Kromatografija

(tekuinska kromatografija i
elektrokromatografija)

Sadraj
1. Uvod ..1
2. Kromatografija.2
2.1.

Kromatogram....5

2.2.

Teorija tavan (odsjeaka)..................8

2.3.

Kromatografski sustav..................9

2.4.

Kromatografske veliine..11

3. Tekuinska kromatografija.............15
3.1.

Faktori koji utjeu na tekuinsku kromatografiju.21

3.2.

LC-MS

4. Kapilarna elektrokromatografija25
5. Zakljuak
Literatura
Prilog 1.

1. Uvod
U analitikoj praksi analit1 u uzorku treba detektirati ili odrediti u prisustvu drugih
tvari, ako one smetaju moe ih se maskirati2 ili provesti postupak odjeljivanja.
Kromatografske metode odjeljivanja analitiki su vrlo iroko primijenjene. Analit koji treba
odijeliti podvrgnut je ponovljenim razdiobama izmeu dvije faze, nepokretne (stacionarne)
faze koja moe biti vrsta tvar ili tekuina i pokretne (mobilne) faze koja moe biti plin ili
tekuina. Kromatografska metoda podrazumijeva skup kromatografskih postupaka koji
omoguuju odjeljivanje, a potom selektivno i osjetljivo odreivanje sastavnica u
multikomponentnim uzorcima (smjesama), ukljuujui i one gdje su sastavnice kemijski vrlo
sline i prisutne u vrlo niskim koncentracijama. Efikasna viestruka odjeljivanja (slinih
spojeva) mogua su primjenom kromatografskih metoda koje su danas prisutne u 60%
analiza. Kromatografija se temelji na pojavama adsorpcije, razdijeljena, ionske izmjene ili
iskljuenja koje omoguuju odjeljivanje sastojaka iz smjese. Uzorak otopljen u pokretnoj fazi
koja je tekuina, plin ili superkritini fluid kree se preko nepokretne faze koja moe biti u
koloni ili na plohi. Kromatografske metode koriste se za odjeljivanja u kvalitativnoj i
kvantitativnoj analizi, ali i u preparativne svrhe. Ispravnu kvalitativnu i kvantitativnu
kromatografsku analizu mogue je provesti samo uz odgovarajue standarde. Pod unutarnjim
standardom podrazumijevamo spoj poznate koncentracije koji je dodan uzorku i koji je vrlo
esto kemijski srodan analitu. Pod vanjskim standardom podrazumijeva se spoj, najee sam
analit, iz kojeg se prireuju standardne otopine poznate koncentracije koje se mjere odvojeno
od nepoznatog uzorka ali pod jednakim eksperimentalnim uvjetima te slue u svrhu
postavljanja kalibracijske funkcije [6].

Analit ( engl. analyte), sastojak koji se mjeri ili ispituje analitikim postupkom
Maskiranje (engl. masking), vezanje smetnja u matici uzorka u stabilne komplekse ili drugi oblik radi
spreavanja sustavne pogreke
(definicija prema M. Katelan-Maca, Enciklopedijski rjenik analitikog nazivlja, Fakultet kemijskog
inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )
1
2

2. Kromatografija
Instrumentalne metode obuhvaaju veliki broj vrlo raznih metoda i postupaka. Kao to
su spektrometrijske metode koje se baziraju na interakciji uzorka i energije, a kao posljedicu
interakcije mjerimo elektromagnetsko zraenje ili zraenje raznih estica (elektrona, protona i
iona), zatim elektroanalitike metode kod kojih imamo ili signal pobude ili signal odziva (ili
oba) elektrina veliina, radiokemijske metode, termike (toplinske) metode (termometrijske),
metode separacije koje obuhvaaju kromatografiju i elektroforezu.
Kromatografija je postala jedna od najvanijih metoda analitike kemije. Kromatografskim
metodama mogue je razdvojiti dva ili vie slinih sastojaka smjese to je drugim postupcima
prilino teko postii. Prvi rad u kojem je opisan postupak odjeljivanja sastojaka smjese koja
prolazi kroz stupac adsorbensa3, nazvan kromatografijom, objavio je M. Cvet4 1906. godine.
Tek od 1931.godine kada su R. Kuhn i E. Lederer opisali odjeljivanje karotena,
kromatografski postupci se poinju ire primjenjivati. A.J.P.Martin i R.L.M.Synge5(1941.)
prvi su upotrijebili tekuinu kao nepokretnu fazu nanijetu u tankom sloju na podlozi velike
povrine te uz tekuinu kao mobilnu fazu. Uveli su i objasnili pojam razdjelne kromatografije,
uveli teoriju tavana u kromatografiju i 1952. za teoriju razdjelne kromatografije dobili
Nobelovu nagradu. Primjenom plina kao pokretne faze i tekuine kao nepokretne faze otvorili
su A.J.P. Martin i A.T. James 1951. godine novo podruje, plinsku kromatografiju. E.Stahl6 je
1958. opisao mogunost kromatografskog razdvajanja u kojem je adsorbens nanesen u
tankom sloju na staklenu plou-tankoslojnu kromatografiju. Prva knjiga o kromatografiji
objavljena je 1936., prvi plinski kromatograf proizveden je 1952., a instrumentalna tekuinska
kromatografija poela se primjenjivati oko 1965. godine.

Adsorbens (engl.adsorbent), prakasta, koloidna ili porozna vrsta tvar na povrini koje dolazi do adsorpcije;
slui kao nepokretna faza u adsorpcijskoj kromatografiji. (definicija prema M. Katelan-Maca, Enciklopedijski
rjenik analitikog nazivlja, Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )
Mihail Semjonovi Cvet ( Asti, 1872.-Voronje, 1919.), ruski botaniar koji je 1906.godine objavio svoje
iskustvo odjeljivanja obojenih biljnih pigmenata adsorpcijom na kalcijevu karbonatu i tu tehniku nazvao
kromatografijom prema grkome chroma-boja i graphien-pisati
5
Archer John Porter Martin ( London 1910.-Llangarron,2002.) i Richard Laurence Millington Synge
(Liverpool,1914.-Norwich, 1994.)bili su britanski biokemiari, dobili su 1952. godine Nobelovu nagradu za
razvoj razdjelne kromatografije.
6
Egon Stahl ( Eberbach, 1924.- Eberch, 1986.), njemaki kemiar, utemeljitelj tankoslojne kromatografije.
4

Slika 1. Znanstvenici koji su se bavili prouavanjem kromatografije.

