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核磁共振基本原理 8讲
核磁共振基本原理 8讲
讲
吴季辉
核磁 共振原 理及 其在
生物学中 的应 用
样品 的准备
样品的体积
现代超导谱仪一般
使用 5mm 直径样品
管,溶液体积
0.5ml-0.7ml ,至少
0.4ml 。早期作
13
C-NMR 谱使用 10mm
直径样品管,溶液
体积 1.5-2ml 。
在样品 管中溶液 的深度由两 个因子决定
,样品若超过一 定高度,超 过部分将
会接收不到发射 线圈发射的 射频造成
浪费;若太低则 样品与空气 磁化率的
不同造成界面磁 化率突变会 影响样品
中磁场的均匀性
核磁共振基本原理 8
讲
吴季辉
样品 的浓度
由于核磁共振实验固有的低灵敏度,所以它需
要比一般红外、紫外实验更大的样品量,这往
往成为核磁共振技术在生物学中应用的一个关
键问题
对于质子磁共振波谱,样品浓度一般在 10-2-10-
4
M 。在 FT 谱仪中通过多次波谱累加可以降低
对最低浓度的要求,只要时间足够,在原则上
对于一个分子量 20000 的蛋白质,可以得到 1-
3mg 样品的 1H 核磁共振波谱
样品的 浓度
对于 13C 谱来说,由于 13C 的低灵敏度
,样品浓度的最低限度是 10-2M 。对
于一个分子量为 20000 的蛋白质,
使用 10mm 直径的样品管,样品体
积是 1.5ml ,则需要大约 300mg 的
样品
天然小蛋白质 5mM
同位素标记的蛋白质 >1mM
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
溶剂 的选择
一个理想的溶剂必须满足以下的条件
:
1. 样品在其中有高溶解度;
2. 在我们所感兴趣的波谱范围内没
有溶剂峰;
3. 在做变温实验的温度范围内保持
液体状态
通常使用一些氘代溶剂
•减少溶剂峰的干扰
锁场
• 采用氘核内锁稳定磁场,起锁场的作用
• 氘代氯仿是一个很理想的溶剂,它既适
合于 1H ,也适合于 13C ,在整个质子谱
范围内透明,再加上化学性质惰性,便
宜,所以是常用的溶剂
• H2O 是生物分子最适宜的溶剂
(90%H2O,10%D2O)
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
蛋白 质 NMR 研究的溶液条件
样品的处理
离心 :样品(特别是生物大分子)溶解后,应该离心
除去可能的微小颗粒,以免影响匀场,降低分辨率
除氧 :在高分辨结构和弛豫研究中除氧是极为重要的
(特别是小分子),溶解在溶液中的分子氧具有顺磁
性,它会极大的减少弛豫时间,必须将氧除去。除氧
的方法通常有两种,一种叫冰冻-抽真空-融化 : 即
把样品放在 NMR 样品管内冰冻,然后抽真空,融化,
重复上述过程四次,最后在真空中将管口封住。另一
种方法是将氮气或氦气,氩气强迫通过整个样品体积
把氧赶走
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
核磁共 振谱 仪的 主要指 标
分辨率 (res oluti on)
谱仪的分辨率被定义为能区分两个接近的共振峰的能力
,和一般光谱仪不一样它不是由能区分的最小频率间距
1
-υ2 表示,因为 1
-υ2 与仪器的频率有关,
250MHz 的谱仪可以区分的频率间距自然大于 60MHz 谱
仪。核磁共振谱仪的分辨率受到谱线宽度的限制,谱线
不是无限窄的,它有一定的宽度,用共振峰半高处的宽
度表示。表观线宽不仅取决于弛豫过程,而且取决于仪
器本身
老式的谱仪用 10%(v/v) 的邻二氟苯 / 四氯化碳作为标样
,测定某条指定的谱线的半高宽,大致在 0.1-0.5Hz
现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样,测定
核磁共振基本原理 8
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氯仿 / 氘代丙酮的 NMR
谱
核磁共振基本原理 8
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核磁共 振谱 仪的 主要指 标
线型 (l inesh ape)
仅仅最小线宽还不足以表征分辨率,特别是所观察的两个
峰高度相差甚大时,这时分辨率在很大程度上受到强峰接
近基线处形状的影响。这时还要进行一种波峰 检验 (Hump
test)
老式的谱仪用 10%(v/v) 的氯仿 / 四氯化碳作为标样,测定
氯仿主峰的 0.5% 处即 13C 卫星线高度处谱线的宽度,大致
在 7-15Hz
现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样,测定氯
仿主峰的 0.55% 及 0.11% 处谱线的宽度
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C 卫星线
13
指与 13C
相耦合的质子产生的
谱线
旋转边带 样品旋
转时由于磁场不够均
