenetic relationship of medicinal species (Henriquez et al., 2014).
Notwithstanding, analyzing genome sequences contributes knowledge about the evolution
of the mt genome. Moreover, the terpene synthase has been found in mt (Hsu et al., 2012),
highlighting its utility in secondary metabolism.
R. stricta (Apocynaceae) is native to arid regions in South Asia and the Middle East and is used
extensively in folk medicine. Analyses of the complete cp and mt genomes and a nuclear (nr)
transcriptome of Rhazya shed light on intercompartmental transfers between genomes and the
patterns of evolution among eight asterid mt genomes (Park et al., 2014). The Rhazya genome is

FIGURE 1.4 Pedicularis longiflora of Scrophulariaceae. Source: Taken in Dingri County, Tibet, China.


8 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

highly conserved with gene content and order identical to the ancestral organization of angio-
sperms. The 548,608 bp mt genome contains recombination-derived repeats that generate a
compound organization; transferred DNA from the cp and nr genomes as well as bidirectional
DNA transfers between the mt and the nucleus are also disclosed. The mt genes sdh3 and rps14
have been transferred to the nucleus and have acquired targeting transit peptides. Two copies
of rps14 are present in the nucleus; only one has the mt targeting transit peptide and may be
functional. Phylogenetic analyses suggest that Rhazya has experienced a single transfer of this
gene to the nucleus, followed by a duplication event. The phylogenetic distribution of gene
losses and the high level of sequence divergence in targeting transit peptides suggest mul-
tiple independent transfers of both sdh3 and rps14 across asterids. Comparative analyses of mt
genomes of eight asterids indicates a complicated evolutionary history in this thriving eudicot
clade, with substantial diversity in genome organization and size, repeat, gene and intron con-
tent, and amount of alien DNA from the cp and nr genomes. The genomic data enable a rigor-
ous inspection of the gene transfer events.

1.2.4 Nuclear Genome Evolution

1.2.4.1 Monocots
The whole cp genome data set is not enough to elucidate the phylogenetic relationship of
groups undergoing rapid radiation, for example, Zingiberales (Barrett et al., 2014). The cp
genome is equivalent to one gene locus, thus it only represents one fulfillment to the coales-
cent random processes and cannot be used with confidence to reconstruct the evolutionary
history of the populations. The most genetic history of any medicinal plant hides in the nr
genome.
High-throughput sequencing and the relevant bioinformatics advances have revolution-
ized contemporary thinking on nuclear genome/transcriptome evolution and provided basic
data for further breeding endeavors. Coix (Poaceae), a closely related genus of Sorghum and
Zea, has 9–11 species with different ploidy levels. The exclusively cultivated C. lacryma-jobi
(2n = 20) is widely used in East and Southeast Asia as food and traditional medicine. C. aquat-
ica has three fertile cytotypes (2n = 10, 20, and 40) and one sterile cytotype (2n = 30), C. aquatica
HG, which is found in Guangxi of China (Cai et al., 2014). Low coverage genome sequencing
(genome survey) showed that around 76% of the C. lacryma-jobi genome and 73% of the C.
aquatica HG genome are repetitive sequences, among which the long terminal repeat (LTR)
retrotransposable elements dominate, but the proportions of many repeat sequences vary
greatly between the two species, suggesting their evolutionary divergence. A novel 102 bp
variant of centromeric satellite repeat CentX and two other satellites are exclusively found in
C. aquatica HG. The FISH analysis and fine karyotyping showed that C. lacryma-jobi is likely
a diploidized paleotetraploid species, and C. aquatica HG is possibly from a recent hybridiza-
tion. These Coix taxa share more coexisting repeat families and higher sequence similarity
with Sorghum than with Zea, which agrees with the phylogenetic relationship.
The heterozygous genome sequences of the tropical epiphytic orchid Phalaenopsis eques-
tris provide insights into the unique crassulacean acid metabolism (CAM) (Cai et al., 2015).
The assembled genome contains 29,431 predicted protein-coding genes and is rich in genes
that might be involved in self-incompatibility pathways, which ensure the genetic diversity
and enhance the fitness and survival. An orchid-specific paleopolyploidy event is disclosed,


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 9
which preceded the radiation of most orchid clades, and gene duplication might have con-
tributed to the evolution of CAM photosynthesis in Ph. equestris. The expanded and diversi-
fied families of MADS-box C/D-class, B-class AP3, and AGL6-class genes might contribute to
the highly specialized morphology of orchid flowers. LTRs are the most abundant transpos-
able element (Fig. 1.5), followed by long interspersed nuclear elements (LINEs).

1.2.4.2 Basal Eudicots

The Macleaya cordata (Papaveraceae, Ranunculales) genome covering 378 Mb encodes 22,328
predicted protein-coding genes, with 43.5% being transposable elements (Liu et al., 2017).
As a member of basal eudicots, this genome lacks the paleohexaploidy event that occurred
in almost all eudicots. From the genomics data, all 16 metabolic genes for sanguinarine and
chelerythrine biosynthesis were retrieved, and the biochemical activities of 14 genes were
validated. These genomics and metabolic data show the conserved benzylisoquinoline alka-
loid (BIA) metabolic pathways in M. cordata and provide the knowledge base for future pro-
ductions of BIAs by crop improvement or microbial pathway reconstruction.

1.2.4.3 Eudicots: Asterids

Whole genome sequencing has been implemented in the representative species of some
plant families/genera (Fig. 1.6), for example, Capsicum annuum (Kim et al., 2014; Qin
et al., 2014), Coffea canephora (Denoeud et al., 2014), Brassica napus (Chalhoub et al., 2014),
and Ph. equestris (Cai et al., 2015). The genome sequences of the cultivated pepper Zunla-1
(Cap. annuum) and its wild progenitor Chiltepin (Cap. annuum var. glabriusculum) were
compared to provide insights into Capsicum domestication and specialization. The pepper
genome expanded ∼0.3 Mya by a rapid amplification of retrotransposon elements, resulting
in a genome containing ∼81% repetitive sequences and 34,476 protein-coding genes. Com-
parison of cultivated and wild pepper genomes with 20 resequencing accessions revealed

FIGURE 1.5 Categories of transposable elements predicted in the orchid genome (Cai et al., 2015). DNA, DNA
transposon; LINE, long interspersed element (retrotransposon); LTR, long terminal repeat (retrotransposon); SINE,
short interspersed nuclear element (retrotransposon).


10 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

FIGURE 1.6 Examples of the phylogeny and genome duplication history of core eudicots. Arrowheads indicate
hexaploidization; triangles indicate tetraploidization. The current evidence does not suggest further polyploidization
after speciation in the genomes of potato, eggplant, chili pepper, tobacco, coffee, grape, papaya, cacao, strawberry,
and peach. Few genome data are available in pepino, tomatillo, and many other species.

­ olecular signatures of artificial selection, providing a list of candidate domestication genes

m
(Qin et al., 2014). Dosage compensation effect of tandem duplication genes might contribute
to the pungency divergence in pepper (Qin et al., 2014). The Capsicum reference genome,
along with tomato and potato genomes, provides critical information for the study of the
evolution of other Solanaceae species, including the well-known Atropa medicinal plants.
The highly heterozygous Salvia miltiorrhiza (Danshen, Lamiaceae) genome was assembled
with the help of 395× raw read coverage using Illumina technologies and about 10× raw read
coverage using single molecular sequencing technology (Zhang et al., 2015). The final draft
genome is approximately 641 Mb, with a contig N50 size of 82.8 kb and a scaffold N50 size of
1.2 Mb. Further analyses predicted 34,598 protein-coding genes and 1644 unique gene fami-
lies in the Danshen genome, which provides a valuable resource for the investigation of novel
bioactive compounds in this traditional Chinese herb.
One of the milestone breakthroughs is the successful sequencing and assembly of the com-
plex heterozygous genome. The heterozygous genome of Co. canephora has been deciphered
(Denoeud et al., 2014), and it displays a conserved chromosomal gene order among aste-
rid angiosperms. Although it shows no sign of the whole-genome triplication identified in
Solanaceae species, the genome includes several species-specific gene family expansions, for
example, N-methyltransferases (NMTs) involved in caffeine biosynthesis, defense-related
genes, and alkaloid and flavonoid enzymes involved in secondary metabolite production.
Caffeine NMTs expanded through sequential tandem duplications independently and are
distinct from those of cacao and tea, suggesting that caffeine in eudicots is of polyphyletic
origin and its biosynthesis underwent convergent evolution.


