Instrumentalne tehnike

odvajanja

Odvajanje analita od interferencija

Ponavljanje AK!!!

Velik dio analitikih metoda nije selektivan, pa je za odreivanje

analita potrebno ukloniti interferencije.

U praktinom smo radu esto suoeni s postupcima odvajanja
prije odreivanja.
Kad interferencije nisu prisutne zabiljeeni signal,SA,
proporcionalan je koncentraciji analita cA :

SA = kA cA
gdje je kA koeficijent osjetljivosti metode pri odreivanju analita
U prisutnosti interferencija:

SA = kA cA

kI cI

Interferencije nisu problem sve dok je zadovoljen uvjet:

kI
cI cA
kA

Odvajanje temeljeno na raspodjeli izmeu

dviju faza
Ponavljanje AK!!!
Najvanija tehnika odvajanja koja se temelji na selektivnoj

raspodjeli analita ili interferencije izmeu dvije faze koje se ne

mijeaju.
Kemijska vrsta se raspodjeljuje izmeu dviju faza koje se mogu
fiziki razdvojiti. Ta je raspodjela ravnotean proces karakteristian
za svaku kemijsku vrstu. Kako se ovakvi postupci odvajanja
temelje na ravnotenim stanjima, potpunost odvajanja praktiki
nikad nije mogua.
Kada jednu fazu u kojoj je otopljena vrsta Z dovedemo u kontakt s
drugom fazom u kojoj je Z topljiv; vrsta Z e se raspodijeliti izmeu
faza:

Zfaza 2

Zfaza1

Odvajanje temeljeno na raspodjeli izmeu

dviju faza Zfaza 2 Zfaza1
Ravnotea raspodjele kemijske vrste Z izmeu dvije faze odreena je

koeficijentom odvajanja (K0)

K0

Zfaza1
Zfaza2

Dvije se vrste mogu razdvojiti postupkom jednostavne ekstrakcije ako se

njihovi koeficijenti odvajanja znaajno razlikuju.

Ekstrakcija je proces u kojem kemijska vrsta prelazi iz jedne faze u drugu

Za uspjenost ekstrakcije osim koeficijenta odvajanja znaajna je i

koncentracijska raspodjela (Rc) , a ona je omjer c1 i c2 , gdje c1

oznaava zbroj koncentracija svih oblika vrste od interesa u
(organskoj) fazi 1, a c2 zbroj koncentracija svih oblika vrste od
interesa u (vodenoj) fazi 2.
Rc

c( Z ) faza1 c1

c( Z ) faza2 c2

Udio komponenti u fazama nakon odvajanja

SL. 81b Raspodjela komponenti
izmeu dvaju otapala koja se
meusobno ne mijeaju.
Kada se vodi doda drugo
otapalo (organsko otapalo)
koje se s njom fiziki ne
mijea i koje se od nje moe
razdvojiti, komponente se
raspodjeljuju izmeu dviju
faza.

Rc

Kada su komponente A i B prisutne

samo u jednom obliku u obje faze:

A1
A 2
c A 1

c A 2

K0

>

K0

faza 2
>

Komponenta B je u ovom
sluaju dominantno prela u
gornju, organsku fazu, dok je
komponenta A dominantno u
donjoj, vodenoj fazi.

faza 1

Rc

K 0 (A) Rc (A);

B1
B 2
c B1

c B 2

K 0 (B) Rc (B);

ODVAJANJE EKSTRAKCIJOM
USPJENOST EKSTRAKCIJEUdio komponenti u fazama nakon odvajanja

organsko otapalo

voda
SL. 84 Prikaz mnoine ekstraktibilne vrste kod jednokratne ekstrakcije prije i poslije
uspostavljanja ravnotenog stanja.