Zahvaljujui svojoj irokoj primjenjivosti i uinkovitosti, kromatografija je danas jedna od

najvanijih analitikih tehnika, ija se naela primjenjuju u znanstvenim istraivanjima i
rutinskim analizama uzoraka iz okolia, biomedicinskim ispitivanjima, forenzikoj analizi,
ispitivanju istoe lijekova, praenja reaktanata i produkata organske sinteze itd.
Kromatografski sustav ine nepokretna i pokretna faza te ispitivana tvar koja se tijekom
kromatografskoga procesa nalazi u dinaminoj ravnotei izmeu tih dviju faza. Zbog
naruavanja ravnotenoga stanja ispitivana tvar putuje s pokretnom fazom, zadravajui se s
vremena na vrijeme u nepokretnoj fazi. Da bi dolo do odjeljivanja sastojaka ispitivane
smjese, nepokretna faza mora selektivno i razliito dugo zadravati sastojke smjese. [2]
Kromatografske se tehnike s obzirom na prirodu ravnotee izmeu pokretne i nepokretne faze
mogu podijeliti na:
razdjelna kromatografija, kada se ravnotea uspostavlja izmeu pokretne faze
(tekuine ili fluida u superkritinim uvjetima) i tekuine nepokretne faze vezane na
inertni vrsti nosa
adsorpcijsku kromatografiju u kojoj se ravnotea uspostavlja izmeu tekuine ili plina
u pokretnoj fazi i povrine vrste nepokretne faze, pri emu se ispitivane molekule
izravno veu na povrinu adsorbensa
ionsko-izmjenjivaku kromatografiju u kojoj dolazi do izmjene iona analiziranoga
spoja s ionima nepokretne faze
afinitetnu kromatografiju u kojoj do vezanja dolazi zbog specifinih interakcija
molekula s kemijskim vezanim ligandom na povrini nepokretne faze
3

kromatografiju iskljuenjem po veliini u kojoj je nepokretna faza materijal s porama

definiranih dimenzija i slabo izraenim adsorpcijskim svojstvima, a odjeljivanje
molekula zbiva se zbog razlike u molekulskoj masi i obujmu [1].

Podjela kromatografskih tehnika mogua je i na temelju sastava pokretne faze. Tako je u

plinskoj kromatografiji (GC) pokretna faza inertni plin, u tekuinskoj kromatografiji (LC) to
je tekuina male viskoznosti, a u fluidnoj kromatografiji u superkritinim uvjetima (SFC)
pokretna je faza fluid iznad svoje kritine temperature i tlaka. Nepokretna faza moe biti
tekua ili vrsta. Ako je gusto pakirana u kromatografskom stupcu rije je o kromatografiji u
stupcu, a ako je kao tanki homogeni film nanesena na inertnu podlogu ili je podloga
specijalno pripremljen papir, govorimo o plonoj kromatografiji koju predstavljaju
tankoslojna kromatografija (TLC) i kromatografija na papiru (PC).
U tekuinsku kromatografiju svrstavamo tankoslojnu kromatografiju (TLC), tekuinsku
kromatografiju visoke djelotvornosti (HPLC), kromatografiju ultravisoke djelotvornosti
(UHLPC), ionsku kromatografiju (IC) i kromatografiju iskljuenjem po veliini (SEC).

imbenici koji utjeu na kromatografski proces su:

energetska barijera
veliina i geometrijski oblik zrna sorbensa koji tvori nepokretnu fazu
temperatura sustava
brzina pokretne faze
priroda veze
koliina ispitivanog spoja [4].

2.1.

Kromatogram

Kromatogram ( engl. chromatogram ) grafiki prikaz odnosa koncentracije ili mase

analita prema obujmu eluata ili vremenu kromatografiranja tijekom kromatografskoga
procesa; u plonoj kromatografiji pojam kromatogram se odnosi na papir ili tanki sloj na
kojem su vidljive razluene kromatografske zone [10]. Proces u kojem se kromatografirana
tvar uravnoteuje izmeu pokretne i nepokretne faze naziva se kromatografsko razvijanje. S
obzirom na kromatografski sustav razvijati se moe ispiranjem (eluiranjem), zamjenom i
frontalnom analizom. U kromatografiji u stupcu danas je uglavnom rije o razvijanju
ispiranjem pri emu se razlueni sastojci detektiraju pri izlazu iz stupca. Kromatogram je
zapis analitikog signala u ovisnosti o vremenu razvijanja ili obujmu eluata7,te informacija o
uspjenosti separacije sadrana je u kromatogramu, na temelju broja opaenih
koncentracijskih profila moe se zakljuiti o sloenosti ispitivanog uzorka. Poloaj mrlje ili
odreene kromatografske krivulje pomae u odreivanju kvalitativnog sastava uzorka dok
povrina kromatografskih krivulja, odnosno njezine visine, vrh , moe se dobiti kvantitativna
procjena [2].
S obzirom na nain razvijanja razlikujemo plone i diferencijalne kromatograme (Slika 2.). U
plonim kromatogramima sastojci uzorka prelaze razliite udaljenosti u istome vremenu pa se
oni po zavretku odjeljivanja detektiraju na nepokretnoj fazi. Kromatografijom na stupcu
dobivaju se diferencijalni kromatogrami. Svi sastojci prelaze isti put, ali se zbog specifinih
interakcija s nepokretnom fazom, na izlazu iz stupca pojavljuju i detektiraju u razliitim
vremenima. U analizi uzoraka iz okolia kromatografija na stupcu zastupljenija je od plone
kromatografije [1].

Eluat ( engl. eluate), otopina sastojaka nakon izlaska iz kromatografskog ili ekstrakcijskog stupca.
Eluens (engl. eluent), sredstvo za eluiranje.
Eluiranje (eng. elution), ispiranje zadranog sastojaka iz kromatografskog ili ekstrakcijskog stupca prikladnim
otapalom.
Eluit (engl.eluite), eluirani analit.
(definicije prema M. Katelan-Maca, Enciklopedijski rjenik analitikog nazivlja, Fakultet kemijskog
inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )

Slika 2. Tipian kromatogram

I.A- ispis dobiven diferencijalnim detektorom
IB.-ispis dobiven integralnim detektorom
( preuzeto iz http://issuu.com/hinus/docs/kroma_11str_obr )

Slika 3. Kalibracijski kromatogram anserina i kranozina koncentracije

25 mg/L,

50mg/L i

6,25 mg/L,

12,5 mg/L

100 mg/L dobiven uz pomo fluorescentnog (RF-20A)

detektora
6

Slika 4. Prikaz kalibracijske krivulje za anserin

2.2.

