Bacterial Pangenomics Methods and

Protocols Second Edition Alessio

Mengoni Editor Giovanni Bacci Editor
Marco Fondi Editor
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/bacterial-pangenomics-methods-and-protocols-secon
d-edition-alessio-mengoni-editor-giovanni-bacci-editor-marco-fondi-editor/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Lipidomics Methods and Protocols 1st Edition Sanjoy K.

Bhattacharya (Editor)

https://textbookfull.com/product/lipidomics-methods-and-
protocols-1st-edition-sanjoy-k-bhattacharya-editor/

Group A Streptococcus Methods and Protocols 2020th

Edition Thomas Proft (Editor)

https://textbookfull.com/product/group-a-streptococcus-methods-
and-protocols-2020th-edition-thomas-proft-editor/

Cardiac Catheterization and Coronary Intervention 2nd

Edition Andrew Mitchell Editor Giovanni Luigi De Maria
Editor Adrian Banning Editor

https://textbookfull.com/product/cardiac-catheterization-and-
coronary-intervention-2nd-edition-andrew-mitchell-editor-
giovanni-luigi-de-maria-editor-adrian-banning-editor/

Foodborne Bacterial Pathogens: Methods and Protocols

Arnaud Bridier

https://textbookfull.com/product/foodborne-bacterial-pathogens-
methods-and-protocols-arnaud-bridier/
Bacterial Persistence Methods and Protocols 1st Edition
Jan Michiels

https://textbookfull.com/product/bacterial-persistence-methods-
and-protocols-1st-edition-jan-michiels/

Cardiac Regeneration Methods and Protocols Methods in

Molecular Biology 2158 Kenneth D. Poss (Editor)

https://textbookfull.com/product/cardiac-regeneration-methods-
and-protocols-methods-in-molecular-biology-2158-kenneth-d-poss-
editor/

Free Will: Historical and Analytic Perspectives Marco

Hausmann (Editor)

https://textbookfull.com/product/free-will-historical-and-
analytic-perspectives-marco-hausmann-editor/

Cellular Senescence: Methods and Protocols Marco

Demaria

https://textbookfull.com/product/cellular-senescence-methods-and-
protocols-marco-demaria/

Animal Influenza Virus Methods and Protocols Methods in

Molecular Biology 2123 Band 2123 3rd Edition Erica
Spackman (Editor)

https://textbookfull.com/product/animal-influenza-virus-methods-
and-protocols-methods-in-molecular-biology-2123-band-2123-3rd-
edition-erica-spackman-editor/
Methods in
Molecular Biology 2242

Alessio Mengoni
Giovanni Bacci
Marco Fondi Editors

Bacterial
Pangenomics
Methods and Protocols
Second Edition
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
 Bacterial Pangenomics

Methods and Protocols

Second Edition

Edited by

Alessio Mengoni, Giovanni Bacci, and Marco Fondi

Department of Biology, University of Florence, Sesto Fiorentino, Firenze, Italy
Editors
Alessio Mengoni Giovanni Bacci
Department of Biology Department of Biology
University of Florence University of Florence
Sesto Fiorentino, Firenze, Italy Sesto Fiorentino, Firenze, Italy

Marco Fondi
Department of Biology
University of Florence
Sesto Fiorentino, Firenze, Italy

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-1098-5 ISBN 978-1-0716-1099-2 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1099-2

© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2021

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Preface

Bacterial genomics has become in the last 10 years a mature research field, contributed by
ecologists, geneticists, bacteriologists, molecular biologists, and evolutionary biologists. In
1999, Carl Woese wrote “Genome sequencing has come of age, and genomics will become
central to microbiology’s future. It may appear at the moment that the human genome is the
main focus and primary goal of genome sequencing, but do not be deceived. The real justifica-
tion in the long run, is microbial genomics” [1]. Indeed, microbial genomics, especially
prokaryotic genomics, is now central in life science, spanning from environmental studies
to medical, agricultural, and industrial application. The discovery of the importance of
microbial communities, their tremendous diversity, and their impact over the life of multi-
cellular organisms, including humans, has led to the emergence of new concepts, including
evolutionary interpretations of biotic relationships. Concurrent improvement of sequencing
technologies is then allowing to shift the interest from the mere assembly/reconstruction
and description of genomes and metagenomes to their functional interpretation.
Under these premises, this second edition of the book Bacterial Pangenomics belonging
to the Methods in Molecular Biology series, became a challenge, in the aim to propose to
readers selected up-to-date methods which are relevant and can bring forth novel discoveries
in such a rapidly evolving field. Consequently, the book has been completely renewed with
respect to the previous edition, paying special attention to the technical and computational
improvements, to the methods used for bacterial pangenome analysis which relies on
microbiome studies and metagenomic data, and also considering the necessity of computa-
tional methods being understandable to every researcher in the field, not a domain restricted
to bioinformaticians.
This book has been organized into five main parts, starting from the up-to-date
sequencing methods (Part I) to the methods for deep phylogenetic analysis (Part II), to
the central role of metagenomic data in understanding the genomics of the many yet
uncultured bacteria (Part III), to the current Part IV. This book ends with two chapters
devoted to promoting the diffusion of computational genomic tools among graduate and
undergraduate students (Part V).
The aim of the present book is then, as for the previous edition, to serve as a “field
guide” both for qualified investigators on bacterial genomics and for less experienced
researchers (including students and teachers) who need references for approaching genomic
analysis and genome data.

Sesto Fiorentino, Firenze, Italy Alessio Mengoni

Giovanni Bacci
Marco Fondi

Reference

1. Woese C (1999) The quest for Darwin’s grail. ASM News 65:260–263

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

PART I OPPORTUNITIES FROM NOVEL SEQUENCING TECHNOLOGIES

1 PacBio-Based Protocol for Bacterial Genome Assembly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Agata Motyka-Pomagruk, Sabina Zoledowska, Michal Kabza,
and Ewa Lojkowska
2 The Illumina Sequencing Protocol and the NovaSeq 6000 System . . . . . . . . . . . . 15
Alessandra Modi, Stefania Vai, David Caramelli, and Martina Lari

PART II PANGENOMICS OF CULTURED ISOLATES

3 Comparative Analysis of Core and Accessory Genes in Coexpression

Network . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Biliang Zhang, Jian Jiao, Pan Zhang, Wen-Jing Cui,
Ziding Zhang, and Chang-Fu Tian
4 Inferring Core Genome Phylogenies for Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Alexander Keller and Markus J. Ankenbrand
5 Inferring Phylogenomic Relationship of Microbes Using Scalable
Alignment-Free Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Guillaume Bernard, Timothy G. Stephens, Raúl A. González-Pech,
and Cheong Xin Chan
6 Fast Phylogeny Reconstruction from Genomes of Closely
Related Microbes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Bernhard Haubold and Fabian Klötzl
7 Comparative Genomics, from the Annotated Genome to Valuable
Biological Information: A Case Study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Sabina Zoledowska, Agata Motyka-Pomagruk, Agnieszka Misztak,
and Ewa Lojkowska

PART III DARK MATTER PANGENOMICS

8 Accurate Annotation of Microbial Metagenomic Genes and Identification
of Core Sets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Chiara Vanni
9 Metagenomic Assembly: Reconstructing Genomes from Metagenomes. . . . . . . . 139
Zhang Wang, Jie-Liang Liang, Li-Nan Huang,
Alessio Mengoni, and Wen-Sheng Shu
10 Genome Recovery, Functional Profiling, and Taxonomic Classification
from Metagenomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
Davide Albanese and Claudio Donati

vii
viii Contents

11 Functional Metagenomics for Identification of Antibiotic

Resistance Genes (ARGs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Francesca Di Cesare
12 Host Trait Prediction from High-Resolution Microbial Features. . . . . . . . . . . . . . 185
Giovanni Bacci

PART IV PROGRESSES IN GENOME-TO-PHENOME INFERENCE

13 Phylogenetic Methods for Genome-Wide Association Studies in Bacteria . . . . . . 205

Xavier Didelot
14 Simple, Reliable, and Time-Efficient Manual Annotation
of Bacterial Genomes with MAISEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Mikolaj Dziurzynski, Przemyslaw Decewicz, Karol Ciuchcinski,
Adrian Gorecki, and Lukasz Dziewit

PART V COOKBOOK FOR PANGENOMICS

15 A Compendium of Bioinformatic Tools for Bacterial Pangenomics
to Be Used by Wet-Lab Scientists . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
Camilla Fagorzi and Alice Checcucci
16 A Protocol for Teaching Basic Next Generation Sequencing (NGS)
Analysis Skills to Undergraduate Students Using Bash and R . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Marco Fondi and Giovanni Bacci

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
Contributors

DAVIDE ALBANESE • Unit of Computational Biology, Research and Innovation Centre,

Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Italy
MARKUS J. ANKENBRAND • Center for Computational and Theoretical Biology, Biocenter,
University of Würzburg, Würzburg, Germany; Department of Bioinformatics, Biocenter,
University of Würzburg, Würzburg, Germany; Comprehensive Heart Failure Center,
University Hospital Würzburg, Würzburg, Germany
GIOVANNI BACCI • Department of Biology, University of Florence, Sesto Fiorentino, Italy
GUILLAUME BERNARD • Sorbonne Universités, UPMC Université Paris 06, Institut de
Biologie Paris-Seine (IBPS), Paris, France
DAVID CARAMELLI • Department of Biology, University of Firenze, Firenze, Italy
CHEONG XIN CHAN • Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland,
Brisbane, QLD, Australia; School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of
Queensland, Brisbane, QLD, Australia; Australian Centre for Ecogenomics, The
University of Queensland, Brisbane, QLD, Australia
ALICE CHECCUCCI • Department of Agricultural and Food Science, University of Bologna,
Bologna, Italy
KAROL CIUCHCINSKI • Faculty of Biology, Institute of Microbiology, Department of
Environmental Microbiology and Biotechnology, University of Warsaw, Warsaw, Poland
WEN-JING CUI • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological
Sciences, China Agricultural University, Beijing, China
PRZEMYSLAW DECEWICZ • Faculty of Biology, Institute of Microbiology, Department of
Environmental Microbiology and Biotechnology, University of Warsaw, Warsaw, Poland
FRANCESCA DI CESARE • Magnetic Resonance Center (CERM), University of Florence, Sesto
Fiorentino, Italy; Department of Biology, University of Florence, Florence, Italy
XAVIER DIDELOT • School of Life Sciences and Department of Statistics, University of
Warwick, Coventry, UK
CLAUDIO DONATI • Unit of Computational Biology, Research and Innovation Centre,
Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Italy
LUKASZ DZIEWIT • Faculty of Biology, Institute of Microbiology, Department of
Environmental Microbiology and Biotechnology, University of Warsaw, Warsaw, Poland
MIKOLAJ DZIURZYNSKI • Faculty of Biology, Institute of Microbiology, Department of
Environmental Microbiology and Biotechnology, University of Warsaw, Warsaw, Poland
CAMILLA FAGORZI • Department of Biology, University of Florence, Florence, Italy
MARCO FONDI • Department of Biology, University of Florence, Sesto Fiorentino, Italy
RAÚL A. GONZÁLEZ-PECH • Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland,
Brisbane, QLD, Australia
ADRIAN GORECKI • Faculty of Biology, Institute of Microbiology, Department of
Environmental Microbiology and Biotechnology, University of Warsaw, Warsaw, Poland
BERNHARD HAUBOLD • Research Group Bioinformatics, Max–Planck-Insitut für
Evolutionsbiologie, Plön, Germany
LI-NAN HUANG • School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, Guangdong
Province, China

