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4 9 4 C . A . VILLEE A N] J . M .

LORING 1 9 6 1
h o w e v e r , r e v e a l e d w i d e d i f f e r e n c e s i n t h e r e l a t i v e
a c t i v i t i e s o f t h e t w o pa t h w a ys i n c o m pa r a b l e
t i s s u e s o f d i f f e r e n t s pe c i e s .
We w i s h t o t h a n k P r o f e s s o r J o h n Li n d , D e pa r t m e n t
o f P e d i a t r i c s , K a r o l i n s k a H o s pi t a l , a n d P r o f e s s o r C a r l
S c h m i t t e r l o w , D e pa r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y, K u n g l .
Ve t e r i n a r h o g s k o l a n , f o r t h e i r g e n e r o s i t y i n pr o v i d i n g t h e
f o e t a l s pe c i m e n s a n d t h e l a b o r a t o r y f a c i l i t i e s f o r t h e e x -
pe r i m e n t s i n S t o c k h o l m . T h i s w o r k w a s a i d e d b y g r a n t s
f r o m t h e C h a r l e s a n d M a r j o r i e K i n g F u n d , f r o m t h e A s s o c i -
a t i o n f o r t h e A i d o f C r i ppl e d C h i l d r e n , a n d Gr a n t C - 2 4 0 0
f r o m t h e Na t i o n a l In s t i t u t e s o f H e a l t h .
REF ERENC ES
B a r k e r , S . B . & S u m m e r s o n , W. H . ( 1 9 4 1 ) . J . b i o l . C h e m .
1 3 8 , 5 3 5 .
B r o w n , A . K . , Z u e l z e r , W. W. & B o l l e t , A . J . ( 1 9 5 8 ) .
A . M . A . A m e r . J . D i s . C h i l d . 9 6 , 4 8 7 .
d e D u v e , C . & H e r s , H . G. ( 1 9 5 7 ) . A n n u . Re v . B i o c h e m . 2 6 ,
1 4 9 .
F i e l d , J . B . , P a s t a n , I. , H e r r i n g , B . & J o h n s o n , P . ( 1 9 6 0 ) .
En d o c r i n o l o g y, 6 7 , 8 0 1 .
F o l c h , J . , Le e s , M . & S l o a n e - S t a n l e y, G. H . ( 1 9 5 7 ) . J . b i o l .
C h e m . 2 2 6 , 4 9 7 .
Gl o c k , G. E. & M c Le a n , P . ( 1 9 5 5 ) . B i o c h e m . J . 6 1 , 3 8 8 .
K a t z , J . & Wo o d , H . G. ( 1 9 6 0 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 5 ,
2 1 6 5 .
K r a h l , M . E. ( 1 9 5 6 ) . B i o c h i m . b i o ph ys . A c t a , 2 0 , 2 7 .
K r e t c h m e r , N. ( 1 9 5 9 ) . P e d i a t r i c s , S pr i n g f i e l d , 2 3 , 6 0 6 .
La t h e , G. H . ( 1 9 5 9 ) . T r a n s . 3 r d J o s i a h M a c y, j u n . , C o n f . ,
P h ys i o l o g y o f P r e m a t u r i t y.
Ne l s o n , N. ( 1 9 4 4 ) . J . b i o l . C h e m . 1 5 3 , 3 7 5 .
S i pe r s t e i n , M . D . l 1 9 5 8 ) . D i a b e t e s , 7 , 1 8 1 .
Vi l l e e , C . A . ( 1 9 5 3 ) . J . b i o l . C h e m . 2 0 5 , 1 1 3 .
Vi l l e e , C . A . , H a g e r m a n , D . D . , H o l m b e r g , N. , Li n d , J . &
Vi l l e e , D . B . ( 1 9 5 8 ) . P e d i a t r i c s , S pr i n g f i e l d , 2 2 , 9 5 3 .
Vi l l e e , C . A . , Lo r i n g . J . & We l l i n g t o n , F . ( 1 9 5 7 ) . B i o l . B u l l . ,
Wo o d ' s H o l e , 1 1 3 , 3 5 8 .
Vi l l e e , D . B . , En g e l , L. L. , Lo r i n g , J . M . & Vi l l e e , C . A .
( 1 9 6 1 ) . En d o c r i n o l o g y, 6 9 , 3 5 4 .
Vi l l e e , D . B . , En g e l , L. L. & Vi l l e e , C . A . ( 1 9 5 9 ) . En d o c r i n -
o l o g y, 6 5 , 4 6 5 .
Wa l a " , 0 . & Wa l a a s , E. ( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 7 ,
7 6 9 .
Wi c k , A . N. , D r u r y, D . R. , Na k a d e r , H . I. & Wo l f e , J . B .
( 1 9 5 7 ) . J . b i o l . C h e m . 2 2 4 , 9 6 3 .
B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 8 1 , 4 9 4
A S t u d y o f t h e C i t r i c A c i d C yc l e i n C e r t a i n T u m o u r T i s s u e s
B Y R. M . D A J A NI, J OYC E D A NIELS K I, W. GA M B LE A ND J . M . ORT EN
D e pa r t m e n t o f P h y8 i o l o g i c a l C h e m i 8 t r y, Wa yn e S t a t e U n i v e r 8 i t y C o l l e g e o f M e d i c i n e ,
D e t r o i t , M i c h i g a n , U . S . A .
( Re c e i v e d 1 3 F e b r u a r y 1 9 6 1 )
A t pr e s e n t t h e r e a r e t w o s c h o o l s o f t h o u g h t
a b o u t t h e r e s pi r a t i o n o f c a n c e r c e l l s . Wh e r e a s b o t h
a g r e e t h a t t u m o u r t i s s u e s e x h i b i t h i g h a n a e r o b i c
a n d a e r o b i c g l yc o l ys i s w i t h a n e x c e s s i v e pr o d u c t i o n
o f l a c t i c a c i d ( C o r i & C o r i , 1 9 2 5 ; Wa r b u r g , 1 9 2 6 ,
1 9 5 6 ) , t h e y d i f f e r a s t o t h e e x t e n t o f t h e o pe r a t i o n
o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e i n t h e s e t i s s u e s ( We i n h o u s e ,
1 9 5 5 ; We i n h o u s e , Wa r b u r g & B u r k , 1 9 5 6 ; Wa r -
b u r g , 1 9 5 6 ) . In t h e s e s t u d i e s t h e a c t i v i t y o f c e r t a i n
s e g m e n t s o f t h e c yc l e h a s b e e n d e t e r m i n e d b y
o x yg e n c o n s u m pt i o n a n d c a r b o n d i o x i d e pr o d u c t i o n
pr o c e d u r e s ( Wa r b u r g , 1 9 2 6 ; B u s c h & P o t t e r , 1 9 5 2 ;
B u s c h & B a l t r u s h , 1 9 5 4 ; B u s c h , 1 9 5 5 ; We i n h o u s e ,
1 9 5 5 ; Wa r b u r g , 1 9 5 6 ; Ib s e n , C o e & M c K e e , 1 9 5 8 ) ,
b y m e a s u r i n g t h e g l yc o l yt i c a n d o x i d a t i v e e n z ym e s
( S i b l e y & Le h n i n g e r , 1 9 4 9 ; Le P a g e , 1 9 5 0 ; M e i s t e r ,
1 9 5 0 ; P o t t e r , 1 9 5 1 ; We i n h o u s e , 1 9 5 1 ; We n n e r ,
S pi r t e s & We i n h o u s e , 1 9 5 2 ; B e c k , 1 9 5 8 ) , a n d t h e
c o f a c t o r s o f t h e e l e c t r o n - t r a n s po r t s ys t e m ( D u b o i s
& P o t t e r , 1 9 4 2 ; We n n e r & We i n h o u s e , 1 9 5 3 ;
Gr e e n s t e i n , We r n e , Es c h e n b r e n n e r & Le u t h a r d t ,
1 9 4 4 ) , o r b y f o l l o w i n g t h e u t i l i z a t i o n o f t h e v a r i o u s
i n t e r m e d i a t e s o f t h e Em b d e n - M e ye r h o f s c h e m e
a n d t h e t r i c a r b o x yl i c a c i d c yc l e ( P a r d e e & P o t t e r ,
1 9 4 9 ; El l i o t t & K a l n i t s k y, 1 9 5 0 ; Ol s o n , 1 9 5 1 ;
We n n e r & We i n h o u s e , 1 9 5 2 ; H e i d e l b e r g e r , 1 9 5 3 ;
B u s c h & B a l t r u s h , 1 9 5 4 ) . H o w e v e r , n o n e o f t h e s e
i n v e s t i g a t o r s h a s u t i l i z e d t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r -
m i n a t i o n o f t h e a m o u n t s a n d r a d i o a c t i v i t i e s o f a l l
t h e m e m b e r s o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e i n v i t r o i n t h e
pr e s e n c e a n d a b s e n c e o f c e r t a i n a d d e d l a b e l l e d
s u b s t r a t e s a n d b l o c k i n g a g e n t s . S u c h a pr o c e d u r e
c o u l d r e f l e c t t h e a c t i v i t y o f t h e c yc l e i f a n e x c e s s o f
s u b s t r a t e i s pr e s e n t d e s pi t e t h e f a c t t h a t t h e i n d i -
v i d u a l c yc l e a c i d s a l l e g e d l y s e r v e a ' c a t a l yt i c '
f u n c t i o n . T h e r e a r e e x a m pl e s o f v a r i a t i o n s i n t h e
a m o u n t s o f t h e i n d i v i d u a l c yc l e a c i d s u n d e r
d i f f e r i n g e x pe r i m e n t a l c o n d i t i o n s , f o r e x a m pl e ,
a f t e r t h e a d d i t i o n o f s pe c i f i c b l o c k i n g a g e n t s . T h e
pr e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o e m pl o y s u c h a
d i r e c t a ppr o a c h . T h e t u m o u r a n d n o r m a l t i s s u e
pr e pa r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h [ 1 4 C ]a c e t a t e ,
K REB S C YC LE IN T U M OU R T IS S U E
[ 1 4 C ]s u c c i n a t e o r n o n - l a b e l l e d m a l a t e a n d t h e
a m o u n t s a n d a c t i v i t i e s o f t h e - i n d i v i d u a l c yc l e
a c i d s w e r e d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d b y D a j a n i &
Or t e n ( 1 9 5 8 ) . T h e r e s u l t s c o n c l u s i v e l y d e m o n -
s t r a t e d a q u a n t i t a t i v e l y r e d u c e d a c t i v i t y o f t h e
t r i c a r b o x yl i c a c i d c yc l e i n t h e t u m o u r s a s c o m -
pa r e d w i t h t h e n o r m a l t i s s u e s s t u d i e d u n d e r t h e
c o n d i t i o n s o f t h e e x pe r i m e n t s .
EXP ERIM ENT A L
M a t e r i a l 8
D P N, A T P , s u c c i n i c a c i d a n d L- m a l i c a c i d , a l l pu r i f i e d
g r a d e , w e r e pu r c h a s e d f r o m t h e C a l i f o r n i a F o u n d a t i o n f o r
B i o c h e m i c a l Re s e a r c h , Lo s A n g e l e s , C a l i f . [ 1 - 1 4 C ]A c e t a t e
a n d [ 1 - 1 4 C ]s u c c i n a t e w e r e o b t a i n e d f r o m Vo l k Ra d i o -
c h e m i c a l C o . , C h i c a g o , Il l . P e n i c i l l i n G po t a s s i u m w a s a
pr o d u c t o f Le d e r l e La b o r a t o r i e s , Ne w Yo r k ; t h e d i h yd r o -
s t r e pt o m yc i n w a s pr o d u c e d b y P f i z e r a n d C o . , Ne w Yo r k .
T r i e t h yl t i n
a c e t a t e w a s k i n d l y s u ppl i e d b y D r K . E. M o o r e ,
U n i v e r s i t y o f M i c h i g a n , a n d b y t h e M e t a l a n d T h e r m i t e
C o r p. , Ne w Yo r k C i t y.
T h r e e t ype s o f t u m o u r t i s s u e s w e r e u s e d : Eh r l i c h m o u s e -
a s c i t e s - t u m o u r c e l l s , a n d Wa l k e r a n d LC - 1 8 c a r c i n o m a f r o m
a d u l t r a t s . T h e Wa l k e r c a r c i n o m a w a s o r i g i n a l l y a h u m a n
a d e n o c a r c i n o m a o f t h e a d r e n a l s a n d t h e LC - 1 8 c a r c i n o m a
w a s o r i g i n a l l y a h u m a n h e pa t o m a . B o t h h a d u n d e r g o n e
r e pe a t e d t r a n s f e r s i n F i s h e r s t r a i n w h i t e r a t s a n d w e r e
i m pl a n t e d a n d g r o w n s u b c u t a n e o u s l y. T h e n o r m a l t i s s u e s
u s e d f o r c o m pa r i s o n w e r e m u s c l e , l i v e r a n d i s o l a t e d l i v e r
c e l l s f r o m F i s h e r s t r a i n a d u l t r a t s a n d n u c l e a t e d e r yt h r o -
c yt e s f r o m P l ym o u t h Ro c k c h i c k e n s .