USPJENOST EKSTRAKCIJEMnoine i koncentracije vrste Z nakon N-ekstrakcija u

pojedinim fazama
JEDNOSTAVNA, VIEKRATNA EKSTRAKCIJA

Ukupna mnoina ekstrahirane vrste Z nakon N-ekstrakcija

ili
+

Ilustrirani prikaz ekstrakcije s N ponovljenih istih

volumena svjee organske faze

Tehnike odvajanja

KARAKTERISTIKE I PODJELA KROMATOGRAFSKIH

TEHNIKA
Prve kromatografske eksperimente (kromatografija

ispis bojama) izveo je ruski botaniar i biokemiar

M. Cvet 1901.-1906.
U cjevicu je bio stavljen smrvljeni vapnenac (CaCO3)
i kroz njega proputena eterska otopina biljnog
pigmenta. Daljnjim dodavanjem otapala (etera)
komponente iz smjese su se razdvojile kroz kolonu i
obojale je.
Rezultati Cvetovih istraivanja doekani su isprva sa
sumnjom, a poeli su se primjenjivati tek nakon 1940.
godine.
Njegova je zasluga to je utemeljio kromatografiju,
fizikalno-kemijsku tehniku za analitika i preparativna
odjeljivanja sastojaka smjese.

 Kod svih kromatografskih metoda postoji

nepokretna ili stacionarna faza i

pokretna ili mobilna faza.

Komponente i smjese razdvajaju se na temelju njihovog veeg ili

manjeg afiniteta prema stacionarnoj fazi.

Kromatografske se metode u osnovi dijele na kolonsku (u literaturi:
kromatografija na koloni) i plonu kromatografiju.
Kod kolonske kromatografije
stacionarna ili nepokretna faza je u uskoj cjevici,
a mobilna ili pokretna faza se potiskuje kroz cjevicu djelovanjem
gravitacije ili poveanog tlaka

Zapis Znaajke signala kod kromatografije

KROMATOGRAM izlazni zapis odziva detektora

tM mrtvo vrijeme kolone

-vrijeme potrebno da mobilna
faza doe na detektor
tR vrijeme zadravanja
komponente u koloni, ili
vrijeme potrebno da neka
komponenta uzorka
dosegne detektor

Kromatogram za uzorak koji sadri jednu komponentu

Kromatogram je ispis bilo koje funkcije koncentracije analizirane tvari u ovisnosti

 Tipovi sila prisutni u kromatografiji su: ionsko

meudjelovanje, Van der Waalsove sile, vodikova veza i

promjena naboja
Naini razdvajanja

Kolonska kromatografija

Shematski prikaz kolonske kromatografi

Uzorak se dodaje na vrh kolone, a moe biti u vrstom ili

tekuem stanju.
Ukoliko je u vrstom stanju, mora biti topljiv u mobilnoj fazi (u
ionskoj izmjeni mobilna faza sadri uzorak; ovdje to nije
sluaj!).
Brzina kojom mobilna faza raznosi uzorak se razlikuje i to je
osnova njihovog odvajanja.

Plona kromatografija
papirna i tankoslojna kromatografija
Kod plone kromatografije stacionarna ili nepokretna faza
smjetena je na ravnu podlogu

KROMATOGRAFIJA ELUIRANJEM (ISPIRANJEM)

ili tekuinska kromatografija
Prvi kromatografski eksperiment zapravo je bila

kromatografija eluiranjem!

a) Dodavanje dvokomponentnog uzorka

na vrh kolone.
Kolona je punjena stacionarnom
fazom - sitnim esticama odreenog
sastava.
Uzorak je sastavljen od dvije
komponente, A i B.
Uzorak koji je u tekuoj fazi dodaje se
na vrh kolone u vremenu to.

Eluacija ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih koliina otapala

KROMATOGRAFIJA ELUIRANJEM (ISPIRANJEM)

b) Razdvajanje komponenata.
ili tekuinska kromatografija

Konstantnim dodavanjem mobilne faze koja ispire uzorak u

vremenu t1 -t4 postie se razdvajanje komponenata.