ix
x Contributors

JIAN JIAO • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological Sciences,
China Agricultural University, Beijing, China
MICHAL KABZA • Department of Integrative Genomics, Faculty of Biology, Adam Mickiewicz
University, Poznan, Poland
ALEXANDER KELLER • Center for Computational and Theoretical Biology, Biocenter,
University of Würzburg, Würzburg, Germany; Department of Bioinformatics, Biocenter,
University of Würzburg, Würzburg, Germany
FABIAN KLÖTZL • Research Group Bioinformatics, Max–Planck-Insitut für
Evolutionsbiologie, Plön, Germany
MARTINA LARI • Department of Biology, University of Firenze, Firenze, Italy
JIE-LIANG LIANG • Institute of Ecological Science, School of Life Science, South China Normal
University, Guangzhou, Guangdong Province, China
EWA LOJKOWSKA • Department of Plant Protection and Biotechnology, Intercollegiate Faculty
of Biotechnology University of Gdansk & Medical University of Gdansk, University of
Gdansk, Gdansk, Poland
ALESSIO MENGONI • Department of Biology, University of Florence, Florence, Italy
AGNIESZKA MISZTAK • Department of Plant Protection and Biotechnology, Intercollegiate
Faculty of Biotechnology University of Gdansk & Medical University of Gdansk, University
of Gdansk, Gdansk, Poland
ALESSANDRA MODI • Department of Biology, University of Firenze, Firenze, Italy
AGATA MOTYKA-POMAGRUK • Department of Plant Protection and Biotechnology,
Intercollegiate Faculty of Biotechnology University of Gdansk & Medical University of
Gdansk, University of Gdansk, Gdansk, Poland
WEN-SHENG SHU • Institute of Ecological Science, School of Life Science, South China Normal
University, Guangzhou, Guangdong Province, China; Guangdong Magigene
Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou, Guangdong Province, China
TIMOTHY G. STEPHENS • Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland,
Brisbane, QLD, Australia
CHANG-FU TIAN • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological
Sciences, China Agricultural University, Beijing, China
STEFANIA VAI • Department of Biology, University of Firenze, Firenze, Italy
CHIARA VANNI • Max Planck Institute for Marine Microbiology, Bremen, Germany; Jacobs
University, Bremen, Germany
ZHANG WANG • Institute of Ecological Science, School of Life Science, South China Normal
University, Guangzhou, Guangdong Province, China
BILIANG ZHANG • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological
Sciences, China Agricultural University, Beijing, China
PAN ZHANG • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological Sciences,
China Agricultural University, Beijing, China
ZIDING ZHANG • State Key Laboratory of Agrobiotechnology, and College of Biological
Sciences, China Agricultural University, Beijing, China
SABINA ZOLEDOWSKA • Department of Plant Protection and Biotechnology, Intercollegiate
Faculty of Biotechnology University of Gdansk & Medical University of Gdansk, University
of Gdansk, Gdansk, Poland; Institute of Biotechnology and Molecular Medicine, Gdansk,
Poland
 Part I

Opportunities from Novel Sequencing Technologies

 Chapter 1

PacBio-Based Protocol for Bacterial Genome Assembly

Agata Motyka-Pomagruk, Sabina Zoledowska, Michal Kabza,
and Ewa Lojkowska

Abstract
Acquisition of high-quality bacterial genomes is fundamental, while having in mind investigation of subtitle
intraspecies variation in addition to development of sensitive species-specific tools for detection and
identification of the pathogens. In this view, Pacific Biosciences technology seems highly tempting taking
into consideration over 10,000 bp length of the generated reads. In this work, we describe a bacterial
genome assembly pipeline based on open-source software that might be handled also by
non-bioinformaticians interested in transformation of sequencing data into reliable biological information.
With the use of this method, we successfully closed six Dickeya solani genomes, while the assembly process
was run just on a slightly improved desktop computer.

Key words Next generation sequencing, Whole-genome sequencing, Single-molecule real-time

sequencing, Soft rot bacteria, Dickeya spp., Pectobacterium spp.

1 Introduction

High throughput and low cost are the hallmarks of next generation
sequencing (NGS) methods, which replaced Sanger-based
approaches in numerous studies on whole bacterial genomes. In
early 2011, Pacific Biosciences (PacBio) RS sequencer has been
released together with Ion Torrent’s PGM and the Illumina
MiSeq platforms [1]. The first technique exploits DNA polymerase
as a single-molecule real-time (SMRT) sequencing engine, yielding
significantly longer reads (approx. 10,000 bp) than the other
above-mentioned methods. Besides, tracking with the base-pair
resolution the kinetic parameters of each individual enzyme opens
perspective for studying the base methylation patterns, polymerase
inhibitors, or DNA binding proteins [2].
The insight into single nucleotide incorporations according to
SMRT technology is achieved within zero-mode waveguide
(ZMW), being a nanophotonic visualization compartment
operating at 100 zeptoliters detection volumes [3]. As depicted in

Alessio Mengoni et al. (eds.), Bacterial Pangenomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2242,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1099-2_1, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2021

3
4 Agata Motyka-Pomagruk et al.

Fig. 1 The principle of PacBio sequencing technology. Polymerase immobilized at the bottom of ZMV is
incorporating fluorescent phospholinked nucleotides into the nascent DNA strand. Attachment of each correct
nucleotide is associated with specific light emission signal followed by liberation of the fluorophore.
Subsequently, the enzyme shifts to the next nucleotide until the end of the template strand is reached.
Brown arrows mark excitation light, while blue and yellow arrows refer to the emission spectra, corresponding
in this case to T and G, respectively

Fig. 1, DNA polymerase attached to ZMW builds a complementary

strand to the DNA matrix from fluorescent phospholinked nucleo-
tides in the presence of a primer. Due to diverse exposure time to
ZMW, approaching of fluorescently labeled nucleotides is easily
discriminated from actual processing of the matching tagged
dNTPs. Notable peak in the fluorescent signal is noted when the
α-β phosphodiester bond is cleaved with the release of a fluoro-
phore. Usage of four distinct fluorescent labels permits to decipher
which nucleotide, namely, dATP, dTTP, dGTP, or dCTP, has been
introduced to a stated position in a newly synthesized strand. The
polymerase continues elongation of the nascent DNA after having
shifted by one base [2, 3].
Apart from the already mentioned dropping prices also higher
availability of NGS platforms contributed to the fact that the num-
ber of studies targeting acquisition of whole genomic information
is constantly increasing. For instance, there were 5,800 sequencing
projects registered in The Genomes Online Database (GOLD) in
2009 [4], in contrast to the current popularity of such actions
reaching the number of 317,275 (October, 2019). Still, vast major-
ity of the genomes deposited in publicly available databases are in
low quality draft states as the finishing steps are considered prob-
lematic, time-consuming and laborious [5].
Though, if the research is aimed at sequencing and subsequent
comparison of the genomes of multiple strains classified within a
 PacBio Protocol for Bacterial Genomes 5

certain species, high-quality genomic assemblies are required to

reveal subtle intraspecies variation [6].
Scientific interest of our group is focused on phytopathogens,
especially pectinolytic plant pathogenic bacteria classified to the
genera Dickeya and Pectobacterium within the recently established
family Pectobacteriaceae [7]. These microorganisms cause soft rot
on diverse crops (especially potato tubers), vegetables and orna-
mentals in addition to blackleg symptoms that are restricted to
potato plants [8]. Significant economic losses, for example, reach-
ing 30 million euro each year just in the seed potato production
sector [9], result either from tuber tissue decay or rejection/down-
grading of the latently infected planting material. During our pre-
vious studies, we collected a pool of pectinolytic bacteria belonging
to the Dickeya solani and Pectobacterium parmentieri species that
differed notably in their virulence; both in the capacity to macerate
plant tissue and the ability to produce virulence factors [10–
12]. Therefore, we decided to incorporate comparative genomic
approaches to screen the unique and accessory pangenome frac-
tions of two recently established pectinolytic species, D. solani and
P. parmentieri, for the presence of genes discriminating highly from
low virulent strains [13, 14]. Regarding D. solani, a tremendous
effort has been made in order to propose a genome assembly
pipeline yielding sequences of sufficient quality for the intended
downstream applications. Previous attempt taking advantage of
both 454 pyrosequencing (191,539 reads) and PacBio SMRT
(118,344 reads) technologies led to aquisition of a draft genomic
sequence of D. solani IFB0099 strain that consisted of 97 contigs
[15]. In that study, 454 reads were converted to FastQC format
and subsequently trimmed with the use of StreamingTrim version
1.0 [16]. Hybrid assembly of the trimmed 454 reads with PacBio
data was achieved with pacBioToCA and the runCA program of the
Celera assembler [17]. Prokka version 1.7.2 [18] was applied for
functional annotation [15]. Though, the resultant low accuracy
draft status of the genome turned out to be insufficient for the
needs of the planned comparative genomic study. Therefore, we
developed a novel genome assembly pipeline proven effective on
ten D. solani strains (Table 1). It required obtaining solely PacBio
reads (Table 2), took advantage of open-source software and run on
just slightly improved desktop computer handled by nonbioinfor-
maticians. In this way we closed six D. solani genomes, while the
others remain in just few scaffolds (Table 3). As D. solani is a highly
homogeneous species, it might be also interesting for other
researchers to look up the alternative hybrid approach (based on
PacBio and Illumina reads) that we incorporated for assembling the
genomes of P. parmentieri [13], being a much more heterogeneous
species.
6 Agata Motyka-Pomagruk et al.