P r o c e d d u r e
T w e n t y pe r c e n t h o m o g e n a t e s o f po o l e d t u m o u r a n d
n o n - t u m o u r t i s s u e s f r o m 8 - 1 0 r a t s w e r e pr e pa r e d a t 5 0 i n
5 0 m l . o f K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e b u f f e r ( pH 7 - 4 ) w i t h t h e
u s e o f a P o t t e r - El v e h j e m g l a s s h o m o g e n i z e r . T o t h e
h o m o g e n a t e s w e r e a d d e d t h e f o l l o w i n g s u b s t a n c e s , t o -
g e t h e r w i t h t h e v a r i o u s s u b s t r a t e s u s e d , d i s s o l v e d i n 5 m l .
o f K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e : L- m a l i c a c i d , 0 0 5 m g . ; A T P ,
8 - 0 m g . ; D P N, 2 - 0 m g . ; m o n o f l u o r o a c e t i c a c i d ( w h e r e
u s e d ) , 0 - 5 m g . ; s o d i u m m a l o n a t e ( w h e r e u s e d ) , 7 5 - 0 m g . ;
pe n i c i l l i n , 1 - 2 m g . ; s t r e pt o m yc i n , 2 - 4 m g . S o d i u m
f l u o r i d e ( 0 - 0 1 m f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) w a s a d d e d t o t h e
K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e u s e d i n h o m o g e n i z a t i o n i n o r d e r
t o pr e v e n t l o s s o f A T P a n d D P N b y a d e n o s i n e t r i ph o s -
ph a t a s e a n d d i ph o s ph o pyr i d i n e n u c l e o t i d a s e ( NA D n u -
c l e o s i d a s e ) r e s pe c t i v e l y. In a n a d d i t i o n a l s e r i e s o f e x pe r i -
m e n t s t r i e t h yl t i n a c e t a t e , a r e c e n t l y i n t r o d u c e d po w e r f u l
a n d c o m pl e t e a d e n o s i n e - t r i ph o s ph a t a s e i n h i b i t o r ( D r K . E.
M o o r e , pe r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , w a s a d d e d t o t h e f l u i d
m i x t u r e u s e d i n t h e h o m o g e n i z a t i o n o f t i s s u e s i n t h e r e c o m -
m e n d e d f i n a l c o n c e n t r a t i o n ( 1
pm ) .
T h e s u ppl e m e n t a r y
D P N, A T P , a s w e l l a s t r i e t h yl t i n a c e t a t e , w e r e a d d e d a s a
f u r t h e r pr e c a u t i o n a r y m e a s u r e b e c a u s e t h e r e i s s o m e
e v i d e n c e t h a t h o m o g e n i z e d t i s s u e s , pa r t i c u l a r l y c e r t a i n
t u m o u r s , e x h i b i t i n c r e a s e d a c t i v i t y o f a d e n o s i n e t r i ph o s -
ph a t a s e a n d pr o b a b l y d i ph o s ph o pyr i d i n e n u c l e o t i d a s e .
T h e a m o u n t s o f t h e s u b s t r a t e s u s e d a r e g i v e n a s s u b h e a d -
i n g s t o t h e a ppr o pr i a t e T a b l e s . T h e a d d i t i o n o f t h e s e
s u b s t r a t e s t o t h e t i s s u e pr e pa r a t i o n s f o l l o w e d t h e pr o -
c e d u r e d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( D a j a n i & Or t e n , 1 9 5 8 ) . T h e
m i x t u r e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 - 3 8 0 i n 0 2 + C O2 ( 9 5 : 5 )
f o r 3 0 m i n . a n d 1 , 4 , 1 8 o r 2 4 h r . , w i t h c o n s t a n t g e n t l e
s h a k i n g ( 2 5 0 o s c i l l a t i o n s / m i n . ) . S i n c e i n c u b a t i o n f o r t h e
s h o r t e r i n t e r v a l s d i d n o t r e s u l t i n a n a c c u m u l a t i o n o f t h e
c yc l e a c i d s t o s i g n i f i c a n t l y m e a s u r a b l e q u a n t i t i e s i n t h e
pr e s e n c e o f i n h i b i t o r s , t h e 4 h r . t i m e i n t e r v a l w a s c h o s e n
f o r i n c u b a t i o n i n a l l s u b s e q u e n t e x pe r i m e n t s . A l t h o u g h a
l o n g e r pe r i o d , 1 8 h r . , g a v e h i g h e r v a l u e s , t h e pi c t u r e o b -
t a i n e d w a s s i m i l a r a n d t h e s h o r t e r pe r i o d w a s a d o pt e d . In
a l l o f t h e s e t r i a l s t u d i e s e x c e s s o f s u b s t r a t e w a s a l w a ys
d e t e c t e d a t t h e e n d o f t h e e x pe r i m e n t . H o w e v e r , a f t e r
i n c u b a t i o n f o r 2 4 h r . n o s u b s t r a t e r e m a i n e d , a n d t h e l e v e l s
o f t h e c yc l e a c i d s w e r e d i m i n i s h e d . It s h o u l d b e e m ph a s i z e d
a t t h i s po i n t t h a t a l l t h e e x pe r i m e n t a l c o n d i t i o n s a d o pt e d
w e r e a l s o f o u n d t o s u ppo r t v i g o r o u s K r e b s - c yc l e a c t i v i t y i n
n u c l e a t e d e r yt h r o c yt e s ( D a j a n i & Or t e n , 1 9 5 8 ) . A s a
f u r t h e r c h e c k , t h e pH o f t h e m i x t u r e s w a s d e t e r m i n e d a t
t h e e n d o f t h e 4 h r . pe r i o d . No s i g n i f i c a n t c h a n g e h a d
o c c u r r e d . A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n pe r i o d , t h e e n z ym i c
r e a c t i o n s w e r e s t o ppe d b y f r e e z i n g , a n d t h e e x t r a c t i o n a n d
d e t e r m i n a t i o n o f t h e c i t r i c a c i d - c yc l e a c i d s a n d t h e i r 1 4 C -
a c t i v i t i e s f o l l o w e d t h e pr o c e d u r e t h a t h a s a l r e a d y b e e n
r e po r t e d ( D a j a n i & Or t e n , 1 9 5 8 ) . T h e c i t r i c a c i d - c yc l e a c i d s
w e r e e x t r a c t e d w i t h a c i d - a c e t o n e a n d t h e a m o u n t s a n d
1 4 C - a c t i v i t i e s o f t h e i n d i v i d u a l c yc l e a c i d s w e r e q u a n t i -
t a t i v e l y d e t e r m i n e d a f t e r s e pa r a t i o n b y s i l i c a - g e l - c o l u m n
c h r o m a t o g r a ph y b y a pr o c e d u r e d e v e l o pe d i n t h i s La b o r a -
t o r y a n d d e s c r i b e d i n d e t a i l b y D a j a n i & Or t e n ( 1 9 5 8 ) .
Es s e n t i a l l y t h e pr o c e d u r e i n v o l v e d t h e d i f f e r e n t i a l e l u t i o n
o f t h e c yc l e a c i d s f r o m t h e s i l i c a - g e l c o l u m n b y a u t o m a t i c -
a l l y i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t e r t . - a m yl a l c o h o l i n
c h l o r o f o r m . T h e e l u t e d a c i d s w e r e c o l l e c t e d i n a n a u t o -
m a t i c f r a c t i o n c o l l e c t o r a n d t h e n t i t r a t e d w i t h s t a n d a r d
s o d i u m h yd r o x i d e b y u s i n g a Re h b u r g m i c r o b u r e t t e . T h e
t i t r a t e d f r a c t i o n s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o pl a n c h e t s ,
e v a po r a t e d t o d r yn e s s a n d t h e 1 4 C - a c t i v i t i e s d e t e r m i n e d i n
a g a s - f l o w c o u n t e r . T h e f l o w o f e f f l u e n t t h r o u g h t h e c h r o -
m a t o g r a ph i c c o l u m n w a s s l o w e d b y t h e e x c e s s i v e a m o u n t s
o f l i pi d i n t h e e x t r a c t s o f t u m o u r t i s s u e , r e s u l t i n g i n a
po o r s e pa r a t i o n o f t h e c yc l e a c i d s , s o t h e pr o c e d u r e w a s
m o d i f i e d t o r e m o v e l i pi d . F o r t h i s pu r po s e , t h e a q u e o u s
c o n c e n t r a t e o f t h e a c i d - a c e t o n e e x t r a c t w a s s h a k e n i n a
s e pa r a t i n g f u n n e l w i t h e t h e r ( 1 0 m l . ) . A f t e r 1 5 m i n . , t h e
e t h e r l a ye r w a s t r a n s f e r r e d t o a l u m i n u m pl a n c h e t s a n d
e v a po r a t e d t o d r yn e s s , a n d t h e r a d i o a c t i v i t y w a s d e t e r -
m i n e d . T h e a q u e o u s l a ye r w a s u s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e
c yc l e a c i d s ( D a j a n i & Or t e n , 1 9 5 8 ) . No s i g n i f i c a n t l o s s o f
c yc l e a c i d s b y t h i s t r e a t m e n t w a s f o u n d i n r e c o v e r y s t u d i e s .
P r e pa r a t i o n o f c e l l 8 u s pe n 8 i o 0 n . Eh r l i c h m o u s e - a s c i t e s -
c a r c i n o m a f l u i d c o n t a i n i n g t h e t u m o u r c e l l s w a s a s pi r a t e d
f r o m t h e pe r i t o n e a l c a v i t y o f 2 0 - 2 5 e t h e r - a n a e s t h e t i z e d
m i c e . T h e f l u i d w a s po o l e d a n d t h e f r e e c e l l s w e r e o b t a i n e d
b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g i n g a t 2 0 0 g f o r 5 m i n . a n d t h e n a t
3 0 0 0 g f o r 1 5 m i n . T h e c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h K r e b s -
Ri n g e r ph o s ph a t e a n d s u s pe n d e d i n 5 0 m l . o f K r e b s -
Ri n g e r ph o s ph a t e ( pH 7 - 4 ) , o r K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e
c o n t a i n i n g 2 0 % o f c l e a r a s c i t e s f l u i d , t o m a k e a 2 0 % c e U
s u s pe n s i o n . H e pa t i c c e l l s f r o m n o r m a l r a t s w e r e i s o l a t e d
b y t h e pr o c e d u r e o f B r a n s t e r & M o r t o n ( 1 9 5 7 ) . Nu c l e a t e d
e r yt h r o c yt e s w e r e pr e pa r e d a s d e s c r i b e d b y D a j a n i &
Or t e n ( 1 9 5 8 ) . T h e s e c e l l s w e r e s u s pe n d e d i n 5 0 m l . o f
K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e , t o g i v e a 2 0 % s u s pe n s i o n . T h e
r e s t o f t h e pr o c e d u r e w a s t h e s a m e a s t h a t g i v e n a b o v e .
Vo l . 8 1 4 9 5 -
R. M . D A J A NI, J . D A NIELS K I, W. GA M B LE A ND J . M . ORT EN
RES U LT S
Ex pe r i m e n t s r e pr e s e n t e d i n T a b l e s 1 a n d 2 o n
n o r m a l a n d t u m o u r t i s s u e s pe r m i t a c o m pa r i s o n o f
t h e u t i l i z a t i o n o f [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e b y w a y o f t h e
K r e b s c yc l e i n t h e s e t i s s u e s . T h e a m o u n t s o f a c i d s
l i s t e d i n t h e s e a n d s u b s e q u e n t T a b l e s a r e i n c r e a s e s
o v e r c o n t r o l s ( n o s u b s t r a t e a d d e d ) . It i s e v i d e n t
t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n s a n d 1 4 C - a c t i v i t i e s o f t h e
c i t r i c a c i d - c yc l e i n t e r m e d i a t e s a r e l o w e r i n t h e
t u m o u r t i s s u e s t h a n i n n o r m a l l i v e r o r m u s c l e .
A l s o , t h e r e i s m o r e i n c o r po r a t i o n o f 1 4 C i n t o t h e
c yc l e a c i d s i n LC - 1 8 c a r c i n o m a t i s s u e t h a n i n
Wa l k e r c a r c i n o m a .
In t h e s t u d i e s r e pr e s e n t e d i n T a b l e s 1 a n d 2 , i t
m a y b e r e c a l l e d t h a t f l u o r i d e w a s a d d e d t o t h e
h o m o g e n a t e s o f t h e t i s s u e s t o i n h i b i t a d e n o s i n e
t r i ph o s ph a t a s e a n d d i ph o s ph o pyr i d i n e n u c l e o t i d -
a s e . S i n c e i t a ppe a r s po s s i b l e t h a t f l u o r i d e m a y
n o t h a v e c o m pl e t e l y i n h i b i t e d t h e s e ph o s ph a t a s e s
w h e n pr e s e n t a t t h e e l e v a t e d l e v e l s c l a i m e d i n
t u m o u r t i s s u e s , t r i e t h yl t i n a c e t a t e w a s e m pl o ye d
a s a n a d e n o s i n e - t r i ph o s ph a t a s e i n h i b i t o r i n pl a c e o f
f l u o r i d e . T h e r e s u l t s , g i v e n i n T a b l e 3 , c o n f i r m
t h o s e f o u n d w h e n f l u o r i d e w a s u s e d a n d t h u s i n d i -
c a t e t h a t t h e l o w e r a c t i v i t y o f t h e c yc l e , i n LC - 1 8
t u m o u r t i s s u e s a t l e a s t , i s n o t d u e t o a l o s s o r
d e s t r u c t i o n o f A T P .