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 11
The 3.5-Gb genome of Pa. ginseng contains more than 60% repeats and encodes 42,006
predicted genes (Xu et al., 2017). Twenty-two transcriptome data sets and mass spectrom-
etry images of ginseng roots were used to precisely quantify the functional genes. Thirty-one
genes were identified to be involved in the ginsenoside biosynthetic mevalonic acid pathway,
eight of which were 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases. A total of 225 UDP-glyco-
syltransferases (UGTs) were identified, which constitute one of the largest gene families of
ginseng. Tandem repeats contributed to the duplication and divergence of UGTs. Molecular
modeling of UGTs in the 71st, 74th, and 94th families revealed a regiospecific conserved motif
at the N-terminus, which captures ginsenoside precursors. The ginseng genome represents a
valuable resource for understanding and improving the breeding, cultivation, and synthetic
biology of this king of TCM.
Pan. notoginseng experienced a series of genome evolution events that created the unique
medicinal properties of this famous medicinal plant (Chen et al., 2017; Zhang et al., 2017).
For example, a recent polyploidy event occurred about 26 million years ago, and there were
a large number of specific duplications of triterpenoid biosynthesis-related gene families;
genes related to triterpenoid saponin biosynthesis formed many gene clusters. Compara-
tive genomics, transcriptomics, and comparative phytochemistry further confirmed that the
rapid functional variation and evolution of genomes determines the chemodiversity, which is
closely related to the therapeutic efficacy of Pan. notoginseng. Most genes associated with the
saponin biosynthesis are mainly expressed in flowers and leaves; after synthesis, saponins
could be transported and stored in the roots. This discovery subverts the view that the Pan.
notoginseng saponins are synthesized in the roots.
The highly heterozygous Erigeron breviscapus genome was assembled using a combination
of PacBio, single-molecular, real-time sequencing and next-generation sequencing methods
on the Illumina HiSeq platform (Yang et al., 2017). The final draft genome is around 1.2 Gb,
with contig and scaffold N50 sizes of 18.8 kb and 31.5 kb, respectively. Further analyses pre-
dicted 37,504 protein-coding genes in the E. breviscapus genome and 8172 shared gene families
among the Compositae species.

1.2.4.4 Gene Family

More than 40 plant genomes have been sequenced, representing a diverse set of taxa of agri-
cultural, energy, medicinal, and ecological importance (Cai et al., 2015; Chalhoub et al., 2014;
Denoeud et al., 2014; Kim et al., 2014; Qin et al., 2014). Gene family members are often inferred
from DNA sequence homology, but deeper insights into evolutionary processes contributing
to gene family dynamics are imperative. In a comparative genomics framework, multiple
lines of evidence can be generated by gene synteny, sequence homology, and protein-based
hidden Markov modeling (HMM) to extract homologous super-clusters composed of multi-
domain resistance (R)-proteins of the NB-LRR (nucleotide binding-leucine rich repeat) type,
which are involved in plant innate immunity (Hofberger et al., 2014). Twelve eudicot plant
genomes were screened to assess the intra- and interspecific diversity of R-proteins, where
2363 NB-LRR genes were found. Half of the R-proteins have tandem duplicates, and 22% of
gene copies are left from ancient polyploidy events (ohnologs, whole genome duplication
duplicates). The positive Darwinian selection and major differences in molecular evolution
rates (Ka/Ks) were detected among tandem (mean = 1.59), ohnolog (1.36), and singleton (1.22)
R-gene duplicates. The distribution pattern of all 140 NB-LRR genes present in the model


12 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

plant Arabidopsis is species specific, and four distinct clusters of NB-LRR “gatekeeper” loci
sharing syntenic orthologs across all analyzed genomes were identified and could be useful
for the gene-edited plant breeding. The near-complete set of multidomain R-protein clusters
in a eudicot-wide scale could shed light on evolutionary dynamics underlying diversification
of the plant innate immune system. More functional NB-LRR genes could be identified from
more sequenced plant species.
The estimated upper limit of extant plants is c. 450,000, indicating the potentially enor-
mous biological space. The multiple and recurrent genome duplications during plant evolu-
tion result in the generation of novel biosynthetic pathways of diverse medicinal compounds,
which are frequently involved in plant defense and disease resistance and, more importantly,
create huge chemical space for drug discovery and development. The duplicated gene copies
could explain the diversification processes of the multigene secondary metabolism pathways,
such as those involved in the biosynthesis of terpenoids (Boutanaev et al., 2015), benzoxa-
zinoid (Dutartre et al., 2012), steroidal glycoalkaloid (Manrique-Carpintero et al., 2013), and
glucosinolates (Hofberger et al., 2013). More than 200,000 secondary metabolites have been
found in angiosperms, many of which could stem from the genome duplication-based rapid
innovation of complex traits (Hao et al., 2014a).

1.2.4.5 Single Copy Gene

Single copy genes are common across angiosperm genomes. Based on 29 sufficiently high-
quality sequenced genomes, the large-scale identification and evolutionary characterization
of single copy genes among multiple species is possible (Han et al., 2014). A significant nega-
tive correlation was found between the number of duplicate blocks and the number of sin-
gle copy genes. Only 17% of single copy genes are located in organelles, most of which are
involved in binding and catalytic activity. Most single copy genes are in nuclear genomes.
Single copy genes have a stronger codon bias than nonsingle copy genes in eudicots (Han
et al., 2014). The relatively high expression level of single copy genes was partially confirmed
by the RNA-Seq (transcriptome sequencing) data. Unlike in most other species, there is a
strong negative correlation between Nc (effective number of codons) and GC3 (G + C content
at third codon position) of single copy genes in grass genomes. Compared to nonsingle copy
genes, single copy genes are of more conservation, as indicated by Ka and Ks values. Selective
constraints on alternative splicing are weaker in single copy genes than in low-copy fam-
ily genes (1–10 paralogs) and stronger than high-copy family genes (>10 paralogs). Using
concatenated, shared, single copy genes, a well-resolved phylogenetic tree can be obtained.
Addition of intron sequences improved the branch support, but striking incongruences are
also obvious. Inclusion of intron sequences might be more appropriate for the phylogenetic
reconstruction at lower taxonomic levels. Evolutionary constraints between single copy genes
and nonsingle copy genes are distinct and are somewhat species specific, especially between
eudicots and monocots.

1.2.5 Transcriptome
The high cost of the whole genome sequencing is still formidable. The accurate sequence
assembly is still challenging, especially when the genome is of a high proportion of repeat
sequences, high heterozygosity, and nondiploid. RNA-Seq is a powerful tool for the


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 13
a­ssessment of gene expression and the identification and characterization of molecular
markers in nonmodel organisms (Hao et al., 2012b). Unlike genome sequences, the intron
sequences are not included in the RNA-Seq data set, and the Unigene (contig) assembly is not
disturbed by the repeat sequences and the ploidy level. The global view of the ethnomedicine
resources and the accurate delimitation of the novel medicinal taxa cannot be achieved with-
out the molecular phylogeny based on the complete taxon sampling of the relevant tribes/
genera. Due to the plummeting cost of RNA-Seq, the dense taxon sampling is now possible in
the phylotranscriptomic studies. It is obvious that the large-scale comparative transcriptome
studies, including those of medicinal plants, are more feasible than comparative genom-
ics based on whole genome sequencing. As shown in National Centre for Biotechnology
Information (NCBI) PubMed, sequence read archive (SRA), and Gene Expression Omnibus
(GEO) databases, transcriptomes of hundreds of medicinal plants have been sequenced, for
example, Caryophyllales (Yang et al., 2015) (Fig. 1.7), Fabaceae (Cannon et al., 2015), Oenothera
(Onagraceae) (Hollister et al., 2015), Rhodiola algida (Crassulaceae) (Zhang et al., 2014), S. sclarea
(Lamiaceae) (Hao et al., 2015a), Polygonum cuspidatum (Polygonaceae) (Hao et al., 2012d), Taxus
mairei (Taxaceae) (Hao et al., 2011a), etc. The single copy orthologous gene sequences could be
extracted from the UniGene data sets of multiple medicinal plants (Hao et al., 2012c), which
can be used in the phylogenetic reconstruction and evolutionary analyses (Hao et al., 2012d;
Yang et al., 2015). The information uncovered in transcriptome studies could serve in the
characterization of important traits related to secondary metabolite formation and in probing
the relevant molecular mechanisms (Hao et al., 2011a, 2012c, 2015a; Zhang et al., 2014).
Reconstructing the origin and evolution of land plants and their algal relatives is a vital
problem in plant phylogenetics and is essential for understanding how novel adaptive traits,
for example, secondary metabolites, arose. Despite advances in molecular systematics, some
evolutionary relationships remain poorly resolved. Inferring deep phylogenies with rapid
diversification is often tricky, and genome-scale data significantly increase the number of
informative characters for analyses. Since the sparse taxon sampling could result in inconsis-
tent results, transcriptome data of 92 streptophyte taxa were generated and analyzed along
with 11 published plant genome sequences (Wickett et al., 2014). Phylogenetic reconstruc-
tions were conducted using 852 nuclear genes and 1,701,170 aligned sites. Robust support
for a sister-group relationship between land plants and one streptophyte green algae, the
Zygnematophyceae, was obtained. Strong and robust support for a clade comprising liverworts
and mosses contradicts the widely accepted view of early land plant evolution. Phylogenetic

FIGURE 1.7 Stellaria chinensis of Caryophyllaceae. Source: Taken in Taibai Mountain, Shaanxi, China.