Table 1
Dickeya solani strains for which the herein described PacBio reads-based genome assembly pipeline
was used

Strain nos. Country of isolation, year Origin References

a
IFB0099 Poland, 2005 Potato, cv. Santa [19, 20]
(IPO2276, LMG28824)
IFB0167 Poland, 2009 Potato, cv. Fresco [11]
IFB0212 Poland, 2010 Potato [21]
IFB0223a Germany, 2005 Rhizosphere of potato [10]
(457)
IFB0231 Finland, NA Potato, cv. Victoria [22]
(VIC-BL-25)
IFB0311 Poland, 2011 Potato, cv. Innovator [11]
IFB0417 Portugal, 2012 Potato, cv. Lady Rosetta [23]
IFB0421 Portugal, 2012 Potato, cv. Lady Rosetta [23]
IFB0487 Poland, 2013 Potato, cv. Vineta [23]
IFB0695 Poland, 2014 Potato, cv. Arielle [23]
IFB Bacterial strains collection of Intercollegiate Faculty of Biotechnology University of Gdansk and Medical University
of Gdansk, Gdansk, Poland
Numbers attributed to the analyzed D. solani strains in other bacterial collections are depicted in parentheses
a
The genomes of these two strains have been sequenced in the frames of the former project by BaseClear (Leiden, The
Netherlands) company (see Note 2)

2 Materials

2.1 General Purpose NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA).

2.2 Biological Bacterial biomass (the strains analyzed herein are listed in Table 1)
Material or 8 μg of high molecular RNA-free DNA (see Note 1).

2.3 Computer System Linux Mint version 17.3 Cinnamon 64-bit, Memory 62.8
Hardware GiB, Hard Drives 190 GB, Processor Intel Core i7-5820K
3.30GHz x 6, NVIDIA Corporation GM206 GeForce GTX 960.

2.4 Computer SMRT Analysis version 2.3, Canu version 1.5 [24], Quiver [25],
Software Prokka version 1.12 [18], samtools, pbalign.

3 Methods

3.1 Obtaining l Bacterial biomass of 8 D. solani strains spread in reductive man-

of PacBio Reads ner on Lysogeny Agar medium has been sent to GATC Biotech
(Konstanz, Germany) (see Note 2) for multiplication of this
Table 2
PacBio reads generated for the studied Dickeya solani genomes

Prefiltered reads Postfiltered reads Filtered subreads

Read Read
Strain No. of No. of bases Read No. of No. of bases length No. of No. of bases length
no.a readsb (bp) N50 length (bp) reads (bp) N50 (bp) reads (bp) N50 (bp)
IFB0167 150,292 1,407,716,051 22,946 9366 93,363 1,348,072,198 23,103 14,439 258,262 1,340,261,637 6168 5189
IFB0212 150,292 321,139,805 24,438 2136 26,205 309,536,324 24,763 11,812 62,031 307,660,285 6047 4959
IFB0231 300,584 805,230,988 21,411 2678 71,357 773,018,933 21,741 10,833 170,468 766,788,395 5500 4498
IFB0311 300,584 858,690,222 24,096 2856 73,736 825,635,137 24,433 11,197 221,577 816,213,960 4314 3683
IFB0417 150,292 1,107,402,396 14,983 7368 102,794 1,043,716,238 15,128 10,153 149,146 1,041,633,970 9484 6983
IFB0421 150,292 1,234,534,051 17,467 8214 106,388 1,201,169,375 17,650 11,290 186,060 1,197,494,239 8913 6436
IFB0487 150,292 1,080,552,377 14,413 7189 100,274 1,029,957,366 14,603 10,271 145,866 1,027,880,868 9524 7046
IFB0695 150,292 1,159,232,658 16,064 7713 99,604 1,127,327,575 16,294 11,318 160,271 1,124,511,594 9505 7016
a
Characteristics of the reads generated for IFB0099 and IFB0223 strains by BaseClear (Leiden, The Netherlands) company are listed in Note 2
b
300,584 reads were generated by 2 SMRT cells 2 movies, while 150,292 reads were obtained from 1 SMRT cell 1 movie
N50 - minimum lenght of contigs covering half of the assembly basses.
PacBio Protocol for Bacterial Genomes
7
 8

Table 3
Statistics of the assembled Dickeya solani genomes

Assembly statistics Annotation statistics

No. of genes encoding

No. of No. of N Genome size Largest contig No. of
Genome scaffolds bases (bp) (bp) N50 L50 %GC genes Proteins rRNA tRNA tmRNA
Agata Motyka-Pomagruk et al.

IFB0099 1 0 4,932,920 4,932,920 4,932,920 1 56.24 4326 4164 22 75 1

IFB0167 1 0 4,922,289 4,922,289 4,922,289 1 56.25 4308 4146 22 75 1
IFB0212 2 0 4,909,935 3,946,010 3,946,010 1 56.25 4304 4143 18 72 1
IFB0223 1 0 4,937,554 4,937,554 4,937,554 1 56.24 4328 4167 22 75 1
IFB0231 1 0 4,924,702 4,924,702 4,924,702 1 56.24 4313 4151 22 75 1
IFB0311 3 0 4,913,261 2,394,283 1,850,246 2 56.24 4306 4144 20 74 1
IFB0417 1 0 4,924,102 4,924,102 4,924,102 1 56.24 4608 4446 22 75 1
IFB0421 1 0 4,934,537 4,934,537 4,934,537 1 56.24 4349 4187 22 75 1
IFB0487 4 0 4,882,124 3,440,832 3,440,832 1 56.23 4572 4409 22 75 1
IFB0695 7 0 4,904,769 2,442,930 755,734 2 56.25 4337 4172 22 75 1
N50 - minimum lenght of contigs covering half of the assembly basses. L50 - number of contigs containing half of teh assembled genome.
 PacBio Protocol for Bacterial Genomes 9

Fig. 2 Pipeline for generation of PacBio reads. DNA is fragmented. Then

fragments of the selected size are repaired and ligated to SMRTbell adapters.
The primers and subsequently DNA polymerase anneal to SMRTbell templates.
After binding to ZMVs, the SMRTbell templates are sequenced on PacBio RS II
platform. The generated reads are deprived of adapters, short and low quality
sequences to form a set of filtered subreads

material in Lysogeny Broth medium at 28
C, cell disruption/

lysis, isolation of high molecular weight DNA (see Note 1) with
Maxi Prep Qiagen (Hilden, Germany), performing quantifica-
tion and quality control of the isolated genomic DNA.
l Subsequently standard genomic PacBio library was prepared
(Fig. 2, see Note 3) involving: fragmentation of DNA
(10,000 bp, see Notes 4 and 5), size selection, repair of DNA
damage (see Note 6) and DNA ends (see Note 7) and adapter
ligation (see Note 8), annealing of primer to SMRTbell tem-
plates (see Note 9), and annealing of polymerase to SMRTbell
templates (see Note 10) [26, 27].
l SMRTbell templates are incorporated into ZMWs (see
Note 11).
10 Agata Motyka-Pomagruk et al.

l Sequencing on PacBio RS II platform proceeds with the use of

raw data package (see Note 12, Fig. 1).

3.2 Primary l The reads generated by the PacBio RS II instrument were pro-
Analysis: Quality cessed and filtered with the use of SMRT Analysis version 2.3
Control and Adapter software (see Note 13) to generate the subreads (Fig. 2;
Trimming with SMRT Table 2). Data Management and SMRT Analysis modules are
Analysis compatible with the PacBio RS II data of interest.

3.3 Assembly l At first all the FASTQ format files have been merged (see Note
of PacBio Data 14).
l Then the successor of Celera assembler, Canu version 1.5 [24] was
incorporated for further correction, trimming and subsequent
assembly of the PacBio reads. This software is based on hierarchical
strategy, therefore profits from multiple rounds of read overlap-
ping in order to increase the quality of single-molecule reads
before performing the assembly process (see Note 15).

3.4 Polishing l Primarily the pacbio.fofn (see Note 16) file containing all paths
the Assembled to .bas.h5 (see Note 17) files present in the pacbio folder was
Genomes created.
with PacBio Data l Secondly, the data were converted with samtools (version 1.4.1)
faidx and pbalign [28] (see Notes 18 and 19).
l For getting consensus and variant calling Quiver [25] was
applied (see Note 20).

3.5 Functional l Functional annotation was accomplished with the use of Prokka
Annotation version 1.12 [18] (see Note 21; Table 3).
of the Genomes

4 Notes

1. DNA concentration should exceed 80 ng/μl with a maximum

volume of 100 μl. High DNA purity is required, meaning OD
260/280  1.8 and OD 260/230  1.9. It is important that
the sample does not contain impurities, such as biological
macromolecules (RNA, proteins, polysaccharides, lipids), che-
lating agents (e.g., EDTA), divalent metal cations (Mg2+), any
detergents (SDS, Triton X-100), or denaturants (e.g., phenol,
guanidinium salts), and has been suspended in RNase-, DNase-
, and protease-free Tris–HCl buffer (pH 8.0–8.5). Usually, an
additional sample (e.g., 20 μl) of the DNA elution buffer used
is requested by the sequencing companies. DNA should not
 PacBio Protocol for Bacterial Genomes 11

have been subjected to multiple freeze-thawing cycles, high

temperatures (e.g., >65
C for over 1 h), UV light, or pH
extremes (< 6 or >9). DNA should rather have been extracted
with the use of commercial kits as the organic extraction meth-
ods (involving phenol or TRIzol™) may inhibit the enzymes
utilized during library preparation. DNA may be shipped at the
room temperature, however performing transfer of the refri-
gerated material is highly recommended [26, 27].
2. Regarding two D. solani strains, IFB0099 and IFB0223, high
quality genomic dsDNA was sent in the frames of the previous
project to another sequencing company BaseClear (Leiden,
The Netherlands). For IFB0099 and IFB0223, respectively,
the following reads’ statistics have been acheived: number of
reads 118,344 and 102,248; sample yield 395,000,000 bp and
356,000,000 bp in addition to average length 3,340,000 bp
and 3,490,000 bp.
3. SMRTbell Template Prep Kit is used for libraries preparation,
while AMPure® PB beads are needed for the purification steps.
The template preparation protocol lasts 3–6 h.
4. Characteristics of the introduced DNA sample, namely, organ-
ism of origin, quality, amount, and purity, are crucial in terms of
size distribution after fragmentation and the resulting insert
size of the genomic PacBio library.
5. Achieved by shearing of DNA. Covaris S2 or LE 220 System
(500 bp < 5000 bp), Covaris g-Tube devices (>6000 bp) or
HydroShear instrument (>5000 bp) might be used.
6. Nicks, abasic regions, thymine dimers, cytosine deamination,
blocked 30 -ends, and oxidation damage sites are treated with
the use of a DNA-damage repair mix.
7. T4 DNA polymerase is utilized for both filling in 50 overhangs
and the removal of 30 overhangs. T4 polynucleotide kinase
phosphorylates the 50 hydroxyl group. Thus, blunt ends are
formed.
8. Double-stranded DNA matrix capped by hairpin loops forms
the SMRTbell template (Fig. 2). In terms of topology,
SMRTbell template is circular, while regarding structure, it is
linear. The ligated adapters protect the ends of the DNA frag-
ments from the action of exonucleases (exonuclease III, exo-
nuclease VII) utilized for degradation of the failed ligation
products or adapter dimers in the following AMPure® PB
beads purification steps.
9. The sequencing primer-binding sites are located within the
loops of the ligated hairpin adapters. The primers hybridize
to both ends of the SMRTbell template. Higher stability of the
primers is assured by 20 -methoxy modifications.
12 Agata Motyka-Pomagruk et al.

