SVEUILITE U ZAGREBU

FAKULTET KEMIJSKOG INENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

SVEUILINI DIPLOMSKI STUDIJ

Mia Ivankovi

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, rujan 2012.

SVEUILITE U ZAGREBU
FAKULTET KEMIJSKOG INENJERSVA I TEHNOLOGIJE
SVEUILINI DIPLOMSKI STUDIJ

Mia Ivankovi

RAZVOJ POTPUNO INTEGRIRANOG PROCESA

PROIZVODNJE HEKSANALA U MIKROKANALU

DIPLOMSKI RAD

Voditelj rada: dr. sc. Bruno Zeli, red. prof.

lanovi ispitnog povjerenstva:
dr. sc. Bruno Zeli, red. prof. (mentor)
dr .sc. Aleksandra Sander, red. prof.
dr. sc. Zvjezdana Findrik Blaevi, docent

Zagreb, rujan 2012.

SAETAK

Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatije kao green note.
Zbog svojih organoleptikih svojstava heksanal je naao iroku primjenu u prehrambenoj,
farmaceutskoj i kozmetikoj industriji, a zbog baktericidnih i fungicidnih svojstava primjenjuje
se i u agronomiji. Uobiajeno se proizvodi fermentacijom s cijelim stanicama, ekstrakcijom iz
biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi,
formiranje neeljenih nusproizvoda i nastanak velike koliine otpada pa je i vie nego oita
potreba za razvojem i primjenom novih tehnologija u proizvodnji heksanala. Kao jedna od novih
tehnologija koje se koriste u proizvodnji heksanala sve se vie nameu mikroreaktorski sustavi
koji omoguuju bolji prijenos tvari i energije, manju potronju kemikalija i energije te druge
prednosti u odnosu na konvencionalne reaktore.
U ovom radu provedena je biokatalitika oksidacija heksanola uz enzim alkohol
dehidrogenazu u mikroreaktoru volumena 6 L. Alkohol dehidrogenaza je enzim koji se ubraja u
skupinu oksidoreduktaza kojima je zajednika karakteristika potreba za koenzimom. Kako je
cijena koenzima NAD+ izuzetno visoka, nuno je procesom regeneracije reducirani oblik
koenzima prevesti ponovno u oksidirani oblik. S tim ciljem razvijen je proces proizvodnje
heksanala s potpuno integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva meusobno
serijski povezana mikroipa. Ispitan je prijenos tvari izmeu dvije faze paralelnog toka koji je
uspostavljen u mikrokanalima te je razvijen 2D matematiki model strujanja. Postavljen je i
matematiki model potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala s regeneracijom
koenzima u mikroreaktoru, te je provedena ocjena valjanosti modela na podatcima nezavisnih
pokusa. Pokazano je dobro slaganje matematikog modela procesa i eksperimentalnih podataka,
a ovako razvijeni model pokazao se kao uinkovito sredstvo u daljnjem razvoju procesa.

Kljune rijei: ADH, heksanal, mikroreaktor, matematiki model procesa, potpuno integrirani
proces

SUMMARY

Hexanal is an essential part of the group of easily volatile components known as "green
notes". Because of its organoleptic properties hexanal has found wide application in food,
pharmaceutical and cosmetic industries, and due to its bactericidal and fungicidal properties is
applied in agriculture. Normally it is produced by fermentation with whole cells and enzymecatalyzed reactions or extracted from plants. The main disadvantages of these processes are low
yields, formation of undesired by-products and the formation of large amounts of waste, so the
need for development and application of new technologies in the production of hexanal is more
than obvious. As one of the new technologies used in the production of hexanal, microreactor
systems are increasingly being imposed as they allow better transfer of mass and energy, lower
consumption of chemicals and energy, and other advantages over conventional reactors.
In this work biocatalytic oxidation of hexanol with the enzyme alcohol dehydrogenase in
6 L microreactor was carried out. Alcohol dehydrogenase is an enzyme that belongs to the
group of oxidoreductases, which share the characteristics of the need for coenzyme. As the price
of coenzyme NAD+ is extremely high, it is necessary to regenerate a reduced form of coenzyme
into the oxidized form. Therefore hexanal production process with fully integrated regeneration
and recirculation of coenzyme in two serially connected microchips was developed. Mass
transfer between the two phases established in microchannel was analysed and corresponding
mathematical model of 2D flow was developed. Additionaly, mathematical model of a fully
integrated hexanal production process with coenzyme regeneration in microreactor was
developed. Validation of the model was performed using data from independent experiments.
The good agreement between simulation and experimental results was observed.

Key words: ADH, hexanal, microreactor, mathematical model, fully integrated process

ii

Sadraj
SADRAJ

1.

UVOD ..................................................................................................................................... 1

2.

TEORIJSKI DIO ................................................................................................................... 3

2.1. Heksanal ............................................................................................................................... 3
2.2. Enzimi .................................................................................................................................. 4
2.2.1. Oksidoreduktaze ............................................................................................................ 5
2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH) ...................................................................................... 5
2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ............................................................ 6
2.3. Kinetika enzimskih reakcija ................................................................................................. 8
2.4. Mikroreaktori ..................................................................................................................... 10
2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora .............................................................................. 10
2.4.2. Struktura mikroreaktora .............................................................................................. 11
2.5. Biokatalitika oksidacija heksanola uz enzim ADH .......................................................... 14

3.

MATERIJALI I METODE ................................................................................................ 15

3.1. Materijali ............................................................................................................................ 15
3.1.1. Kemikalije .................................................................................................................... 15
3.1.2. Priprema otopina......................................................................................................... 15
3.1.3. Aparatura..................................................................................................................... 16
3.2. Analitike metode .............................................................................................................. 19
3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH ................................................................................. 19
3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH .................................................................................... 20
3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala ........................................................... 20
3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola ................................................................................... 21
3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru...................................................................................... 21
3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola...................................................................... 21
3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+ ........................................................ 22
3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u
serijski povezanim mikroreaktorima ..................................................................................... 23
3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala .................................. 24
3.4. Obrada podataka ................................................................................................................. 25
iii

Sadraj
4.

REZULTATI I RASPRAVA .............................................................................................. 27

4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu .......................................................................................... 27
4.1.1. Odreivanje veliine meufazne povrine pri paralelnom i segmentiranom strujanju u
mikrokanalu ........................................................................................................................... 29
4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu .............................................................................................. 30
4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima ..................................... 30
4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola ........................................ 35
4.3. Reakcija oksidacije heksanola ............................................................................................ 37
4.4. Reakcija regeneracije koenzima ......................................................................................... 38
4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima ..................................................................................................... 39
4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala............................................................. 40

5.

ZAKLJUAK ...................................................................................................................... 44

6.

LITERATURA..................................................................................................................... 46

7.

POPIS SIMBOLA................................................................................................................ 49

8.

PRILOZI .............................................................................................................................. 51
8.1. Badarni pravci .................................................................................................................. 51
8.2. Kromatogrami .................................................................................................................... 53
8.3. Jednodimenzijski matematiki model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
Scientist ..................................................................................................................................... 54
8.4. Dvodimenzijski matematiki model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
MATLAB .................................................................................................................................. 54

IVOTOPIS

iv

1. Uvod
1. UVOD

Green note spojevi su veinske komponente svjeih, zelenih aroma povra i voa poput
jabuka, vianja, kiwija, brusnica, jagoda i rajica. Ove kemikalije se koriste u prehrambenoj
industriji kao dodatak za postizanje svjeeg okusa u piima i hrani. Procijenjena trina
vrijednost pred petnaestak godina im je bila otprilike 20 40 milijuna $ godinje [Whitehead et
al. 1995]. Veinu tih spojeva ine aldehidi i alkoholi sa est ugljikovih atoma. Jedan od takvih je
heksanal [Gargouri et al. 2004]. Heksanal se, osim u prehrambenoj industriji, koristi i u
farmaceutskoj i agrokemijskoj industriji zbog svojih organoleptikih svojstava [Santiago- Gmez
et al. 2009]. Heksanal je spoj koji se nalazi u prirodi u lipoksigenazi biljaka koja slui kao
pretea za proizvodnju alkohola i estera koji su esto koriteni u proizvodnji aroma [Hildebrand
1989].
Opisano je nekoliko procesa proizvodnje heksanala koji su temeljeni na fermentaciji,
ekstrakciji iz biljaka i enzimski kataliziranim reakcijama [Whitehead et al. 1995, Mrczy et al.
2002, Brunerie & Koziet 1997]. Zbog male koliine dobivenog proizvoda, formacije velike
koliine sporednih produkata i otpada, tradicionalni spojevi kao to su aromatski alkoholi ili
alkilni aromati, nisu prihvatljivi reaktanti za proizvodnju heksanala [Yokoyama & Yamagata
2001]. Jedan od prihvatljivijih naina proizvodnje heksanala je enzimski katalizirana reakcija uz
koenzim NAD+. Upotreba koenzima NAD+ u organskim sintezama ograniena je injenicom da
je koenzim prilino skup reagens, koji se mora dodati u stehiometrijskom omjeru. Kako se
njegovo oksidacijsko stanje tijekom reakcije mijenja, potrebno ga je regenerirati in situ
uporabom druge redoks reakcije. Regeneracijom koenzima redukcijom acetaldehida, osim to se
postie znatna uteda na koenzimu, moe se utjecati i na pomicanje reakcijske ravnotee u
eljenom smjeru.
U dananje vrijeme ulau se veliki napori u razvoj novih proizvodnih tehnika i procesa.
Primjena mikroreaktora u provedbi kemijskih i biokemijskih reakcija bi mogla predstavljati novu
generaciju proizvodnih procesa, a biotransformacije u mikroreaktorima mogu initi dobru
alternativu procesima klasine kemijske sinteze [ali et al. 2010]. Mikroreaktori su nali iroku
primjenu u razliitim podrujima poevi od klasinih kemijskih sinteza pa sve do
biotehnolokih procesa i zatite okolia. Mikroreaktori se sve vie primjenjuju i u industrijskim
procesima zahvaljujui svojim prednostima poput velike brzine prijenosa tvari i topline te
1

1. Uvod
mogunosti provedbe egzotermnih ili eksplozivnih reakcija koje zahtjevaju intenzivan nadzor i
provode se pod stroim uvjetima [Jensen 2001]. Velika brzina prijenosa tvari i topline u
mikroreaktoru posljedica je smanjene difuzijske udaljenosti unutar reaktora i velike meufazne
povrine po jedinici volumena reaktora u odnosu na konvencionalne makroreaktore. Zbog ovih
prednosti mikroreaktorske tehnologije se sve vise primjenjuju u farmaceutskoj industriji i
industriji finih kemikalija [Geyer et al. 2006]. Jedno od bitnih podruja istraivanja je i primjena
enzimatskih mikroreaktora. Enzimatski mikroreaktori se uobiajeno dijele na dvije vrste, oni koji
se koriste u biotransformacijama i oni koji se koriste za ispitivanje kinetike, odnosno interakcija
razliitih supstrata i produkata u enzimski kataliziranim reakcijama [Urban et al. 2006].

