Sistematika zaraznih bolesti domaih ivotinja

Naini razvrstavanja zaraznih bolesti mogu biti razliiti i mijenjaju se od autora do autora
ovisno o tradiciji karakteristinim za pojedine znanstveno istraivake ustanove,
sveuilita odnosno drave. Uobiajena sistematika zaraznih bolesti zasniva se na podjeli
prema:
1. Etiologiji (vrsti uzronika bolesti)
2. Duljini trajanja bolesti
3. Duljini trajanja i simptomima bolesti
4. Prikazu zaraznih bolesti po organskim sustavima
Razvrstavnje po etiologiji dijeli zarazne bolesti na bolesti uzrokovane: bakterijama,
virusima, mikoplazmama, rikecijama, gljivicama i prionima, a esto se zarazne bolesti
prikazuju prema velikim skupinama uzronika: bakterijske bolesti goveda, virusne bolesti
konja i sl. Prema duljini trajanja zarazne bolesti mogu se podijeliti na: perakutne,
akutne, subakutne, kronine i inaparentne (latentne). Duljina trajanje perakutne bolesti
iznosi do 1 dan, akune do 7 dana, subakutne do 14 dana i kronine preko 21 dan. Prema
duljini trajanja bolesti i klinikim simptomima bolesti zarazne bolesti dijele se obino na
akutne koje se dijele na vie podskupina kao to su: akutne septikemijske zarazne bolesti,
akutne egzantematine zarazne bolesti, akutne zarazne bolesti s lokalizacijom, akutne
ope zarazne bolesti s izrazitom organskom manifestacijom, plinovite edeme i
enterotoksemije, zarazne bolesti sredinjeg ivanog sustava itd. Kronine zarazne bolesti
mogu se dijeliti na: kronine zarazne bolesti specifine upale, kronine zarazne bolesti
nespecifine upale, mikoze, mikotoksikoze, tumore itd. esto se dogaalo da su u jednoj
knjizi zarazne bolesti bile prikazane na vie naina, a danas je najprisutnija podjela
zaraznih bolesti prema vrstama uzronika.
Na Zavodu za mikrobiologiju i zarazne bolesti s klinikom ubiajena praksa u provedbi
nastave iz predmeta Zarazne bolesti domaih ivotinja je podjela zaraznih bolesti na
osnovi simptoma bolesti. Osnova te sistematike su dvije velike skupine bolesti: akutne i
kronine koje se sastoje od niza podskupina koje su kliniki meusobno sline, ali se

mogu razlikovati. Ovakva podjela pogoduje veterinaru praktiaru da na osnovi

anamnestikih podataka i klinikih sindroma karakteristinih za akutne ili kronine
zarazne bolesti donese odluku kojoj velikoj skupini pripada bolest koju treba
dijagnosticirati, a na isti nain svrstati je u odgovarajuu podskupinu te se diferencijalno
dijagnostiki odrediti o kojoj bolesti se radi, te postaviti privremenu kliniku dijagnozu.
Zbog brojnih slinosti koje su zajednike za bolesti iz skupina

akutnih odnosno

kroninih zaraznih bolesti opisati emo klinike i patoloke sindrome koji se pritom
pojavljuju, a razumjevanje ovih sindroma uveliko e olakati praenje nastave iz
predmeta.
Osnovne klinike karakteristike akutnih zaraznih bolesti
Osnovna karakteristika akutnih zaraznih bolesti je brzina razvoja bolesti. Po klinikim
simptomima akutna zarazna bolest moe biti:
1. Opa, generalizirana, septikemijska, pa je u tom sluaju moemo nazvati opom
septikemijskom ili akutnom septikemijskom zaraznom bolesti. To je oblik
zarazne bolesti pri kojem su zahvaeni svi organi i tkiva, pri emu se kliniki
javlja opi infekcijski sindrom (OIS). OIS je nespecifian, ali karakteristian
sindrom akutnih zaraznih bolesti koji se pojavljuje u blaem ili jaem obliku kod
svih akutnih zaraznih bolesti u stadiju generalizacije. Oituje se kroz pojavu
povienih tjelesne temperature, frekvencije bila i disanja, smanjenog ili potpunog
gubitka apetita, ope slabosti i potitenosti. Vidljive sluznice su upalno zaarene i
prokvaene, srani tonovi su naglaeni, a zbog poviene temperature moe se
pojaviti koprostaza ili zaep. ivotinja se narado kree i uglavnom lei i ne mari
za okolinu. Simptomi OIS-a mogu nastupiti iznenadno i estoko pri emu
govorimo o perakutnom nastupu bolesti ili se postupno razvijaju kroz nekoliko
dana kada na vrhuncu bolesti ivotinja moe uginuti ili nastupa oporavak kao
rezultat lijeenja ili na osnovi nespecifine i specifine obrane makroorganizma.
2. Akutne zarazne bolesti mogu se oitovati i promjenama na koi i sluznicama pa ih
nazivamo akutnim egzantematinim zaraznim bolestima, a obino su

uzrokovane epiteliotropnim virusima. Kliniki se oituju predilekcijskim

promjenama na koi i/ili sluznicama ili generalizirano na koi i sluznicama.
Obino se javlja i OIS koji je jae izraen kod generaliziranog oblika, no blai je
od OIS-a koji se javlja kod akutnih septikemijskih bolesti. Kada promjenama
budu zahvaene i epitelne stanice unutranjih organa (dinog, probavnog) tada se
uz egzantematine promjene i OIS javlja i kataralni sindrom uz este sekundarne
bakterijske infekcije.
3. Neke akuzne zarazne bolesti mogu biti primarno ope infekcije, pri emu je OIS
nedovoljno naglaen, ali je lokalna organska upala izrazita. Takve zarazne bolesti
nazivamo akutnim opim zaraznim bolestima s izrazitom organskom
manifestacijom kao npr. zarazna agalakcija ovaca i koza.
4. Akutne zarazne bolesti mogu biti izrazito lokalne (organske) i takvima i ostaju
ukoliko nisu napravljene pogreke u lijeenju i dranju bolesne ivotinje
(drebeak, nekrobaciloza, zarazni keratokonjunktivitis).
5. Zarazne bolesti koje se primarno oituju promjenama na sredinjem ivanom
sustavu (SS), obino su akutnog (bjesnoa) ili perakutnog (Aujeszkyjeva bolest)
tijeka, a zbog javno zdravstvenog znaaja svrstavaju se u posebnu skupinu.
Kliniki simptomi promjena na SS-u, esto se pojavljuju i kao posljedica
septikemije u nekih opih septikemijskih zaraznih bolesti (bedrenica, listerioza,
klasina svinjska kuga).
6. U posebnu skupinu mogu se svrstati bolesti uzrokovane anaerobnim bakterijama
iz roda Clostriduim (plinoviti edemi i enterotoksemije). One se oituju izrazitim
perakutnim tijekom uz pojavu lokalnih miozitisa, estokog OIS-a i poremeaja
svijesti.
7. Posebnu skupinu predstavljaju takozvane uvjetne zarazne bolesti. Primarni
uzronik tih bolesti su mikrooorganizmi koji su sastavni dio mikroflore pojedinih
organskih sustava. Zbog ubikvitarnosti tih mikroorganizama za kliniki nastup
bolesti najvaniji su stresni imbenici koji dovode do pada ope otpornosti
ivotinja. Stoga se uvjetne zarazne bolesti najee pojavljuju u intenzivnim
farmskim uzgojima ivotinja (enzootska bronhopneumonija goveda, zarazni

proljevi mladunadi), ali i sporadino u malim obiteljskim uzgojima (svinjski

vrbanac).
Akutne zarazne bolesti mogu zavriti uginuem ili klinikim ozdravljenjem ivotinje.
Ovisno o pojavi klinikih sipmtoma tijekom bolesti patoloke promjene u uginulih ili
rtvovanih ivotinja mogu biti razliite.
Akutne septikemijske zarazne bolesti: opa je pojava da su zbog kratkog tijeka bolesti
leine uginulih ivotinja obino srednjeg gojnog stanja (izuzetak mogu biti kronini
oblici primarno akutnih zaraznih bolesti kao npr. infektivna anemija kopitara ili klasina
svinjska kuga). Pretragom vidljivih sluznica nalazimo obino upalnu hipermiju

iscjetkom i lokalnim krvarenjima. U potkoju moemo nai krvarenja i promijenjene

limfne vorove. U velikim seroznim upljinama nalazimo serofibrinozni eksudat, a po
pleuri i peritoneumu krvarenja. Parenhimski organi obino su poveani i degenerirani, s
nalazom krvarenja po njihovim serozama ili u parenhimu.
U skupini akutnih egzantematinih bolesti uginua bolesnih ivotinja obino nisu esta,
a posljedica su sekundarnih infekcija. Na predilekcijskim mjestima nalazimo razliite
razvojne oblike egzantematinih promjena. U generaliziranim oblicima kada je prisutan i
kataralni sindrom, moemo nai degenerativne i upalne promjene na unutarnjim odnosno
parenhimskim organima.
U skupini akutnih opih zaraznih bolesti s lokalizacijom i akutnih zaraznih bolesti s
izrazitom lokalizacijom rijee dolazi do uginua, a patoloke promjene nalazimo
uglavnom na zahvaenom organu ili organskom sustavu (gangrenozni masitis ovaca i
koza, zarazni peritonitis u maaka)
Kod zaraznih bolesti SS-a razudbom nalazimo negnojne meningoencefalitise kod
virusnih ili gnojne kod bakterijskih zaraznih bolesti. Patohistolokom pretragom moemo
nai patognomonine promjene koje se mogu koristi za postavljanje etioloke dijagnoze
(bjesnoa, govea spongiformna encefalopatija).
Patoloki nalaz u zaraznih bolesti uzrokovanih klostridijima obino je vrlo oskudan zbog
perakutnog tijeka bolesti.

Osnovne klinike karakteristike kroninih zaraznih bolesti

Kronine zarazne bolesti, kao i autne, imaju stanovite ope i zajednike
karakteristike. Odlikuje ih dugi i polagani razvoj klinikih simptoma bolesti (dulje od tri
tjedna). Kronine zarazne bolesti patogenetski i patoanatomski karakterizira stvaranje
granuloma (stvaranje upalnog tkiva u obliku voria kao odgovor organizma na kroninu
upalu). Granulome u bolesnoj ivotinji moemo pronai u fazi inkubacije na ulaznim
vratima infekcije (primarni afekt) ili u obliku matastaza u daljnjem tijeku bolesti. Razvoj
patolokog procesa je vrlo polagan, a primarni afekt obino se nalazi samo u sluajevima
kada je izvreno rtvovanje ivotinje (nalaz tuberkuloznih voria u trupovima goveda
zaklanih po pozitivnom tuberkulinskom testu). Kod kroninih zaraznih bolesti dominiraju
kliniki simptomi vezani uz organske manifestacije ovisno o lokalizaciji upalnog procesa.
Opi kliniki sindrom karakteristian za kronine zarazne bolesti oituje se pojavom:
mravosti, relativne ope slabosti, anemije i povremeno alteriranim trijasom. Mravost
kao kliniki simptom nalaziti emo samo kod uznapredovalih jako izraenih organskih
manifestacija neke bolesti, meutim, unato brojnih arita i metastaza, esto ne nalazimo
mravost kao dominantni popratni simptom bolesti, a promjene uoavamo tek na razudbi
ivotinje ili pregledom trupova na liniji klanja. Relativna opa slabost ide u korak s
mravou ivotinje, osim u sluajevima kada je zahvaen vitalni organ kao to su srce ili
plua. Anemija se javlja kod uznapredovalog stanja bolesti, a treba je razlikovati od
popratnih simptoma nekih primarno akutnih zaraznih bolesti kao to su infektivna
anemija kopitara i abdominalni drebeak. Da bi razlikovali sindrom karakteristian za
kronine zarazne bolesti od sindroma koje nalazimo kod kroninih organskih i
parazitarnih bolesti te sa stanjem pothranjenosti ivotinje, treba paziti da bude nazoan
alterirani trijas. Stoga je potrebno u kronino bolesnih ivotinja redovito pratiti
vrijednosti trijasa kroz dulje vrijeme. Za neke kronine zarazne bolesti karakteristino je
povremeno alteriranje trijasa bolesne ivotinje. Te alteracije posljedica su promjena
nastalih u patogenezi i uzroniku bolesti, odnosno padu otpornosti makroroganizma i
obino su slabije izraenih vrijednosti. Navedene promjene treba razlikovati od nekih
primarno akutnih zaraznih bolesti koje prijeu u subakutan i kronian tijek s povremenim
akutnim napadima bolesti (infektivna anemija kopitara).

U skupinu kroninih zaraznih bolesti svrstavamo:

1. Kronine zarazne bolesti-specifine upale su podskupina koja se kliniki
oituje pojavom specifinih upalnih voria koji se mogu pouzdano meusobno
razlikovati karakteristinom patohistolokom graom (tuberkuloza, maleus,
aktinomikoza)
2. Kronine zarazne bolesti-nespecifine upale su bolesti koje imaju kronian
tijek, ali patohistoloki ni su specifine upale (bruceloze)
3. Mikoze su podskupina kroninih zaraznih bolesti koje u ivotinja mogu izazvati
ograniene promjene na koi, noktima i dlaci ivotinja (dermatomikoze) ili
generalizirane, sistemske promjene na koi u unutranjim organima Tumore
uzrokovane virusima (leukoze, papilomatoze).

Patogeneza i klinika slika zaraznih bolesti

Zarazne bolesti su bolesti ivotinja i ljudi izazvane mikroorganizmima odnosno njihovim
toksinima. Za mikroorganizme koji izazivaju zarazne bolesti kaemo da su u parazitskom
odnosu sa svojim domainom. Osim tetnih mikroorganizama u naem okoliu puno je vei
broj onih koji ive neovisno o drugim viim biljkama ili ivotinjama ili pak kao komenzali
ak i simbionti. Samo mala skupina mikroorganizama ulazi u domaina i u njemu nalazi
optimalne uvjete za svoje preivljavanje, umnaanje i dalje irenje na nove prijemljive
domaine. Sa stanovita mikroorganizma za to uspjenije nastavljanje svoje vrste potreban je
zdrav i vitalan domain koji e pruiti sve ono to je parazitu potrebno. Svi oni
mikroorganizmi koji su uspjeli postii da uzimaju od domaina to im je potrebno za njihov
ivotni ciklus, a da pri tome ne izazovu prevelike patoloke promjene u domainu
predstavljaju uspjene parazite i kao takvi imaju puno veu mogunost umnaanja i daljeg
irenja na nove domaine. Za ove mikroorganizme kaemo da su se prilagodili svom
prirodnom domainu i da su postigli stanje balansirane patogenosti. Ako je ovo stanje,
stanje kojem svaki mikroorganizam tei, postavlja se pitanje zato uope dolazi do pojave
zaraznih bolesti, osobito onih tekih, ak i sa smrtnim ishodom za domaina? Vjeruje se da su
uzronici ovih zaraznih bolesti ustvari jo u procesu prilagodbe na domaina, odnosno da
predstavljaju stepenicu u evoluciji koja e ih dovesti u stanje balansirane patogenosti. Ovi
mikroorganizmi su moda dospjeli u novo podruje, tj. u novu populaciju prijemljivih
domaina koja se tijekom evolucije jo nije srela s uzronikom. Isto tako mogue je da je
uzronik preskoio vrsnu barijeru i sada izaziva bolest u sasvim nove vrste ivotinja ili ljudi i
tek se treba prilagoditi na novonastale prilike. Napose mogue je da je data jedinka samo
sluajni domain. Primjer je infekcija virusom encefalitisa Zapadnog Nila ili virusom
bjesnoe. U domaina u kojih je ova infekcija puno ea, ptice u prvom sluaju, lisice,
imii i neke druge ivotinje u drugom, patogenost uzronika je puno manja nego kod
infekcije vrsta u kojih se ova infekcija rijee pojavljuje, recimo domae ivotinje i ljudi. Kod
ovih, sluajnih domaina, ovi uzronici su patogeniji jer za njihov opstanak sudbina sluajnog
domaina nije vana i oni nisu prilagoeni na parazitiranje u tim jedinkama.
Faze u nastanku, patogenezi i klinikoj manifestaciji zaraznih bolesti
Kad se govori openito o infekciji i zaraznim bolestima, uz vee ili manja odstupanja one se
mogu podijeliti u est faza. Ove faze prate ivotni ciklus mikroorganizma i eventualne

promjene u domainu koje se dogaaju tjekom infekcije odnosno zarazne bolesti. Svaka od
faza zarazne bolesti moe, ali i ne mora, biti vezana s pojedinim patolokim promjenama i one
se moraju sagledavati kao posljedica reakcije makroorganizma na infekciju i kao potreba
mikroorganizma da sebi osigura minimalne uvjete za ivot.

Faza

Pojava

Neophodno

Prijanjanje +/-

Infekcija

Nadilaenje prirodnih barijera i sustava zatite

domaina

ulazak u tijelo
Lokalno ili

Lokalne promjene,

sustavno irenje u irenje unutar domaina

Nadilaenje trenutanih lokalnih zatitnih

mehanizama i barijera

tijelu
Umnaanje

Umnaanje

to vei broj... mnogo ih nee doivjeti novog

domaina

Nadilaenje

Odgovor m.o. na

Nadilaenje fagocitnog i imunosnog sustava

obrambenih

zatitne mehanizme

dovoljno dugo za zavretak cijelog ciklusa u

mehanizama

domaina

domainu

irenje na nove

Izlazak na mjestu i u koliini dovoljnoj da se

domaine

proiri na novog domaina

Izazivanje

Patoloke promjene,

Nije nuno ali vrlo esto

oteenja u

bolest

domaina
Izluivanje iz tijela

domainu

Prijanjanje i ulazak u tijelo

Prva faza svake infekcije odnosno zarazne bolesti je prepoznavanje odgovarajueg pogodnog
domaina i prijanjanje na njega. Za prepoznavanje domaina mikroorganizmi posjeduju
razliito sloen adhezijski sustav. To je sustav receptora koji prepoznaje proteine domaina i
na njih se vezuje. Proteini domain, a koje mikroorganizmi prepoznaju, najee su i sami po
svojoj prirodi receptori koji slue za interakciju stanica makroorganizma izmeu sebe ili s
vanstaninim matriksom.
Makroorganizam moemo shematski predstaviti kao veliki balon. Ovaj balon je pokriven
koom. Svaki organizam za svoj ivot mora izmjenjivati informcije, tvari i energiju s
okoliem u kojem ivi. Tu ulogu u makroorganizmima, osim senzornog sustava iji se
receptori uglavnom nalaze u koi, imaju probavni sustav koji se moe zamisliti kao cijev, sa
svoja dva divertikula, dinim i urogenitalnim sustavom. Koa je izuzetno dobra barijera, koja
je praktiki neprobojna za veinu mikroorganizama te veina infekcija i poinje kao infekcija
gastrointestinalnog odnosno respiratornog sustava. Zbog specifine grae koe, ulaz infekta je
najee kroz mjesta prekide kontinuitete. Ova mjesta mogu biti fizioloka ili patoloka. Pod
fiziolokim prekidima podrazumjevamo sluznice koje su neophodne za rad osjetilnih organa,
ali isto tako i sluznice na poetku, odnosno kraju probavnog, respiratornog i urogenitalnog
sustava. Nadalje prekidi kontinuiteta koe su i folikuli dlaka, otvori lijezda koe i mikropore.
Pod patolokim prekidima podrazumjevamo u prvom redu traume, ugrize i ubode
lankonoaca.
Probavni, urogenitalni i respiratorni sustav moraju imati sposobnost izmjene tvari s vanjskom
sredinom, a opet pri tome pruati dovoljnu zatitu. U probavnom sustavu osnovni je zatitni
mehanizam stalna pasaa sadraja, koja onemoguava predugo zadravanje mikroorganizama
na jednom mjestu i smanjuje mogunost njihove adhezije. Uz pasau tu su i razlike u pH,
razliiti enzimi, une kiseline i brojni drugi zatitni mehanizmi. U respiratornom sustavu
osnovni zatitni mehanizam je mukocilijarni eskalator sastavljen od cilija trepetljikavog
epitela dinog sustava i sluzi koju lue ljezdane stanice. Stalna izmjena i kretanje ove sluzi
daju veliku zatitu epitelu dinog sustava. Uz to u respiratornom sustavu bitne su i specifine
anatomske strukture pojedinih dijelova, fagociti i drugo. Urogenitalni sustav titi se stalnim
ispiranjem urinom, ali i cilijarnim epitelom i luenjem sluzi.
irenje u tijelu

Vjerojatno najjednostavniji i najuinkovitiji ivotni ciklus imaju mikroorganizmi koji se

zadravaju i ive na povrini domaina. Pojedini uzronici zaraznih bolesti svoje optimalne
ivotne uvjete nalaze dalje od povrine, u samom tijelu domaina. Ti imbenici koji uvjetuju
da je mikroorganizmu potrebno prodiranje u tijelo nazivaju se imbenici diseminacije.
Strategija prodiranja u tijelo uvelike ovisi da li je uzronik intra ili ekstracelularni parazit.
Ekstracelularni paraziti mogu samostalno prodirati u dublje dijelove tijela, meutim glavni
problem s kojim se ovi mikroorganizmi moraju suoiti je izloenost svim zatitnim
mehanizmima domaina. Unutarstanini paraziti moraju za svoj prodor im prije pronai
prijemljivu stanicu i to je kritini trenutak za uspostavljanje infekcije. Jednom kada se nalaze
u stanici zatieni su od veine mehanizama koje domain koristi za obranu od infekcije.
Za zatitu stanica epitela od infekcije najvaniji su imbenici lokalne rezistencije, od kojih je
interferonski sustav najbolje prouen. Uz to i brojni drugi sustavi iji se mehanizam tek
otkriva. Nakon prodora kroz bazalnu membranu mikroorganizam se susree sa tri onsovna i
izrazito efikasna zatitna mehanizma: tkivna tekuina, sustav odvodnje i filtracije limfe u
limfnim vorovima i fagociti.
Tkivne tekuine sadre brojne antimikrobne tvari kao aktivirane komponente sustava
komplementa, protutijela, produkte fagocita ali i antimikrobne tvari nastale tjekom propadanja
stanica. Limfatini sustav tkivnu tekuinu odnosi do limfnih vorova gdje mikroorganizmi
bivaju vrlo djelotvorno uklonjeni, a isto tako i prezentirani stanicama koje su odgovorne za
imunosni odgovor. Fagociti su vjerojatno najvanija linija obrane od infekcija. I
polimorfonukleari i mononukleari vrlo uspjeno prodiru mikroorganizme i sprjeavaju
njihovo irenje.
Sva ova tri mehanizma dobivaju svoj puni opseg kada nastane upalna reakcija. U trenutku
kada tijelo prepozna da je dolo do ulaska stranog agensa aktivira se upalna reakcija. U tom
trenutku dolazi do promjena cirkulacije koje na mjesto upalne reakcije dovode jo vie
antimikrobnih tvari, ubrzavaju izmjenu limfe i dovode jo vie fagocita. Ukoliko lokalna
reakcija nije dovoljna, odnosno ukoliko mikroorganizmi nastave dalje prodiranje, dolazi i do
metabolikih promjena u cijelom organizmu. Ovo se naziva akutno-fazni odgovor. Dolazi do
porasta temperature, rabdomiolize, ali i sinteze brojnih proteina koji pomau obranu od
mikroorganizama. Upala je odgovorna i za prve simptome kao to su, nujnost, smanjen apetit,
porast tjelesne temperature i druge promjene trijasa, zaarenost sluznica, poveanje lokalnih
limfnih vorova koje se sve zajedno nazivaju opi infekciozni sindrom.