10. For binding of DNA polymerase to the primer-annealed

SMRTbell templates, incubation at 30
C for 30 min is
performed.
11. Efficacy of loading SMRTbell templates into ZMWs depends
on the insert size; SMRTbell templates containing smaller
fragments link more potently than these including larger
inserts. Libraries larger than 1000 bp are immobilized in the
bottom of ZMWs by paramagnetic beads. The MagBead load-
ing procedure starts from hybridization between the poly-A tail
of the sequencing primer and the oligo dT on the surface of
magnetic beads. After the washing steps, SMRTbell-MagBead
sample is moved to a 96-well plate, loaded on the instrument,
and then put into the SMRT Cell for immobilization.
The MagBead station moves the beads around the surface of
the SMRT Cell in order to immobilize SMRTbell templates at
the bottom of the ZMWs.
12. Specification >500 Mb raw data per package (3%), polymer-
ase reads >6000 bp.
13. Read-length (>50), subread-length (>50), and read quality
(>0.75) filters were implemented.
14. cat pacbio/*.fastq > pacbio.fastq
15. canu genomeSize¼4.9 m maxMemory¼20 maxThreads¼12
minOverlapLength¼500 -pacbio-raw pacbio.fastq
16. with .fofn referring to “file of file names”.
17. These are the main output files generated by the primary
analysis pipeline on PacBio RS II.
18. samtools faidx canu/canu.contigs.fasta
19. pbalign --nproc 12 --forQuiver pacbio.fofn canu/
canu.contigs.fasta quiver.cmp.h5
20. quiver -j 12 -r canu/canu.contigs.fasta -o quiver.
gff -o quiver.fasta quiver.cmp.h5
21. prokka --cpus 12 --compliant --centre XXX --rfam --
force --outdir prokka_1/ --prefix IFB_0099 --
genus Dickeya --species solani --strain IFB_0099
genome.fasta

Acknowledgments

All sequencing and comparative genomics research tasks were con-

ducted thanks to founding from National Science Centre in Poland
via 2014/14/M/NZ8/00501 granted to E.L. A.M.P. is sup-
ported from National Science Centre in Poland via 2016/21/N/
NZ1/02783.

References
1. Quail M, Smith ME, Coupland P et al (2012)
A tale of three next generation sequencing plat-
forms: comparison of Ion Torrent, Pacific Bios-
ciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC
Genomics 13:341. https://doi.org/10.1186/
1471-2164-13-341
2. Eid J, Fehr A, Gray J et al (2009) Real-time
DNA sequencing from single polymerase
molecules. Science 323:133–138. https://doi.
org/10.1126/science.1162986
3. Korlach J, Bjornson KP, Chaudhuri BP et al
(2010) Real-time DNA sequencing from single
polymerase molecules. Methods Enzymol
472:431–455. https://doi.org/10.1016/
S0076-6879(10)72001-2
4. Liolios K, Chen I-MA, Mavromatis K et al
(2010) The Genomes On Line Database
(GOLD) in 2009: status of genomic and meta-
genomic projects and their associated meta-
data. Nucleic Acids Res 38:D346–D354.
https://doi.org/10.1093/nar/gkp848
5. Galardini M, Biondi EG, Bazzicalupo M, Men-
goni A (2011) CONTIGuator: a bacterial gen-
omes finishing tool for structural insights on
draft genomes. Source Code Biol Med 6:11.
https://doi.org/10.1186/1751-0473-6-11
6. Tettelin H, Riley D, Cattuto C, Medini D
(2008) Comparative genomics: the bacterial
pan-genome. Curr Opin Microbiol
11:472–477. https://doi.org/10.1016/J.
MIB.2008.09.006
7. Adeolu M, Alnajar S, Naushad S, Gupta RS
(2016) Genome-based phylogeny and taxon-
omy of the ‘Enterobacteriales’: proposal for
Enterobacterales ord. nov. divided into the
families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam.
nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae
fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganella-
ceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov. Int J
Syst Evol Microbiol 66:5575–5599. https://
doi.org/10.1099/ijsem.0.001485
8. Perombelon MCM, Kelman A (1980) Ecology
of the soft rot Erwinias. Annu Rev Phytopathol
18:361–387. https://doi.org/10.1146/
annurev.py.18.090180.002045
9. Toth IK, van der Wolf JM, Saddler G,
Lojkowska E, Hellas V, Pirhonen M, Tsror L,
Elphinstone JG (2011) Dickeya species: an
emerging problem for potato production in
Europe. Plant Pathol 60:385–399. https://
doi.org/10.1111/j.1365-3059.2011.02427.x
10. Potrykus M, Golanowska M, Hugouvieux-
Cotte-Pattat N, Lojkowska E (2014) Regula-
tors involved in Dickeya solani virulence, genetic
conservation, and functional variability. Mol
PacBio Protocol for Bacterial Genomes 13
Plant-Microbe Interact 27:700–711. https://
doi.org/10.1094/MPMI-09-13-0270-R
11. Potrykus M, Golanowska M, Sledz W,
Zoledowska S, Motyka A, Kołodziejska A,
Butrymowicz J, Lojkowska E (2016) Biodiver-
sity of Dickeya spp. isolated from potato plants
and water sources in temperate climate. Plant
Dis 100:408–417. https://doi.org/10.1094/
PDIS-04-15-0439-RE
12. Zoledowska S, Motyka A, Zukowska D,
Sledz W, Lojkowska E (2018) Population struc-
ture and biodiversity of Pectobacterium parmen-
tieri isolated from potato fields in temperate
climate. Plant Dis 102:154–164. https://doi.
org/10.1094/PDIS-05-17-0761-RE
13. Zoledowska S, Motyka-Pomagruk A, Sledz W,
Lojkowska E (2018) High genomic variability
in the plant pathogenic bacterium Pectobacter-
ium parmenieri deciphered from de novo
assembled complete genomes. BMC Genomics
19:751. https://doi.org/10.1186/s12864-
018-5140-9
14. Golanowska M, Potrykus M, Motyka-
Pomagruk A, Kabza M, Bacci G, Galardini M,
Bazzicalupo M, Makalowska I, Smalla K,
Mengoni A, Hugouvieux-Cotte-Pattat N, Loj-
kowska E (2018) Comparison of highly and
weakly virulent Dickeya solani strains, with a
view on the pangenome and panregulon of
this species. Front Microbiol 9:1940. https://
doi.org/10.3389/fmicb.2018.01940
15. Golanowska M, Galardini M, Bazzicalupo M,
Hugouvieux-Cotte-Pattat N, Mengoni A,
Potrykus M, Slawiak M, Lojkowska E (2015)
Draft genome sequence of a highly virulent strain
of the plant pathogen Dickeya solani, IFB0099.
Genome Announc 3:e00109–e00115. https://
doi.org/10.1128/genomeA.00109-15
16. Bacci G, Bazzicalupo M, Benedetti A, Mengoni
A (2014) StreamingTrim 1.0: a Java software
for dynamic trimming of 16S rRNA sequence
data from metagenetic studies. Mol Ecol
Resour 14:426–434. https://doi.org/10.
1111/1755-0998.12187
17. Koren S, Schatz MC, Walenz BP et al (2012)
Hybrid error correction and de novo assembly of
single-molecule sequencing reads. Nat Biotech-
nol 30:693–700. https://doi.org/10.1038/
nbt.2280
18. Seemann T (2014) Prokka: rapid prokaryotic
genome annotation. Bioinformatics
30:2068–2069. https://doi.org/10.1093/bio
informatics/btu153
19. Slawiak M, Łojkowska E, van der Wolf JM
(2009) First report of bacterial soft rot on
14 Agata Motyka-Pomagruk et al.
potato caused by Dickeya sp. (syn. Erwinia chry-
santhemi) in Poland. Plant Pathol 58:794–794.
https://doi.org/10.1111/j.1365-3059.2009.
02028.x
20. Slawiak M, van Beckhoven JRCM, Speksnijder
AGCL et al (2009) Biochemical and genetical
analysis reveal a new clade of biovar 3 Dickeya
spp. strains isolated from potato in Europe. Eur
J Plant Pathol 125:245–261. https://doi.org/
10.1007/s10658-009-9479-2
21. Golanowska M, Kielar J, Lojkowska E (2017)
The effect of temperature on the phenotypic fea-
tures and the maceration ability of Dickeya solani
strains isolated in Finland, Israel and Poland. Eur
J Plant Pathol 147:803–817. https://doi.org/
10.1007/s10658-016-1044-1
22. Degefu Y, Potrykus M, Golanowska M,
Virtanen E, Lojkowska E (2013) A new clade
of Dickeya spp. plays a major role in potato
blackleg outbreaks in North Finland. Ann
Appl Biol 162:231–241. https://doi.org/10.
1111/aab.12020
23. Motyka-Pomagruk A (2019) Genotypic and
phenotypic characterization of bacteria from
Dickeya solani species and development of
novel control methods against phytopatho-
gens. PhD thesis, University of Gdańsk
24. Koren S, Walenz BP, Berlin K et al (2017)
Canu: scalable and accurate long-read assembly
via adaptive k-mer weighting and repeat sepa-
ration. Genome Res 27:722–736. https://doi.
org/10.1101/gr.215087.116
25. Chin CS, Alexander DH, Marks P et al (2013)
Nonhybrid, finished microbial genome assem-
blies from long-read SMRT sequencing data.
Nat Methods 10:563–569. https://doi.org/
10.1038/nmeth.2474
26. Pacific Biosciences P/N 000-710-821-13
(2014) Template preparation and sequencing
guide. Pacific Biosciences, Menlo Park, CA
27. Pacific Biosciences 100-338-500-01 (2014)
Introduction to SMRTbell™ template prepa-
ration. Pacific Biosciences, Menlo Park, CA
28. Li H, Shahriari AR, Wysoker A (2009) Dur-
bin R; 1000 genome project data processing
subgroup. The sequence alignment/MAP
format and samtools. Bioinformatics
25:2078–2079
 Chapter 2

The Illumina Sequencing Protocol and the NovaSeq 6000

System
Alessandra Modi, Stefania Vai, David Caramelli, and Martina Lari

Abstract
The NovaSeq 6000 is a sequencing platform from Illumina that enables the sequencing of short reads with
an output up to 6 Tb. The NovaSeq 6000 uses the typical Illumina sequencing workflow based on library
preparation, cluster generation by in situ amplification, and sequencing by synthesis. Flexibility is one of the
major features of the NovaSeq 6000. Several types of sequencing kits coupled with dual flow cell mode
enable high scalability of sequencing outputs to match a wide range of applications from complete genome
sequencing to metagenomics analysis. In this chapter, after explaining how to assemble a normalized pool
of libraries for sequencing, we will describe the experimental steps required to run the pools on the
NovaSeq 6000 platform.