2. Teorijski dio
2. TEORIJSKI DIO

2.1. Heksanal

Heksanal ili kapronaldehid je aldehid molekulske formule C6H12O. Ima specifian miris,
topljiv je u alkoholu i ulju, ali slabo topljiv u vodi. Vaan je element mirisa cvijeta i lista biljaka
kao to su jabuka, avokado i borovnica. Nastaje tijekom ciklusa linoleinske kiseline (LOX). U
tom ciklusu, linoleinska kiselina uz enzim lipoksigenazu, te uz prisutstvo kisika, kao kosupstrata
prelazi u 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadiensku kiselinu (13-HPOD). U drugom koraku, ta se
kiselina uz hidroperoksid liazu raspada na 12-okso-9-dodekensku kiselinu i heksanal [Mrczy et
al. 2002].
Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatijih kao greennote. Ove komponente su kemikalije koje se upotrebljavaju u prehrambenoj i kozmetikoj
industriji zbog svojih organoleptikih svojstava [Schade et al. 2003]. U dananje vrijeme postoji
poveano zanimanje da se kemijska proizvodnja green-note proizvoda zamijeni biolokom
prirodnom proizvodnjom. Potronja ovih proizvoda dobivenih prirodnim putem se procijenjuje
na 5- 10 tona godinje [Muller et al. 1995].
Osim upotrebe u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji heksanal se koristi i kao
fungicid i baktericid. Dokazano je da kada se pri uzgoju jabuka koristi kao fungicid istovremeno
djeluje i na poboljanje okusa ploda [Song et al. 1996].
Prirodnim putem heksanal se proizvodi fermentacijama, ekstrakcijom iz biljaka ili
enzimski kataliziranim reakcijama. Prilikom upotrebe enzima koriste se proieni enzimi,
ekstrakti stanica, te cijele stanice. Primjer upotrebe izoliranog enzima je alkohol dehidrogenaza
koja je katalizira oksidaciju heksanola kojeg je u prirodi puno vie nego heksanala [KarraChaabouni et al. 2002]. Uz enzimske ekstrakte, heksanal se proizvodi iz linoleinske kiseline, pa
se za njegovu pripravu koriste stanice raznih biljaka (metvica, jagoda, rajica, karanfil) koje
sadre enzime LOX ciklusa. Uz cijele stanice, aldehidi se proizvode mikrobiolokom
oksidacijom primarnih alkohola uz koritenje bakterija Acetobacter i Gluconobacter u
dvofaznom mediju [Vrsalovi Preseki 2006] .

2. Teorijski dio
Kemijskim putem heksanal se proizvodi oksidacijom heksanola uz katalizator
oksoaminijevu sol [Yamaguchi et al. 1990] ili uz metalne katalizatore (mangan, cink, bakar,
eljezo) uz prisutstvo vodikovog peroksida [Guangdong et al. 2005]. Isto tako kemijski se moe
proizvesti redukcijom estera, etil heksanoata, uz litij aluminij hidrid ili heksan kiseline uz
katalizator Cr2O3/TiO2 [Vrsalovi Preseki 2006].

2.2. Enzimi

Naziv enzim prvi je upotrijebio Kuhne (1878. godine), a potjee od grke rijei en ziyme
koja znai u kvascu. Jo od vremena prije starog Egipta datira prva uporaba enzima za ljudske
potrebe (kvasac u proizvodnji kruha). Danas postoji itav niz izoliranih enzima tako da je 1989.
izoliran 2461 enzim dok je 1947. bilo tek 200 izoliranih enzima [Vrsalovi Preseki 2006].
Enzimi su organske makromolekule proteinskog sastava. To su bioloki katalizatori, koji
ubrzavaju kemijske reakcije, a da se pri tome ne troe i ne mijenjaju. Vrlo su aktivni jer vrlo
mala koliina enzima ubrzava reakciju 10 20 puta. Aktivnost enzima izraava se kao koliina
pretvorenog supstrata u mikromolovima u jedinici vremena.
Djelovanje enzima zapoinje tvorbom kompleksa sa supstratom koji ima manju energiju
aktivacije nego aktivirani intermedijer supstrata bez enzima (slika 1). U tom je kompleksu enzim
vezan uz supstrat Van der Waalsovim i elektrostatskim silama, vodikovim vezama ili rijee,
kovalentnom vezom. Kompleksiranje mora biti brzo i reverzibilno, tako da se produkt odvaja od
enzima odmah nakon reakcije i oslobaa enzim za daljnje katalitiko djelovanje. Dok su neki
enzimi strogo specifini i djeluju samo na jedan supstrat, drugi su manje ili grupno specifini.
Specifinost enzima se oituje i prema djelovima molekule koji su udaljeni od mjesta djelovanja
enzima [Schmid et al. 2001].

Slika 1. Mehanizam enzimatske reakcije

4

2. Teorijski dio
Prednosti enzima pred klasinim kemijskim katalizatorima su: selektivno i specifino
djelovanje, blagi uvjeti provedbe reakcija (pH, tlak, temperatura), potrebne male koliine,
biorazgradljivost, obnovljivost izvora, provedba kompleksnih reakcija u jednom stupnju. Glavni
nedostatci enzima su visoka cijene proiavanja i izolacije, teko i skupo odvajanje od
reakcijske smjese, inaktivacija temperaturom, kiselou, bazinou, podlonost ihibiciji
supstratom ili produktom, nestabilnost izvan prirodnog okruenja.
Upotreba enzima see od primjene u industriji detergenata, prehrambenoj, naftnoj,
tekstilnoj te do najvanije, organske sinteze u svrhu proizvodnje vrlo kompleksnih lijekova.
Enzimi se djele u nekoliko skupina: oksidoreduktaze (enzimi koji kataliziraju bioloke
oksidacije i redukcije), transferaze (enzimi koji kataliziraju prijenos skupina), hidrolaze (enzimi
koji kataliziraju hidrolitika cjepanja), liaze (enzimi koji kataliziraju reakcije eliminacije),
izomeraze (enzimi koji kataliziraju pregradnju unutar molekula), ligaze (enzimi koji kataliziraju
stvaranje veze uz istovremeno cijepanje ATP-a) [Louglin 2000].

2.2.1. Oksidoreduktaze

Oksidoreduktaze su enzimi koji kataliziraju redoks reakcije prijenosom vodikovog ili

kisikovog atoma ili elektrona od jednog supstrata do drugog [Vrsalovi Preseki 2006]. Dijelimo
ih na dehidrogenaze, oksigenaze i oksidaze. Imaju veliku vanost u organskim sintezama zbog
velikog broja supstrata s kojima reagiraju kao i zbog posjedovanja enantio-, regio- i
stereoselektivnih svojstava [Sariaslani & Rosazza 1984]. Karakteristika oksidoreduktaza je da
prilikom kataliziranja reakcija, zahtijevaju prisutnost koenzima. Oksidoreduktaze se primjenjuju
za sintezu lijekova, steroida, polimera, oksidativnu razgradnju zagaivaa, te za konstrukciju
biosenzora za razliite analitike i klinike primjene [May 1999].

2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH)

Alkohol dehidrogenaza (ADH) je oksidoreduktaza koja je iroko rasprostranjena u

prirodi. Moe se pronai u mnogim ivotinjama, biljkama i mikroorganizmima. Ima vanu ulogu
5

2. Teorijski dio
u irokom rasponu fiziolokih procesa [Reid & Fewson 1994]. Poznato je da je ADH tetramer
sastavljen od podjedinica molekulske mase priblino 35.000, koje su vrlo sline, no nisu
identine [Harris 1964].

Slika 2. Pojednostavljeni prikaz molekule enzima ADH

Openito se alkohol dehidrogenaze dijele u tri skupine, srednjolana Zn-ovisna ADH kao
ADH iz konjske jetre i ADH iz Saccharomyces cerevisiae, kratkolanana Zn-neovisna ADH kao
ADH iz Lactobacillus brevis i dugolanana Fe-ovisna ADH kao ADH IV iz S. cerevisiae
[Jornvall et al. 1987]. ADH katalizira reverzibilnu oksidaciju alkohola u odgovarajui aldehid ili
keton. U razliitim ogranizmima otkrivene su ADH koje kataliziraju stereospecifinu redukciju
karbonilnih grupa. Alkohol dehidrogenaza komercijalno se proizvodi za odreivanje alkohola u
procesima i u ljudskom tijelu, odnosno tjelesnim tekuinama [Vrsalovi Preseki 2006].

2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+)

Osnovna zadaa koenzima je da djeluju kao transporteri kemijskih grupa od jednog do

drugog reaktanta. Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ukljuen je u mnoge oksidacijske
procese katalizirane dehidrogenazama [Kane 2008]. Nikotinamidni prsten je redoks aktivan,
prima vodikov ion pri emu se reducira u NADH. Reverzibilni transfer vodikovog iona iz
reduciranog supstrata u NAD+ i obrnuto je stereoselektivan i karakteristian za svaki pojedini
enzim [Bruiee & Benkovic 1965]. Nikotinamid koenzimi obino se ne veu na enzime
6

2. Teorijski dio
kovalentnom vezom pa se lagano disociraju. Preskupi su da bi ih se koristilo kao reagense u
stehiometrijskom omjeru, stoga je potrebno pronai nain njihove regeneracije ukoliko enzim
zahtijeva prisutnost koenzima.

Slika 3. Struktura koenzima NAD(P)

Regeneracijom koenzima moe se utjecati na pomicanje reakcijske ravnotee.
Termodinamiki nepovoljnu reakciju moe se, spajanjem s reakcijom regeneracije koenzima,
pretvoriti u termodinamiki povoljnu spreavanjem akumulacije produkta koenzima koji bi
mogao inhibirati proces. U praksi se koristi reducirani oblik nikotinamid koenzima (NADH)
zbog nie cijene od njegovog oksidiranog oblika (NAD+). Postoje razliite metode regeneracije
koenzima, ali sve moraju biti regioselektivne, kompatibilne s glavnom enzimskom reakcijom,
praktine, jeftine, te moraju regenerirati koenzim od 10 2 do 105 puta. Trenutno jedino enzimi
omoguavaju tako visoku selektivnost redukcije NAD+ u NADH i obrnuto. Proces regeneracije
enzimom moe se provesti istim enzimom kao u glavnoj reakciji ili enzimom razliitim od onog
koji se koristi u glavnoj reakciji. Druge metode koje se temelje na kemijskim, elektrokemijskim i
fotokemijskim strategijama nisu dovoljno selektivne [Yoon et al. 2005]. Za uinkovitu
regeneraciju koenzima nuno je da su potrebni enzimi, reagensi i oprema dostupni na tritu,
jeftini i jednostavni za koritenje.

