II.

gimnazija Maribor

LABORATORIJSKA EKSPERIMENTALNA VAJA:

VPLIV KONCENTRACIJE SUBSTRATA NA HITROST ENCIMSKE REAKCIJE

AVTOR: Doris Barat Razred: 4.f MENTOR: Katja Holnthaner Zorec, prof

29.10.2013.

Kazalo

1.) UVOD ..................................................................................................................................... 3 2.) EKSPERIMENT ........................................................................................................................ 5 2.1) NAMEN IN CILJ VAJE ....................................................................................................... 5 2.2) RAZISKOVALNA VPRAANJE IN HIPOTEZE ...................................................................... 6 2.3) OPREDELITEV SPREMENJIVK ........................................................................................... 6 2.4.) MATERIJAL IN METODA .................................................................................................. 7 3.) REZULTATI ............................................................................................................................. 9 4.) DISKUSIJA ........................................................................................................................... 14 VIRI ........................................................................................................................................... 15 SLIKOVNI VIRI ........................................................................................................................... 15

1.) UVOD
Spontane kemijske reakcije se pojavljajo brez potrebe po zunanji energiji. Vendar se lahko pojavljajo tako poasi, da so neopazne. Na primer: eprav je hidroliza saharoze v glukozo in fruktozo eksotermna rekacija, torej se pojavlja spontano s sproanjem e nergije, raztopina saharoze v destilirani vodi pri sobni temperaturi bo leta stala brez opazne hidrolize. Vendar, e raztopini dodamo malo koliino encima sukraze, bo hidroliza potekla v nekaj sekundah. [1] Encim je makromolekula, ki deluje kot katalizator, kemijska supstanca, ki uravnava hitrost in smer kemijske reakcije, pri emer se ne porablja. *2+ Encimi pospeujejo metabolne reakcije z znianjem aktivacijske energije. Aktivacijska energija je energija potrebna za razcep vezi med reaktanti v kemijski reakciji. [1]

Slika 1: prikaz vpliva encima na aktivacijsko energijo [7]

Encimi delujejo po principu kljua in kljuavnice. Imajo posebno oblikovana aktivna mesta, kamor se po obliki prolegajo molekule, ki jim reemo substrati. Encimi omogoijo preoblikovanje substrata, sami pa se pri tem ne spremenijo. Ko sta aktivno mesto in substrat pravilno nameena se poveeta in omogoita, da se encimska reakcija zane. [3]

Kofaktor je nebeljakovinska spojina, ki je mono ali ibko vezana na beljankovino in je potrebna za bioloko aktivnost beljankovin; najpogosteje so te beljankovine encimi. Obstajajo anogranski in organski kofaktorji. Anorganski kofaktorji so v veini primerov kovinski ioni. Pri loveku so najpogosteji ioni eleza, mangana, kobalta, bakra, cinka, selena in molibdena. Organski kofaktorji so pa veliko krat vitamnini ali derivati vitaminov. Glede na mo vezave na encime se lahko kofaktorje razdeli v koencime. [4] Koencimi pomagajo encimu katalizirati reakcijo. Lahko sprejemajo atome, ki jih oddaja substrat ali oddajajo atome, ki jih substrat sprejema. Vloga koencimov je pri kataliziranju encimskih reakcij kljunega pomena, saj pri nekaterih encimih proteinski del ne zadostuje za popolno reaktivnost. Tako encimi potrebujejo pomo koencimov, da lahko reakcija potee. Konecimi so po strukturi sorodni vitaminom. Koencime viji organizmi lahko sintetizirajo le, e dobijo vitamine s hrano, saj nekateri deli koencimov lahko nastanejo samo iz njih. Takna sta tudi dva od najpomembnejih koencimov v celinem metabolizmu, NAD+ (nikotinamid adenin dinukleotid) in NADP+ (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat); oba vsebujeta vitamin B, natanneje nikotinsko kislino, ki deluje kot nosilec elektronov *5+

Pri stalni koncentraciji encima hitrost reakcije naraa z veanjem koncentracije substrata . Ko veamo koncentracijo substrata je uporabljenih vedno ve aktivnih mest. Pri doloeni koncentraciji so uporabljena vsa aktivna mesta e od te toke dalje poveujemo koncentracijo substrata, se hitrost encimske reakcije ne bo ve poveevala, saj je omejejo dejavnik tevilo molekul encima. To je maksimalna hitrost encimske reakcije. [6]

Slika 2: Graf aktivnost encima v odvisnosti od koncentracije substrata [8]