Key words Library quality control, Library quantification, Sequencing pool, Standard sequencing
workflow, XP sequencing workflow, Run setup

1 Introduction

The NovaSeq 6000 System is a production-scale sequencing plat-

form from Illumina, Inc. The instrument makes use of the Illumina
sequencing by synthesis (SBS) chemistry and enables the massively
parallel sequencing of billions of DNA fragments in the range of
50–500 bases with an output up to 6 Tb. Beside the high-
throughput and cost-effective sequencing, the NovaSeq 6000
offers flexible output and run-time configuration. Multiple flow
cell types support a wide output range. User can choose between
four flow cell types (SP, S1, S2, and S4) and different read lengths
to easily adjust output and sample throughput of sequencing run to
a specific project (Table 1). More flexibility is achieved with indi-
vidual lane loading (Xp workflow): two lanes for SP, S1, and S2 flow
cells; four lanes for S4 (Fig. 1). Additionally, the instrument can run
one or two flow cells of the same type at a time. Due to scalability,
the NovaSeq 6000 could be applied in several applications spanning
from complete genome and exome sequencing to target

Alessio Mengoni et al. (eds.), Bacterial Pangenomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2242,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1099-2_2, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2021

15
16 Alessandra Modi et al.

Table 1
NovaSeq 6000 flowcells and outputs

Reads passing filter

(Billion reads)

Flow cell Sequencing output Number of lanes on Single Paired-end Run time
type (Gb) flowcell reads reads (h)
SP 2
50 bp 65–80 2 0.6–0.8 1.3–1.6 13
SP 200–250 25
2
150 bp
SP 325–400 38
2
250 bp
S1 2
50 bp 134–167 2 1.3–1.6 2.6–3.2 13
S1 2
100 bp 266–333 19
S1 2
150 bp 400–500 25
S2 2
50 bp 333–417 2 3.3–4.1 6.6–8.2 16
S2 2
100 bp 667–833 25
S2 2
150 bp 1000–1250 36
S4 2
100 bp 1600–2000 4 8–10 10–20 36
S4 2
150 bp 2400–3000 44

Fig. 1 NovaSeq 6000 flow cell types. From left to right SP, S1, S2, and S4 flow cell respectively. Lanes size
and number according to kit output

approaches, transcriptome and gene expression analysis, and shot-

gun metagenomics.
As in other Illumina NGS sequencing systems, the NovaSeq
6000 workflow includes four basic steps:
 NovaSeq 6000 Sequencing Protocol 17

1. Library preparation. The first step is the conversion of the

genomic DNA (gDNA), cDNA, or PCR amplicons into a
sequencing library. DNA fragments are coupled with two oli-
gonucleotides adapters (named as P5 and P7) carrying specific
sequences that enable the subsequent amplification and
sequencing steps in the Illumina sequencing systems. During
library preparation, short individual “barcode” sequences
(“indexes”) are also added to the standard adapters in order
to allow the simultaneous sequencing of DNA fragments from
different samples (multiplexing).
Two main different approaches can be applied to obtain
sequencing libraries from genomic DNA or cDNA. In the
“TruSeq” approach, a sequencing library is generated by ran-
dom mechanical fragmentation of the DNA sample (usually
with an ultrasonicator), followed by 50 and 30 adapters ligation
[1]. Alternatively, following the “Nextera” workflow, fragmen-
tation and ligation reactions can be combined into a single step
employing a transposon/transposase-mediated cleavage mech-
anism (“tagmentation”) [1]. Genomic fragments are subse-
quently amplified using primers targeted to adaptor
sequences. During the library amplification step, individual
indexes are incorporated into the adaptors of each sample by
means of sample-specific indexing primers; both single or dou-
ble indexing can be performed in order to increase multiplex-
ing. Several commercial library preparation kits are available
Most of the commercial kits have been optimized for specific
applications (e.g., transcriptomics, epigenomics, ChIP-seq,
PCR-free library). Alternatively, custom in-house protocols
have been developed [2, 3]. When degraded material is ana-
lyzed, as in the case of DNA extracted from ancient biological
samples, fragmentation step is usually skipped, and adapters are
ligated directly to the ends of each DNA molecules. Amplicons
targeted sequencing, as in a typical microbial metagenomic 16S
analysis, can be simply achieved by using user-defined PCR
primers with overhang adapters; a subsequent limited-cycle
amplification step is performed to add multiplexing indexes
and Illumina sequencing adapters [4]. For some applications
where huge numbers of targets are required, specific amplicon
panels can be designed and purchased.
After quality control and quantification, indexed libraries
are normalized, pooled in the required molarity, and then
loaded into the sequencing platform along with buffers and
reagents.
Despite the original source material and/or the specific
library preparation protocol followed, each type of library can
be virtually sequenced in all the Illumina sequencing platforms.
The choice of a specific sequencer and of the appropriate
sequencing kit is therefore mainly driven by the required out-
put and cost-effectiveness.
18 Alessandra Modi et al.

2. Cluster generation. For cluster generation, the library is loaded

into a flow cell, a glass slide containing small fluidic channels
and a lawn of surface-bound oligonucleotides complementary
to the library adapters. The DNA library hybridize to these
oligonucleotides, temporarily immobilizing individual DNA
fragments onto the flow cell. After library hybridization, poly-
merases, dNTPs, and buffers are pumped in the flow cell. Each
single fragment is then copied several thousand times to gener-
ate distinct, clonal clusters through an in-situ amplification
process known as “bridge PCR” [5]. When cluster generation
is complete, the templates are ready for sequencing.
The NovaSeq 6000 makes use of patterned flow cells that
contain billions of nanowells at fixed locations across both
surfaces of the flow cell [6]. The structured organization pro-
vides fixed spacing of sequencing clusters, making the flow cells
less susceptible to overloading, and reduces run time (no need
to map cluster sites during sequencing). Additionally, higher
cluster density leads to more usable data per flow cell.
3. Sequencing. Within each cluster, templates are sequenced by
means of Illumina sequencing by synthesis (SBS) chemistry.
The SBS chemistry is a reversible terminator–based method
using a single base extension and competitive addition of
nucleotides [5]. As all four nucleotides are present during
each sequencing cycle, the method minimizes incorporation
bias and significantly reduces errors and missed calls associated
with strings of repeated nucleotides. Illumina sequencing kits
are designed to support both single-end and paired-end
sequencing. In paired-end sequencing the DNA fragments of
each cluster are first sequenced from one end (as in the single-
end sequencing) and then from the opposite end. This
approach generates high-quality sequence data improving
alignment and genome assembly. Additionally, paired-end
sequencing can help in identifying authentic reads from endog-
enous DNA when libraries from ancient and degraded samples
are analyzed.
During each sequencing cycle, a single florescent labeled
deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) is added to the nucleic
acid chains. The label dyes act as a reversible 30 blockers and
serve a terminator for DNA strand synthesis. As each dNTP is
added, the fluorescently dye is imaged and then cleaved to
allow incorporation of the next nucleotide. At each sequencing
cycle, fluorescent emission from each cluster is registered and
normalized. Emission wavelength and intensity are then used
by control software of the instrument to call the bases. For
nucleotide detection, the NovaSeq 6000 makes use of the
two-channel SBS method that requires only two images per
cycle, instead of four, and accelerates sequencing and data
 NovaSeq 6000 Sequencing Protocol 19

processing times. Rather than four separate dyes, two-channel

SBS uses a mix of dyes. Images are taken of each DNA cluster
using only two different wavelength filter bands. Clusters seen
in red or green images are interpreted as C and T bases,
respectively. Clusters observed in both red and green images
(yellow clusters) are recognized as A bases, while unlabeled
clusters correspond to G bases. The NovaSeq 6000 usually
produces 75–85% of sequenced bases over 30 quality score,
that means 0.1% probability that a base was called incorrectly.
4. DataAnalysis. After a sequencing run is completed, data are
available for downstream analysis. In order to assign the reads
to each different sample, raw data are first “demultiplexd” by
means of indexes recognition. The sequenced reads are then
mapped to a reference genome or sequence and analyzed
according to specific approaches (e.g., SNPs and indel identifi-
cation, phylogenetic or metagenomic analysis).
While steps 1 (Library Preparation) and 4 (Data analysis)
can be carried out in any molecular biology laboratory or
computation facility regardless of the sequencing machine
and the run schedule, steps 2 (Cluster Generation) and
3 (Sequencing) are physically executed into the sequencing
platform during the run.
In this chapter, we will describe the experimental steps
required to run a set of libraries on the NovaSeq 6000 sequenc-
ing platform (Fig. 2).
We will first provide some tips for the following:
(a) To perform library quantification and quality control.
(b) To normalize concentration and prepare an equimolar
pool of libraries.

Then, according to the specific manuals of instruction by Illu-

mina [7], we will report the workflow that should be followed for
the following steps:
(a) To prepare reagents for cluster generation and sequencing.
(b) To load the pools of libraries and reagents on the flow cell with
both standard and XP workflow.
(c) To set the instrument for the run.

2 Materials

2.1 General Automated electrophoresis system with related reagents and data
Equipment and processing software.
Reagents Fluorometer with related reagents.
Vortex.
20 Alessandra Modi et al.

Fig. 2 Schematic overview of the experimental steps for pooling sequencing

libraries and run the pools on the NovaSeq 6000

Microspin.
Micropipettes with disposable tips.
Ice bath.
10 mM Tris–HCl, pH 8.5.
0.2 N NaOH.
For library dilutions and pool assembling we suggest using LoBind
or siliconized tubes.