2. Teorijski dio

Slika 4. Mehanizam regeneracije koenzima drugim enzimom

Slika 5. Mehanizam elektrokemijske regeneracije koenzima

2.3. Kinetika enzimskih reakcija

Kinetiki model reakcije je matematiki izraz koji opisuje zavisnost brzine reakcije o
reakcijskim veliinama i parametrima [Gomzi 1998].
Brzina jednosupstratnih enzimskih reakcija opisuje se Michaelis-Menteniinom
kinetikom jednadbom [Dunn et al. 1992]. U navedenoj jednadbi ovisnost poetne brzine
reakcije o koncentraciji supstrata i enzima temelji se na mehanizmu prikazanom sljedeim
jednadbama:

(1)
U prvom koraku dolazi do reverzibilne reakcije enzima (E) i supstrata (S) pri emu
nastaje kompleks enzim-supstrat (ES). Taj kompleks se potom kemijski mijenja to rezultira
stvaranjem produkta (P) i njegovim odvajanjem od enzima. Jednadba koja opisuje MichaelisMenteniinu kinetiku za jednosupstratne enzimske reakcije glasi (jednadba 2):
r

Vm c S
K mS c S

(2)

2. Teorijski dio
U navedenom izrazu cS oznaava koncentraciju supstrata, Vm maksimalnu brzinu reakcije,
KmS Michaelis-Menteniinu konstantu.
Dvosupstratna enzimska kinetika sainjava glavninu svih enzimskih reakcija [Blanch &
Clark 1993], a drugi supstrat je najee koenzim. Michaelis-Menteniin kinetiki model za
dvosupstratnu reakciju, prikazan je sljedeom jednadbom (jednadba 3):
r

S1
m

Vm c S 1 c S 2
c S 1 K mS 2 c S 2

(3)

U reakcijama biotransformacije vrlo esto dolazi do inhibicije i deaktivacije enzima.

Inhibicija enzimski katalizirane reakcije javlja se kada se neki spoj, inhibitor, vee na aktivno
mjesto enzima te tako smanjuje brzinu reakcije. Inhibitor moe biti supstrat ili produkt neke
kemijske reakcije. Tri su tipa reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna (jednadba 4),
nekompetitivna (jednadba 5) i antikompetitivna (jednadba 6) [Laidler & Bunting 1973].

Vm c S

(4)

c
K 1 PP c S
Ki

S
m

Vm c S

c
K mS c S 1 PP
Ki

(5)

Vm c S

c
K mS c S 1 PP
Ki

(6)

Kod kompetitivne inhibicije, inhibitor se vee za aktivno mjesto na enzimu te se pritom

natjee sa supstratom za to mjesto. Inhibitor konkurira za aktivno mjesto i smanjuje na njemu
koncentraciju supstrata. To se oituje kao smanjenje brzine reakcije pri niskim koncentracijama
supstrata, a rezultat je poveanje vrijednosti Michaelis-Menteniine konstante. Kod
nekompetitivne inhibicije dolazi do ireverzibilnog vezanja inhibitora na mjesto razliito od
aktivnog te se tako ometa vezanje supstrata na aktivno mjesto i inhibira brzina enzimske
reakcije. Antikompetitivna inhibicija je kombinacija dviju prethodno navedenih inhibicija.
Drugi razlog zbog kojeg moe doi do smanjenja reakcijske brzine je deaktivacija
enzima. Uzrok smanjenja aktivnosti enzima se vrlo esto ne moe odrediti. Mogui razlozi
deakcivacije su temperatura, tlak, pH, brzina mijeanja, denaturacija proteina, prisutnost ili
9

2. Teorijski dio
odsutnost neke komponente ili kombinacija navedenih faktora [Vrsalovi Preseki 2006]. Brzina
deaktivacije enzima se najee opisuje kinetikom prvog (jednadba 7) i drugog reda (jednadba
8) [Laidler & Bunting 1973].

dVm
k d Vm
dt

(7)

dVm
k d Vm2
dt

(8)

2.4. Mikroreaktori

2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora

Mikroreaktori su reaktorski sustavi izvedeni u mikroskopskom mjerilu koji su, u cijelosti

ili

barem

djelomino,

proizvedeni

koritenjem

metodologije

mikrotehnologije

mikroinenjerstva. Sastoje se od mikrokanala izrazito malih dimenzija, karakteristinih veliina

od 10 - 500 m, urezanih u ploice od stakla, silikona, silicija, polimera, i razliitih drugih
materijala (slika 6) [ali et al. 2010]. Glavna karakteristika tih sustava je smanjenje volumena
procesne opreme na red veliine od desetak nanolitara do jednog mililitra. Zahvaljujui svojim
mikroskopskim dimenzijama mikroreaktori se odlikuju brojnim prednostima u odnosu na
konvencionalne/klasine makroreaktore. Tako mikroreaktori zauzimaju manje prostora, za
provedbu reakcija potrebna je manja koliina kemikalija i energije, a znaajno se smanjuje i
vrijeme provedbe reakcije [Nassar et al. 2007].

Slika 6. Mikroreaktori
10

2. Teorijski dio
S druge strane volumen mikroreaktora je jo uvijek prevelik da bi njegove dimenzije
utjecale na tijek odvijanja reakcije na molekularnoj razini, ali njegove male karakteristine
dimenzije rezultiraju intenzivnijim prijenosom tvari i energije, i unaprjeenjem reima strujanja.
U mikroreaktorima je tok fluida obino laminaran, dok u klasinim reaktorima moe biti
laminaran i turbulentan. Kada su prijenos tvari i topline ograniavajui imbenici, mikroreaktori
su pogodniji za provedbu ovakvih procesa zbog intenzivnijeg prijenosa tvari i topline. Za
mikroreaktore je karakteristian i izrazito velik omjer povrine prema ukupnom volumenu.
Odnos povrine prema volumenu raste sa smanjenjem promjera reaktora. Za mikroreaktore je
omjer povrine prema volumenu u rasponu veliina od 103 105 m2 m-3, dok je ta vrijednost za
makroskopske reaktore oko 102 m2 m-3 [Matsushita et al. 2007]. Primjerice, prenoenjem procesa
iz reaktora volumena 1 dm3 u reaktor volumena 30 m3 (nisu geometrijski slini sustavi), omjer
povrine prema volumenu smanjuje se 30 puta. U sluaju prenoenja procesa u mikroreaktor
volumena 30 cm3, taj omjer raste 3000 puta [Wrz et al. 2001]. Razlika mikroreaktora i
makroreaktora je i u tome to stjenka mikroreaktora ima mnogo vei utjecaj na strujanje fluida
nego stjenka konvencionalnih reaktora.
Veina dananjih istraivanja vezanih uz primjenu mikrokanala usmjerena je prema
razvoju mikrosustava za provedbu i analizu procesa (eng. micro-total-analysis-systems, -TAS).
U idealnim uvjetima takvi sustavi istovremeno obavljaju pripremu uzorka, mijeanje, reakciju,
separaciju, detekciju i obradu podataka. Smatra se da e se zbog mogunosti dobrog ugaanja
protoka i male koncentracije potrebnih reaktanata takvi sustavi moi ugraditi na teko dostupna
mjesta (ljudsko tijelo, dijelovi postrojenja, dna oceana, vrhovi planina, pustinje, polovi,
svemirske letjelice i slino) te kontinuirano pratiti kemijske i biokemijske procese koji se tamo
odvijaju. Trenutno je najvie pozornosti usmjereno prema istraivanju i razvoju -TAS koji se
primjenjuju u analizi DNA i kljunih metabolita vezanih uz razliite bolesti [ali et al. 2010].

2.4.2. Struktura mikroreaktora

Karakteristine dimenzije unutranjih struktura mikroreaktora uglavnom se nalaze u mili, mikro- ili nanopodruju s uim ili irim rasponom veliina pojedinih dijelova ureaja koji su
prikazani na slici 7.

11

2. Teorijski dio

Slika 7. Osnovne strukturne jedinice mikroreaktora

Mikrokanali (slika 7a) su osnovne graevne jedinice mikroreaktora, a u veini sluajeva
su paralelni i nalaze se u nizu jedan do drugoga. Omeeni su spojnicama za dovod reaktanata i
odvod produkata. Mogu biti pravokutnog ili krunog poprenog presjeka, povrine od nekoliko
m2 do nekoliko mm2. Mikrokanali se urezuju u ploice od razliitih materijala (npr. metal,
plastika, keramika) razliitim tehnologijama urezivanja, to ima za posljedicu razliita svojstva
povrine mikrokanala, koja bitno utjeu na karakteristike strujanja fluida i provedbu procesa.
Svaki kanal moe sadravati manje komore, odnosno moe se sastojati od jo sitnijih
mikrostruktura koje oblikom podsjeaju na pore [ali et al. 2010].
Pojedini protoni kanal ili nekoliko povezanih kanala odreene geometrije ini jedan
mikroelement (slika 7b). Tipine dimenzije mikroelementa su 15 mm : 2 mm : 45 mm (irina :
debljina : duljina). S obzirom na izvedbu elementa mikroreaktora, postoje oni s vie

12

2. Teorijski dio
ulaznih/izlaznih procesnih tokova koji se spajaju/razdvajaju u zajednike/odvojene tokove
pomou tzv. Y ili T spojnica (slika 8).

Slika 8. Prikaz T i Y spojnica

Kombinacija mikroelementa, povezanih linija toka fluida i nosaa ini jedan ip (slika
7c.) koji omoguuje lake povezivanje s vanjskim pumpama i detektorima te spajanje vie
elemenata serijski ili paralelno. Mikroreaktorski ipovi se meusobno povezuju paralelno ili
serijski, kako bi se poveala protonost i produktivnost sustava, s obzirom na protok reaktanata,
produkata ili katalizatora. Takav nain povezivanja najee se primjenjuje kod mikroreaktora
koji se koriste za provoenje reakcija u plinskoj fazi. Nijedna elementarna elija ne moe
funkcionirati samostalno jer su joj za neovisan rad potrebni periferni ureaji kao to su
odgovarajue pumpe ili senzori.
Naziv mikroureaj odnosi se na element ugraen u kuite, povezan odgovarajuim
spojnicama s vanjskim pumpama za dovod reaktanata, katalizatora ili povratni tok reakcijske
smjese (slika 7d). Mikroureaj moe biti sastavljen od nekoliko povezanih mikroureaja, koji u
tom sluaju ine njegove osnovne komponente. Paralelno ili serijski povezani mikroureaji,
odnosno razliite mikroprocesne jedinice za pripremu reaktanata i katalizatora, provedbu
reakcije i separaciju produkata predstavljaju tzv. mikropostrojenje. Graa i veliina
mikropostrojenja ovisi o tipu reaktora koji ga ine i o vrsti reakcija koje se u njemu odvijaju te, u
openitom sluaju, o tome jesu li reaktori laboratorijskog ili industrijskog mjerila.

13

2. Teorijski dio
2.5. Biokatalitika oksidacija heksanola uz enzim ADH

Biokatalitika oksidacija heksanola provodi se uz enzim alkohol dehidrogenazu pri emu

kao produkt nastaje heksanal. Za provoenje ove reakcije potrebno je u stehiometrijskom omjeru
dodavati koenzim NAD+ u sustav. Reakcijom se koenzim NAD+ reducira u NADH kojeg je
potrebno regenerirati natrag u NAD+. Regeneracija koenzima NAD+ moe se provesti reakcijom
redukcije acetaldehida uz koenzim NADH enzimom ADH. Reakcijski sustav prikazan je
kemijskim jednadbama na slici 9.