Hitrost encimske reakcije se vija z vianjem temperature. Saj se molekule substratov gibljejo hitreje, kar pomeni da bodo vekrat trile ob encimova aktivna mesta. Vendar previsoka temperatura lahko provzroa prekinitev ibkih vodikovih in ionskih vezi, ter denatruacijo encima. Vsak encim ima optimalno temperaturo pri kateri je hitrost encimske reakcije najvija. Pri loveku se te temperature gibljejo med 3540C. [1] Tako kot temperatura, obstaja tudi optimalna pH vrednost za delovanje encimov. Pri loveku je to med 6-8, vendar obstajajo izjeme kot so pepsin, ki najbolje deluje pri pH vrednosti 2. To lahko tudi priakujemo, saj je pepsin encim, ki deluje v kislem okolju v elocu. *1+ Katalaza je encim prisoten pri evkariontih in prokariontih. Pri loveku se nahaja v jetrih , najdemo ga pa tudi v eritrocitih. Njegova naloga je, da katalizira kemijsko reakcijo, pri kateri pride do razkroja toksinega vodikovega peroksida, ki nastaja kot stranski produkt pri keminih reakcijah v ivih celicah, na 2 molekule vode in molekulo kisika. [2]

Pri loveku obstajajo tudi drugi encimi, ki razkrojujejo vodikov peroksid. Eden izmed takih je glutation peroksidaza. Glutation peroksidaza je v fiziolokih pogojih (nizka koliina vodikovega peroksida), celo bolj aktivna od katalaze. Vendar se pri viji koncentraciji vodikovega peroksida aktivnost katalaze mono povea. [2]

2.) EKSPERIMENT
2.1) NAMEN IN CILJ VAJE Vaje smo izvedli 3.10.2013. z sledeim namenom: Raziskati vpliv koncentracije vodikovega peroksida (substrata) na hitrost encimske reaksije Spoznati metodo merjenja hitrosti kemijske reakcije zbiranje kvantitativnih podatkov in njihova obdelava Grafino prikazati odvisnost encimske reakcije od koncentracije substrata Ugotoviti mone vire napak in predlagati naine za njihovo zmanjanje Dokazovanje proizvodov reakcije pri kokih jeter in vodikovim peroksidom Primerjava anorganski organski (beljankovinski) katalizator Raziskati monost ponovne uporabe encima Ugotoviti vpliv velikost delkov jetre na hitrost encimske reakcije Ugotoviti vpliv visoke temperature na hitrost encimske reakcije
5

2.2) RAZISKOVALNA VPRAANJE IN HIPOTEZE Iskali smo odgovore na naslednja raziskovalna vpraanja: Kaki je vpliv koncentracije vodikovega peroksida na hitrost encimske reakcije? Kaj je proizvod pri encimskih reakciji med jetri in vodikovim peroksidom? Kakna je hitrost encimske reakcije organskih katalizatorjev v primerjavi z anorganskimi? Ali se encimi po reakciji porabijo? Ali ima velikost delkov vpliv na hitrost encimske reakcije? Kaki je vpliv visoke temperature na aktivnost encimov?

Zastavili smo si naslednje hipoteze: H1: Z zvianjem koncentracije vodikovega peroksida se zviuje tudi hitrost encimske reakcije H2: Proizvod pri encimskih reakcijah med jetri in vodikovim peroksidom je kisik H3: Hitrost encimske reakcije je veja pri organskih katolizatorih kot pri anorganskih katolizatorih H4: Encimi se pri reakciji ne porabijo H5: Velikost delkov encima vpliva na hitrost reakcije hitreja je pri manjih delcih encimov H6: Visoka temperatura onemogoa nastanek encimske reakcije

2.3) OPREDELITEV SPREMENLJIVK Pri poskusu je neodvisna spremenljivka bila koliina suspenzije kvasovk in koncentracija vodikovega peroksida. Odvisna spremenljivka je hitrost encimske reakcije, oz. sprememba tlaka v odvisnosti od asa. Kontrolirana spremenljivka je bila temperatura suspezije kvasovk in koncentracija vodikovega peroksida.

2.4.) MATERIAL IN METODA Pri eksperimentu smo uporabili naslednje materiale: Suspenzija kvasovk (1 paket suhega kvasa / 250 ml vode) Razline koncentracije vodikovega peroksida ( 1%, 1.5%, 2%, 2,5%, 3%) Inekcije (5ml) Stojalo za epruvete Raunalnik z Looger Pro programom Vernier plinski tlani senzor Lavor s toplo vodo Termometer Terilnica Erlenmajerica 2 epruveti Cevka in zamaek Kremenev pesek Manganov dioksid Koek krompirja Koek jeter

1. Del vaje

Na raunalniku smo zagnali program Logger Pro. Nastavili smo teajanje poskusa (2 minuti) in tevilo meritev (60 / min). V epruvete smo z inekcijo odmerili 2 ml suspenzije kvasovk. S pomojo zgornjega dela inekcijske igle smo odmerili 2 mj 1% vodikovega peroksida. Peroksid smo iztisnili v epruveto, tako da se je vsebina dobro premeala, nato smo im hitreje namestili zamaek, ki je bil povezal s senzorjem za tlak. Ves dodani materijal je bil na sobni temperaturi (cca 23 C) Za vsako koncentracijo vodikovega peroksida smo opravili 5 meritev. Postopek smo ponovili z ostalimi koncentracijami. Shranili smo podatke in nove meritve smo vnaali na isti graf. Pogoji so morali biti pri vseh poskusih enaki.

