TEKNIK MAKMAL BIOKIMIA

BIOCHEMISTRY LABORATORY TECHNIQUES

MANUAL MAKMAL/LAB MANUAL

Makmal/Lab 5
L

Protein
Proteins

Program Sains Bioperubatan,

Fakulti Sains Kesihatan,
UKM
 MAKMAL 5 : PROTEIN

Protein merupakan diet penting bagi haiwan peringkat tinggi kerana tubuh hanya mensintesis
protein mudah daripada sumber nitrogen lain. Protein ditemui dalam semua tisu tubuh dan
cairan tubuh. Ia membina sebahagian besar struktur sel dan juga memainkan peranan
fisiologi khusus.
Peranan protein antara lain adalah sebagai:
a) sumber tenaga
b) pengangkut
c) reseptor
d) faktor penggumpalan darah.
e) hormon
f) antibodi
g) komplimen
h) enzim

UJIKAJI 1: PENENTUAN PROTEIN JUMLAH DALAM PLASMA DARAH MANUSIA (KAEDAH

BRADFORD 1976)

BAHAN
1) Plasma tercair (200x pencairan)
2) Reagen Bradford yang telah disediakan
3) Larutan piawai protein 500 µg/ml

CARAKERJA

1) Bagi menyediakan lengkuk kalibrasi, sediakan 6 tabung uji (piawai) seperti berikut:

Tabung Uji
Kandungan 1 2 3 4 5 6
(Pengosong)
Piawai Protein 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(albumin) (ml)

Air suling (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

2) Pipetkan 0.1 ml dari setiap tabung uji di atas dan masukkan ke dalam 6 tabung uji yang
lain.
3) Untuk ujian, sampel plasma tercair telah disediakan.
4) Sediakan 5 tabung uji ujian:
i. Tabung uji A1 dan A2 (duplikat)
ii. Tabung uji B (bagi mencairkan plasma tercair)
iii. Tabung uji B1 dan B2 (duplikat)
5) Masukkan 0.1 ml plasma tercair yang telah disediakan ke dalam setiap tabung uji
berlabel A1, A2 dan B.
6) Bagi tabung uji B, plasma tercair dicairkan lagi dalam nisbah 1:2 iaitu dengan menambah
0.1 ml plasma tercair dengan 0.2 ml air suling. Sebatikan.
7) Pipetkan 0.1 ml cairan dari tabung uji B ke dalam tabung uji berlabel B1 dan B2.
8) Tambahkan 2.0 ml reagent Bradford ke dalam setiap tabung uji (piawai dan ujian) dan
sebatikan dengan vortex mixer.
9) Eramkan semua tabung uji selama 5 minit pada suhu bilik.
10) Baca penyerapan pada panjang gelombang 595 nm. Sediakan lengkuk piawai dan
hitungkan protein dalam plasma. Berikan jawapan anda dalam g%.

SOALAN
1) Jika sampel mengandungi bahan-bahan lipid campuran menjadi keruh. Bagaimanakah
kekeruhan ini dapat dihilangkan?
2) Berikan perbezaan di antara plasma dan serum.
3) Bagaimanakah globin, fibrinogen dan albumin dapat dipisahkan daripada plasma?
4) Selain daripada kaedah Bradford, senaraikan sekurang-kurang dua kaedah lain
penentuan protein dan keadaan di mana setiap kaedah itu sesuai digunakan.
5) Komen mengenai lengkuk piawai yang anda perolehi, adakah hukum Beer-Lambert
dipatuhi?
6) Berikan julat normal protein jumlah. Bandingkan nilai protein jumlah dalam plasma
dengan nilai rujukan. Berikan komen.

