l

a
b
o
r
a
t
o
r
i
j
i
61
Validacija analitikih
metoda osnovna naela
Katica lazari
Validacija analitikih metoda po-
stupak je kojim dokazujemo da na-
a metoda slui svrsi, a zahtijeva je
i regulativa i analitika profesija.
Validirane metode u najveoj e
mjeri osigurati pouzdanost i to-
nost analitikih podataka.
A
nalitike metode trebaju biti validirane kako bi se osigurala pouzdanost
i tonost analitikih podataka. Tako kae regulativa koja to i zahtijeva
zadnjih dvadesetak godina. Slau se i analitiari koji su temeljna naela vali-
dacije metoda primjenjivali i puno prije pojave regulative jer je to jednostav-
no sastavni dio struke. U meuvremenu objavljeno je puno radova, lanaka,
osvrta, provedeno bezbroj razliitih eksperimenata. U nekim su laboratoriji-
ma validacije metoda postale rutina, dok se u drugima one tek poinju pro-
voditi. U ovome e lanku biti predstavljene osnovne postavke za validaciju
analitikih metoda nune analitiarima koji poinju, ali i koristan podsjetnik
za one koji su ve uli u rutinu validacija analitikih metoda.
osnovna naela validacije
analitikih metoda
to je to validacija analitikih metoda? Najjednostavnija defnicija kae da je
to postupak kojim dokazujemo da naa metoda slui svrsi koju smo joj
namijenili, a najjednostavnija logika kae da je prije svega uistinu potrebno
znati/defnirati svrhu metode. Nakon toga se, po struci i logici posla, utvru-
ju postupci, tj. planiraju i provode eksperimenti ije rezultate treba prikupiti
i prikazati kao dokaze o validnosti metode. Sigurno je da se isti postupci ne-
e primjenjivati na sve metode razliito se pristupa validaciji kvalitativnih i
kvantitativnih metoda; razlikuju se postupci validacije metode kojom se odre-
uje analit koji pretee u uzorku i one kojom se odreuju tragovi u komplek-
snoj matrici. Svakoj se metodi pristupa individualno, procjenjuje se to treba
napraviti za dokaz svrhovitosti. I struka i regulativa i zakonodavstvo prihva-
tili su osam osnovnih parametara, tj. izvedbenih znaajki validacije:
specifnost /selektivnost
linearnost
podruje
preciznost
ponovljivost, eng. repeatability
meupreciznost (eng. intermediate precision)
obnovljivost (eng. reproducibility)
istinitost (eng. trueness)
granica kvantifkacije
granica detekcije
postojanost.
Kombinacijom tih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.
Specifnost /selektivnost svojstvo je metode da tono i specifno odredi
eljeni analit u prisutnosti ostalih komponenata u matrici uzorka pod
utvrenim uvjetima ispitivanja. Iako se u praksi esto poistovjeuju, speci-
fnost i selektivnost dva su razliita svojstva metode. Specifna metoda je
ona kojom se moe odrediti samo jedan specifni analit. Metoda kojom se
moe odreivati vie komponenata istodobno, ali pod uvjetom da te kompo-
nente pri odreivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom.
l
a
b
o
r
a
t
o
r
i
j
i
62
Selektivnost je nezaobilazan parametar za validaciju veine
metoda. U praksi se dokazuje usporedbom odziva metode na
referencijski materijal i analit u uzorku. Kod kromatografskih
metoda, osim usporedbe kromatograma referencijskog ma-
terijala i uzorka, potrebno je dokumentirati i parametre koji
odreuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod odreenih
metoda i prikupiti dokaze o istoi pikova.
Linearnost je odreena kao mogunost metode da unutar
odreenog podruja daje ispitne rezultate proporcionalne
koncentraciji analita u uzorku.