Slika 9. Reakcijski sustav

U dvosupstratnoj reakciji regeneracije acetaldehid se reducira do etanola s koenzimom

NADH o kojem ovisi katalitiko djelovanje enzima alkohola dehidrogenaze. Ravnotea ove
reakcije pomaknuta je ulijevo, pa se udesno pomie dodavanjem NAD + u suviku, podeavanjem
povoljnog pH i dodatkom otopine semikarbazida za uklanjanje etanola.

14

3. Materijali i metode
3. MATERIJALI I METODE

U radu su provedeni pokusi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, regeneracije koenzima

NAD+ u mikroreaktoru, reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima, te potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala. Tijekom ovih
procesa odreivane su koncentracija NADH i aktivnost enzima NADH spektrofotometrijski, te
koncentracije etanola, heksanola i heksanala plinskom kromatografijom.

3.1. Materijali

3.1.1. Kemikalije
U ovom radu koritene su sljedee kemikalije: acetaldehid (Fluka, vicarska), acetonitril
(J. T. Baker, Nizozemska), ADH (Sigma, Belgija), cikloheksanon (Carlo Erba Group,
Francuska), etanol (Carlo Erba Group, Francuska), glicin (Sigma, Belgija), HCl (Kemika,
Hrvatska), heksan (Merck, Njemaka), heksanal (Fluka, vicarska), heksanol (Merck,
Njemaka), NAD+ (Jlich Fine Chemicals, Njemaka), NADH (Jlich Fine Chemicals,
Njemaka), pirofosfat (Kemika, Hrvatska).

3.1.2. Priprema otopina

Za pripremu glicin-pirofosfatnog pufera pH = 9 potrebno je otopiti 8,34 g Na4P2O7 10

H2O i 0,42 g glicina u 250 cm3 redestilirane vode te podesiti pH otopine dodatkom 1 mol/dm 3
otopine HCl.
1 mol/dm3 otopina HCl pripremljena je mijeanjem 8,47 cm 3 36 % - tne HCl sa 100 cm3
destilirane vode.
Otopina za odreivanje badarnog pravca za NADH c = 0,3 mmol/dm3 pripremljena je
otapanjem 1,49 mg NADH u 7 cm3 glicin-pirofosfatnog pufera.

15

3. Materijali i metode
Otopina za odreivanje badarnog pravca za etanol c = 25 mmol/dm3 pripremljena je
mijeanjem 0,0146 cm3 etanola u 10 cm3 glicin-pirofosfatnog pufera.
Otopina za odreivanje badarnog pravca za heksanol i heksanal pripremljena je
razrijeivanjem standardnih otopina heksanola i heksanala 200 puta u heksanu, te mijeanjem s
1%-tnom otopinom cikloheksanona u heksanu.
1 %-tni cikloheksanon pripravljen je mijeanjem 1 cm 3 cikloheksanona u 99 cm3
destilirane vode.
Za odreivanje aktivnosti enzima alkohol dehidrogenaze koritene su sljedee otopine: 2
mmol/L otopina etanola (pripremljena je mijeanjem 2,917 cm 3 etanola s 250 cm3 destilirane
vode), otopina NAD+ c = 25 mmol/dm3 (0,89 g NAD+ otopljeno u 50 cm3 destilirane vode), 75
mmol/dm3 glicin-pirofosfatni pufer pH = 9, suspenzija enzima ADH = 0,2 mg/cm3 (1 mg ADH
otopljen u 5 cm3 destilirane vode).
Sve otopine uvane su u hladnjaku na + 4 C, a prije koritenja zagrijavane su u
termostatu na radnu temperaturu od 25 C.

3.1.3. Aparatura

3.1.3.1. Mikroreaktorski sustav

Mikroreaktorski sustav (slika 10) sastoji se od mikroipa s mikrokanalima od

borosilikatnog stakla (cijevni mikroreaktor, duina : irina : visina = 330 : 250 : 50 m s
unutarnjim volumenom 6 mm3). Srednja hrapavost mikrokanala je u podruju 0,8 2,5 m
ovisno o nainu izrade. Mikroreaktor je opremljen s dva ulaza "Y"-oblika, za odvojeno uvoenje
razliitih procesnih struja i dva izlaza istog oblika. ipovi mikroreaktora smjeteni su u nosa od
nehrajueg elika, koji omoguuje spajanje bez gubitaka (Micronit Microfluidics BV,
Nizozemska). Dvije pumpe (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) opremljene pricama od
nehrajueg elika (8 cm3, Harvard Apparatus, SAD) koritene su za dovoenje procesnih struja.
Mikroreaktorski ipovi su spojeni na pumpe silicijskim cijevicama (375 m O.D., 150 m I.D.,
Micronit Microfluidics BV, Nizozemska). Protok fluida u mikroreaktoru promatran je pomou

16

3. Materijali i metode
mikroskopa povezanog na raunalo (Motic B1-220A, binokularni Weltzar, Njemaka) na
uveanjima od 40 x i 100 x (uveanje okulara = 10 x; uveanje objektiva = 4 x, 10 x).

Slika 10. Mikroreaktorski sustav: a) injekcijske pumpe, b) mikroreaktorski ip na nosau

promatran mikroskopom, c) komponente raunala)

3.1.3.2. Plinski kromatograf

Koncenentracije etanola, heksanola i heksanala odreivane su plinskom kromatografijom

(GC-2014, Shimadzu, Japan) s plameno-ionizacijskim detektorom uz koritenje helija kao plina
nosioca (slika 11).

Slika 11. Plinski kromatograf

17

3. Materijali i metode
3.1.3.3. Spektrofotometar

Dvozrani spektrofotometar (UV-1601, Shimadzu, Japan) koriten je za mjerenje

aktivnosti enzima ADH i za odreivanje koncentracije NADH (slika 12).

Slika 12. UV spektrofotometar

3.1.3.4. Centrifuga

Uzorci su centrifugirani na stojeoj, horizontalnoj centrifugi (Universal 320R, Hettich,

Njemaka) na 9000 min-1 kroz 3 minute (slika 13).

Slika 13. Centrifuga

18

3. Materijali i metode
3.1.3.5. Ostala aparatura

o homogenizator (Vibrofix VF1, IKA-Werke, Njemaka)

o filter (Chromafil Xtra PA 20/25, 0.2 m, 25 mm, a 100, proizvoa, zemlja)
o vaga (EW, max. 1500 g, min. 0.5 g, Kern, zemlja))
o vaga (AUW 120, max. 120 g, min. 10 mg, Shimadzu, Japan)

3.2. Analitike metode

3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH

Aktivnost enzima ADH je odreena spektrofotometrijskim testom koji se temelji na

reakciji oksidacije etanola u acetaldehid u glicin pirofosfatnom puferu pH 9. Shematski se
reakcija moe prikazati jednadbom 9:
(9)
Spektrofotometrijski je mjerena promjena apsorbancije nastalog NADH pri = 340 nm
jer reducirani oblik nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) apsorbira maksimalnu koliinu
svjetla te valne duljine, dok njegova oksidirana forma (NAD+) u valnom podruju 300 400 nm
ne apsorbira svjetlo.
Iz promjene apsorbancije u vremenu ABS/t izraunata je volumna aktivnost enzima
ADH prema izrazu (jednadba 10):

AV =

Vu
D ABS

f
Dt V r e340 d

(10)

gdje su: f faktor razrjeenja; Vr volumen uzorka (cm3); Vu ukupni volumen (cm3);
340 ekstincijski koeficijent (cm2 m-1), iznosi 6,22 cm2 m-1 za = 340 nm; d promjer kivete
(cm). Volumna aktivnost je izraena u meunarodnoj jedinici enzimske aktivnosti U po jedinici
volumena pri emu je 1 U = 1 mol/min, odnosno ona aktivnost enzima koja je potrebna da se
oksidira 1 mol/dm3 supstrata u minuti.

19

3. Materijali i metode
Za test je bilo potrebno u kivetu od 3 cm3 odpipetirati 0,500 cm3 etanola (cEtOH = 2
mol/dm3), 1,000 cm3 NAD+ (cNAD+ = 25 mmol/dm3), 1,490 cm3 pufera (75 mmol/dm3 glicinpirofosfatni pufer pH = 9), 0,010 cm3 enzima (ADH = 0,2 mg/cm3).

3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH

1 cm3 uzorka iz mikroreaktora izmjerena je apsorbancija na spektrofotometru pri = 340

nm. Iz izmjerene apsorbancije izraunata je koncentracija NADH pomou prethodno
konstruiranog badarnog pravca (prilog 1). Badarni pravac odreen je mjerenjem apsorbancije
otopine razliitih poznatih koncentracija NADH na istoj valnoj duljini.

3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala

100 mm3 uzorka iz mikroreaktora pomijeano je sa 100 mm3 1%-tne otopine

cikloheksanona u heksanu koji je koriten kao unutarnji standard. Smjesa je prvo mjeana na
vorteksu 30 60 s kako bi se heksanol i heksanal ekstrahirali, a potom centrifugirana 3 min na
9000 rpm pri 4 C. Nakon centrifugiranja odvojen je i profiltriran gornji organski sloj. Ovaj sloj
je analiziran na plinskom kromatografu s plameno- ionizacijskim detektorom, koritenjem helija
kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB- WAX (l = 30 m; ID = 0,53 mm; df = 1 m).
Temperatura injektora iznosila je 280 C, dok je temperatura detektora bila 240 C. Kolona se
grijala 1 min na temperaturi 50 C, zatim se zagrijavala na 180 C brzinom od 10 C/min, te se
grijala na konanoj temperaturi od 180 C 2 min. Vrijeme zadravanja heksana bilo je 2,1 min,
heksanala 5,9 min, cikloheksanona 9,2 min, a heksanola 9,7 min (prilog 6). Koncentracije
heksanola i heksanala izraunate su pomou prethodno prireenih badarnih pravaca (prilog 3 i
prilog 4).

20

3. Materijali i metode
3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola

Koncentracija etanola odreivana je plinskom kromatografijom s plameno- ionizacijskim

detektorom, koritenjem plina helija kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB-WAX (l = 30 m;
ID = 0,53 mm; df = 1 m). Temperatura injektora iznosila je 240 C, kao i temperatura
detektora. Kolona se grijala 1 min na temperaturi 50 C, zatim se zagrijavala na 125 C kroz 6
minuta. Uzorci su pripremani mijeanjem jednakog volumena uzorka i otopine 1%-tnog
acetonitrila, koji je sluio kao unutarnji standard, na vorteksu tijekom jedne minute. Nakon
centrifugiranja (3 min, 9000 rpm, 4 C) uzorci se injektiraju u plinski kromatograf. Vrijeme
zadravanja etanola je 3,2 min, a vrijeme zadravanja acetonitrila je 4,1 min (prilog 5).
Koncentracija etanola izraunata je pomou prethodno prireenog badarnog pravca (prilog 2).