UJIKAJI 2: ELEKTROFORESIS SELULOS ASETAT PROTEIN PLASMA

Pemisahan protein dengan kaedah elektroforesis bergantung kepada perbezaan dalam

pergerakan fraksi-fraksi protein apabila berada di dalam medan elektrik. Kebanyakan molekul
mempunyai cas elektrik yang magnitudnya dipengaruhi oleh:
a) jenis molekul
b) pH
c) komposisi medium di mana ia berada
Apabila berada di dalam larutan dan apabila dilalukan arus elektrik, molekul yang bercas akan
berhijrah kepada elektrod yang berlawanan dengan cas pada molekul tersebut. Kadar
penghijrahan ini berbeza di antara satu fraksi protein dengan fraksi yang lain bergantung
kepada jumlah cas yang dibawa oleh setiap fraksi itu.
Bahan yang hendak dipisahkan komponennya berada pada fasa pegun yang terdiri daripada
bahan lengai. Pergerakan komponen berlaku dalam fasa bergerak. Contoh fasa pegun ialah
selulos asetat, gel agar, gel kanji dan gel akrilamida.

PERINGATAN

a) Jangan pegang strip selulos asetat dengan jari. Gunakan forsep untuk mengelak dari
berlakunya kerosakan atau kontaminasi pada strip tersebut.
b) Nombor kumpulan ditulis dengan pensil pada strip selulos asetat dan diletakkan pada
hujung anod.
c) Cara merendamkan strip dengan betul:
Mula-mula biarkan strip terapung di permukaan larutan selama 2 minit supaya larutan
diserap masuk ke dalam lubang-lubang membran secara tindakan kapilari. Selepas itu
barulah masukkan seluruh strip ke dalam larutan.
CARAKERJA:
1) Isikan tangki elektroforesis dengan penimbal pH 8.6 pada petak sebelah anod dan pH
8.2 pada petak sebelah katod. Pastikan paras penimbal adalah sama dalam kedua-dua
petak.
2) Tuliskan nombor kumpulan di satu hujung dengan pensil. Rendamkan strip di dalam
campuran isipadu yang sama penimbal pH 8.6 dan 8.2 selama 2 minit.
3) Keluarkan strip dan lapkan satu kali dengan meletakkannya di antara 2 keping kertas
terap (blotting paper). Pasangkan strip kepada paper wick.
4) Letak strip di antara kedua-dua elektrod. Pastikan 0.5-1 cm daripada kedua-dua hujung
strip berada pada keadaan terendam dengan penimbal. Strip hendaklah mendatar dan
tegang.
5) Tutup tangki dan lalukan arus elektrik pada kelajuan 0.4 mA/cm lebar strip (200 V
dengan voltan tetap). Biarkan strip dalam keseimbangan selama 10 minit. Matikan
aliran letrik.
6) Di permukaan strip yang licin, titikkan sampel dengan kapilari sebagai satu jalur, kira-
kira 5 cm dari hujung katod.
7) Lalukan arus eletrik dan biarkan selama 90 minit.
8) Matikan aliran letrik. Dengan menggunakan forsep keluarkan strip dan rendamkannya
dalam larutan Ponceau S untuk 10 minit.
9) Keluarkan strip dan bilas beberapa kali dengan 5% asid asetik mengeluarkan semua
warna yang berlebihan.
10) Keringkan.
11) Lukiskan hasil elektroforesis protein plasma dengan ukuran sebenar dan namakan
semua komponen yang terpisah.

SOALAN

1) Bagaimanakah teknik elektroforesis selulosa asetat protein plasma dapat digunakan di

dalam diagnosa penyakit?
2) Nyatakan keadaan yang dapat menyebabkan kepekatan albumin plasma menjadi tinggi
atau rendah dan peningkatan globulin plasma.
3) Terangkan kepentingan nisbah albumin/globulin.
 MAKMAL 5 : PROTEIN

UJIKAJI 1: PENENTUAN PROTEIN JUMLAH DALAM PLASMA DARAH MANUSIA (KAEDAH

BRADFORD)

HASIL

a) Tentukan ketumpatan optik untuk setiap tabung uji.

Tabung
1 2 3 4 5 6 Uji A Uji B
uji
OD 595
nm
Tentukan kepekatan protein pada setiap tabung uji.
Protein
(µg/ml)

b) Plot graf kalibrasi (lengkuk piawai).

c) Hitung jumlah protein dalam plasma (dalam nilai g%).

KESIMPULAN
SOALAN

1) Jika sampel mengandungi bahan-bahan lipid, larutan akan menjadi keruh.