Teorija tavana (odsjeaka)

A. J. P. Martin i R. L. M. Synge (engleski znanstvenici), 1952. godine, dobili su Nobelovu

nagradu za doprinos razvitku suvremene kromatografije. U teorijskim razmatranjima
primijetili su model razvijen ranih 1920.-tih godina, kojim je objanjeno odjeljivanje na
kolonama za frakcijsku destilaciju. Kolone za frakcijsku destilaciju, koje su se najprije
upotrebljavale u naftnoj industriji za odjeljivanje ugljikovodika, sastoje se od velikog broja
tavana na kojima se uspostavlja ravnotea izmeu pare i tekuine pri radu kolone u uvjetima
reflektiranja. Djelotvornost kolone, kao ureaja za odjeljivanje, izravno je povezana s brojem
tavana po jedinici duljine kolone.
Martin i Synge promatrali su kromatografsku kolonu kao da je napravljena od dugakog niza
tavana unutar kojega uvijek prevladavaju ravnoteni uvjeti. Model tavana (odsjeaka)
pogodan je za tumaenje Gaussova oblika kromatografskog vrha. On uzima u obzir i veliine
koje utjeu na razliitost brzina gibanja analiziranih sastojaka. U svakom tavanu doi e do
uravnoteenja u razdiobi kromatografiranih komponenata izmeu pokretne i nepokretne faze.
Meutim, taj model ne objanjava irenje zone eluiranog sastojka zbog osnovne pretpostavke
da tijekom eluacije ravnoteni uvjeti prevladavaju du cijele kolone. U dinamikom stanju
koje vlada u kromatografskoj koloni, faze se jedna prema drugoj pomiu tako da ne ostavljaju
dovoljno vremena za uspostavljanje ravnotee. Budui da je model tavana (odsjeaka) vrlo
manjkav prikaz kromatografske kolone, treba izbjegavati svako stvarno i imaginarno davanje
vanosti izrazima tavan i visina tavana i te izraze treba promatrati kao oznake za
djelotvornost kolone zadrane samo zbog povijesnog razloga. Ti pojmovi nemaju fizikalnu
vanost. Na nesreu, oba su pojma udomaena u kromatografskoj literaturi pa je teko
oekivati njihovu zamjenu primjerenijim pojmovima [3].
Broj teorijskih tavana (odsjeaka) predstavlja broj pseudoravnotea ili faznih prijelaza
postignut na odreenoj koloni, a zadan je izrazom N= 16(tR/Wb)2, pri emu je Wb irina vrha
u osnovici (Slika 5.). Djelotvornost kromatografske kolone poveava se poveanjem broja
teorijskih tavana (odsjeaka) [5].

Slika 5. Nain raunanja broja teorijskih tavana (odsjeaka) N ( preuzeto iz M.

Cindri, A. Markovi, A. Horvati, Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar
masa: osnove metodologije i primjene, Medicina, 45 (3) (2009) 220)

2.3.

Kromatografski sustav

Separacija se ostvaruje selektivnom distribucijom komponenta izmeu pokretne i

nepokretne faze. No postoje brojni faktori koji se odnose na fizikalno-kemijska svojstva
pokretne i nepokretne faze te analita, a kontroliraju razne interakcije izmeu analita i ove
dvije faze. Brojnost moguih interakcija izmeu analita i nepokretne faze (adsorbensa) ovisi o
veliini estica nepokretne faze tj. to je vea povrina nepokretne faze vei je broj
interakcija. Nepokretna faza s velikom povrinom moe osigurati bolju separaciju [12].
Kromatografska odjeljivanja se temelje na razliitoj razdiobi sastojaka izmeu pokretne i
nepokretne faze [9].
Analit pokretna Analit nepokretna
Raspodjela uzorka izmeu dviju faza odreena je konstantom ravnotee, a naziva se jo i
koeficijentom raspodjele (distribucije), K. Ravnotea je dinamiki proces, a molekule
komponenata prelaze iz jedne u drugu fazu tako da se u prosjeku njihove koncentracije
ravnaju prema zakonu raspodjele (Jednadba 1.):
K=

(1)

gdje su cS i cM koncentracije analita u nepokretnoj i pokretnoj fazi

Konstanta ravnotee ovisna je o kemijskim svojstvima sustava [13]. Kao to je spomenuto,
kromatografski sustav ini uzorak koji analiziramo te pokretna i nepokretna faza. Budui da
su molekule analita zadrane interakcijama s povrinom nepokretne faze, separacija se temelji
uglavnom na razlici afiniteta adsorpcije molekula analita prema povrini nepokretne faze [12].
Zato treba pridodati posebnu pozornost izboru nepokretnih i pokretnih faza jer o njihovom
izboru ovisi uinkovitost kromatografskog odjeljivanja. Nepokretna faza je vrsta tvar ili
kapljevina na inertnom nosau.
S obzirom na kemijsku strukturu i polarnost, sorbensi8 se dijele:
-

na polarne anorganske (hidrofilne) sorbense, kojima su predstavnici silikagel,

aluminijev oksid i magnezijev silikat

na nepolarne anorgnaske sorbense kao to su aktivni ugljen i grafit

na polarne vezane faze, npr. aminopropil, cijanopropil, diol

na nepolarne vezane faze, poput alkana C8 i C18 ugljikovodika

na polarne organske sorbense kojih su predstavnici celuloza, hitin, poliamid [2].

S obzirom na sposobnost tvorbe vodikove veze, otapala su podijeljena na pet skupina:

1. tekuine kojima su molekule meusobno povezane viestrukim vodikovim vezama
(voda, glicerol, aminoalkoholi, etilenglikol i sl.),
2. tekuine kojima su molekule povezane vodikovom vezom i koje mogu tvoriti
vodikovu vezu s molekulama ispitivanog spoja ( alkoholi, fenoli, amini),
3. tekuine kojima molekule sadre atome kisika, koji mogu imati udjela u vodikovoj
vezi, ali ne sadre atome vodika (ketoni, eteri, esteri, aldehidi),
4. tekuine kojima molekule sadre atom vodika, koji moe tvoriti vodikovu vezu, ali ne
sadri odgovarajue atome koji bi mogli imati udjela u vezi ( kloroform, diklormetan)
5. ostale tekuine kojima molekule mogu tvoriti vodikovu vezu [2].

Sorbensi (engl. sorbent), tvari koje veu druge tvari fizikalnim i kemijskim silama, a mogu biti polarni i
nepolarni. (definicija prema M. Katelan-Maca, Enciklopedijski rjenik analitikog nazivlja, Fakultet kemijskog
inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )

10

2.4.

Kromatografske veliine

Za svaki analit na svakoj koloni oitavani su karakteristine veliine kromatografske

krivulje.
Tablica 1. Prikaz kromatografskih veliina (tablica preuzeta iz D. A. Skoog, D. M. West, F. J.
Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb (1999) 669)
Naziv

Oznaka za eksperimentalnu
veliinu [mjerna jedinica]

Vrijeme kretanja
nezadranog spoja
Vrijeme zadravanja,
sastojka A i B

tM [s]
(t-engl.time)

(tR)A, (tR)B [s]

(, )A [s]

Prilagoeno/ispravljeno vrijeme
zadravanja

{(t,R )A= (tR)A -tM}

irina vrhova, sastojka A i B

WA i WB [s]
(W-engl.width)

L [cm]

Duljina punila kolone

(L-engl-leght)

F [mL/min]

Brzina protoka
Volumen pokretne i nepokretne
faze
Koncentracija sastojaka u
pokretnoj i nepokretnoj fazi

(F-engl.flow)

VM i VS [ml]
(S-engl.stacionary, M-engl.mobile)

Mi S
(S-engl.stacionary, M-engl.mobile)

Vrijeme kretanja nezadranog spoja (tM), ili mrtvo vrijeme, je vrijeme koje je potrebno da
sastojak koji se ne zadrava u koloni proe kroz kolonu, to su uzorci ije su molekule vee od
najveih pora estica gela.
Vrijeme zadravanja (tR) je vrijeme od unoenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u
detektoru smjetenome na izlazu kromatografske kolone.
Prilagoeno vrijeme zadravanja (, ) je ukupno vrijeme zadravanja umanjeno za vrijeme
zadravanja nezadranog sastojka.