Nadilaenje zatitnih mehanizama domaina

Fagocitoza je jedna od najjaih zatita makroorganizama od infekcije. Postoji cijeli niz
stanica koje posjeduju sposobnost fagocitoze, meutim manji broj njih je usko specijaliziran
da uklanja sve ono to organizmu ne treba iz razliitih tkiva. Evolucijom i mikroorganizmi su
razvili sustave kojima se tite od toga da budu fagocitirani. Najjednostavniji nain je da veliki
broj mikroorganizama ubija fagocite. Drugi su mikroorganizmi zbog specifine strukture
rezistentni na fagocitozu odnosno da budu obuhvaeni i uneseni u fagocite. Ima i
mikroorganizama koji su razvili vrlo specijalizirane sustave kojima mogu sprijeiti fuziju
fagosoma i lizosoma ili ak izai iz fagosoma u citoplazmu fagocita. Neki mikroorganizmi
su jednostavno otporni na enzime koji djeluju u fagolizosomu i ne mogu biti probavljeni.
Kasnije tijekom evolucije osim fagocitnog sustava razvio se imunosni sustav. Ovaj se sustav
sastoji u produkciji specifinih protutijela i stanica senzibiliziranih na odreeni antigen.
Imunosni sustav je isto tako vrlo uinkovita zatita i to osobito pri ponovljenom kontaktu s
uzronikom odreene zarazne bolesti. Kako se evolucijski razvio imunosni sustav i
mikroorganizmi su nalazili naine kako da ga nadvladaju. Veliki broj mikroorganizama koji
izaziva infekcije epitelnih pokrova domaina koristi hit and run taktiku. Ti mikroorganizmi
zavre cijeli svoj ivotni ciklus prije nego li se stigne generirati imunosni odgovor u dovoljnoj
mjeri. Pojedini mikroorganizmi dovode do slabog ili nikakvog odgovora makroorganizma na
njihove antigene, dok za druge antigene odgovor nije promjenjen i tada govorimo o
imunotoleranciji. Tri su osnovna mehanizma kojima dolazi do imunotolerancije: prenatlna
infekcija,

desenzitizacija

stanica

imunosnog

sustava

cirkulirajuim

antigenom

ili

podraavanje antigena domaina kada je rije o antigenskoj mimikriji. Osim imunotolerancije

mikrobi mogu dovesti i do imunosupresije, kada domainov imunosni odgovor na bilo koji
antigenski podraaj slabi. Do nedostatnog imunosnog odgovora dolazi i kada ne postoji
odgovarajua meta. Mikroorganizmi koji parazitiraju unutar stanice tipian su primjer. Istim
mehanizmom se slue i mikroorganizmi iji antigeni podljeu glikozilaciji ili dovode do
smanjene ekspresije staninih receptora neophodnih u imunosnom odgovoru. Ukoliko je dolo
do infekcije dijela tijela nedostupnog stanicama imunosnog sustava ili protutijelima i
takvi uzronici su zatieni. Iako se kod svakog imunosnog odgovorak aktivira i stanina i
humoralna komponenta, za svaki pojedini mikroorganizam odreena komponenta je vanija.
Kada mikroorganizam moe inducirati snaniji humoralni odnosno stanini odgovor na raun
drugog, a taj koji je dominantan ne titi domaina govorimo o induciranju neodgovarajueg
imunosnog odgovora. Postoji jo nekoliko mehanizama koji slue za nadilaenje imunosnog

odgovora domaina, a kao vrlo vani izdvajaju se jo neutralizacija protutijela topivim

antigenom i izmjena antigenske strukture uzronika. Ova posljednja moe biti ili u
samom domainu ili na razini populacije.
Mehanizam oteenja stanica i tkiva domaina
Oteenje stanica i tkiva domaina je faza infekcije odnosno ivotnog ciklusa
mikroorganizma koja se ne mora pojaviti uvijek. Ova se faza, u veini sluajeva, treba gledati
kao rezultat nadilaenja zatitnih mehanizama domaina i uzimanja hranjivih tvari i svega to
je potrebno ne bi li mikroorganizam zavrio svoj ivotni ciklus. Kada ovako razmatramo
patoloke promjene koje su posljedica infekcije oteenja moemo podijeliti po mehanizmu
nastanka na izravna i neizravna. Izravna su oteenja posljedica samog djelovanja
mikroorganizma, dok su neizravna posljedica djelovanja zatitnih mehanizama domaina.
Kod virusnih infekcija izravna oteenja stanica i tkiva domaina nastaju zbog
preusmjeravanja sinteze proteina i nukleinskih kiselina u inficiranoj stanici. esto dolazi i do
apoptoze tih stanica ili drugih vidljivih morfolokih promjena. Virusi, ali i drugi
mikroorganizmi sposobni su izazvati i morfoloki nevidljive odnosno funkcionalne promjene
u stanicama. Rikecije djeluju toksino na same stanice u kojima se umnoavaju dok kod
bakterijskih infekcija osim propadanja stanica na mjestu infekcije, najee fagocita, dolazi i
do negativnog uinka na udaljene stanice i tkiva posredstvom toksina. Toksini kada ih
promatramo kroz prizmu balansirane patogenosti vjerojatno predstavljaju samo imbenike
koji su nuni za opstanak bakterije, odnosno za odravanje infekcije dovoljno dugo da se
zavri umnaanje i omogui izlazak iz domaina. Drugi razlog nastanka toksina je mjena tvari
mikroorganizama i iako evolucijski bakterije koje stvaraju toksine nemaju nikakvu prednost
toksini su verojatno nuno zlo.
Neizravna oteenja stanica i tkiva nastaju tjekom obrane domaina i kao takve djelimo ih na
one koji su posljedica upalne reakcije i one koji nastaju zbog imunosnog odgovora.
Upalna reakcija je osnova pojave gotovo svih simptoma zaraznih bolesti, osobito u ranoj fazi
generalizacije. Iako je ona izrazito kontrolirana moe doi do poremetnje u sustavu kontrole i
tada nastupaju teka oteenja samog organizma domaina. Toksini, nekrotino tkivo,
proupalni produkti bakterija i stanice inficirane virusima koje lue proupalne medijatore
dovode do upalne reakcije koja nerjetko dovede do oteenja zdravog tkiva.
Kada imunosni odgovor na uzronika zarazne bolesti dovede do oteivanja stanica i tkiva
domaina govorimo o imunopatolokim promjenama. One se isto kao i alergijske reakcije

dijele u etiri tipa. Prvi tip su reakcije u tipu anafilakse i kod velikog broja virusnih
infekcija gornjeg respiratornog sustava dolazi do degranulacije mastocita i lokalne
anafilaktike reakcije. Drugi tip ima za posljedicu unitavanje stanice domaina na kojem
se nalaze antigenske determinante uzronika zaraznih bolesti, a trei tip nastaje zbog
taloenja imunih kompleksa u sitnim kapilarima i njihovim stjenkama koje budu kasnije
oteene upalnom reakcijom. etvrti tip imunopatolokih promjena je posljedica draenja
imunosnog sustava antigenom koji se teko uklanja iz organizma. Zbog aktivacije
primarno staninog imunosnog odgovora ovaj tip karakterizira nastanak granuloma.
Postoje i druge promjene koje nastaju tjekom infekcije ili zarazne bolesti i koje nanose tetu
makroorganizmu. U prvom redu tu su promjene koje su posljedice stresa, zatim tumorozne
promjene kod onkogenih virusa, posljedice dijareje i povraanja ali i sva oteenja ploda
nastala izravno ili neizravno tjekom infekcije.
Izlazak mikroorganizma
Kao konana faza infekcije odnosno zarazne bolesti nastupa izluivanje mikroorganizma u
okoli kada on prelazi na novog domaina gdje zapoinje novi krug faza infekcije. Izlazak
mikroorganizma je na mjestu gdje e se on najlake prenjeti na novog domaina ili izluiti u
okoli u dovoljnom broju. Ovdje primarno govorimo o povrini tijela i izlazna vrata obino
odgovaraju mjestima ulaska, dakle koa, gastrointestinalni, respiratorni i urogenitalni
sustav i krv. Pod izluivanjem krvlju u prvom redu podrazumjevamo prijenos uzronika
hematofagnim lankonocima, ali i vertikalno na plod.

Osobitosti klinike pretrage ivotinja kod sumnje na zaraznu bolest

Klinika pretraga ivotinja sumnjivih na zaraznu bolest u osnovi se ne razlikuje od
klinike pretrage ivotinja koje boluju od nezaraznih bolesti. Zbog specifinosti nastanka i
irenja zaraznih bolesti, pred veterinara praktiara postavljaju se viestruki zahtjevi koji od
njega zahtjevaju strunost i primjerenu odgovornost. Kako inficirane ivotinje predstavljaju
izvore infekcije za druge ivotinje i ljude (zoonoze) klinika pretraga ima svoje specifinosti.
Dijagnoza zaraznih bolesti mora biti brza i tona, no brzina nikako ne smije utjecati na
kvalitetu, sustavnost i temeljitost pretrage na zaraznu bolest sumnjive ivotinje. Greke i
propusti nainjeni prilikom klinike pretrage na zaraznu bolest sumnjive ivotinje, mogu
dovesti do postavljanja krive dijagnoze i posljedino velikih gospodarskih teta te izravne i
neizravne ugroze zdravlja ljudi.
Da bi u prvi mah mogli razlikovatu zaraznu bolest od nezarazne i sprijeili njeno irenje
zakonodavac je pretpostavio i odredio u kojem trenutku vlasnik, draoc ivotinje i veterinar
trebaju postaviti sumnju da se moda radi o zaraznoj bolesti. Smatra se da se radi o zaraznoj
bolesti u sluaju kad se meu stokom istog dvorita, staje, obora ili stada pojave uzastopno
dva ili vie sluajeva oboljenja s istim ili slinim znacima bolesti ili kad nastupi naglo uginue
stoke bez vidljivog razloga.
U svrhu postavljanja radne i eventualno konane dijagnoze, pri sumnji na zaraznu bolest treba
nastojati uvijek provesti potpunu, temeljitu kliniku pretragu. Kao garanciju da emo provesti
dobru kliniku pretragu, pri pretrazi ivotinje treba se drati predvienog redoslijeda ili
sheme. Shema klinike pretrage ivotinja sumnjivih na zaraznu bolest jednaka je shemi koja
se koristi za pretragu ivotinja koje boluju od nezaraznih bolesti.
Shema klinike pretrage
1. Podaci o vlasniku ime i prezime, adresa, telefon
2. Nacional vrsta i spol, pasmina, boja i znakovi, dob, ime, oznake
3. Anamneza
4. Status praesens:
a) ope stanje
b) stanje pojedinih sustava i organa

Podaci o vlasniku
Klinika pretraga zapoinje uzimanjem podataka o vlasniku ivotinje. Podaci moraju biti
potpuni i po mogunosti provjereni. Osim podataka o vlasniku esto je puta potrebno uzeti i
podatke o draocu, odnosno osobi koja se brine o ivotinji. Osobito je vano uzeti tonu
adresu, broj telefona ili e-mail kako bi se uvijek moglo doi do dodatnih informacija, provjere
starih ili pak dati uputu vlasniku-draocu kako da postupi s bolesnom ivotinjom. U Hrvatskoj
je u postupku uvoenje jedinstvene evidencije dranja ivotinja po vrstama odnosno
vlasnicima tako da e se u svakom trenutku moi provjeriti istinitost podataka o vlasniku
ivotinje.
Nacional
Pravilno uzet i interpretiran nacional ivotinje od velike je koristi u usmjeravanju i odabiru
metoda dijagnostike zaraznih bolesti i postavljanju dijagnoze. Poznavajui osobitosti
dispozicije-rezistencije makroorganizma na odreenu infekciju, veterinar moe postupkom
eliminacije izuzeti vei broj zaraznih bolesti. Poznato je da s obzirom na vrstu
mikroorganizma postoje razlike na dispoziciju s obzirom na vrstu, spol, dob i eventualno
pasminu ivotinje. Prilikom uzimanja nacionala, izuzetno je vano provjeriti i upisati oznaku
ivotinje (una markica, mikroip, tetovir) osobito u sluaju kada je obolilo vie ivotinja.
Anamneza
Uzimanje anamneze od vlasnika-draoca ivotinje izuzetno je vaan postupak u klinikoj
pretrazi ivotinje sumnjive na zaraznu bolest. Pojam anamneza (gr. anamnesis sjeanje)
predstavlja skup podataka o poetku, tijeku i ishodu bolesti; dranju, hranjenju, njezi i uporabi
bolesne ivotinje; provedenom dosadanjem lijeenju i cijepljenju, a daje ih vlasnik ili osoba
koja se bavi bolesnom ivotinjom.
Osnovna svrha anamneze je pravilno usmjeriti kliniku pretragu u cilju to ranijeg
postavljanja tone, objektivne dijagnoze.
Dobivene anamnestike podatke uvijek je potrebno prosuivati kritiki. Razlog tomu je
sluajno ili namjerno preuivanje podataka od strane vlasnika-draoca ivotinje. esto puta
vlasnici nisu u stanju dati relevantne podatke iz razloga to nisu dovoljno esto boravili uz
ivotinju prije i za vrijeme pojave bolesti, nisu dovoljno educirani da bi uoili promjene na

ivotinji, previe su uzbueni zbog pojave bolesti i sl. Rjee se susreemo s praksom da
vlasnik namjerno izostavlja traene podatke ili ih namjerno iskrivljuje, s ciljem da sebe
prikae u drugom svjetlu (kao savjesnog vlasnika) ili zbog toga to je prekrio zakone i
pravilnike koji se odnose na dranje i iskoritavanje, promet i zatitu zdravlja ivotinje.
Kvaliteta anamneze stoga ovisi o iskustvu i educiranosti vlasnika ivotinje, ali i veterinara.
Kvalitetu anamnestikih podataka prosuujemo tijekom uzimanja anamneze, a osobito kasnije
kada je u miru moemo analizirati i provjeriti s ostalim dostupnim podacima. Stoga se jednom
uzeta anamneza uvijek moe nadopuniti novim podacima koje prikupljamo dok traje bolest,
odnosno tijekom suzbijanja i sprjeavanja irenja epizootije.
Pri uzimanju anamneze prvo pustimo vlasnika da opie sluaj na svoj nain, pri emu ga ne
prekidamo pitanjima, ve anamnezu kasnije nadopunjujemo pitanjima po odreenom
redosljedu. Kako bi dobili to kvalitetniju anamnezu vlasniku postavljamo dodatna pitanja
koja su razvrstana u etiri skupine:
1. Pitanja o poetku, simptomima i tijeku bolesti
2. Pitanja o nainu dranja i hranidbi ivotinja
3. Pitanja o dosadanjem lijeenju i cijepljenju ivotinja
4. Pitanja o epizootiolokim podacima u uem i irem smislu
Pitanja koja se odnose na poetak, simptome i tijek bolesti postavljamo s ciljem da saznamo
zato je vlasnik doveo ivotinju; kada je bolest poela datum, vrijeme; koji su prvi uoeni
znakovi bolesti (obino nespecifini); kako se kliniki razvijala bolest i koji su specifini
znakovi bolesti; koliko je ivotinja obolilo i koje su vrste te kakav je bio ishod bolesti (broj
preboljelih, broj uginulih i rtvovanih). Potom vlasniku postavljamo pitanja koja se odnose na
stanje ili bolest pojedinih organskih sustava.
Pitanja o nainu dranja i hranidbi ivotinja koje postavljamo vlasniku osobito su vana kod
pojave uvjetovanih zaraznih bolesti. To je skupina zaraznih bolesti do ije pojave dolazi zbog
pada ope otpornosti izazvanog stresom uzrokovanim grekama u dranju, hranjenju i
iskoritavanju ivotinja. Prikupljamo podatke o nainu dranja i objektu u kojem boravi
ivotinja, tipu i organizaciji proizvodnje; broju ivotinja i kohabitaciji vrsta u objektu;
zoohigijenskim prilikama u objektu; porijeklu, koliinama, kvaliteti i pripremi hrane i vode;
nainu hranidbe; nainu iskoritavanja i upotrebe ivotinje. Sve podatke moemo provjeriti na
licu mjesta, ako se nalazimo u objektu u trenutku uzimanja anamneze, te ih kritiki analizirati.

Uz suglasnost vlasnika (ili po sili zakona) moemo uzeti i uzroke hrane i vode i provjeriti
njihovu ispravnost.
Podatke o dosadanjem lijeenju i cijepljenju ivotinja provjeravamo pitanjima o tome da li je
ivotinja ve lijeena; ime je lijeena; dozama lijeka; trajanju lijeenja; osobi koja je lijeila
ivotinju; porijeklu lijekova itd. Na osnovi podataka prosuujemo da li je provedena terapija
odgovarala klinikom stanju ivotinje i da li je po lijeenju dolo do poboljanja-pogoranja
opeg stanja ivotinje. Podatke o cijepljenju prikupljamo s ciljem da provjerimo da li je u
trenutku pojave bolesti ivotinja bila imuna na odreene zarazne bolesti. elimo saznati protiv
kojih zaraznih bolesti je cijepljena (imunizirana); kada je cijepljena; s ime je cijepljena
(vrsta, kontrolni broj cjepiva i rok valjanosti); doza i nain aplikacije; porijeklo cjepiva; tko je
cjepio ivotinju. Na osnovi dobivenih podataka moemo zakljuiti da li je ivotinja pravilno
cijepljena i da li je u trenutku pojave bolesti bila imuna protiv bolesti za koja je cijepljena.
Glavna specifinost u uzimanju anamneze pri sumnji na zaraznu bolest odnosi se na skupinu
epizootiolokih podataka u uem i irem smislu. Podacima o epizootiolokim podacima u
uem smislu elimo saznati ima li vlasnik jo bolesnih ivotinja iste ili druge vrste; da li je
ivotinja iz vlastitog uzgoja ili je kupljena (kada i gdje) na legalan ili ilegalan nain; da li je
ranije u uzgoju bilo oboljenja ili ugibanja s istim ili slinim znakovima bolesti; koje su sve
bolesti (nezarazne, parazitarne) dosada javljale u uzgoju itd. Epizootioloki podaci u irem
smislu odnose se na pojavu bolesti u susjedstvu ili selu; ima li bolesnih ivotinja s istim ili
slinim znakovima bolesti; da li je bilo bolesti u kraju iz kojeg je kupljena ivotina; da li je
bilo oboljenja ljudi i sl. Sve epizootioloke podatke, ukoliko nismo sigurni u njih, moemo
provjeriti u slubenim podacima veterinarske ambulante ili u slubenim podacima Uprave za
veterinarstvo MPRRRH.
Cjelovita i objektivna anamneza ponekad je dovoljna za postavljanje dijagnoze, no naalost
takvih je bolesti vrlo malo. Veterinarima koji dugo rade u nekom epizootiolokom podruju
dobro uzeta anamneza esto je dovoljna da se odredi skupina ili podskupina zarazne bolesti
(osobito za skupinu uvjetovanih zaraznih bolesti) te da primjene mjere za lijeenje, suzbijanje
i sprjeavanje irenja bolesti do postavljanja konane dijagnoze. Znaenje anamneze ne treba
precijeniti, te se nikada ne smije na temelju nje zanemariti temeljita i sustavna klinika
pretraga i primjena ostalih metoda dijagnostike zaraznih bolesti.
Status praesens
Uzimanje statusa praesens-a ivotinje podrazumjeva kliniku procjenu

a) opeg stanja (habitus; vrijednosti temperature, bila i disanja; pretraga vidljivih

sluznica i limfnih vorova)
b) stanja pojedinih sustava i organa
Pri uzimanju opeg stanja ivotinje i stanja pojedinih sustava i organa koristimo osnovne
metode klinike pretrage: inspekciju, palpaciju, perkusiju, auskultaciju, pretragu mirisom i
mjerenje.
Po pretrazi opeg stanja i stanja pojedinih sustava i organa po potrebi provodimo i dodatne
pretrage: uzimanje materijala za mikrobioloke, imunitetske i molekularne pretrage,
hematoloku i biokemijsku pretragu krvi, pretraga urina, RTG,

ultrazvuk, dijagnostike

operacije itd. Pri odabiru dodatnih pretraga, kada je god to mogue, trebamo koristiti metode
koje e osigurati objektivnu dijagnozu bolesti.
Kompletna klinika pretraga, uz primjenu osnovnih i pomonih metoda klinike pretrage
osigurati e podatke koji e nas uputiti na odabir ostalih metoda dijagnostike zaraznih bolesti
s ciljem postavljanja objektivne dijagnoze bolesti. Specifinost zaraznih bolesti oituje se i u
tome to u sluaju nekih zaraznih bolesti nije uputno provoditi kompletnu kliniku pretragu
zbog pogoranja opeg zdravstvenog stanja ivotinje ili izloenosti veterinara i vlasnika
ivotinje moguoj infekciji (zarazni encefalomijelitisi; bjesnoa, tularemija itd.).