T a b l e 1 . A v e r a g e c o n c e n t r a t i o n s ( , u m o l e 8 / 1 0 0 g . ) o f K r e b 8 - c yc l e a c i d 8 i n t i s 8 u e 8 i n c u b a t e d w i t h [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t h r e e e x pe r i m e n t s : a v e r a g e d e v i a t i o n s , w i t h
d i f f e r e n t b a t c h e s o f po o l e d t i s s u e s . T h e s u b s t r a t e c o n t a i n e d : 0 - 4 5 m g . o f [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e ( 4 - 1 1 m c / m - m o l e ) ;
4 0 m g . o f s o d i u m a c e t a t e t r i h yd r a t e . T h e s e w e r e d i s s o l v e d i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e , w h i c h c o n t a i n e d i n e a c h
5 0 m l . o f K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e b u f f e r ( pH 7 . 4 ) : L- m a l i c a c i d , 0 0 5 m g . ; A T P , 8 - 0 m g . ; D P N, 2 - 0 m g . ; Na F ,
2 1 - 0 m g . ; pe n i c i l l i n , 2 m g . ; d i h yd r o s t r e pt o m yc i n , 4 m g . ; m o n o f l u o r o a c e t i c a c i d ( w h e r e u s e d ) , 0 5 m g . No s u b -
s t r a t e w a s a d d e d t o t h e c o n t r o l s .
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a a s )
i s o C i t r i c
o - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n 8 )
i 8 o C i t r i c
m - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
A c e t a t e +
C o n t r o l A c e t a t e f l u o r o a c e t a t e
2
1
1
3
7
El
3
I
Li v e r
3 - 0 0 - 0 6
0 - 6 0 - 0 2
0 6 0 - 0 1
3 - 8 0 - 0 8
4 - 4 0 * 0 7
3 - 8 0 - 0 5
3 - 5 0 - 0 6
1 - 0 0 - 0 2
2 - 0 0 - 0 2
0 - 9 0 - 0 1
0 - 8 0 - 0 1
2 - 2 0 - 0 2
3 - 8 0 - 0 6
3 - 6 0 - 0 5
3 - 3 0 0 3
6 - 2 0 t 0 7
Wa l k e r c a r c i n o m a
1 0 - 7 0 - 0 2 1 - 5 0 - 0 3
3 0 . 5 0 . 0 4 0 * 9 0 - 0 2
3 0 5 0 t 0 3 0 - 9 0 - 0 1
3 5 + 0 - 0 6 1 - 4 0 - 0 6
1
1 * 4 0 - 0 4 1 - 0 0 - 0 4
4 1 . 4 0 - 0 3 1 - 0 0 - 0 3
3 1 . 4 0 . 0 2 0 * 9 0 * 0 4
2 1 - 3 0 - 0 2 2 - 9 0 - 0 6
1 . 1 0 - 0
0 4 0 * 0
0 . 5 0 . 0
1 - 3 0 - 0 : -
1 7 0 0 0
1 . 5 0 . 0 i
1 - 3 0 - 0 '
0 - 2 0 - 0 1
0 1 5 0 - 0 1
0 - 2 0 - 0
0 - 2 0 - 0 '
0 - 3 0 0
0 3 0 0 0
0 - 4 0 - 0 1
C o n t r o l A c e t a t e
M u s c l e
1 0 0 0 1 3 3 0 0 3
0 - 3 0 * 0 1 0 - 5 0 - 0 1
0 - 4 0 - 0 2 0 7 0 - 0 2
0 - 9 0 - 0 1 2 * 4 0 : 0 6
1 - 5 0 - 0 3 4 - 2 0 - 0 7
1 - 4 0 - 0 2 3 9 0 0 5
1 - 3 0 - 0 4 3 - 6 + 0 - 0 5
0 - 3 0 - 0 1 0 - 8 0 - 0 2
LC - 1 8 c a r c i n o m a
0 - 5 0 0 7 0 - 6 0 - 0 3
0 - 3 0 - 0 2 0 5 0 0 4
0 - 3 0 0 4 0 - 6 0 - 0 2
0 - 3 0 - 0 3 1 - 7 0 - 0 3
0 6 0 - 0 2 2 - 1 0 - 0 5
1 - 5 0 - 0 6 2 - 4 0 - 0 5
0 - 4 0 : 0 4 1 . 2 0 - 0 4
0 3 0 * 0 3 1 - 3 0 - 0 3
A c e t a t e +
f l u o r o a c e t a t e
4 - 6 0 - 0 8
0 - 8 0 - 0 2
0 - 8 0 - 0 1
2 - 1 0 - 0 2
3 - 9 0 * 0 6
3 - 7 0 - 0 8
3 5 0 - 0 7
5 9 0 - 0 5
1 - 7 0 - 0 6
1 - 1 0 0 3
1 * 1 0 . 0 1
1 - 5 0 - 0 3
1 - 8 0 - 0 8
1 - 9 0 0 7
1 - 2 0 - 0 4
3 - 8 0 - 0 8
T a b l e 2 . A v e r a g e 1 4 C c o u n t s ( 1 0 - 3 x c o u n t / m i n . / 1 0 0 g . ) o f K r e b 8 - c yc l e a c i d s
i n t i s s u e s i n c u b a t e d w i t h [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e
Va l u e s a r e a v e r a g e s o f t h r e e e x pe r i m e n t s , w i t h d i f f e r e n t b a t c h e s o f
po o l e d t i s s u e s . T h e s u b s t r a t e a n d c o m -
po s i t i o n o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n T a b l e 1 .
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n s )
i 8 o C i t r i c
o - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
Li v e r
. ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
A c e t a t e +
f l u o r o -
A c e t a t e a c e t a t e
1 1 0 0 1 0 5 - 0
3 0 0 3 1 - 0
3 8 - 0 3 2 - 0
9 5 - 0 6 1 x 0
1 2 5 - 0 9 6 - 0
1 0 4 - 0 1 0 0 . 0
9 2 - 0 8 7 - 0
2 7 - 0 2 9 7 0
M u s c l e
A c e t a t e +
f l u o r o -
A c e t a t e a c e t a t e
1 2 5 x 0 2 0 3 x 0
3 8 x 0 3 0 - 0
3 6 - 0 3 4 - 0
6 8 - 0 5 9 . 0
1 2 2 - 0 1 1 5 - 0
1 1 3 - 0 1 1 0 0
1 0 9 . 0 1 0 7 - 0
2 2 - 0 1 6 8 - 0
Wa l k e r c a r c i n o m a
A c e t a t e +
f l u o r o -
A c e t a t e a c e t a t e
7 - 4 8 - 7
3 - 2 2 - 7
3 - 2 2 - 6
4 - 3 4 - 0
2 - 2 2 - 1
2 - 1 2 - 0
2 - 0 1 . 8
4 - 5 8 - 4
LC - 1 8 c a r c i n o m a
A c e t a t e +
f l u o r o -
A c e t a t e a c e t a t e
7 . 9 9 . 5
3 - 4 2 - 8
3 - 3 2 - 7
4 - 8 4 - 2
2 - 9 2 - 4
3 - 2 2 - 5
3 - 6 2 - 0
4 - 6 1 2 - 0
4 9 6 1 9 6 1
8 1 K REB S C YC LE IN T U M OU R T IS S U E
T a b l e 3 . A v e r a g e c o n c e n t r a t i o n a n d l 4 C _ a C t i v i t y o f K r e b 8 - c yc l e a c i d s i n t i s s u e h o m o g e n a t e s i n c u b a t e d
w i t h [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e i n t h e pr e s e n c e o f t r i e t h yl t i n a c e t a t e
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t w o e x pe r i m e n t s w i t h d i f f e r e n t b a t c h e s o f po o l e d
t i s s u e s . T h e c o m po s i t i o n s o f t h e s u b s t r a t e a n d i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n T a b l e 1 , w i t h t h e e x c e pt i o n t h a t
t r i e t h yl t i n a c e t a t e a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 u M r e pl a c e d Na F a s a n a d e n o s i n e - t r i ph o s ph a t a s e i n h i b i t o r .
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n s )
i s o C i t r i c
o x - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
Li v e r
( 1 0 - 3 x C o u n t s /
( , u m o l e s / 1 0 0 g . ) m i . / 1 0 0 g . )
3 - 2 0 - 0 2 1 1 2 - 0
0 - 7 0 - 0 2 3 3 - 0
0 - 6 0 - 0 3 3 5 - 0
4 - 1 0 - 0 5 1 0 0 - 0
4 - 3 + 0 - 0 2 1 2 2 - 0
4 - 0 + 0 - 0 6 1 0 8 - 0
3 - 6 0 - 0 5 9 4 - 0
1 - 2 0 - 0 3 3 0 - 0
LC - 1 8 c a r c i n o m a
( j u m o l e s / 1 0 0 g . )
0 - 7 0 - 0 2
0 - 4 0 - 0 3
0 - 5 0 - 0 3
1 - 8 0 - 0 4
2 - 0 0 - 0 5
2 - 3 0 - 0 4
1 - 3 0 - 0 7
1 - 4 0 - 0 3
( 1 0 - ' x C o u n t s /
m i n . / 1 0 0 g . )
8 - 1
3 - 1
3 - 3
4 - 0
3 - 0
3 - 3
3 - 8
4 - 9
T a b l e 4 . C yc l e a c i d s i n a s c i t e s - t u m o u r c e l 1 s i n c u b a t e d w i t h [ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e + 2 0 % o f a s c i t e s f l u i d
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t h r e e e x pe r i m e n t s , a v e r a g e d e v i a t i o n s , w i t h
d i f f e r e n t b a t c h e s o f po o l e d t i s s u e s . T h e c o m po s i t i o n s o f t h e s u b s t r a t e a n d t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n
T a b l e 1 . Wh e r e u s e d , 7 5 - 0 m g . o f s o d i u m m a l o n a t e w a s a d d e d t o t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . No s u b s t r a t e w a s
a d d e d t o t h e c o n t r o l s . B l a n k v a l u e s i n d i c a t e a m o u n t s t o o s m a l l t o b e m e a s u r e d a c c u r a t e l y.
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n s )
i s o C i t r i c
a o - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
j A m o l e s / 1 0 0
g . o f pa c k e d c e l l s
F l u o r o -
a c e t a t e
C o n t r o l A c e t a t e a d d e d
- 1 - 5 0 - 0 3 2 - 3 0 - 0 5
0 - 9 0 - 0 3
0 - 7 0 - 0 2
1 - 3 0 - 0 2
2 - 0 0 - 0 4
1 - 9 0 - 0 5
1 - 6 0 - 0 4
2 - 7 0 - 0 6
1 - 0 0 - 0 3
1 - 8 0 - 0 5
1 - 8 0 - 0 7
1 - 5 0 - 0 3
3 - 3 0 - 0 7
M a l o n a t e
a d d e d
2 - 1 0 - 0 6
1 - 2 0 - 0 2
2 - 4 0 - 0 3
1 - 1 0 - 0 1
1 - 5 0 - 0 5
2 - 4 0 - 0 8
1 0 - 8 C o u n t s / m i n . / 1 0 0 g .
o f pa c k e d c e l l s
, ~~ A
F l u o r o -
a c e t a t e M a l o n a t e
A c e t a t e a d d e d a d d e d
4 - 3 6 - 4 6 - 0
1 - 4 1 - 3 1 - 6
1 - 4 1 - 2 1 - 6
3 - 3 2 - 9 3 . 4
5 - 4 5 - 3 6 - 9
5 - 1 4 - 9 4 . 3
4 - 2 3 * 9 3 * 9
7 - 5 9 * 4 6 - 9
T h e a m o u n t s o f l a c t i c a c i d a n d pyr u v i c a c i d i n
t h e d i f f e r e n t t i s s u e s w e r e a l s o d e t e r m i n e d t o g e t h e r
w i t h t h e c yc l e a c i d s i n a l l e x pe r i m e n t s . T h e c o n c e n -
t r a t i o n s o f t h e s e t w o a c i d s w e r e i n v a r i a b l y g r e a t e r
i n a l l t u m o u r t i s s u e s s t u d i e d t h a n i n t h e n o r m a l
t i s s u e s . T h i s o b s e r v a t i o n i s i n a g r e e m e n t w i t h t h a t
o f o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( Ol s e n , 1 9 5 1 ; H e i d e l b e r g e r ,
1 9 5 3 ; Wa r b u r g , 1 9 5 6 ; We i n h o u s e e t a l . 1 9 5 6 ) .
