核磁共振基本原理 11

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吴季辉

核磁 共振原 理及 其在
生物学中 的应 用

第十章 蛋白质 结构测定

§ 10.1 — § 10.5
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吴季辉

生物 大分 子空 间结构
的测 定方 法

X 射线晶体学 多维核磁共振波谱学
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核磁共振 的特 点

•蛋白质处于溶液状态
•适合研究蛋白质 - 蛋白质，
蛋白质 - 核酸 ，蛋 白质 - 配基相互
作用
•可研究蛋白质分子内部运动
•可研究膜蛋白
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NMR structure of the

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recombinant murine prion protein

核磁技术和应用范围
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吴季辉

蛋白质 三维 空间结 构测定

• 样品制备
• 记录核磁共振谱
• 谱峰归属
• 确定二级结构单元
• 约束条件的建立
• 从 NMR 数据到分子模型
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NMR 实验对蛋 白质 样品的 要

求
• mg 量级的蛋白质
• 溶解度大
• 高纯度
• 无聚集
• 足够稳定
• 大蛋白质需要 15N 标记或 13C ， 15N 双标记甚至
2
H ， 13C ， 15N 叁标记
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非标记 蛋白 的谱峰 归属

• 进行 COSY, DQF-COSY, Relay, DQ,

TOCSY 等一系列二维 NMR 实验
• 进行氨基酸残基自旋系统的识别
• 根据蛋白质的一级结构与 COSY 谱中反
映的 J 耦合关系和 NOESY 谱中反映的
NOE 效应关系进行顺序识别（序列证认）
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自旋 系统识 别

•根据 COSY ， TOCSY 等二维谱

揭示的 J 耦合关系
•根据谱峰的化学位移提供的信息
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20 种常 见氨 基酸残基 侧链 不活 泼氢原 子的 自旋系 统

氨基酸 残
基自旋 系
统的特 征
－ COSY 谱中的
交叉峰；
ο, ＋－ Relay 谱中
的交叉峰；
ο,+,* － TOCSY 谱
中的交叉峰；
－对角峰
 － COSY 谱中的交叉峰；
氨基酸 残
ο, ＋－ Relay 谱中的交叉峰；
基自旋 系
ο,+,* － TOCSY 谱中的交叉峰；
统的特 征
－对角峰
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蛋白 质的一 维 1H 谱
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蛋白质 的 COSY 谱
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双量子 滤波 COSY ，显示 BmP02 的 3 个 GLY 的自

旋系统
131 1144 127
HN HA1 HA2 HA1 HA1 HA1
22 22 22 22 22 22

375 1146 365

HN HA1
12 12 HA2
12 12HA1 HA1
12 12HA1

542 1154 535

HN
2 2 HA1 HA2
2 2 HA1 HA1
2 2 HA1
376 370 1152
HN HA2 HA2 HA2 HA1
12 12 130 12312 12 12 12HA2 1145
HN HA2 HA2
22 22HA2
HA1
22 22 22 22HA2
543 540 1153
HN
2 2 HA2
HA2
2 2 HA2
HA1
2 2 HA2

132 125 128

HN HN
22 22 HA2
22 22HN HA1
22 22HN

377 371 367

HN HN HA2
12 12HN
HA1
12 12 12 12HN

544 541 537

HN
2 2 HN
HA2
2 2 HN
HA1
2 2 HN
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TOCSY 是同相谱，可提供整个自旋体系的连接，而且
信号强，对于谱峰证认很有用
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混合时 间 80ms 的 TOCSY ，显示

BmP02 的 NH 与其他 质子的 连接
119
15 HN HB
23 23
HN HB
485
HN28 28
5 5 HB3

98
HN HB2165 304
5520 20 HN HB3 HN HB2
HN
2699HB2
26 HB3
HN 16624 14
24 30514
HN HB2
HN
20 20 24 24 527 HB3
14 14
HN HB3
56 33
HN HB3
26 26
528 439
HN HB2 HN
9 9 HB2
33
440
HN HB3
99
131
HN HA1
22 22
375
HN HA1
12 12
542
HN HA1 376
1972 2 HN HA2 130
HN HB 16 120
18 18
543 12 12 359445 HN HA HN HA2
22 22
720 HN HA
HN HA2 HN HA 28 28 HN HA 272 23 23
22 13 HN
11
HA
13 11 88 HN HA
529 487 15 15
198 HN
HN HA
18 18 33063 HA HN
5 5 HA
441
37 HN HA
14 14 257
852 HN
9 9 HA
HN HA
27 27 HN HA
57 16 16
HN HA
100
26HN 167
26 HAHN HA
20 20 24 24
176
HN HA
19 19
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序列证 认

•根据 NOESY 等二维谱揭示的空

间距离关系将已经识别的自旋系
统或氨基酸残基定位到蛋白质序
列上
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多肽 链中中等范 围的 1H － 1H
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距离
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顺序识别 -1
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顺序识别 -2
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顺序识别 -3
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•蛋白质序列相距甚远的氨基酸残基上的质子也可能
在空间上很接近 , 而导致错误的序列证认
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确定 二级结 构单 元
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蛋白 质的二级结 构 -1
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蛋白质 的二级结构 -2
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蛋白质 的二级结构 -3
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化学位 移标 志 (CSI)

• 两个蛋白的 Hα 的化学位移标志图，弹簧状的和箭头状
的图形分别表示螺旋和 折叠
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约束条件 的建 立

1
 Sref  6
ri = rref  
• 距离约束  Si 
• 二面角约束
• 氢键约束
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核磁共振基本原理 4
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吴季辉

