Radioimunoloke analize

principi
Prof.dr sc.med. Boris Ajdinovi

Uvod
Razvoj radioimunolokih metoda (RIA) vezano je za ime
Jalou i Bersena (Yalow i Berson) 1960. godine, ije se
metode baziraju na principu takmienja neobeleenog i
radioizotopom obeleenog insulina na vezivna mesta
antitela. Iste godine Ikins (Ekins) je postavio osnove
radiosaturacionih metoda baziranog na principu
kompeticije neobeleenog i obeleenog tiroksina na
fizioloki transportni protein ovog hormona.

Dr. Rosalyn Yalow - prva ena

dobitnica Nobelove nagrade- 1959

RIA- pretea modernih

imunoeseja

Uvod
Radioimunoloke analize su mikroanalitike
tehnike bazirane na principu reakcije (antigenantitelo) izmeu bioloki aktivnih supstancija u
telesnim tenostima i specifinih vezujuih
proteina uz primenu radioaktivnih izotopa.

Prednosti radioimunolokih analiza:

OSETLJIVOST- veoma male koliine ( koncentracije)
mogu biti kvantifikovane
SPECIFINOST meri se koncentracija samo jedne
supstance od mnogih koje se nalaze u uzorku
UPOTREBLJIVOST- veliki broj uzoraka moe biti
obraen za kratko vreme

OSETLJIVOST
Kocka eera u olimpijskom bazenu

Koncentracija eera u vodi

5g/ 1 milion l vode
( 5 g / l )
Koncentracija T3 u serumu
1g / l

SPECIFINOST
ANTIGEN-ANTITELO IMUNOLOKA REAKCIJA
Princip kljua

antigen
Vezivanje antigena
i antitela

antitelo

Zahtevi RIA
1. Produkcija i karakterizacija antigena
(analita koji treba da se odreuje)
2. Obeleavanje antigena radioaktivnom
substancom
3. Produkcija specifinog antitela
4. Razvijanje RIA kompleta (eseja)

Principi kompetitivnih vezujuih

radioimunoanaliza- radioimunoeseja

Kompetitivno vezivanje
Dodavanje poznatog obeleenog Ag
Dodavanje nepoznatog Ag
Kompeticija jednog i drugog za vezujua mesta
na molekulu Ab
Subpstanca koja nije reagovala se mora odvojiti
Nain obeleavanja poznatog Ag odrejuje i
metod detekcije.

Kompetitivno vezivanje

Radioimmunoassay Competitive

Measurement of Circulating Hormone: RIA Method

Excess Labeled + No Unlabeled Hormone

= antibody
= labeled hormone

Figure 2. Example of a
radioimmunoassay

Antibodies saturated by excess labeled hormone;

Equilibrium: unbound labeled + antibody bound labeled

Measurement of Circulating Hormone: RIA Method

Labeled Hormone + Some Unlabeled Hormone

= antibody
= labeled hormone
= unlabeled hormone

Figure 2. Example of a
radioimmunoassay

Small amount of unlabeled displaces some labeled = labeled antibody

Equilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody
some unlabeled bound

Measurement of Circulating Hormone: RIA Method

Labeled Hormone + Large Quantity of Unlabeled Hormone

= antibody
= labeled hormone
= unlabeled hormone

Figure 2. Example of a
radioimmunoassay

Large amount of unlabeled displaces most labeled = labeled antibody

Equilibrium: unbound unlabeled + saturated labeled antibody
mostly unlabeled bound

Measurement of Circulating Hormone: RIA Displacement Curve

= antibody

Labeled hormone bound to antibody

A
4

No unlabeled
hormone

Small amount
unlabeled hormone
Large amount
unlabeled hormone

= labeled hormone
= unlabeled hormone

18

Concentration of total unlabeled hormone

Figure 2. Example of a
radioimmunoassay

Measurement of Circulating Hormone: RIA Standard Curve

(*H) bound to antibody

Percent labeled hormone

Standard curve: *H-antibody

known unlabeled [hormone]
vs
measured labeled bound

Concentration of total unlabeled hormone

X = measured for patient sample

= [hormone] in patient sample

Figure 3. Standard
curve for evaluation of
blood [hormone] by RIA

Produkcija i obeleavanje Antigenaanalita-substance koja se odreuje

Produkcija Antigena
Sinteza molekula
Izolovanje iz prirodnih izvora
Obeleavanje antigena
3 H 14 C 125 I kao obeleivai
NE SME se naruiti specifinost antigena kao ni
aktivnost antigena!