匀而在强峰两边产生
的弱峰,与主峰的距
离为旋转速度的倍数
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核磁共 振谱 仪的 主要指 标
灵敏度 (sen sitiv ity)
灵敏度是指谱仪能够测量出弱信号的能力。核磁共振谱
仪的灵敏度不仅受到放大器增益的限制,而且受到电子
线路中随机噪声的限制,如果弱信号和噪声振幅大小相
同,则弱信号就不能检测出来。
灵敏度以信噪比表示
S/N = 2.5H/h
其中 H 是信号高度, h 是噪声振幅的峰-峰值。 h 值除
以 2.5 的原因是:按照噪声理论,噪声振幅的峰值是无
意义的,只有均方根噪声才有意义,二者之间的转化因
子在核磁共振中选为 2.5
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1
H 灵敏度
老式的谱仪用 1%(v/v) 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样,测
定某些指定谱线的信噪比,大致在 20-300 或更高
现代的 FT 谱仪用 0.1%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿作为标样
,同样测定某些指定谱线的信噪比
13
C 灵敏度
老式的谱仪用 90% 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样,测定某
些指定谱线的信噪比,得到的信噪比和质子一般同数量级
现代的 FT 谱仪用 10%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿 (1H 去耦 )
或 ASTM(40% p-Dioxane/60% 氘代苯 ) (1H 不去耦 ) 作为标
样,同样测定某些指定谱线的信噪比
核磁共振基本原理 8
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脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱
仪
讲 脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱
核磁共振基本原理 8
吴季辉
仪
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脉冲付里叶变换 核磁共振 谱仪
•Magnet
•Probe
•Console
•Computer
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超导磁体
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对磁体的要求
•高磁场强度
•高均匀性
•高稳定性
核磁共振基本原理 8
对磁体的要求:高磁场强度
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核磁共振基本原理 8
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吴季辉
高场谱仪分辨率的提高
Oestradiol-acetate
900 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536
SF 900.0200000 MHz
WDW GM
SSB 0
650 600 550 Hz LB -0.30 Hz
GB 0.3
PC 4.00
核磁共振基本原理 8
对磁体的要求:高均匀性
讲
吴季辉
对磁体的要求:高稳定性
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吴季辉
磁场变化的原因:磁体的老化;附近有金属物体移动;温
度的波动
解决方法:监视 2H 锁信号的共振频率(由氘代溶剂提供
)
场频联锁:
磁场变化 共振频率变化 产生校正电流 产生补偿磁场
总磁场保持不变
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
探头
功能:放置样品管,发
射射频脉冲,接收核磁
信号;
组成:射频线圈及调谐
电路;梯度磁场线圈;
热电偶,加热器件,传
送恒温气流的杜瓦管道
;样品管进出用的气流
通道
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核磁共振基本原理 8
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脉冲谱仪普遍采用单线圈探头,发射与接收由同一线圈完成
匀场系统 (The Shim System)
• 低温匀场系统
• 室温匀场系统
• the on-axis (spinning) shims (z,z2,z3,z4..)
• the off-axis (non-spinning) shims (x,y,xy...)