Komponenta A u ovom sluaju bre prolazi kroz kolonu jer se

komponenta B jae vee uz vrstu fazu i sporije putuje.

Kako komponenta A bre prolazi kroz kolonu, dolazi na detektor
u vremenu t3 , a komponenta B u vremenu t4 .

KROMATOGRAFIJA ELUIRANJEM (ISPIRANJEM)

Zapis (ili) Signal kod kromatografije
Karakteristika

kromatografske metode je
zbrojni vremenski signal!

Grafiki prikaz odnosa

signala i vremena za
dvokomponentni uzorak ije
je razdvajanje prikazano na
prethodnoj slici.
U vremenu t0 , t1 i t2 na
detektoru nema niega.
Signal se registrira tek u
vremenu t3 . Teoretski,
komponente A u vremenu t3
ima i iznad i ispod detektora,
ali je glavnina na detektoru,
pa zato na ovom mjestu nije
tap, ve brijeg.

DJELOTVORNOST KROMATOGRAFSKE KOLONE

Na poetku kromatografskog razdvajanja analit zauzima usku vrpcu (zonu)

konane irine.

Zone (vrpce) se ire kako se sastojak mie niz kolonu. to se zona

eluiranog sastojka due nalazi u koloni, to ima na raspolaganju vie
vremena za irenje.
Djelotvornost kromatografske kolone moe se kvantitativno izraziti dvjema
srodnim veliinama, a to su: visina tavana H i broj teorijskih tavana N.

-Broj teorijskih tavana se moe izraunati iz eksperimentalnih podataka: vrijeme zadravanja analita u koloni i irina osnovice signala.

W- irina osnovice pika

tR vrijeme zadravanja

 Uspjena raspodjela analita izmeu stacionarne i mobilne faze temelji

se na tzv. teoriji tavana prema kojoj je kolona duljine L podijeljena

horizontalno na N zamiljenih diskova jednake visine H, oznaenih od
1 do n. Za svaki tavan analit se raspodjeljuje ravnoteno izmeu
mobilne i stacionarne faze. Sa svakom sljedeom ravnoteom ili
raspodjelom analit napreduje kroz kolonu za visinu jednog tavana.

to definira uspjeno razdvajanje na koloni?

1. Koeficijent raspodjele u kromatografiji
Amobilna Astacionarna
2. Brzina analita i otapala:
3. Odnos izmeu vremena zadravanja
i koeficijenta raspodjele
4.Brzina gibanja analita; Faktor kapaciteta

5. Diferencijalne brzine gibanja; Koeficijent selektivnosti

 Faktor kapaciteta moe se dobiti na temelju zapisa na

kromatogramu.
Faktor kapaciteta za pojedinu komponentu pogodan je kada je
izmeu 1 i 5.
Ako je vrijednost manja od 1, komponenta brzo prolazi kroz kolonu,
pa je vrijeme zadravanja teko odrediti.
Ako je faktor kapaciteta velik (20-30), onda je eksperiment jako
spor.
Mijenjanjem sastava mobilne i stacionarne faze mijenja se faktor
kapaciteta s ciljem poboljanja odjeljivanja.
je uvijek vei od 1

DJELOTVORNOST ODVAJANJA U/NA KOLONI

Razluivanjekolone je kvantitativna mjera kojom se izraava sposobnost
-Razluivanje
odjeljivanja dvaju analita na toj koloni.
Kromatografsko odjeljivanje moe se optimizirati mijenjanjem eksperimentalnih
uvjeta, sve dok se sastojci smjese ne odijele uz minimalni utroak vremena.

Promjena efikasnosti razluivanja promjenom duljine kolone

Razluivanje i vrijeme ispiranja su dvije najvanije meusobno ovisne

varijable bitne pri optimizaciji uvjeta odvajanja.
Cilj je ostvariti razdvajanje analita u minimalnom vremenu. Ako je
razdvajanje dobro, vrijeme trajanja analize se moe smanjiti smanjenjem
kolone.