Pripremanje specifinog antitela

intradermalno injektovanje antigena zeevima ili zamorcima

produkcija antitela
Antitela izdvojena iz seruma
Neki analiti su slabo antigeni- te se konjugiraju sa haptenima
Hormoni , Steroidi, lekovi HAPTENI
: Gastrin, Morphine,
Hapteni conjugovani za albumin antigeni

Radioimunoloka
- RIA -metoda
Sadraj kompleta:
boica sa radioaktivno obeleenim
Ag (I-125-Tg);
boica sa Ab (oviji anti - Tg antiserum);
standardi (tano odreene
koncentracije Tg);
3% rastvor PEG;
kontrolni serum.

Pregled postupaka radioimunolokih

analiza
priprema analitikih uzoraka (ukoliko je potrebna) deproteinizacija, izdvajanje proteinskih analoga,
preiavanje
pravljenje standardnih rastvora za kalibracionu mernu
krivu
formiranje saturacionog sistema (inkubacija i
uspostavljanje ekvilibrijuma)
izdvajanje slobodne /F/ od za proteine vezane /B/
frakcije
merenje aktivnosi reakcije /B ili F/

Principi i postupci u toku RIA analize

;

inkubacija (duina trajanja i uslovi predloeni od strane proizvoaa)

dodavanje sredstva za taloenje (PEG)
centrifugiranje
Aspiriranje
merenje radioaktivnosti u vezanom kompleksu u gamascintilacionom
brojau;
koliina izmerene radioaktivnosti obrnuto je proporcionalna
koncentraciji hormona u serumu.

Radioimmunassay

Princip testa

Princip testa/ RIA

RIA- standardna kriva

Tanost rezultata radioimunolokih

analiza

Tanost rezultata radioimunolokih

analiza

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Princip:
Bazira na imunoj reakciji kao RIA
Od RIA se razlikuje po metodi detekcije
Detekcija se bazira na
Enzim katalizatorskoj reakciji
Fluorescentnoj probi

NEMA RADIOAKTIVNOSTI (PREDNOST)

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT
ASSAY (ELISA)
PRINCIP: Detekcija antigena ili antitela antitelima koja su
obeleena razliitim enzimima.
Hromogeni supstrat ENZIMI: Alkalna fosfataza
bezbojni supstrat koji
Peroksidaza
regauje sa enzimom
-galaktozidaza
STOP reagens zaustavlja
enzimsku reakciju
(najee neka kiselina)

ELISA reader

ELISA
Klasifikacija
Heterogena potrebno odvajanje reaktanata
Homogena nema odvajanja

Dva tipa:
Kompetitivna kompeticija poznatog I nepoznatog
Nekompetitivna reaguje samo nepoznato

ELISA nekompetitivni
Sandwich Assay
Antigen merni sistem

Epruvete obloene odgovarajuim antitelom

Dodavanje uzorka krvi sa Ag
Inkubacija do zavretka reakcije Ag-Ab
Ispiranje odvajanje nevezanog antigena
Dodavanje Antitela obeleenog Enzimom
Incubacija dok se l antigen ne vee za obeleeno antitelo
Ispiranje odvajanje nevezanog antitela
Dodavanje substrata ; inkubacija
Enzyme + Substrate Produkt merenje boje
Boja proporcionalna antigenu u uzorku seruma pacijenta