Bagaimanakah kekeruhan ini dapat dihilangkan?
2) Berikan perbezaan di antara plasma dan serum.
3) Bagaimanakah globin, fibrinogen dan albumin daripada plasma dapat dipisahkan?
4) Selain daripada kaedah Bradford, senaraikan sekurang-kurangnya dua (2) kaedah
penentuan protein yang lain dan keadaan di mana setiap kaedah itu sesuai
digunakan.
5) Komen mengenai lengkung piawai yang anda perolehi. Adakah hukum Beer-Lambert
dipatuhi?
6) Berikan julat normal protein jumlah. Bandingkan nilai jumlah protein dalam plasma
dengan nilai daripada rujukan. Beri komen.

UJIKAJI 2: ELEKTROFORESIS SELULOS ASETAT PROTEIN PLASMA

HASIL
Lukiskan hasil elektroforesis yang diperolehi.

KESIMPULAN

SOALAN
1) Bagaimanakah teknik elektroforesis selulosa asetat protein plasma dapat digunakan di
dalam diagnosa penyakit?
2) Nyatakan keadaan/penyebab yang dapat menyebabkan:
i) Peningkatan albumin plasma
ii) Penurunan albumin plasma
iii) Peningkatan globulin plasma
3) Terangkan kepentingan nisbah albumin/globulin.
 LAB PRACTICAL 5: PROTEINS
Protein is an important diet for high-level animals because the body only synthesizes simple proteins
from other sources of nitrogen. Protein is found in all body tissues and body fluids. It builds most of
the cell structure and also plays a specific physiological role.

The role of protein, among others, is as:

a) energy source
b) carrier
c) receptors
d) blood clotting factors
e) hormones
f) antibodies
g) complements
h) enzymes

EXPERIMENT 1: DETERMINATION OF AMOUNT OF PROTEIN IN HUMAN BLOOD PLASMA

(BRADFORD METHOD 1976)
REAGENTS

1) Diluted plasma (200x dilution)

2) Prepared Bradford reagent
3) Standard protein solution of 500 µg/ml

METHOD

1) To prepare the calibration curve, prepare 6 test tubes (standards) as follows:

Test Tubes
Contents 1 2 3 4 5 6
(Blank)
Protein standard 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(albumin) (ml)

Distilled water (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

2) Pipette 0.1 ml from each of the test tubes above and insert into another 6 empty test tubes.
3) For this experiment, diluted plasma samples are already prepared for you.
4) Prepare 5 test tubes:
i. Test tubes A1 and A2 (duplicate)
ii. Test tube B (for diluting diluted plasma)
iii. Test tubes B1 and B2 (duplicate)
5) Pipette 0.1 ml of diluted plasma that has been prepared into each test tube labeled A1, A2
and B.
6) For test tube B, the diluted plasma is diluted again in a ratio of 1:2 by adding 0.1 ml of diluted
plasma with 0.2 ml of distilled water. Mix well.
7) Pipette 0.1 ml of liquid from test tube B into the test tubes labeled B1 and B2.
 8) Add 2.0 ml of Bradford reagent into each test tube (standard and test) and mix with a vortex
mixer.
9) Incubate all test tubes for 5 minutes at room temperature.
10) Read the absorption at a wavelength of 595 nm. Prepare a standard curve and calculate the
amount of protein in the plasma. Give your answer in g%.

QUESTIONS

1) If the sample contains lipid substances, the mixture becomes turbid. How can this turbidity
be eliminated?
2) Give the difference between plasma and serum.
3) How can globin, fibrinogen and albumin be separated from plasma?
4) In addition to the Bradford method, list at least two other methods of protein determination
and the conditions under which each method is suitable for use.
5) Comment on the standard curve you obtained, is Beer-Lambert’s law complied with?
6) Give the normal range of total protein. Compare the value of total protein in the plasma with
the reference value. Give a comment on this comparison.