11

Slika 6. Tipini kromatogram smjese koja sadri dva sastojka. Mali pik s lijeve strane
predstavlja sastojak koji se ne zadrava u koloni pa u detektoru dospijeva gotovo neposredno
nakon poetka eluacije. Dakle, vrijeme zadravanja tM je priblino jednakom vremenu
potrebnome da molekule mobilne faze prou kroz kolonu. (preuzeto iz D. A. Skoog, D. M.
West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb (1999) 649)

Tablica 2. Prikaz izraunavanja kromatografskih veliina (tablica preuzeta iz D. A. Skoog,

D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb (1999) 669)
Veza s ostalim
veliinama

Linearna brzina mobilne faze

Izraunavanje
izvedenih veliina
u=

Volumen pokretne faze

VM= tMF

Faktor kapaciteta

, = (tR-tM)/tM

Naziv

Razluivanje

( )

2[( ) ( ) ]
+

N=16( )2

Visina tavana (odsjeaka)

H=

= =

=( )
RS=

K=

Broj tavana (odsjeaka)

Vrijeme zadravanja

,=

K=

Koeficijent raspodjele
Koeficijent selektivnosti

1
)(
, )

1+

RS= 4 (

N=162(

,
1 2
)
(
, )

1+

/
,

( )B=

162 1 2( )3
( ) ( , )2

12

Faktor kapaciteta (k,) parametar s kojim se opisuje brzina gibanja analita u koloni. Kada je k,
manji od 1,eluacija je tako brza da je teko oitati njegovo vrijeme zadravanja. Kada je k ,
vei od 20 do 30 tada je eluacija preduga, najoptimalniji k, za analite u smjesi iznosi 1 i 5.
Mijenjanjem k, u tekuinskoj kromatografiji poboljava se odjeljivanje, a to se postie
mijenjanjem sastava nepokretne i pokretne faze.
Razluivanje9 kromatografskih krivulja (Rs) (Slika 7.) je kvantitativna mjera kojom se
izraava sposobnost odjeljivanja dvaju analita na koloni. Razluivanje za odreenu
stacionarnu fazu moe se poboljati produivanjem kolone, ime se poveava broj teorijskih
tavana (odsjeaka). Nepogodnost pri poveanju broja tavana (odsjeaka) jest produenju
vremena koje je potrebno za postizanje boljeg razluivanja. Izraeno je pomou prosjeka
irina njihovih osnovica (tR2>tR1).
Djelotvornost kromatografske kolone ili irenje povrine zone pokazuje uinkovitost
kromatografske separacije moe se kvantitativno izraziti :
Broj tavana (odsjeaka) (N) (Slika 5.) je broj koji oznaava djelotvornost kolone, a
izraunava se pomou gore navedene jednadbe.
Visina tavana (odsjeaka) (H) je duljina kolone podijeljena s brojem tavana.
Kolona je djelotvorna kada je H mali, a N veliki.
Linearna brzina pokretne faze () se izraunava dijeljenjem duljine kolone (L) s vremenom
zadravanja spoja koji kroz kolonu prolazi bez zadravanja (tM).
Koeficijent selektivnosti () neke kromatografske kolone izraunat za dva razliita analita
pokazuje kako e dobro ta kromatografska kolona odijeliti te sastojke, uvijek >1.

Razluivanje (engl. resolution), najmanja promjena mjerene veliine koja pokazuje zamjetnu promjenu u
odgovarajuem pokazivanju. (definicija prema M. Katelan-Maca, Enciklopedijski rjenik analitikog nazivlja,
Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014) )

13

Slika 7. Primjeri razliito razluenih pikova i osnovnih

veliina koje se koriste u izraunu N, Rs (na slici R), i k te irina vrhova (WA i WB). Na slici
je vidljivo razluivanje od 1,5 omoguuje potpuno odjeljivanje sastojaka A i B, a razluivanje
od 0,75 to ne omoguuje. Uz razluivanje od 1,0 zona A sadri otprilike 4% B, a zona B
sadri priblino 4% A. Uz razluivanje od 1,5 preklapanje iznosi otprilike 0,3%. (preuzeto iz
D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb
(1999) 663)

14

3. Tekuinska kromatografija
U tekuinskoj kromatografiji pokretna faza je kapljevina, a nepokretnu fazu mogu
initi razliiti sorbensi. Izbor pogodnog otapala, odnosno smjese otapala, provodi se s
obzirom na sposobnost otapala da stvaraju vodikove veze (odjeljivanje hidrofilnih, odnosno
hidrofobnih spojeva). Otapala moraju biti kromatografski ista, ta znai da ne smiju
sadravati

neistoe

koje

mogu

smetati

kromatografskom

odreivanju.

Vrlo su velike mogunosti uporabe tekuinske kromatografije za odjeljivanje polarnih i

nepolarnih spojeva. U posljednja dva desetljea ta se tehnika naglo razvila zbog mogunosti
utjecanja na uinkovitost separacije modificiranjem nepokretne i pokretne faze [2].
Izbor nepokretne faze je uvjetovan vrstom veze koja nastaje izmeu ispitivanog spoja i
kromatografske podloge, prirodom ravnotee kromatografskog procesa, prirodom ravnotee
kromatografskog procesa te ponajprije prirodom ispitivanog spoja.
Silikagel je u tekuinskoj kromatografiji stacionarna faza koja se najee upotrebljava za
separaciju prirodnih produkata i moe biti komercijalno dostupna u vie oblika. Povrina
silikagela je blago kisela, pa stoga postoji tenja k preferiranoj adsorpciji jako bazinih
supstancija u odnosu prema adsorpciji na neutralni ili bazini adsorbens [12] (Slika 8.).