B e c a u s e t h e Wa l k e r a n d LC - 1 8 t u m o u r s a r e a
c o m po s i t e t i s s u e a n d h a v e a v a r yi n g c a n c e r - c e l l
c o n t e n t , t h e i r u s e c o u l d , u n d o u b t e d l y, l e a d t o u n -
c e r t a i n t y i n i n t e r pr e t a t i o n . It w a s t h o u g h t a d -
v i s a b l e , t h e r e f o r e , t o c a r r y o u t f u r t h e r e x pe r i m e n t s
o n Eh r l i c h m o u s e - a s c i t e s - t u m o u r c e l l s , w h i c h a r e a
n e a r l y pu r e c u l t u r e o f i n t a c t c a n c e r c e l l s . M o r e -
o v e r , t h e u t i l i z a t i o n o f u n r u pt u r e d a s c i t e s c e l l s
m i n i m i z e s t h e u n c e r t a i n t y o f A T P l o s s r e s u l t i n g
f r o m h o m o g e n i z a t i o n . A t f i r s t , s u s pe n s i o n s o f t h e s e
c e l l s i n K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e a l o n e w e r e u s e d .
T h e r e s u l t s o f t h r e e e x pe r i m e n t s o n d i f f e r e n t pr e -
pa r a t i o n s o f a s c i t e s c e l l s i n d i c a t e d t h a t a c e t a t e
w a s i n c o r po r a t e d i n t o t h e v a r i o u s c i t r i c a c i d - c yc l e
3 2
a c i d s t o a l e s s e r d e g r e e t h a n t h a t i n t h e n o r m a l
t i s s u e s . M o s t o f t h e s u b s t r a t e a ppe a r e d t o h a v e
b e e n d i v e r t e d m a i n l y t o t h e f o r m a t i o n o f a c e t o -
a c e t a t e a n d f a t t y a c i d s . In d e e d , a g r e a t e r po r t i o n
o f t h e 1 4 C - a c t i v i t y r e s i d e d i n t h e e t h e r e x t r a c t
m e n t i o n e d a b o v e . In f u r t h e r e x pe r i m e n t s , i n
o r d e r t o pr o v i d e m o r e n e a r l y ph ys i o l o g i c a l c o n d i -
t i o n s f o r i n c u b a t i o n , 2 0 % o f a s c i t e s f l u i d w a s i n -
c o r po r a t e d i n t o t h e i n c u b a t i o n m e d i u m , r e pl a c i n g a n
e q u i v a l e n t a m o u n t o f K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e .
T h e u s e o f a s c i t e s f l u i d i n t h e i n c u b a t i o n m e d i u m
h a s b e e n f o u n d a d v a n t a g e o u s b y o t h e r s ( K u n ,
T a l a l a y & Wi l l i a m s - A s h m a n , 1 9 5 1 ; Wa r b u r g ,
1 9 5 6 ) . In d e e d , i n t h e pr e s e n t s t u d y, t h e i n c l u s i o n
o f a s c i t e s f l u i d i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e e m pl o ye d
i n t h i s a n d t h e s u b s e q u e n t e x pe r i m e n t s i n c r e a s e d
t h e c o n c e n t r a t i o n s a n d a c t i v i t i e s o f t h e c i t r i c a c i d -
c yc l e a c i d s o v e r t h o s e o b t a i n e d w i t h K r e b s - Ri n g e r
ph o s ph a t e a l o n e . A s i s e v i d e n t f r o m t h e d a t a
pr e s e n t e d i n T a b l e 4 , h o w e v e r , t h e a c t i v i t y o f t h e
c yc l e i s l e s s t h a n t h a t o f t h e n o r m a l t i s s u e s s t u d i e d
( T a b l e s 1 a n d 2 ) .
B i o c h . 1 9 6 1 , 8 1
Vo l . 8 1 4 9 7
R. M . D A J A NI, J . D A NIELS K I, W. GA M : B LE A ND J . M . ORT EN
S i n c e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f D P N h a v e b e e n r e -
po r t e d t o i n c r e a s e t h e o x yg e n u pt a k e o f h e pa t o m a
a n d l i v e r m i t o c h o n d r i a ( We n n e r & We i n h o u s e ,
1 9 5 2 ) , t h e e f f e c t o f t h e t w o c o n c e n t r a t i o n s o f
t h i s c o f a c t o r ( 2 o r 5 m g . ) o n t h e u t i l i z a t i o n o f
a c e t a t e b y t h e a s c i t e s - t u m o u r c e l l s w a s s t u d i e d . In
s pi t e o f t h e f a c t t h a t t h e a d d i t i o n o f D P N d i d n o t
s e e m t o r a i s e t h e c o n c e n t r a t i o n s a n d a c t i v i t i e s o f
t h e K r e b s - c yc l e i n t e r m e d i a t e s t o a n y a ppr e c i a b l e
e x t e n t , i t s i n c l u s i o n i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e , a s
s t a t e d e a r l i e r , w a s c o n t i n u e d s i m pl y a s a pr e -
c a u t i o n a r y m e a s u r e .
In a d d i t i o n t o t h e e f f e c t o f f l u o r o a c e t a t e u po n
t h e a c t i v i t y o f t h e K r e b s c yc l e , m a l o n a t e , a s pe c i f i c
i n h i b i t o r o f s u c c i n i c d e h yd r o g e n a s e ( P a r d e e &
P o t t e r , 1 9 4 9 ) , w a s a l s o s t u d i e d . It s u s e a s a b l o c k i n g
a g e n t s h o u l d r e s u l t i n t h e a c c u m u l a t i o n o f s u c c i n a t e .
T h e r e s u l t s i n T a b l e 4 s h o w t h a t , a l t h o u g h t h e r e
w a s a n a c c u m u l a t i o n o f s u c c i n a t e , t h i s w a s s m a l l .
A s w i t h f l u o r o a c e t a t e i n h i b i t i o n , t h i s o b s e r v a t i o n
po i n t s t o a r e d u c e d a c t i v i t y o f t h e c yc l e i n t h e s e
c e l l s . T h i s i s n o t i n c o m pl e t e d i s a g r e e m e n t w i t h t h e
e x pe r i m e n t s i n v i v o o f o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( B u s c h &
P o t t e r , 1 9 5 2 ) , w h o d e m o n s t r a t e d t h a t s e v e r a l
t i s s u e s , i n c l u d i n g f i v e t u m o u r s , a c c u m u l a t e d
s u c c i n a t e i n t h e pr e s e n c e o f m a l o n a t e . T h e i r d a t a
w e r e i n t e r pr e t e d t o m e a n o n l y t h a t t h e K r e b s
c yc l e i s f u n c t i o n i n g i n t h e s e t i s s u e s , a n d d o n o t
po i n t t o t h e e x t e n t o f t h e c yc l e a c t i v i t y. D e s pi t e
t h i s f i n d i n g , h o w e v e r , t h e s e a u t h o r s c a u t i o n e d
a g a i n s t d r a w i n g d e f i n i t e c o n c l u s i o n s b a s e d o n t h e i r
d a t a a l o n e , s i n c e s u c c i n a t e m a y h a v e a r i s e n f r o m
s o u r c e s o t h e r t h a n t h e c i t r i c a c i d - c yc l e i n t e r -
m e d i a t e s , e . g . g l u t a m i c a c i d .
T h e r e s u l t s g i v e n t h u s f a r s t r e n g t h e n t h e t h e s i s
t h a t t h e c i t r i c a c i d c yc l e i s o pe r a t i n g a t a l o w e r
l e v e l i n t h e t u m o u r t i s s u e s s t u d i e d t h a n i n n o r m a l
t i s s u e s . T h i s c o u l d b e d u e t o a b l o c k ( s ) o f a n u n -
k n o w n n a t u r e e i t h e r w i t h i n o r o u t s i d e t h e c yc l e ,
h i n d e r i n g a c e t a t e f r o m e n t e r i n g i n t o t h e c yc l e . In
o r d e r t o o b t a i n f u r t h e r e v i d e n c e o n t h e f o r m e r
po i n t , t w o o f t h e i n t e r m e d i a t e s o f t h e c yc l e i t s e l f
w e r e e m pl o ye d a s s u b s t r a t e s , i n a d d i t i o n t o a c e t a t e .
In o n e s e r i e s , n o n - l a b e l l e d L- m a l i c a c i d m i x e d
w i t h l a b e l l e d a c e t a t e w a s i n c u b a t e d w i t h t h e
t u m o u r - c e l l s u s pe n s i o n . In a n o t h e r , r a d i o a c t i v e
s u c c i n a t e m i x e d w i t h n o n - l a b e l l e d a c e t a t e w a s u s e d .
T h e r e s u l t s o f t h e s e e x pe r i m e n t s a r e g i v e n i n
T a b l e s 5 a n d 6 r e s pe c t i v e l y. A g a i n , t h e d a t a
c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e s e t w o i n t e r m e d i a t e s
w e r e n o t u t i l i z e d b y t h e c yc l e e n z ym e s b e t t e r t h a n
w a s a c e t a t e a l o n e ( T a b l e 4 ) . T h i s w a s e x pe c t e d , a t
l e a s t w i t h r e s pe c t t o s u c c i n a t e , s i n c e t h e s u c c i n i c -
d e h yd r o g e n a s e a c t i v i t y i n t u m o u r t i s s u e i s b e l i e v e d
t o b e l o w ( S c h n e i d e r & P o t t e r , 1 9 4 3 ) . F u r t h e r , t h e
o c c u r r e n c e o f a w e a k e l e c t r o n - t r a n s po r t c h a i n
r e po r t e d b y S c h n e i d e r & P o t t e r ( 1 9 4 3 ) a n d o t h e r s
( Gr e e n s t e i n e t a l . 1 9 4 4 ) c o u l d a l s o b e a c o n t r i b u t i n g
f a c t o r . T h e u s e o f f l u o r o a c e t a t e a n d m a l o n a t e a s
i n h i b i t o r s , a l s o , d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h e c o n -
c e n t r a t i o n s o f c i t r a t e o r s u c c i n a t e r e s pe c t i v e l y.
T h i s f i n d i n g i s s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d a b o v e w h e n
a c e t a t e a l o n e w a s u s e d a s a s u b s t r a t e ( T a b l e 4 ) . If
t h e r e w e r e a n i m pa i r m e n t i n t h e pa t h w a y b e t w e e n
a c e t a t e a n d c i t r a t e , o n e o f t w o po s s i b i l i t i e s , o r
b o t h , c o u l d b e a c o n t r i b u t i n g f a c t o r ( s ) . Ei t h e r t h e
a c t i v a t i n g - e n z ym e s ys t e m o f a c e t a t e w h i c h b r i n g s
a b o u t t h e f o r m a t i o n o f a c e t yl - C o A o r t h e c o n -
d e n s i n g e n z ym e m i g h t n o t b e f u n c t i o n i n g n o r m a l l y.
Ot h e r s t u d i e s , h o w e v e r , a ppe a r t o r u l e o u t t h e
l a t t e r po s s i b i l i t y ( We n n e r e t a l . 1 9 5 2 ) . T h i s l e a v e s
t h e f o r m e r a s a po s s i b l e a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m .
On e c o u l d s pe c u l a t e , t h e r e f o r e , t h a t a c e t yl - C o A
m a y n o t h a v e b e e n b i o s yn t h e s i z e d i n s u f f i c i e n t
q u a n t i t i e s o r t h a t i t s pr o d u c t i o n w a s a t s u c h a
s l o w r a t e t h a t i t c o u l d n o t k e e p pa c e w i t h t h e
t u r n o v e r b y t h e c o n d e n s i n g e n z ym e . T o e x pl o r e
t h i s po i n t , t h e s ys t e m s o f t h e e x pe r i m e n t s t h a t
f o l l o w w e r e f o r t i f i e d w i t h 5 m g . o f C o A t o t e s t i t s
e f f e c t o n t h e u t i l i z a t i o n o f a c e t a t e o r s u c c i n a t e b y
T a b l e 5 . C yc l e a c i d s i n a 8 c i t e 8 - t u m o u r c e l Il i n c u b a t e d w i t h 8 u b s t r a t e c o n t a i n i n g 1 - 5 m g . o f L- m a l i c a c i d
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t h r e e e x pe r i m e n t s , a v e r a g e d e v i a t i o n s , w i t h
d i f f e r e n t pr e pa r a t i o n s o f a s c i t e s c e l l s . T h e c o m po s i t i o n s o f t h e s u b s t r a t e a n d i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n
T a b l e s 1 a n d 4 . B l a n k v a l u e s i n d i c a t e a m o u n t s t o o s m a l l t o b e m e a s u r e d a c c u r a t e l y.
i Lm o l e s / 1 0 0
g . o f pa c k e d c e l l s
1 0 - 3 x C o u n t s / m i n . / 1 0 0 g .
o f pa c k e d c e l l s
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n 8 )
i 8 o C i t r i c
a - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
A c e t a t e +
C o n t r o l m a l a t e
1 - 4 0 - 0 2
1 - 3 0 * 0 3
0 - 8 0 - 0 3 2 * 3 0 * 0 4
0 - 7 0 - 0 2 2 * 2 0 - 0 5
1 9 0 * 0 4
3 0 0 * 0 8
F l u o r o -
a c e t a t e
a d d e d
2 - 3 + 0 - 0 7
1 ' 2 0 - 0 8
2 X0 0 - 1
1 9 0 * 0 4
1 7 0 0 5
3 - 4 0 - 0 6
M a l o n a t e
a d d e d
2 - 3 0 - 0 7
1 - 5 0 - 0 4
2 - 5 0 - 0 8
1 * 7 0 - 0 9
2 - 0 0 * 0 6
3 . 3 0 - 0 6
F l u o r o -
A c e t a t e + a c e t a t e
m a l a t e a d d e d
M a l o n a t e
a d d e d
4 - 5 6 - 5 6 - 1
1 - 3 1 - 3 1 - 4
1 * 4 1 - 2 1 - 4
3 - 4 3 . 2 3 X3
5 - 3 5 . 3 6 . 3
5 * 0 4 . 9 4 - 4
4 . 5 4 - 1 4 - 1
7 - 8 9 . 7 6 - 9
4 9 8 1 9 6 1
K i REB S C YC LE IN T U M OU R T IS S U E
T a b l e 6 . C yc l e a c i d s i n a 8 c i t e s - t u m o u r c e U s 8 i n c u b a t e d w i t h [ 1 - 1 4 C ]&u c c i n i c a c i d
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t w o e x pe r i m e n t s , + a v e r a g e d e v i a t i o n s , w i t h
d i f f e r e n t pr e pa r a t i o n s o f a s c i t e s c e l l s . T h e s u b s t r a t e c o n t a i n e d : s u c c i n i c a c i d , 5 - 0 m g . ;
[ 1 - " 4 C ]s u c c i n i c a c i d ,
1 - 5 m g . ( a c t i v i t y 1 - 3 m c / m - m o l e ) ; s o d i u m a c e t a t e t r i h v d r a t e , 2 - 0 m g . ; i n 5 0 m l . o f K r e b s - Ri n g e r ph o s ph a t e .