3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru

3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola

Tijekom provedbe procesa oksidacije heksanola koriten je stakleni mikroreaktor

volumena 6 mm3 s dva ulaza i dva izlaza Y oblika. Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5
mmol dm-3) kao jedna procesna struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm-3) kao druga
procesna struja uvoene su pomou preciznih injekcijskih pumpi (PHD 4400, Harvard
Apparatus, SAD) u mikroreaktor pri protocima od 5-200 mm3 min-1.
Za usporedbu razliitih sustava proces je proveden u mikroreaktorima s glatkim i
hrapavim stjenkama, te pri omjerima organske i vodene faze 1:1 te 3:1.
Uzorci izlaznih procesnih struja za odreivanje koncentracije heksanola i heksanala
prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri emu je volumen 1 %-tnog cikloheksanona
bio duplo vei od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Prije analize na plinskom
kromatografu uzorci su centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 um, 25
mm, Macherey-Nagel GmbH CoKG, Njemaka). Aparatura za provedbu procesa oksidacije
heksanola shematski je prikazana na slici 14.

21

3. Materijali i metode

Slika 14. Shematski prikaz sustava za provedu procesa oksidacije heksanola

3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+

Provedena su dva nezavisna pokusa s istom koncentracijom NADH, ali razliitom

koncentracijom acetaldehida te su praene konverzije pri razliitim vremenima zadravanja.
Koriten je mikroreaktor volumena 6 cm3, s dva ulaza Y-oblika i dva izlaza jednakog
oblika, pri emu je jedan ulaz koriten za uvoenje procesne stuje acetaldehida i pufera, a drugi
za procesnu struju enzima, koenzima i pufera. Otopine su u mikroreaktor uvoene preciznim
injekcijskim pumpama uz konstantni protok (Harvard Apparatus PHD 4400 USA). Pokusi su
provedeni za razliita vremena zadravanja (0,9 9 s) pri emu je protok dviju procesnih struja
uvijek bio jednak. Uzorci su prikupljani u ledu kako bi se zaustavila reakcija.
Koncentracija enzima ADH u oba pokusa je bila 0,2 mg/cm3, koncentracija NADH 5,5
mmol/dm3, a koncentracija acetaldehida u prvom pokusu je bila 5,5 mmol/dm 3, dok je u drugom
bila 44 mmol/dm3. Aparatura za provedbu procesa oksidacije heksanola shematski je prikazana
na slici 15.

Slika 15. Shematski prikaz sustava za provedbu procesa regeneracije koenzima NADH
22

3. Materijali i metode
3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u
serijski povezanim mikroreaktorima

Na slici 16 prikazan je sustav serijski spojenih procesa oksidacije heksanola i

regeneracije koenzima. Reakcije su provoene u 75 mmol/dm 3 glicin-pirofosfatnom puferu pH =
9 pri temperaturi 25 C.
Koriteni su stakleni mikroreaktori volumena 6 cm3 s dva ulaza i dva izlaza Y oblika.
Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5 mmol dm-3) pri protoku 30 mm3 min-1 kao jedna procesna
struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm-3) i enzima ADH ( = 0,2 mg cm-3), pri
protoku 10 mm3 min-1 kao druga procesna struja uvoene su pomou preciznih injekcijskih
pumpi (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) u prvi mikroreaktor. Ulaz u drugi mikroreaktor
jedna procesna struja bila je otopina izreagiranog koenzima NAD + iz prvog mikroreaktora pri
protoku od 10 mm3 min-1, dok je druga procesna struja otopina acetaldehida (c = 2 mmol dm-3)
pri protoku od 10 mm3 min-1.
Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za odreivanje koncentracije
heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri emu je volumen 1
%-tnog cikloheksanona bio duplo vei od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci
izlaznih procesnih struja iz drugog mikroreaktora za odreivanje koncentracije etanola iz jedne
struje i za odreivanje koncentracije NADH iz druge struje, prikupljani su u ledu kako bi se
zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu i spektrofotometru uzorci su
centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 m, 25 mm, Macherey-Nagel
GmbH CoKG, Njemaka).

23

3. Materijali i metode

Slika 16. Shematski prikaz serijski spojenih sustava za za provedu oksidacije heksanola i
regeneraciju koenzima NADH

3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala

Za provedbu potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala koritena je aparatura

shematski prikazana na slici 17. Eksperiment je proveden na isti nain kao i proces oksidacije
heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s tom razlikom
da je procesna struja koja sadri vodenu otopinu enzima ADH i regeneriranog koenzima NAD+
pomou protone pumpe uvoena na ulaz prvog mikroreaktora protokom od 10 mm3 min-1.
Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za odreivanje koncentracije
heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri emu je volumen 1
%-tnog cikloheksanona bio duplo vei od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci izlazne
procesnih struja iz drugog mikroreaktora za odreivanje koncentracije etanola prikupljani su u
ledu kako bi se zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu uzorci su
centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 m, 25 mm, Macherey-Nagel
GmbH CoKG, Njemaka). Aktivnost enzima je praena nakon 1, 4, 22 i 43 sata na svim izlaznim
procesnim strujama, te je praena aktivnost po broju prolaza reaktanata kroz sustav, gdje se jedan
prolaz odnosi na potroenu poetnu koliinu reaktanata u injekcijskim pumpama.

24

3. Materijali i metode

Slika 17. Shematski prikaz potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala

3.4. Obrada podataka

Za simulacije matematikog modela procesa koriteni su raunalni programi Scientist

(Micromath) i MATLAB (MathWork).
Scientist je raunalni program razvijen za primjenu u razliitim podrujima znanosti i
inenjerstva. Omoguava:

rjeavanje sustava jednadbi matematikih modela koji mogu biti sastavljeni od

nelinearnih jednadbi, diferencijalnih jednadbi te Laplace-ovih transformacija

jednostavan unos jednadbi modela

jednostavno upravljanje podacima

statistiku analizu podataka i njihov grafiki prikaz

izraunavanje optimalnih parametara modela.

Algoritmi koje upotrebljava Macromath Scientist prilagoeni su iz razliitih izvora. Za

rjeavanje diferencijalnih jednadbi koriste se etiri standardne metode (Eulerova, Runge-Kuta,
Runge-Kuta metoda kontrole pogreaka i Bulirsch-Stoer metoda) te metoda razvijena za
rjeavanje sustava jednadbi (Episode).

25

3. Materijali i metode
MATLAB je programski jezik za tehnike proraune. Ime je dobio od rijei MATrini
LABoratorij (eng. Matrix Laboratory), poto mu je osnovni element za obradu podataka matrica
(niz). MATLAB slui za rjeavanje razliitih matematikih problema, te itavog niza problema
vezanih uz digitalnu obradu signala, upravljanje, regulaciju i identifikaciju sustava. Koristi se za
matematika izraunavanja, modeliranje i simulaciju, analizu i obradu podataka, grafiko
prikazivanje rezultata i razvoj algoritma.
Programski paket MATLAB ima vie funkcija:

omoguuje lako dodavanje novih funkcija izgraenih pomou ugraenih naredbi,

podaci u MATLAB-u se tretiraju kao matrice, odnosno retci i stupci,

obina varijabla se takoer predstavlja kao matrica s dimenzijom [11],

sadri sve naredbe i operacije iz linearne algebre (zbrajanje, mnoenje, traenje vlastitih
vrijednosti itd.), svi su podaci u obliku pominog zareza dvostruke preciznosti (eng.
double float) to osigurava zadovoljavajuu dinamiku i tonost za gotovo sve primjene,

pored realnih varijabli odnosno matrica, program podrava i kompleksne brojeve.

26

4. Rezultati i rasprava
4. REZULTATI I RASPRAVA

U ovom radu istraivani su tipovi strujanja u mikrokanalima razliite hrapavosti za

razliite omjere protoka organske i vodene faze. Odreene su meufazne povrine pri paralelnom
i segmentiranom strujanju. Odreen je prijenos tvari za komponenete reakcijskog sustava
oksidacije heksanola i regeneracije koenzima. Provedeni su pokusi u kojima su analizirani
razliiti procesni sustavi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, sustavi s i bez regeneracije
koenzima, sustav s povratnim tokom regeneriranog enzima, a u svrhu odreivanja najpovoljnije
procesne konfiguracije.

4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu

Ispitani su tipovi strujanja dvofaznog sustava kapljevina-kapljevina (organska-vodena

faza) u mikrokanalu. Praena je promjena tipova strujanja pri protjecanju dvofaznog sustava kroz
mikrokanale hrapave povrine i mikrokanale glatke povrine, gdje se hrapavost povrine odnosi
na mikrogeometrijsku nepravilnost povrine koja nastaje tijekom postupaka obrade, te promjena
tipova strujanja kao funkcije omjera protoka organske i vodene faze. Na slici 18 prikazane su
fotografije hrapavog i glatkog mikrokanala.

a)

b)

Slika 18. Fotografija a) hrapavog mikrokanala, b) glatkog mikrokanala

Razliita hrapavost povrine mikrokanala utjee na tipove strujanja. Na slici 19 prikazani

su tipovi strujanja u hrapavom i glatkom mikrokanalu pri omjeru protoka organske i vodene faze
30:10 mm3/min. Vidljivo je da je u mikrokanalu hrapave povrine uspostavljeno segmentirano
27

4. Rezultati i rasprava
strujanje, dok je u mikrokanalu glatke povrine uspostavljeno paralelno strujanje dviju faza.
Takoer, u mikrokanalu glatke povrine ne dolazi do mjeanja, a uspostavljena meufazna
povrina je postojana od ulaza do izlaza iz mikrokanala.

a)

b)
Slika 19. Tipovi strujanja za omjer protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min u
mikrokanalima: a) hrapave povrine, b) glatke povrine

Promatrajui tipove strujanja u mikrokanalima glatke povrine pri razliitim omjerima

protoka organske i vodene faze, vidljiva je nestabilnost paralelnog toka pri manjim protocima.
Na slici 20 prikazani su tipovi strujanja za omjere protoka organske i vodene faze 3:1 (slika 20a),
6:2 (slika 20b) i 30:10 (slika 20c) mm3/min. Vidljivo je da je tek pri omjeru protoka 30:10
mm3/min uspostavljen stabilan laminaran tok te su stoga svi daljnji pokusi u ovom radu
provedeni za ovaj omjer protoka organske i vodene faze.

a)

b)

c)

Slika 20. Profili strujanja za razliite omjere protoka organske i vodene faze, a) 3:1
mm /min; b) 6:2 mm3/min; c) 30:10 mm3/min
3

28

4. Rezultati i rasprava
4.1.1. Odreivanje veliine meufazne povrine pri paralelnom i segmentiranom
strujanju u mikrokanalu

Meufazna povrina u dvofaznom sustavu pri paralelnom toku dviju kapljevina,

uspostavjena u mikrokanalu glatke povrine, je jednaka umnoku irine i duljine mikrokanala
(jednadba 11):
Apar = L W = 332 mm 50 m

(11)

i iznosi 1,66 10-5 m2.