UZROCI IRENJA VRPCE i Van Deemter-ova jednadba

Veza izmeu visine tavana H sa prosjenom linearnom brzinom protoka

mobilne faze.
Eksperimentalni koeficijenti A,B i C ovise o fizikalno-kemijskim
parametrima kolone i o eksperimentalnim uvjetima
Postoji optimalna brzina mob.faze za svaku kolonu prema min.visini H.
Djelotvornost se smanjuje poveanjem brzine protoka ali i kada je protok
veoma spor.
A, B i C se mogu optimizirati za svaki analit mijenjanjem protoka i brzina
mob. faze u eksperimentima optimizacije odvajanja.

A-Viestruke staze
Profil protoka mobilne faza dok prolazi
kolonom( preko stacionarne faze).
Parametar A ovisi iskljuivo od punila kolone i ne moe se eksperimentalnim
varijablama smanjiti
B-Uzduna difuzija (rasprenje)
Ako je protok spor, analit e difundirati bre nego
to putuje kolonom. Difuzija i proces raspodjele
nemogu se zaustaviti ni na trenutak jednom kad
kromatografski proces pone. Posebno je izraen
utjecaj difuzije kad je mob.faza plin.
C- Otpor prema prijenosu mase analita izmeu dviju
faza postaje dominantna kad je brzina protoka prevelika za
uspostavljanje ravnotee. Turbulencije mob.faze i
gradijent koncentracija usporavaju uspostavljanje ravnotee
izmeu faza. Dogaa se rasprenje analita u m.i st.fazi bez

Uspjena primjena kromatografskih metoda ovisi o razliitim

faktorima koje treba optimizirati:
-vrijeme zadravanja analita u koloni;
-brzina gibanja kroz kolonu;
-broj teoretskih tavana; visina tavana;
-kemijski sastav stacionarne faze;
-kemijski sastav mobillne faze.

Podjela kromatografskih metoda na koloni (stupcu)

Opa podjela
kromatografskih tehnika
Tekuinska kromatografija (LC);
Mobilna faza: tekuina

Plinska kromatografija (GC);

Mobilna faza: plin
Kromatografija sa superkritinom tekuinom (SFC);
Mobilna faza: tekuina pri superkritinim uvjetima

Podjela kromatografskih metoda na koloni (stupcu)

Opa podjela

Specifina
metoda

Stacionarna
faza

Vrsta ravnotee

LC

Tekue- tekue, ili

raspodjela

Tekuina
adsorbirana na
vrstoj tvari

Razdioba izmeu
tekuina koje se
ne mijeaju

Tekua vezana
faza

Organski spojevi
vezani na vrstu
povrinu

Razdioba izmeu
tekue i vezane
povrine

Tekuina-vrstina;
ili adsorpcija

vrsta tvar

Adsorpcija

Ionska izmjena

Ionski izmjenjiva Ionska izmjena

Odjeljivanje
temeljem veliine
estica

Tekuina u
prostorima
polimera

Raspodjela
/prosijavanje

Podjela kromatografskih metoda na koloni (stupcu)

Opa podjela

Specifina
metoda

Stacionarna
faza

Vrsta
ravnotee

GC

Plinskotekuinska

Tekuina
adsorbirana na
vrstoj tvari

Raspodjela
izmeu plina i
tekuine

Plinska vezana
faza

Organski spojevi
vezani na
povrinu vrste
tvari

Raspodjela
izmeu tekue i
vezane povrine

vrsta tvar

Adsorpcija

Organski spojevi
vezani na vrstu
povrinu

Raspodjela
izmeu
superkritine
tekuine i vezane
povrine

Plinsko-vrstinska

SFC

Tekuinska kromatografija
Liquid Chromatography, LC

Plona

Papirna
Tankoslojna (thin-layer chromatography, TLC)
Kromatografija na/u koloni (stupcu) (kolonska
kromatografija)