2.2 Proprietary PhiX Control v3 (FC-110-3001).

Reagents and NovaSeq Reagent Kits: several kits are available, according to
Materials from different flow cells and outputs (Table 1). Each kit provides the
Illumina1 following:

1
At the time of writing, the authors are not aware of alternative suppliers offering sequencing reagents and
materials compatible with Illumina NovaSeq6000 System.
Another random document with
no related content on Scribd:
villalankoineen. Mrs. Edgecomben tavallinen lepotuoli, joka talvisin
nostettiin takkavalkean ääreen ja kesäisin avoimen, penkereelle
vievän oven luo, sijaitsi kiinalaisen varjostimen muodostamassa
komerossa; sen vieressä olevalla pöydällä oli paitsi viuhkaa ja
hajupulloa äsken luettu kirja tai päivän posti. Siinä nurkassa oli siellä
täällä joitakuita tuoleja vieraita varten. Kaikesta näkyi, että siinä
huoneessa elettiin, ajateltiin, työskenneltiin ja keskusteltiin. Kukkien
raikas tuoksu ja kiinalaisten lakeerattujen töitten, santelipuisten
rasiain ja nahkaselkäisten kirjankansien tuoksu tuntui ihanalta.
Ikkunaverhot päivisin ja lampunvarjostimet iltaisin aikaansaivat
huoneessa miellyttävän hämärän, joten jokainen saapuessaan tähän
huoneeseen tunsi suloista hyvinvointia. Tässä huoneessa Mrs.
Edgecombe istui mainittuna iltapäivänä — kello oli noin kuusi —
avaten kirjaa, kun vieraita saapui.

»Tohtori Scherenberg», ilmoitti palvelija vetäen syrjään raskaat

oviverhot.

Mrs. Edgecombe nyökäytti päätään. Sitten hänen katseensa

ilmaisi tyytyväisyyttä. Tohtori Scherenberg, hänen kotilääkärinsä tai
oikeammin hänen ystävänsä — sillä hän ei koskaan ollut sairas —
oli aina tervetullut vieras. Harvan ihmisen seura saattoi niin virkistää
häntä, vaikka hänen kodissaan seurusteli monta mielenkiintoista
henkilöä.

Tohtori Scherenberg eli »Scherr», kuten Mrs. Edgecombe häntä

nimitti, oli hänen suosikkinsa. »Scherr»-nimityksen, joka oli lyhennys
hänen nimestään, sai hän siitäkin syystä, että hänen voimakas
puhetapansa muistutti Johannes Scherrin kirjoitustyyliä, samoin kuin
myös hänen alituinen katkeruutensa ihmissuvun tyhmyydestä
muistutti tätä kulttuuri-historioitsijaa.
 Tohtori astui sisään, ja hänen takanaan saapui eräs toinen herra.

»Tuon omin lupini tänne erään 'suositetun', Mrs. Edgecombe»,

sanoi tohtori ja esitti vieraan, jonka nimeä talon emäntä ei
kuitenkaan kuullut.

Vieras kumarsi, ja ystävällisesti hymyillen ja sanoen »hyvin

hauskaa»
Mrs. Edgecombe pyysi häntä istuutumaan.

»Ehkei se teistä ole niinkään hauskaa», keskeytti tohtori

Scherenberg.
»Tuo lauseparsi on vain tylsynyt keihäs seuraelämän asevarastossa.
Tarkoitukseni ei ollutkaan tuottaa teille hauskuutta, vaan huvittaa
holhokkiani.»

»Oletteko äskettäin tullut Wiesbadeniin?» kysyi Mrs. Edgecombe

»holhokilta».

»Saavuin tänne eilen ja menin heti tohtori Scherenbergin luo

vieden hänelle erään yhteisen ystävämme kirjeen.»

»Entä mistä te tulette?»

»Viimeksi olin Frankfurtissa, mutta sitä ennen olen monta vuotta

oleskellut Filadelfiassa.»

Silloin Mrs. Edgecombe katsahti tutkivasti häneen. Pitkämatkaiset

matkailijat herättivät hänen erikoista mielenkiintoaan.

Vieras oli kolmenkymmenenkuudenvuotias, ja hänellä oli hyvin

säännölliset piirteet; hänen vartalonsa oli solakka ja pitkä. Hänellä oli
hyvinhoidettu kokoparta, ja hänen lyhyeksi leikattu tukkansa oli
paksu ja kihara. Niin hyvin hänen pukunsa kuin käytöksensä olivat
moitteettomat.

»Ja siellä teidän olisi pitänyt pysyä», härnäili tohtori.

»Tähtilippuinen maa on vielä niin nuori ja elämänhaluinen, meidän
Eurooppamme ollessa vanha sammaltunut raunio, jota
madonsyömät,
horjuvat pilarit kannattavat.»

»Mutta rakas Scherr, älkää puhuko siten vanhoista maista vanhan

naisen läsnäollessa», sanoi Mrs. Edgecombe nauraen, »niidenkin
täytyy saada olla olemassa.»

»Te, Mrs. Edgecombe, kuulutte nuorekkaimpiin ihmisiin, mitä

tunnen. Te ette koskaan vanhene, sillä te ette anna elämän
pyrkimysten mennä ohitsenne, vaan seuraatte itse mukana. Te olette
valmis tutustumaan kaikkeen uuteen, versovaan, koittavaan; te ette
kiinny tietämättömyyden pimennossa olevaan patsaaseen. Mutta
puhuessamme nuoruudesta, missä on miss Jane?»

»Veljentyttäreni on ulkona, mutta ellen erehdy, ajavat vaunut juuri

pihalle; se kai on Jane, joka palaa kotiin… Entä mitä te pidätte
Wiesbadenista?» kysyi hän jälleen vieraaltaan.

»Mitä tähän saakka olen nähnyt, on ihastuttavaa: kulttuurin loisto

ja luonnon kauneus yhteen sulaneina. Taidenautinnoista ei täällä
myöskään näy olevan puutetta. Minä olin eilen teatterissa: näyteltiin
Freytagin 'Sanomalehtimiehiä'; yhteisnäytteleminen oli hyvää; Bolzin
osa…»

Hänen puheensa keskeytyi, sillä Hanna astui sisään.

 Molemmat herrat nousivat.

»Vai niin, te olette täällä, tohtori Scherenberg!» huudahti Hanna

ojentaen kätensä hänelle. Sitten hän katsahti vieraaseen, joka
kumarsi jääden tuijottamaan Hannaan. Tämä näytti myöskin
hämmästyneeltä. Missä hän olikaan nähnyt nämä piirteet?

»Vanha ystävämme on tuonut tänne uuden ystävänsä, Jane»,

sanoi Mrs. Edgecombe. »Suokaa anteeksi, mutta en kuullut teidän
nimeänne; sitäpaitsi unohdan aina nimet, joita en ole nähnyt
kirjoitettuina.»

Vieras otti esiin lompakkonsa.

Mrs. Edgecombe otti vastaan käyntikortin, katsahti siihen

sivumennen ja pani sen sitten pöydälle. Oli jo hämärä, joten hän ei
voinut erottaa pienillä kirjaimilla painettua nimeä, sillä silloin hän olisi
huomannut, että siinä oli nimi Ewald Ballmann.

Molemmat puolisot katsoivat toisiansa yhä edelleen kiihtyneinä,

ihmeissään, mutta eivät tunteneet toisiaan.

»Mikä yhdennäköisyys!» ajattelivat he molemmat — »mutta

kuitenkin erilainen, miten paljon kauniimpi onkaan tämä kuin
sielussani kantamani kuva…»
XXXII.

Keskustelu oli pian taas käynnissä. Hanna istuutui nojatuoliin

lepotuolin jalkopäässä, ja molemmat herrat istuutuivat entisille
paikoilleen.

Mrs. Edgecombe, joka, ehkä kiusoitellakseen tohtoria, ei tänään

väsynyt käyttämästä iänikuisia lauseparsia, kysyi jälleen vieraalta:

»Aiotteko viipyä kauan Wiesbadenissa?»

»Luultavasti muutamia viikkoja; se riippuu olosuhteista.»

»Taikka siitä, miten viihdytte täällä.»

»Mitä siihen tulee, olen tähän saakka viihtynyt erinomaisesti…»

Ja taasen hän käänsi katseensa Hannaan.

»Varokaa ensi hetken vaikutelmia!» yhtyi Hanna puheeseen.

»Matkoillamme olemme usein huomanneet saaneemme kylliksi
niistä paikoista, jotka ensi silmäyksellä ovat näyttäneet ihanilta.»

»Tohtorimme tässä ei ainakaan ihastu ensi silmäyksellä», jatkoi

Mrs. Edgecombe leikkiä laskien. »Hän on rakentanut kokonaisen
teorian siitä, ja tämän teorian hän on meille selittänyt kuten kaikki
muutkin teoriansa.»

»Älkää nyt saattako minua huonoon valoon, Mrs. Edgecombe! En

ole mikään teoreetikko. Jos epäilen ensi silmäyksen vaikutelmia,
jotka ovat aiheena kaikkiin erehdyksiin, niin epäilen vielä enemmän
teorioja. Jos jollain ihmisellä ei ole selvää käsitystä jostain asiasta,
niin hän yhdistää tavallisesti sata enemmän tai vähemmän
epäselvää käsitettä ja nimittää sitä teoriaksi.»

»Varokaa, Scherr, te olette jo hyvällä alulla rakentamassa teoriaa

teorioista», keskeytti Mrs. Edgecombe.

»Vaikka nyt joudunkin vaaraan, että minun luullaan tahtovan

rakentaa teoria, täytyy minun kuitenkin puolustaa epäiltyjä
'ensivaikutelmia', niin pieneksi kuin arvostelenkin kykymme ilmaista
niitä», sanoi Ballmann. »Kielemme on niin köyhä, ettei se kykene
kohoamaan edes ensi kerrokseen ajatustemppelissä. Kun se haluaa
seurata ajatustemme lentoa, niin sen lyijynraskaitten siipien
aikaansaama melu paraiten vaimennetaan runollisella muodolla.
Siksi onkin runous ja musiikki salaisimpien, ylevimpien
vaikutelmiemme paras ilmaisumuoto.»

»Jos te olette runoilija, olisi ollut rehellisempää sanoa se heti

minulle», keskeytti tohtori. »Silloin en olisi niin muitta mutkitta sallinut
runoratsurin tunkeutua pahaa-aavistamattomien ystävieni kotiin.»

»Pelkäämmekö me sitten runoutta niin kovin?» kysyi Hanna.