Metode dijagnostike zaraznih bolesti

Dijagnostika zaraznih bolesti mora biti brza i tona. Zbog karaktera zaraznih bolesti,
osobito vrlo infektivnih, svaka krivo postavljena dijagnoza, zamjena zarazne bolesti s
nezaraznom ili odlaganje postavljanja tone dijagnoze moe omoguiti namnaanje
izvora infekcije i brzo irenje bolesti. Koliko greke mogu biti fatalne govori podatak od
prije desetak godina kada je veterinarskim slubama u Nizozemskoj i Njemakoj trebalo
gotovo mjesec dana da postave sumnju i dijagnosticiraju klasinu svinjsku kugu, zbog
ega se bolest jako proirila, a tijekom suzbijanja epizootije rtvovano je vie milijuna
svinja. Velike pogreke mogu se napraviti i u sluajevima kada se zbog neopravdane
bojazni od vrlo opasne zarazne bolesti, takva bolesti proglasi utvrenom, a nje doista nije
bilo. Takva pogreka dogodila se prije tridesetak godina, kada je lokalni veterinar
neovlateno proglasio pojavu slinavke i apa u krave koja je imala strano tijelo u jednjaku
te je alarmirao policiju i vojsku. Sreom, uzbuna je potrajala samo 24 sata.
Brza i tona dijagnoza osnova je za provedbu odgovarajuih mjera suzbijanja i
sprjeavanja zarazne bolesti. Pri tome treba naglasiti da je brza dijagnoza relativan
pojam. Naalost, rijetke su zarazne bolesti koje se mogu dijagnosticirati klinikom
pretragom ivotinje (miksomatoza kunia, vrbanac u svinja), dok je za veliku veinu
zaraza potrebno uzeti klinike materijale u ivotinja ili leina i poslati ih na
mikrobioloke, imunoloke i molekularne pretrage u cilju postavljanja tone, objektivne
dijagnoze. Pretrage klinikih uzoraka mogu potrajati od nekoliko sati (pretraga tkiva
mozga na bjesnou) do mjesec i vie dana (mikrobioloka pretraga na mikoplazme).
Zbog objektivnih problema i potrebnog vremena za postavljanje tone dijagnoze,
podrazumijeva se, i predvieno je, da se prilikom postavljanja sumnje na zaraznu bolest
istovremeno primjene mjere sprjeavanja irenja zarazne bolesti. Te mjere ostaju i
provode se sve dok se ne postavi tona dijagnoza bolesti (potvrdi sumnja), a na osnovu
nje donese odluka kako e se bolest suzbiti (lijeenje ili nekodljivo uklanjanje). Kako bi
se sprijeila pojava i irenje vrlo infektivnih zaraznih bolesti i opasnih zoonoza,
veterinarska struka svake drave duna je donijeti posebne pravilnike o dijagnostici,
mjerama suzbijanja i iskorjenjivanja pojedinih zaraznih bolesti, ijih odredbi se moraju
pridravati veterinari i vlasnici ivotinja.

Tijekom povjesti otkrivene su mnoge metode dijagnostike zaraznih bolesti koje moemo
svrstati u osam skupina.
Metode dijagnostike zaraznih bolesti
1. Epizootioloka metoda
2. Klinika metoda
3. Mikrobioloka metoda
4. Molekularne metode
5. Imunitetske metode
6. Patolokoanatomska metoda
7. Bioloki pokus
8. Terapijska metoda
Redoslijed navedenih osam metoda je logian i sljediv. Naime, kada vlasnik primjeti
da mu je ivotinja bolesna obino pozove svog veterinara. Zakoni obvezuju vlasnika
ivotinje da se brine o njenoj dobrobiti i zdravlju, a za neke vrlo opasne zarazne
bolesti zakonom je odreeno da je vlasnik duan pozvati veterinara kada postavi
sumnju na zaraznu bolest. Po dolasku, pozvani veterinar e od vlasnika uzeti iscrpnu
anamnezu, odnosno primijeniti e epizootioloku metodu u cilju postavljanja
dijagnoze. Po uzimanju anamneze, pristupiti e klinikom pregledu ivotinje (ili vie
njih) odnosno primjeniti kliniku metodu dijagnostike zaraznih bolesti. Ukoliko je do
njegovog dolaska dolo do uginua ivotinje, veterinar moe nainiti razudbu ili
poslati leinu na razudbu pri emu je primijenjena patolokoanatomska metoda
dijagnostike Primjenom epizootioloke i klinike metode veterinar e doi do radne
dijagnoze koja e mu u veini sluajeva biti dovoljna da zapone s lijeenjem bolesne
ivotinje, odnosno primjene terapijske metode u dijagnostici zaraznih bolesti. Kako je
broj zaraznih bolesti koje se mogu sa relativnom sigurnou dijagnosticirati
epizootiolokom, klinikom i terapijskom metodom ogranien (miksomatoza kunia,
vrbanac u svinja i dr.), veterinar e u potrazi za objektivnom dijagnozom posegnuti za
ostalim metodama dijagnostike zaraznih bolesti. Na osnovi epizootiolokih podataka i

klinike pretrage odluiti e koje e klinike uzorke uzeti i poslati ih na odgovarajue

pretrage. Kliniki uzorci mogu se pretraiti postupcima koji su sastavni dijelovi
mikrobioloke, molekularne, imunitetske, patolokoanatomske metode i biolokog
pokusa. Epizootioloka, klinika, patolokoanatomska i terapijska metoda su
subjektivne metode i na osnovu njihovih rezultata ne moemo postaviti objektivnu
dijagnozu zarazne bolesti. Izuzetak predstavlja patohistoloka pretraga kod koje u
nekim sluajevima moemo postaviti objektivnu dijagnozu (nalaz specifinih virusnih
inkluzija ili promjena kao kod govee spongiformne encefalopatije). Nalaz
patognomoninih patomorfolokih promjena nije dovoljno specifian i zbog toga se
prilikom razudbe na zaraznu bolest sumnjive leine, moraju uzeti uzorci koji e biti
pretraeni objektivnim metodama. Objektivne metode dijagnostike zaraznih bolesti su
mikrobioloka metoda (izdvajanje i dokaz uzronika zarazne bolesti), molekularna
metoda (dokaz DNK uzronika zarazne bolesti), imunitetske metode (specifinost
odnosa antigen protutijelo) i bioloki pokus (Koch-ovi postulati).
Navedenih osam metoda predstavljaju slijed koji treba pratiti u cilju postavljanja
tone dijagnoze. Zbog specifinosti svake zarazne bolesti ponekad e za dijagnozu
zarazne bolesti biti dovoljno primijeniti samo jednu metodu, a ponekad vie njih.
Odabir metoda ovisi o vie imbenika kao to su duljina trajanja bolesti, broj
oboljelih ivotinja, dostupnost dijagnostikih postupaka, ekonomske mogunosti
vlasnika i dr. Uvaavajui sve potekoe pred kojima se nalazi, veterinar praktiar u
svakoj prigodi treba nastojati da doe do objektivne dijagnoze kako bi se redovito
mogla pratiti epizootioloka sitacija u nekom drvoritu, farmi, selu i irem podruju.
Premda dijagnoza zarazne bolesti mora biti brza, izuzetno je vano da bude tona, pa
emo vrijeme potrebno za postavljanje objektivne dijagnoze osigurati pravodobnom
primjenom mjera za sprjeavanje irenja zarazne bolesti.

Metode dijagnostike zaraznih bolesti epizootioloka metoda

Epizootioloka metoda prva je u nizu od osam metoda koje se koriste u dijagnostici
zaraznih bolesti. Slui za postavljanje ili pribliavanje dijagnozi zaraznih bolesti i za
usmjeravanje kasnijih dijagnostikih postupaka. Njena primjena zasniva se na osnovi
praenja i poznavanja:
a) Epizootioloke situacije
b) Dinamike pojave i irenja, te ishoda bolesti
c) Imunosnog statusa ivotinja/uzgoja/populacije
Ranije smo naglasili da je vlasnik ili draoc ivotinje duan prijaviti sumnju na zaraznu
bolest koja je definirana u sluaju kada se meu stokom istog dvorita, obora ili stada
pojave uzastopce dva ili vie sluajeva oboljenja sa istim ili slinim znakovima ili kad
nastupi naglo uginue ivotinje bez vidljivih uzroka.
Kada se veterinar susretne sa sumnjom na zaraznu bolest pokuati e brzo i tono
postaviti dijagnozu, a postupak e zapoeti primjenom epizootioloke metode. Prvi korak
biti e provjera epizootioloke situacije, odnosno utvrivanje zaraznih bolesti koje se
pojavljaju u podruju gdje je postavljena sumnja na zaraznu bolest. Provjera
epizootiloke situacije mogua je iz slubenih podataka o pojavnosti zaraznih bolesti
kojima raspolae ovlatena veterinarska ustanova, a koje redovito dobiva od Uprave za
veterinarstvo Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja republike Hrvatske.
Na taj nain provjerava se koje zarazne bolesti se pojavljuju u podruju gdje se pojavila
sumnja na zaraznu bolest do onog trenutka kada je prijavljena sumnja. Stoga je postupak
svakodnevnog objektivnog dijagnosticiranja i prijavljivanja zaraznih bolesti u ivotinja
na odreenom podruju izuzetno vaan posao jer na osnovi njega moemo s vie ili
manje tonosti posumnjati na zaraznu bolest koja se na osnovi epizootiloke situacije
navodi da se javlja u nekom kraju. Ta spoznaja predstavljati e nam putokaz da ostalim
dijagnostikim metodama dokaemo ili iskljuimo u prvom redu zarazne bolesti na koje
nam ukazuje epizootioloka situacija. Treba naglasiti da kod pojave zarazne bolesti u

ivotinja koje su nabavljene iz drugog epizootiolokog podruja treba provjeriti

epizootioloku situaciju u tom kraju iz kojeg potjeu ivotinje.
Epizootioloku metodu dijagnostike nastavljamo uzimanjem iscrpne epizootioloke
anamneze od vlasnika ili draoca ivotinje. Podatke koje smo prikupili po potrebi
moramo provjeriti na licu mjesta ili naknadno iz drugih izvora te tako provodimo
epizootioloku anketu kao nastavak epizootioloke anamneze. Uzimanje epizootioloke
anamneze detaljno je opisano u poglavlju Klinika pretraga ivotinja sumnjivih na
zaraznu bolest gdje je anamneza dio klinikog pregleda ivotinje i pojam epizootioloke
anamneze treba razlikovati od pojma epizootioloke metode dijagnostike zaraznih bolesti.
Znai, na osnovi dobivenih i provjerenih podataka (podaci o poetku, simptomima i
tijeku bolesti; nainu dranja, hranidbe ivotinja, ustanovljavanje tehnolokih principa u
uzgoju

koji mogu utjecati na imunosni status ivotinja; dosadanjem lijeenju i

cijepljenju ivotinja i imunosnom statusu ivotinja/populacije; o epizootiolokim

podacima u uem i irem smislu) treba ustanoviti dinamiku pojave i irenja, te ishoda
bolesti odnosno ustanoviti od kuda se zarazna bolest mogla unijeti u taj kraj, da li se
bolest iri naglo ili polako, koliko vrsta ivotinja je obolilo, koliki je broj uginulih
ivotinja itd. Sve dobivene i analizirane podatke treba usporediti s poznatim i u
literaturi opisanim zaraznim bolestima i ustanoviti stupanj podudranosti. Dinamika
pojave i irenja zaraznih bolesti razliita je za svaku bolest, pa podatke o brzini irenja
bolesti, broju oboljelih vrsta i broja ivotinja neemo moi utvrditi odmah kod prvih
sluajeva sumnje na zaraznu bolest nego neto kasnije. Ako je rije o sumnji na pojavu
tzv. uvjetovanih zaraznih bolesti trebati e vremena za provjeru zoohigijenskih prilika
koje utjeu na smanjenu otpornost ivotinje.

Metode dijagnostike zaraznih bolesti klinika metoda

Prva zadaa klinike metode dijagnosticiranja zaraznih bolesti je primjenom
klinike pretrage bolesne ivotinje odrediti da li se doista radi o zaraznoj bolesti ili ne.
Druga zadaa sastoji se u odreivanju skupine zaraznih bolesti kojoj konkretna bolest
pripada (akutne, kronine i njihove podskupine), a trei zadatak je po mogunosti odrediti
o kojoj se bolesti radi unutar podskupine.

Klinika pretraga

Zarazna bolest

Nezarazna bolest

Akutna
- podskupina

Kronina
- podskupina

Bolest unutar podskupine - dijagnoza

Kako emo odrediti da li se radi ozaraznoj bolesti? Uvaavajui definiciju sumnje na

zaraznu bolest (sluaj kada se meu stokom istog dvorita, obora ili stada pojave
uzastopce dva ili vie sluajeva oboljenja sa istim ili slinim znakovima ili kad nastupi
naglo uginue ivotinje bez vidljivih uzroka), obino emo biti u situaciji odrediti
dijagnozu pri naglim pojavama bolesti, odnosno pri pojavi skupine akutnih zaraznih
bolesti. Kliniki akutne zarazne bolesti kao skupinu razlikovati emo od nezaraznih
bolesti po pojavi opeg infekcijskog sindroma (OIS). Ako nema opeg infekcijskog
sindroma, a pojava bolesti je nagla i iznenadna, tada u veini sluajeva moemo tvrditi da
se ne radi o zaraznoj bolesti. Mogunost odreivanja pripadnosti skupini zaraznih bolesti

unutar akutnih i kroninih ovisi o stadiju zarazne bolesti u trenutku klinikog pregleda
ivotinje. Kliniki stadiji akutnih zaraznih bolesti su:
a) Stadij inkubacije
b) Stadij generalizacije
c) Stadij organske manifestacije
Kod kroninih zaraznih bolesti nema izraenih klinikih stadija bolesti. Njihovom
klinikom slikom u poetku dominiraju opi nespecifini simptomi kao to su smanjen
apetit, mravljenje, opa slabost, anemija, neznatno promijeni trias, a kasnije organske
manifestacije ovisno o lokalizaciji bolesnog procesa.
Odreivanje podskupine zarazne bolesti unutar skupine akutnih zaraznih bolesti u
poetku bolesti nee biti lako. Na poetku bolesti, u stadiju generalizacije, prevladavati
e opi nespecifini simptomi (OIS). Tek kasnije, kroz nekoliko dana, kada nastupi stadij
organskih manifestacija javljati e se specifiniji simptomi koji e konkretnu bolest
svrstavati u odreenu podskupinu. Odreivanje podskupine ili ak same zarazne bolesti
biti e lake kada oboli vei broj ivotinja. Kako obino do zaraavanja veeg broja
dolazi postupno (ne obole sve u isto vrijeme), tako emo tijekom klinikog pregleda
nalaziti ivotinje u razliitim stadijima bolesti to e nam omoguiti da dobijemo uvid u
cijeli tijek razvoja klinike slike. Takav postupak esto e nam omoguiti kliniku
dijagnozu bolesti. Stoga je u klinikoj pretrazi vano provoditi potpunu pretragu
propisanim redoslijedom. Samo na taj nain moi emo dobiti kompletan uvid u
zdravstveno stanje ivotinje, odnosno rijetko emo previdjeti neke vane simptome
bolesti. Izuzetak od kompletne klinike pretrage treba napraviti kada se radi o opsanoj
zoonozi ili kada kompletna pretraga moe naruiti zdravlje ivotinje.
Kada klinikom pretragom ne moemo odrediti podskupinu ili postaviti dijagnozu
postupak dijagnostike nastaviti emo na osnovi prikupljenih nalaza odgovarajuim
ostalim

metodama

dijagnostike

(mikrobioloka,

molekularna,

imunitetske,

patoanatomska). Svaki put kada nam je potrebno vie vremena za postavljanje dijagnoze
trebamo odluiti kako postupiti s bolesnom ivotinjom. U cilju sprjeavanja irenja
zarazne bolesti, na zaraznu bolest sumnjivu

ivotinju treba izolirati i zapoeti

simptomatsko lijeenje (osim ako to zakonom nije zabranjeno). U meuvremenu

moemo provesti dodatne klinike pretrage, uzeti uzorke za objektivnu dijagnostiku s

ciljem postavljanja preciznije ili objektivne dijagnoze. Po postavljanju dijagnoze

ivotinju bolesnu od zarazne bolesti nastaviti emo etioloki i simptomatski lijeiti ili
prekinuti lijeenje i nekodljivo ukloniti ako je to odreeno zakonom.
Povezanost epizootioloke i klinike metode dijagnostike, osim kod postavljanja
dijagnoze, izraena je i kod suzbijanja i profilakse utvrene zarazne bolesti. Kada smo u
nekom uzgoju/populaciji ivotinja ustanovili zaraznu bolest, primjenom klinike metode
obino nalazimo tri skupine ivotinja:
1. Bolesne,
2. Sumljive na obolenje,
3. Sumnjive na zaraenje
U zaraenom uzgoju, tijekom suzbijanja zarazne bolesti, treba konstantno
provoditi kliniku trijau ivotinja, odvajati ih po skupinama, lijeiti ih ili nekodljivo
uklanjati.