Sandwich Technique ELISA

ELISA- kompetitivni esej

Kompeticija nepoznatog Ag sa obeleenim poznatim Ag
Enzimi izazivaju kolor reakciju

PRIMENA IMUNOESEJA
[RIA & ELISA]

Analiza hormona, vitamina, metabolita,

tumorskih markera
ACTH, FSH, T3, T4, Glucagon, Insulin,
Testosteron, vitamin B12, prostaglandini,
glukokortikoidi,

Praenje koncentracije uneenih lekova:

Barbiturati, morfin , digoxin,

Diagnostika procedura za otkrivanje infekcije

HIV, Hepatitis A, B, itd.

IRMA Imunoradiometrijski esej) _ Princip testa

kvantitativno odreivanje hormona ili neke druge supstance;
sendvi metoda reakcija vezivanja supstance iz seruma sa Mo-At
vezanim za dno epruvete i sa Mo-At koja su obeleena
radioaktivnim izotopom I-125;
inkubacija (vreme trajanja i uslovi predloeni od strane
proizvoaa);
aspiriranje i ispiranje (broj aspiririranja predloen od strane
proizvoaa);
merenje radioaktivnosti u gamascintilacionom brojau;
koliina izmerene radioaktivnosti direktno je proporcionalna
koncentraciji hormona u serumu.

IRMA Imunoradiometric assay )

Nekompetitivna ili
Sendvi analiza

Imunoradiometrijska
IRMA - metoda
Sadraj kompleta:
boica sa radioaktivno obeleenim
Mo-Ab I-125;
epruvete sa vezanim Mo-Ab;
standardi (tano odreene koncentracije);
rastvor za ispiranje;
kontrolni serum.

Princip testa

IRMA- standardna kriva

Imunoloki radioimunieseji
Kompetitivni esej
Limitirana Ab

Ne-kompetitivni esej
Ab u viku

RIA

IRMA

Obeleeni Ag
Poliklonska Ab

Obeleena Ab
Veinom monoklonska Ab
Sendvi sistem solidne faze
Senzitivnost 5x 10-14 mol/ l

Senzitivnost 10-12 mol/ l

Fluorescence Immunoassay

Markeri
Fluoroforni ili fluorohromni
Sposobnost apsorpcije energije i emitovanja
svetlosti
Najee u upotrebi :
Fluorescein zelena
Tetramethylrhodamine crvena

Fluorescencija

Fluorescent Immunoassay
Direktna imunofluorescencija
Markirano antitelo dodaje se nepoznatom antigenu
fiksiranom na strip

Indirektna imunofluorescencija
Pacientov plus poznati fiksirani antigen
Dodavanje markiranog anti-antitela
Fluorescencija

DELFIA METODA (Dissociation Enhanced

Lanthanide Fluoroimmuno Assay)
Sadraj kompleta
boica sa hormon- Eu-tracer;
antiserum za hormon koji se odreuje;
stripovi sa Po-At;
standardi (tano odreene koncentracije);
rastvor za ispiranje;
boica sa rastvorom za izdvajanje Europijuma.

Princip testa
kvantitativno odreivanje;
kompetitivno vezivanje serumskog hormona i Europijumom
obeleenog hormona za poliklonalana anti-hormonska At koja su
vezana za dno epruvete;
inkubacija;
ispiranje;
dodavanje rastvora za izdvajanje Europijuma;
merenje jaine fluorescentnog signala;
jaina fluorescentnog signala je obrnuto proporcionalna
koncentraciji hormona u serumu.

Princip testa/ DELFIA

Radioligandni eseji
metoda

Vezujui protein

Afinitet (l/ mol)

Klinika primena

RIA

Antitelo

109- 1011

Hormoni

CPBA(competitiv

Plazma ili tkivno

vezujuci proteini

108- 109

Vit B12, folna kiselina

stariT4

ni protein vezujuci
esej)

RRARadiorece
ptorski esej

elijski receptori
hormona

autoantitela
108-109