Univerzitet u Kragujevcu

Prirodno-matematiki fakultet

Seminarski rad

Tema:

Citogenetika u detekciji mutacija na humanim elijama, in vitro

Mentor:

Student:

Prof. Dr Olivera Miloevi orevi

Filip Mireti 215/2012

Kragujevac, januar, 2015

Sadraj:

Uvod 3
Citogenetika u detekciji mutacija na humanim elijama, in vitro.....4
Indirektne metode.4
Venska periferna krv.....4
Kotana sr...8
Oocite8
Indirektne metode dugotrajne kultivacije.8
Literatura....9

Uvod
2

Citogenetika je grana genetike koja se bavi prouavanjem hromozoma. Hromozomi su

dugi nizovi DNK koji se nalaze u svim elijama. Njihov broj je karakteristian za svaku vrstu i
kod oveka on predstavlja njegov kariotip. Broj hromozoma je stalan i ne menja se osim u
izuzetnim situacijama i razliitim uticajima u kojima se njegov broj menja.Tada nastaju razliiti
poremeaji koji se zovu hromozomske aberacije. Razvojem tehnologije, biologije i njenih
disciplina formirale su se razliite tehnike i naini pomou kojih je mogue detektovati mutacije
na hromozomima. Kod oveka, zbog humanosti i zabrane eksperimenata nad ljudima su to
uglavnom citogenetike metode u kulturi elija, in vitro.

Citogenetika u detekciji mutacija na humanim elijama, in vitro

3

Citogenetika istraivanja u in vitro uslovima su doprinela razumevanju i detektovanju

mnogih hromozomskih aberacija na humanim elijama. In Vitro metode omoguavaju
naunicima da precizno utvrde kako i zato odreeni faktor utie na nastanak ili spreava neku
bolest. U in vitro uslovima se uglavnom koriste testovi na limfocitima periferne krvi pre svega
zbog jednostavnog dobijanja uzoraka iz ovog biolokog materijala. Ali se takoe koriste kotana
sr i oocite. Za citogenetika ispitivanja se uglavnom koriste elije koje imaju jedro. Prednost in
vitro metoda je to to su brze i jednostavne. In vitro metode ukljuuju najee metode
kratkotrajne kultivacije limfocita periferne krvi ali i metode dugotrajne kultivacije tkiva i
elijskih linija. Ove dve metode spadaju u indirektne citogenetike metode, dok u direktne
metode najee spadaju in vivo testovi.

Indirektne metode

Mogu se podeliti na dve metode.Metodu kratkotrajne i dugotrajne kultivacije.

Metoda kratkorajne kultivacije - ukljuuje ispitivanja na oocitama, venskoj perifernoj
krvi, fibroblastima i elijama kotane sri.
Venska periferna krv Ispitivanja na ovim elijama su najprimenjenija jer je ovo
najmanje invazivna metoda za pacijente ali takoe se i uzorci elija dobijaju veoma lako. elije
se kultiviu na odgovarajuoj podlozi na temperaturi od 37 stepeni celzijusa i ukupno 72 asa.
Nakon 69-og asa dodaje se citostatik. Nakon 72 asa se vri preparacija. Nakon preparacije
dobijamo kvalitetne hromozomske preparate. Ovi preparati se dalje boje nekom od tehnika
bojenja (G,C,Q i R) radi detaljnijeg ispitivanja.
Kod odraslih, analiza se radi kod endokrinolokih poremeaja, kada fenotipske
karakteristike odrasle osobe ukazuju na hromozomopatije (primarna amenoreja, testikularna
feminizacija, adronogenitalni sindrom, anomalije reproduktivnih organa, hipogonadizma,
ginekomastija, sve azo i oligospermije)
Kod dece, analiza kariotipa se vri radi dijagnostike kongenitalnih anomalija koje se
odlikuju specifinim fenotipskim karakteristikama, reproduktivnih organa, hipogonadizma,
ginekomastija, sve azo i oligospermije).
Dva su testa koja se najee koriste:

SCE test razmene sestrinskih hromatida

Mikronukleus test

Slika 1. Postupak izolacije limfocita periferne krvi

Test razmene sestrinskih hromatida Jedan od najee korienih testova na humanim
elijama.Ovo je test kojim se prate oteenja na nivou DNK. Predstavlja jednokratnu detekciju
recipronih razmena segmenata DNK izmeu sestrinskih hromatida metafaznih hromozoma, koje
nastaju kao posledica izlaganja ispitanika dejstvu mutagenih I karcinogenih materija iz okruenja.
Za skrining ukupne izloenosti razliitim mutagenim agensima kod ljudi koristi se kultura
limfocita iz periferne krvi. Meutim, SCE test se takoe moe primeniti i pojedinano za
dokazivanje mutagenih i karcinogenih svojstava odreenih supstanci iz spoljanje sredine za koje
se predpostavlja da to jesu i kojima su ispitanici profesionalno izloeni. Tom prilikom se test
sprovodi in vitro na kontinuiranoj elijskoj liniji fibroblasta.

Slika 3. SCE kod normalne osobe (levo) i kod osobe sa Bloomovim sindromom
(desno)
Znaaj ove metode, pored toga to je relativno jednostavna i pouzdana, lei i u njenoj
osetljivosti jer se pomou nje mogu detektovati oteenja na molekulu DNK i rearanmani
genetskog materijala, nastali dejstvom mutagenih faktora prisutnih u koncentracijama ak I do sto
puta niim od onih koncentracija koje su potrebne da bi se izazvale vedljive hromozomske
aberacije, koje se mogu konstatovati standardnim citogenetskim metodama analize kariotipa.
Zbog toga je ova metoda (SCE test) prihvaena i od strane Svetske zdravstvene organizacije i
uvrena u listu standardnih kratkotrajnih (short-term) metoda za skrining populacije. Metoda je
standardizovana i izvodi se u mnogim laboratorijama irom sveta.
6

Za test razmene sestrinskih hromatida kod ljudi potreban je uzorak periferne krvi
zapremine 2 mL. Uzorak krvi se od ispitanika uzima venskom punkcijom i koriste se iskljuivo
sterilne tehnike. Duina trajanja testa po jednom ispitaniku od momenta uzimanja uzorka krvi od
ispitanika (zasaivanje, obrada materijala, preparacija, bojenje i analiza) do izdavanja nalaza
iznosi minimum tri nedelje.
Evaluacija dobijenih vri se standardnim statistikim metodama i donose se zakljuci o
eventualnoj izloenosti ispitanika genotoksinim i mutagenim materijama.
Mikronukleus test - Poznato je da se citogenetska oteenja akumuliraju tokom ivota
kod ljudi kao i sa konstantnim izlaganjem oksidativnim oteenjima, hemikalijama I jonizujuem
zraenju (terapijsko ili akcidentalno ozraivanje). Test mikronukleusa je u irokoj upotrebi za
evaluaciju prisustva i obima hromozomskih oteenja kod ljudi izloenih genotoksinim
agensima iz radne i ivotne sredine. Ovaj test predstavlja metodu kojom se limfociti periferne
krvi stimuliu na deobu i inkubiraju kako bi proli dve uzastopne elijske deobe, sa tim da se
prilikom druge deobe spreava podela elijske citoplazme. Tehnika blokiranja citokineze
sprovodi se korienjem citohalazina-B koji spreava deobu citoplazme bez inhibicije jedarne
deobe.