U praksi se linearnost odreuje mjerenjem odziva metode na
razliite poznate koncentracije referencijskog materijala (pre-
poruuje se najmanje pet koncentracijskih razina uz tri ponav-
ljanja). Procjenjuje se matematiki i grafki. Matematiki se
preko linearne regresije izrazi jednadba pravca (y = ax + b) i
izrauna koefcijent korelacije (k). Nagib pravca (a) parametar
je koji izravno ukazuje na osjetljivost metode. Odsjeak pravca
(b) moe ukazivati na sustavnu pogreku. Za koefcijent kore-
lacije uobiajeno se postavlja kriterij k 0,99. Za vrlo niske
koncentracije prihvaa se i kriterij k 0,98. Grafki prikazi
ovisnosti signala o koncentraciji analita vani su zbog mogu-
nosti vizualnog nadzora. Najee se upotrebljavaju dva naina
grafkog prikaza:
Grafki prikaz odstupanja od regresijskog pravca pre-
ma koncentraciji ili logaritmu koncentracije za line-
arna podruja odstupanja jednoliko rasporeena izme-
u pozitivnih i negativnih vrijednosti (slika 1a).
Grafki prikaz relativnih signala (omjer signala i odgo-
varajue koncentracije) na osi y i odgovarajuih kon-
centracija na osi x log skale. Dobivena linija treba biti
vodoravna u cijelome linearnom podruju, a podruje
linearnosti prestaje pri koncentracijama gdje linija re-
lativnog odziva sijee paralelne linije koje odgovaraju
95 postotnoj ili 105 postotnoj koncentraciji (slika 1b).
Podruje je raspon izmeu gornje i donje koncentracijske
granice analita (granice su ukljuene) u uzorku koje se
mogu kvantifcirati uz odgovarajuu preciznost, istinitost
i linearnost. Za odreivanje tog parametra nije potrebno
provoditi zasebne eksperimente, nego se zakljuci izvode iz
studije linearnosti.
U puno sluajeva podruje je odreeno svrhom metode i ne-
ma potrebe za ispitivanjem krajnjih mogunosti metode. Na-
protiv, suavanjem podruja na koncentracijski raspon uzo-
raka postiu se bolja tonost i preciznost metode. Meutim,
kad se oekuju uzorci sa irokim rasponom koncentracija,
isplati se defnirati maksimalno podruje metode.
Preciznost se odreuje kao izraz slaganja izmeu niza mje-
renja izvedenih iz istog homogenog uzorka pod propisa-
nim uvjetima. Ovisno o uvjetima u kojima se odreuje ra-
zlikujemo:
preciznost pod uvjetima ponovljivosti ili ponovljivost
pri emu uvjeti ukljuuju jedan laboratorij, istog ana-
litiara, istu aparaturu, kratko razdoblje.
meupreciznost preciznost koja se ostvaruje unutar
istog laboratorija u duljem razdoblju uz oekivane
promjene nekih uvjeta (razliiti analitiari, instru-
menti, kolonereagensi iz razliitih boca i razliitih do-
bavljaa).
Preciznost pod uvjetima obnovljivosti ili obnovljivost promjen-
ljivi uvjeti ukljuuju razliite laboratorije. Taj se parametar
odreuje u svrhu normiranja metode i rijetko je sastavni dio
validacije koju provodi sm laboratorij. Eksperimentima pre-
ciznosti kvantifciraju se sluajne pogreke metode, a nume-
riki je pokazatelj standardna devijacija, koefcijent varijacije
ili varijanca. Kod eksperimenata meupreciznosti iznimno je
vano mjerenja koja se ponavljaju provoditi u uvjetima koji
su to sliniji onima pri rutinskoj uporabi metode. U sluaju
rezultata koji ne zadovoljavaju treba otkriti najvaniji izvor
pogreke i pokuati ga ukloniti.
Vano je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na ho-
mogenom autentinom uzorku, odnosno umjetno pripre-
mljenom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu u
metodi upravo onako kako e se ubudue raditi u praksi. Broj
ponavljanja treba zadovoljiti zahtjeve statistike. Najee se
radi po tri ponavljanja na nekoliko koncentracijskih razina
koji se, naravno, poklapaju s podrujem linearnosti. Kriteri-
ji prihvatljivosti ovise o vrsti analize, matrici uzorka i koncen-
traciji analita koji se odreuje.