Slika 8. Strukturna graa silikagela ( opa formula je SiO2H2O), adsorpcijska svojstva

silikagela ovise o broju, poloaju i meusobnom odnosu hidroksilih skupina na povrini
silikagela. (preuzeto iz M. Katelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, kolska
knjiga, Zagreb (2003) 232)

15

Kako bi se s obzirom na izbor nepokretne faze omoguio optimalan kromatografski sustav za

odjeljivanje eljene smjese, treba izabrati pogodan sustav otapala koji ine pokretnu fazu.
Intermolekulske interakcije Van der Waalsovim silama, veze diplo-inducirani dipol, dipoldipol te vodikova veza najee su u tekuinskoj kromatografiji normalnih faza (NPLC, engl.
Normal Phase Liquid Chromatography) i obrnutih faza (RPLC, engl. Reversed Phase Liquid
Chromatography).
Kromatografija normalnih faza: nepokretna faza (najee silikagel, a katkad Al2O3) je
polarna, a pokretna nepolarna (sustav organskih otapala u kojemu se prema potrebi dodaje
voda ili elektrolit radi podeavanja polarnosti). Odjeljivanje smjese u tome sluaju ovisi o
interakciji polarnog analita s polarnom nepokretnom fazom. No treba naglasiti da se
homologni ili izomerni spojeva ne mogu odjeliti (npr. nepolarni ugljikovodici bez polarnih
skupina, u tom sluaju vrlo slabo reagiraju s nepokretnom fazom). Interakcije polarnih
skupina u analitu (npr. hidroksi, keto, amino, amido, ester, eter ili merkapto) i polarna strana
povrine dominiraju mehanizmom retencije. Polarne i kisele silanolne skupine podlijeu
dipolnim i vodikovim vezama i kiselo-baznim interakcijama [12].
Kromatografija obrnutih faza: nepokretna faza je nepolarna, a pokretna faza polarna.
Mehanizam odjeljivanja smjese se temelji na hidrofobnosti analita. Materijali od kojeg je
veinom izraena nepokretna faza je alkilno modificirani silikagel te polistiren-divinilbenzen
(PS-DVB) polimeri (alkilni ligandi vezani na aromatske prstenove). Pokretake sile za
ostvarivanje retencije jesu: disprezivne interakcije izmeu nepolarnih liganada s povrine i
nepolarnih komponenata u analitu, te "hidrofobni efekt", tj, nastojanje da se minimizira
naruavanje strukture vode [12]. Stoga je velika primjena RPLC-a u razdvajanju homolognih
izomernih spojeva sline polarnosti, ali i onih vrlo polarnih i ioniziranih spojeva.
Silikagel je temeljna nepokretna faza, no zbog smanjivanja njegove polarne moi treba ga
modificirati, pa se na povrinu silikagela veu alkilne i arilne skupine, amino, cijano, nitro ili
diolne skupine te kiralni dodatci [6]. Treba jo naglasiti da je silikgel, nepokretne faze,
nestabilan izvan 2,5-8 pH.
Pokretna faza je smjesa i

polarnog organskog otapala

(metanola, acetonitrlila,

tetrahidrofurana), izbor otapala ovisi o njegovoj moi eluiranja analita (povezana s

viskoznosti, dielektrinoj konstanti, proton-akceptor te proton donorima) [6].

16

Tekuinska kromatografija se moe provoditi u zatvorenom ili otvorenom sustavu, tj. stupcu
ili na kromatografskoj ploi [1].
Osnovni konstrukcijski dijelovi tekuinskog kromatografa visoke djelotvornosti su spremnici
za otapala pokretne faze, crpka, injektor, po mogunosti predkolona, kolona i detektor
(Slika 9.). Crpka ubacuje pokretnu fazu u stupac pod visokim tlakom stalnom brzinom
(0,1-10mL/min), a uzorak se automatski dodavanjem unosi u sustav za injektiranje, tzv. petlju
(obujam 5-500 L) u kojoj se odrava tlak. Otapalo prolazi kroz injektor te nosi uzorak u
kolonu (moe biti runo ili automatsko unoenje, autosampler), mora se paziti da se ne
oteti kolona) koja je obino cijev od nehrajuega elika, duljine 50-250 mm, unutarnjeg
promjera 2-4,6 mm, punjena esticama veliine 1,7-5 m, a najee 4 ili 5 m. Za
produljenje kolone dobro je rabiti predkolone tzv. guard kolona kojoj je glavna uloga
odravanje analitike kolone u to duljem i boljem radu (uklanjajui smetnje).
Kolone najee nose oznake po vrsti nepokretne faze (C18, C8, C4, NH2, Ph-NH2, CN,
grafitna, SiO2 , gel-propusna itd.). Pri razvoju tekuinske kromatografije najprije su se
upotrebljavala anorganska punila, a razvojem metode organska punila. Punila kolone moraju
udovoljavati odreenim zahtjevima: moraju imati otpornost prema visokim tlakovima koji se
stvaraju u koloni, otpornosti prema organskim otapalima i kemikalijama koje su
upotrijebljene u kromatografiji te prikladnosti za usitnjavanje do vrlo malih estica (za HPLC
do 3 m)
Pokretna faza u tekuinskoj kromatografiji je tekuina: voda, organska otapala i puferi. Sva
otapala koja se rabe u tekuinskoj kromatografiji moraju udovoljavati strogim zahtjevima:
moraju biti savreno ista
ne smiju biti tetna
moraju biti kompatibilna s detektorom i relativno ne reaktivna
moraju moi otopiti uzorak.
Prema temeljnim svojstvima detektori mogu biti osjetljivi na koncentraciju (odgovor je
detektora proporcionalan koncentraciji komponente uzorka) i masu (odgovor je detektora
proporcionalan masi komponente uzorka).
Vani detektori su spektometar masa, spektrofotometrijski detektori u UV-VIS podruju
elektromagnetskog zraenja, detektori na osnovi molekulske fluorescencije, indeksa loma
(Slika 10.), oni koji se temelje na rasprenju elektromagnetskog zraenja na isparenom uzorku
17

(Slika 11.), te elektrokemijski detektori (konduktometrijski na slici 12. i amperometrijski na

slici 13.). Detektori mogu pratiti vane znaajke pokretne faze ili otopljene tvari. U prvome
sluaju mjeri se indeks loma il provodnosti, pa se otopljeni analit dokazuje neizravan iz
promjene tih veliina. U drugome se sluaju prate karakteristike otopljene tvari (apsorpcija u
UV/VIS ili IR podruju, fluorescencija ili struja na elektrodi) [1].
Vrlo dobri detektori su spektometri s diodnim nizom koji omoguuju snimanje spektra
eluiranih sastojka u UV/VIS podruju. Apsorbancija se prikazuje u ovisnosti o vremenu
zadravanja i o valnoj duljini (Slika 14.) [1].

Slika 9. Shematski prikaz HPLC kromatografa (preuzeto iz M. Katelan-Macan, M. Petrovi

(urednice), Analitika okolia, HINUS i Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013)
211)

18

Slika 10. Refraktometar (preuzeto iz M. Katelan-Macan, M. Petrovi (urednice), Analitika

okolia, HINUS i Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013) 211)

Slika 11. ELS (engl. evaporative light scattering) detektor(preuzeto iz M. Katelan-Macan,

M. Petrovi (urednice), Analitika okolia, HINUS i Fakultet kemijskog inenjerstva i
tehnologija (2013) 212)

19

Slika 12. Konduktometrijski detektor (preuzeto iz M. Katelan-Macan, M. Petrovi

(urednice), Analitika okolia, HINUS i Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013)
212)

Slika 13. Amperometrijski detektor(preuzeto iz M. Katelan-Macan, M. Petrovi (urednice),

Analitika okolia, HINUS i Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013) 213)

20

3.1.