14 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

hypotheses could be tested using phylotranscriptomic approach to give deeper insights and
novel arguments into the evolution of fundamental plant traits, including the fascinating
chemodiversity.
The transcriptome sequencing also sheds light on other untapped issues of plant evolution.
Arbuscular mycorrhizal (AM) are symbiotic systems in nature and have great significance
in promoting the growth and stress resistance of medicinal plants (Zeng et al., 2013). AM
has multifaceted effects on the active ingredients of TCM plants. The transcriptomes of nine
phylogenetically divergent non-AM symbiosis plants were analyzed to reveal the correlation
between the loss of AM symbiosis and the loss of many symbiotic genes (Delaux et al., 2014),
which was found in four additional plant lineages besides the Arabidopsis lineage (Brassi-
cales), implicating the convergent evolution. RNA-Seq was used to outline gene sequence
and expression discrepancy between cultivated tomato and five allied wild species (Koenig
et al., 2013). Human handling of the genome has profoundly altered the tomato transcrip-
tome via directed admixture and by secondarily choosing nonsynonymous over synonymous
substitutions. A hitherto unidentified paleopolyploidy event that arose 20–40 million years
ago was uncovered based on the transcriptomes of 11 Linum species (Sveinsson et al., 2014),
which is specific to a clade enclosing cultivated flax (L. usitatissimum) and other mainly blue-
flowered species.

1.2.6 Evolution and Population Genetics/Genomics

SSRs play a major role as molecular markers for genome analysis and plant breeding.
The microsatellites existing in the complete genome sequences would have a direct role in
the genome organization, recombination, gene regulation, quantitative genetic variation,
and evolution of genes. Microsatellite markers have been characterized for many medici-
nal plant families and genera, for example, Acanthaceae family (Kaliswamy et al., 2015),
Artemisia genus (Karimi et al., 2015), Camellia genus (Li et al., 2015), Chinese jujube (Wang
et al., 2014), etc. For instance, 11 nuclear SSR loci were used to reveal the relative low genetic
diversity of three Camellia taliensis (Da Li tea) populations, three Ci. sinensis var. assamica (Pu
Er tea in TCM) populations, and two transitional populations of Ca. taliensis. A momentous
genetic differentiation was found between Ci. sinensis var. assamica and Ca. taliensis popu-
lations. The transitional populations of Ca. taliensis stemmed mainly from Ca. taliensis and
underwent genetic differentiation during domestication. Gene introgression was spotted in
the cultivated Ci. sinensis var. assamica and Ca. taliensis of the same tea garden, and genetic
material of Ca. taliensis seemingly intruded into Ci. sinensis var. assamica, suggesting that the
former was genetically involved in the domestication of the latter. These results are useful for
protecting the genetic resources of ancient tea plants. The whole nucleotide sequences—for
example, the genomic sequences (Hao et al., 2015b) or the transcriptomic sequences (Hao
et al., 2012b, 2015a)—of plant species can be obtained from NCBI databases and screened for
the presence of SSRs.
Both ISSR (Hao et al., 2010) and SRAP markers were suitable for discriminating among
the studied individuals, and the SRAP markers were more efficient and preferable (Karimi
et al., 2015). Multiple regression analysis revealed statistically significant associations between
rust resistance and some molecular markers; this can provide clues for identification of the
individuals with higher rust resistance. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) and


 1.2 Evolution of Genome, Gene, and Genotype 15
ISSR markers were used to characterize Schisandra chinensis with white fruit (Li et al., 2014).
The molecular marker-based study of genetic diversity helps in assessing the studied germ-
plasm, which would be a valuable genetic resource for future breeding. Based on such a
study, in situ conservation measures or other methods could be recommended to preserve the
valuable medicinal plant genetic resources.
Sinopodophyllum hexandrum is an endangered Berberidaceae (Ranunculales) medicinal plant,
and its genetic diversity must be protected against habitat loss and anthropogenic factors.
The Qinling Mountains are an Si. hexandrum distribution area, where unique environmen-
tal features highly affect the evolution of the species. ISSR analysis of 32 natural popula-
tions revealed the genetic diversity and population structure of Si. hexandrum in Qinling and
provides reference data for evolutionary and conservation studies (Liu et al., 2014). The 32
populations fell into three major groups, where analysis of molecular variance confirmed sig-
nificant variation among populations. The high genetic differentiation may be attributed to
the limited gene flow within the species. The spatial pattern and geographic locations of dif-
ferent populations are not correlated with one another. In light of the low within-population
genetic diversity, high differentiation among populations, and the increasing anthropogenic
pressure on the species, in situ conservation is proposed to preserve Si. hexandrum in Qinling,
and other populations must be sampled to maintain genetic diversity of the species for the ex
situ preservation.
SNPs (single nucleotide polymorphisms) are much more abundant than SSRs in most spe-
cies (Clevenger et al., 2015), including medicinal plants. The mutation rate of SNPs (10−9 per
locus per generation) is much lower than that of SSRs (10−3–10−4) (Guichoux et al., 2011). Gen-
erally there are only two alleles in each SNP site, while more than 10 alleles can be in each SSR.
The highly polymorphic SSRs are especially suitable for detecting the hybridization between
closely related species and studying the gene flow/introgression (Wee et al., 2015). SSRs are
of lower ascertainment bias and are also good for studying the recent population structure.
Mining suitable SSR sites via transcriptome sequencing data sets is fast and affordable; for
example, 3446 microsatellites are identified from 2718 Unigenes (16.8% of 16,142 assembled
sequences) of the S. sclarea transcriptome (Fig. 1.8). Trinucleotide (1883) is the predominant
microsatellite, followed by dinucleotide (1144) and mononucleotide (315), indicating that
many microsatellites are in translated regions of the expressed genes. CCG/CGG is the pre-
dominant trinucleotide SSR, followed by AAG/CTT and AGC/GCT. AG/CT is the most com-
mon dinucleotide SSR. Of the identified repeats, 601 (19.2%) have sufficient flanking sequence
information to allow for PCR primer design. Intriguingly, many SSR motifs are linked with
unique sequences encoding enzymes involved in phenylpropanoid/terpenoid metabolism.
For instance, SSRs were detected in phenylalanine ammonia-lyase, 4-coumarate-CoA ligase,
hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, flavonoid 3’-hydroxylase, cinnamyl alcohol dehy-
drogenase, and lignan glycosyltransferase sequences, which belong to the phenylpropanoid
pathway; SSRs were also found in 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway genes
(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomer-
ase, 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl
diphosphate synthase), mevalonate pathway genes (mevalonate pyrophosphate decarboxyl-
ase) and other terpenoid biosynthesis genes (isopentenyl diphosphate isomerase, cytochrome
P450 71D18, pinene synthase, squalene synthase, and squalene monooxygenase). These SSRs
might be useful in future breeding and ecological studies. One of the major drawbacks of


16 1. Genomics and Evolution of Medicinal Plants

FIGURE 1.8 SSRs predicted from the Salvia sclarea transcriptome data set (Hao et al., 2012b). Msatcommander
(http://code.google.com/p/msatcommander/) was used to annotate SSRs. BatchPrimer3 (You et al., 2008) was em-
ployed to design PCR primers in the flanking regions of the detected SSRs, setting a minimum product size of 100 bp,
a minimum primer length of 18 bp, a minimum GC content of 30%, a melting temperature between 50°C and 70°C,
and a maximum melting temperature difference between primers of 8°C.