Istinitost metode defnira se kao stupanj podudaranja iz-
meu stvarne, tj. prihvaene referencijske vrijednosti, i
srednje vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom
odreeni broj puta. Numeriki pokazatelj istinitosti ekspe-
rimentalno je utvreno sustavno odstupanje (eng. bias) me-
tode, dobiven je kao razlika aritmetike sredine rezultata i
referencijske vrijednosti ili kao njihov odnos, to se posebno
primjenjuje kod odreivanja iskoritenja. Eksperimenti se
provode nakon odreivanja selektivnosti, linearnosti i preci-
znosti, najmanje tri puta za najmanje tri koncentracijske ra-
Slika 1. Dva naina grafkog prikaza linearnosti
O
d
z
i
v

d
e
t
e
k
t
o
r
a
O
d
z
i
v
d
e
t
e
k
t
o
r
a

/

k
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
j
a
Koncentracija Logaritam
l
a
b
o
r
a
t
o
r
i
j
i
63
zine rasporeene unutar radnog podruja metode. Raspon
koncentracija treba odgovarati stvarnom uzorku, ali treba
ukljuiti i koncentraciju na granici kvantifkacije (GK) kada
je ona bitna.
Istinitost metode mogue je procijeniti na nekoliko naina:
usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima
dobivenim uhodanom referencijskom metodom
analizom uzorka poznate koncentracije, npr. certifci-
ranoga referencijskog materijala i usporedbom izmje-
renih rezultata i certifciranih vrijednosti
cijepljenjem matrice ili uzorka poznatom koncentra-
cijom referencijskog materijala.
Rezultati se mogu prikazati grafki kao odnos teorijske (oe-
kivane) vrijednosti prema izmjerenoj koncentraciji, ali obve-
zatno kao srednje iskoritenje. Relativna standardna devija-
cija i ovdje moe posluiti kao pokazatelj preciznosti.
Nekoliko praktinih napomena povezanih s istinitou:
matrica ili uzorak cijepe se dodavanjem (uvagivanjem)
referencijskog materijala na samom poetku postupka
tako da cijepljeni uzorak bude podvrgnut cjeloku-
pnom postupku od pripreme uzorka do mjerenja
iskoritenje ovisi o matrici uzorka, postupku uzorko-
vanja i koncentraciji analita
kod kromatografskog odreivanja vie komponenta
treba odrediti imbenike odziva za svaku kompo-
nentu ako se sve odreuju preko istoga referencijskog
materijala
Granica detekcije/kvantifkacije najmanja je koliina ana-
lita u uzorku koja se moe detektirati/kvantifcirati uz od-
govarajuu preciznost i tonost. Odreuje se razrjeivanjem
osnovne otopine.
Procjena moe biti vizualna, s pomou omjera signal/um ili
statistika. Vizualna se procjena moe primijeniti i kod nein-
strumentnih i instrumentnih metoda, uglavnom samo za gra-
nicu detekcije, a procjenjuje se najmanji signal koji se ned-
vojbeno moe prepoznati. Omjer signal/um moe se
primijeniti samo na analitike postupke s baznom linijom, a
prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu detekcije i 10 : 1 za gra-
nicu kvantifkacije. Statistiki se granice detekcije i kvantif-
kacije mogu odrediti na bazi standardne devijacije signala i
nagiba prema jednadbama: GD = 3.3 /a, odnosno K
g
= 10
s/a pri emu je a nagib, a s standardna devijacija regresijskog
pravca.
Ako se zahtijeva da metoda ima zadanu preciznost na grani-
ci kvantifkacije, pripremi se vie uzoraka poznate koncentra-
cije u podruju oko mogue granice kvantifkacije, svaki se
izmjeri 56 puta i izraunaju se relativne standardne devija-
cije za svaku koncentraciju. Zatim se grafki prikae odnos
RSD-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na
granici kvantifkacije s tono odreenom preciznou kako
se vidi na 3. slici. U praksi se obino pripremi uzorak tako
odreene koncentracije i potvrdi preciznost viekratnim mje-
renjem.
Parametar granice kvantifkacije iznimno je vaan kod meto-
da kojima se odreuju analiti u tragovima koji i u vrlo niskim
koncentracijama mogu tetno djelovati na zdravlje ljudi i
okoli.