Tekuinska kromatografija

Tankoslojna kromatografija

Kromatografija na papiru

Kolonska kromatografija tekuinska

kromatografija na koloni

Primjena tekuinske kromatografije na koloni

Veliine estica stacionarne faze i kontroliranje protoka

Prve kromatografske analize:

Staklene kolone promjera 1-5 cm, duljine 50-500 cm

Promjer zrnaca stacionarne faze (punila) 150-200 m
Brzina protoka 0,1 mL /min
Vrijeme odjeljivanja: do nekoliko sati

Djelotvornost se moe poveati smanjenjem

dimenzija zrna punila

60-tih godina punilo promjera <10m
Novi standardi kontrole protoka mobilne faze pod
tlakom i razvoj TEKUINSKE KROMATOGRAFIJE
VISOKE DJELOTVORNOSTI

Tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti

High-Performance Liquid Chromatography, HPLC
Zato HPLC?
Najmonije orue u analitikoj kemiji za odvajanje,

identifikaciju (kvalitatitvno odreivanje), kvantitativno

odreivanje sastojaka (bilo kojeg uzorka) topljivih u tekuem
otapalu.
Znanstveno istraivaki laboratoriji, industrija, biomedicinske
znanosti
Odvajanje nehlapljivih tvari: amino kiseline, proteini,
nukleinske kiseline, farmaceutici, pesticidi, pigmenti, vitamini,
steroidi, antibiotici i ostale organske i anorganske vrste.
Ako je analit topljiv u vodi, alkoholu,acetonitrilu, acetonu.
moe se upotrijebiti HPLC.

Tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti

High-Performance Liquid Chromatography, HPLC

Prednosti nad klasinom tekuinskom

kromatografijom
Brzina
Prilagodljivost
Djelotvornost odvajanja
Osjetljivost
Trajanje kolone

Tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti

High-Performance Liquid Chromatography, HPLC

Osnovne komponente HPLC sustava

Sustav za prijenos otapala- crpka i spremnici za otapala

Injektor za unoenje uzorka
Predkolona- filter guard column
Kolona (sa stacionarnom fazom)
Detektor
Spremnik za otpad
Sustav za obradu podataka

Stari HPLC sustav

pisa
filter
spremnik za otapalo

crpka

detektori

injektor
kolona

predkolona

Moderni HPLC sustav

Crpke i injektori
Crpke
Tlakovi do 40 000 kPa
Izlaz bez pulsiranja tlaka
Brzine protoka od 0,1- 10 mL/min
Reproducibilnost protoka 99,5 %
Otpornost na koroziju izazvanu razliitim otapalima
Injektori

Petlja za uzorak volumena od

(5-500 L; 0.5-5L)

Kolone
3(5)- 15(30) cm duljine
Promjer 1 (4) -5 (10) mm
Moderne kolone

uskog unutarnjeg promjera 2-4 mm

mikrokolone1-2 mm
punjene kolone 1 mm
Zahtijevaju male protoke od nekoliko mikroL/min.
Manje mob.faze se troi, posebne pumpe i detektori, bolje razluivanje
Predkolona (guard column)-(0,4-1 cm) za odvojiti prainu i
neistoe, iz uzorka i otapala, koje mogu nepovratno oneistiti
kolonu

 Kolona je smjetena u termostatiranom

prostoru-zagrijavanjem se smanjuju
primijenjeni tlakovi i poveava protok,
smanjuje vrijeme analize i poveava
uspjenost razluivanja.
Najee punilo za HPLC kolonu je silika gel
(estice submikrometarskih dimenzija)
Upotrebljavaju se punila koja sadre glinicu,
porozne polimere i ionske izmjenjivae

Odjeliti, identificirati, kvantificirati

to je u uzorku?
Koliko je analita u uzorku?