Meufazna povrina u dvofaznom sustavu pri segmentiranom toku dviju kapljevina,
uspostavljena u mikrokanalu hrapave povrine, ovisi o ukupnom protoku u mikrokanalu. Ova
meufazna povrina se odreuje zbrajanjem meufazne povrine odvojeno za svaki segment
zasebno, te je reda veliine 10-6 m (slika 21). Kontaktna povrina sa strane vodene faze je vea
od kontaktne povrine sa strane organske faze, zbog naina odreivanja. Aproksimirana je ravna
kontaktna povrina izmeu segmenata, unato njihovoj zaobljenosti, te je stoga kontaktna
povrina sa strane vodene faze porasla zbog smanjenja kontaktne povrine organske faze.
0,00003

A [m2]

0,00002

0,00001

vodena faza
organska faza
0,00000
0

50

100

q [mm3/min]

Slika 21. Ovisnost kontaktne povrine vodene i organske faze o ukupnom protoku prilikom
strujanja u mikrokanalu hrapave povrine

29

4. Rezultati i rasprava
S obzirom da je meufazna povrina u mikrokanalu s glatkom povrinom 10 puta vea od
meufazne povrine mikrokanala s hrapavom povrinom, mogue je oekivati vee reakcijske
brzine, te za mala vremena zadravanja i poveanje konverzije.

4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu

4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima

Ukupna brzina reakcije odreena je enzimskom aktivnou i brzinom kojom se ostvaruje

veza enzim-supstrat. Zbog malih dimenzija mikrokanala, prijenos tvari i brzina difuzije ne
limitiraju ukupnu brzinu reakcije kao u klasinim makroreaktorskim sustavima.
Utjecaj difuzije za reakciju regeneracije koenzima prethodno je eksperimentalno ispitivan
[Ferk & Ivankovi 2011.]. Difuzijski koeficijent (D) za sve komponente koje sudjeluju u reakciji
regeneracije koenzima, a otopljene su u vodi procijenjen je prema Scheibelovoj empirijskoj
korelaciji (jednadba 12):
DS /W

2/3
8.2 108 T 3 VW
1

W VS1/3 VS

(12)

gdje je S ispitivana komponenta (ADH, NADH i etanol), a W otapalo (voda), T je temperatura

(K), VW i Vs su molarni volumeni pojedinih komponenata, a viskoznost otapala (kg/ms).
Difuzijsko vrijeme (D) pojedine komponente izraunato je prema jednadbi 13:

( R) 2
DS /W

(13)

gdje R predstavlja polumjer mikrokanala. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 1.

Za NAD+ difuzijski koeficijent i difuzijsko vrijeme nisu odreivani jer se molarni
volumen NAD+ ne razlikuje znaajno od molarnog volumena NADH.

30

4. Rezultati i rasprava
Tablica 1. Procjenjene vrijednosti difuzijskog koeficijenta i difuzijskog vremena pri 25 C za
sve komponente koje sudjeluju u reakciji regeneracije koenzima
Vs

DS/W 109

[cm3/mol]

[ m2/s]

[s]

ADH

335

0,560

30,55

NADH

305

0,551

27,89

Etanol

55,2

1,563

9,99

Acetaldehid

58,9

1,504

10,39

Komponenta

Dobiveni difuzijski koeficijenti koriteni su u postavljenom 2D matematikom modelu

koji ukljuuje konvekciju u aksijalnom smjeru () i difuziju u aksijalnom i radijalnom smjeru (,

, slika 22).

Slika 22. Shema mikrokanala s pripadajuim dimenzijama

(2W = 220 m, H = 50 m i L = 332 mm)

Bilanca tvari za pojedine komponente (S) u mikrokanalu u stacionarnim uvjetima za

sustav u kojemu se ne odvija kemijska reakcija moe se prikazati sljedeim izrazom (jednadba
14):

( )

cS DS /W 2cS 2cS

W 2 2

(14)

s pripadajuim rubnim uvjetima (jednadbe 15):

31

4. Rezultati i rasprava

cS (0, ) ci , S ;

0 1

cS (0, ) 0;
cE

cE

1 0

, 0
W

1 0

, 0

(15)

L
W

Prvi lan bilance tvari u mikrokanalu (jednadba 15) predstavlja konvekciju, a drugi
difuziju. Iz prvog rubnog uvjeta (jednadba 16) koji se odnosi na procesnu struju otopine s
otopljenom ispitivanom komponentom, slijedi da je koncentracija komponente na ulazu u
mikroreaktor, za interval od 0 do 1 (irina mikroreaktora) jednaka poetnoj koncentraciji u
ulaznoj procesnoj struji. Za interval od -1 do 0 (irina mikroreaktora) iz rubnog uvjeta slijedi da
je koncentracija komponenti jednaka 0. Sljedea dva rubna uvjeta podrazumijevaju da na cijelom
intervalu irine na izlazu iz mikroreaktora i na cijelom intervalu duine na rubovima mikrokanala
nema promjene koncentracije.
cS u jednadbama predstavljaju koncentracije otopljenih komponenti, DS/W predstavlja
difuzijske koeficijente razliite komponente u vodi, ci oznaava ulaznu koncentraciju, v je
linearna brzina strujanja u smjeru .
Nakon to je postavljen matematiki model procesa parcijalna diferencijalna jednadba je
diskretizirana primjenom metode konanih razlika. Dobivena linearna jednadba (jednadba 16)
rijeena je u programskom paketu MATLAB (Prilog 8.4).

( )

cS ,i , j cS ,i 1, j

DS /W cS ,i 1, j 2cS ,i , j cS ,i 1, j cS ,i , j 1 2cS ,i , j cS ,i , j 1

W
2
2

(16)

Dobiveni rezultati simulacije matematikog modela u mikroreaktoru za svaku pojedinu

komponentu reakcijskog sustava regeneracije koenzima prikazani su na slici 23.

32

4. Rezultati i rasprava

a)

b)

c)
Slika 23. Rezultati simulacije matematikog modela difuzije u vodenom dvofaznom sustavu u
mikroreaktoru za: a) ADH, b) NADH, c) etanol
S obzirom na kompleksnost rjeavanja parcijalnih diferencijalnih jednadbi, takoer je
ispitana mogunost upotrebe jednostavnih numerikih aproksimacija za opis difuzije pojedinih
komponenti u mikrokanalu. Kako bi predvidjeli i opisali dogaaje koritena je metoda dvofaznog
idealnog cijevnog reaktora [Ptiar, 2010] gdje je svaka od dvije faze u mikroreaktoru
matematiki opisana kao idealni cijevni reaktor u stacionarnom stanju. Prijenos tvari izmeu faza
odvija se difuzijom koja je opisana jednostavnim kvocijentom razlika koncentracija izmeu dvije
toke i udaljenosti izmeu njih.
Ako je na poziciji x1 koncentracija tvari c1, a na poziciji x2 koncentracija c2
koncentracijski gradijent opisan je izrazom (jednadba 17):

c c 2 c1

x x 2 x1

(17)

33

4. Rezultati i rasprava
Model prijenosa tvari difuzijom izmeu dvije vodene faze prikazan je jednadbom 18
koja je rijeena u programskom paketu Scientist (Prilog 8.3).
1 DS 2
c S 2 (c S c1S )
x
W
D

v c S2 S2 (c S2 c1S )
x
W
v

(18)

Na slici 24 prikazana je usporedba rezultata simulacija dobivenih rjeavanjem

matematikih modela procesa u programskim paketima Scientist (jednadba 18) i MATLAB
(jednadba 16) te je vidljivo da oba modela dobro opisuju eksperimentalne podatke. S obzirom
na jednostavnije i bre rjeavanje matematikog modela procesa koji je temeljen na dvofaznom
idealnom cijevnom reaktoru u ostatku rada koriten je samo ovaj model.

45
40
35

V.A. [U/cm3]

30
25
20
15
10
5
0
0

10

10

[s]

a)
8
7

c [mmol/dm3]

6
5
4
3
2
1
0
0

[s]

b)

34

4. Rezultati i rasprava

c [mmol/dm3]

0
0

10

[s]

c)
Slika 24. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematikog
modela procesa difuzije u mikrokanalu za: a) ADH, b) NADH, c) etanol (: eksperimentalni
rezultati; - - - model rjeavan u Scientistu, model rjeavan u MATLABu]

4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola

Utjecaj prijenosa tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola eksperimentalno je

odreivan u mikroreaktoru. S obzirom na netopivost heksanola i heksanala u vodi, za reakcijski
sustav oksidacije heksanola odreivana je samo difuzija enzima i koenzima (c0,NADH = 7
mmol/dm3, 0,ADH = 0,2 g/cm3). Difuzijski koeficijenti i difuzijska vremena jednaki su onima
procijenjenim u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima.
Iako model za difuziju NADH u organsku fazu nije jednak modelu za difuziju u sustavu
voda-voda koji je koriten za difuziju u procesu regeneracije koenzima, zbog pojednostavljenja
rauna i simulacija pretpostavljeno je da slijede isti trend. Dobiveni rezultati prikazani su na slici
25. Vidljivo je odstupanje od matematikog modela pri viim vremenima zadravanja zbog
pojednostavljenja modela.

35

4. Rezultati i rasprava

9
8
7

c [mmol/dm3]

6
5
4
3
2
1
0
0

10

15

20

[s]

Slika 25. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematikog

modela procesa difuzije u mikrokanalu (metoda dvofaznog idealnog cijevnog reaktora) za
NADH
Kod pokusa u kojima je ispitivana difuzija enzima ADH uoena je njegova deaktivacija u
organskoj fazi te bi za opisivanje ovog sustava u matematiki model procesa bilo potrebno
ukljuiti i koeficijent deaktivacije (slika 26).

30

V.A. [U/cm3]

25
20
15
10
5
0,04

0,00
0

[s]

Slika 26. Eksperimentalni rezultati za ADH

36

4. Rezultati i rasprava
4.3. Reakcija oksidacije heksanola

Napravljeni su pokusi pri razliitim vremenima zadravanja u kojima je reakcija

oksidacije heksanola katalizirana enzimom ADH provedena uz prisustvo ekvimolarne koliine
koenzima NAD+ (c0,heksanol = 5,5 mmol/dm3, c0,NAD+ = 5,5 mmol/dm3, 0,ADH = 0,092 g/cm3) pri
omjeru protoka organske i vodene faze 1:1. Konverzija postignuta u mikroreaktorskom sustavu
za vrijeme zadravanja = 36 s u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama iznosila je 30 %, dok je u
mikroreaktoru s glatkim stjenkama iznosila 60 % (slika 27).

60

X [%]

40

20

0
0

10

20

30

40

[s]

Slika 27. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadravanja za reaktor s hrapavim () i

glatkim () stjenkama pri istim poetnim uvjetima
Takoer, proveden je pokus u mikroreaktoru s glatkim stjenkama pri emu je omjer
protoka organske i vodene faze bio 3:1, te je pri vremenu zadravanja = 36 s dobivena
konverzija od 20 % (slika 28).

37

4. Rezultati i rasprava

50

40

X [%]

30

20

10

0
0

10

15

20

25

30

35

40

[s]

Slika 28. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadravanja za reaktor s glatkim stjenkama
pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1
Moe se zakljuiti da je konverzija za iste uvjete u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama
manja od konverzije postignute u mikroreaktoru s glatkim stjenkama zbog manje meufazne
povrine to je pokazano u poglavlju 4.1.1. Konverzija u mikroreaktoru s glatkim stjenkama
manja je u sustavu s omjerom faza 3:1 zbog deaktivacije enzima ADH organskom fazom.
Unato manjoj vrijednosti postignute konverzije sustav u kojemu je omjer protoka faza bio 3:1 je
bolji za provedbu integriranog procesa jer se faze u potpunosti razdvajaju na izlazu iz
mikroreaktora.