T h e c o m po s i t i o n o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e i s g i v e n i n T a b l e 1 . B l a n k v a l u e s i n d i c a t e a m o u n t s t o o s m a l l t o b e
m e a s u r e d a c c u r a t e l y. T h e h i g h c o u n t s f o r s u c c i n i c a c i d a r e d u e pr i m a r i l y t o n o n - u t i l i z e d
[ 1 - 1 4 C j s u c c i n i c
a c i d .
, u m o l e s / 1 0 0 g . o f pa c k e d c e l l s
1 0 - 8 x C o u n t s / m i n . / 1 0 0 g
o f pa c k e d c e l l s
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i 8 + t r a n s )
i 8 0 C i t r l i c
a - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
C o n t r o l
0 - 9 4 0 - 0 2
0 - 8 0 - 0 2
S u c c i n a t e
1 - 3 0 - 0 3
0 - 8 0 - 0 1
2 0 - 8 0 - 0 8
1 - 7 0 - 0 4
1 - 6 0 - 0 7
1 - 1 0 - 0 3
S u c c i n a t e +
f l u o r o a c e t a t e
1 - 4 0 - 0 2
0 . 7 4 0 . 0 3
2 1 - 0 0 - 0 4
1 - 6 0 - 0 6
1 - 7 0 - 0 5
1 - 2 0 - 0 6
S u c c i n a t e
1 1 - 5
5 - 8
5 - 3
7 - 5
3 6 1 - 5
1 8 - 8
1 7 - 4
1 4 - 0
S u c c i n a t e +
f l u o r o a c e t a t e
1 2 - 0
4 - 7
4 - 0
7 - 8
3 9 5 - 0
1 8 - 0
1 6 - 8
1 4 - 5
T a b l e 7 . C yc l e a c i d s i n a 8 c i t e m - t u m o u r c e l l s i n c u b a t e d w i t h 8 u b 8 t r a t e c o n t a i n i n g a c e t yl - c o e n z ym e A
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e f r o m o n e e x pe r i m e n t . T h e c o m po s i t i o n s o f t h e s u b s t r a t e a n d
i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n T a b l e 1 , w i t h t h e e x c e pt i o n t h a t 2 . A m o l e s o f a c e t yl - C o A w e r e a d d e d . No s u b -
s t r a t e w a s a d d e d t o t h e c o n t r o l s . B l a n k v a l u e s i n d i c a t e a m o u n t s t o o s m a l l t o b e m e a s u r e d a c c u r a t e l y.
, u m o l e s / 1 0 0 g . o f pa c k e d c e l s
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i 8 + t r a n 8 )
i 8 o C i t r i c
a - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
C o n t r o l
0 - 9
0 - 7
A c e t a t e +
a c e t yl - C o A +
f l u o r o a c e t a t e
a d d e d
2 - 3
1 - 2
2 - 0
1 - 9
1 * 5
3 - 4
1 0 - 8 x C o u n t s /
m i n . / 1 0 0 g . o f
pa c k e d c e l l s .
A c e t a t e +
a c e t yl - C o A +
f l u o r o a c e t a t e
a d d e d
6 - 4
1 - 3
1 - 2
2 - 9
5 - 3
4 - 9
3 - 9
9 - 3
w a y o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e i n a s c i t e s c e l l s . If C o A
i s l a c k i n g o r n o t pr e s e n t i n a d e q u a t e a m o u n t s , i t s
a d d i t i o n t o t h e i n c u b a t i o n m e d i u m w o u l d b e
e x pe c t e d t o r a i s e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c yc l e
m e m b e r s , pr o v i d e d t h a t t h e o t h e r c o f a c t o r s a n d
t h e a c t i v a t i n g e n z ym e a r e n o t o n l y pr e s e n t b u t a r e
a l s o f u n c t i o n i n g n o r m a l l y. It i s a s s u m e d , o f c o u r s e ,
t h a t t h i s w o u l d b e t h e c a s e i f t h e c yc l e i t s e l f i s a l s o
o pe r a t i n g a t a n o r m a l l e v e l . Wh e n i t w a s f o u n d t h a t
C o A f a i l e d t o i n c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e
c yc l e a c i d s s i g n i f i c a n t l y u n d e r t h e e x pe r i m e n t a l
c o n d i t i o n s , a f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n w i t h pr e f o r m e d
a c e t yl - C o A w a s pu r s u e d ( T a b l e 7 ) i n a n e f f o r t t o
d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t t h e a c t i v a t i n g s ys t e m
i t s e l f m i g h t b e d e f e c t i v e . C o n t r a r y t o e x pe c t a t i o n ,
n o i n c r e a s e i n c i t r a t e i n t h e pr e s e n c e o f f l u o r o -
a c e t a t e w a s o b s e r v e d ( c f . T a b l e 4 ) , a f i n d i n g t h a t
c a n b e c o n s i d e r e d a s i n d i r e c t e v i d e n c e a g a i n s t a n
i m pa i r m e n t o f t h e a c e t a t e - a c t i v a t i n g s ys t e m . T h e
o n l y i n c r e a s e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s w a s i n t h e
o x a l o a c e t a t e - a c e t o a c e t a t e f r a c t i o n . T h i s o b s e r v a -
t i o n w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r .
T o a s s e s s s t i l l f u r t h e r t h e o pe r a t i o n o f t h e c i t r i c
a c i d c yc l e i n a s c i t e s - t u m o u r c e l l s , t h e a c t i v i t y o f t h e
c yc l e w a s c o m pa r e d u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s
w i t h t h a t i n i s o l a t e d l i v e r c e l l s a n d i n n u c l e a t e d
e r yt h r o c yt e s ( a l s o s u s pe n s i o n s o f i n t a c t c e l l s ) . T h e
d a t a ( T a b l e 8 ) s h o w t h a t t h e q u a n t i t i e s a n d a c t i v i -
t i e s o f t h e c yc l e m e m b e r s b i o s yn t h e s i z e d i n h e pa t i c
c e l l s a n d i n n u c l e a t e d e r yt h r o c yt e s a r e s e v e r a l t i m e s
g r e a t e r t h a n t h o s e f o u n d i n a s c i t e s - t u m o u r c e l l s .
P a r t i c u l a r l y s t r i k i n g i s t h e a c c u m u l a t i o n o f c i t r a t e
i n n u c l e a t e d e r yt h r o c yt e s w h e n f l u o r o a c e t a t e i s
a d d e d . Li k e w i s e , w h e n m a l o n a t e i s a d d e d t o
h e pa t i c c e l l s , t h e r e i s a m a r k e d a c c u m u l a t i o n o f
s u c c i n a t e .
3 2 - 2
Vo l . 8 1 4 9 9
R. M . D A J A NI, J . D A NIELS K I, W. GA M B LE A ND J . M . ORT EN
T a b l e 8 . C ( o m pa r i s o n o f c yc l e a c i d 8 i n a 8 c i t e 8 - t u m o u r c e l l e , i 8 o l a t e d h e pa t i c c e U l 8
a n d n u c l e a t e d e r yt h r o c yt e 8 i n c u b a t e d w i t h t h e s a m e 8 u b s t r a t e
Va l u e s a r e n e t s yn t h e s e s a b o v e c o n t r o l s a n d a r e a v e r a g e s o f t h r e e e x pe r i m e n t s , a v e r a g e d e v i a t i o n s , w i t h
d i f f e r e n t pr e pa r a t i o n s o f po o l e d c e l l s . T h e c o m po s i t i o n s o f t h e s u b s t r a t e a n d i n c u b a t i o n m i x t u r e a r e g i v e n i n
T a b l e s 1 a n d 4 . B l a n k v a l u e s i n d i c a t e a m o u n t s t o o s m a l l t o b e m e a s u r e d a c c u r a t e l y. T h e v a l u e s f o r n u c l e a t e d
e r yt h r o c yt e s a r e t a k e n f r o m D a j a n i & Or t e n ( 1 9 5 8 ) .