Kolone
Stacionarna faza
Silicijev oksid-silika gel
povrina oko 1000 m 2 / g

350 m 2 / g
10 nm veliina upljine u strukturi

Na povrini zrnca silike gela ima oko 8 mol silanolne skupine (-SiOH) /m
Topljiv pri pH 8
Silanolna skupina je u pH podruju 2-3 protonirana
Zbog visoke adsorpcijske moi i polarnosti primjena silikagela
ograniena je na visokodjelotvornu adsorpcijsku kromatografiju.

Punila s vezanom fazom

na -OH skupine silikagela veu se razliite organske
funkcionalne skupine (punila s vezanom fazom)
R je najee ravan lanac oktili (C8H17-) ili oktidecil
(C18H37-) skupine- nepolarna faza
Na povrinu silika gela mogu se vezati i alifatski
amini, eteri, nitrili i aromatski ugljikovodici.

organoklorsilan

Punila s vezanom fazom

Osnovni nedostatak: mali kapacitet za uzorak
Uz odreeni nain priprave dugaki lanci ugljikovodika

poravnavaju se usporedo jedna s drugom i okomito na povrinu

zrna silikagela. Nastaje nepolarna povrina.

Sustav za obradu otapala

Programirano mijeanje otapala
Najjednostavniji nain odjeljivanja tekuinskom

kromatografijom je izokratina eluacija-analit kroz

kolonu nosi jedno otapalo ili uvijek ista smjesa
otapala
Bolji kromatogram tj. uspjenije razdvajanje se
dobije gradijentnom eluacijom uz upotrebu dvaju ili
vie sustava otapala polarnosti kojih se meusobno
razlikuju.

 Izokratina eluacija

 Gradijentna eluacija
Odnos zapremine otapala mijenja se na unaprijed

utvren nain, neprekidno ili u nizu koraka.

Poboljana djelotvornost odjeljivanja

Visoko djelotvorna razdjelna kromatografija

Kromatografija u sustavu tekuina-tekuina
Kromatografija u sustavu vezane faze

Razliit nain vezanja

stacionarne faze na punilo

Stacionarna faza je tekuina koja se ne mijea s tekuom

mobilnom fazom

Sustav tekuina-tekuina
Stacionarna faza je fizikalnom adsorpcijom zadrana na punilu
Potrebno ju je povremeno obnavljati, jer je postupno ispire

mobilna faza
Nije pogodna za gradijentnu eluaciju
Kad se poela primjenjivati razdjelna kromatografija se temeljila
iskljuivo na sustavu tekuina-tekuina, a danas se koristi samo
u iznimnim sluajevima

Visoko
razdjelnastacionarne
kromatografija
Ovisnodjelotvorna
o relativnoj polarnosti
i mobilne faze razlikujemo:
Kromatografija
u sustavu
vezane faze
Normalnu razdjelnu
kromatografiju
vezane faze
Obrnutu razdjelnu kromatografiju vezane faze
Normalna
Veoma polarna stacionarna faza (voda, trietilenglikol)
Relativno nepolarne mobilne faze (heksan, propileter)
Reverzna
Stacionarna je faza nepolarna (ugljikovodici..)
Mobilna je faza relativno polarno otapalo (voda, metanol, acetonitril)

Visoko djelotvorna razdjelna kromatografija

Kromatografija u sustavu vezane faze
Najee koritena HPLC tehnika
Odreuju se :
analiti relativno male molekulske mase < 3000 g/mol
polarni i nepolarni analiti
HPLC odjeljivanja obavlja se reverznom

kromatografijom na punilima s vezanim oktil (C8)

ili oktildecilsiloksanom (C18)

Visoko djelotvorna razdjelna kromatografija

Kromatografija u sustavu vezane faze
Izbor stacionarne i mobilne faze
U normalnoj HPLC najmanje polaran sastojak eluira prvi.

Poveanjem polarnosti mobilne faze smanjuje se vrijeme

eluacije.
U reverznoj HPLC najpolarniji satojak eluira prvi, a poveanjem
polarnosti mobilne faze produuje se vrijeme eluacije.