锁场系统 (The lock-system)
• 氘锁系统
• 保证磁场稳定
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吴季辉
脉冲发生器
•频率综合器:产生所需频率的射频电流
•脉冲编程器:控制脉冲的时序,长度,
幅度,相位甚至形状
•射频放大器:产生足够的功率(几十至
几百 W )
•通常一台谱仪有若干射频通道,分别工
作在不同的核的共振频率上,在实验中可
以同时施加作用于不同核的射频脉冲
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吴季辉
接收器
•前置放大器:由于核磁信号很弱,前置放大器总
是尽量靠近探头,其性能决定了仪器能达到的信噪
比
•相敏检波:从射频信号中检出低频的核磁信号
(相当于旋转坐标系中的信号),并完成正交检波
•模数转换器:或称 ADC ,完成模拟信号的数字化
,一般谱仪考虑到转换速度和动态范围,配置的为
16bit ADC ,其动态范围为 -28 到 28-1 即 -32,768
到 32,767
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吴季辉
核磁共 振信号的检 测
样品中磁化强度矢量按 Bloch 方程在空间运动,磁化强度
矢量在空间的运动将在接收线圈中引起感应电动势,假设
线圈在 y 轴方向
所以在接收线圈上可以得到包含核磁化向量的大小,进
动频率和起始相位的高频信号(高频 FID )
单一线 圈不能区分 正负频率和 相位
正交 检波区别正 负频率及 相位
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
相敏 检波器 及正 交检 波
相敏检波器实际上相当于一个混频器或模拟乘法器,接收到的
核磁信号与参照信号(与射频场同频)经相敏检波器得到的输
出为低频 FID ,但不能区别正负频率及相位
两路正交的相敏检波器完成正交检波,以区别正负频率及相位
数据获取
sfo1: spectrometer frequency offset of
the first (observe) channel
离散采样
•脉冲付里叶变换核磁共振方法的优点之一是可
以对数据进行各种处理(信息加工)
•模拟的 FID 信号必须经过离散采样,并对信号
数字化,才能送到计算机处理
•采集的离散化数据同原始的模拟数据有相同点
, 也有不同点 :
在一定条件下 , 离散化数据可以代表原始的
模拟数据
•采样定 理
核磁共振基本原理 8
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采样 定理
要使采集的离散的时间序列能代表原来的模拟信号,
采样速率必须遵守采样定理,即
fs ≥ 2fh
其中 fs 是采样频率,表示每秒钟采样次数, fh 为被采
样的模拟信号的最高频率。从上式可见,每个周期至
少采取两点
采样速率不够引起将导致信号折迭现象 ,这是离散化
导致的后果
dw = 1/sw or dw = 1/2sw
采样定 理
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信号 折迭 现象
数字分 辨率
吴季辉
2∆ν At = N
如果采用正交检波,则射频照射频率可以放在谱的中心,这
时谱宽为 2∆ν ,经过 Fourier 变换后的频域信号谱线频率的
数字精确度(数字分辨率)相当于谱宽为点数所除,为 FID
采集时间的倒数
注意要区分谱仪分辨率和这里所说的数字分辨率。前者是由磁
场的均匀度决定的,而后者由可选择的谱宽和数据点决定,它
是对谱仪分辨率的实际限制,影响信号的确定和线型
核磁共振基本原理 8
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吴季辉
相干叠加
•采样得到的 FID 信号可以进行多次累加以提高信噪比
•由于信号是有规律的出现的,所以 n 次累加所得信号的
大小与累加次数 n 成正比
•而噪声是随机的 , 假设噪声按高斯分布 , 正的和负的等
几率分布 , 则经过 n 次累加 , 噪声的大小和累加次数 n
的平方根成正比
•于是信噪比等于
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FFT 快速 Fourier 变换
FID 信号必须经过 Fourier 变换才能变为普通的核磁共
振波谱。这种变换是靠计算机上进行的离散 Fourier 变
换实现的,它的正负变换的表示式分别为
窗函数 处理
各种窗函数形式
(a) 未加权 FID; (b) 线性截趾 ; (c)
升指数函数 ; (d) 梯形函数 ; (e) 降
指数函数 ; (f) 卷积差函数 ; (g) 正
弦钟函数 ; (h) 移位的正弦钟函数
; (i)LIRE; (j)Gauss 函数
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吴季辉
改进灵敏度或分辨率的各种
方法比较 ( 计算机模拟谱 )
( 左 ) 无噪声 ; ( 右 ) 含有噪
声 ; (a) 未加权波谱 ; (b) 梯
形函数 ; (c) 升指数函数 ;
(d) 卷积差函数 ; (e) 正弦钟
函数 ; (f) LIRE; (g) Gauss 函
数
核磁共振基本原理 8
相位 调整( 调相 )
讲
吴季辉