多肽构象

多肽是由多个氨基酸组成的，
氨基酸之间通过肽键（酰胺
键）连接，肽键具有部分双键
性质，不能自由旋转
核磁共振基本原理 4
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多肽主链 的二 面角

A-B-C-D 定义二面角， C-D 相对 A-B 顺

时针转为正，逆时针转为负，重叠为零
 邻位耦合 常数 J 和二面 角
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Karplus 关系

3
J ＝ Acos2ϑ+Bcosϑ+Csin2ϑ
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角和 角的关系

L －氨基酸 ： =φ-60°

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吴季辉

角和 角的关系
D －氨基酸 ： =φ+60
°
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因此每一个 角对应于 2 个 角，而对于大多数 3JH-

N-Cα-H
，每一个耦合常数 3JH-N-Cα-H 又对应于二个 值,
因此有四个可能的 角对应于观察到的 3JH-N-Cα-H 值

Karplus-Bystov 关系式和构象能的计算相结合，或简单地
和构象能图相结合可以帮助正确选择可能的二面角
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对 L- 氨基酸来说：

右手 螺旋 3
JH-N-Cα-H≈3.9Hz (φ ＝ -57

°)

310 螺旋 JH-N-Cα-H≈4.2Hz (φ ＝ -60°)

3

反平行 折叠 3
JH-N-Cα-H≈8.9Hz (φ ＝ -

139°)
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氢 - 氘交换
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15h

60'

10'

0'

in H2O

ppm 9 8 7
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从 NMR 数据到分 子模 型

•仅根据核磁实验获得的约束条件不足
以构建蛋白质的空间结构 , 所以还需
要利用蛋白质的一级结构 ( 序列 ) 信
息 , 利用一般共价键的键长 , 键角等信
息
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分子 力场

d 2 ri
2
= Fi (r1 , r2 , r3 , rn ) / m i
dt
Fi (r1 , r2 , r3 , rn ) = −∇Vi (r1 , r2 , r3 , rn )

Vi = ∑ 1
2
K b (b − b0 ) 2 + ∑ 1
2
K θ (θ − θ 0 ) 2
键长 键角

+ ∑ 1
2
K ξ (ξ − ξ 0 ) 2 + ∑ K φ [1 + cos( nφ − δ)]
非正常二面角 正常二面角

+ ∑ [C12 / rij12 − C 6 / rij6 + q i q j / 4 nεε 0 rij2 ]

i, j
• 基本原理：在准各态历经假设下，任何力学量对系综
的平均等于该力学量对时间的平均，而力学量对时间
的平均可以从经典运动方程所决定的运动轨迹得到
Secondary Structure
(a) NMR constraints
Distance constraints 1032
Intra-residue 152
Sequential (|i-j|=1) 273
Medium-range (|i-j|<5) 379
Long-range (|i-j|≥5) 228
Dihedral angle restraints 100
Hydrogen bonds 11
(b) Statistics for 20 structures
NOE violations
Number > 0.1 Å 4.8 ± 1.4
Maximum violations (Å) 0.16 ± 0.03
RMS deviation from idealized
covalent geometry
Bonds (Å) 0.0019±
0.0002
Angles (deg) 0.39 ± 0.01
Impropers (deg) 0.21 ± 0.01
Lennard-Jones potential energy -206 ± 20
(kcal mol-1)
(c) Coordinate precision

Pairwise rmsd for backbone atoms 0.80 ±

(13-68) (Å) 0.13
Pairwise rmsd for heavy atoms 1.73 ±
(13-68) (Å) 0.18
RMS deviation to the mean bb/heavy

11-75 (Å) 0.98/1.88

17-31,38-51,57-75 (Å) 0.78/1.67

13-68 (Å) 0.55/1.53

61-78 (Å) 1.03/2.32

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14 个最好构象的重叠 ( 模拟退火计算 30 个构象， violation<0.5A)

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能量最小的一个代表性构象的 ribbon representation

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吴季辉
核磁共振基本原理 11
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吴季辉
核磁共振基本原理 11
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吴季辉

2D-NMR 的限 制
• 2D-NMR 在确定蛋白质溶液的结构方面已取得了巨
大的成就，可以获得小于 100 个残基的小蛋白的
溶液结构，在准确度方面类似于 2.0-2.5Å 分辨
率的晶体结构
• 随着蛋白质分子量的进一步提高，由于化学位移
的重叠或简并，使得在 2D NMR 方法中所使用的
自旋系统识别和序列识别方法不再完全有效
• 其次是随着分子量增加，谱线变宽，因而使得较
难利用建立在小的同核耦合 ( 耦合常数 12Hz)
之上的一些位移相关实验
核磁共振基本原理 11
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小蛋白和 大蛋 白二维 谱的比

吴季辉

BmP02(28 个残基 ) 部分 NOESY 谱 ADR6(115 个残基 ) 部分

NOESY 谱
核磁共振基本原理 11
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吴季辉

异核 多维 NMR
• 增加谱的维数，提高分辨率
• 将大的单键异核耦合用于磁化转移

preparation evolution mixing acquisition 2D

2D preparation evolution mixing acquisition

combine
t1 t2
preparation evolution mixing evolution mixing acquisition
3D
核磁共振基本原理 11
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吴季辉

多维 NMR 分辨率 的提 高

F3

F1 F2
F2
F2
2D F1
F4

F1

F3 3D
核磁共振基本原理 11
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1
H- N 异核 相关谱
15
核磁共振基本原理 11
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吴季辉

15
N 编辑三维 NOESY 谱
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吴季辉

谢 谢