, u m o l e s / 1 0 0 g . o f pa c k e d c e l l s
A c i d
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i s + t r a n s )
i s o C i t r i c
o - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
C i t r i c
A c o n i t i c ( c i 8 + t r a n s )
i 8 o C i t r i c
m - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
C i t r i c
A c o n i t i c ( C i 8 + t r a n 1 s )
i 8 o C i t r i c
m - Ox o g l u t a r i c
S u c c i n i c
F u m a r i c
L- M a l i c
Ox a l o a c e t i c + a c e t o a c e t i c
A c e t a t e
1 - 5 0 - 0 3
1 - 3 0 - 0 2
2 - 0 0 t 0 4
1 - 9 0 . 0 5
1 - 6 0 - 0 4
2 - 7 0 - 0 6
3 - 0 0 - 0 2
0 - 7 0 * 0 1
0 - 8 + 0 - 0 2
4 - 2 0 - 0 4
4 - 3 0 - 0 3
3 - 8 0 - 0 6
3 - 3 0 - 0 6
1 - 2 0 - 0 2
2 8 - 5
1 - 6
1 - 6
1 6 - 0
4 9 . 7
5 1 - 0
3 9 . 5
2 8 - 0
F l u o r o a c e t a t e M a l o n a t e
a d d e d a d d e d
A s c i t e s c e l l s
2 * 3 0 - 0 5 2 - 1 + 0 * 0 6
1 - 0 0 - 0 3 1 - 2 0 - 0 2
1 - 8 0 - 0 5 2 - 4 0 - 0 3
1 * 8 0 * 0 7 1 . 1 0 . 0 1
1 - 5 0 - 0 3 1 - 5 0 - 0 5
3 - 3 0 - 0 7 2 - 4 0 * 0 8
Is o l a t e d h e pa t i c c e l l s
1 * 9 0 - 0 3 1 - 9 0 - 0 5
0 - 6 0 - 0 4 0 - 6 0 - 0 4
0 - 5 0 * 0 2 0 - 5 0 - 0 2
2 - 6 4 0 - 0 3 4 - 5 0 - 0 5
3 9 0 0 5 6 - 7 0 - 0 6
3 - 6 0 - 0 6 2 - 1 0 - 0 3
3 * 2 0 - 0 4 2 - 2 0 - 0 4
5 - 8 0 - 0 5 3 5 0 0 7
Nu c l e a t e d
e r yt h r o c yt e s
4 9 . 5
1 * 1
1 * 1
3 - 6
4 8 * 5
4 9 . 5
3 9 * 0
1 3 5 - 0
1 0 3 x c o u n t s / m i n . / 1 0 0 g . o f pa c k e d c e l l s
A
I
F l u o r o a c e t a t e M a l o n a t e
A c e t a t e a d d e d a d d e d
4 - 3
1 - 4
1 - 4
3 . 3
5 - 4
5 . 1
4 - 2
7 . 5
1 1 3 - 0
3 0 * 5
3 8 - 0
9 7 - 0
1 2 8 * 0
1 0 7 - 0
9 3 - 0
2 9 - 0
1 3 8 0 - 0
6 7 - 2
6 8 * 8
4 3 2 - 0
1 6 5 0 0
1 4 4 0 - 0
1 2 2 0 * 0
7 8 5 - 0
6 - 4
1 - 3
1 - 2
2 - 9
5 . 3
4 . 9
3 . 9
9 . 4
1 1 2 - 0
2 9 - 5
3 4 0
6 3 - 0
9 9 . 0
1 0 1 - 0
8 8 - 0
2 1 2 - 0
6 - 0
1 - 6
1 - 6
3 . 4
6 - 9
4 . 3
3 . 9
6 - 9
1 1 0 - 5
3 2 - 5
3 5 0
1 0 2 - 0
1 6 5 - 5
7 5 - 8
6 6 - 0
9 7 0
2 3 1 0 - 0
4 8 - 5
4 7 . 9
9 5 . 5
1 7 4 0 - 0
1 3 9 0 - 0
1 0 8 0 - 0
3 7 8 0 - 0
D IS C U S S ION
It a ppe a r s f r o m w o r k i n o t h e r l a b o r a t o r i e s ( s e e
r e f e r e n c e s c i t e d i n i n t r o d u c t i o n ) , w i t h m a n o m e t r i c ,
e n z ym i c a n d i s o t o pi c t e c h n i q u e s , t h a t s e g m e n t s o f
t h e c i t r i c a c i d c yc l e pr o c e e d , t o s o m e e x t e n t a t
l e a s t , i n t u m o u r t i s s u e . On t h e o t h e r h a n d , t h e r e i s
a l s o e v i d e n c e w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e a c t i v i t y o f
t h e c yc l e i s o f a l o w e r o r d e r t h a n t h a t o f m a n y
n o r m a l t i s s u e s . T h e r e s u l t s pr e s e n t e d i n t h e pr e s e n t
pa pe r , h o w e v e r , i n d i c a t e c l e a r l y t h a t t h e a c t i v i t y
o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e i n t h e t u m o u r t i s s u e s s t u d i e d
i s o f a l o w e r o r d e r t h a n t h a t i n t h e n o r m a l c o n t r o l
t i s s u e s . T h i s i s b a s e d o n t h e i n t e r pr e t a t i o n t h a t t h e
c o n c e n t r a t i o n s a n d t o t a l 1 4 C - a c t i v i t i e s o f t h e i n t e r -
m e d i a t e s i n t h e c yc l e r e f l e c t t h e a m o u n t o f m a t e r i a l
pa s s i n g t h r o u g h i t . A n o t h e r po s s i b l e i n t e r pr e t a -
t i o n , o n t h e o t h e r h a n d , i s t h a t t h e l o w e r c o n c e n t r a -
t i o n s o f t h e a c i d s i n t h e t u m o u r t i s s u e s c o u l d m e a n
t h a t t h e c yc l e i s a s a c t i v e o r e v e n m o r e a c t i v e i n
t h e s e t i s s u e s , pr o v i d e d t h a t t h e e n z ym e l e v e l s a r e
h i g h e r . H o w e v e r , m e a s u r e m e n t o f t h e l e v e l s o f
c e r t a i n e n z ym e s o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e a n d s o m e
o t h e r r e l a t e d e n z ym e s , h a v e s h o w n t h a t t h e y a r e
e i t h e r c o m pa r a b l e o r l o w e r , b u t n e v e r h i g h e r , i n
t u m o u r t i s s u e s . T h e e n z ym e s m e a s u r e d i n c l u d e
c yt o c h r o m e o x i d a s e ( Gr e e n s t e i n e t a l . 1 9 4 4 ) ,
s u c c i n i c d e h yd r o g e n a s e a n d c yt o c h r o m e o x i d a s e
( S c h n e i d e r & P o t t e r , 1 9 4 3 ) , a c o n i t a s e ( We i n h o u s e ,
1 9 5 1 ) , m a l i c d e h yd r o g e n a s e ( P o t t e r , 1 9 4 6 ) , c o n -
d e n s i n g e n z ym e ( P o t t e r & B u s c h , 1 9 5 0 ) , a n d l a c t i c ,
o c - o x o g l u t a r i c , m a l i c a n d i s o c i t r i c d e h yd r o g e n a s e s ,
f u m a r a s e , o x a l o a c e t i c c a r b o x yl a s e , c o n d e n s i n g
e n z ym e a n d a c o n i t a s e ( We n n e r e t a l . 1 9 5 2 ) .
F u r t h e r , a n e q u a l o r h i g h e r a c t i v i t y o f t h e c yc l e i n
t u m o u r t i s s u e s w o u l d r e q u i r e a h i g h e r r a t e o f
a c e t a t e u t i l i z a t i o n w h e n a c e t a t e w a s u s e d a s t h e
s u b s t r a t e . A c t u a l l y, a c e t a t e u t i l i z a t i o n h a s b e e n
f o u n d b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s t o b e m u c h l e s s i n
t u m o u r t h a n i n t h e n o r m a l t i s s u e s t h a t t h e y h a v e
s t u d i e d . P a r d e e , H e i d e l b e r g e r & P o t t e r ( 1 9 5 0 )
m e a s u r e d t h e o x i d a t i o n o f
[ 1 - 1 4 C ]a c e t a t e
t o
1 4 C O2
i n s l i c e s a n d h o m o g e n a t e s o f t u m o u r a n d n o n -
t u m o u r t i s s u e s a n d f o u n d t h a t l e s s t h a n o n e -
5 0 0 1 9 6 1
Vl 8 1 REB S C YC LE IN T U M OU R T IS S U E
t w e n t y- f i f t h a s m u c h 1 4 C O2 w a s pr o d u c e d b y
t u m o u r a s b y k i d n e y. S i m i l a r r e s u l t s w e r e l a t e r
o b t a i n e d b y B u s c h & B a l t r u s h ( 1 9 5 4 ) . A n o t h e r
l i n e o f e v i d e n c e f o r t h e o c c u r r e n c e o f a r e d u c e d
a c t i v i t y o f t h e K r e b s c yc l e w a s pr o v i d e d b y K i t &
Gr e e n b e r g ( 1 9 5 1 ) , w h o w e r e a b l e t o s h o w t h a t
a c e t a t e w a s o x i d i z e d t o c a r b o n d i o x i d e i n Ga r d n e r
l ym ph o s a r c o m a t o a b o u t o n e - t h i r d t h e e x t e n t o f
t h a t i n s pl e e n , o n e o f t h e n o r m a l t i s s u e s o f r e l a -
t i v e l y l o w o x i d i z i n g a c t i v i t y. A l s o , c i t r a t e a c c u m u -
l a t i o n w a s a l m o s t o f t h e s a m e m a g n i t u d e i n t h e
pr e s e n c e o f f l u o r o a c e t a t e a s i n i t s a b s e n c e . We i n -
h o u s e ( 1 9 5 1 ) , o n t h e o t h e r h a n d , h a s s h o w n t h a t
1 4 C O2 i s f o r m e d i n a ppr o x i m a t e l y e q u a l q u a n t i t i e s
f r o m v a r i o u s s u b s t r a t e s , i n c l u d i n g a c e t a t e , b y
t u m o u r a n d n o r m a l - t i s s u e s l i c e s . F u r t h e r , w h e n
[ 2 - _ 4 C ]pyr u v a t e i s u s e d a s a s u b s t r a t e , 1 4 C O2 pr o -
d u c t i o n i n h e pa t o m a w a s n e a r l y t h e s a m e a s t h a t
pr o d u c e d i n l i v e r ( Ol s o n , 1 9 5 1 ) . T h u s m o s t o f t h e
o b s e r v a t i o n s i n v i t r o c i t e d a b o v e i n d i c a t e a l o w e r
a c t i v i t y o f t h e c yc l e i n t h e t u m o u r t i s s u e s s t u d i e d , a s
w a s f o u m d b y a d i f f e r e n t pr o c e d u r e i n t h e pr e s e n t
s t u d y.
F u r t h e r e v i d e n c e o f a d i m i n i s h e d a c t i v i t y o f
s e g m e n t s o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e h a v e b e e n f u r n -
i s h e d b y s e v e r a l e x pe r i m e n t s i n v i v o . P o t t e r &
B u s c h ( 1 9 5 0 ) d e t e r m i n e d t h e c i t r i c a c i d c o n t e n t o f
t i s s u e s o f f l u o r o a c e t a t e - t r e a t e d r a t s a n d f o u n d i t t o
a c c u m u l a t e i n m o s t t i s s u e s w i t h t h e e x c e pt i o n o f
l i v e r , t e s t i s a n d t u m o u r . T h e i n a b i l i t y o f t h e l i v e r ,
w h i c h i s k n o w n t o e x h i b i t h i g h c i t r i c a c i d - c yc l e
a c t i v i t y, t o a c c u m u l a t e c i t r a t e w a s e x pl a i n e d o n t h e
b a s i s o f t h e o c c u r r e n c e o f a n o t h e r pa t h w a y f o r
a c e t a t e a n d pyr u v a t e u t i l i z a t i o n , n a m e l y a c e t o -
a c e t a t e f o r m a t i o n . T h e a b s e n c e o f c i t r a t e a c c u m u l a -
t i o n i n t u m o u r w a s c o n s i d e r e d a s ' s t r o n g e v i d e n c e
t h a t t h e a b i l i t y o f t u m o u r t i s s u e s t o f o r m c i t r a t e
i s v e r y l o w i n c o m pa r i s o n w i t h a w i d e v a r i e t y o f
n o r m a l t i s s u e s ' . Ot h e r e x pe r i m e n t s o n t r a n s -
pl a n t e d r a t t u m o u r i n v i v o a l s o s h o w e d e i t h e r n o
s i g n i f i c a n t a c e t a t e o r pyr u v a t e o x i d a t i o n ( B u s c h &
B a l t r u s h , 1 9 5 4 ; B u s c h , 1 9 5 5 ) , o r , w i t h t h e u pt a k e
o f g l u t a m a t e o r s u c c i n a t e , a c t i v i t y o f o n l y a
po r t i o n o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e ( Nyh a n & B u s c h ,
1 9 5 8 ) .
Re c e n t l y B u s c h , D a v i s & Ol l e ( 1 9 5 7 ) h a v e
d e m o n s t r a t e d t h a t o n l y ' u n d e r o pt i m a l c o n d i t i o n s
( i . e . e x c e s s o f a v a r i e t y o f s u b s t r a t e s o f t h e c i t r i c
a c i d c yc l e , pH 7 - 4 , a n d a n a t m o s ph e r e o f 1 0 0 pe r
c e n t o x yg e n ) i s t h e c a pa c i t y o f t r a n s pl a n t a b l e r a t
t u m o u r f o r pr o d u c t i o n o f c i t r a t e e s s e n t i a l l y t h e
s a m e a s t h a t o f a v a r i e t y o f n o n - t u m o u r t i s s u e s ' .
Ev e n u n d e r s u c h u n ph ys i o l o g i c a l c o n d i t i o n s a s
t h e s e , t h e i r d a t a s h o w t h a t c i t r a t e a c c u m u l a t i o n
w a s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r i n t h e n o r m a l t i s s u e s t h a n
i n a n y o f t h e t u m o u r s i n v e s t i g a t e d .
T h e pr e s e n t s t u d y pr o v i d e s a m o r e c o m pl e t e a n d
d i r e c t d e m o n s t r a t i o n o f a l o w a c t i v i t y o f t h e e n t i r e
K r e b s c yc l e i n c e r t a i n t u m o u r s . It i s e v i d e n t t h a t ,
w i t h t h e e x c e pt i o n o f t h e o x a l o a c e t a t e f r a c t i o n ,
w h i c h c o n t a i n s a n a ppr e c i a b l e q u a n t i t y o f a c e t o -
a c e t a t e , t h e a m o u n t s a n d a c t i v i t i e s ( T a b l e s 1 a n d 2 )
o f a l l t h e c yc l e i n t e r m e d i a t e s i n l i v e r o r m u s c l e
w e r e a l w a ys g r e a t e r t h a n i n t h e t w o t u m o u r t i s s u e s .
T h e e x pe r i m e n t s w i t h f l u o r o a c e t a t e f u r n i s h e d
f u r t h e r s u ppo r t f o r t h i s o b s e r v a t i o n . T h e a ppa r e n t
i n c r e a s e i n t h e o x a l o a c e t a t e f r a c t i o n w o u l d b e
e x pe c t e d f r o m t h e e f f e c t o f f l u o r o a c e t a t e i n h i b i t i o n
o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e a n d t h e d i v e r s i o n o f a c o n -
s i d e r a b l e po r t i o n o f a c e t a t e t o w a r d s f a t t y a c i d
b i o s yn t h e s i s ( C r a n d a l l , Gu r i n & Wi l s o n , 1 9 4 7 ) .
T h e s t u d i e s o f Eh r l i c h a s c i t e s c e l l s g a v e e v e n
m o r e c o n v i n c i n g e v i d e n c e a b o u t t h e s t a t u s o f t h e
c yc l e i n t u m o u r s . H e r e a g a i n , t h e q u a n t i t i e s a n d
a c t i v i t i e s o f t h e c yc l e a c i d s ( T a b l e 4 ) a r e d e c i d e d l y
l e s s t h a n t h o s e i n i s o l a t e d l i v e r c e l l s o r n u c l e a t e d
e r yt h r o c yt e s ( T a b l e 8 ) . F u r t h e r , t h e v a l u e s a r e
l e s s t h a n t h o s e f o r l i v e r o r m u s c l e ( T a b l e s 1 a n d 2 ) .