SSRs is the low universality and poor transferability; that is, usually the species-specific SSR
primers have to be developed. The other disadvantage of SSRs is their uncertain mutation
model, which is often simplified to be the stepwise mutation model, but the actual mutation
pattern might be more complicated.
NGS tool kits could provide grist for the medicinal plant phylogeography mill. Sufficiently
abundant SNPs could be identified directly from the genome sequences of the model plants.
Most medicinal plants lack the genomic data; therefore, two alternative strategies can be
adopted. The faster and cheaper one is mining suitable SNP sites via transcriptome sequenc-
ing data sets (Hao et al., 2012b). However, the subsequent PCR primer design might not be
successful, as no information about the intergenic sequences and the introns are available
from the RNA-Seq data. On the other hand, large amounts of SNPs can be obtained by the
simplified genome sequencing, mainly referring to RAD-Seq (Eaton and Ree, 2013) and geno-
typing-by-sequencing (GBS) (He et al., 2014a); although, their reproducibility and reliability
warrant further improvements.
Plants of various evolutionary levels, not only higher plants, are harnessed in TCM and
worldwide ethnomedicine. The caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Dong Chong Xia
Cao in TCM) is one of the most valuable medicinal fungi in the world, and host insects of fam-
ily Hepialidae (Lepidoptera) are a must to complete its life cycle. The genetic diversity and
phylogeographic structures of the host insects are characterized using mtCOI (cytochrome
oxidase subunit I) sequences (Quan et al., 2014). Abundant haplotype and nucleotide diversity
were mainly found in the east edge of the Qinghai-Tibet Plateau (QTP), which is the diversity


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Ampio cappuccio gli ricade sulla fronte, interamente celandogli la
faccia, se non che trasforato in due parti lascia libero vibrare lo
sguardo. Impugna colla destra una spada che tien sollevata in atto
imperante, minaccioso.
Ad un di lui cenno, mortale grandine di dardi e di sassi piomba sugli
attoniti guerrieri. Scossi questi e furenti pei colpi che li flagellano,
non badando a periglio, entrano nelle spumose acque del torrente e
lo varcano, trovando però non pochi ne’ suoi gorghi la morte.
Pervenuti al di là, svaginati gli acciari, s’arrampicano su pei greppi e
le rupi onde raggiungere e punire gli audaci feritori. Ma ad un nuovo
segno del loro misterioso condottiero, gli alpigiani, che di semplici
panni coverti mai sostenere potevano la pugna da vicino con nimici
tutti irti e lucenti di ferro, guadagnano le alture e spariscono.
I Sanguigni dopo tal fatto tennero tra essi consiglio; alcuni opinarono
doversi far ritorno; ma i più, inanimiti dalle parole dell’intrepido
Ubaldo, ripeterono il voto di dar compimento all’impresa e
procedettero arditi, benchè più cauti, nell’interno della valle.
Non sempre lucente splendette l’estivo raggio. Si viddero a mezzo il
dì passare di prospetto frettolose le nubi, ed accavallarsi poscia sulle
erette e nude cime delle torreggianti montagne. Vaste volute salirono
a coprire la faccia del sole: cominciò a fremere il vento e sorse indi a
poco il soffio delle propinque ghiacciaje, che rimescolando quelle
masse di nebbia, abbassavale talora sino al fondo della valle.
Camminano i guerrieri taciturni in ordinanza lungo i margini scoscesi
della Sesia che rumoreggia più cupa. Ma avanzatisi di poco, freccie
e pietre scendono a furia dall’alto e molti gravemente ne percuotono
per gli elmi e le corazze. Vano è per essi alzare gli scudi e dar di
piglio alle spade: invisibile è il nemico.
Squarciasi però ad un tratto il vaporoso velo e mirano sull’irradiato
fianco del monte la schiera formidabile del camuffato Monaco che
stende ver loro la punta del ferro e li fa segno agli incessanti colpi.
Trascorsi brevi momenti si ricongiungono e frammischiano le rotte
nubi e tutto s’invola di nuovo alla vista.
Uno sgomento s’impossessa dell’animo dei guerrieri che vorrebbero
arretrare, ma imperterrito Ubaldo fa sacramento di muovere da solo
al castello se i suoi sono sì vigliacchi da abbandonarlo. Nessuno più
ardisce mostrarsi restìo e riprendono più spediti il viaggio.
Continuamente or da destra or da manca essi vengono saettati, e
sempre al sollevarsi delle nebbie scorgono il Monaco colle sue
bande che sul pendìo dei monti laterali procede a pari passo con
essi.
Raggiunta finalmente è la meta, chè tocco hanno il confine della
valle. Le montagne di fianco divergono allargandosi in anfiteatro
chiuso in fondo dal Rosa che innalza al cielo i suoi candidi gioghi. Al
principiare dell’erta sorge un quadrato castello che va agli angoli ed
al centro munito di rotonde torri colle acute piramidali sommità
vestite di piombo. Ne bagna un lato la nascente Sesia e dietro è
cinto da una selva di larici i cui rami frangiati in verdebruno stanno
vergenti al suolo. È il castello de’ Boniprandi.
Finiva il giorno; eransi dissipate le nebbie, taceva il vento. Quasi si
fosse sciolto nell’aure o l’avessero inghiottito le rupi, il Monaco fatale
era scomparso con tutti i suoi e completa ivi regnava la solitudine.
Gli ultimi fuochi del sole, abbandonato il rimanente della terra,
splendevano ancora sulle nevi dell’alpe e lo pingevano di quel colore
soave che gli fe’ prendere il nome dal più vago de’ fiori.
Condusse Ubaldo i guerrieri e li collocò a conveniente distanza
intorno al castello la cui ferrata porta era serrata saldamente; benchè
non si scorgesse per le mura o sulle torri traccia di sentinella o
d’abitante.
Furono alzate le tende; s’accesero ampie cataste, e molti militi
raccolti nel bosco de’ larici trascelsero gli alberi che venir dovevano il
mattino atterrati onde formare le macchine murali. Inoltratasi la notte,
poste che furono le scolte di spazio in ispazio, posarono i guerrieri
presso i fuochi che s’andavano spegnendo, e giacquero nel sonno.
Quando venne l’ora che salita la luna sopra le più alte vette mandò
obbliquo dai nereggianti monti l’argenteo raggio al fondo della valle,
e biancheggiarono le merlate muraglie, splendettero i plumbei
culmini delle torri, l’audace Ubaldo, cui agitava il desìo di penetrare
l’arcano di che pareva cinto quel castello, volle mirarlo vicino mentre
tutto era silenzio. Colà quindi s’avvia a lenti passi, quand’ecco al suo
appressarsi sorgere sulle mura il Monaco tremendo.
Arretra Ubaldo d’un passo, ma poi quasi da malìa incatenato si
ferma, fiso tenendo lo sguardo a contemplarlo. Terribile allora non
era quanto misterioso il di lui aspetto; le fosche lane che
ricoprivamo, fatte men rudi dalla pallida notturna luce, segnavano
perfetti contorni e parevano l’involucro d’un genio in umane forme.
Immobile rimaneva in mesto e fiero atteggiamento.
Ubaldo sbandita prestamente ogni apprensione, alzata la destra con
voce ferma, esclamò: «Invano, chiunque tu sii, ti ostini a difendere
queste mura: esse hanno ricettato l’iniquo nostro nemico e debbono
cadere. Cedi ai valorosi Sanguigni; cedi e risparmia la vita dei tuoi»
— Giammai — fu l’unica parola che dalle labbra del Monaco
pronunciare s’intese.
Due giorni dopo ogni cosa trovossi in pronto per l’assalto. Le mura
del castello difese da risoluti alpigiani non offrirono agevole
conquisto ai guerrieri d’Ubaldo. Il combattimento fu lungo,
sanguinosissimo. Il Monaco presente per tutto infiammava il
coraggio dei vassalli di Guido che tenevano con eroiche prove
lontani gli assalitori. Ma dai cozzi tremendi d’un ferreo ariete
sconquassata va a terra la porta e i guerrieri si scagliano precipitosi
per entro, nel tempo stesso che superato il muro in più parti altri
padroneggiano il vallo. Si pugna pei portici e nel cortile. Ubaldo che
all’entrare erasi scontrato nel Monaco, nella folla lo perdette di vista.
Ansioso di rinvenirlo ascese le scale seguìto dai più fidi, e lo scorse
all’ingresso della sala d’armi circondato dai pochi tra suoi
sopravvissuti. Questi vengono tosto atterrati dai guerrieri e le spade
del Monaco e d’Ubaldo s’incrocicchiano e si ribattono. Ma sia
lassezza o riportate ferite debole è il braccio del Monaco che
l’avversario incalza vigorosamente. Si va desso ritraendo,
difendendosi, sin che urta in una porta che si spalanca, e nel punto
stesso Ubaldo d’un colpo furioso lo trapassa col ferro. Dà un grido,
vacilla e abbandonata la spada cade ai piedi d’un letto su cui giace
un cadavere.
Commosso e inorridito Ubaldo impone agli accorsi guerrieri di
porgere ogni aita al languente. Vien egli tosto rialzato, gli si
sciolgono le lane, si rigetta dalla fronte il cappuccio, e... oh vista!...
un volume di treccie scende lungo il candido collo sulla maglia
d’acciajo... È la contessa Adelberta! Riapre gli occhi, si sforza a
sollevarsi, e si trascina verso le coltri, ove ricadendo spira sopra la
salma dello sposo, che sottratto vivente alle acque del fiume, venne
dai fidi vassalli portato al suo castello in cui dalla ferita morì.
Ai Sanguigni fece poscia pagar cara quella vittoria il Torniello, che
scampato di là seppe ottenere da Napo Torriano protezione ed
armati.