2. Del vaje Pripravili smo aparat za zbiranje plina. V terilnico smo s pomojo peska zmekali koek jeter. Meanico smo dali v 250 ml erlenmajerico in smo dolili 100 ml 3% vodikovega peroksida. Zamaili smo erlenmajerico z zamakom, na katerega je bila pritrjena cevka. Zbrali smo 2 epruveti plina. V epruveto, obrnjeno z ustjem navzdol, smo vtaknili tleo trsko in zapisali ugotovitve.

V 4 epruvete smo nalili 3% raztopino vodikovega peroksida. Oznaili smo jih od 1 do 4. Dodali smo kremenkov pesek, manganov dioksid, koek krompirja in koek jeter. Opazovali in ocenjevali smo hitrost reakcije od 2 do 4.

Vzeli smo e uporabljeni koek jeter. Dali smo ga v sveo raztopino 3% vodikovega peroksida in ocenini (od 1 do 4) hitrost reakcije.

Primerjali smo hitrost reakcije, ki potee z zdrobljenim kokom jeter z reakcijo z nezdrobljenim kokom jeter. Vzeli smo koek jeter, dodali kremenev pesek in s stekleno palko zmekali jetra. Nato smo dodali 3% vodikov peroksid. In (od 1 do 4) ocenili hitrost reakcije.

Vzeli smo koek kuhanih jeter in dodali 3% vodikov peroksid ter opazovali in ocenjevali hitrost reakcije.

3. ) REZULTATI
Slika 1: prikaz hitrosti encimske reakcije v odvisnosti od koncentracije vodikovega peroksida (neobdelani podatki)

Graf 1: prikaz dobljenih rezultatov v programu Logger Pro (neobdelani podatki)

10

Graf 2: Prikaz dobljenih rezultatov v programu Logger Pro z opcijo Linear Fit (neobdelani podatki)
11

Opis grafa 1 in 2 Grafa prikazujeta hitrost encimske reakcije, kar se kae v spremembi tlaka (x os) v enoti asa (y os). Graf smo zaradi veje preglednosti oznaili z barvami in sicer: Rdea . 1% vodikov peroksid Modra . 1,5% vodikov peroksid Oranna 2% vodikov peroksid Violna . 2,5% vodikov peroksid Zelena 3% vodikov peroksid

Tabela1: prikaz hitrosti encimske reakcije v odvisnosti od koncenteacije vodikovega peroksid n 1 2 3 4 5 1% [kPa/s] 1,040 0,874 1,338 1,611 1,461 1,5% [kPa/s] 2, 673 2,260 2,798 1,848 2,541 1,5% [kPa/s] 2% [kPa/s] 2,982 3,429 2,940 2,746 2,846 2 [kPa/s] 2,5% [kPa/s] 3,846 4,063 4,231 4,127 3,959 2 [kPa/s] 3% [kPa/s] 4,768 5,149 5,457 5,153 4,774 3,0 % [kPa/s]

[kPa/s]

1,265

2,424

2,989

4,045

5,060

Legenda: n tevilo ponovitev x povpreje *kPa/s+ . Kilopaskalov na sekundo 1% ..... 1,5% ... 2% ....... 2,5% ... 3% 1% koncentracije vodikovega peroksidida 1,5% koncentracije vodikovega peroksidida 2% koncentracije vodikovega peroksidida 2,5% koncentracije vodikovega peroksidida 3% koncentracije vodikovega peroksidida

12

Graf 1: odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata

6 5 5 [hitrost reakcije [kPa/s] 4.05 4 2.99 3 2 1 0 1 1.5 2 2.5 koncentracija H2O2 [%] 3 2.42 1.27

Standardni odklon

= 0,99071

2. del Primerjava anorganski organski katalizator Dodani material Kremenev pesek Manganov dioksid Hitrost reakcije 0 1 Dodani material / Koek jeter Hitrost reakcije / 3

Ocenjeno od 1 do 4 (subjektivna ocena).

Ponovna uporaba encima Z demonstracijo smo se prepriali, da se encimi lahko ponovno uporabijo. Hitrost reakcije smo ocenili z 3.

13

Vpliv velikosti delkov

Opazili smo, da obstaja razlika v hitrosti reakcije pri zdrobljenih jetrih in pri vejem koku jetre. In sicer smo hitrost reakcije pri zdrobljenih jetrih ocenili z 4, pri vejem koku jetre pa z 3.