EXPERIMENT 2: CELLULOSE ACETATE ELECTROPHORESIS OF PLASMA PROTEINS

Separation of proteins by the electrophoresis method depends on the differences in the movement of
the protein fractions when in an electric field. Most molecules have an electrical charge whose
magnitude is influenced by:

a) type of molecule
b) pH
c) the composition of the medium it is in

When in solution and when an electric current is flowing, the charged molecule will migrate to the
electrode opposite to the charge on the molecule. The rate of this migration varies from one fraction
of protein to another, depending on the amount of charge carried by each fraction.

The material to be separated from its components is in a stationary phase consisting of an inert
material. The movement of components occurs in the mobile phase. Examples of stationary phases
are cellulose acetate, agar gel, starch gel and acrylamide gel.

REMINDERS
a) Do not hold the cellulose acetate strips with your fingers. Use forceps to prevent damage or
contamination to the strip.
b) Write your group number in pencil on a strip of cellulose acetate and place it on the end of
the anode.
c) How to soak the strip properly:
First let the strip float on the surface of the solution for 2 minutes so that the solution is
absorbed into the holes of the membrane by capillary action. After that, put the whole strip
into the solution.
METHOD
1) Fill the electrophoresis tank with a pH 8.6 buffer of on the anode side of the compartment and
pH 8.2 on the cathode side of the compartment. Make sure the buffer level is the same in both
compartments.
2) Write your group number on one end with a pencil. Soak the strips in an equal volume mixture
of pH 8.6 and 8.2 buffers for 2 minutes.
3) Remove the strip and wipe once by placing it between 2 pieces of blotting paper. Attach the
strip to the paper wick.
4) Place a strip between the two electrodes. Make sure 0.5-1 cm of both ends of the strip are in
a submerged state with the buffers. The strip should be horizontal and taut.
5) Close the tank and run an electric current at a speed of 0.4 mA/cm strip width (200 V with
constant voltage). Leave the strip in equilibrium for 10 minutes. Turn off the power supply.
6) On a smooth strip surface, spot the sample with capillaries as a single line, approximately 5
cm from the end of the cathode.
7) Run an electric current and leave for 90 minutes.
8) Turn off the electrical current. Using forceps to remove the strip and soak it in Ponceau S
solution for 10 minutes.
9) Remove the strip and rinse several times with 5% acetic acid to remove all excess color.
10) Dry the strip.
11) Draw the result of the plasma protein electrophoresis in actual size and name all of the
separated components.

QUESTIONS

1) How can the technique of cellulose acetate electrophoresis of plasma protein be used in the
diagnosis of diseases?
2) State the conditions that can cause the plasma albumin concentration to be high or low and
the increase in plasma globulin.
3) Explain the importance of albumin/globulin ratio.
 LAB PRACTICAL 5: PROTEINS
EXPERIMENT 1: DETERMINATION OF AMOUNT OF PROTEIN IN HUMAN BLOOD PLASMA
(BRADFORD METHOD 1976)
RESULTS

a) Determine the optical density for each test tube.

Test
1 2 3 4 5 6 Test A Test B
Tube

OD 595
nm

Determine the protein concentration of each test tube:

Protein
(µg/ml)

b) Plot the calibration graph (standard curve).

c) Calculate the amount of protein in the plasma (in g% value).

CONCLUSIONS

QUESTIONS
1) If the sample contains lipid substances, the mixture becomes turbid. How can this turbidity
be eliminated?
2) Give the difference between plasma and serum.
3) How can globin, fibrinogen and albumin be separated from plasma?
4) In addition to the Bradford method, list at least two other methods of protein determination
and the conditions under which each method is suitable for use.
5) Comment on the standard curve you obtained, is Beer-Lambert’s law complied with?
6) Give the normal range of total protein. Compare the value of total protein in the plasma with
the reference value. Give a comment on this comparison.
EXPERIMENT 2: CELLULOSE ACETATE ELECTROPHORESIS OF PLASMA PROTEINS
RESULTS
Draw the electrophoresis results obtained.

CONCLUSIONS

QUESTIONS
1) How can the technique of cellulose acetate electrophoresis of plasma protein be used in the
diagnosis of diseases?
2) State the conditions that can cause the following:
i. high plasma albumin concentration
ii. low plasma albumin concentration
iii. increased plasma globulin.
3) Explain the importance of albumin/globulin ratio.