FINE.
 MACARUFFO VENTURIERO
O LA CORTE DEL DUCA FILIPPO MARIA VISCONTI

Portano a’ lor cappucci le visiere

E mantelline a la cavalleresca
E capezzali, e strette alle ventriere
Coi petti vaghi alla guisa inghilesca
Qualunque donna è più gaja e più fresca
Più tosto il fa per esser fra le belle.
Pecor. Giorn. XVIII.

Se come vennero personificate altre città e nazioni nascesse in capo

ad un poeta epico o lirico o a chi si voglia, di personificare Milano
onde far narrare da lui stesso le proprie vicende dal suo nascere
sino ai nostri dì, egli è certo che s’aprirebbe un campo di cui non vi
sarebbe il più vasto per esaurire tutti gli stili, tutte le immagini, le
figure, i giuochi d’affetto, insomma tutto quanto è possible ottenere
coll’arte del dire. Esso infatti avrebbe nel suo amplissimo monologo
a descrivere i Romani in tutte le fasi della loro grandezza; farebbe
passare in mostra i Galli e i Germani qui discesi, prima seminudi
colle barbe arruffate, armati di clavi e di scuri; poi ricoperti di fitte
maglie e pesanti armature colle lande e le mazze; indi calati di nuovo
con penne agli elmi, loriche dorate, conducendo pesanti bombarde;
ritornati in seguito con cappelli a tre punte e larghi stivali, portando
moschetti e colubrine; e discesi finalmente colle assise succinte, la
bajonetta al fucile, le artiglierie volanti. Avrebbe eziandio a ragionare
a lungo della baldanza spagnuola, e far cenno persino delle aquile
russe e delle lancie cosacche.
Il proposto soggetto dovrebbe poi essere specialmente fecondo di
quelle pagine che la moderna scuola oltremontana chiama palpitanti,
poichè racchiudono descritte con tutta evidenza le angoscie della
disperazione, gli strazj della tortura, del fuoco e dei patiboli. Poche
città per vero dire ebbero nei fasti de’ tormenti a vantarne del genere
della quaresima di Galeazzo o dei forni di Monza, senza parlare
delle gabbie di ferro, delle tanaglie, degli aculei, delle ruote, ch’erano
leggiadrìe sociali, un giorno comuni a tutti i popoli europei. — E chi
potrebbe in tale argomento dimenticare i mastini del duca Giovan
Maria, che venivano unicamente nutriti onde squarciassero gli
uomini, e coi quali inseguiva di notte i cittadini nelle contrade a guisa
di animali feroci? — Il solo nome di lui faceva inorridire, eppure (ch’il
crederebbe!) egli contava appena ventiquattr’anni quando cadde
esanime sotto il ferro de’ congiurati.
Non erano trascorsi che due giorni da che aveva resa l’anima quel
giovine sanguinario, secondo fra i Visconti nella linea Ducale [2],
allorchè l’eroe di questa narrazione, Macaruffo, veniva di buon
mattino alla volta di Milano con un drappello de’ suoi commilitoni,
tutti soldati venturieri, appartenenti alle bande di Facino Cane, il più
celebre e possente condottiero di ventura che fosse allora in Italia.
Il loro numero era di diciotto o venti; marciavano a piedi, disgiunti e
senz’ordine. Portavano gli elmi, le corazze, i cosciali, ma scorgevasi
che non curavano gran fatto il pulimento e la lucentezza di quegli
arnesi, poichè oltre d’essere pieni d’intacchi e d’ammaccature
apparivano tutti neri e irruginiti. Tenevano le spade a bandoliera e
recavano neglettamente abbandonate sulle spalle all’indietro chi le
alabarde e chi le partigiane.
Macaruffo fra quegli uomini d’armi poteva chiamarsi primus inter
pares, vale a dire, che sebbene non avesse un grado speciale,
poichè quella milizia non ammetteva distinzioni subalterne, pure a
causa della predilezione del Conte Facino e della confidenza che gli
era accordata, godeva verso gli altri di una supremazìa che sapeva
esercitare a tempo debito, e, vuolsi dirlo, con profitto di tutti. Le sue
forme però erano poco vantaggiose; una rilevata prominenza che
aveva sul dosso lo faceva apparire tozzo della persona; il suo volto
abbrunito dal sole mostrava lineamenti irregolari e rozzi sebbene i
suoi occhi fossero sommamente vivi e penetranti. Era dotato di
grande scaltrezza; instancabile nella fatica, d’un coraggio senza
limiti, e consacrato con tutta l’anima agli interessi del suo Capo, di
cui la moglie, la contessa Beatrice di Tenda, era stata sua antica
signora.
Nato egli nelle alpi marittime entro il castello dei Lascari conti di
Tenda, era cresciuto insieme alla Contessa, e fanciullo soleva
prestarle ufficio di palafreniero, di guida, di porta-astore, quand’ella
seguiva la caccia nei monti nativi, solendo ella trasceglierlo fra gli
altri valletti, quantunque deforme, siccome il più pronto in ubbidire e
il più destro di tutti. Divenuta sposa di Facino Cane, Beatrice ottenne
dal padre che Macaruffo facesse parte del suo seguito; onde questi
le stette lungo tempo ancora d’appresso, e palesava per lei in ogni
incontro, misto alle memorie di patria e di famiglia, un sentimento di
riconoscenza indistruttibile. Da ciò più grande sembrava rendersi il
suo attaccamento verso lo stesso condottiero Facino, pel quale
sentiva eziandìo quell’enfatica venerazione che sempre ispira nel
soldato avido di gloria un capitano esperto, ardimentoso, che lo
conduce spesso alla vittoria.
Camminava quella mattina Macaruffo di buon passo innanzi agli altri,
e sembrava assorto in pensieri di tale natura che tutta gli
occupassero la mente. La novella dell’uccisione del Duca era
pervenuta al suo orecchio nella rocca di Canturio in Brianza, ove
Facino lo aveva spedito coi compagni tre mesi addietro a rinforzo dei
signori di quel paese, di fazione ghibellina, minacciati dai guelfi
d’Incino; e quasi contemporaneamente aveva ricevuto avviso da
parte di Facino stesso, il quale trovavasi ammalato in Pavia,
d’abbandonare quella rocca e recarsi nel castello di Milano, lo che
appunto eseguiva.
Dopo avere alquanto meditato tra sè allentò il passo, e lasciatosi
raggiungere dal soldato che gli veniva subito dietro, gli disse a
mezza voce:
«Che ne pensi, Uguccio, di queste novità?
«Io per me ci ho un gusto pazzo (rispose l’altro) ch’abbiano fatta la
festa a quel ragazzaccio frenetico di Giovan Maria.
«Sì: meritava veramente di finir male i suoi giorni. Ha fatto
ammazzare tanti bravi signori e cavalieri che a dirlo è incredibile.
«Per lui far morire un cristiano se lo aveva come una bagatella. È
arrivato per sino a dare il tossico alla stessa sua madre in Monza.
«Lo so; e poi uccise il Pusterla come se ne fosse stato il reo.
«Altro che uccidere! lo fece mangiare dai cani insieme coi suoi figli.
Ma per provare s’era un’anima scellerata, senti che brutto giuoco si
prese un giorno di me. Trovandomi io colle squadre a Milano, il
nostro conte Facino mi comandò lo seguissi al palazzo negli
appartamenti della Duchessa, ch’egli si recava a visitare. Entrati colà
m’appostò per guardia in un camerone a cui mettevano capo due
scale. Io passeggiava quivi sbadatamente con questa partigiana così
in ispalla, gettando un’occhiata di quando in quando entro i vetri
della finestra d’una stanza ove stavano alcune damigelle che
attendevano a varii lavori. Ad un tratto sento un abbajamento
infernale e vedo comparire da una scala e corrermi addosso sei o
sette mastini che sembravano lupi affamati. Balzarono per
addentarmi al collo, alle braccia, alle gambe e gran mercè ch’aveva
l’armatura intiera colla buffa al viso e le manopole, altrimenti non
avanzava di me neppure un osso; intanto ch’io mi dibatteva a tutte
forze contro quelle bestie inferocite, indovina?... il Duca stava ad uno
spiatojo e mi guardava ridendo smascellatamente insieme a quel
satanasso di Squarcia Giramo. Liberatomi appena dai mastini ritornò
il nostro Conte, e vedendomi ansante e rabbuffato mi addomandò
che fosse avvenuto; io glielo narrai, ed egli portossi tosto dal Duca e
lo minacciò di unirsi ai guelfi e di assediarlo nel suo castello, se non
rendeva tostamente ragione dell’ingiuria a me fatta che prendeva