»Rauhoittukaa», sanoi Ballmann, »minä en ole eläissäni

kirjoittanut runoa… minä olen ennen pelännytkin runoutta, kuten neiti
suvaitsi sanoa. Tämän pelon olen nyttemmin kuitenkin voittanut,
mutta minua ei kuitenkaan voi koskaan laskea tohtorin pelkäämiin
runoilijoihin. On vallan ihme, miten paljon aika ja olosuhteet voivat
muuttaa ihmistä.»

»Se on varmaa se», vahvisti Hanna.

»Neiti on tuskin voinut sitä kokea huolettomassa elämässään,

mutta minä, joka kohtalon pakosta sain jättää urani ja jouduin vallan
toisiin olosuhteisiin, voisin kertoa yhtä ja toista niistä muutoksista,
joiden alaiseksi ihminen voi joutua.»

»Kertokaa siitä meille», pyysi Mrs. Edgecombe, »se on varmaan

hyvin mieltäkiinnittävää.»

»Kuten käskette», vastasi Ballmann, »vaikka on vaikeata lyhyesti

kertoa kehittymisestä, joka on seurauksena pienistä toisiinsa
vaikuttavista seikoista… Nuoruudessani olin ujo, en siksi, että olisin
oppinut tuntemaan ihmisten huonon puolen, vaan pikemmin siksi,
etten heitä ensinkään tuntenut. Silloin kohtasi minua suuri
perheonnettomuus… johon ehkä itse olin suurimmaksi osaksi
syypää. Mutta se ei kuulu tähän. Tahdon vain sanoa, että tämän
tapahtuman johdosta heräsin tavallisesta uneliaasta tavastani ja
omien kärsimysten kautta opin tuntemaan ihmiskunnan kärsimyksiä.
Siitä hetkestä saakka kiinnittivät mieltäni maailmassa vellovat
rakkauden ja vihan, huimaavan onnen ja katkeran surun aallot.
Tavalliset kuivat työskentelyni eivät viehättäneet minua enää; minun
täytyi itseni syöstä maailmanmeren pyörteisiin. Ainoastaan siten
saatoin unohtaa tuskani… Kaikki oli minulle uutta, ja minusta tuli
siten uusi ihminen. Janosin mielenliikutuksia ja ahmin runoilijain ja
taiteilijain teoksia. Luin romaaneja, olin läsnä näytännöissä, joissa
vuoroin näin liikuttavia, vuoroin kauheita kohtauksia, kuulin
hivelevää, ihanaa musiikkia, ja silloin avautui minulle intohimoinen
elämä ja hengitin kuin uudessa maailmassa. Nyt on myrsky
laantunut, mutta mielenkiinto on yhä säilynyt. Olen oppinut
tuntemaan ja rakastamaan asioita, joista minulla ennen ei ollut
aavistustakaan. Ihmiset, joita opin tuntemaan, työni — olin jotenkin
kauan erään saksalaisen kaunokirjailija-lehden päätoimittajana
Filadelfiassa — lyhyesti sanoen, lukemattomat asiat ovat tehneet
ujosta nuorukaisesta, joka pelkäsi runoutta, miehen, joka rakastaa
kaunokirjallisuutta ja seuraelämää.»

Kuului kellon soitto. Tohtori nousi.

»Oh, jo kuuluu pukeutumis-kutsu, hyvät naiset», sanoi hän.

»Sulkeudumme suosioonne.»

Ballmann nousi.

»Ette saa ajatellakaan mennä tiehenne nyt, Scherr… te jäätte

tänne päivälliselle… Ja te myöskin… ellei teillä ole muuta tänä iltana,
pyytäisin… sans cérémonie…»

»Kiitos!» vastasi Ballmann, »mutta ei sovi mitenkään… minua

odotetaan toisaalla…»

»Se ei ole totta», keskeytti tohtori. »Tehän sanoitte itse, että aiotte
syödä hotellissanne. Minä neuvon teitä seuraamaan esimerkkiäni ja
noudattamaan rakastettavan emäntämme kutsua… Missään emme
voi syödä paremmin, ja jos hänestä ei olisi hauskaa, että jäämme, ei
hän olisi meitä pyytänyt jäämään.»

»Hyvä, tohtori!» huudahti Hanna.

»Tohtori Scherenberg on oikeassa», vakuutti emäntä. »Jos

seuraatte kutsuani, teette minut hyvin iloiseksi. Se on siis päätetty, te
jäätte?»

Ballmann kumarsi. Mrs. Edgecombe nousi ja Hanna myöskin.

»Nyt menemme pukeutumaan», sanoi ensinmainittu, »se kuuluu

tapoihimme ollessamme kahdenkinkesken.»

Molemmat naiset poistuivat.

»Ihastuttavia naisia!» sanoi Ballmann puoliääneen.

»Sitähän sanoin teille jo edeltäpäin. Lupasin viedä teidät tämän

kaupungin, mielestäni maailman, hauskimpaan taloon. Minä nimittäin
ihailen tätä viehättävää naista…»

»Veljentytärtä?»

»En, tätiä.»

»Hän muistuttaa ensimäistä… onnetonta… rakkauttani.»

»Tätikö?»

»Ei, veljentytär. Hän on hyvin kaunis.»

»Mutta julma — kuin Turandot. Varokaa! Kukaan ei ole löytänyt

armoa hänen silmissään.»

Puoli tuntia tämän jälkeen soi kello uudestaan. Kohta senjälkeen

saapuivat molemmat naiset. He olivat vaihtaneet lyhyet
aamupäiväpukunsa iltapukuihin, jotka, vaikka olivatkin yksinkertaiset,
laahustimineen, timantteineen vanhan rouvan tukassa ja kukkineen
nuoremman kiharoissa, tekivät täydellisen englantilaisen
päivällispuku-vaikutuksen.
 Viereiseen huoneeseen johtavat ovet avattiin. Mrs. Edgecombe
tarttui tohtorin käsivarteen, ja Ballmann tarjosi käsivartensa —
rouvalleen.
XXXIII.

Pieni päivällinen oli aivan erinomainen. Pöytä loisti hopeasta,

kristallista ja kukista. Ruokalajeja ei ollut monta, mutta ne olivat
erinomaisesti valmistetut; lyhyt ruokalista oli somille korteille
kirjoitettuna kunkin lautasen vieressä. Hansikaskätiset palvelijat
mainitsivat lyhyesti, kysyvästi viinien nimet, ennenkuin kaatoivat
laseihin; tämä kädenkäänteessä järjestetty päivällinen tarjoiltiin
niinkuin juhlapäivällinen konsanaan. Mrs. Edgecombe oli tuonut
tämän tavan Englannista, ja hän oli aina valmis kutsumaan
pöytäänsä vieraan, olipa tämä miten vaatelias tahansa.

Pöytäkeskustelu oli hyvin vilkas. Tohtori oli mitä parhaimmalla

tuulella, ja emäntä nauroi sydämensä pohjasta hänen jutuilleen.
Hänen tapansa nauraa oli niin iloinen ja sydämellinen, että olisi
luullut lapsen nauravan. Hanna oli totisempi kuin tavallisesti. Vieras
oli tehnyt häneen syvän, melkein järkyttävän vaikutuksen, sillä hän
muistutti suuresti sitä kuvaa, joka oli Hannan sydämessä säilynyt
hänen miehestään.

Useimmiten tarvitaan hyvin vähän, jotta kaksi ihmistä ymmärtävät

ja alkavat pitää toisistaan. Heidän puhuessaan mitä
jokapäiväisimmistä asioista kuulee heidän äänestään, näkee heidän
katseestaan, hymyilystään paljon enemmän kuin mitä sanat kertovat.

Päivällisen jälkeen saapui uusia vieraita, eräs venäläinen kenraali

rouvineen ja tyttärineen, Wiesbadenissa asuva runoilija Bodenstedt,
kuninkaallisen teatterin kapellimestari ja joitakuita muita herroja.

Keskustelu oli välitöntä ja vilkasta. Hanna osoitti mitä

ihastuttavinta herttaisuutta. Hän oli iloissaan saavuttamastaan
voitosta… huomiosta, jota hänelle osoitti mies, joka häntä miellytti.

Illan kuluessa saatiin kuulla musiikkia. Venäläinen neiti soitti

muutamia venäläisiä kansanlauluja mollissa sekä Tshaikovskin ja
Glinkan sävellyksiä. Pyytämättä istuutui Hanna sitten pianon ääreen
ja soitti muutamia Schumannin kappaleita niin mestarillisesti, että
kapellimestari, hänen poistuessaan pianon luota, suuteli häntä
kädelle ja huudahti:

»Te olette suuri taiteilija!»

Kellon yhdeksän tienoissa tarjottiin teetä. Ballmann oli Hannan

lähettyvillä. Hän tarjosi hänelle kupin ja pyysi häntä istuutumaan
viereensä. He olivat erillään muista, jotka olivat ryhmittyneet Mrs.
Edgecomben ympärille, osaksi pianon lähelle.

Ballmann alotti keskustelun.

»En voi ymmärtää, että näen teidät ensi kerran ja että vasta
muutama tunti sitten olen teihin tutustunut.»

»Minustakin tuntuu, niinkuin olisimme vanhoja tuttuja», vastasi

Hanna.
 »Kukapa tietää?… Ehkä olemme olleet ystäviä jossain toisessa
maailmassa», sanoi Ballmann miettivästi.

»Tai toisena aikakautena», vastasi Hanna nauraen.

»Mitä menneisyys meitä koskee, meillähän on tulevaisuus

edessämme!»

»Te sanotte sen niin syvään huoahtaen, ikäänkuin olisitte

kuolemaantuomittu.»

»Me olemme jokainen tuomitut kuolemaan kolmenkymmenen tai

neljänkymmenen vuoden kuluessa. Mutta sitä en huokaa…»

He juttelivat vielä kauan keskenään vaihdellen puheenaiheita. Sillä

välin yhtyivät heidän katseensa usein. He eivät voineet olla
katsomatta toisiinsa ja ihmettelemättä, missä yhtäläisyys piili. Mutta
heidän mieliinsä ei juolahtanut, että he saattoivat olla niin läheisiä.

Keskiyön aikaan vieraat lähtivät, ja molemmat naiset jäivät

kahdenkesken.

»Miten paljon kello jo onkaan!» sanoi Mrs. Edgecombe koettaen

peitellä haukotustaan. Ja hetkisen kuluttua hän jatkoi: »Scherrin
tuoma herra oli hyvin miellyttävä.»

Hanna myönsi.

»Oletko väsynyt, lapsi? Menemmekö levolle?»

»En, väsynyt en ole.»

Hanna huokasi syvään.

 »Mikä sinun on, Jane? Olet muuttunut.»

»Mikäkö minun on?… En tiedä?… Ajattelehan, jos se nyt

tapahtuisi, täti?»