Mikrobioloka metoda dijagnosticiranja zaraznih bolesti

Mikrobioloka

metoda

dijagnosticiranja

zaraznih

bolesti

je

objektivna

metoda

dijagnosticiranja to znai da je u pravilu rezultat mikrobiolokog dijagnosticiranja dostatan

za potvrdu ili iskljuivanje odreene zarazne bolesti.
U mikrobiolokoj metodi, u openitom smislu, podrazumjevamo izdvajanje i uzgoj uzronika
u njemu optimalnim uvjetima, nakon ega ga sukladno morfologiji ili oitovanju odreenih
tipinih biolokih svojstava identificiramo do razine vrste ili soja odnosno podtipa.
Mikrobioloka metoda dijagnosticiranja zaraznih bolesti osniva se na principu objektivnog
dokaza i identifikacije uzronika u dijagnostikom materijalu uzorkovanom od oboljele
ivotinje ili iz uzorka tkiva uginule ivotinje. Sukladno ovome moemo razlikovati
mikrobioloku metodu za ivota i mikrobioloku metodu poslije smrti.
Mikrobioloka metoda za ivota provodi se dokazom ili izdvajanjem uzronika iz klinikih
dijagnostikih materijala. Odabir uzoraka pogodnih za provoenje mikrobioloke metode za
ivota ovise o stadiju zarazne bolesti, odnosno o mjestu primarnog umnaanja i patogenog
djelovanja uzronika kao i dostupnosti takvog mjesta za uzorkovanje.
Najei uzorci pogodni za mikrobioloku metodu za ivota ivotinje su uzorci krvi, razliiti
obrisci sluznica ili koe, odnosno uzorci razliitog tkiva te sekreti i ekskreti oboljelih
ivotinja. Upravo ispravan odabir dijagnostikog uzorka kao i naina uzorkovanja znaajno
ovisi o prethodnom kvalitetnom dijagnosticiranju epizootiolokom i klinikom metodom.
Naime na osnovu navedenih metoda potrebno je postaviti sumnju na odreenu zaraznu bolest
ili barem na skupinu zaraznih bolesti s obzirom na tijek, kliniku manifestaciju i uzronika
kako bi mikrobioloka metoda bila usmjerena i svrsishodna. Ovo je temeljni preduvjet za
uzimanje uzoraka za mikrobioloke pretrage zbog znaajno razliitog naina uzorkovanja i
upuivanja na pretrage dijagnostikog materijala ovisno o klinikoj manifestaciji, tijeku
bolesti i ponajvie etiologiji (virusna, bakterijska, gljivina...). Sve ovo detaljno je pojanjeno
u poglavlju o uzimanju i slanju materijala na laboratorijske pretrage.
Mikrobioloka metoda poslije smrti je istovjetna onoj za ivota s tim da je mogunost
uzimanja dijagnostikog materijala olakana. Potekoe moe, kao i za ivota, predstavljati
nesterilan rad. U uzorkovanju materijala za mikrobioloke pretrage poslije smrti izuzetno

znaajno je materijal uzorkovati u to kraem vremenskom razdoblju po uginuu jer se

pojedine vrste mikroorganizama ubrzano razmnoavaju, a druge ubrzano propadaju u
leinama, to moe dovesti do pogrenih rezultata mikrobioloke pretrage. Zbog navedenoga
obvezno je naznaiti na popratnom dopisu nakon koliko vremena po uginuu je uzorkovan
materijal za mikrobioloke pretrage.
Prema nainu izvedbe mikrobioloku metodu moemo podijeliti na izravni dokaz uzronika i
dokaz uzronika uzgajanjem u pogodnim hranjivim podlogama.
Izravni dokaz uzronika podrazumijeva pripremu preparata iz dijagnostikog materijala u
kojima je svjetlosnim ili elektronskim mikroskopom uzronik vidljiv i prepoznatljiv.
Vidljivost uzronika i mogunost njegovog prepoznavanja ograniena je na manji broj
uzronika, a ovisi o morfolokoj specifinosti. Poboljavanje izravne vidljivosti i
determinacije uzronika mogue je postii razliitim bojenjima ili mjerenjem. U izravni dokaz
uzronika mikrobiolokom metodom pripadala npr. identifikacija uzronika zarazne anemije
maaka (Mycoplasma haemofelis) u krvnom razmazu maaka prema bojenju po Giemsi,
smjetaju na eritrocitima i morfologiji. Za pojedine uzronike zbog nemogunosti izdvajanja i
umnaanja na hranjivim podlogama izravni dokaz je jedina mogunost dokaza uzronika
mikrobiolokom metodom (npr. elektronskim mikroskopom dokaz virusa papilomatoze
goveda koji se ne moe izdvajati na staninim kulturama).
Razvojem laboratorijskih metoda dijagnosticiranja zaraznih bolesti u svakodnevnoj primjeni
su i pojedine metode koje je vrlo teko razvrstati u osnovne skupine dijagnostikih metoda.
Primjerice imunohistokemija je dijagnostika metoda u kojoj u promijenjenom tkivu izravno
dokazujemo uzronika prema emu pripada mikrobiolokoj metodi. S druge strane, vidljivost
uzronika omoguava reakcija u kojoj se stvara antigenski kompleks izmeu antigena
uzronika, specifinog protutijela (najee monoklonskoga) te oznaenog protuprotutijela
to je svrstava u seroloke metode. Kako se navedena metoda izvodi na histolokim
preparatima postoji osnova i da je se svrsta u patolokohistoloku metodu dijagnosticiranja.
Bez obzira na navedene iznimke, mikrobioloka metoda dokaz uzronika uzgajanjem u
pogodnim hranjivim podlogama je najee primjenjivani nain primjene mikrobioloke
metode i predstavlja zlatni standard u objektivnoj dijagnostici veine zaraznih bolesti. Ovaj
nain izvoenja dobrim djelom se osniva na, prije vie od stoljea postavljenim, Kochovim
postulatima koji tvrde da bi uzronik bio potvren kao uzronik odreene zarazne bolesti
mora se zadovoljiti osnovna tri uvjeta:

1. Uzronik se mora nai u svim promjenjenim tkivima i ne smije ga biti kod drugih zaraznih
bolesti
2. Uzronik se mora izdvojiti i uzgojiti u istoj kulturi
3. Izdvojeni uzronik inokuliran zdravoj ivotinji mora izazvati istu bolest i mora se moi
ponovo izdvojiti iz nje.
Navedeni postulati u potpunosti odgovaraju velikom broju zaraznih bolesti, ali razvojem
infektologije otkriven je niz zaraznih bolesti i uzronika za koje navedeni postulati ne vrijede.
Razlozi dananje upitnosti Kochovih postulata su primjerice zarazne bolesti kod kojih se
uzronik ne nalazi u promijenjenim tkivima nego promijene uzrokuju njegovi toksini (npr.
Tetanus i Botulizam). Nadalje, postoje brojne bolesti kod kojih se uzronik uope ne moe
izdvojiti i uzgajati (npr. prionske bolesti, virus papilomatoze i slino). itava velika i u
veterinarskoj medicini znaajna skupina uvjetnih zaraznih bolesti takoer ne odgovara
zahtjevu iz 3. Kochovog postulata. Naime za veliki broj bolesti uzronik izdvojen iz oboljele
ivotinje inokuliran u zdravu ivotinju ne izaziva nikakve klinike znakove bolesti zbog
utjecaja imbenika ope i individualne dispozicije makroorganizma (primjerice infekcija
patogenim sojevima bakterije Escherichia coli). S druge strane izdvajanje pojedinih uzronika
zaraznih bolesti ne mora biti dokaz da se primarno radi o toj zarazi zbog uestalih koinfekcija
te mogunosti da pojedini uzronici bez patogenog uinka budu prisutni u kliniki zdravim
ivotinjama (Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathie...).
Zbog navedenoga i samo izvoenje mikrobioloke metode u nekim sluajevima nije dostatno
u potvrdi zarazne bolesti samo na razini dokaza uzronika nego je neophodno nainiti i
dodatna ispitivanja kao to je primjerice kvantifikacija uzronika, toksikoloke pretrage...
Iz svega navedenoga razvidno je da je provoenje mikrobioloke metode zahtjevno s obzirom
na potrebna predznanja iz epizotiologije, etiologije, patogeneze i klinike slike zaraznih
bolesti. Samo uz navedeni preduvjet potrebnih znanja i iskustava mogue je ciljano dostaviti
prikladne uzorke na mikrobioloko dijagnosticiranje i pravilno tumaiti rezultate nainjenih
pretraga. Uz nespornu objektivnost, znaajno je takoer naglasiti da je nedostatak metode
potreba za dobro opremljenim laboratorijem i specijalistiki educiranim osobljem, znaajni
trokovi pojedinih dijagnostikih postupaka kao i trajanje pretrage koje ponekad iznosi i vie
tjedana od zaprimanja dijagnostikih materijala do zavretka pretrage.

Bez obzira na navedeno, mikrobioloka metoda dijagnosticiranja zaraznih bolesti je nesporni

temelj objektivnog dijagnosticiranja zaraznih bolesti te ju je nuno provoditi kad god je to
mogue.

Imunitetske metode dijagnostike

Imunitetske metode dijagnostike zaraznih bolesti objektivne su metode koje se temelje
na specifinoj reakciji antigena i protutijela (seroloke reakcije) odnosno antigena i
senzibiliziranih T-limfocita (alergijske reakcije). Njima se pomou jedne poznate komponente
(antigena) dokazuje prisutnost specifine komplementarne druge komponente (protutijela ili
senzibiliziranih T-limfocita) ili se, rjee, pomou poznatog protutijela dokazuje prisutnost
odgovarajueg antigena. Protutijela su nosioci humoralne, a senzibilizirani T-limfociti
stanine imunosti.
Seroloke metode rabe se za dokaz protutijela ili antigena. Mogu biti kvalitativne
(dokazuju prisutnost protutijela za odreeni antigen) i kvalitativne (dokazuju prisutnost i
odreuju koliinu titar protutijela).
Alergijskim metodama dokazuje se prisutnost senzibiliziranih T-limfocita za neki
antigen. Najea alergijska dijagnostika metoda je tuberkulinizacija, postupak za
dokazivanje tuberkuloze. Alergijske metode rabe se i za dokaz nekih drugih kroninih
zaraznih bolesti npr. sakagije.
Imunost, definirana kao stanje otpornosti na infekciju, dijeli se na nespecifinu i
specifinu. U dijagnosticiranju zaraznih bolesti rabe se svojstva nositelja specifine imunosti,
specifinih protutijela (humoralna imunost) odnosno senzibiliziranih T-limfocita (stanina
imunost). Specifina imunost moe biti aktivna i pasivna, prirodna i umjetna.
Aktivna imunost je ona koju organizam stjee tvorbom vlastitih protutijela, a pasivna
ona koja nastaje kada organizam primi protutijela nastala izvan njega. Prirodna imunost
nastaje bez utjecaja ovjeka, a umjetna njegovim posredovanjem.
Iz toga proizlaze sljedee kombinacije navedenih vrsta imunosti:
1.

prirodna aktivna (posljedica prirodne infekcije organizma)

2.

prirodna pasivna (zatita mladunadi kolostralnim protutijelima)

3.

umjetna aktivna (steena nakon cijepljenja)

4.

umjetna pasivna (steena primjenom hiperimunog seruma gotovih

protutijela)
Neki imbenici, poput dobi i porijekla ivotinje mogu utjecati na objektivnost rezultata
imunitetskih metoda. Kod mladih ivotinja prilikom uporabe imunolokih metoda
dijagnosticiranja treba voditi rauna o mogunosti detekcije kolostralnih protutijela ukoliko su

ih primili od majke, a od roenja nije prolo dovoljno vremena potrebnog za njihovu

razgradnju. Tada dobivamo lano pozitivan rezultat jer prisutnost protutijela nije posljedica
infekcije. U takvim sluajevima pretragu treba ponoviti kada proe najdue vrijeme trajanja
kolostralne imunosti za dotinu vrstu ivotinja. Kolostralna imunost razliitog je trajanja
ovisno o vrsti ivotinja, koliini i vrsti primljenih protutijela. U prosjeku traje oko tri mjeseca,
no u drebadi kolostralna protutijela mogu biti prisutna i do dobi od est mjeseci.
Tvorba protutijela u organizmu u primarnoj imunosnoj reakciji odvija se kroz etiri
stadija. Poetni stadij je stadij indukcije tvorbe protutijela, zatim slijedi stadij
eksponencijalnog rasta kada se koliina protutijela naglo poveava, nakon njega stadij platoa
u kojem je razina protutijela ostaje na istoj vrijednosti, da bi se u sljedeem stadiju poela
postepeno smanjivati uslijed razgradnje protutijela.

titar Pt

Dinamika tvorbe Pt u primarnoj imunosnoj reakciji

Induktivna
faza

Faza
eksponencijalnog
rasta

Faza platoa

Faza postupnog smanjenja titra

protutijela

vrijeme

Imunitetske metode imaju veliku ulogu u dijagnostici inaparentnih infekcija kada ih se

obino provodi jednokratno, jer je nalaz protutijela ili senzibiliziranih T-limfocita dovoljan za
poduzimanje daljnjih postupaka sa ivotinjom (npr. kod kroninih zaraznih bolesti poput
tuberkuloze ili infekciozne anemije kopitara) dok je u sluajevima akutnih zaraznih bolesti
esto potrebno razluiti je li prisutnost protutijela posljedica akutne ili ranije preboljene
infekcije. To moemo uiniti pomou takozvanih parnih seruma, izvoenjem dviju uzastopnih
pretraga u razmaku od sedam do etrnaest dana i usporeivanjem dobivenih titrova. U sluaju
da je prvi nalaz negativan, a drugi pozitivan radi se o akutnoj infekciji. Ako su oba nalaza
pozitivna, a drugi titar barem etverostruko vei od prvog takoer moemo zakljuiti da je
ivotinja u akutnom stadiju infekcije. Pri tome treba znati da uporaba antibiotika u ranim
stadijima infekcije moe znatno usporiti tvorbu protutijela pa porast titra moe biti i manji od
etverostrukog. U ova dva sluaja titar je viestruko porastao jer su serumi uzorkovani u

stadiju eksponencijalnog rasta titra protutijela ili je prvi uzorkovan u stadiju indukcije, a drugi
u stadiju eksponencijalnog rasta titra (vidi sliku). Ukoliko su oba titra podjednaka radi se o
rekonvalescentnoj fazi infekcije.

Gel-difuzijska precipitacija
Gel-difuzijska precipitacija je seroloka metoda dijagnostike zaraznih bolesti. Moe sluiti za
dokaz i protutijela i antigena, a ovisno o izvedbi moe biti i kvalitativna i kvantitativna.
Osnova ove reakcije je da topiva protutijela i antigen difundiraju u gel i u njemu stvaraju
precipitacijsku liniju na mjestu gdje su oba sudionika imunosne reakcije u optimalnim
koncentracijama. Gel koji se najee koristi je agarozni gel dobiven otapanjem agara u
puferiranoj otopini. Nakon priprave gel se izljeva u posudu, najee Petrijevu zdjelicu.
Nakon skruivanja gela u njemu se bue jaice u koje se stavljaju sudionici seroloke reakcije.
Osnovni nedostatak ove seroloke metode u dijagnostici zaraznih bolesti je relativno duga
inkubacija i vrijeme potrebno do oitavanja rezultata. Rezultati se najee mogu oitati za 24
pa ak i vie sati.
Postoji nekoliko osnovnih inaica izvedbe GDP-a.
Jednosmjerna radijalna imunodifuzija
Kod jednosmjerene radijalne difuzije samo jedan od uesnika seroloke reakcije difundira u
gel, dok je drugi ve prisutan u gelu u poznatoj koncentraciji. Difuzija je neusmjerena,
odnosno antigen ili protutijela iz uzoraka koji se ispituju difundirati e radijalno iz jaice u
svim smjerovima i njihova koncentracija postupno pada. Oko jaice nastaje kruna
precipitacijska linija na mjestu gdje su koncentracije antigena i protutijela optimalne, a kako
se u gel dodaju poznate koncentracije jednog od sudionika seroloke reakcije na osnovu
povrine koju zatvara kruna precipitacijska linija mogue je tono odrediti koncentraciju
drugog sudionika u jednosmjernoj radijalnoj difuziji. Ovaj se postupak najee koristi za
odreivanje ukupne koliine imunoglobulina u serumu ili pojedinih imunoglobulinskih
frakcija seruma, ali moe sluiti i u druge svrhe.
Dvosmjerna radijalna imunodifuzija
Dvosmjerna se radijalna difuzija daleko ee koristi u dijagnostici zaraznih bolesti.
Infekciozna anemija kopitara i zarazna leukoza goveda su samo neki od primjera. Ova metoda
je vrlo specifina i osjetljiva te za infekcioznu anemiju kopitara predstavlja zlatni standard u
dijagnostici.

Kod dvosmjerne radijalne imunodifuzije oba sudionika, i antigen i specifina protutijela,

difundiraju iz jaica u gel. Precipitacijska linija nastaje izmeu jaica s antigenom i
protutijelima na udaljenosti na kojoj oba sudionika postiu optimalne koncentracije.
Dvosmjerna se radijalna difuzija izvodi na nain da se u agaroznom gelu izbui sedam jaica i
to tako da je jedna centralno postavljena, a ostalih est se nalazi jednakomjerno rasporeenih
kruno oko nje na istoj udaljenosti. U centralnu se jaicu stavlja poznati sudionik reakcije,
bilo antigen, bilo protutijela, a u ostalih est ispitujui uzorci. Pozitivna se reakcija oituje
stvaranjem precipitacijske linije izmeu centralne jaice, koja sadi poznatog sudionika
imunosne reakcije, i periferne jaice, koja sadri ispitujui uzorak koji sadri specifina
protutijela ili antigen. Radi provjere izvedbe i tonosti rezultata kao i utvrivanja specifinosti
imunosne reakcije obino se u dvije nasuprotne periferne jaice stavljaju pozitivne kontrole.
To su uzorci koji e sa poznatim antigenom ili protutijelom u centralnoj jaici sigurno dati
precipitacijsku liniju ukoliko je test pravilno izveden.
Ukoliko je koliina antigena i protutijela ujednaena linija e nastati na sredini rastojanja
izmeu jaica, ukoliko nije linija e biti pomaknuta ka jaici s manjom koliinom uesnika u
imunosnoj reakciji.
Pri oitavanju rezultata dvostruke imunodifuzije u gelu osim rastojanja na kojem nastaju
precipitacijske linije, zanima nas i njihov broj te meusobni odnos linija ispitujuih uzoraka i
pozitivne kontrole. U pojedinim sluajevima moe se izmeu jaica javiti dvije ili vie linija.
U tom sluaju pripravci i antigena i protutijela nisu imunosno jedinstveni. Pripravak antigena,
u tom sluaju, sadri vie antigenskih determinanti, kao i pripravak protutijela koji sadri vie
specifinih protutijela na razliite antigenske determinante antigena. Kada se u susjednim
perifernim jaicama nalaze ispitujui uzorci koji sadre imunosno srodna protutijela, odnosno
koja su specifina za istu antigensku determinantu antigena, te e se dvije precipitacijske
linije spajati u blagom luku. Ukoliko postoji samo djelomina imunosna srodnost protutijela,
u ispitujuim uzorcima, od dviju linija koje se spajaju u luku, neposredno prije skretanja u
luk, odvojit e se postrana linija, imunosni brk.
Ukoliko su protutijela u susjednim perifernim jaicama potpuno imunosno nesrodne
precipitacijske e se linije kriati.

Imunofluorescencija
Imunofluorescencija (IF, IFA) je seroloka metoda kojom se pomou protutijela
obiljeenih fluorescentnim tvarima mogu dokazivati antigeni ili specifina protutijela.
Reakcija postaje vidljiva uporabom fluorescentnog mikroskopa. Osim u dijagnostici zaraznih
i parazitarnih bolesti IF se koristi i pri dokazivanju fiziolokih i patoloko promijenjenih
bjelanevina (imunohistologija), istraivanju nastanka protutijela i dr.
Fluorescencija je pojava da neke tvari, za vrijeme dok su obasjane, emitiraju svjetlost iste
ili vee valne duljine od svjetlosti kojom su obasjane. U prirodi postoji niz takvih tvari koje
fluoresciraju, npr. aromatski ugljikovodici, derivati ksantena (fluorescein, eozin, rodamin),
derivati akridina (tripaflavin), derivati tiazola (primulin, tioflavin), derivati azina
(magdalacrvenilo, safranin) i dr. Fluorescentne tvari mogu se spajati s bjelanevinama
stvarajui stabilne spojeve. Tako spajanjem fluorescentne tvari i protutijela dobijemo
obiljeena (markirana) protutijela koja jo nazivamo i fluorescentno protutijelo (Fl Pt). Da bi
se mogla koristiti u reakciji fluorescentna tvar mora imati sljedea svojstva:
z treba sadravati kemijsku skupinu (ili mora postojati mogunost uvoenja
takve skupine) koja e reagirati s protutijelom stvaranjem stabilnog spoja
z jaina fluorescencije ne smije oslabiti nakon vezanja na protutijelo
z ne smije imati kemijsku skupinu koja koja bi smetala u reakciji s protutijelom
z pri spajanju s protutijelom ne smije utjecati na imunokemijsku specifinost i
aktivnost protutijela
z poeljno je da je tvar stabilna, jeftina i da se jednostavno skladiti

Fluorescentne tvari koje u najveoj mjeri zadovoljavaju navedena svostva te se stoga i

najee koriste su fluorescein i rodaminom.

Slika 1. Fluoresceinizotiocijanat (FITC)

Slika 2. Rodamin B izotiocijanat

Izravna (direktna) imunofluorescencija

Kao to je ve reeno imunofluorescencijom moemo dokazivati antigen u ispitujuem
materijalu. To moemo initi izravno i neizravno u razliitom materijalu (iscjedak, gnoj,
sputum, krv, izmet, tkivo, kultura stanica i dr.).
Izravna (direktna) imunofluorescencija koristi se dokazivanje virusa bjesnoe u tkivu
mozga te e biti i objanjena na tom primjeru.
Pouzdanost IF u dijagnosticiranju bjesnoe je od 95-99% ovisno o:
-

starosti uzorka- najpouzdanije iz svjeeg materijala. Mogue je koristiti i

formalinom fiksirane preparate uz obvezno prethodno tretiranje proteolitikim
enzimima, ali je rezultat manje pouzdan.

nainu uzimanja uzorka - najpouzdanije uzorkovati talamus pozitivna pretraga u

svim sluajevima, no u pravilu se koristi skupni uzorak vie dijelova mozga.

iskustvu djelatnika laboratorija.

Na pretragu se dostavlja cijela leina ili glava. Mozak se vadi u cijelosti, naini se
suspenzija tkiva i razmazak na predmetnici. Preparat se fiksira acetonom. Nasloje se
fluorescentna protutijela (monoklonska ili poliklonska) te se nakon inkubacije i ispiranja
preparata puferom rezultat oitava pod fluorescentnim mikroskopom.

Slika 3. Grafiki prikaz izravne IF kod pretrage na bjesnou

Preparat suspenzija mozga ivotinje pozitivne na bjesnou

Preparat naslojimo markiranim protutijelom ime antigen dolazi u direktni kontakt s

markiranim protutijelom te inkubiramo.

Y Y Y

Nakon inkubacije preparat ispiremo da bismo uklonili nevezana oznaena protutijela. Kako
bismo reakciju oitali preparat promatramo fluorescentim mikroskopom.

Slika 4. Pozitivna IF virus u mozgu bijesne ivotinje

Neizravna imunofluorescencija
Neizravnom (indirektnom) imunofluorescencijom moemo dokazivati prisustvo antigena u
ispitujuem materijalu ili pak prisustvo specifinih protutijela u serumu. U reakciji rabimo
dvije vrste protutijela; nemarkirana specifina protutijela (Sp Pt) ili primarna protutijela i
oznaene antiglobuline (Fl anti--globulin) ili sekundarna protutijela. Oznaeni antiglobulini
su protutijela za globuline ivotinjske vrste od koje potjeu neoznaena protutijela.
Prednost neizravne fluorescencije je izraenija fluorescencija, naime vie sekundarnih
protutijela moe se vezati na jedno primarno protutijelo pojaavajui signal. Osim toga kod
neizravne fluorescencije istim pripravkom sekundarnih protutijela mogu se u odreene
ivotinjske vrste dokazivati protutijela za razliite antigene. Nedostaci su manja osjetljivost
metode kod odreivanja titra protutijela.