Faktori koji utjeu na tekuinsku kromatografiju

Kao kod svake kromatografske metode tako i kod tekuinske kromatografije, najvei dio
vremena ak oko 60 % odlazi na pripremanje uzorka (homogenizacija, centrifugiranje,
precipitacija, hidroliza, filtracija itd.). Zatim moramo predvidjeti faktore koji e utjecati na
kromatografski proces. U tekuinskoj kromatografiji na kromatografski proces utjeu:
energetska barijera (Slika 14.),da bi molekule prele iz jedne faze u drugu potrebna im
je odreena koliine energije, energija koja ima je potrebna da preskoe energetsku
barijeru izmeu faza. Vjerojatnost da pojedina molekula iz promatranog skupa u
promatranom vremenskom intervalu nadmai energetsku barijeru E moe se
prikazati jednadbom 2:
p=

(2)

prijelaz pojedine molekule iz nepokretne faze u pokretnu fazu dogaa se onda kada se
ona oslobodi veze u nepokretnoj fazi te obratno. Molekula e lake prelaziti
energetsku barijeru ako se nalazi u pokretnoj fazi jer je ta veza puno slabija nego veza
molekule i nepokretne faze.

Slika 14. Shematski prikaz energetskog stanja molekula u nepokretnoj fazi i pokretnoj fazi:
Em-osnovno energetsko stanje u pokretnoj fazi, Es-osnovno energetsko stanje u nepokretnoj
fazi (preuzeto iz M. Katelan-Macan, M. Petrovi (urednice), Analitika okolia, HINUS i
Fakultet kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013) 227)
21

Uspjenost odjeljivanja smjese, u kojoj se nalaze spojevi A i B, tijekom kromatografskog

procesa ovisi o to veem omjeru razlika njihovih energetskih stanja kao to je prikazan
jednadbom 3.:

(3)

te to veem broju teorijskih odsjeaka N, prema jednadbi 4.:

N=(

)2(RF-2 )

(4)

L- prijeeni put otapala

- standardno odstupanje
R

F-

omjer puta koji je tijekom kromatografskog procesa prela ispitivana tvar i puta otapala
temperatura utjee na odjeljivanju u tekuinskoj kromatografiji, s povienjem
temperature sustava poveava se difuzija, a poveanjem difuzije dolazi do poveanja
disperzije ispitivanih molekula [9].

Slika 15. Slika prikazuje kromatogram smjese od tri razliita sastojaka gdje se vidi utjecaj
temperature na ravnoteni pomak i retencijsko vrijeme (preuzeto iz K. A. Rubinson, J. F.
Rubinson, Contemporary Instrumental Analysis, Prentice Hall (2000) 650)

22

veliina i oblik estica nepokretne faze utjee na tekuinsku kromatografiju te najbolju

iliti optimalnu veliinu zrna nepokretne faze treba se nai eksperimentalnim putem.
Manja zrnca imaju veu aktivnu povrinu te proces uravnoteenja pribliava idealnom.
Dok vea zrnca imaju manju aktivnu povrinu, ali omoguavaju bri protok pokretne
faze.
priroda veze analita s nepokretnom fazom takoer je bitan faktor u tekuinskoj
kromatografiji, ako je veza prevrsta kromatografske mrlje su razvuene, no ako je
preslaba nema kromatografskog fenomena i analit putuje pokretnom fazom.
koliinu analita moram unaprijed odrediti jer utjee na disperziju10 skupa molekula u
analitu, idealno bi bilo beskonano razrjeenje to nije, realno, mogue.
kapilarnost je pojava podizanja ili sputanja razine tekuina uz rub uskih cijevi
(kapilara) uzrokovana silama adhezije11 i kohezije12. U uskim cijevima, gdje je
povrina tekuine velika prema volumenu tekuine, vrijednosti povrinskih sila i
gravitacije postaju usporedive i razina tekuine u cijevi moe se podizati (kapilarna
elevacija) ili sputati (kapilarna depresija). Tekuina koja moi stjenke kapilare
(adhezija vea od kohezije, npr. voda u staklenoj posudi) podizat e se, a tekuina koja
ne moi stjenke kapilare (kohezija vea od adhezije, npr. iva u staklenoj posudi)
sputat e se [23].

Disperzija (rasprenost) (engl. dispersion)

Adhezija (lat. adhaesio), pojava meusobnog privlaenja povrina dvaju tijela nainjenih od razliitih tvari, ili
tijela i tekuine, zbog djelovanja elektromagnetskih sila meu molekulama. Privlane sile kratka su dosega, a
vrijednost im ovisi o vrsti tvari u dodiru. Prianjanje je izraenije ako je jedna od tvari tekuina.
12
Kohezija (lat. cohaerere: prianjati, biti povezan), privlana meuatomska ili meumolekularna sila koja
djeluje izmeu susjednih estica tvari. Najjaa je u tvarima koje su u vrstom stanju, slabija u tekuinama, a
najslabija u realnim plinovima
10
11

23

3.2.

LC-MS

Brojni autori su pisali o tandemu tekuinske kromatografije i spektrometrije masa

(LC-MS) kao najvei napredak u analitikoj kemiji u posljednjem desetljeu i kao brzo i
selektivno odreivanje mnotva spojeva u biolokim uzorcima. LC/MS postao je nezamjenjiv
alat u brojnim poljima istraivanja. Prua rjeenja visoke pouzdanosti, produktivnosti i
osjetljivosti, koja su traena u podrujima farmaceutske, prehrambene i kemijske industrije i
analize okolia. Tekuinska kromatografija i spektrometrija masa do prije dvadesetak godina
bile su dvije potpuno odvojene tehnike. Sedamdesetih i osamdesetih godina, meutim, dolo
je do povezivanja LC-a i MS-a na podrujima mehanizama desorpcije, otparavanja i
ionizacije analita u tekuoj fazi, ionizacije pri atmosferskom tlaku i povezivanja ionizatora i
analizatora, to je predstavljalo ogroman iskorak k rutinskoj upotrebi tzv. vezanog sustava
LC-MS [5].