Visoko djelotvorna razdjelna kromatografija

Kromatografija u sustavu vezane faze
Izbor stacionarne i mobilne faze
Uspjena razdjelna kromatografija:

Ravnotea izmeu molekularnih sila triju sudionika procesa:

analit, mobilna faza, stacionarna faza

Uskladiti relativne polarnosti reaktanata prema pravilu slinosti:

Najbolje odjeljivanje: slina polarnost analita i stacionarne

faze, a polarnost mobilne faze razliita od polarnosti analita

Meutim, kada su polarnosti analita i stacionarne faze previe

slina tada vremena zadravanja postaju preduga.

Visoko djelotvorna razdjelna kromatografija

Kromatografija u sustavu vezane faze
Uobiajene primjene visoko djelotvorne razdjelne

kromatografije

Podruje
Farmacija
Biokemija

Analiti u smjesi

Antibiotici, sedativi, steroidi, analgetici

Aminokiseline, bjelanevine,
ugljikovodici,lipidi
Umjetna sladila, antioksidansi, aflatoksini,
ivene namirnice
aditivi
Industrijski kemijski proizvodi Kondenzirani aromati, premazi, boje
Pesticidi, herbicidi, fenoli, poliklorirani
Zagaivai
bifenili
Droge, otrovi, alkoholi u krvi, narkotici
Forenzika kemija
une masne kiseline, metaboliti droga,
Klinika medicina
urinski ekstrakti, estrogeni

Visoko djelotvorna adsorpcijska kromatografija

Adsorpcija u sustavu tekuina-vrsta tvar
Analizirani sastojci se adsorbiraju na povrini fino

usitnjenog polarnog punila

Analit ulazi u pore na povrini punila
Stacionarna faza: veliki kapacitet za uzorak i veliki broj
oblika
Varijabla o kojoj ovisi odjeljivanje: sastav mobilne faze
mijenja se faktor kapaciteta i koeficijent selektivnosti
Teko pronai pogodnu mobilnu fazu
Analit: relativno nepolarne organske molekule

molekulske mase < 5000

Pogodna za odjeljivanje smjese izomera (npr.
parasupstituirani i metasupstituirani derivati benzena)

Visoko djelotvorna kromatografija ionske izmjene

Stacionarna faza je ionski izmjenjiva
Odjeljivanje: ioni slinog naboja odjeljuju se eluacijom

iz kolone punjene fino usitnjenim zrncima ionskih

izmjenjivaa
Ionski izmjenjivai

Prirodni ionski izmjenjivai: zeoliti

Polimerne tvari velike molekulske mase koji sadre
mnoge funkcionalne skupine po molekuli.
Kationski i anionski izmjenjivai

Prirodni ionski izmjenjivai: zeoliti

Sintetski ionski izmjenjivai

Sintetski ionski izmjenjivai

Polimerne tvari:
1. kopolimerizacija stirena i divinilbenzena
Divinilbenzen 1-16 % : vei postotak

divinilbenzena vie je izmjenjiva umreen

vie mjesta za ionsku izmjenu

Visoko djelotvorna kromatografija ionske izmjene

Ionski izmjenjivai
Kationski izmjenjivai

Jake kiseline sa sulfonskim kiselim skupinama:

RSO 3 H
Slabe kiseline s karboksilnim kiselim skupinama:
RCOOH

Visoko djelotvorna kromatografija ionske izmjene

Ionski izmjenjivai
Anionski izmjenjivai

Bazine aminske funkcionalne skupine vezane na

polimernu molekulu

Kvaterni amini -jake baze RN(CH ) OH

3 3
Sekundarni i tercijarni amini -slabe baze

Sintetski ionski izmjenjivai

2. Celuloza, dextran, polisaharid agaroza, poliakrilamid
Polimeri eera glukoze s veim

porama i manjom gustoom u odnosu

na polistirenske smole
Meki su te se esto nazivaju gelovi
Za ionsku izmjenu makromolekula
Dexran umreen s glicerinom ima
komercijalni naziv Sephadex

Ravnotea ionske izmjene

Razmotrimo ionsku izmjenu iona litija na kation izmjenjivakoj smoli:

K predstavlja afinitet smole prema ionu.