Slika 2. Prikaz preciznosti i istinitosti
Slika 3. Odreivanje granice kvantifkacije sa zadanom preciznou
Robusnost se odreuje kao mjera otpornosti analitikog
postupka na male, namjerne promjene radnih uvjeta me-
tode.
Ispitivanje robusnosti provodi se kako bi se odredilo kako
male promjene radnih uvjeta i provedbe metode utjeu na
rezultat analize. Vaan su dio razvoja metode jer pomau ot-
kriti optimalne uvjete izvedbe metode te upuuju na to to
treba nadzirati. Tijekom eksperimenta mijenjaju se radni
uvjeti unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promjena
rezultata. Na primjer kod tekuinske kromatografje ispituju
se utjecaji sastava i pH mobilne faze, temperature, protoka te
razliite are ili dobavljai kolona. Stabilnost otopine tako-
er je tipian parametar ispitivanja robusnosti metode. Ako
promjena nekog radnog uvjeta ne utjee bitno na rezultat,
kae se da je on u podruju robusnosti metode. Uvjete za ko-
je je utvreno da utjeu na rezultat treba drati pod nadzo-
rom i to jasno naznaiti u opisu metode. Primjeri utjecaja
promjene parametara temperature kolone i pH mobilne faze
prikazani su na 4. slici.
Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za is-
pitivanje prikladnosti sustava.
Pri provedbi validacije nije potrebno za svaku metodu odre-
diti sve parametre. Njihov odabir ovisi o namjeni metode,
kako to je to prikazano u 1. tablici.
Razumijevanje znaenja pojedinih parametara i naina na
koji se izvode u laboratoriju, poznavanje znaajka metode i
regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija pri-
NEPRECIZNO I
NETONO
PRECIZNO ALI
NETONO
PRECIZNO I
TONO
l
a
b
o
r
a
t
o
r
i
j
i
64
hvatljivosti za svaki parametar, to je takoer neizostavni dio
validacije. Postavljeni kriteriji usporeuju se s dobivenim re-
zultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje
izvjea s jasno naznaenim zakljukom o potvrdi da metoda
odgovara namijenjenoj svrsi.
4. slika Postojanost metode utjecaj
temperature kolone i pH mobilne faze
Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitikih me-
toda razliitih namjena
Identikacijski
testovi
Analiza tragova
Sadraj
kvantitativna Limit Test
istinitost ne da ne da
preciznost
ponovljivost ne da ne da
meupreciznost ne da ne da
selektivnost da da da da
GD ne ne da ne
GK ne da ne ne
linearnost ne da ne da
podruje ne da ne da
Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline Validation Of Anal-
ytical Procedures: Text And Methodology Q2(R1)
literatura
[1] Te European Community Guidelines: CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (http://
www.eudra.org)
[2] USA Guidelines: US Food and Drug Administration (http://www.fda.gov)
[3] USP (http://www.usp.org)
[4] cGMP (http://www.cgmp.com)
[5] International Committee for Harmonisation (http://www.ich.org) ICH Guidance for Industry Q2(R1)
Validation of Analytical Procedures Methodology
[6] Eurachem (http://www.vtt.fr/ket/eurachem) Te Fitness for Purpose of Analytical Methods
[7] AOAC How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verifcation Prepared by AOAC INTERNATI-
ONAL 481 N. Frederick Ave, Suite 5002007
[8] IUPAC Technical Report: Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis,
Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835855, 2002
[9] NATA: Technical Note #17 Guidelines for the Validation and Verifcation of Chemical Test Methods, April
2009
zakljuak
Validacijom analitike metode dobit e se obavijesti o nje-
zinoj tonosti i preciznosti, o odnosu izmeu koncentracije
uzorka i odziva metode, o moguim interferencijama iz ma-
trice uzorka, o najmanjim koncentracijama koje e se moi
utvrditi ili kvantifcirati tom metodom i doznat e se njezi-
ne najslabije, ali i najjae strane. Validacija analitikih me-
toda je regulatorni zahtjev kao i profesionalna odgovornost
analitiara. Vrijeme i novac uloeni u validaciju investicija
su koja e se viestruko isplatiti tijekom koritenja metode
pruajui sigurnost analitiarima i vjerodostojnost njihovim
rezultatima.