»Mikä sitten?»

»Se, josta juttelimme eilen… Oi, jospa olisin vapaa!»

»Jane, tekikö tuo vieras sinuun niin valtavan vaikutuksen?»

Hanna oli sillä välin mennyt sen pöydän luo, jolle vieraan
käyntikortti oli jäänyt. Hän tahtoi nähdä, mikä hänen nimensä oli.
Hän oli päättänyt heti etsiä sen. Hän haki hajallaan olevien paperien
joukosta. Lopulta hän sen löysi ja katsahti siihen. Samassa kuului
vihlova huuto, ja hän kaatui lepotuolin viereen.

Mrs. Edgecombe kumartui hänen ylitseen.

»Jumalan tähden, Jane! Mikä sinun on?»

Hanna nousi. Hetkeen hän ei voinut puhua. Hän puristi

suonenvedontapaisesti kättä sydäntään vasten hilliten sen lyöntejä;
toisessa kädessä hän piti korttia.

»Mikä sinun on, Jane?»

Hän ojensi kortin Mrs. Edgecombelle ja sanoi äänellä, joka

hänestä itsestäänkin tuntui vieraalta:

»Ewald Ballmann!»

»Mitä… miehesi nimi?»

 »Se on hän… mieheni!»

Hanna heittäytyi Mrs. Edgecomben viereen ja laski päänsä hänen

syliinsä purskahtaen itkuun.

He viipyivät vielä kauan salissa. Tapaus oli niin merkillinen ja

odottamaton, ettei voinut tulla kysymykseenkään mennä levolle.
Kadonnut puoliso oli löydetty… Hanna oli rakastunut häneen! Hänkin
oli näyttänyt hyvin mieltyneeltä.

»Sehän olisi suunnaton onni, Jane, jos te löytäisitte toisenne tällä

tavoin… ei niin että ottaisitte toisenne armoihin taas unohdetun ja
anteeksiannetun menneisyyden takia, vaan ainoastaan ajatellen
nykyisyyttä ja rakkautta täynnä olevaa tulevaisuutta», sanoi Mrs.
Edgecombe.

»Se olisi liiankin ihanaa!» huokasi Hanna vavisten, kuten kaikki

muutkin, joille kajastaa täydellinen onni.

»Mutta Jane… sinun kuvauksesi mukaan olin ajatellut miestäsi

aivan toisenlaiseksi.»

»Hänhän on, kuten hän itse kertoi, tullut toiseksi ihmiseksi.

Siksihän en minäkään häntä tuntenut. Näinä kahdeksana vuotena on
hän muuttunut yhtä paljon kuin kaksikymmenvuotias
kaksitoistavuotiaaseen verrattuna.»

»Taikka niinkuin sinä itse, rakas Jane, tässä ajassa.»

»Se on totta. Siksi hänkään ei tuntenut minua. Mitä onkaan meistä

enää jäljellä? Tuskin mitään. Me tapaamme toisemme kuin kaksi
uudestisyntynyttä ihmistä… me tunnemme mieltymystä toisiimme,
rakkaus saa meissä vallan… meissä, jotka jo kauan sitten menimme
naimisiin keskenämme! Eikö tämä ole kuin satua, täti? Ei, ei, se olisi
liian ihanaa. Pelkään, että kun hän saa tietää, kuka olen, hän hylkää
minut…»

»Sinun täytyy valloittaa hänet, Jane.»

He puhelivat vielä kauan. Kello oli jo kaksi, kun nämä ystävykset

sanoivat toisilleen hyvää yötä ja menivät kumpikin omalle puolelleen.
XXXIV.

Seuraava aika oli Hannalle hyvin onnellinen. Hän ei olisi tahtonut

vaihtaa osaansa kenenkään kanssa. Ballmann oli melkein
jokapäiväinen vieras Mrs. Edgecomben talossa. Ratsastusretkiä,
ajeluja tehtiin; hän seurasi molempia naisia teatteriin ja konsertteihin
tai vietti iltansa heidän salissaan. Hänen mieltymyksensä Hannaan
sai yhä intohimoisemman luonteen. Näytti kylläkin alussa siltä, että
hän olisi taistellut rakkautta vastaan, mutta antautui viimein sen
lumoihin. Hanna kiemaili mitä suurimmalla ihastuksella. Hän pani
hänen päänsä pyörälle suloisilla hymyilyillään ja loistavilla
katseillaan. Hän saattoi loukkaamatta naisellista ylpeyttään antautua
tälle rakkaudelle, jota sitäpaitsi ympäröi salaperäisyyden viehätys,
kun Ballmann ei tiennyt hänen olevan hänen vaimonsa.

Mrs. Edgecombe seurasi heidän eriskummallista armasteluaan

mitä suurimmalla mielenkiinnolla. Hanna uskoi ystävälleen kaikki
salaisuutensa, ja tämä luki hänen sydämestään kuin avatusta
kirjasta.

»Sinä olet siis onnellinen, Jane?»

»Olen, elämä on ihanaa!»

 »Nuoruus on ihana aika, ja kaunis on rakkauden punainen kukka»,
vastasi vanha rouva. »Minä seuraan innolla kohtalosi kehitystä, joka
päättyy häihin, jotka päälle päätteeksi ovat jo pidetyt; hääthän ovat
se ehto, jonka me vanhat kunnianarvoiset ihmiset asetamme
armastelulle, jota tahdomme suojella. Mutta milloin aiot ilmaista
itsesi?»

»En vielä. Tahtoisin ensin olla varmempi hänen rakkaudestaan.»

»Varmempi? Minusta se loistaa hänen jokaisesta katseestaan. On

ajatuksia, jotka, kun ne syntyvät kahdessa sydämessä yhtaikaa,
täytyy myöskin pukea sanoihin.»

Tähän saakka olivat rakastuneet ainoastaan ani harvoin ja vain

muutamia silmänräpäyksiä saaneet olla kahdenkesken. He olivat
aina joko suuressa seurassa tai keskustelussa Mrs. Edgecomben
kanssa. Viisas ja rakastettava vanha rouva oli pitänyt paljon huolta
siitä, että Hannan herttaisuus tuli näkyviin.

Useita tunteja he viettivät soittokoneen ääressä, Hanna soitti ja

Ballmann kuunteli. Ballmann nautti sanomattomasti hänen
taiteellisesta esityksestään, ja Hanna oli ihastunut huomatessaan
taidolleen annettavan arvoa. Kerran tohtori mainitsi Ballmannin
työskentelevän Amerikassa julkaisemiensa kirjoitelmien
järjestämiseksi ja että hän oli jättänyt ne eräälle saksalaiselle
kustantajalle, joka oli luvannut ne painattaa, ja silloin Mrs.
Edgecombe pyysi kirjailijaa lukemaan heille joitakuita töitään. Ne oli
selvällä ja säkenöivällä tyylillä kirjoitetut ja koskettelivat erilaisia
filosofisia ja esteettisiä aineita. Nyt oli Hannan vuoro nauttia ja ihailla.

*****
 Pari viikkoa oli kulunut Ewaldin ensimäisestä käynnistä. Kun
Hanna ajatteli tätä aikaa, tuntui se hänestä paljon pitemmältä, sillä
sinä aikana oli tapahtunut niin paljon. Rakastaville ovat kaikki
pikkuseikat suuren arvoisia, ja muistojen sarjaan siirtyy suuri joukko
tapauksia.

Kaksi viikkoa ensimäisen päivällisen jälkeen nuo neljä ihmistä

istuivat jälleen samassa päivällispöydässä. Päivällisen jälkeen
emäntä sanoi tohtori Scherenbergille.

»Uskallatteko antautua shakkitaisteluun kanssani?»

Tohtori ilmoitti olevansa halukas, ja he istuutuivat shakkipöydän

ääreen.

Penkereelle vievä ovi oli auki. Oli mitä ihanin kesäkuun-ilta.

Kaukaa
kuuluivat kylpylaitoksen orkesterin sävelet. Hanna meni ulos, ja
Ballmann seurasi häntä. Shakkinappulat olivat asetetut paikoilleen.
Tohtorilla oli mustat nappulat.

»Valkoinen siirtää», sanoi hän odotettuaan hetkisen.

Mrs. Edgecombe katseli miettivän näköisenä molempia nuoria.

Tohtori huomasi sen, kääntyi ja näki Ballmannin häviävän
penkereellä vallitsevaan hämärään.

»Valkoinen alottaa», hän toisti.

Mrs. Edgecombe siirsi talonpojan.

»Miten vanha te olette, tohtori parka?» kysyi hän.

 »Kuusikymmentäviisi vuotta», vastasi tohtori siirtäen nappulaa.
»Vanhuus on ikävä laitos. On niin harmillista nähdä elämänarvoisten
asiain joutuvan saavuttamattomiin.»

»Oletteko kateellinen?» kysyi Mrs. Edgecombe nauraen ja vei

talonpoikaansa eteenpäin.

»Tietysti; tuolla penkereellä sykkivät kahden ihmisen sydämet

ilosta, joka on paljon suurempi meidän innostustamme teidän
hevoseenne tuossa; nyt minun täytyy siirtää näinikään.»

»Ja minä en ole hitustakaan kateellinen, Scherr. Minä muutan

ilomielin juoksijani tänne ja riemuitsen siitä, että maailmassa on
auringonpaistetta ja onnea.»

Penkereellä olevat nuoret olivat lähestyneet toisiaan yhä

enemmän. Hanna oli kaukaisimmassa nurkkauksessa ja nojasi
pylvääseen; Ballmann oli pysähtynyt oven luo ja katseli tätä
valkopukuista, kuutamossa seisovaa kaunotarta. Miten mielellään
Hanna olisikaan rientänyt hänen luokseen, painanut päänsä hänen
povelleen, mutta hän ei tahtonut vielä ilmaista itseänsä. Ewaldin
täytyi tunnustaa rakkautensa ensin… ja Hanna tunsi hetken tulleen.
Hän ei ajatellut sanoja tai muuta, mutta tunsi suurta, sanomatonta
onnea. Ewaldinkin mielen täytti elämänilo. Hän astui muutamia
askeleita eteenpäin…

»Te olette ihmeellinen nainen», sanoi tohtori ja vei esiin torninsa.

»Toisten onnea on tavallisesti ikävä nähdä. Tuhannesta tädistä
menisi yhdeksänsataayhdeksänkymmentäyhdeksän nyt ulos ja
sanoisi: 'Tuntuu niin kolealta: sinulla pitäisi olla liina hartioillasi, rakas
lapsi.' Ja te lähetätte vain hyvin levollisesti hevosenne peliin.»