Slika 4. Normalne binuklearne elije za analizu MN frekvence

To omoguava nastanak binukleranih elija. Analizom velikog broja binuklearnih elija
(preko 1000) u nekim od njih se osim postojanja dva jedra mogu uoiti i tvorevine sline jedima,
ali mnogo manjih dimenzija. Ove tvorevine se nazivaju mikronukleusi i predstavljaju odvojene
delove jedarnog materijala obavijene takoe jedarnom membranom, tako da se na preparatu boje
isto kao i normalni elijski nukleusi. Mikronukleusi nastaju od acentrinih hromozomskih
fragmenata ili celih hromozoma, koji nisu sposobni da uestvuju u deobi (da se kreu ka
polovima deobnog vretena tokom mitoze) i zbog toga nisu u sastavu novonastalih jedra kada se
jedarna deoba zavri. Mikronukleusi predstavljaju meru hromozomskih prekida I gubitka
hromozoma i pokazano je da su osetljiv indikator hromozomskog oteenja kao to je to i
klasina analiza metafaznih hromozoma. Kljuna prednost testa mikronukleusa je relativno lako
analiziranje i statistika snaga dobijena od skorovanja velikog broja elija, mnogo veeg uzorka
7

nego to je to sluaj u analizi hromozomskih aberacija. Ako se koristi detekcija centromera u

mikronukleusima (pomou
FISH metode, Fluorescentna In Situ Hibridizacija), mogue je razlikovati mikronukleuse nastale
od hromozomskih prekida od onih nastalih od malsegregacije hromozoma.
Test mikronukleusa
je na neki nain varijacija
testa
hromozomskih
aberacija. Umesto detekcije
abnormalnosti
na
metafazama
hromozomoma,
mikronukleusi se detektuju
nakon prvog elijskog
ciklusa, to omoguava
detekciju aneupolidija, kao i
manji gubitak oteenih
Slika 5. Binuklearne elije sa mikronukleusima
elija nakon prve deobe.
Indukcija mikronukleusa je efikasan biomarker bolesti i procesa povezanih sa indukcijom
oteenja DNK. Frekvencijaa mikronukleusa se poveava kod razliitih hroninih bolesti, zavisi i
od pola, dijete, puenja, konzumiranja alkohola, a takoe se znaajno poveava i sa starou
ispitanika. Test mikronukleusa omoguava pouzdano merenje hromozomskih prekida i gubitaka,
n mnogo laki nain nego analiza hromozomskih aberacija. Potencijal ove metode kao prediktora
tetnih efekata na zdravlje je velik, meutim veza izmeu frekvencije mikronukleusa u
binukleranim elijama i dugoronih biolokih kensekvenci jo uvek nije najjasnija.
Kotana sr - Mogue je kultivisati elije kotane sri kratkotrajno, ali zbog invazivnosti
metode, koristi se samo kod leukemija i to bez PHA (fitohemaglutinina). Fitohemaglutinnin je
lektin ili protein koji vezuje eere. Nalazi se u biljkama, najee mahunarkama.
Oocite - Oocite se kratkotrajno kultiviu u cilju ispitivanja oogeneze ena u generativnom
dobu, nakon hormonske stimulacije (FSH). Lekar aspirira sadraj sekundarnog folikula pod
kontrolom ultrazvunog aparata, a oocite se postave na odgovarajuem medijumu. Njihovom
citogenetikom analizom dobija se karakteristian rezultat- 70 c.o./analiz. el.

Metode dugotrajne kultivacije U okviru ove metode razlikujemo:

Kulture organa - Kultivacije iseaka organa, pri emu se zadrava njihova originalna
arhitektura, a primenjuje se kada je nemogue kultivisati pojedinane elije.
Kulture tkiva sastavljene su od elija jednog ili vie tkiva i rastu na odreenoj podlozi.
Primarne elijske culture, se dobijaju iz tkiva organizma i koriste se u ogranienom roku
nakon njihovog odrastanja.
8

elijske linije Kulture elija koje se gaje u laboratorijskim uslovima

Literatura:
1. D. B. Zimonji, N. Savkovi, M. Anelkovi: Hromozomske aberacije u elijama sisara,
Principi detekcije i evaluacije efekta genotoksinih agenasa, GENOTOKSINI AGENSI,
158-169, 276-299
2. http://mehmedbasic.ba/genetika/citogenetika/