4.4. Reakcija regeneracije koenzima

Reakcija regeneracije koenzima (redukcija acetaldehida) provedena je u dva pokusa s

razliitim poetnim uvjetima. U pokusu 1 poetne koncentracije komponenata reakcijske smjese
bile su c0,acetaldehid = 6,9 mmol/dm3, c0,NADH = 5,5 mmol/dm3, 0,ADH = 0,2 g/cm3. U pokusu 2
poetne koncentracije komponenata reakcijske smjese bile su c0,acetaldehid = 44 mmol/dm3, c0,NADH =
5,5 mmol/dm3, 0,ADH = 0,2 g/cm3.

38

4. Rezultati i rasprava

100

X [%]

80

60

40

20

0
0

10

[s]

Slika 29. Ovisnost konverzije etanola o vremenu zadravanja za pokus 1 () i pokus 2 () pri
razliitim poetnim uvjetima [: model]

Postignuta konverzija u procesu regeneracije koenzima provedenom s ekvimolarnim

koncentracijama reaktanata iznosila je 80 %, dok je u pokusu sa suvikom acetaldehida (pokus 2)
konverzija iznosila 100 % (slika 29).

4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u

serijski povezanim mikroreaktorima

Na slici 30. prikazan je shematski prikaz reakcije oksidacije heksanola i reakcije

regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s izlaznim koncentracijama i
postignutim konverzijama.

39

4. Rezultati i rasprava

cNADH = 0 mmol/dm

cEtOH = 0,654 mmol/dm

cNADH = 0 mmol/dm3

cNADH = 0,66 mmol/dm

XNADH = 100 %
3

cheksanol = 3,21 mmol/dm

cheksanal = 0,66 mmol/dm

Xheksanol = 17, 22 %
Slika 30. Shematski prikaz serijski spojenog glavnog i regeneracijskog sustava sa zavrnim
koncentracijama i dobivenim konverzijama
Postignuta konverzija heksanola pri ukupnom protoku od 40 mm3/min u mikroreaktoru
za provedbu glavne reakcije iznosila je 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju
ostvarena 100 %tna regeneracija koenzima NAD+ pri ukupnom protoku od 20 mm3/min.
Vrijeme zadravanja u mikroreaktoru za provedbu glavne reakcije za heksanol je = 12 s,
dok je za NAD+ = 36 s. Vremena zadravanja u mikroreaktoru za provedbu regeneracije za
obje procesne struje = 36 s. Stoga je reakcija provoena tijekom etiri vremena zadravanja
komponenti s veim vremenom zadravanja, tj. reakcija je provoena 144 s.

4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala

Proces potpuno integrirane proizvodnje heksanala (slika 14) proveden je pod istim
poetnim uvjetima kao i oksidacija heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima. Na slici 31 prikazane su koncentracije heksanola i heksanala na
izlaznoj procesnoj struji iz provog mikroreaktora i koncentracije etanola na izlaznoj procesnoj
struji iz drugog mikroreaktora u ovisnosti o vremenu, dok je na slici 32 prikazana ovisnost
konverzije heksanola o vremenu provoenja eksperimenta.
40

4. Rezultati i rasprava

4,0
3,5

c [mmol/dm3]

3,0

heksanol
heksanal
etanol

2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

t [h]

Slika 31. Ovisnost koncentracija heksanola, heksanala i etanola na izlazima o vremenu

20

X [%]

15

10

0
0

10

20

30

40

50

t [h]

Slika 32. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu

U procesu proizvodnje heksanala u potpuno integriranom sustavu postignuta je

maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan unutar prva 4 h provedbe pokusa nakon
ega je dolo do postupnog pada konverzije uslijed deaktivacije enzima, to je takoer vidljivo iz
poveanja koncentracije heksanola nakon prva 4 h provedbe pokusa. Za postizanje boljih
rezultata potrebna je daljnja optimizacija sustava, prvenstveno u smislu poveanja stabilnosti
enzima u prisutnosti organskog otapala.
Praena je i aktivnost enzima po prolazu to je prikazano na slici 33. S obzirom da su za
recirkulaciju potrebna dva klipa, od kojih se jedan neprestano prazni, a drugi puni, kraj prvog
41

4. Rezultati i rasprava
prolaza je kada se prvi klip u potpunosti isprazni, a drugi napuni. Tada oni zamijene svoje
funkcije i onaj koji se do tada punio, sada se poinje prazniti, i obrnuto. Vrijeme jednog prolaza
je 27 h.

V.A. [U/cm3]

20

10

0
0

10

20

30

40

50

60

t [h]

Slika 33. Ovisnost aktivnosti enzima o vremenu trajanja procesa

Takoer, praena je aktivnost enzima u vremenu (slika 34), tj. dio enzima koji je koriten
za reakciju, sauvan je u zasebnoj kiveti. Dakle praena je aktivnost enzima koji nije sudjelovao
u reakciji kako bi se vidjelo kada prestaje djelovanje enzima bez obzira na reakciju.
25

V.A. [U/cm3]

20

15

10

0
0

10

20

30

40

50

60

70

t [h]

Slika 34. Dinamika promjena aktivnosti enzima na sobnoj temperaturi u nezavisnom

pokusu

42

4. Rezultati i rasprava
Prema slici 33 vidljivo je da je enzim prestao biti aktivan nakon drugog prolaza, to je u
naem sluaju bilo 54 h nakon poetka procesa, dok je na slici 34 vidljivo da bi enzim trebao biti
aktivan 72 sata. Razlog to do opadanja aktivnosti enzima u procesu dolazi ranije je zbog
inhibicije organskih otapala (acetaldehida, heksana, heksanola i heksanala), te je mogue
zakljuiti da proces zahtijeva daljnju optimizaciju.

43

5. Zakljuak
5. ZAKLJUAK

U ovom radu proveden je potpuno integriran proces proizvodnje heksanala s potpuno

integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva meusobno serijski povezana
mikroipa.
U mikrokanalu s hrapavom povrinom ostvareno je segmentirano strujanje, dok je u
mikrokanalu s glatkom povrinom uspostavljeno paralelno strujanje. Vea meufazna povrina
postignuta je u mikrokanalu s glatkom povrinom te je stoga i konverzija heksanola u ovakom
reaktoru vea. Takoer je uoeno da je pri omjeru protoka organske i vodene faze 30:10
mm3/min uspostavljen stabilan paralelan tok ovih faza. Stoga su svi daljnji pokusi
biotransformacije heksanola bili provoeni u mikrokanalu s glatkim stjenkama pri omjeru
protoka organske i vodene faze 30:10 mm 3/min.
Analiziran je utjecaj difuzije komponenata reakcijske smjese na uinkovitost procesa u
svakom od serijski povezanih mikroipova, odnosno za reakciju oksidacije heksanola i reakciju
regeneracije koenzima. Za proces regeneracije koenzima NAD+ uoeno je da etanol izrazito
difundira iz jedne faze u drugu, za razliku od enzima i koenzima. Pokazano je da rezultati
simulacije matematikog modela procesa dobro opisuju eksperimentalne podatke. U procesu
oksidacije heksanola uoena je izrazita difuzija NADH iz vodene u organsku fazu, kao i
postepena deaktivacija enzima djelovanjem organskog otapala.
Za sustav oksidacije heksanola u mikrokanalu s glatkim povrinama pri omjeru protoka
organske i vodene faze 1:1 postignuta je konverzija od 60 % pri vremenu zadravanja 36 s, dok
je pri istom vremenu zadravanja uz omjer protoka organske i vodene faze 3:1 postignuta
konverzija od 20 %. Unato manjoj konverziji pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1, pri
tom omjeru protoka faza bolje je odvajanje faza na izlazu iz mikroreaktora te je ovaj omjer
protoka pogodniji za pri provedbi integriranog procesa proizvodnje heksanala. U sustavu
regeneracije koenzima postignuta je konverzija od 80 % pri vremenu zadravanja od 9 s u
pokusu s ekvimolarnim koncentracijama reaktanata, dok je u pokusu sa suvikom acetaldehida
pri istom vremenu zadravanja postignuta konverzija od 100 %. U procesu reakcije oksidacije
heksanola i regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima postignuta je
konverzija heksanola od 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju ostvarena 100 %tna
regeneracija koenzima NAD+. U potpuno integriranom procesu proizvodnje heksanala postignuta
44

5. Zakljuak
je maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan prva 4 h provedbe pokusa nakon ega
dolazi do opadanja konverzije uslijed deaktivacije enzima.
Promatrani integrirani sustav moe se koristiti kao proces za proizvodnju heksanola, ali je
nuna daljnja optimizacija procesnih uvjeta prvenstveno zbog nedovoljne stabilnosti koritenog
enzima. Kao sljedei korak u daljnjem razvoju potpuno integriranog procesa proizvodnje
heksanala nuna je integracija ekstrakcije dobivenog heksanala i recirkulacija regeneriranog
heksanola.

45

6. Literatura
6. LITERATURA

1. Blanch H.W., Clark D.S., Biochemical Engineering, Marcel Dekker, New York, 1993,
str. 151-157
2. Bruiee T.C., Benkovic S.J., Biorganic Mechanisms, Benjamin, New York, 1965, str. 301
3. Brunerie P., Koziet Y., Process for producing natural cis-3-hexenol from unsaturated fatty
acids, US Patent 5,620,879, 1997
4. Doku G.N., Verboom W. , Reinhoudt D.N., van den Berg A., Tetrahedron 61 (2005) 2733
5. Dunn I.J., Heinzle E., Ingham J., Prenosil J.E., Biological Reaction Engineering, WileyVCH, Weinheim, 1992, str. 25-31
6. Ehrfeld W., Hessel V., Lwe H., Microreactors: New Technology for Modern Chemistry.
Wiley-VCH, Weinheim, 2000, str. 1-34
7. Ferk E., Ivankovi M., Regeneracija koenzima NAD+ u mikroreaktoru, kemijskoinenjerske vjebe, Zagreb, 2011.
8. Gargouri M., Akach N.B., Legoy M.D., Coupled hydroperoxide lyase and alcohol
dehydrogenase for selective synthesis of aldehyde or alcohol, Appl. Biochem.
Biotechnol. 119 (2004) 171-180
9. Geyer K., Codee J.D., Seeberger P.H., Microreactors as tools for synthetic chemist- the
chemists round bottomed flask of the 21st century?, Chem. Eur. J. 12 (2006) 8434-8442
10. Gomzi Z., Kemijski reaktori, HINUS, Zagreb, 1998, str. 36-55
11. Guangdong Z., Zhanlin X., Xiaohong G., Hong Z., Yanan L., Xueju L., Tiexin C.,
Wenxing L., Kaiji Z., Transition metal substitued tungstophosphoric compound catalyzed
oxidation of hexanol to hexanal with hydrogen peroxide, React. Kinet. Catal. Lett. 85
(2005) 57-64
12. Harris J.I., Structure and catalytic activity of alcohol dehydrogenase, Nature 203 (1964)
30-34
13. Hildebrand D.F., Lipoxygenases, Plant Physiol. 76 (1989) 249-253
14. Jensen K.F., Microreaction engineering- is small better?, Chem. Eng. Sci. 56 (2001) 293303