come fatta a sè stesso, ed ebbe termine la faccenda con dieci fiorini
d’oro dati a me, e cento colpi di curlo al canattiere che non aveva
una colpa al mondo.
«Se non fosse stato il nostro Conte avrebbero invece appiccato te
per avere malconci i cani del Duca, e sarebbe stato dato un premio a
quell’altro. Questi principi della razza del biscione sono tutti d’una
pasta velenosa, ed io li odio a morte, e ne vorrei vedere distrutta la
stirpe. Quando spirò Giovan Galeazzo primo Duca, che fu padre di
questo Giovan Maria, le nostre bande trovavansi a Parma e mi
ricordo che il nostro Conte ragionando colla signora Beatrice
manifestò certi pensieri sopra Milano, che mi davano la più gran
consolazione del mondo, e sì che a quel tempo il Conte non era
padrone di Pavia, Alessandria, Novara e tante altre città che
possiede adesso e da cui può trarre molto maggior numero d’uomini
e di danari.
«Per San Matteo! (esclamò Uguccio) quello era un colpo degno di
lui: oh perchè non l’ha tentato?
«Nacquero in quell’incontro altri trambusti gravissimi e dovette
recarsi altrove. Il bel momento (proseguì Macaruffo più piano, con un
sorriso significante e aggrottando le ciglia) il bel momento, caro
Uguccio, sarebbe questo! Chi ha forze bastevoli per poterglisi
opporre? I ghibellini sono per lui; Ottobon Terzo, il Casati e gli altri
guelfi se li mangia come la balena i pesciolini. Filippo Maria ch’è
fratello di quegli che hanno scannato e che dovrebbe diventar Duca,
se lo tiene in Pavia nelle sue unghie. Tutto presentemente andrebbe
a meraviglia, ma farebbe d’uopo muoversi alla spedita onde non
lasciar campo ai partigiani di Filippo d’unirsi e farsi forti.
«Ti giuro che per un’impresa di questa sorta non vi sarebbe uno solo
de’ nostri uomini che non ci metterebbe allegramente la pelle.
Diventare padroni di Milano! d’una cittadona sì splendida, ricca, così
piena di belle donne!
«E salutare per duca il nostro Conte, e per duchessa la signora
Beatrice. Ella sì saprebbe bene occupare quel posto come si deve.
Io darei il sangue per vederle in capo la corona ducale. Mi punge
però il pensiero che pare che il demonio vi ci si caccia per entro,
poichè il messo venuto jeri sera mi disse che appunto in questi giorni
il nostro Conte assalito dalla sua doglia al fianco, giace tormentato
senza potersi levare.
«La doglia che lo prende di consueto. Ma sai che suole presto
sparire, e giuocherei che a quest’ora è al tutto risanato e cammina e
cavalca come potremmo far noi.
«Così fosse, che non frapporrebbe indugio a porsi a capo alle
squadre, per venire a dar l’ultimo scacco alla malnata vipera
divoratrice.
Facendo tali e simili discorsi erano giunti a vista di Milano, ed
appressatisi alla Porta Comasina trovarono chiuso il ponte e calata
la saracinesca, onde dovettero penare assai a farsi aprire ed
intromettere coi compagni nella città.
Nelle contrade era un subuglio, una confusione, un movimento di
popolo straordinario. Pressochè tutti, i signori, gli artieri, la plebe
mostravansi muniti d’armi e ve n’aveva d’ogni specie; parte di essi
n’andavano in compagnie ordinate; parte movevano in turba per le
vie. Gli uni passavano gridando — Viva Estore; vivano i figli di
Bernabò; viva Baggi e il Pusterla che ci hanno vendicati [3]. — Altri
seguivano imprecando invece morte a questi ed acclamando —
Filippo Maria legittimo Signore — Alcuni volevano s’andasse ad
assalire il castello per ammazzare il Marliano che lo teneva per
Filippo, altri all’incontro facendo sventolare le bandiere cercavano di
formare grossa massa onde muovere alla volta di Pavia a prendere il
nuovo Duca e qui condurlo in trionfo. Ve n’avevano eziandio di quelli
che non andavano esclamando che — Viva Milano — e volevano si
proclamasse la repubblica come nei primi tempi, ma questi essendo
in pochissimo numero non esercitavano sulla moltitudine alcuna
influenza. Per le piazze e pei crocicchii, sui gradini delle colonne o
sovra carri e trabacche eranvi frati, magistrati, cavalieri che
arringavano a tutta voce il popolo; ciascuno però oppostamente ed a
norma soltanto dell’interesse di quei capi il cui dominio poteva
essere per loro una fonte di migliori speranze. Or qua or là udivansi
urli furiosi ed acutissime grida, e le campane di questa o di quella
parrocchia suonare a stormo, e ciò perchè scontrandosi le contrarie
fazioni nascevano risse sanguinose, e si moltiplicavano gli
ammazzamenti. Insomma tutto concorreva a presentare il quadro
d’una città senza alcun regime, abbandonata al furore dei partiti e
nella quale l’ambizione, la forza, l’astuzia gareggiano con ogni
mezzo onde afferrare il potere.
Il nostro venturiero Macaruffo sebbene durasse non poca fatica ad
aprirsi la via col suo drappello frammezzo a tanto tumulto, pure
godeva internamente alla vista di quel disordine ch’ei sperava
propizio al progetto che aveva supposto volersi eseguire dal suo
signore. Due o tre volte fu serrato d’appresso dalla plebe che lo
inseguiva gridando — Dàlli al gobbo co’ suoi sgherri; ammazza,
ammazza — ma le punte delle partigiane abbassate a tempo, le
fisonomie intrepide e risolute, il non avere assise che indicassero a
quale delle parti appartenevano li sottrassero dal periglio.
Pervenuti al castello di Porta Giobia, n’andarono lungo la fossa sino
al Portello detto del Pozzo: quivi Macaruffo diede alla scolta che
stava sul battifolle la parola d’ordine; questa comunicò l’avviso al
Castellano e fu indi a poco calata la trave e que’ soldati ricevuti
dentro.
Il dì seguente Macaruffo avido ed impaziente di conoscere a qual
termine inclinassero le cose andò con arte interrogando or questo or
quell’altro de’ capitani di masnada ch’erano nel castello, ma tutti
ignoravano al pari di lui la somma delle vicende, nè potevano che
abbandonarsi a fantastiche congetture. Vedendo riuscire vana
l’opera sua, salì sul vallo, e quivi appoggiato neghittosamente alla
torre fisava sulle campagne che gli si stendevano alla vista, uno
sguardo acuto per iscoprire se mai qualche vessillo spuntasse sulla
via dalla parte di mezzodì, o si vedessero luccicare punte di lancie
od elmi, ch’ei teneva per fermo che il suo conte Facino non dovesse
star guari a presentarsi sotto le mura di Milano e non dubitava, a
causa di quanto aveva veduto il giorno passato, che, compresse le
fazioni, si sarebbe prontamente impossessato della città.
Ogni qual volta questo pensiero gli si affacciava alla mente, i bruni e
ruvidi tratti del suo viso esprimevano una soddisfazione, un contento
singolarissimo. Ed in ciò, all’opposto di quello che naturalmente
arguire si dovea, l’orgoglio e la brama delle prede o degli onori
avevano lievissima o nessuna parte. Un sentimento indiviso, senza
speranze, celato all’aria stessa, pur sempre vivo e profondo quanto
essere lo può in anima umana, formava da lunghi anni la cura
assidua e l’unico movente di quel Venturiero, il cui sformato aspetto,
i costumi e la vita sprezzata e soldatesca facevano rassembrare il
più duro ed insensibile degli uomini.
Mentre pure guardando dall’elevato baluardo nei sottoposti piani
lasciava errare lo spirito fra le sue consuete idee, che i casi recenti
vestivano di più lusinghieri colori, ode venire dalla parte della città
rumore di grida festose e di plausi vivissimi. Discende frettoloso dal
vallo, e scontra nel cortile vairii cittadini pervenuti a fatica a
ricoverarsi nel castello, i quali circondati da una folla d’uomini d’armi
narravano, che all’alba di quello stesso giorno era venuto a Milano
da Monza Estore Visconti con molti armati ed aveva sconfitto i
ghibellini che parteggiavano per Filippo Maria; e che sendo già gli
animi disposti in favore di Estore dalle calorose ed incessanti
prediche di frate Bartolomeo Caccia, presso i popolari avuto in
estimazione di santo, venne il medesimo accolto e proclamato