24

4. Kapilarna elektrokromatografija
Kapilarna elektrokromatografija, CEC (engl. capillary electrocromatography) je
hibrid kapilarne elektroforeze i HPLC-a koji omoguava razdvajanje i nabijenih i nenabijenih
vrsta [19]. Moemo rei da se ova metoda temelji na dva naela: elektromigracija
(elektroosmozu i elektroforezu) , te naelo kromatografije (razdioba analita izmeu dvije
faze) [17]. Metoda se razvila 1980.-tih godina no veu pozornost dobiva tek posljednjih
godina. Odjeljivanje analita, koji se nalaze u kapilarnoj koloni, temelji se na njihovom
odjeljivanju izmeu nepokretne faze i eluenta. Ono to je specifino za ovu tehniku je da tu
separaciju pokree elektroosmotski tok, EOF (engl. electroosmotics flow), koji doprinosi
boljoj rezoluciji i boljoj separaciji nego kod HPLC-a [20]. Metoda je vrlo uinkovita u
odjeljivanju nenabijenih estica (kao kod HPLC-a) na mikro-koliinama uzorka bez potrebe
za pumpama koje rade pod visokim tlakom (kao kod kapilarne elektroforeze). Veliki
nedostatak ove metode je to visoki napon moe prouzroiti pregrijavanje (self heating)
gdje u veini sluajeva dolazi do stvaranja mjehura koji dovodi do isuivanja kolone i prekida
struje. Ovaj nedostatak CEC-a svodimo na minimum tako da smanjujemo promjer kapilare,
jer je ta toplina upravo proporcionalna kvadratu promjera kapilare [14]. Kapilare su nainjene
od tzv.frit stakla i pune se najee s materijalima kao u HPLC-u i HPLC-u (C18 i C8
ugljikovodici /3m i 5m) [17].
Koristei ovu metode trebamo pripaziti da:
-

uzorke uvijek moramo profiltrirati radi otklanjanja neotopljenih dijelova koji bi mogli
sprijeiti prohodnost kapilare

uzorci bi trebali biti otopljeni u mobilnoj fazi

pomno odabrati pH pufera

kada je god mogue koristiti prirodne pufere, jer e prouzroiti niu struju, a time
analit moe biti vee koncentracije (jer tada smanjuje opasnost od pregrijavanja)

zbog krhkosti kapilara trebaju uvijek biti pravilno skladitene

25

Slika 16. Prikaz tri razliita naina kapilara, koje su punjene sa silikagelom (preuzeto iz M.
Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless capillary electrochromatography,
Electrophoresis 20 (1999) 44)

Slika 17. Primjer elektrokromatograma (kapilara:25.2/33.7 cm,75mm ID; nepokretna faza:3

mm Grom-Sil ODS-0 AB; pokretne faza: acetonitril/13M trifluoroctena kiselina u omjeru
60:4 ,pH =3.5; napon=15 kV; injektiranje= 5 kV, 6 s;tlak=8 bar; uzorak:2.4 M, koji se
otapa u pokretnoj fazi. (preuzeto iz M. Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless
capillary electrochromatography, Electrophoresis 20 (1999) 45)

26

EOF je uzrokovan Kulonovom silom induciranom elektrinim poljem koje djeluje na nabijene
estice dok se gibaju u otopini. Kemijska ravnotea izmeu vrste povrine i otopine
elektrolita uglavnom dovodi do stvaranja naboja iznad povrine, tj. sloj pokretnih iona koji se
naziva dvostruki sloj ili Debye-ev sloj. Kada se pusti elektrino polje tada dolazi do kretanja
nabijenih estica iz dvostrukog sloja zbog rezultirajue Kulonove sile, tj. dolazi do kretanja
otopine u kapilari koje je uzrokovano elektrinim poljem. Protok koji se javlja se naziva EOF.
Uzrokovan je primjenom separacijskog potencijala te gura nabijene estice [16] (Slika 18.).

Slika 18. Prikaz elektroosmotskog toka i estica koje se gibaju u separacijskom kanalu pod
utjecajem elektroosmotskog toka, od anode prema katodi (preuzeto iz C. S. Henry, Microchips
capillary electophoresis, Humana Press, New Yersey, 2006.)

27

Slika 19. Prikaz puta nabijenih estica u kapilarnoj elektrokromatografiji (K. D. Bartle, P.
Myers, Theory of capillary electrochromatography, Journal of Chromatography A, 916
(2001) 6)

Dva imbenika kontroliraju EOF, to je jakost elektrinog polja i dvostruki sloj. Od ta dva
imbenika pri mjerenju je najlake kontrolirati jakost elektrinog polja, dok je dvostruki sloj
puno tee kontrolirati, ali on je openito reduciran ako se ionska jakost poveava, a pH
smanjuje. to je dvostruki sloj vei, protok je slabiji. Brzina EOF-a (izraena kao EOF
mobilnost) ovisi o brojnim parametrima poput pH pufera, ionske jakosti pufera, temperature,
intenziteta elektrinog polja i prisutnosti nekih aditiva. Zaustavljanje ili promjena smjera
EOF-a postie se modifikacijama stjenki kapilare, trajnim ili privremenim modifikacijama
[22].
Tokom analize, nabijene molekule putuju brzinom koju odreuje brzina elektroosmotskog
toka. Brzina kretanja pozitivno nabijenih iona se poveava, a negativnih smanjuje. Ukupna
mobilnost () supstanci u kapilari predstavlja sumu elektroforetske (EOF, zavisi od odnosa
m/z) i elektroosmotske mobilnosti (EOS). Elektroosmotska mobilnost predstavljena je
izrazom:

28

(5)

gdje su - gustoa naboja na povrini kapilare, - debljina dvostrukog elektrinog sloja, viskoznost otopina, - dielektrina konstanta pufera i - elektrini potencijal na povrini
kapilare. Brzina kretanja otopine pod utjecajem elektroosmoze na razmaku x od zida kapilare
zavisi od elektroosmotske mobilnosti i jaine primijenjenog elektrinog polja (E):

v x EOF E

(6)

te je brzina samog analita odreena umnokom njegove mobilnosti sa EOF-om i jakosti

elektrinog polja, kao to se vidi iz izraza:

v analita e EOF E

(4)

gdje je v - brzina analita, e - elektroforetska mobilnost analita, EOF - elektroosmotski tok te

E - jakost elektrinog polja.

29

Zakljuak
U razvoju kromatografskih metoda, jedan od prioritetnih ciljeva je definirati uvjete za
postizanje najboljeg odjeljivanja svi sastojaka smjese, a u tu svrhu potrebno je pronai
najprikladnije eksperimentalne uvjete tj. validirati metodu. Kromatografija je postala jedna od
najvanijih metoda analitike kemije. Kromatografskim metodama mogue je razdvojiti dva
ili vie slinih sastojaka smjese to je drugim postupcima prilino teko postii. Da bismo
postigli to bolje kromatgrafsko odjeljivanje smjese moramo obratiti pozornost na odabir
nepokretne i pokretne faze. Razliiti separacijski mehanizmi ostvaruju se odabirom razliitog
materijala za nepokretnu i pokretnu fazu. Tekuinska kromatografija osnovna je
vienamjenska separacijska tehnika koja se primjenjuje u modernim biolokim znanostima i
srodnim podrujima molekularne biologije, ima veliku uspjenost odjeljivanja molekula
irokog spektra kao to su polimeri, male molekule, peptidi, proteini itd. U posljednje vrijeme
veliku pozornost dobiva i elektrokromatografija, kao hibrid dvaju vrlo uinkovitih metoda,
zbog svoje uspjenosti u razdvajanju i polarnih i nepolarnih spojeva. Ta se tehnika naglo
razvila zbog mogunosti utjecanja na uinkovitost separacije modificiranjem nepokretne i
pokretne faze.