Slika 5. Grafiki prikaz neizravne imunofluorescence

Y
Sandwich imunofluorescencija

Sandwich imunofluorescencija je zapravo preinaena izravna reakcija imunofluorescencije

kojom dokazujemo protutijela. Izvedba je jednostavna:
-

pripremimo ispitujui preparat (serum, likvor ili tkivo)

naslojimo antigen

nakon ispiranja preparata naslojimo specifino markirano protutijelo (Fl Pt)

oitavamo reakciju

Slika 6. Grafiki prikaz sandwich testa

Y
Y

Y
Y

Protukomplementski test
U reakciji izmeu antigena i protutijela pojedinih imunoglobulinskih razreda (IgM i pojedini
podrazredi IgG) nastali imunokompleksi sadre aktivirani komplement. Uporabom oznaenih
protutijela specifinih za komplement moe se ustanoviti nazonost imunokompleksa.

Slika 7. Grafiki prikaz protukomplementnog testa

Inhibicija hemaglutinacije

Openito
Inhibicija hemaglutinacije (IHA) je seroloka metoda dijagnostike virusnih zaraznih bolesti.
Prema principu reakcije pripada neutralizirajuim testovima, a osniva se na inhibiranju
svojstva pojedinih virusa da aglutiniraju eritrocite odreene vrste sisavaca ili ptica. Za dokaz
specifinih protutijela za pojedinu vrstu virusa u izvoenju pretrage obvezno je koritenje
eritrocita odreene vrste ili ak krvne grupe.
Metoda se moe primjenjivati za relativno veliki broj virusa koji iskazuju svojstvo
aglutinacije eritrocita kao to su pripadnici rodova Influenzavirus, Respirovirus, Alphavirus te
pojedini pripadnici porodica Parvoviridae, Adenoviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae i
Picornaviridae.
Za dokaz specifinih protutijela za pojedine viruse metoda inhibicije hemaglutinacije smatra
se zlatnim standardom dijagnosticiranja (npr. Influenzavirus A). Sama specifinost metode
razlikuje se za pojedine virusne porodice i rodove. Tako je metoda izrazito specifina ak i za
razliite sojeve virusa iz roda Infuenzavirus A, jer je hemaglutinacijski antigen istovjetan
antigenu odgovornom za prijanjanje virusa na stanicu i neutralizaciju virusa. S druge strane
znaajno je nia specifinost metode za primjerice viruse iz porodice Flaviviridae za koje su
zabiljeene este unakrine reakcije uzronika i specifinih protutijela za druge viruse iste
porodice.
Kao to je ranije navedeno metoda pripada u skupinu neutralizirajuih testova, a s obzirom na
viedesetljetnu primjenu u rutinskom dijagnosticiranju metoda pripada skupini klasinih
(tradicionalnih) virusolokih dijagnostikih metoda.
Metoda se prvenstveno koristi kao kvantitativna metoda za dokaz specifinih serumskih
protutijela. Uz navedeno moe se koristiti u znanstvene svrhe npr. za antigensku tipizaciju
sojeva virusa influence.
Uz specifinost i osjetljivost metode koja se razlikuje za pojedinog uzronika, znaajno je
naglasiti da je metoda jednostavna za izvedbu, ne zahtjeva posebno skupu opremu tako da nije
neophodna visoka razina opremljenosti dijagnostikog laboratorija. Nadalje prednost IHA u
odnosu na neke druge metode je i mogunost dobivanja rezultata pretrage istog dana kada su

zaprimljeni dijagnostiki uzorci. S obzirom da se radi o kvantitativnoj metodi rezultat koje je

odreivanje titra specifinih protutijela, metoda je prikladna i za ustanovljavanje akutnih
infekcija na principu parnih seruma i dokaza signifikantnog (etverostrukog ili veeg) porasta
titra specifinih protutijela.
Radi standardizacije interpretacije rezultata pretrage metodom inhibicije hemaglutinacije,
metoda se izvodi uz koritenje virusa u propisanoj, prethodno odreenoj, koliini od 4
hemaglutinacijske jedinice. Takoer se koristi uvijek ista standardna koncentracija suspenzije
eritrocita. Za razliku od navedenih standardnih koliina virusa i eritrocita, ispitujui serumi se
koriste u dvostrukim uzastopnim razrijeenjima.
Izvoenje metode IHA
U izvoenju pretrage metodom IHA koristimo virus u koncentraciji od 4 HA jedinice,
suspenziju eritrocita u odreenoj koncentraciji i ispitujue serume. Pretraga se izvodi u
mikrotitracijskim pliticama s V-dnom pri sobnoj temperaturi. Za pretragu nisu potrebni
sterilni uvjeti rada.
Odreivanje koncentracije virusa
Koncentracija virusa u koliini od 4 HAJ odreuje se na nain da se virus u dvostrukim
uzastopnim razrijeenjima dodaje u dva reda mikrotitracijske plitice. Nakon toga u svaku
jaicu se dodaje suspenzija eritrocita odreenog postotka (0.5-10%) u istoj koliini. Nakon
inkubacije od 30 minuta pri sobnoj temperaturi mikrotitracijska plitica se naginje pod 45 i
prati se aglutiniranost ili taloenje eritrocita. Ukoliko su eritrociti aglutinirani nita se ne
mijenja naginjanjem plitice, a ukoliko je aglutinacija izostala istaloeni eritrociti na dnu jaice
se razlijevaju nakon naginjanja plitice.
U zadnjoj jaici u kojoj je izostala aglutinacija 50% eritrocita smatramo da je virus
razrijeen u 1 HAJ. Potrebno razrijeenje virusa, kako bi dobili 4 HAJ za koritenje u
pretrazi, je etverostruko manje od onog u kojem smo oitali 1 HAJ.
Primjer: Ukoliko je u jaici u kojoj je oitana vrijednost od 1 HAJ razrijeenje virusa bilo
1:64 zbog koritenja dvostrukih uzastopnih razrijeenja 2 HAJ su bile u razrijeenju virusa
1:32, odnosno eljene 4 HAJ u razrijeenju 1:16.
Pomou ovog rezultata odredili smo da virus treba razrijediti 16 puta kako bi dobili radnu
otopinu za izvoenje IHA koja sadri koliinu od 4 HAJ.

Red mikrotitracijske plitice u kojem izvodimo odreivanje koncentracije virusa:

Zaradnuotopinuantigenazapretragu
potrebnojevirusrazrijediti16puta

1:4

1:8

1:16

4HAJ

1:32

1:64

1:128 1:256 1:512

1HAJ

aglutiniranieritrocitidjelovanjemvirusaujaicimikrotitracijskeplitice
razlijevanjeistaloeniheritrocitanakonnaginjanjamikrotitracijskeplitice

Pripremanje eritrocita za koritenje u pretrazi

Eritrocite koji su nam potrebni za izvoenje pretrage moramo nainiti kao suspenziju tono
odreene koncentracije (najee 1%, a za pojedine uzronike i do 10%). Ovo nainimo tako
da krv prvo centrifugiramo, odvajamo supernatant i talog resuspendiramo u otopini fosfornog
pufera (PBS). Ponavljamo centrifugiranje i resuspendiranje jo 2 puta. Nakon toga pomou
kapilare i centrifuge za odreivanje hematokrita odredimo postotak eritrocita u suspenziji.
Prireenu suspenziju eritrocita nakon toga razrijeujemo s otopinom PBS-a onoliko puta
koliko je potrebno da bi dobili eljenu koncentraciju eritrocita u radnoj suspenziji. Ovako
pripremljena suspenzija spremna je za koritenje u pretrazi.
Priprema seruma za pretraivanje metodom IHA
Svaki serum moe sadravati nespecifine inhibitore aglutinacije koji bi mogli dovesti do
greke u oitavanju pretrage. Zbog toga je inaktivacija pretraivanih seruma obvezna prije
postavljanja pretrage metodom IHA. Inaktivacija se moe nainiti na razliite naine, kao to
su toplinski (56 C tijekom 30 minuta), inkubacijom ispitujueg seruma u 10% otopini
eritrocita (tijekom 1 sata pri 37 C), pomou enzima za unitavanje receptora (RDE receptor
destroying enzyme) ili odstranjivanjem nespecifinih inhibitora aglutinacije adsorpcijom na
kaolin.
Postupak izvoenja pretrage seruma metodom IHA

Nakon na prethodno opisani nain prireene suspenzije virusa u koncentraciji 4 HAJ,

eritrocita i inaktivaciji seruma moemo postaviti pretragu IHA. Pretraga se izvodi na
mikrotitracijskim ploama s 96 jaica s V-dnom. U jaicama nainimo dvostruka uzastopna
razrijeenja pretraivanog seruma. Nakon toga dodajemo otopinu virusa u koliini koja sadri
4 HAJ. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tijekom koje je omogueno vezanje
specifinih protutijela na virus dodajemo suspenziju eritrocita. Sve zajedno se inkubira na
sobnoj temperaturi do oitavanja pretrage naginjanjem mikrotitracijske plitice i odreivanjem
aglutinacije ili taloenja eritrocita u jaicama.
Ukoliko je u dodanoj koliini seruma bilo dostatno specifinih protutijela da se veu na viruse
i inhibiraju svojstvo aglutinacije eritrociti e se taloiti i razlijevati nakon naginjanja
mikrotitracijske plitice. U prvoj jaici (razrijeenju seruma) u kojoj uoimo da je 50%
eritrocita aglutinirano dokazali smo koliinu protutijela koja inhibira svojstvo aglutinacije 4
HAJ koritenog virusa. Ovo razrijeenje ispitujueg seruma oitavamo kao titar protutijela.

Primjer: Odreivanje titra specifinih serumskih protutijela metodom IHA

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128 1:256 1:512

Oitanititarspecifinihprotutijelau
ispitujuemserumuje1:32

REAKCIJA VEZANJA KOMPLEMENTA

Reakcija vezanja komplementa je seroloka dijagnostika metoda koja se koristi u dijagnostici
zaraznih bolesti. Ova seroloka reakcija moe se koristiti i za dokaz specifinih protutijela, ali
i za dokaz antigena s poznatim protutijelima. Nadalje ova reakcija moe biti kvalitativna ili
kvantitativna. Metoda je relativno visoko specifina i osjetljiva (ovisno o antigenu) te
predstavlja metodu izbora u dijagnostici pojedinih zaraznih bolesti.
Kao osnova reakcije vezanja komplementa, kao dijagnostike metode, koristi se sposobnost
protutijela da nakon specifine reakcije s odgovarajuim antigenom aktiviraju sustav
komplementa i utroe ga. Sam komplement je kaskadni sustav od desetak bjelanevina koje
su fizioloki prisutne u serumu ivotinja i ljudi i koje se mogu aktivirati na razliite naine, a
jedan od njih je i nastanka imunolokih kompleksa kao rezultata reakcije antigena i za njih
specifinih protutijela. Sposobnost aktivacije komplementa imaju protutijela klasa IgG i IgM.
Kako bi metoda RVK bila objektivna i mjerljiva komplement prisutan u ispitujuem serumu
mora se prije pretrage seruma toplinski inaktivirati tijekom 30 minuta pri 55C. Na taj nain
osiguravamo koritenje tono odreene koliine komplementa u izvoenju metode. Najee
koriteni izvor komplementa je serum zamoria. Osim komplementa zamoria moe se
koristiti isti dobiven iz drugih vrsta ivotinja.
Metode RVK izvodi se na mikrotitracijskim pliticama s V-dnom, a osim navedenog
ispitujueg seruma i komplementa u odreenoj koncentraciji koristi se i antigen u glavnoj
reakciji, te eritrociti i specifina protutijela za eritrocite u sporednoj reakciji.
Kao to je spomenuto seroloka metoda reakcije vezanja komplementa izvodi se u dva dijela:
glavna reakcija i sporedna reakcija.
U glavnoj reakciji koristimo antigen, ispitujui serum i komplement. Nakon inkubacije ako su
specifinih protutijela prisutna u ispitujuem uzorku seruma nastaju imunoloki kompleksi
vezanjem antigena i za njega specifinih protutijela. Nastali imunokompleks aktivira
komplement i dolazi do njegova utroka. Ukoliko u ispitujuem serumu nije bilo specifinih
protutijela, nije dolo do tvorbe imunolokog kompleksa te ne dolazi do aktivacije i utroka
komplementa. U ovom sluaju komplement ostaje intaktan i moe sudjelovati u sljedeoj fazi
reakcije. Opisana glavna reakcija je nevidljiva okom te je neophodno radi oitavanja rezultata
glavne reakcije nainiti sporednu reakciju.
Sporedna reakcija nam slui samo da rezultat glavne reakcije bude vidljiv golim okom i na taj
nain uini rezultat cijele pretrage pogodnim za oitavanje i interpretaciju.

U sporednoj se reakciji dodaju se eritrociti i specifina protutijela za eritrocite. Antigen u

sporednoj reakciji su antigenske determinante samih eritrocita, a protutijela su protutijela
(hemolizini) kunijeg seruma na te antigenske determinante eritrocita.Sama reakcija antigenprotutijelo, odvija na povrini tih naknadno dodanih eritrocita. Kada je komplement neutroen
u glavnoj reakciji, aktivira se u reakciji antigen-protutijelo u sporednoj reakciji to se oituje
lizom eritrocita (hemolizom) koja je vidljiva okom. Ukoliko je komplement utroen u glavnoj
reakciji eritrociti e ostati intaktni jer im za lizu nedostaje komplement neovisno o vezanju
preotutijela za eritrocite. Intaktni eritrociti se u tom sluaju taloe na dno jaica
mikrotitracijske plitice s V-dnom.
U izvoenju sporedne reakcije najee se koriste ovji eritrociti, a protutijela porijeklom od
kunia. Protutijela na ovje eritrocite u kunijem serumu dobivaju se na nain da se kuni iji
e se serum koristiti prethodno senzibilizira na ovje eritrocite (aplikacijom eritrocita ovce
kuni e razviti protutijela na njih kao na strani antigen). Izuzev navedenih najee
koritenih u izvoenju pretrage, u izvoenju RVK mogu se koristiti i eritrociti i protutijela
porijeklom od drugih ivotinjskih vrsta.
Gledano obje, glavnu i sporednu reakciju sveukupno kada nema lize eritrocita uzorak
ispitujueg seruma smatra se pozitivnim jer smo dokazali utroak komplementa u glavnoj
reakciji pa ga nije bilo dostatno za hemolizu u sporednoj. Nasuprot tome ukoliko je
pretraivani uzorak bio negativan, odnosno nije bilo specifinih protutijela u ispitujuem
serumu, komplement dodan u glavnoj reakciji nije utroen u njoj te u sporednoj izaziva lizu
eritrocita. Dakle nastanak hemolize u jaici u kojoj se izvodi pretraga smatra se negativnim
rezultatom za pretraivani serum.
Reakcija vezivanja komplementa nam moe rei i vie od informacije da li ima protutijela (ili
antigena) ili ne u ispitujuem serumu. Ukoliko prije izvoenja reakcije nainimo dvostruka
razrijeenja ispitujueg seruma moemo kao konani rezultat dobiti toan titar protutijela
odnosno antigena. Pri pozitivnim ispitujuim serumuma najvee razrjeenje seruma u kojem
je izostala hemoliza predstavlja titar protutijela vezivanja komplementa.
Sama metoda ima i odreene nedostatke koji se prije svega oituju u osjetljivosti i
zahtjevnosti izvedbe kao i potrebe za dobro opremljenim laboratorijem i educiranim iskusnim
osobljem. Osim toga zapaeno je da pojedini uzorci seruma djeluju protukomplementski. To
znai da kod ispitivanja pojedinih uzoraka seruma dolazi do aktivacije komplementa u
glavnoj reakciji iako nije dolo do reakcije protutijelo-antigen. Najei uzrok je aktivacija
komplementa u glavnoj reakciji bakterijama kod kontaminacije uzoraka. Slino je uoeno da

uzorci seruma svinja inhibiraju djelovanje komplementa zamoria i tada takoer govorimo o
prokomplementskom uinku.
Kod goveda i svinja u reakciju vezanja komplementa dobro je uz komplement zamoria
ubaciti i komplement navedenih vrsta ivotinja. Takoer kod pretrage uzoraka seruma ptica
metodom RVK mora se dodati ptiji komplement jer ptija protutijela nemaju mogunost
aktivacije komplementa zamoria.

Imunoenzimni test
Imunoenzimni test je seroloka metoda koja se esto koristi u dijagnostici zaraznih bolesti
domaih ivotinja. Ona se moe koristiti za dokaz specifinih protutijela, ali i za dokaz
antigena. Rezultat imunoenzimnog testa moe biti kvalitativan ili kvantitativan. ee od
pojma imuno enzimni test koristi se kratica ELISA po engleskom nazivu Enzyme Linked
Imunosorbent Assay.
Povjesno otkriu ELISA-e prethodilo je otkrie da se topivi proteini mogu nespecifino vezati
na vrstu podlogu i da su kao takvi otporni na ispiranje puferiranim otopinama ak i pri
dodatku blagih detergenata. Polistiren je pokazao optimalne osobine i postao standardni
materijal od kojeg se rade mikrotitracijske plitice s jaicama u kojima se izvodi imunoenzimni
test. Princip imunoenzimnog testa je da se na podlogu fiksira odreena koliina antigena, a
zatim se na njega dodaju specifina protutijela koja su oznaena nekim enzimom. Sam
antigen moe biti vezan na podlogu ili nespecifino, adsorpcijom, ili se vezuje specifino na
protutijela koja su prethodno adsorbirana (sandwich ELISA). Prije dodatka specifinih
protutijela u svaku jaicu dodaje se otopina za blokiranje. U ovoj se otopini nalaze topivi
proteini, najee govei albumini, ija je uloga da prekriju cijelu jaicu i da se adsorbiraju na
sva slobodna mjesta u polistirenu kako se protutijela, koja se dodaju u sljedeem koraku, ne bi
vezala nespecifino. Nakon to je antigen vezan za podlogu na njega se vezuju specifina
protutijela. Ona ve sama mogu biti oznaena enzimom ili se pak njihova prisutnost dokazuje
dodatkom sekundarnih protutijela oznaenih enzimom. Protutijela oznaena enzimom se u
tom sluaju specifino vezuju za protutijela koja su se vezala na antigen. Protutijela koja se
specifino vezuju na antigen nazivamo primarna protutijela, a protutijela koja su oznaena
enzimom i vezuju se specifino na primarna protutijela nazivamo sekundarnim protutijelima.
Uvoenjem sekundarnih protutijela izbjegava se skupa proizvodnja specifinih protutijela
oznaenih enzimom za svaki pojedinani antigen. Kada se koriste sekundarna protutijela
oznaena enzimom ona e reagirati sa Fc podrujem primarnih protutijela neovisno o tome za
koji antigen su primarna protutijela specifina, odnosno mogu se proizvesti protutijela koja e
reagirati sa svim protutijelima iste klase za odreenu vrstu ivotinje, odnosno
ovjeka.Vidljivost imunosne reakcije postie se dodavanjem otopine supstrata. Zbog reakcije
supstrata i specifinog enzima koji se nalazi vezan za protutijela dolazi do takvih promjena
supstrata koje ine tu reakciju vidljivom, najee u smislu promjene boje. Rezultat se oitava
ili golim okom ili se promjena boje mjeri spektrofotometrom kada se rezultat moe

kvantificirati. Kako se u jaici moe vezati razliita koliina protutijela oznaenih enzimom,
ovisno o koliini antigena ili primarnih protutijela, boja u konanici moe jako varirati u svom
intenzitetu. Isto tako enzimi su biokatalizatori i reagirat e sa supstratom sve dok njega ima u
otopini. Jedina razlika razlaganja supstrata, ovisno o broju molekula enzima, e biti u brzini
reakcije odnosno brzini promjene boje. To je razlog da se nakon dodatka supstrata cijela
plitica stavlja na inkubaciju u tono odreenom vremenu, a zatim se u datom trenutku reakcija
naglo prekida stop otopinom u svim jaicama.
Izmeu svakog koraka mikrotitracijska plitica sa jaicama nekoliko se puta ispire
puferiranom otopinom (najee PBS) s dodatkom nekog blagog detergenta (najee
Tween). Cilj ovog ispiranja je da se uklone sva protutijela ili antigen koji se nisu vezali, bilo
specifino bilo nespecifino.
Vrste imunoenzimnog testa
Izravni imunoenzimni test slui za dokaz prisustva antigena u ispitujuem uzorku. Uzorak
se direktno dodaje u polistirenske jaice. Nakon adsorpcije antigena iz uzorka jaice se ispiru
i dodaje se otopina za blokiranje. Nakon ponovnih ispiranja dodaju se specifina protutijela
oznaena enzimom. Jaice se ponovno ispiru i dodaje se supstrat te se reakcija prekida stop
otopinom nakon inkubacije. Glavni nedostatak ovog tipa imunoenzimnog testa je da se
prilikom adsorpcije antigena on u uzorku natjee sa svim ostalim bjelanevinama koje su u
uzorku prisutne. Ukoliko je samo mala koliina antigena prisutna, mogue je da se nee vezati
i to je glavni razlog da se ovaj postupak rijee koristi. Problem neselektivnog vezanja na
podlogu rijeen je uvoenjem sandwich ELISA-e
Postupak dvostrukih protutijela ili sandwich ELISA, slui kao i izravni imunoenzimni
test za dokaz antigena u ispitujuem uzorku. Neselektivno vezanje bjelanevina na polistiren
prenebregnuto je vezivanjem protutijela specifinih za taj antigen prvih na plastiku, a zatim
blokiranjem preostalih slobodnih mjesta bjelanevinama otopine za blokiranje. Nakon
dodatka ispitujueg uzorka i ispiranja dodaju se protutijela oznaena enzimom i postupak se
nastavlja kao u izravnom imunoenzimnom testu. Naziv sandwich ELISA je dobila jer se
antigen nalazi zarobljen izmeu dva protutijela. Iz ovog razloga ponekad se koristi i
nazivcapture ELISA.
Neizravni imunoenzimni test izvodi se u nekoliko koraka i slui za dokazivanje prisustava
specifinih protutijela u ispitujuem uzorku. U prvom koraku se u jaice dodaje antigen.
Antigen e se nespecifino vezati za polistiren i nakon ispiranja u jaice se dodaje otopina za