Kada je K velik stacionarna faza snano zadrava taj ion.
Kad je K mali, onda vrijedi suprotno
Snanije se veu na ionski izmjenjiva:

Polivalentni ioni u odnosu na jednostruko nabijene.

Hidratizirani ioni manjeg prenika

Primjena ionskih izmjenjivaa u kromatografiji

Priprava ultra iste deionizirane vode

Kromatografija ionske izmjene s priguenjem eluensa

Tekuinska kromatografija visoke djelotvornosti

Detektori

 Plinska kromatografija
Mobilna faza: plin (He, N2,H2)
Stacionarna faza: nehlapljiva tekuina
Analit:plin ili hlapljiva tekuina

 Kapilarne kolone

Elekroforeza
Elektroforeza podrazumijeva kretanje iona u otopini pod

utjecajem elekrinog polja

 Vie teoretskih tavana i bolje razluivanje nego to nude druge

kromatografske tehnike
Kapilarna elektroforeza rutinski proizvodi
50 000- 500 000 teoretskih tavana i ovo su bolji rezultati nego
to ih daje kromatografija.
Koriste se kapilarne kolone, te je izbjegnut problem viestrukih
staza punjenih kolona
Nema problema prijenosa mase jer nema stacionarne faze
Ostaje samo longitudalna difuzija.

Stalna brzina kretanja:

Sila ubrzavanja= sila usporavanja
Nabojjakost el.polja=koeficijent trenjabrzina iona
Elektroforetska pokretljivost (ep) je konstanta proporcionalnosti izmeu
brzine iona i jakosti elektrinog polja.

Pokretljivost je proporcionalna naboju iona i obrnuto proporcionalna

koeficijentu trenja. Za molekule sline veliine, magnituda pokretljivosti se

poveava sa nabojem.
Za sferine estice promjera r koje se kreu kroz fluid viskoznosti ,
koeficijent trenja f, je dan Stokesovom jednadbom:
f=6r

 Unutranjost zida kapilare sa slojem silika gela prekrivena je

silanolnim (Si-OH) skupinama negativnog naboja (Si-O-) pri

pH vrijednosti iznad 2.
Slika prikazuje elektrini dvosloj na zidu kapilare. Dupli sloj se
sastoji od fiksiranog negativnog naboja na zidu kapilare i
vika kationa u njegovoj blizini.
Ostatak negativnog naboja je neutraliziran mobilnim kationima
u difuznom dijelu dvosloja u otopini blizu zida. Debljina
difuznog dijela dvosloja varira od 10 nm kada je ionska jakost
1 mM do 0.3 nm kada je ionska jakost 1 M.
U elektrinom polju, kationi su privueni katodi, a anioni
anodi. Viak kationa u difuznom dijelu dvosloja
uzrokuje kretanje prema katodi i stvara
elektroosmotski tok itave otopine prema katodi..

 Konstanta proporcionalnosti izmeu brzine elektroosmoze u eo i

zadanog polja zove se elektroosmotska mobilnost (eo).

Elektroosmotska mobilnost proporcionalna je gustoi povrinskog
naboja na silika gelu i obrnuto proporcionalna kvadratnom korijenu
ionske jakosti.
Elektroosmoza se smanjuje na niskom pH i veim ionskim jakostima.
Elektroforeza prenosi anione u suprotnom smjeru od elektroosmoze.
Na neutralnom ili viem pH elektroosmoza prenosi anione prema
katodi jer je elektroosmoza obino bra od elektroforeze. Na niskom
pH, elektroosmoza je slaba i anioni ne mogu dosegnuti detektor. Ako
se eli odvojiti anione pri niskom pH, moe se obrnuti polaritet na
instrumentu tako da strana uzorka bude negativna a strana detektora
pozitivna.