30

Literatura
[1] M.

Katelan-Macan, M. Petrovi (urednice), Analitika okolia, HINUS i Fakultet

kemijskog inenjerstva i tehnologija (2013) 207-215

[2] M. Katelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, kolska knjiga, Zagreb (2003)
222-235
[3] D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije, kolska knjiga, Zagreb
(1999) 645-672
[4] I.Keselj, Ekstrakcija farmaceutika iz sedimenta ultrazvukom, zavrni rad, Zagreb (2012)
29
[5] M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati, Spregnute tehnike tekuinski kromatograf
spektrometar masa: osnove metodologije i primjene, Medicina, 45 (3) (2009) 218-232

[6] S. Luterotti, Uvod u kemijsku analizu, sedmo izdanje, Farmaceutsko-biokemijski fakultet

sveuilita u Zagrebu (2014)
[7] M. A. Mansoor, Liquid Chromatography, Encyclopedia of life sciences, Macmillan
Publishers Ltd, Nature Publishing Group (2002) 1-3
[9] K. A. Rubinson, J. F. Rubinson, Contemporary Instrumental Analysis, Prentice Hall
(2000) 629-671[10] M. Katelan-Maca, Enciklopedijski rjenik analitikog nazivlja, Fakultet
kemijskog inenjerstva i tehnologije; Mentor, Zagreb (2014)
[11] http://issuu.com/hinus/docs/kroma_11str_obr ( 19.2.2015.)
[12] B. Borovika, Izolacija i strukturna karakterizacija novih poliketida, derivata antrona
dobivenih biosintezom, doktorska disertacija, Zagreb (2012) 38
[13] Satinder, A., Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier
Science, Maryland Heights (4) (2003)
[14] K. D. Bartle, P. Myers, Theory of capillary electrochromatography, Journal of
Chromatography A, 916 (2001) 323
[15] M. Mayer, E. Rapp, C. Marck, G. J. M. Bruin, Fritless capillary electrochromatography,
Electrophoresis 20 (1999) 43-49
31

[16] J.F.Ricelli, N. L.Carvalho, C.Lago, JbrazChemSoc,14 (2003) 265-268

[17] I. Mikik, P. Sedlkov, Capillary electrochromatography of proteins and peptides, J. Sep.
Sci. 30 (2007) 1686 1703
[18] N.Smith, Capillary electrocromatography, Beckman Coulter (1999)
[19] D. Klini, S. Herceg Romani, Pah and PCB metabolite determination in biological
material, Arh Hig Rada Toksikol 62 (2011) 77-89
[20] M. Guek, B. Pihlar, Separation of sugar anomers by capillary electrocromatography,
Acta Chim. Slov., 47 (2000) 165177
[21] C. S. Henry, Microchips capillary electophoresis, Humana Press, New Yersey, 2006
[22] M. Vlkov, Microchip electrophoresis bioanalytical applications, Doktorska dizertacija,
Fakultet prirodoslovno-matematikih znanost, Basel, 2008.
[23] http://www.enciklopedija.hr/Natuknica.aspx?ID=30305 (1.3.2015.)

32

Prilog 1.
GC ( engl. Gas Chromatography), plinska kromatografija, kromatografska tehnika u kojoj je
pokretna faza plin nosilac, a nepokretna faza vrsti adsorbens ili selektivna tekuina nanesena
u tankom sloju na internu vrstu podlogu, temperatura i protok pokretne faze programiraju se
ovisno o ispitivanoj smjesi.
LC (engl. Liquid Chromatography),tekuinska kromatgorafija, kromatografska tehnika u
kojoj je pokretna faza tekuina, a ovisno o nepokretnoj fazi dijeli se na adsorpcijsku i
razdjelnu kromatografiju.
HPLC (engl. High Performance Liquid Chromatography), tekuinska kromatografija visoke
djelotvornosti, kromatografska tehnika u kojoj se visoka djelotvornost postie vrlo sitnim
esticama nepokretne faze i relativno visokim tlakom.
UHPLC (engl. Ultra High Performance Liquid Chromatography), tekuinska kromatografija
ultravisoke djelotvornosti, kromatografska tehnika u kojoj su stupci ispunjeni esticama
promjera <2m, to omoguuje veu brzinu odjeljivanja, bolju osjetljivost i razluivost nego
HPLC-om.
TCL (engl. Thin Layer Chromatography), tankoslojna krmatografija, plona kromatografija,
u kojoj je nepokretna faza u tankom sloju nanosi na vrsti inertan nsa, a razvija putuje
noen kapilarnou.
IC (engl. Ion-Chromatography, ion-exchange chromatography), ionska kromatografija,
kromatografska tehnika u kojoj je nepokretna faza ionski izmjenjiva, a ionska se izmjena
odvija u stupcima visoke djelotvornosti; rabi se za odjeljivanje srodnih iona relativno male
razlike u selektivnosti, to uvjetuje razliitu brzinu njihova kretanja u stupcu izmjenjivaa.
SFC (engl. Supecritical Fluid Chromatography), kromatografija natkritinim fluidom,
kromatgorafsko odjeljivanje u kojem je pokretna faza fluid iznad ili blizu njegove kritine
temperature i tlaka; odjeljivanje se odvija u kapilarnim ili punjenim stupcima, a nepokretne su
faze obino kemijski vezane na nosa.
SEC (engl. Exclusion Chromatography), kromatografija iskljuivanjem, kromatografska
tehnika koja se temelji na razlici u molekulskoj masi, veliini molekula te njihovu obliku ili
naboju.

33

NPLC (engl. Normal Phase Liquid Chromatography), tekuinska kromatografija normalne

faze, polarna stacionarna faza je u meusobnom djelovanju s mobilnom fazom male
polarnosti. Interakcije polarnih skupina u analitu (npr. hidroksi, keto, amino, amido, ester, eter
ili merkapto) i polarna strana povrine dominiraju mehanizmom retencije. Polarne i kisele
silanolne skupine podlijeu dipolnim i vodikovim vezama i kiselo-baznim interakcijama.
RPLC (engl. Reversed Phase Liquid Chromatography), tekuinska kromatografija obrnutih
faza, nepolarna stacionarna faza je u meusobnom djelovanju s polarnom, obino smjesom
vodeno-organskom mobilnom fazom. RPLC se najee primjenjuje za analite koji se mogu
otopiti u vodeno-organskim eluensima. Materijali od kojeg je veinom izraena stacionarna
faza je alkilno modificirani silikagel te polistiren-divinilbenzen (PS-DVB) polimeri (alkilni
ligandi vezani na aromatske prstenove) .

34