Vpliv visoke temperature Reakcija ni potekla. Hitrost je 0.

4.) DISKUSIJA
V prvem delu vaje smo potrdili H1. Saj smo dokazali, da se z zvianjem koncentracije vodikovega peroksida (substrata), zviuje tudi hitrost encimske reakcije, kar je razvidno iz rezultatov (graf 1, tabela 1). Temu je tako zato, ker je vedno ve zasedenih aktivnih mest na encimih. Hitrost naraa dokler se ne porabijo vsa aktivna mesta. Vejo zanesljivost razultatov, bi lahko dobili, e bi z enako hitrostjo (im hitreje , zaradi burne reakcije) zapirali vse epruvete, ter uporabljali iste epruvete, ne pa oprane, saj se v opranih lahko e najde kakna kap vode, ki lahko vpliva na rezlutate. Temu v prid pravi tudi vir [4]. V drugem delu vaje smo potrdili H2, H3, H4, H5 in H6. Encim katalaza, ki ga najdemo v jetrih je kljuen za razkroj toksinega vodikovega peroksida, ki nastaja kot stranski proizvod pri keminih reakcijah v ivih celicah. Pri tej reakciji se sprosti kisik kot stranski produkt. To smo dokazali tako, da smo v epruveto zbrali plin, ki je nastal pri encimski reakciji med koki jeter in vodikovim peroksidom. V epruveto z plinom smo vtaknili tleo trsko, ki je vepruveti za kratek as gorela (dokler se ni porabil ves kisik). Ker vemo, da gorenje ni mogoe brez prisotnosti kisika, je H2 dokazana. O tem poroa tudi vir *2+. H3 smo potrdili z poskusom. Opazili smo, da je hitrost reakcije pri jeterih bila nepremerljivo veja kot pri manganovem dioksidu (reakcijo pri jertih smo ocenili z 3, rekacijo pri manganovem dioksidu pa z 1, pri lestvici od 1 do 4), pri kremenevem pesku pa je niti ni bilo. Vendar razline organske (vitamini) in anorganske spojine (kovine) v organizmu delujejo kot kofaktorji, oz. kot koencimi, ki delujejo kot most med aktivnim mestom in substratom. Za delovanje nekaterih encimov je prisotnost anorganskih spojin v vlogi kofaktorjev od kljunega pomena. Zato ne smemo zanemariti pomen teh esencijalnih spojin in jih moramo redno vnaati v organizem. *5+*6+ Ker se encimi ne morejo porabiti, smo dokazali tudi H4. Po ponovni uporabi encimov iz jeter in dodajanjem 3% vodikovega peroksida, je reakcija, e vedno potekala. To pa zato, ker encim in substrat delujejo po principu kljua in kljuavnice. Kadar se substrat vee na aktivno
14

mesto encima, se substrat spremeni, encim pa ostane ne spremenjen in je po reakciji pripravljen sprejeti naslednji substrat. [3] Potrdli smo H5 - velikost delcev encima vpliva na hitrost encimske reakcije. In sicer je ta veliko hitreja (4 krat), kadar so kokki manji. in to zato ker na hitrost delovanja encimov vpliva stina povrina med encimom in substratom. Veja kot je stina povrina (manji delci), hitreje poteka reakcija. H3 smo potrdili - previsoka temperatura lahko provzroa prekinitev ibkih vodikovih in ionskih vezi, ter denatruacijo encima. Vsak encim ima optimalno temperaturo pri kateri je hitrost encimske reakcije najvija. Pri loveku je te temperature gibljejo med 3540C. Ker so encimi bili jetrnega izvora, ne bi smeli encime ispostavljati temperaturam vijim od 40C, v kolikor bi hoteli da ostanejo funkcionalni. V nasprotnem prihaja do denatruacije beljankovin, ki je ireverzibilna reakcija. [1]

VIRI
[1] Campbell Biology (9th Edition), Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson [2] Biologija celice in genetika : biologija v gimnaziji / P. Stuek, B. Vilhar *3+ Kjer se ivljenje zane, M. Dermastia, R. Komel, T. Turk [4] http://sl.wikipedia.org/wiki/Kofaktor [online prevzeto 10.11.2013] [5] http://sl.wikipedia.org/wiki/Koencim [online prevzeto 10.11.2013] [6] Vaja: Vpliv koncentracije substrata na hitrost encimske reakcije, K.H. Zorec

SLIKOVNI VIRI [7] http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSq0hgGOZkLIrqSLy3R7qhlyezGBKWUzTMtIfGns vtdgvM2_ic9yA [prevzeto online 10.11.2013] [8] http://sl.wikipedia.org/wiki/Slika:Graf_aktivnosti_encima.jpg [prezveto online 10.11.2013]

15