T h e s e d i f f e r e n c e s a r e a l s o a ppa r e n t i f s pe c i f i c
a c t i v i t i e s , w h i c h r e f l e c t r a t e o f t u r n o v e r a n d h e n c e
t h e e x t e n t o f t h e a c t i v i t y o f t h e c yc l e e n z ym e s , a r e
c a l c u l a t e d a n d t h e n c o m pa r e d . In d e e d , t h e s pe c i f i c
a c t i v i t i e s o f t h e i n d i v i d u a l i n t e r m e d i a t e s i n t u m o u r s
a r e d e f i n i t e l y m u c h l e s s t h a n t h e i r c o u n t e r pa r t s i n
t h e n o r m a l t i s s u e s .
A l t h o u g h t h e f o r e g o i n g o b s e r v a t i o n s t e n d t o
s u ppo r t t h e v i e w t h a t t h e K r e b s c yc l e i s o f l o w
a c t i v i t y i n t u m o u r s , t h e y h a v e l e f t u n d e c i d e d t h e
q u e s t i o n o f w h e t h e r o r n o t a b l o c k ( s ) e x i s t s o u t s i d e
t h e c yc l e w h i c h c o u l d h i n d e r t h e n o r m a l e n t r a n c e o f
a c e t a t e i n t o i t . On e c o u l d a s s u m e e i t h e r a n e n -
z ym e o r a c o f a c t o r , o r b o t h , t o b e t h e l i m i t i n g
f a c t o r ( s ) . A s a m a t t e r o f f a c t , s e v e r a l c o f a c t o r s ,
s u c h a s D P N, A T P a n d C o A , a r e k n o w n t o b e i n -
v o l v e d i n t h e s e r e a c t i o n s a n d w o u l d r e t a r d t h e r a t e
o f c i t r a t e b i o s yn t h e s i s i f t h e y w e r e n o t pr e s e n t i n
s u f f i c i e n t q u a n t i t i e s . A l s o , t w o e n z ym e s ys t e m s
a r e r e c o g n i z e d a s b e i n g c o n c e r n e d w i t h t h e r e a c t i o n s
t h a t l e a d t o c i t r a t e f o r m a t i o n f r o m a c e t a t e , n a m e l y
t h e a c t i v a t i n g a n d c o n d e n s i n g e n z ym e s . T h e l a t t e r ,
h o w e v e r , i s n o t b e l i e v e d t o e x i s t i n t u m o u r s i n
l e v e l s c o m pa r a b l e w i t h t h o s e i n n o n - t u m o u r s
( We n n e r e t a l . 1 9 5 2 ) . B e c a u s e D P N a n d A T P w e r e
u s e d i n a l l e x pe r i m e n t s , i n c l u d i n g t h e c o n t r o l ,
o n l y t h e C o A w a s t e s t e d f o r i t s e f f e c t o n t h e u t i l i z a -
t i o n o f a c e t a t e o r s u c c i n a t e b y w a y o f t h e c i t r i c
a c i d c yc l e i n t h e a s c i t e s c e l l s . T h e pr e s e n t r e s u l t s
m a k e i t c l e a r t h a t t h e c yc l e c o m po n e n t s d i d n o t
i n c r e a s e a n y m o r e i n t h e pr e s e n c e o f C o A t h a n i n i t s
a b s e n c e . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t C o A e i t h e r d o e s
n o t pe n e t r a t e t h e c e l l r e a d i l y o r t h a t t u m o u r s a r e
l e s s a b l e t o a c t i v a t e a c e t a t e t h a n m a n y n o r m a l
t i s s u e s . A l t h o u g h n o a t t e m pt w a s m a d e t o i n v e s t i -
g a t e t h e pe r m e a b i l i t y o f t h e a s c i t e s c e l l t o C o A i n
t h e pr e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e f o r m a t i o n o f a c e t yl -
C o A w a s s t u d i e d b y i n d i r e c t m e a n s . If a c e t a t e
Vo l . 8 1 5 0 1
5 0 2 R. M . D A J A NI, J . D A NIELS K I, W. GA M B LE A ND J . M . ORT EN 1 9 6 1
w e r e n o t n o r m a l l y m e t a b o l i z e d v i a t h e c i t r i c a c i d
c yc l e b e c a u s e o f a l a c k o r a s u b n o r m a l a c t i v i t y o f
t h e a c t i v a t i n g e n z ym e , i t w o u l d b e r e a s o n a b l e t o
a s s u m e t h a t a d d i n g pr e f o r m e d a c e t yl - C o A w o u l d
i n c r e a s e t h e o u t pu t o f c i t r a t e i n t h e pr e s e n c e o f
f l u o r o a c e t a t e . A c e t yl - C o A d i d n o t pr o d u c e a n y
s u c h i n c r e a s e i n t h e c i t r a t e c o n c e n t r a t i o n ( T a b l e 8 ) .
It i s , o f c o u r s e , po s s i b l e t h a t a c e t yl - C o A m a y a l s o
n o t h a v e pe n e t r a t e d t h e c e l l o r t h a t i t m a y h a v e
b e e n d e a c yl a t e d . T h e s i m pl e s t e x pl a n a t i o n o f t h e
i n a c t i v i t y o f a c e t yl - C o A i s , o f c o u r s e , t h a t i t d o e s
n o t pe n e t r a t e t h e c e l l . H o w e v e r , i f i t b e a s s u m e d
t h a t pe r m e a b i l i t y a n d d e a c yl a t i o n a r e n o t i n f a c t
i m po r t a n t f a c t o r s , t h e n t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t
t h e r e i s n o d e f i c i e n c y o f a c t i v a t i n g - e n z ym e a c t i v i t y
i n a s c i t e s - t u m o u r c e l l s a n d pe r h a ps i n o t h e r t ype s
o f t u m o u r s . T h i s i s s u ppo r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n
t h a t t h e r e w a s a m a r k e d i n c r e a s e i n t h e pr o d u c t i o n
o f a c e t o a c e t a t e a n d f a t t y a c i d s ; s u c h a f i n d i n g
a r g u e s a g a i n s t a n i m pa i r m e n t i n t h e a c t i v a t i n g -
e n z ym e s ys t e m , s i n c e a c e t yl - C o A f o r m a t i o n i s
e s t a b l i s h e d t o b e t h e f i r s t s t e p i n t h e b i o s yn t h e s i s
o f t h e s e s u b s t a n c e s . T h i s f i n d i n g w o u l d a l s o a r g u e
a g a i n s t a n y po s s i b l e e x c e s s i v e d e s t r u c t i o n o f A T P
a n d D P N, w h i c h , o f c o u r s e , c o u l d r e t a r d t h e c yc l e
a c t i v i t y i n t h e t u m o u r t i s s u e s e m pl o ye d .
In v i e w o f t h e pr e s e n t f i n d i n g s , t o g e t h e r w i t h
t h o s e i n t h e l i t e r a t u r e c i t e d , i t s e e m s r e a s o n a b l e t o
c o n c l u d e t h a t t h e r e a c t i o n s o f t h e K r e b s c yc l e a r e
o f a l o w e r o r d e r i n t h e t u m o u r a s c o m pa r e d w i t h
n o r m a l t i s s u e s i n v e s t i g a t e d . A d i m i n i s h e d a m o u n t
o r a c t i v i t y, o r b o t h , o f s o m e i n t r a c yc l e e n z ym e
s ys t e m ( s ) a ppe a r s t o b e t h e l i m i t i n g f a c t o r .
S U M M A RY
1 . T h e o pe r a t i o n o f t h e K r e b s c yc l e i n c e r t a i n
t u m o u r a n d n o n - t u m o u r t i s s u e s h a s b e e n s t u d i e d
b y m e a s u r i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s a n d 1 4 C - a c t i v i t i e s
o f t h e c yc l e i n t e r m e d i a t e s w h e n a c e t a t e , m a l a t e
a n d / o r s u c c i n a t e w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s i n t h e pr e -
s e n c e a n d a b s e n c e o f t h e b l o c k i n g a g e n t s , f l u o r o -
a c e t a t e a n d m a l o n a t e . T h e u t i l i z a t i o n o f t h e s e
s u b s t a n c e s b y w a y o f t h e c i t r i c a c i d c yc l e w a s l e s s
i n t h e Wa l k e r , LC - 1 8 a n d m o u s e a s c i t e s t u m o u r s
t h a n i n m u s c l e , l i v e r ( h o m o g e n a t e s a n d i s o l a t e d
i n t a c t c e l l s ) o r n u c l e a t e d e r yt h r o c yt e s .
2 . A d d i t i o n o f a d e n o s i n e t r i ph o s ph a t e a n d t w o
c o n c e n t r a t i o n s o f d i ph o s ph o pyr i d i n e n u c l e o t i d e t o
t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e , i n t h e pr e s e n c e o f f l u o r i d e
o r t r i e t h yl t i n a c e t a t e , d i d n o t r e s u l t i n a n y a ppr e c i -
a b l e i n c r e a s e i n t h e a m o u n t s o r 1 4 C - a c t i v i t i e s o f t h e
c i t r i c a c i d - c yc l e m e m b e r s i n t u m o u r s . Li k e w i s e ,
f o r t i f yi n g t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e w i t h e i t h e r
c o e n z ym e A o r pr e f o r m e d a c e t yl - c o e n z ym e A
f a i l e d t o pr o d u c e a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e
q u a n t i t i e s a n d a c t i v i t i e s o f t h e c yc l e a c i d s . T h e
o n l y i n c r e a s e w a s i n t h e l i pi d a n d a c e t o a c e t a t e
f r a c t i o n s . T h i s w a s c o n s i d e r e d t o i n d i c a t e t h a t
t h e r e w a s n o a ppa r e n t i m pa i r m e n t i n t h e a c t i v a t i n g -
e n z ym e s ys t e m o r e x c e s s i v e l o s s o f a d e n o s i n e t r i -
ph o s ph a t e o r d i ph o s ph o pyr i d i n e n u c l e o t i d e i n t h e
t u m o u r s e m pl o ye d .
3 . T h e c yc l e i n t e r m e d i a t e s , s u c c i n a t e a n d
m a l a t e , w e r e n o t u t i l i z e d a n y b e t t e r b y t h e t u m o u r
t i s s u e s t h a n w a s a c e t a t e .
4 . In v i e w o f t h e a b o v e f i n d i n g s , i t i s c o n c l u d e d
t h a t t h e l o w e r a c t i v i t y o f t h e c yc l e i n t h e t u m o u r
t h a n i n t h e n o r m a l t i s s u e s s t u d i e d i s pr i m a r i l y d u e
t o s o m e d e f e c t i n a n i n t r a - K r e b s - c yc l e r e a c t i o n ( s ) .
T h e a u t h o r s w i s h t o e x pr e s s t h e i r d e e p g r a t i t u d e t o t h e
s t a f f o f t h e D e t r o i t C a n c e r Re s e a r c h In s t i t u t e f o r t h e i r
g e n e r o s i t y i n s u ppl yi n g a l l t h e t u m o u r - b e a r i n g a n i m a l s
e m pl o ye d i n t h i s s t u d y. Gr a t e f u l t h a n k s a r e a l s o d u e t o o u r
c o l l e a g u e , D r J . J . J a s pe r , f o r a v e r y pu r e s a m pl e o f f l u o r o -
a c e t i c a c i d . We a r e e s pe c i a l l y i n d e b t e d t o D r D . E. Gr e e n ,
o f t h e U n i v e r s i t y o f Wi s c o n s i n , f o r s u ppl yi n g a c e t yl - C o A ,
a m a t e r i a l w h i c h h a s a d d e d m o r e w e i g h t t o t h e f i n d i n g s o f
t h i s i n v e s t i g a t i o n . T h i s w o r k w a s s u ppo r t e d b y Re s e a r c h
Gr a n t n o . C Y- 2 1 4 4 f r o m t h e Na t i o n a l In s t i t u t e s o f H e a l t h .
REF ERENC ES
B e c k , W. S . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 2 , 2 5 1 .
B r a n s t e r , V. M . & M o r t o n , R. K . ( 1 9 5 7 ) . Na t u r e , Lo n d . ,
1 8 0 , 1 2 8 3 .
B u s c h , H . ( 1 9 5 5 ) . C a n c e r Re s . 1 5 , 3 6 5 .
B u s c h , H . & B a l t r u s h , H . A . ( 1 9 5 4 ) . C a n c e r . Re s . 1 4 ,
4 4 8 .
B u s c h , H . , D a v i s , J . R. & Ol l e , E. W. ( 1 9 5 7 ) . C a n c e r Re s .
1 7 , 7 1 1 .
B u s c h , H . & P o t t e r , V. R. ( 1 9 5 2 ) . C a n c e r Re s . 1 2 , 6 6 0 .
C o r i , C . F . & C o r i , G. T . ( 1 9 2 5 ) . J . b i o l . C h e m . 6 5 , 3 9 7 .
C r a n d a l l , D . I. , Gu r i n , S . & Wi l s o n , D . W. ( 1 9 4 7 ) . F e d .
P r o c . 6 , 2 4 6 .
D a j a n i , R. M . & Or t e n , J . M . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 1 ,
9 1 3 .