signore di Milano insieme al nipote Giovan Carlo Visconti nato dal
sangue di Bernabò.
A tale notizia Macaruffo indispettì gravemente, ma pure non depose
la lusinga che da un istante all’altro potessero arrivare le masnade
del conte Facino a rovesciare quella nuova signorìa, priva d’ogni
valido appoggio ed alla quale rimaneva a compiere la più ardua
impresa ch’era quella d’impadronirsi del castello.
Assiso la sera con Uguccio sopra un pancone presso la porta dello
stemma (la maggiore della fortezza, dalla larga volta della quale
pendeva accesa un’affumicata lucerna), andava ragionando sui fatti
stati riportati là dentro, ed esponeva con fervore gli argomenti che
s’aveva per non dubitare che il loro Condottiero avrebbe mosso il
campo ed ottenuta la vittoria. Interruppe quell’animato dialogo la
voce della sentinella che s’udì dallo spalto annunziare che
s’appressava al castello un soldato a cavallo. Tosto l’araldo
s’affaccia alla feritoja del ponte, e vedendo giungere vicino il
cavaliere, gli grida chi sia, e cosa voglia. «Sono messaggiero e reco
dispacci da Pavia» fu la risposta che venne data. Il capitano d’armi
fece disporre gli arcieri di guardia in ordinanza, poi ordinò
s’abbassasse il picciolo ponte levatojo laterale, e il messaggiero
entrò.
Appena ebb’egli posto piede a terra, e consegnato all’araldo un
involto suggellato di carte dirette al Castellano, il nostro Venturiero e
il compagno gli balzarono con tutta cupidigia d’intorno, giacchè in lui
riconobbero un commilitone, un uomo delle loro bande a cavallo.
«E così vengono i nostri? — gli domandarono sommessamente ad
una voce.
«Chi diavolo volete che sappia se si va o si viene; per me credo che
sia tutto finito.
«Il Conte non vorrebbe forse...
«Oh! con lui a quest’ora già si sarebbero fatte gran cose.
«Ma dunque perchè non si muove?
«Perchè non si muove?... Oh bella!... domandate a un morto perchè
si sta fermo.
«Che?... dici tu il vero?... (chiesero pure entrambi colpiti come da un
fulmine).
«E voi non lo sapete?... Pur troppo è la verità!... Il nostro povero
Conte chiuse gli occhi per sempre l’altro jeri a sera.
«Io non posso persuadermene (esclamò Uguccio).
«L’ho veduto io nel suo palazzo in Pavia disteso sopra un catafalco
col padiglione di broccato oscuro ricoperto delle sue armi più ricche.
Tutti gli uomini delle squadre recavansi a rimirarlo, e vi dico ch’era
una compassione a pensare che un battagliero come il nostro Conte
dovesse essere serrato giù a marcire fra quattro pietre. Per noi la
sua perdita è la piu grande delle disgrazie. Egli era la perla de’
condottieri di ventura; il soldato con esso lui doveva bensì menare
delle braccia, ma poteva poi essere certo del fatto suo, e le coreggie
si foderavano spesso di buoni zecchini. I principi, le città andavano a
gara onde trarlo dalla loro, e per averlo bisognava che mettessero lì
pile d’oro e d’argento da riempierne le staja.
«Quando però egli s’era collocato agli stipendi d’una parte ci si
adoperava davvero (disse Uguccio), e chi l’assoldava poteva
incominciare a cantar vittoria; nè egli ritiravasi colle schiere prima
che si ponesse capo alla guerra, come fecero il Branda e molt’altri, i
quali dopo numerate le caparre passarono co’ loro uomini dal lato
del nemico perchè offriva più grosse paghe.
«No: il conte Facino non commise mai di queste ribalderie. A Novi,
Ziaratone che non fece per toglierlo al marchese Teodoro? Soltanto
per determinarlo a levarsi dall’assedio gli promise in danaro il carico
di quattro muli, e davagli il figlio in ostaggio. Ma tutto fu inutile, anzi ti
ricorderai che Ziaratone rimase ucciso nell’assalto da Facino stesso.
«E fu adunque quella maledetta doglia nel fianco la cagione dalla
morte del nostro Conte?
«Ohibò: i signori della veste negra, i dottori, che in Pavia son più
numerosi delle zanzare, sostengono che è morto per il colpo nella
testa che prese due anni sono qua in Milano, quando a motivo della
sommossa del popolo, spingendo a corsa il cavallo, urtò nell’arco
della porta interna del palagio del Duca, e perdette molto sangue.
Vogliono che quella botta macinasse dentro dentro, sin che gli diede
l’ultima stretta.
«Qual malavventura!... Ora che non abbiamo più il nostro capo che
faremo noi? (proferì Uguccio con voce addolorata)... Staremo qui
con questi Visconti a rischio qualche giorno da farci mangiare dai
cani, e senza sapere nemmeno chi di loro comanda?... Si getteremo
alla campagna coi banditi, o andremo ad offrirci a qualch’altro
capitano? Vi sarebbero veramente lo Sforza, Braccio, e...
«Che osi tu dire? Saresti tu mai un traditore? (l’interruppe
esclamando Macaruffo ch’era stato silenzioso sino a quel momento,
immerso ne’ proprii pensieri). Perchè è morto Facino dovremo noi
abbandonare vigliaccamente la sua casa, e lasciare che sfumino in
un lampo tutte le conquiste che abbiamo fatte seco lui, spendendo
tanto sangue e fatica? Non rimane forse Beatrice di Tenda, la nostra
Contessa da noi sempre obbedita come Signora? Vorremo noi
permettere che la vedova d’un Capo sì glorioso sia scacciata da’
suoi dominii, e venga oppressa ed avvilita come una femmina da
trivio?
«A quanto pretendi dovremmo noi dunque rimanere sotto il comando
d’una donna?
«Non vi sono con lei ancora molti capitani ed i migliori d’Italia? Non
v’è Castellino? non v’è Carmagnola? questo solo ne vale dieci dei
più famosi che vivono al presente.
«Io credo bene (disse il soldato messaggiero) che la contessa
Beatrice abbia prescelto il Carmagnola per comandare le nostre
bande. Da che è morto Facino tutti gli ordini vengono dati da lui. Egli
fu che ingiunse all’armata ch’era intorno a Bergamo di levare il
campo e condursi a Pavia, ed io mi sono qui recato perchè mi vi
spedì egli stesso.
«La signora Beatrice non poteva fare una scelta più lodevole e
giudiziosa (disse Macaruffo con satisfazione). Francesco
Carmagnola era la mano destra del Conte, ei lo considerava come
un altro sè stesso, quindi nessuno rifiuterà di obbedirgli.
Stette muto alcun tempo, poi aggiunse: «Quand’è che tu fai ritorno a
Pavia?
«Ho l’ordine di non retrocedere se non quando mi vien consegnata
la risposta dal signor Castellano.
«Ebbene ora va e bada che il tuo cavallo sia governato a dovere; ma
ti prego di non partire di qua senza parlare nuovamente con me».
Ciò detto si separarono.
Macaruffo trovò modo, alcuni giorni dopo, d’abbandonare il castello
seguendo il messaggiero, e uscito sull’alba per istrade appartate da
Milano, arrivò la sera senz’altri inciampi a Pavia.
Quella città era ingombra di soldati che appartenevano alle squadre
di Facino, ed ivi giungevano da ogni parte, siccome aveva ordinato il
Carmagnola, il quale divenuto supremo comandante calcolò tosto
essere opportuno di adunare tutte le forze in un punto solo, onde più
facilmente dominarle, e dirigerle là dove lo stato degli eventi l’avesse
richiesto. Il nostro Venturiero recossi tosto al palazzo dell’estinto
Conte. Stanziavano continuamente colà numerose guardie, poichè
continuavansi a rendere i principeschi onori alla vedova Contessa,
divenuta per la morte del marito sovrana signora di Pavia e di gran
numero d’altre città appartenenti prima al Ducato.
Macaruffo da lunga mano conosciuto da tutti quegli uomini d’armi,
scambiò, passando in mezzo a loro, parole di saluto ed entrò
liberamente nelle camere inferiori del palazzo. Al vederlo i servi gli
furono intorno festeggiandolo e Matteo, vecchio scalco, uno de’ piu
antichi suoi compagni, che scendeva in quell’atto dagli appartamenti
superiori, venutogli lentamente incontro dimenando il capo, gli
strinse la mano, poi s’asciugò gli occhi e disse:
«Vedi qual cangiamento, Macaruffo? Siam tutti vestiti a bruno; non
regna che lutto nella casa di Facino, quello che ne formava la gloria