blokiranje. Nakon ispiranja dodaje se uzorak koji bi mogao sadravati specifina protutijela za
adsorbirani antigen. Nakon ponovljenih ispiranja puferiranom otopinom s detergentom dodaju
se sekundarna protutijela oznaena enzimom. Kada se viak sekundarnih protutijela ukloni
ispiranjem dodaje se supstrat i nakon inkubacije reakcija se zaustavlja stop otopinom i slijedi
oitavanje rezultata.
Kompetitivni imunoenzimni test je donekle osobit u izvoenju od ranije navedenih
primjera. U prvom koraku kod kompetitivne ELISA-e neoznaena primarna protutijela se
inkubiraju s uzorkom u kojem se dokazuje antigen. Nakon inkubacije uzorak u kojem su
dodana protutijela dodaje se u jaice u kojima je adsorbiran antigen. Ukoliko je u uzorku bilo
antigena primarna protutijela e specifino reagirati s njim i utroiti se. Ovisno o koliini
antigena u uzorku utroit e se razliita koliina dodatih protutijela, a samo e se slobodna
protutijela u drugoj fazi vezati za antigen koji je adsorbiran u jaicama. Samo protutijela koja
se veu za adsorbirani antigen nee biti isprana iz jaice pri ispiranju puferiranom otopinom,
dok e se sva protutijela vezana na antigen iz uzorka isprati. U sljedeoj fazi dodaju se
sekundarna protutijela, specifina za primarna protutijela, oznaena enzimom. Nakon
ispiranja dodaje se supstrat i gleda promjena boje. Kompetitivni imunoenzimni test moe se
izvesti i dodatkom enzimom oznaenog antigena. Ovaj oznaeni antigen e se natjecatis
antigenom iz uzorka za primarna protutijela. Primarna protutijela su adsorbirana u jaici u
ovom sluaju i to je vie antigena u uzorku to e manje oznaenog antigena se vezati za
primarna protutijela i ostati u jaici nakon ispiranja
Posebnu primjenu imunoenzimni test je naao i u svakodnevnoj klinikoj praksi. Danas su
dostupni brzi dijagnostiki kitovi za pojedine zarazne bolesti domaih ivotinja koji se mogu
izvesti i rezultati protumaiti u terenskim uvjetima. Ovo su kitovi koji se zasnivaju na
imunoenzimnom testu i slue samo za dobivanje kvalitativnih rezultata. Pozitivna reakcija se
obino oituje pojavom promjene boje testnih trakica, pojavom linije ili nekog drugog
simbola odreene boje ili promjenom boje reakcijeske smjese. Najpoznatiji primjeri su brzi
dijagnostiki kitovi za dijagnosticiranje teneaka, parvoviroze pasa i maaka, zarazne
leukemije maaka, laymske borelioze, i infekcije virusom imunodeficijencije maaka.
Rezultati svih ovih brzih testova moraju se uzimati izuzetno kritiki jer osjetljivost i
specifinost testa pri praktinoj primjeni obino ne odgovara nonj navedenoj od strane
proizvoaa te je rezultate obino potrebno potvrditi tonijim laboratorijskim testovima.

Virus neutralizacijski test (VN-test)

Openito

Virus neutralizacijski test (VN-test) je seroloka metoda kojom se dijagnosticiraju virusne

zarazne bolesti. Pripada u skupinu neutralizirajuih testova koji se osnivaju na sposobnosti
specifinih protutijela da nakon vezanja na uzronika neutraliziraju neko njegovo bioloko
svojstvo kao to je hemaglutinacija, hemadsorpcija, infektivnost, citopatogeni ili letalni
uinak, stvaranje tipinih promjena na kokojem embriju ili stvaranja plaka na staninim
kulturama pod agaroznim gelom.
Prema kvalifikaciji VN-test pripada tzv. klasinim (tradicionalnim) virusolokim metodama
zbog viedesetljetnog koritenja u laboratorijskom dijagnosticiranju. Metoda se najee
koristi kao kvantitativna za odreivanje titra specifinih protutijela ili virusa, a rijee kao
kvalitativna seroloka metoda dijagnosticiranja virusnih zaraznih bolesti.
Metoda virus neutralizacijskog testa osniva se na neutralizaciji patogenih i/ili infektivnih
svojstava virusa u nazonosti specifinih serumskih protutijela. Ova reakcija se oituje
izostankom vidljivog patogenog uinka na staninoj kulturi, kokojim embrijima ili pokusnim
ivotinjama. Virus neutralizacijskim testom moe se dokazivati nazonost specifinih
protutijela u serumu kao i dokazivati nazonost virusa u ispitujuem materijalu uz poznate
specifine antiserume. Metoda se moe koristiti u dijagnostici gotovo svih virusnih zaraznih
bolesti, a zbog visoke osjetljivosti i specifinosti predstavlje zlatni standard za
dijagnosticiranje velikog broja virusnih zaraznih bolesti.
Specifina serumska protutijela najee se dokazuju tako da u sluaju njihove nazonosti
nakon mjeanja i inkubacije virusa i seruma izostaje patogeni uinak virusa na domaina
(staninu kulturu, kokoji embrij ili pokusnu ivotinju) ili infekcija i umnaanje virusa u
stanicama stanine kulture. Ovaj uinak se moe odreivati samo kvalitativno, ali znatno
ee se koristi kvantifikacija protutijela. Odreivanje koliine protutijela u ispitujuem
serumu naini se dodavanjem iste koliine virusa u razliita dvostruka uzastopna razrijeenja
seruma.

Virus u ispitujuem materijalu dokazuje se dodavanjem specifinih antiseruma za pojedini

virus. Pozitivan nalaz oituje se izostankom patogenog uinka na staninoj kulturi, kokojem
embriju ili pokusnoj ivotinji, odnosno izostankom infekcije stanica stanine kulture.
Koliinu virusa takoer je mogue kvantificirati pretragom s razliitim, najee dvostrukim
uzastopnim razrijeenjima specifinih antiseruma.

Jedinice za Izraavanje titra virusa koji se koristi u VN-testu

Ovisno na koji nain titriramo virus, titar se izraava u razliitim jedinicama.
Ukoliko se virus titrira prema sposobnosti izazivanja infekcije, titar se izraava kao
minimalna infekcijska doza (DMI dosis minima infectans) koja oznaava najmanju koliinu
virusa potrebnu za izazivanje infekcije. Titar prema sposobnosti izazivanja infekcije moe se
izraziti i kao sigurno infektivna doza (DCI dosis certe infectans) to oznaava dozu virusa
koja u svim inokuliranim staninim kulturama, kokojim embrijima ili pokusnim ivotinjama
izaziva infekciju. Pri titraciji virusa na pokusnim ivotinjama gdje kao rezultat pratimo
uginue pokusnih ivotinja titar se izraava u letalnim dozama za 50% pokusnih ivotinja
(LD50 dosis letalis 50). Koliina virusa titriranog na kokojim embrijima izraava se kao
infektivna doza za 50% koritenih embrija (EID50 embryo infectious dose 50) ili kao letalna
doza za 50% koritenih embrija (ELD50 embryo letal dose 50) ukoliko se prati uginue
embrija kao pokazatelj virusne aktivnosti.
Kako se VN-test, pa sukladno tome i titracija virusa, najee izvodi na staninim kulturama,
titar virusa se najee izraava kao infektivna doza za 50% koritenih stanica (TCID50 tissue culture infective dose 50) ili u jedinicama nastanka plaka na staninim kulturama (PFU
- plaque forming unit).

Izraavanje titra specifinih protutijela dokazanih VN-testom

Titar specifinih protutijela u ispitujuem serumu izraava se kao najvee razrijeenje seruma
u kojem je jo uvijek inhibirano patogeno ili infektivno svojstvo virusa. Da bi titar specifinih
protutijela mogao biti izraen na opisani nain za svaku pojedinu pretragu neophodna je
prethodna titracija virusa i koritenje virusa u istom titru za svaku pojedinanu pretragu.

Virus neutralizacijski test na pokusnim ivotinjama

Virus neutralizacijski test se moe izvoditi na pokusnim ivotinjama. U tu svrhu se najee
koriste laboratorijski glodavci, a rezultat pretrage se odreuje prema nastanku klinikih
znakova ili uginuu koritenih pokusnih ivotinja. Na ovaj nain se moe dokazivati virus u
ispitujuem materijalu ili specifina serumska protutijela.
Ukoliko se eli dokazati virus, suspenziju ispitujueg materijala apliciramo u pokusnu
ivotinju. U druge pokusne ivotinje apliciramo suspenziju ispitujueg materijala prethodno
pomjeanu i inkubiranu sa specifinim antiserumom za virus za kojeg provodimo pretragu u
razliitim razrijeenjima. Na ovaj nain mogue je objektivno ustanoviti da li se radi o virusu
za kojeg se provodi pretraga, odnosno ustanoviti i njegov titar u ispitujuem materijalu
sukladno razrijeenju specifinog seruma (titru specifinih protutijela) koji uzrokuje izostanak
patogenog uinka virusa.
Kod dokazivanja specifinih protutijela VN-testom na pokusnim ivotinjama, ranije titriran u
istom titru mjea se s dvostrukim uzastopnim razrijeenjima ispitujueg seruma. Nakon
inkubacije dobivena suspenzija se inokulira pokusnim ivotinjama i prema nastanku klinikih
znakova, odnosno uginuu pokusne ivotinje, odreuje se nazonost i titar specifinih
protutijela u ispitujuem serumu.
Virus neutralizacijski test na pokusnim ivotinjama sve se rijee primjenjuje, tako da je danas
praktiki potpuno zamijenjen drugim dijagnostikim metodama u rutinskoj laboratorijskoj
praksi. Prvenstveno iz razumljivih etikih razloga, kao i zbog zahtjevne izvedbe pretrage
obvezno na veem broju ivotinja, VN-test na pokusnim ivotinjama danas se samo iznimno
izvodi u znanstvene svrhe, ali ne i u rutinskom dijagnosticiranju.

Virus neutralizacijski test na kokojim embrijima

Virus neutralizacijski test na kokojim embrijima metoda je dijagnostike pojedinih virusnih
zaraznih bolesti i danas. izvodi se na nain da se u kokoje embrije starosti 10-14 dana
inokulira odreena koliina ispitujueg materijala te da se rezultat pretrage oitava

odreivanjem uginua embrija ili nastankom patolokih promjena tipinih za pojedinog

uzronika. Patoloke promjene se mogu oitovati kao specifian nalaz na korioalantoisnoj
membrani, krljanjem kokojih embrija i slino. Metoda se moe koristiti za dokazivanje
virusa u ispitujuem materijalu kao i za dokaz specifinih protutijela. Koritenjem veeg broja
kokojih embrija inokuliranih razliitim razrijeenjima antiseruma ili ispitujueg seruma uz
stalno koliinu virusa metoda moe biti i kvantitativna.
Primjena virus neutralizacijskog testa na kokojim embrijima u uporabi je za manji broj
zaraznih bolesti, ali gdje god je bilo mogue nainiti zamjenu, VN-test se izvodi na staninim
kulturama. Razlog je laka manipulacija, bolja standardizacija metode, mogunost sterilnijeg
rada kao i gospodarski i etiki razlozi.

Virus neutralizacijski test na staninim kulturama

Virus neutralizacijski test na staninim kulturama daleko je najprimjenjivaniji oblik VN-testa.
Moe se izvoditi za sve viruse koji se mogu uzgajati na staninim kulturama. U pravilu se
koristi za viruse koji tijekom umnaanja na staninim kulturama izazivaju citopatogeni uinak
u vidu unitavanja ili promjene morfologije stanica. Mogue ga je koristiti i za
necitopatogenih virusa uz dodatne imunoloke metode vizualizacije umnaanja virusa u
stanicama staninih kultura. U izvedbi se mogu koristiti primarne i linijske stanine kulture. U
svakodnevnoj praksi znaajno vie se koriste linijske stanine kulture zbog olakavanja rada u
laboratoriju te lake standardizacije metode.
Kao i u ranije navedenim nainima izvoenja virus neutralizacijskog testa i na staninim
kulturama je mogue izvoenje metode s poznatom koliinom virusa ili s poznatom
koliinom specifinog antiseruma ovisno to elimo dokazati.
U svakodnevnoj laboratorijskoj praksi najee se primjenjuje odreivanje specifinih
serumskih protutijela pomou ranije odreene stalne koliine virusa koji ima citopatogeni
uinak na stanice. Titar virusa za koritenje u izvoenju VN-testa na staninim kulturama radi
dokazivanja specifinih protutijela prethodno se izraunava i izraava u TCID50 (Tissue
Culture Infective Dose 50) jedinicama. U dokazivanju specifinih serumskih protutijela
najee se koristi virus u koliini od 30 do 300 TCID50 to ovisi o dijagnostikom protokolu
pretrage za pojedinog uzronika. Nakon mjeanja i inkubacije konstantne koliine virusa i
razliitih razrijeenja ispitujueg seruma mjeavina se dodaje na staninu kulturu ili se

suspendirane stanice dodaju u takvu mjeavinu. Inkubacija se nastavlja sljedeih 3-6 dana,
ovisno o uzroniku, te se rezultat pretrage oitava prema izostanku citopatogenog uinka na
staninim kulturama. Ova pretraga se najee izvodi na mikrotitracijskim pliticama s ravnim
dnom, a rezultati se oitavaju pomou invertnog mikroskopa.

Slika 1. Mikrotitracijska plitica za izvoenje VN-testa

Slika 2. Citopatogeni uinak virusa virusnog arteritisa konja na linijsku staninu kulturu RK13 (http://www.izssicilia.it/images/stories/virol/eva__rk13_100x.jpg)

Slika 3. Citopatogeni uinak konjskog herpesvirusa 1 na linijsku staninu kulturu RK-13

(http://www.izssicilia.it/images/stories/virol/ehv1__rk13_100x.jpg)
Virus neutralizacijski test na staninim kulturama iroko se primjenjuje u radu mikrobiolokih
dijagnostikih laboratorija zbog izrazito visoke specifinosti i osjetljivosti metode te, uz dobru
opremljenost laboratorija i educiranost osoblja, pouzdanosti i standardizacije izvoenja.
Ipak znaajno je napomenuti da se pri svakom postavljanju pretrage VN-testa obvezno mora
nainiti kontrola stanine kulture, provjeriti titar koritenog antigena te pretraiti pozitivan
uzorak seruma s prethodno odreenim titrom kao i negativan serum. Navedena neophodna
kontrola svake postavljene pretrage predstavlja dodatni zahtjev u vremenu potrebnom za
postavljanje pretrage te posljedino uzrokuje i neto viu cijenu VN-testa.
Nadalje, nedostatak metode je neophodan rad u sterilnim uvjetima, rad s infektivnim ivim
virusom te oitavanje rezultata pretrage za 3-6 dana. Takoer, iako se metoda koristi za
dijagnosticiranje akutnih infekcija na principu parnih seruma znaajno je istaknuti da
neutralizirajua protutijela u serumu mogu biti detektibilna i preko godinu dana od infekcije.

MIKROSKOPSKA AGLUTINACIJA
Mikroskopska aglutinacija (MAT) je referentna seroloka metoda za dijagnosticiranje
leptospiroze kojom se utvruje prisutnost protutijela za leptospire u pretraivanom serumu.
Metoda se osniva na principu aglutinacije reakcije antigena i protutijela (IgM i/ili IgG), pri
emu dolazi do tvorbe netopivih kompleksa aglutinata, koji se mogu promatrati uporabom
mikroskopa s tamnim vidnim poljem.
Za izvoenje MAT-a potreban nam je ivi antigen odnosno iva kultura leptospira i
ispitujui serum. Obzirom na seroloku raznolikost bakterija iz roda Leptospira prilikom
izvoenja testa ne koristimo samo jedan antigen ve se sluimo tzv. panelom antigena. Paneli
antigena sastavljeni su od sojeva referentnih serovara ija se prisutnost na podruju Republike
Hrvatske potvrdila dosadanjim epidemio-epizootiolokim analizama. Panel antigena
prilagoen je pojedinoj vrsti ivotinje, a njegov je odabir izuzetno bitan zbog nedostatka
unakrine reaktivnosti izmeu serolokih skupina leptospira.
Kao primjer dajemo popis antigena koji se trenutno koriste u Laboratoriju za leptospire
Zavoda za mikrobiologiju i zarazne bolesti s klinikom:
Tablica 1. Panel antigena koji se koristi za pretraivanje zdrave populacije konja
Rb.

Seroloka skupina

Serovar

Soj

Genomska vrsta

Grippotyphosa

Grippotyphosa

Moskva V

L. kirschneri

Sejroe

Sejroe

M 84

L. borgpetersenii

Australis

Bratislava

Je Bratislava

L. interrogans

Pomona

Pomona

Pomona

L. interrogans

Canicola

Canicola

Hond Utrecht IV

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

Icterohaemorrhagiae

RGA

L. interrogans

Sejroe

Saxkoebing

Mus 24

L. interrogans

Bataviae

Bataviae

Swart

L. interrogans

Tablica 2. Panel antigena koji se koristi za pretraivanje seruma konja kliniki sumnjivih na
leptospirozu
Rb.

Seroloka skupina

Serovar

Soj

Genomska vrsta

Grippotyphosa

Grippotyphosa

Moskva V

L. kirschneri

Sejroe

Sejroe

M 84

L. borgpetersenii

Australis

Australis

Ballico

L. interrogans

Australis

Bratislava

Je Bratislava

L. interrogans

Pomona

Pomona

Pomona

L. interrogans

Pomona

Mozdok

5621

L. kirschneri

Canicola

Canicola

Hond Utrecht IV

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

Icterohaemorrhagiae

RGA

L. interrogans

Tarassovi

Tarassovi

Perepelitsin

L. borgpetersenii

10

Sejroe

Saxkoebing

Mus 24

L. interrogans

11

Ballum

Ballum

Mus 127

L. borgpetersenii

12

Bataviae

Bataviae

Swart

L. interrogans

Tablica 3. Panel antigena koji se koristi za pretraivanje seruma ostalih vrsta ivotinja
Rb.

Seroloka skupina

Serovar

Soj

Genomska vrsta

Grippotyphosa

Grippotyphosa

Moskva V

L. kirschneri

Sejroe

Sejroe

M 84

L. borgpetersenii

Australis

Bratislava

Je Bratislava

L. interrogans

Pomona

Pomona

Pomona

L. interrogans

Canicola

Canicola

Hond Utrecht IV

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

Icterohaemorrhagiae

RGA

L. interrogans

Tarassovi

Tarassovi

Perepelitsin

L. borgpetersenii

Sejroe

Saxkoebing

Mus 24

L. interrogans

Ballum

Ballum

Mus 127

L. borgpetersenii

10

Bataviae

Bataviae

Swart

L. interrogans

11

Javanica

Poi

Poi

L. borgpetersenii

12

Sejroe

Hardjo

Hardjobovis

L. interrogans

Slika 1. Mikrotitracijske plitice u kojima se izvodi Mikroskopska aglutinacija

Metoda mikroskopske aglutinacije je kvalitativni i kvantitativni postupak jer se njime

istodobno odreuje prisutnost i koliina (titar) protutijela. U kvalitativnom dijelu pretrage
utvruje se da li u osnovnom razrjeenju pretraivanog seruma (ovisno o laboratoriju moe
biti 1:20, 1:50 ili 1:100) postoje protutijela za odreeni serovar leptospira. Rezultat
kvalitativne pretrage moe biti pozitivan ili negativan. U sluaju kada je rezultat pozitivan
radi se kvantitativni MAT kojim odreujemo koliinu protutijela titar. Prilikom izvoenja
kvantitativnog dijela pretrage rade se dvostruka serijska razrjeenja seruma za one serovarove
kod kojih smo imali pozitivan rezultat u kvalitativnom dijelu reakcije. U ovom dijelu pretrage
odreuje se konani titar protutijela najvee razrjeenje seruma u kojem je prisutna
pozitivna reakcija. Pozitivna reakcija odreuje se procjenjivanjem broja slobodno plivajuih
ivih leptospira u odnosu na negativnu kontrolu. Svaki serum u kojem je aglutiniralo
najmanje 50% leptospira (usporeujui s kontrolom antigena) smatra se pozitivnim.
Aglutinirane leptospire formiraju vee ili manje nakupine (aglutinati) u kojima je vidljivo

gibanje slobodnih krajeva leptospira. Kada je aglutinacija potpuna u vidnom polju ne vide se
niti slobodne niti aglutinirane leptospire, polje je prazno.
Slika 2. Negativna reakcija

Slika 3. Pozitivna reakcija

Tumaenje rezultata
Za pravilno tumaenje rezultata potrebno je znati;
-

Mikroskopskom aglutinacijom moemo utvrditi protutijela protiv leptospira koja se u

serumu javljaju 5 do 10 dana nakon poetka bolesti. Ukoliko se pretraivanjem seruma
tijekom prvog tjedna bolesti utvrdi negativna reakcija vano je pretraiti parni uzorak
seruma nakon 1-2 tjedna kako bi se ustanovila eventualna serokonverzija odnosno
etverostruko poveanje titra to je znak akutne leptospiroze.