D u b o i s , K . P . & P o t t e r , V. R. ( 1 9 4 2 ) . C a n c e r Re 8 . 2 ,
2 9 0 .
El l i o t t , W. B . & K a l n i t s k y, G. ( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 6 ,
4 8 7 .
Gr e e n s t e i n , J . P . , We r n e , J . , Es c h e n b r e n n e r , A . B . &
Le u t h a r d t , F . M . ( 1 9 4 4 ) . J . n a t . C a n c e r i n s t . 5 , 5 5 .
H e i d e l b e r g e r , C . ( 1 9 5 3 ) . A d v a n c . C a n c e r Re s . 1 , 2 7 3 .
Ib s e n , K . H . , C o e , E. L. & M c K e e , R. W. ( 1 9 5 8 ) . B i o c h i m .
b i o ph y8 . A c t a , 3 0 , 3 8 4 .
K i t , S . & Gr e e n b e r g , D . M . ( 1 9 5 1 ) . C a n c e r Re s . 1 1 , 4 9 5 .
K u n , E. , T a l a l a y, P . & Wi l l i a m s - A s h m a n , H . G. ( 1 9 5 1 ) .
C a n c e r Re s . 1 1 , 8 5 5 .
Le P a g e , G. A . ( 1 9 5 0 ) . C a n c e r Re s . 1 0 , 7 7 .
M e i s t e r , A . ( 1 9 5 0 ) . J . n a t . C a n c e r In s t . 1 0 , 1 2 6 3 .
Nyh a n , W. L. & B u s c h , H . ( 1 9 5 8 ) . C a n c e r Re 8 . 1 8 , 3 8 5 ,
1 2 0 3 .
Ol s e n , R. E. ( 1 9 5 1 ) . C a n c e r Re 8 . 1 1 , 5 7 1 .
P a r d e e , A . B . , H e i d e l b e r g e r , C . & P o t t e r , V. R. ( 1 9 5 0 ) .
J . b i o l . C h e m . 1 8 6 , 6 2 5 .
P a r d e e , A . B . & P o t t e r , V. R. ( 1 9 4 9 ) . J . b i o l . C h e m . 1 7 8 ,
2 4 1 .
P o t t e r , V. R. ( 1 9 4 6 ) . J . b i o l . C h e m . 1 6 5 , 3 1 1 .
P o t t e r , V. R. ( 1 9 5 1 ) . C a n c e r Re s . 1 1 , 5 6 5 .
Vo l . 8 1 K REB S C YC LE IN T U M OU R T IS S U E 5 0 3
P o t t e r , V. R. & B u s c h , H . ( 1 9 5 0 ) . C a n c e r Re 8 . 1 0 , 3 5 3 .
S c h n e i d e r , W. C . & P o t t e r , V. R. ( 1 9 4 3 ) . C a n c e r R&s . 3 ,
3 5 3 .
S i b l e y, J . A . & Le h n i n g e r , A . L. ( 1 9 4 9 ) . J . n a t . C a n c e r
In 8 t . 9 , 3 0 3 .
Wa r b u r g , 0 . ( 1 9 2 6 ) . U b e r d e n S t o f f w e c h 8 e l d e r T u m o r e n .
B e r l i n : J u l i u s S pr i n g e r
Wa r b u r g , 0 . ( 1 9 5 6 ) . S c i e n c e , 1 2 3 , 3 0 9 .
We i n h o u s e , S . ( 1 9 5 1 ) . C a n c e r Re s . 1 1 , 5 8 5 .
We i n h o u s e , S . ( 1 9 5 5 ) . A d v a n c . C a n c e r Re s . 3 , 2 6 9 .
We i n h o u s e , S . , Wa r b u r g , 0 . & B u r k , D . ( 1 9 5 6 ) . S c i e n c e ,
1 2 4 , 2 6 7 .
We n n e r , C . E. , S pi r t e s , M . A . & We i n h o u s e , S . ( 1 9 5 2 ) .
C a n c e r Re s . 1 2 , 4 4 .
We n n e r , C . E. & We i n h o u s e , S . ( 1 9 5 2 ) . C a n c e r Re 8 . 1 2 , 3 0 6 .
We n n e r , C . E. & We i n h o u s e , S . ( 1 9 5 3 ) . C a n c e r Re 8 . 1 3 , 2 1 .
B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 8 1 , 5 0 3
T h e M e t a b o l i s m o f C 2 - C o m po u n d s i n M i c r o - o r g a n i s m s
8 . A D IC A RB OXYLIC A C ID C YC LE A S A ROU T E F OR T H E OXID A T ION OF
GLYC OLLA T E B Y ES C H ERIC H IA C OL1 *
B Y H . L. K ORNB ERGt A ND J . R.
S A D LER$
M e d i c a l Re s e a r c h C o u n c i l C e l l M e t a b o l i s m Re s e a r c h U n i t , D e pa r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y,
U n i v e r s i t y o f Ox f o r d
( Re c e i v e d 2 5 M a y 1 9 6 1 )
A l t h o u g h t h e t r i c a r b o x yl i c a c i d c yc l e h a s b e e n
e s t a b l i s h e d a s t h e m a j o r r o u t e f o r t h e o x i d a t i o n o f
a c e t a t e , a n d o f c o m po u n d s c a t a b o l i z e d t o a c e t a t e ,
i n a w i d e v a r i e t y o f o r g a n i s m s ( f o r r e v i e w , s e e
K r e b s & Lo w e n s t e i n , 1 9 6 0 ) l i t t l e i s k n o w n o f t h e
pa t h w a ys o f o x i d a t i o n o f C 2 c o m po u n d s m o r e
h i g h l y o x i d i z e d t h a n a c e t a t e , s u c h a s g l yc o l l a t e o r
g l yo x yl a t e . T h e m a i n pu r po s e o f t h i s pa pe r i s t o
s h o w t h a t , w h e r e a s t h e t r i c a r b o x yl i c a c i d c yc l e
pl a ys a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e g r o w t h o f EWc h e r i c h i a
c o l i o n g l yc o l l a t e a s s o l e c a r b o n s o u r c e , t h i s c yc l e i s
n o t n e c e s s a r y f o r g l yc o l l a t e o x i d a t i o n . T h e r e s u l t s
o b t a i n e d w i t h t h e m u t a n t M 2 2 - 6 4 o f E. c o l i , s t r a i n
w , w h i c h i s d e v o i d o f t h e c i t r a t e - f o r m i n g c o n d e n s i n g
e n z ym e ( Gi l v a r g & D a v i s , 1 9 5 7 ) , a n d w i t h i t s
pa r e n t w i l d t ype , s u ppo r t t h e v i e w t h a t g l yo x yl a t e ,
d e r i v e d f r o m t h e o x i d a t i o n o f g l yc o l l a t e , c a n b e
o x i d i z e d c o m pl e t e l y v i a a d i c a r b o x yl i c a c i d c yc l e
i n w h i c h g l yo x yl a t e c o n d e n s e s w i t h a c e t yl -
c o e n z ym e A t o f o r m m a l a t e , w h i c h i s o x i d i z e d v i a
o x a l o a c e t a t e a n d pyr u v a t e t o r e g e n e r a t e t h e
a c e t yl - c o e n z ym e A r e q u i r e d f o r t h e i n i t i a l c o n d e n s a -
t i o n . A n o u t l i n e o f t h i s w o r k h a s b e e n pu b l i s h e d
( K o r n b e r g & S a d l e r , 1 9 6 0 ) .
M A T ERIA LS A ND M ET H OD S
M a i n t e n a n c e a n d g r o w t h o f m i c r o - o r g a n i s m s . T h e m i c r o -
o r g a n i s m s u s e d i n t h i s w o r k w e r e E. c o l i , s t r a i n w , a n d t h e
m u t a n t M 2 2 - 6 4 i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d b y Gi l v a r g &
D a v i s ( 1 9 5 7 ) . T h e m u t a n t d i f f e r e d f r o m i t s pa r e n t w i l d
s t r a i n i n b e i n g u n a b l e t o c a t a l ys e t h e c o n d e n s a t i o n o f
a c e t yl - c o e n z ym e A a n d o x a l o a c e t a t e t o f o r m c i t r a t e , a n d
h e n c e r e q u i r e d t h e a d d i t i o n o f g l u t a m a t e f o r g r o w t h . T h e
o r i g i n a l c u l t u r e s o f t h e m u t a n t a n d o f t h e pa r e n t w i l d t ype
w e r e g i f t s f r o m P r o f e s s o r B . D . D a v i s ( H a r v a r d M e d i c a l
S c h o o l , B o s t o n , M a s s . , U . S . A . ) .
C u l t u r e s o f t h e m u t a n t a n d o f t h e pa r e n t w i l d t ype w e r e
g r o w n a n d m a i n t a i n e d o n a g a r s l o pe s , c o n t a i n i n g 5 0 m M -
po t a s s i u m ph o s ph a t e b u f f e r , pH 7 - 2 , 5 0 m M - NH 4 C l , 5 0 m M -
s o d i u m g l yc o l l a t e , 2 m M - s o d i u m g l u t a m a t e a n d e s s e n t i a l
s a l t s ( 4 m g . o f C a C l 2 , 6 H 2 0 ;
0 - 2 m g . o f M n C l 2 , 4 H 2 0 ; 4 m g .
Of M g S O4 , 7 H 2 0 a n d 0 - 2 m g . o f F e S O4 , 6 H 2 0 pe r 1 0 0 m l . o f
m e d i u m ) s o l i d i f i e d w i t h 1 - 5 % ( w / v ) o f a g a r a g a r ( H o pk i n
a n d Wi l l i a m s Lt d . , C h a d w e l l H e a t h , Es s e x ) . S t o c k c u l t u r e s
o f t h e o r g a n i s m w e r e s u b c u l t u r e d e v e r y 2 w e e k s , g r o w n
a t 3 0 0 a n d s t o r e d a t 2 0 .
F o r g r o w t h i n l i q u i d m e d i u m , a l o o pf u l o f o r g a n i s m s
f r o m a f r e s h l y g r o w n s l o pe w a s s u s pe n d e d i n 4 0 0 n i l . o f t h e
a b o v e m e d i u m w i t h t h e a g a r o m i t t e d ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o
a s ' g l yc o l l a t e - g l u t a m a t e ' m e d i u m ) i n a C a r r e l c u l t u r e f l a s k
( J . A . J o b l i n g a n d C o . Lt d . , S u n d e r l a n d ) . T h e f l a s k s w e r e
s h a k e n f o r 3 0 - 3 5 h r . o n a r e c i pr o c a l s h a k e r a t 3 0 . Gr o w t h
o f t h e c e l l s w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r e m e n t s i n a n EEL
U n i g a l v o T ype 2 0 n e ph e l o m e t e r ( Ev a n s El e c t r o s e l e n i u m
Lt d . , H a r l o w , Es s e x ) o f t h e l i g h t - s c a t t e r i n g o f s a m pl e s o f
t h e b a c t e r i a l s u s pe n s i o n s a n d c o m pa r i s o n o f t h e o b s e r v e d
r e a d i n g s w i t h a pr e v i o u s l y c o n s t r u c t e d c a l i b r a t i o n c u r v e
r e l a t i n g s u c h r e a d i n g s t o t h e d r y w e i g h t o f b a c t e r i a / m l . o f
s u s pe n s i o n . A l t h o u g h t h e m e d i u m w a s s h o w n t o b e
a d e q u a t e t o s u s t a i n t h e g r o w t h o f m o r e t h a n 1 m g . d r y w t .
o f b a c t e r i a / m l . , t h e o r g a n i s m s w e r e h a r v e s t e d w h i l e i n t h e
ph a s e o f l o g a r i t h m i c g r o w t h , a t d e n s i t i e s o f 0 - 2 - 0 - 5 m g .
d r y w t . / m l . T h e c o n t e n t s o f t h e C a r r e l - c u l t u r e f l a s k s w e r e
c e n t r i f u g e d a t 1 0 f o r 1 5 m i n . a t 1 5 0 0 g .
Ox i d a t i o n s t u d i e s . T h e pa c k e d c e l l s w e r e s u s pe n d e d i n
1 0 0 - 1 5 0 m l . o f po t a s s i u m ph o s ph a t e , pH 7 - 2 , c e n t r i f u g e d
a t 1 5 0 0 g f o r 1 0 m i n . , a n d r e s u s pe n d e d i n a s u f f i c i e n t
v o l u m e o f b u f f e r t o g i v e a c e l l d e n s i t y o f 5 m g . d r y w t . / m l .
S a m pl e s ( 2 m l . ) o f t h i s w a s h e d c e l l s u s pe n s i o n w e r e pi pe t t e d
i n t o t h e m a i n c o m pa r t m e n t o f Wa r b u r g m a n o m e t e r c u ps .
*
P a r t 7 : Go t t o
&
K o r n b e r g ( 1 9 6 1 ) .
t
P r e s e n t a d d r e s s :
D e pa r t m e n t
o f
B i o c h e m i s t r y,
U n i -
v e r s i t y o f Le i c e s t e r .
$ P r e s e n t a d d r e s s : In s t i t u t e o f M o l e c u l a r B i o l o g y,
U n i v e r s i t y o f Or e g o n ( U . S . A . ) .