è andato sotto terra.
«Pur troppo! (rispose Macaruffo) lo seppi nel castello di Milano con
indicibile cordoglio e m’affrettai a qui venire per conoscere quali
provvedimenti la signora Beatrice....
«Oggi avrai fatto lungo cammino (l’interruppe lo Scalco) e
abbisognerai di refiziamento e di riposo?
«No per ora veramente, e vorrei prima udire appunto da te....
«Voi altri sfaccendati (gli troncò di nuovo la parola Matteo
rivolgendosi ai servi) state qui a guardarlo come babbuini e non gli
avrete nemmeno esibito da cena? Sapete pure che questa è la
prima offerta che il Conte voleva sempre si facesse a chi arrivava:
possibile che s’abbia già da perdere ogni buona usanza? Presto
andate a preparare la tavola nel salotto vicino alla mia camera,
portatevi l’occorrente poi lasciateci colà tranquilli».
Invitò Macaruffo a seguirlo, precedendolo col lume su per lo scalone;
passò varie loggie e da un andito riuscì in una stanza ove stavano
appesi alcuni quadri. Quivi accesa una lucerna sopra un doppiero di
ferro gli accennò di sedere e passò in una contigua cameretta.
Allorchè fu disposta la mensa Matteo ritornò portando una
damigiana che andava spolverando con un pannolino; la depose
sulla tavola, quindi chiuse l’uscio a chiave; venne poi a sedersi in
faccia a Macaruffo, e nello sturare la damigiana disse:
«Non ho amato d’entrare in alcun ragionamento là abbasso alla
presenza di quelle gazze scilinguate, che ripetono tutto ciò che
ascoltano e potrebbero farmi cadere addosso qualche mala
tempesta. Ma sappi che ho desiderato ansiosamente il tuo ritorno
per comunicarti delle novelle che ti faranno stupire.
«Ben temeva che la morte del Conte sarebbe stata cagione di molte
novità (profferì in tuono dolente il Venturiero). Al certo v’ha discordia
tra i capitani, i soldati disertano, od i vassalli minacciano d’insorgere
contro la Contessa...?
«Nulla di questo (rispose lo Scalco versando il vino in due bicchieri e
riempiendo di vivande il piatto di Macaruffo), anzi per grazia del cielo
tutte le bande armate e i loro capi rinnovarono il giuramento di
fedeltà alla nostra padrona, e questa città ha già protestato della sua
devozione, lo che pure faranno prestamente le altre. Alla testa de’
soldati v’è quel sì eccellente ed avveduto...
«Il Carmagnola, lo so (disse Macaruffo con impazienza). E dunque
quali sono queste novelie che vuoi narrarmi?
«Le teneva sepolte qui (ed indicò il gorgozzule), e sono sì importanti
che non oserei dirle con alcuno. Ma tu sei di quelli della vecchia
stampa, tu ami sinceramente la casa, con te posso parlare.
Si guardò d’intorno quasi volesse meglio accertarsi che nessun altro
lo stesse ad ascoltare; MacarufFo gli affisò in volto uno sguardo
acuto, indagatore, ed ei proseguì con voce bassa in aria misteriosa.
«Si sta per combinare un matrimonio! (e comprimendo un labbro
coll’altro rimase a ciglia inarcate).
«Un matrimonio... e con chi?
«Sai che nella Rocca qui di Pavia v’è quel giovine che il Conte
teneva, non veramente come prigioniero, ma poco meno, perchè lo
faceva custodire da Antonio Bogero il cremonese, onde non avesse
colle sue pretensioni alla signoria della città a far nascere tumulti.
«Sì: è Filippo Maria fratello del Duca che hanno ammazzato a
Milano. Ebbene?
«Si tratta (pronunciò Matteo piu pianamente, data di nuovo
un’occhiata all’uscio) si tratta di farlo sposare alla contessa Beatrice.
«Sarebbe ciò possibile? (esclamò Macaruffo cui salì una fiamma al
volto).
«Non v’ha ombra di dubbio. Facino era appena sepolto quando ne
venne fatta la proposta alla Contessa.
«Ed ella come l’accolse? (disse con freddezza e impallidendo il
Venturiero).
«Sulle prime esitò; ma poi vi s’inframmise un tale che la trasse ben
presto al suo partito.
«Chi è costui?
«Oh! l’uno de’ grandi della cappa pavonazza e la croce di gemme:
un Arcivescovo.
«Quel di Milano?
«Sì quello.
«È un fautore acerrimo de’ ghibellini. Moverà cielo e terra per far
trionfare il figlio di Giovan Galeazzo. Chi sa con quali armi assalì il
cuore della Contessa; e quali mezzi adoperò per guadagnarla!
«Domilda che le sta sempre al fianco, mi accertò che non gli fu
d’uopo usare grande fatica a farla persuasa; s’arrese ai primi assalti.
Quest’è una prova dell’amore che portava al suo sposo!
«Ma Filippo Maria conta poco piu di venti anni ed ella ne oltrepassa
quaranta...
«Ecco forse la ragione che l’ha più fortemente e più presto convinta
(s’espresse lo Scalco con sorriso sdegnoso e maligno). D’altronde
quel giovine è di sangue ducale, ha faccia bianca, pelle fina, begli
occhi; tutto ciò insomma che vale ad appagare i capricci d’una
donna.
«Non credo che la signora Beatrice possa essere stata sedotta da
così semplici e leggiere apparenze, che son frascherie da pulcella
(rispose con risentimento Macaruffo). Ella ha pensato ognora
nobilmente e fu degna compagna dell’uomo potente e famoso che
venne a sceglierla in moglie nel castello paterno.
«Sia come tu vuoi, ma, diciamolo in estrema confidenza, essa
mostra soverchia inclinazione pei giovinetti ch’hanno visi leccati e
capigliature che sembrano di lino.
«Matteo tu eccedi (esclamò fremendo il Venturiero e vibrandogli
un’occhiata minacciosa). Pensa che le tue parole offendono l’onestà
della nostra padrona, e se non fosse l’amore che portavi al Conte
ch’ora a torto ti slega la lingua...
«Se parlo è perchè le veggo le cose (replicò lo Scalco più piano ma
in tuono d’asseveranza). Non ha ella sempre tra piedi quel Michele
Orombello qui mandato dai Conti di Ventimiglia onde divenisse
valente cavaliero alla scuola di Facino? invece di lasciare che si
eserciti nel maneggio delle armi e che il poltroncello sudi e s’addestri
col cavallo e la lancia, se lo tiene tutto il giorno vicino a strimpellare il
liuto e canticchiare alla provenzale.
«Sono i suoni e le canzoni del suo paese nativo e vuoi fargliene
accusa se dopo tanto tempo ama sentirle ripetere da un fanciullo?
chi sarà sì temerario d’immaginarsi che in ciò vi sia colpa? Ella non
ebbe il diletto di dirsi madre e quindi predilige l’età di chi le potrebbe
essere figlio.
«Anche Filippo Maria, quanto agli anni, potrebbe essere suo figlio,
eppure se lo prende per isposo, e non è quasi freddo ancora il letto
di Facino.
«Se ciò avvenisse mai, egli è, mi credi, per la forza degli intrighi e
della violenza esercitata sul di lei animo dal Ghibellino venuto qui
appositamente da Milano. — E dopo essere rimasto alquanto
taciturno riprese: — «L’astuzia sua è profonda; ben m’avveggo
ch’egli pensò che collo stringere le nozze tra Filippo Maria e la
contessa Beatrice, i sudditi e le bande armate ch’ella possiede
diventeranno del marito, e questi potrà con tali mezzi ricuperare lo
Stato e farsi proclamare nuovo Duca, mentre da solo, misero e
derelitto come egli è, non sarebbe mai divenuto in grado di farlo.
«Che la nostra padrona fosse vittima d’una trama sì iniqua?... Ma, or
che ci penso, ella a fine del conto diverrebbe duchessa di Milano, e
caspita è tal leccarderìa da stuzzicare il palato d’ogni cristiano.
«Per diventare signora di quella città ella non abbisogna di farsi
moglie o piuttosto schiava d’un suo proprio prigioniero!... (e
piegandosi verso di lui, proseguì con tuono di voce più basso ed
accentato) «Tenga il Visconte rinchiuso nella torre della Rocca dov’è
stato sin ora, faccia intendere le sue volontà al Carmagnola, e lasci
poi operare da esso lui e da noi soldati. Buone parole a tutti, una
tagliata alle gabelle, dar bando ai guelfi sanguisughe dei poveri
cittadini, e noi saremmo accolti a larghe braccia dal popolo milanese.
«Oh se fosse al mondo il signor Facino!...
«A quest’ora era cosa fatta. Ma non disperiamo (disse Macaruffo
animandosi in volto), il matrimonio non è finora celebrato, nè forse
concluso. La volpe ghibellina può ancora cogliere in falso, vi