Kod kronine leptospiroze/kliconotva nema poveanja titra u parnom serumu

Granini titar titar protutijela koji se smatra pozitivnim; odreuje se ovisno o

zakonskim regulativama, epizootiolooj/epidemiolokoj situaciji na odreenom
podruju i vrsti koju pretraujemo.

Prema Pravilniku o mjerama za suzbijanje i iskorjenjivanje leptospiroze ivotinja (NN

89/2011):
Sumnja na leptospirozu i mogue rekonvalescentno kliconotvo postavlja se u ivotinje sa ili
bez klinikih znakova, u koje se serolokom pretragom krvi reakcijom mikroskopske
aglutinacije za bilo koji serovar Leptospira spp. utvrdi titar protutijela:
(a) za kopitare 1:400 i vii, osim za serovare Bratislava i Australis 1:200 i vii,
(b) za svinje 1:100 i vii,
(c) za goveda 1:100 i vii,
(d) za ovce i koze 1:100 i vii,
(e) za pse 1:50 i vii.
Sluaj leptospiroze u ivotinja potvren je:
(a) u sluaju klinikih znakova bolesti, kada je serolokom pretragom krvi reakcijom
mikroskopske aglutinacije principom parnih seruma, u razmaku sedam dana, utvren
etverostruki i vii porast titra protutijela u drugom serumu, ili

(b) ukoliko nema klinikih znakova bolesti, kada je jednokratnom serolokom

pretragom utvren titar protutijela u kopitara 1:800 ili vii, a u svih drugih ivotinja
1:400 ili vii, ili
(c) je uzronik leptospiroze dokazan iz krvi, mokrae, organa ivotinje ili pobaenog
fetusa.

U inicijalnoj fazi bolesti esto se dogaa da se u serumu nalaze protutijela koja

reagiraju sa vie serovara. Ta se pojava naziva unakrina reakcija. Serovar sa
najviim titrom naziva se vjerojatno infektivni serovar, a ostali serovari koji imaju
nii titar nazivamo koaglutinacijama. U kasnijem tijeku bolesti (rekovalescentni
serum) koaglutinacije padaju a titar serovara koji je izazvao bolest raste ili ostaje
jednako visok (ovisno o tome u kojoj se fazi uzorkovao serum).

Paradoksalna reakcija je ona kada je heterologni titar vei od homolognog (titar na

serovar koji je uzrokovao bolest), Homologni titar moe ak i izostati. Javlja se u
pojedinih serovara i to poetkom bolesti.

Primjer unakrine reakcije kod akutnog oboljenja:

1. uzorak seruma uzorkovan prvog tjedna bolesti:

Seroloki pozitivno: titar protutijela; Grippotyphosa 1:400, Pomona 1:800,
Vjerojatno infektivni serovar

Mozdok 1:1600, Poi 1:800

2. uzorak seruma uzorkovan 10 dana nakon prvog:

Seroloki pozitivno: titar protutijela; Grippotyphosa 1:400, Pomona 1:3200,
Mozdok 1:12800, Poi 1:400

koaglutinacije

3. uzorak seruma uzorkovan 3 tjedna nakon drugog seruma te nakon provedenog

lijeenja:
Seroloki pozitivno: titar protutijela; Pomona 1:800, Mozdok 1:6400

NUKLEINSKE KISELINE
Svaki organizam jedinstvena je jedinka odreena svojim GENOMOM. Pod pojmom genoma
smatramo skup svih GENA nekog organizma.
GEN je osnovna jedinica nasljedne informacije nekog organizma, a sastoji od slijeda
NUKLEOTIDA .
Svaki se nukleotid se sastoji od:
a- FOSFATNE SKUPINE
b- EERA - -D-2-DEOKSIRIBOZA
- -D-RIBOZA
c- BAZA - PURINSKA - A (adenin), G ( guanin),
-

PIRIMIDINSKA- C (citozin), ), T (timin) ili U (uracil)

Ukupan slijed nukleotida ini NUKLEINSKU KISELINU koja moe biti:

1- deoksiribonukleinska kiselina ili DNK koja je dvostruka uzvojnica
2- ribonukleinska kiselina ili RNK koja je jednolanana molekula
Pirimidinska baza T (timin) prisutna je u DNK, dok je u RNK je zamijenjena bazom U
(uracil).
eer riboza prisutan je u RNK, dok je eer deoksiriboza prisutan u DNK molekuli.

Slika 1. Strukturni prikaz purinskih i pirimidinskih baza u molekula DNK i RNK

U eukariotskim stanicama (biljke, ivotinje, gljive i protisti) veina DNK je smjetena u

jezgri stanice, ali i njihovi stanini organeli kao to su mitohondriji i kloroplasti takoer
sadre DNK.
Prokarioti ( bakterije ) nemaju formiranu staninu jezgru, pa je njihova DNK smjetena u
citoplazmi.

Deoksiribonukleinska kiselina (DNK)

Deoksiribonukleinska kiselina (DNK ili DNA) je dvolanana molekula koja je odgovorna
za prijenos genetikih informacija odnosno nasljeivanje. U njenim dijelovima (genima)
nalaze se upute za sintezu proteina.
DNK se sastoji od dva komplementarna lanca nukleotida koji se spiralno uvijaju, a
povezani su vodikovim vezama preko duikovih baza.
Baze se sparuju u molekuli DNK pomou vodikovih ( H ) veza i to na nain da se adenin
vee sa guaninom sa dvije vodikove veze (A=T), a citozin sa guaninom sa tri vodikove veze
C=G.
Nukleotidi su meusobno povezani fosfodiesterskim vezama.

Slika 2. Shematski prikaz dvostruke uzvojnice molekule DNK

Redosljed baza u jednom lancu u potpunosti ovisi o redosljedu baza u drugom,
komplementarnom lancu. To svojstvo je od velikog znaaja prilikom diobe stanice i
prenoenja nasljednog materijala.

Ribonukleinska kiselina (RNK)

Ribonukleinska kiselina (RNK ili RNA) je sastavljena od jednog lanca nukleotida

povezanih fosfodiesterskim vezama. Ta je molekula je posrednik izmeu DNK i njihovog
konanog produkta, proteina.
Neki virusi koriste RNK molekule za prijenos genetskih informacija umjesto DNK.

Slika 3. Shematski prikaz jednolanane molekule RNK

Lanana reakcija polimerazom ( PCR)

Molekularna metoda koja omoguuje kemijsku sintezu oligonukleotida
deoksiribonukleinske kiseline DNK uz pomo enzima DNK polimeraze naziva se PCR
metoda. Naziv dolazi od skraenice engleskog naziva za metodu lanane reakcije
polimerazom (Polymerase Chain Reaction).
Uporabom PCR metode omogueno je umnoavanje ciljanog dijela genoma nekog
organizma, odnosno njegovih specifinih DNA ili RNA sljedova.
Metoda je to koja je nala iroku primjenu u dijagnostici razliitih nasljednih bolesti,
forenzici, populacijskoj genetici, sistematici, bioinenjerstvu, evolucijskoj biologiji. Tom je
metodom mogue dijagnosticirati niz virusnih, bakterijskih i parazitarskih bolesti, te je
zato jako primjenjiva i u veterinarskoj medicini.
Prednosti PCR metode oituju se u brzom dobivanju rezultata, visokoj specifinosti i
osjetljivosti.

Princip izvoenja PCR metode

PCR je metoda koja se osniva na otkrivanju i umnoavanju (amplifikaciji) jedne ili vie
sekvenci nukleinskih kiselina koje su specifine za porodicu, rod,vrstu, soj ili tip bakterija,
virusa, odnosno parazita.

Za PCR reakciju potrebno je:

1. DNK uzorak/ izolat- sveukupna DNK izolirana iz uzorka koji elimo pretraiti na
prisustvo odreenog mikroorganizma. Uzorak moe biti krv, urin,
tkivo, sjemena tekuina, feces.
2. PCR smjesa (mix)- koju ine pufer, deoksinukleotidi (graevne jedinice DNKnukleotidi sa bazama A, T, C, G), magnezijev klorid, voda
3. Poetnice ili eng. primeri- fragmenti DNA koje ini oko dvadesetak
nukleotida iji je redoslijed specifian za odreenog uzronika (virus, bakterija,
nametnik). Dio nukleinske kiseline tog uzronika koji elimo u uzorku dokazati i
amplificirati odreen je pomou parova primera
4. Enzim DNK polimeraza (Taq polimeraza)

U svakoj PCR reakciji moramo imati POZITIVNU i NEGATIVNU KONTROLU reakcije.

Pozitivnom kontrolom nazivamo PCR uzorak u kojem je DNK uzorak/izolat DNK izolirana
iz mikroorganizma iju prisutnost elimo dokazati u svom uzorku (krv, likvor, urin, tkivo).
Negativnom kontrolom smatramo uzorak u kojeg je umjesto DNK uzorka/izolata stavljena
voda.
PCR metoda zasniva se na ciklikoj promjeni temperature kojoj se podvrgava PCR uzorak
u kojem elimo dokazati prisutnost dijela DNK specifinog za uzronika bolesti.
1. Reakcija zapoinje denaturacijom nukleinskih kiselina ispitivanog uzorka zbog
djelovanja temperature od 94 do 97 C. Dvolanana molekula DNK se tada razdvaja u
dvije jednolanane molekule.

Slika 4. Denaturacija- odvajanje dvolanane molekule DNK

2. Zatim se smjesa ohladi na 50 do 55 C (ovisno o poetnicama), kako bi se poetnice
mogle vezati za svoje komplementarne sekvence na odvojenim lancima DNK te ih
umnoiti, odnosno amplificirati. Taj proces naziva se hibridizacijom ili engl.
annealing. Poetnice omeuju ciljni DNA niz.

Slika 5. Hibridizacija - spajanje poetnica sa svojim komplementarnim bazama na DNK

molekuli koja slui kao kalup za nastajanje novih kopija iste DNK molekule

3. Enzim Taq polimeraza vee dodane nukleotide u niz, od jednog do drugog kraja kalupa
DNA i stvara novi lanac DNK koji je komplementaran lancu ija je kopija. Ta se
reakcija naziva produljivanje ili eng. extension i dogaa se na temperaturi od 72C.

Slika 6. Produljivanje tj. elongacija novonastalog lanca DNK

4. Reakcije denaturacije, hibridizacije i produljivanja ponavljaju se 30-35 puta ovisno
o uzorku.
CIKLIKIM PONAVLJANJEM zagrijavanja i hlaenja, umnoava se traeni DNA
segment.
Za otprilike 2 sata, 30-tak ciklusa PCR reakcije moe amplificirati traenu sekvencu milijardu
puta.

Slika 6. PCR amplifikacija ciljanog odsjeka DNK

Postupak amplifikacije tj. PCR metoda se odvija u posebnom, za to opremljenom aparatu

engl. termocycler.

Slika 7. Ureaj za izvoenje PCR reakcije

Elektroforeza
Nakon amplifikacije dijela DNK metodom PCR, umnoeni dio DNK ili PCR produkt se
podvrgava elektroforezi.
Elektroforeza je postupak koji se primjenjuje za vizualizaciju dijelova DNK umnoenih
PCR reakcijom. Tijekom elektroforeze PCR produkti putuju kroz agarozni gel u
elektrinom polju. Budui da je DNK negativno nabijena, molekule putuju prema
pozitivnoj elektrodi - anodi ovisno o svojoj veliini, odnosno teini. Na taj se nain na
agaroznom gelu izdvoji traena sekvenca (ako zaista postoji u uzorku), u obliku linije
engl. banda.
Da bi umnoenu DNK u uzorku uinili vidljivom na gelu moramo je obojati. To radimo
pomou kemikalije etidijev bromid koju dodajemo u agarozni gel.
Na gelu pomou eljia sa utorima prilikom polimerizacije agaroze nastaju tzv. jaice u koje
stavljamo svaki PCR produkt pojedinano pomijean s kemikalijom brom - fenol plavila.
Ta boja sputa PCR produkt na dno jaice. Za vizualizaciju i fotografiranje PCR produkta
na gelu potrebno je gel staviti pod utjecaj UV svjetla.
Oitavanje rezultata

Za oitavanje rezultata potrebno je imati standarde tj. poznate veliine bandova DNK koje
nazivamo DNK markerima. Usporeujui dobivene bandove tj. linije (umnoeni dio DNK)
sa linijama DNK markera moemo odrediti priblinu veliinu umnoenih dijelova DNK.

Slika 8. Fotografija agaroznog gela

Varijante PCR metode
RT PCR - slui za umnoavanje dijela RNK kod detekcije prisutnosti RNK virusa u
ispitujuem uzorku. Za tu metodu potreban je dodatan enzim reverzna transkriptaza koji
prevodi jednolananu RNK u dvolananu molekulu i tada se reakcija umnoavanja
ciljanog dijela RNK odvija prema principu PCR metode sa DNK uzorkom.

Real-time PCR- reakcija PCR u stvarnom vremenu koja omoguuje kvantifikaciju DNK u
ispitujuem uzorku

WESTERN BLOT metoda

Metoda Western blot ili immunoblot je analitika metoda koja slui za detekciju
specifinih proteina u ispitujuem uzorku (homogenizirano tkivo, stanice, tjelesna tekuina).
Princip Western blotting metode-

Iz ispitujueg uzorka izdvojimo proteine, koje zatim razdvojimo i denaturirramo metodom

elektroforeze u poliakrilamidnom gelu, eng. naziv SDS PAGE. Proteini se zatim prenose
na nitroceluloznu membranu i oznaavaju i detektiraju uz pomo antitijela specifinih za
ciljani protein.
Western blot je metoda koja je nala primjenu u molekularnoj biologiji, biokemiji,
imunogenetici, ali i u dijagnostici nekih bolesti kroz dokazivanje prisutnosti odreenih
proteina (koristi se naziv antigen-a) u ispitujuem uzorku.
Western blot metoda se sastoji od:

1. SDS PAGE- eng. Sodim Dodecyl Sulphate, Poly Acrylamid Gel Electrophoresis uzorak se najprije usitni ukoliko je rije o tkivu, te se podvrgne djelovanju detergenta
SDS te se pod njegovim djelovanjem proteini denaturaju i prevode u primarnu
linearnu strukturu s negativnim nabojem.

Slika 9. Djelovanje detergenta SDS-a na proteine

Zatim se taj uzorak smjese proteina podvrgne elektroforezi u poliakrilamidnom gelu, te se
proteini razdvajaju u elektrinom polju na temelju veliine.

Slika 10. Gel elektroforeza u poliakrilamidnom gelu

2. Prijenos proteina s gela na nitroceluloznu membranu

Gel se pokrije nitroceluloznom membranom i uloi izmeu dva filter papira i dvije spuve
natopljene puferiranom otopinom.
Spontanom adsorpcijom i uz pomo elektrine struje (150 mA) odvojene linije (razdvojeni
proteini) se s gela prenesu, transferiraju ili umrljaju na nitroceluloznu membranu.

Slika 11. Shematski prikaz prijenosa uzorka proteina na nitroceluloznu membranu

3. Identifikacija proteina (antigena) imunoenzimnim testomNitrocelulozna membrana s preneenim uzorkom rastavljenog antigena, odnosno proteina
razdvojenih na temelju veliine, uroni se u otopinu s protutijelima.
Ta protutijela mogu biti za kompleks antigena tzv. poliklonska protutijela ili za specifino
protutjelo tzv. monoklonska protutijela.
Nakon inkubacije slijedi ispiranje da bi se uklonila nevezana protutijela.
Vano je napomenuti da su protutijela su oznaena enzimom, npr. alkalnom fosfatazom.
Nakon toga slijedi detekcija vezanih protutijela. Nitrocelulozna membrana uranja se u
otopinu supstrata za taj enzim.

Slika 12. Shematski prikaz reakcije protutijela sa traenim proteinom u uzorku (antigenom)

Pozitivna reakcija oituje se razgradnjom supstrata i obojenjem linije na mjestu gdje su

su protutijela reagirala s odgovarajuim sastojkom antigena, odnosno naim traenim
proteinom u ispitujuem uzorku. Veliina, odnosno molekulska masa oznaenog, a ujedno i
traenog proteina u ispitujuem uzorku usporeuje se s poznatim veliinama proteina, tzv.
proteinskim markerom.

Slika 13. Fotografija nitrocelulozne membrane s ispitujuim uzorcima u kojima je oznaen I

detektiran traeni protein

Bioloki pokus
Bioloki pokus objektivna je metoda dijagnostike koja se provodi na pokusnim ivotinjama, a
ima za cilj dijagnosticiranje zaraznih bolesti za ivota ili nakon smrti ivotinje. Materijal za
izvoenje biolokog pokusa uzima se na isti nain kao materijal za izvoenje mikrobioloke
pretrage. ivotinjama u septikemijskom stadiju bolesti uzorkuje se krv, kod bolesti s
organskom manifestacijom odgovarajui uzorci promijenjenih tkiva, a ivotinjama nakon
uginua krv ili promijenjeni organi ovisno o klinikoj slici i patoloko-anatomskom nalazu.
Prilikom infekcije pokusne ivotinje uzorkovanim materijalom treba paziti da put unosa
odgovara prirodnim ulaznim vratima. Bioloki pokus moe se izvoditi na homolognim i
heterolognim ivotinjama (ivotinjama iste ili razliite ivotinjske vrste kao oboljela
ivotinja).
Dijagnosticiranje zaraznih bolesti biolokim pokusom temelji se na Kochovim postulatima
prema kojima se mikroorganizam smatra uzronikom neke bolesti ako udovoljava sljedeim
uvjetima:
a) uzronik mora biti prisutan u svih oboljelih ivotinja i ne smije biti prisutan u
zdravih jedinki,
b) uzronik se iz oboljele ivotinje mora moi izdvojiti u istoj kulturi,
c) inokuliran drugoj, zdravoj ivotinji mora uzrokovati istu bolest i
d) iz te ivotinje mora se u istoj kulturi izdvojiti uzronik istovjetan onom
izdvojenom iz oboljele ivotinje.
Premda su u prolosti Kochovi postulati imali veliku ulogu u razvoju mikrobiologije i
infektologije, danas se zna da imaju i odreena ogranienja. Inaparentne infekcije su, na
primjer, iznimka od prvog postulata koji govori da mikroorganizam ne smije biti prisutan u
zdravih ivotinja. Isto tako, ponekad uzronik izdvojen iz domaina u kojem je uzrokovao
bolest nee uzrokovati bolest u drugom domainu zbog razliite otpornosti organizma i drugih
imbenika koji utjeu na razvoj bolesti. Takoer, u vrijeme kada je Koch postavio svoje
postulate jo nije bilo otkriveno postojanje virusa i priona koji esto uzrokuju inaparentne
infekcije i kojih se veliki broj ne moe uzgojiti na umjetnim podlogama.
Osim gore navedenih iznimki od Kochovih postulata na kojima se ova metoda temelji, njeno
izvoenje oteavaju i financijski i etiki razlozi. Nadalje, znamo da je brzina dijagnosticiranja
posebice vana u sluaju zaraznih bolesti zbog sprijeavanja irenja pa je nedostatak
biolokog pokusa i to to je postupak puno dugotrajniji od niza suvremenih, mikrobiolokih, a

ponajprije molekularnih metoda dijagnosticiranja. Molekularne dijagnostike metode

razvijene posljednjih desetljea omoguavaju brzi dokaz uzronika i vrlo su osjetljive (to
znai da mogu detektirati uzronika u tkivu u kojem ga ima vrlo malo). Njima je takoer
mogue brzo i precizno potvrditi u tkivima prisutnost uzronika koji se ne mogu izdvojiti in
vitro ili je njihovo izdvajanje vrlo zahtjevno. Sva ta svojstva daju ovim metodama veliku
prednost pred biolokim pokusom pa je on u dananje vrijeme gotovo u potpunosti naputen.

UZIMANJE I SLANJE KLINIKIH MATERIJALA NA

LABORATORIJSKE PRETRAGE (PO VRSTAMA)
Uzimanje i slanje klinikih materijala na laboratorijske pretrage od iznimne je vanosti i sve
je vie zastupljeno u modernoj veterinarskoj medicini. Iz injenice da veliki broj zaraznih
bolesti ne moemo objektivno dijagnosticirati samo na temelju anamnestikih podataka,
epizootioloke situacije na pojedinom prostoru te sustavnom klinikom pretragom pacijenta
postavljanje etioloke dijagnoze (nalaz uzronika ili njihovih toksina) od presudne je vanosti.
Pred doktorima veterinarske medicine stoje sve zahtjevniji i opseniji zadaci i odgovornosti
kada je rije o postavljanju sumnje za zaraznu bolest odnosno njena potvrda ili iskljuivanje.
Odgovornost proizlazi iz injenice da mnoge zarazne bolesti predstavljaju izravnu prijetnju
spram ljudi (zoonoze) te ukoliko poduzete mjere u sluaju sumnje ili pojave zarazne bolesti
nisu pravovremene i odgovarajue ugroavaju stoni fond. Iz navedenog nedvojbeno proizlazi
da doktori veterinarske medicine imaju veliku ulogu primarno u ouvanju zdravlja ivotinja i
ljudi, meutim ekonomski i financijski gubici koji proizlaze iz eventualnih enzootija,
epizootija ili panzootija nikako ne smiju biti zanemareni. U tu svrhu uzimanje materijala i
njegovo slanje na laboratorijske pretrage mora biti pravovremeno, uzeto na odgovarajui
nain, pravilno skladiteno i poslano u odgovarajui laboratori sve u svrhu postavljanja ili
iskljuivanja zarazne bolesti kako bi se na vrijeme i odgovarajuim radnjama zatitilo zdravlje
ivotinja i ljudi te svelo ekonomske gubitke na najmanu moguu razinu.
Pojam laboratorijske pretrage iznimno je opiran i poprilino nedefiniran i nejedinstven. Pod
njim podrazumijevano veliki broj razliitih vrsta pretraga i metoda koje su mogue i dolaze u
obzir pri dijagnosticiranju zaraznih bolesti domaih ivotinja. Ubrzanim razvojem znanosti i
tehnologija svakim danom razvijaju se sve sofisticiranije, specifinije i osjetljivije
laboratorijske pretrage kojima se objektivno postavlja dijagnostika mnogih zaraznih bolesti
kako ivotinja tako i ljudi.
Kao to je prethodno spomenuto postavljanje parvovremene i tone dijagnoze zarazne bolesti
kompleksan je i sloen zadatak. U svrhu postavljanja tone i objektivne dijagnoze treba
potivati odreeni redosljed klinike pretrage (podaci o vlasniku ili dratelju ivotinje,
nacional, anamneza, status praesens) koji e nas usmjeriti i uvelike nam pomoi pri pravilnom
odabiru materijala koji emo uzorkovati i poslati na dodatne laboratorijske pretrage ukoliko
ne moemo samo na temelju sustavne klinike pretrage postaviti tonu dijagnozu. Skup
fizikalnih,

kemijskih,

kemijsko-toksikolokih,

mikroskopskih,

patoanatomskih,

bakteriolokih,virusolokih,

mikolokih,

hematolokih,

biokemijskih,

serolokih,

parazitolokih, molekularnih pretraga zajedniki nazivamo laboratorijskim pretragama.

