C.

LOWRY METHOD

1. PRINCIPLE
The Lowry method combines the biuret
reaction (see point B) with the
reduction of the Folin-Ciocalteau
phenol reagent (phosphomolybdicphosphotungstic acid) by tyrosin &
tryptophan residues in the protein
The bluish color developed is read at
750 nm (high sensitivity for low protein
concentration) or 500 nm (low
sensitivity for high protein
concentration)

Protein reaction with cupric ion under

alkaline condition

2a. PROSEDUR
Terdapat 2 macam reagen Lowry, yaitu
Lowry A (mengandung fosfotungstat-fosfo
molibdat 1 : 1)
Lowry B (mengandung Na-karbonat 2%
dalam NaOH 0,1N serta Cu-sulfat dan Na-Ktartrat 2%)

 Cara :
1 mL larutan protein sampel + 5mL reagen
Lowry B, gojog dan biarkan 10 menit
Kemudian tambahkan 0,5 mL reagen Lowry
A dan biarkan 20 menit
Baca nilai absorbansi pada 600 nm

2b. PROCEDURE
1. Proteins to be analyzed are diluted to an
appropriate range (20 100 g)
2. K Na Tartrate-Na2CO3 solution is added
after cooling and incubated at room
temperature for 10 min
3. CuSO4-K Na Tartrate-NaOH solution is
added after cooling and incubated at
room temperature for 10 min

4. Freshly prepared Folin reagent is added,

then the reaction mixture is mixedand
incubated at 50oC for 10 min
5. Absorbance is read at 650 nm
6. A standard curve of bovine serum albumin
(BSA) is carefully constructed for
estimating protein concentration of the
unknown

 Cu++ in alkaline solution to form complexity with

protein.

at 750 nm

Cu++ catalyses oxidation of phenol group of tyrosine

with phosphomolybdic-phosphotungstic acid.

g of protein (Kjeldahl)

3. ADVANTAGES
1. Very sensitive :
a. 50 100 times more sensitive than
biuret method
b. 10 20 times more sensitive than
280nm UV absorption method
c. Similar sensitivity as Nesslerization;
however, more convenient than
Nesslerization
2. Less affected by turbidity of the sample
3. More specific than most other methods
4. Relatively simple, can be done in 1
1.5 hr

4. DISADVANTAGES
1. Color varies with different proteins to a
greater extent than biuret method
2. Color is not strictly proportional to
protein concentration
3. The reaction is interfered with to
varying degrees by sucrose, lipids,
phosphate buffers, monosaccharides,
and hexoamines
4. High concentration of reducing sugars,
ammonium sulfate, and sulfhydryl
compounds interfere with the reaction

D. TITRASI FORMOL

1. PRINSIP
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH),
kemudian ditambah formalin sehingga terbentuk
dimetilol
Dengan terbentuknya dimetilol maka gugus amino
protein sudah terikat dan tidak mempengaruhi reaksi
antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH
sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat

 Indikator yang dipakai adalah PP

Akhir titrasi ditandai saat terjadinya
perubahan warna menjadi merah muda
yang tidak hilang dalam 30 detik
Titrasi formol baik untuk digunakan untuk
evaluasi proses terjadinya pemecahan
protein (misal : pada fermentasi protein
pada tempe, kecap, tauco, dzsb.)
Proses hidrolisis protein ditandai dengan
meningkatnya titrasi formol

2. REAKSI PADA TITRASI

FORMOL
O
H O

RCHCOH + NaOH RCCO

NH2
NH3+
pada pH netral
H O
H
RCCO + CH2O

RCCOOH
NH3+
(formalin)
HOH2CNCH2OH
(dimetilol)
H
RCCOOH
H O
HOH2CNCH2OH + NaOH
RCCONa
(dimetilol)
HOH2CNCH2OH

3. PROSEDUR
10 ml larutan protein sampel + 20 ml
aqu-ades + 0,4 ml larutan K-oksalat
jenuh (K-oksalat : air = 1 : 3) dan 1 ml
indikator PP 1%. Diamkan selama 2
menit
Titrasi larutan tersebut dengan 0,1N
NaOH sampai terbentuk warna pink atau
warna standar (10 ml susu + 10 ml
aquades + 0,4 ml K-oksalat jenuh + 1
tetes indikator rosanilin-khlorida 0,01%)

 Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml

formaldehid 40% dan titrasilah kembali
dengan larutan NaOH sampai warna seperti
warna standar tercapai lagi. Catatlah nilai
titrasi kedua ini.
Dibuat titrasi blanko yang terdiri dari : 20
ml aquades + 0,4 ml larutan K-oksalat
jenuh + 1 ml indikator PP + 2 ml formaldehid, dan titrasilah dengan larutan NaOH
Titrasi formol = titrasi terkoreksi
= titrasi kedua titrasi blanko

 Bila nilai titrasi formol akan digunakan

untuk menentukan kadar protein, maka
harus dibuat percobaan serupa dengan
menggunakan larutan yang telah diketahui
kadar proteinnya (misalnya dengan metoda
Kjeldahl)
Selanjutnya ditentukan hubungan antara
titrasi formol dengan % protein.
Misal :
% protein susu = 1,83 x ml titrasi formol
% kasein = 1,63 x ml titrasi formol