46

6. Literatura
15. Jornvall H., Persson B., Jeffery J., Characteristics of alcohol/polyol dehydrogenases, the
zinc- containing longchain alcohol dehydrogenases, Eur. J. Biochem. 167 (1987) 195-201
16. Kane C., Tzedakis T., AIChE Journal 54 (2008) 365
17. Karra- Chaabouni M., Pulvin S., Meziani A., Thomas D., Touraud D., Kunz W.,
Bioxidation of n-hexanol by alcohol oxidase and catalase in biphasic micelar systems
without solvent, Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 27-32
18. Laidler K.J., Bunting P.S., The chemical kinetics of enzyme action, Claredon Press,
Oxford, 1973, str. 93-97, 430-435
19. Louglin W.A., Biotransformation in organic synthesis, Bioresource Technol. 74 (2000)
49-62
20. Mrczy J.S., Nmeth .S., Samu Z., Hger-Veress ., Szajni B., Production of hexanal
from hydrolized sunflower oil by lipoxygenase and hydroperoxid lyase enzymes,
Biotechnol. Lett. 24 (2002) 1673-1675
21. Matsushita Y., Ichimura T., Ohba N., Kumada S., Sakeda K., Suzuki T., Tanibata H.,
Murata T., Pure. Appl. Chem. 79 (2007) 1959
22. May S.W., Applications of oxidoreductase, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 370-375
23. Muller B.L., Dean C., Whitehead I.M., The industrial use of plant enzymes for the
production of natural green note flavour compounds, Bioflavour 95, Dijon (France)
(1995) 339-344
24. Nassar R. Hu J., Palmer J., Dai W., Catal. Today 120 (2007) 121
25. Ptiar A., Numerike aproksimacije modela enzimske oksidacije L-DOPA u
mikroreaktoru, diplomski rad, Sveuilite u Zagrebu, Zagreb, 2010
26. Reid

M.F.,

Fewson

C.A.,

Molecular

characterization

of

microbial

alcohol

dehydrogenases, Crit. Rev. Microbiol. 20 (1994) 13-56

27. Santiago- Gmez M.P., Thanh H.T., Coninck J.D., Cachon R., Kermasha S., Belin J.M.,
Gervais P., Hisson F., Modelling hexanal production in oxido-reducing conditions by the
yeast, Yarrowia lipolytica, Proc. Biochem. 44 (2009) 1013-1018
28. Sariaslani F.S., Rosazza J.P.N., Biocatalysis in natural products chemistry, Enzyme
Microb. Technol. 6 (1984) 242-253
29. Schade F., Thompson J.E., Legge R.L., Use of a plant-derived enzyme template for the
production of the green-note volatile hexanal, Biotechnol. Bioeng. 84 (2003) 265-273
47

6. Literatura
30. Schmid A., Dordick J.S., Hauer B., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B., Industrial
biocatalysis today and tomorrow, Nature 409 (2001) 258-268
31. Song J., Leepipattwit R., Deng W., Beaudry R., Hexanal vapor acts as residueless
antifungal agent that enhances aroma biosynthesis in apple fruit, Acta Hort. 464 (1996)
219-224
32. ali A., Tuek A., Kurtanjek ., Zeli B., Kem. Ind. 59 (2010) 227-248
33. ali A., Tuek A., Kurtanjek ., Zeli B., Biotechnol. Bioproc. Eng. 16 (2011) 495-504
34. Urban P.L., Goodall D.M., Neil C., Bruce N.C., Enzymatic microreactors in chemical
analysis and kinetic studies, Biotechnol. Adv. 24 (2006) 42-57
35. Vrsalovi Preseki A., Studij fumaraze i alkohol dehidrogenaze u biotransformacijama,
dizertacija, Sveuilite u Zagrebu, Zagreb, 2006
36. Whitehead I.M., Muller B.L., Dean C., Industrial use of soybean lipoxygenase forthe
production of natural green note flavor compounds, Cereal Foods World 40 (1995) 193197
37. Wrz O., Jckel K.P., Richter T., Wolf A., Chem. Eng. Technol. 24 (2001) 138
38. Yamaguchi M., Miyazawa T., Takata T., Endo T., Application of redox system based on
nitroxides to organic synthesis, Pure Appl. Chem. 62 (1990) 217-222
39. Yokoyama T., Yamagata N., Hydrogenation of carboxylic acids to the corresponding
aldehydes, Appl. Catal. A. General 221 (2001) 227-239
40. Yoon S.K., Choban E.R., Kane C., Tzedakis T., Kenis P.J.A., J. Am. Chem. Soc. 127
(2005) 10466.
41. Yoshida J., Nagaki A., Iwasaki T., Suga S., Chem. Eng. Technol. 28 (2005) 259.

48

7. Popis simbola
7. POPIS SIMBOLA

Simboli
A

- povrina [m2]

ABS

- aprosbancija [-]

- mnoinska koncentracija [mol/dm3]

- promjer kivete [cm]

- difuzijski koeficijent [m2/s]

df

- debljina filma [m]

- faktor razrjeenja [-]

- visina mikroreaktora [m]

ID

- unutarnji promjer kolone [mm]

Kd

- deaktivacijska konstanta [min-1]

Ki

- inhibicijska konstanta [mmol/dm3]

Km

- Michaelis-Menteniina konstanta [mmol/dm3]

- duljina kolone [m]

- duljina mikroreaktora [m]

- konverzija [%]

- brzina reakcije [U/mg]

- vrijeme [s]

- temperatura [C]

- volumen [m3]

V.A.

- volumna aktivnost [U/dm3]

Vm

- maksimalna brzina reakcije [U/g]

- irina mikroreaktora [m]

49

7. Popis simbola
Grki simboli

- masena koncentracija [mg/dm3]

- ekstinkcijski faktor [cm2/m]

- viskoznost [Pa s]

- valna duljina [nm]

- vrijeme zadravanja [s]

Indeksi
P

- produkt

- uzorak

- supstrat

- ukupno

- voda

50

8. Prilozi
8. PRILOZI
8.1. Badarni pravci

1,5

y = 5,0624x
R2 = 0,9998

ABS

1,0

0,5

0,0
0,0

0,1

0,2

0,3
3

cNADH [mmol/dm ]

Prilog 1. Badarni pravac za odreivanje koncentracije NADH

0,14

y = 0,0054x
R2 = 0,9983

0,12
0,10

ABS

0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0

10

15

20

25

cEtOH [mmol/dm3]

Prilog 2. Badarni pravac za odreivanje koncentracije etanola

51

8. Prilozi

0,040
0,035

y = 0,0078x
R2 = 0,9915

0,030

ABS

0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0

cheksanol [mmol/dm ]

Prilog 3. Badarni pravac za odreivanje koncentracije heksanola

0,030

0,025

y = 0,0059x
R2 = 0,9958

ABS

0,020

0,015

0,010

0,005

0,000
0

cheksanal [mmol/dm ]

Prilog 4. Badarni pravac za odreivanje koncentracije heksanala

52

8. Prilozi
8.2. Kromatogrami

Prilog 5. Tipini kromatogram za etanol

Prilog 6. Tipini kromatogram za heksanal

53

8. Prilozi
8.3. Jednodimenzijski matematiki model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
Scientist

// MicroMath Scientist Model File

IndVars:z
DepVars:ce1,ce2
Params:De,W
v*ce1'=-(De/W^2)*(ce1-ce2)
v*ce2'=(De/W^2)*(ce1-ce2)
z=0
ce1=0
ce2=5
De=0.00156
W=0.125
v=213.33
***

8.4. Dvodimenzijski matematiki model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu

MATLAB
clear all
clc
close all
% poetni uvjeti
% nadh-reg

k1=1328;
k2=1;
k3=0.00001512;
x=[1:50];
y=[1:9];
c(51,y)=0;
c(1,1:5)=0;
c(1,5:8)=7;
i=[0:6];
c(2:3,7)=7;
c(2:4,8)=7;

for x=1:50
for y=1:8
for i=0:50
if y>5 && x==2+i
c(x,y)=7;

54

8. Prilozi
for y=8:-1:1
if y<5 && x==2+i
c(x,y)=0;

for x=1:50
for y=1:7
for i=0:50
for z=2:50
c(4:50,8)=c(4:50,7);
if y==5+i && x==z+i
c(x,y)=c(x+1,y);
c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2);
fprintf('c1=%g\n',c(x,y));
for y=8:-1:2
for i=0:50
for z=1:50
c(4:50,1)=c(4:50,2);
y==5-i && x==z+i

if

c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2);
fprintf('c2=%g\n',c(x,y));
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end
end

55

IVOTOPIS
Mia Ivankovi je roena 8. veljae 1989. godine u Koprivnici gdje je s izvrsnim
uspjehom zavrila Osnovnu kolu i Prirodoslovno matematiku gimnaziju. kolsku godinu
2000./2001. pohaala je na engleskom jeziku u Meunarodnoj osnovnoj koli u Ljubljani. 2007.
godine upisala je preddiplomski studij Kemijsko inenjerstvo na Fakultetu kemijskog
inenjerstva i tehnologije Sveuilita u Zagrebu. Demonstrator je na Zavodu za mehaniko i
toplinsko procesno inenjerstvo od 2009. godine te na Zavodu za reakcijsko inenjestvo i
katalizu od 2011. godine. 2009. godine sudjelovala je u pripremi provedbe znanstvenoistraivakog projekta EU FP6 - Javnozdravstveni utjecaj dugorone izloenosti niskoj razini
mjeavine elemenata na podlone skupine stanovnitva (Public health impact of long-term, lowlevel mixed element exposure in susceptible population strata (PHIME) www.phime.org).
Sudjelovala je na 6. susretu studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopenjem
Laccase based oxidation of phenol in microreactor 2010. godine u Zagrebu, te na 7. susretu
studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopenjem NAD+ coenzyme
regeneration in microchannel kinetic parameters estimation and modelling 2011. godine u
Mariboru. Koautor je nagraenog postera na 1st European Congress of Applied Biotechnology u
Berlinu 2011. godine. Sudjelovala je na IX. Susretu mladih kemijskih inenjera s posterima
Razvoj potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala u mikrokanalu i Niskotemperaturna razgradnja duikovog monoksida na Au/Fe2O3 katalizatoru. Dobitnica je
Dekanove nagrade u ak. god. 2009./2010. za zapaeni znanstveni rad. Preddiplomski studij je s
izvrsnim uspjehom zavrila 2010. godine i upisala diplomski studij Kemijsko procesno
inenjerstvo. Provela je pet mjeseci u 2012. godini na Katholieke Universiteit Leuven, u sklopu
programa razmjene studenata Erasmus. Aktivno se slui engleskim jezikom, a pasivno
njemakim. Tokom studiranja zavrila je 3. stupanj francuskog jezika.