Neke od tih pretraga su jednostavne pa se mogu vriti u svakodnevnoj praksi, meutim neke
od njih su sloenije pa iz tog razloga zahtijevaju posebnu laboratorijsku opremu i uvjete. U
mnogim sluajevima kliniku pretragu treba upotpuniti i potvrditi sloenijim laboratorijskim
metodama te se tada materijal za pretragu dostavlja u istraivaki ili dijagnostiki laboratorij.
U ovom dijelu naglasak na uzimanje i slanje klinikog materijala odnosit e se na
mikrobioloku, mikoloku, seroloku i patolokoanatomsku pretragu.
Rezultat bilo koje od navedenih laboratorijskih pretraga uvelike ovisi o pravilnom izboru
materijala koji aljemo, o njegovoj svjeini, nainu uzorkovanja, pakiranju te samom slanju.
Uzronici zaraznih bolesti ili njihovi toksini na osnovi tkivnog afiniteta i same patogeneze
bolesti nalaze se, ovisno o stadiju bolesti, u ive ivotinje ili nakon smrti u razliitom
materijalu. Radi toga za laboratorijsku pretragu treba najprije uzeti promijenjeni organ, tkivo,
patoloki sekret ili ekskret odnosno uzeti uzorak iz kojeg oekujemo da e potvrditi etioloki
agens odnosno protutijela koja ga dokazuju.
Svjeina uzetog materijala takoer utjee na ishod laboratorijske pretrage,pogotovo ako se
radi o organima i tkivima uginule ivotinje u kojoj vrlo brzo nastupaju autolitike promjene
kojima se pogoravaju ivotni uvjeti mikroorganizama koji su doveli do uginua te
nepravovremeno uzorkovanje moe znatno oteati i krivo usmjeriti laboratorijsku pretragu.
Isto tako da bi uzeti materijal ostao svje i upotrebljiv za laboratorijsku pretragu treba ga to
je bre mogue dostaviti u dijagnostiki laboratorij.
Materijal za veinu laboratorijskih pretraga uzrokuje se sterilnim instrumentima (igle,
brizgalice, tapii za obriske, pincete, no, kare i sl.). Koliina uzetog materijala mora
odgovarati potrebama pretrage na koju uzeti uzorak aljemo. to se riba tie njih u pravilu
aljemo cijele, zamotane u navlaeni papir u ledu. Uzorci pela (oko 30 komada iz pojedine
konice) stavljaju se u papirnate vreice, a uzorak saa 10x10 cm zamota se u papir i alje u
kartonskoj ili drvenoj kutiji.
Samo pakiranje poslanog materijala takoer je od iznimne vanosti kako bi dostavljeni
materijal bio upotrebljiv za zatraene laboratorijske pretrage i kako bi ostao u posudama u
kojima je skladiten jer u protivnom moe predstavljeti ozbiljnju zdravstvenu prijetnju
ljudima koji dolaze u kontakt s njim jer se radi o biolokom materijalu koji je potencijalni
izvor zaraze. Iz tog razloga boce s materijalom i epruvete zatvaraju se hermetikim epom ili
zatvaraem kako bi se osigurao njihov siguran transport.

Slanje samog dijagnostinog materijala bilo bi najbolje poslati putem kurira. Na poiljci treba
vidljivo oznaiti da se radi o biolokom materijalu koji je potencijalno zarazan kako bi se s
njim u transportu propisno postupalo. Ukoliko su zakonom ili naredbom propisani uvjeti
transporta njih se svakako treba pridravati.
Svaki uzorkovani i poslani kliniki materijal koji se alje na laboratorijske pretrage obavezno
treba pratiti uputnica koja sadrava sljedee podatke:
a) naziv i adresu poiljatelja, broj protokola i datum
b) ime, prezime i adresu (broj telefona) vlasnika ivotinje
c) podatke o ivotinji (vrsta, spol, pasmina, dob, posebni znaci, ime, jedinstveni matini
broj, broj mikroipa ako je ivotinja obiljeena mikroipom)
d) popis materijala upuenih na pretragu, njihove oznake na posudama i datum
uzorkovanja
e) vrsta pretrage koju se trai
f) klinika dijagnoza (sumnja na odreenu bolest ili skupinu bolesti), eventualne
patolokomorfoloke promjene
g) epizootioloke podatke i podatke o lijeenju (lijekovi trajanje)
h) ime, prezime i potpis osobe koja je uputila materijal.
Danas postoje slubeni obrasci (uputnice) koje propisuje Uprava za veterinarstvo RH koje
trebaju pratiti odreene bioloke materijale (npr. krv za seroloko testiranje IAK, leptospiroza,
arteritis konja, bedrenica itd.) koji se alju u dijagnostike laboratorije radi provoenja
Narebe o mjerama zatite ivotinja od zaraznih i namtetnikih bolesti i njihovom
financiranju u 2011. godini.

Uzimanje i slanje materijala na bakterioloku i mikoloku pretragu

Osnovni razlog zbog kojeg se materijal uzima i alje na pretragu u mikrobioloki laboratorij je
taj da se na osnovu mikrobioloke pretrage pretraenog materijala postavi objektivna
(etioloka) dijagnoza. Bakteriolokim i mikolokim pretragama u materijalu se moe dokazati
prisutnost patogene bakterije ili gljivice i njihovih toksina.
Materijal za bakterioloku pretragu moe se uzeti od bolesne, zdrave ili uginule ivotinje.
Od ive ivotinje na osnovi anamnestikih podataka, epizootiolokih podataka, klinikog
nalaza i postavljene sumnje na zaraznu bolest moemo uzeti: krv, iscjedak iz prirodnih otvora,
ispirak sa sluznica, sekret mlijene lijezde, sputum, mokrau, izmet, tekuinu iz edema,
plodne vode, posteljicu ili samo njezin dio, pobaeni fetus ili dijelove fetusa, obrisci s koe i
dostupnih sluznica, strugotine s koe i dlaku, perje, punktati apscesa, obrisci fistula te bioptati
organa.
Od peradi treba na pretragu uputiti cijelu leinu (odrasle peradi najmanje 15). Iznimno je
dovoljno poslati manji broj leina, a organe se u pravilu rijetko alje.
Bolesne ribe, rakove i koljkae treba slati u veem broju, u vodi, kako bi na pretragu stigli
ivi.
Materijal od uginule ivotinje moe biti razliit, ali se najee dostavljaju ovi organi ili
njihovi dijelovi: jetra, slezena, bubreg, srce, plua, mozak, limfni vorovi, kotanu sr, spolne
organe, eksudate iz prsne i trbune upljine, guterau, crijevo i eludac sa sadrajem.
Izvori zaraze ne moraju biti samo bolesne domae ivotinje ili ivotinje kliconoe ve one
svojim sekretima i ekskretima mogu kontaminirati okolinu koja postaje sekundarni izvor
zaraze. Upravo iz tog razloga uzorak za bakterioloku ili mikoloku pretragu moe biti uzet iz
neposredne okoline ili s predmeta koju su bili u doticaju s bolesnom ivotinjom, ivotinjom
sumljivom na oboljenje ili sumnjivom na zaraenje. Stoga se na pretragu uzima: hrana, voda
za napajanje, stelja, tlo, obrisci predmeta (pribor za hranjenje, napajanje, munju, njegu
ivotinje i sav ostali radni pribor), a posebnim mikrobiolokim postupkom moe se pretraiti i
zrak u nastambi.
Od primarnih izvora infekcije ukoliko su dostupni bilo bi uputno bakterioloki pretraiti i
artropode (lankonoce- krpelje, muhe itd.) te takoer druge divlje ivotinje (kraljenjake)
koji mogu biti izvori infekcije.
Ishod same laboratorijske pretrage uvelike ovisi o ranije opisanim uputama o pravilnom
izboru,svjeini samog uzorka, nainu uzorkovanja, pakiranju te njegovom slanju na pretragu.
4

Nepotivanje navedenih smjernica uvelike e kompromitirati laboratorijsku pretragu.

Materijal za pretragu mora biti svje to znai da mora biti uzrokovan to prije nakon uginua
ivotinje, jer kao to je spomenuto vrlo brzo nakon uginua mijenja se stanje u tkivima i
organima. Da bismo sprijeili uginue neotpornih mikroorganizama, uzorkovani materijal
moemo staviti u tzv. transportnu podlogu. Takve podloge nemaju hranjivu vrijednost i ne
omoguuju razmnoavanje uzronika, ali njihovom uporabom osiguravamo preivljavanje
mikroorganizma u vremenu od uzimanja materijala do njegova nacijepljivanja na hranjivu
podlogu u laboratoriju. Materijal se uzorkuje sterilnim priborom i aseptiki. Dijelovi organa
koji se uzimaju moraju biti dovoljno veliki (oko 100 grama), zatieni vlastitom ovojnicom a
tekueg materijala potrebno je uzorkovati oko 100 ml. Svaki materijal koji se alje na
mikrobioloku odnosno mikoloku pretragu mora biti dobro zapakiran i zatien kako
prilikom transporta nebi dolo do irenja infekcije. Tako se zatiuje i osobe koje obavljaju
dostavu isto kao i osobe u laboratoriju koje e rukovati s pristiglim materijalom.
Na Klinici za zarazne bolesti Veterinarskog fakulteta veina materijala uzetog za
bakterioloke odnosno mikoloke pretrage uzorkovan je sa kunih ljubimaca (psi i make,
meuti u posljednje vrijeme sve je vei broj egzotinih kunih ljubimaca npr. kunii, zeevi
inile i ostali monogastrini glodavci). U veini sluajeva radi se o uzimanju obrisaka koe,
zvukovoda, konjuktiva, nosnih prohoda, vaginalnih obrisaka te bakterioloke pretrage urina i
fecesa. U navedenim sluajevima nakon temeljite klinike pretrage pacijenta sterilnim
stapiima s vatom uzima se obrisak promijenjenog podruja s kojeg elimo izolirati
mikroorganizme u cilju postavljanja etioloke dijagnoze. U svrhu uzimanja materijala za
mikoloku pretragu uzorak izbora je obrisak koe ivotinje i dlaka zajedno s korjenom koja se
skladiti u sterilne staklene boice. Uzeti obrisci za bakterioloku odnosno mikoloku
pretragu nebi smjeli biti stariji od 24 sata. Rezultati bakterioloke pretrage u veini sluajeva
gotovi su nakon 48 do 72 sata po dospijeu u laboratorij a za rezultate mikoloke pretrage
potrebno je 7 do 14 dana.

Uzimanje i slanje materijala na seroloke pretrage

U novije vrijeme sve su vie zastupljene imunoloke metode dijagnostike mnogih zaraznih
bolesti. U ovom dijelu bit e rijei o serolokim reakcijama gdje pomou poznatog jednog
sudionika seroloke reakcije dokazujemo drugi. Sudionici serolokih reacija su antigen (u
5

najveem broju sluajeva etioloki agens zaraznih bolesti) i protutijelo (antitijelo). Kao to je
prethodno reeno u svakom imunolokom postupku jedan od sudionika reakcije uvijek mora
biti poznat, da bi se njime mogao indentificirati drugi sudionik reakcije. Tako se poznatim
antigenom moe dokazati nazonost odgovarajuih protutijela u krvnom serumu ili nekoj
drugoj tjelesnoj tekuini, a poznatim protutijelima dokazati nepoznati antigen.
Pojedine zarazne bolesti mogu se relativno lako prepoznati i dijagnosticirati na temelju
anamnestikih podataka, epizootiolokie situacije na terenu i same klinike pretrage te
eventualno patoanatomskim nalazom. Potekoe nastaju u sluajevima kada kliniki znakovi
bolesti nisu specifini, nisu jasno izraeni ili je ivotinja naizgled zdrava ali u sebi nosi
uzronika zarazne bolesti i iri ga u okolinu koja postaje sekundarni izvor zaraze. U tim
nerijetkim sluajevima tona dijagnoza (etioloka dijagnoza) moe se postaviti na osnovu
izdvajanja i indentifikacije uzronika ili dokazom protutijela odnosno antigena u
pretraivanom krvnom serumu tzv. serolokim reakcijama. U otkrivanju latentnih infekcija i
kroninih zaraznih bolesti seroloke reakcije u naelu su pouzdanije od izdvajanja uzronika,
a u dijagnostici virusnih zaraznih bolesti redovito daju bre rezultate. Osim same dijagnostike
zaraznih bolesti seroloke metode rabe se i u svrhu provjere imunosnog statusa ivotinja. Da
bi se serolokim reakcijama brzo i pouzdano postavila dijagnoza ili provjerila imunost,
prijeko je potrebno na ispravan nain i u pravo vrijeme uzorkovati krv ivotinje. Pritom treba
imati na umu da se protutijela u dokazivom titru pojavljuju u krvnom serumu od 7. dana post
infekcijski. Pri pojedinim akutnim zaraznim bolestima (leptospiroza, virusni arteritis konja,
rinopneumonitis konja) na seroloku pretragu potrebno je poslati parne serume kako bi se po
razlici titra protutijela mogli donijeti odreeni zakljuci. Prvi uzorak uzima se na poetku
bolesti, a drugi u razmaku 7 do 14 dana nakon prvoga. Na trenutnu infekciju upuuje znaajno
(etverostruko) poveani titar protutijela u drugom pretraivanom krvnom serumu. Ako se u
oba pretraivana uzorka krvnog seruma dokau protutijela u podjednakom titru, rije je o
protutijelima koja su preostala od prijanje infekcije (rezidualni titar protutijela).
Samo uzrokovanje odnosno venepunkcija od velike je vanosti za pouzdanu dijagnostiku.
Svrha venepunkcije je dobivanje dostatne koliine krvi odnosno krvnog seruma koji je
najei izvor protutijela. Prilikom vaenja krvi treba se strogo pridravati naela aseptinog
rada iz razloga to je krv idealni medij za bakterije koje uzorak mogu uiniti neprikladnim za
seroloku pretragu. Krv se uzima sterilnom iglom i brizgalicom ili jo bolje i praktinije
pomou vakutajner sistema. Na mjestu venepunkcije treba oiati dlaku i dezinficirati kou
svaki puta kada je to mogue. Za seroloku pretragu uzima se od ivotinja 10ak ml krvi kako
bi se nakon gruanja dobilo oko 5 ml seruma. Krv se vadi u sterilne epruvete sa ili bez
6

aktivatora gruanja krvi. Kako bi se izbjeglo stvaranje pjene i kasnije hemolitiki serum
(posljedica razbijanja eritrocita) mlaz krvi treba usmjeriti tako da krv klizi uz stijenke
epruvete. Samo vaenje krvi razlikuje se po ivotinjskim vrstama.
Govedima venepunkciju obino izvodimo iz:
a) vanjske jugularne vene (v. jugularis externa)
b) podrepne vene/arterije (v. coccygea; a. coccygea)
Vanjska jugularna vena nastaje spajanjem v. linguofacialis i v. maxilaris. V. jugularis externa
lei ventralno na vratu u jugularnom lijebu (sulcus jugularis) koji se nalazi na granici regio
colli leteralis i regio colli ventralis. U kranijalnoj i srednjoj treini vrata ona lei neposredno
ispod koe, stoga je taj dio pogodan za vaenje krvi i intravenske injekcije kod goveda, konja,
ovce i koze. Na tom mjestu oia se dlaka te se mjesto dezinficira alkoholom. Jednom rukom
napravi se kompresija krvne ile ventralno od mjesta venepunkcije a drugom rukom se ubada
u krvnu ilu i vadi se krv. Nakon vaenja krvi mjesto se ponovo dezinficira vatom
natopljenom alkoholom.
Uz v. jugularis externu pogodno i jednostavno mjesto za vaenje krvi govedima je v.
coccygea i a. coccygea. Obje, arterija i vena, lee pod korjenom repa na granici regio
perinealis (analis) i regio caudalis. Poto vena i arterija lee jedna na drugoj esto nismo
sigurni iz koje emo krvne ile (arterije ili vene) dobiti krv. Samo na temelju boje krvi
(arterijska krv svjetlija) emo znati iz koje smo krvne ile izvadili krv, meutim to nam ne
utjee na sami ishod i vjerodostojnost seroloke reakcije. Prilikom vaenja krvi govedu iz
podrepne vene odnosno arterije pomonik nam podigne rep goveda ili ako smo ve dovoljno
vjeti jednom ga rukom sami podignemo a drugom rukom ubadamo iglom u podruje izmeu
treeg i petog repnog kraljeka te vrimo venepunkciju. Mjesto venepunkcije najprije
pripremimo po prethodno opisanom postupku.
Kod konja, ovaca i koza venepunkciju vrimo iz v. jugularis externe kao to je opisano kod
goveda.

Kod psa i make vene punkciju najee izvodimo iz:

a) v. cephalica (prednja noga)
b) v. saphena medialis/lateralis (stranja noga)
c) v. femoralis (stranja noga)
Kod venepunkcije iz v. cephalica pas odnosno maka je u sjedeem poloaju dok su prednje
noge ispruene. Nakon postavljanja esmarchove gume/trake i dezinfekcije mjesta uboda
njeno palpiramo napunjenu venu koja se esto vidi i golim okom u regio antebrachi. Po
vaenju krvi poputamo esmarch i vadimo iglu iz vene i pritiskom vate natopljene u alkohol
zaustavljamo krvarenje koje u pravilu staje unutar jedne minute.

Venepunkcije iz v. saphene dok ivotinja lei na boku,odnosno venepunkcija iz v. femoralis.

Kod svinja venepunkciju vrimo iz v. cave cranialis i iz krvnih ila uke, a u peradi iz krilne
vene (v. ulnaris).
Svaku epruvetu propisno oznaimo da se moe kasnije seroloki nalaz povezati s ivotinjom
ija je krv pristigla u dijagnostiki laboratorij te je skladitimo i to hitnije poaljemo
potivajui prethodno navedena pravila slanja materijala na laboratorijske pretrage.

Uzimanje i slanje materijala na patolokoanatomsku i patolokohistoloku pretragu

Na patolokoanatomsku pretragu alju se itavi leevi uginulih ivotinja ili njihovi dijelovi
(organi i tkiva). Osnovno je pravilo u slanju takvog materijala da se le ili pojedini organi
trebaju dostaviti u to je mogue kraem roku i na nain da se izbjegne svaka mogunost
irenja zarazne bolesti. Velike se ivotinje rjee alju na razudbu zbog zahtjevnog transporta.
Leevi malih ivotinja dostavljaju se znatno ee i to u sanducima ili drugim prikladnim
posudama, koje imaju vrste i nepropusne stijenke. Preporuljivo je na razudbu slati cijele
neotvorene leeve, naroito malih ivotinja, jer se u neotvorenim leevima organi bolje
ouvaju. Kada se na patolokoanatomsku pretragu ne mogu dostaviti cijeli leevi, alju se
pojedini organi ili organski sustavi. U tom sluaju uplje organe treba podvezati na krajevima
kako bi se izbjeglo cijeenje sadraja. Svaku poiljku treba pratiti pravilno i sa svim
potrebnim podacima ispunjeni dopis.
Na patolokohistoloku pretragu dostavlja se materijal najee uzorkovan od ivih ili
uginulih ivotinja. Materijal od ivih ivotinja namijenjen patolokohistolokoj pretrazi moe
biti izvaen u cijelosti (tumor i sl.) ili ee uzorak dijela organa ili tkiva. Za patohistoloku
pretragu uzima se dio promijenjenog organa ili tkiva tako da se dvama paralelnim rezovima
okomito na povrinu organa izree tkivo u obliku kocke eera. Izrezana tkiva stave se u
sterilnu posudu s 10%-tnim formalinom. Koliina formalina u posudi za transport mora biti
deset puta vea od volumena uzetog tkiva. Boice moraju biti pravilno oznaene kako bi se
znao njihov sadraj po dospijeu u laboratori i poiljka mora sadravati popratni dopis sa
svim potrebnim podacima.

Uzimanje i slanje materijala na kemijsko-toksikoloku pretragu

??

??

??

??

??

??

??

??

??

??

??

??

10

11