Professional Documents
Culture Documents
Các Phương Pháp Hiện Đại Ứng Dụng Trong PTTP
Các Phương Pháp Hiện Đại Ứng Dụng Trong PTTP
Bài giảng
Hình 1.1. Phân loại các phương pháp phân tích công cụ
II.2.3. Ưu - nhược điểm của phương pháp phân tích công cụ
-5-
Ưu điểm:
- Độ chính xác cao
- Giới hạn định lượng thấp, do đó có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ và phân tích các
cấu tử vi lượng và vết.
- Độ chọn lọc cao, do vậy có thể phân tích các mẫu có thành phần phức tạp
- Tốc độ phân tích nhanh nhờ hệ thống thiết bị được tự động hóa
Nhược điểm:
- Thiết bị đắt tiền
- Người phân tích cần có chuyên môn sâu để sử dụng hiệu quả thiết bị
Ứng dụng: dùng để định lượng các cấu tử vi lượng (hàm lượng cỡ 0,01- 0,1%)
hay cấu tử vết (hàm lượng < 0,01%) trong các mẫu thực phẩm, dược phẩm, môi
trường, sinh học,…
Ngoài ứng dụng trong phân tích định lượng, một số phương pháp phân tích vật lý
và hóa lý còn được dùng trong nghiên cứu cấu trúc vật chất như:
- Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (phổ UV-Vis): Nhận biết
phân tử chất hấp thụ nhờ hình dạng phổ hấp thụ và các đỉnh hấp thụ đặc trưng.
- Phương pháp quang phổ hồng ngoại (phổ IR): Xác định sự có mặt và vị trí của
các nhóm chức trong các phân tử hợp chất hữu cơ dựa vào các tần số dao động đặc
trưng cho nhóm chức xuất hiện trong phổ IR.
- Phương pháp phổ khối lượng (phổ MS): Bắn phá phân tử thành các ion. Xác
định phân tử lượng và cấu trúc phân tử dựa vào khối lượng và điện tích (tỷ số m/z) của
mảnh ion phân tử và các mảnh ion được tạo thành.
- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ NMR): Đặt mẫu phân tích (khá
tinh khiết) chứa phân tử chất nghiên cứu cấu trúc vào trong một từ trường ngoài, kích
thích các hạt nhân nguyên tử (thường là hạt nhân 1H hay 13C) trong phân tử bằng một
bức xạ vô tuyến có tần số thích hợp để xảy ra sự chuyển hạt nhân lên trạng thái có mức
năng lượng từ cao hơn (gọi là sự cộng hưởng từ hạt nhân). Xác định sự có mặt của các
nhóm chức có trong phân tử dựa vào cường độ và vị trí (độ chuyển dịch hóa học) của
các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho các nhóm chức này.
- Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X: Ghi phỗ nhiễu xạ tia X của chất rắn tinh thể.
Xác định cấu trúc mạng lưới tinh thể chất rắn dựa vào các chỉ số đặc trưng.
III. PHÂN LOẠI CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THỰC PHẨM –
NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
Có thể phân loại các chỉ tiêu chất lượng thực phẩm thành các nhóm sau dựa theo
hàm lượng của cấu tử cần phân tích trong mẫu:
-6-
a) Các thành phần đa lượng: là các thành phần hóa học cơ bản có trong nguyên
liệu chế biến thực phẩm hay các thành phần khác được hình thành trong quá trình chế
biến, bảo quản thực phẩm
Để định lượng các thành phần đa lượng này có thể dùng các phương pháp phân
tích hóa học (phương pháp chuẩn độ; phương pháp phân tích khối lượng).
Ví dụ:
- Xác định đạm thối (NH3); N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; xác định acid
amin tổng số bằng phương pháp chuẩn độ formol,…(chuẩn độ acid – baz)
- Xác định hàm lượng muối ăn bằng phương pháp Mohr (chuẩn độ kết tủa)
- Định lượng Ca2+ , Mg2+ trong các mô thực vật; xác định độ cứng của nước,…
bằng phương pháp chuẩn độ complexon (chuẩn độ phức chất)
- Xác định glucid (đường khử, saccharose, đường tổng, tinh bột,…) bằng phương
pháp Bertrand hay phương pháp Xanh Metylen; xác định etanol bằng phép đo
dicromat…; định lượng vitamin C, SO 2 bằng phép chuẩn độ Iod – Thiosulfat (chuẩn
độ oxy hóa – khử)
- Xác định hàm lượng nước (hay chất khô tổng số), khoáng tổng số, lipid tổng số
bằng phương pháp phân tích khối lượng.
b) Các thành phần vi lượng: thường là các phụ gia được đưa vào trong quá
trình chế biến thực phẩm.
Ví dụ: Chất chống vi sinh vật; chống oxy hoá, các chất chống đóng vón; chất điều
chỉnh độ ẩm; chất làm trong; chất làm đặc và tạo gel; chất điều chỉnh độ chua; chất
điều vị; chất ngọt nhân tạo; chất tạo mùi; chất tạo màu; các enzyme,…
Các phụ gia thực phẩm thường được định lượng bằng phương pháp phân tích công
cụ thông thường (trắc quang – so màu; sắc ký bản mỏng; GC; HPLC,…)
c) Các thành phần vết: bao gồm các độc tố có trong thực phẩm do nguyên liệu
chế biến không đảm bảo chất lượng, hoặc bị thôi nhiễm từ các thiết bị sản xuất/bao bì
trong quá trình chế biến và bảo quản, hoặc được hình thành do các phản ứng sinh hóa
xảy ra trong quá trình chế biến thực phẩm không đúng cách,…
Ví dụ: Kim loại nặng (Pb, Hg, Cd, As, Se, Cu, Sn, Cr,…); độc tố do vi sinh vật
tiết ra (aflatoxin); dư lượng thuốc trừ sâu; dư lượng kháng sinh; dư lượng chất kích
thích tăng trưởng; độc chất gây ung thư (3-MCPD),…
Các độc tố thực phẩm thường được bằng phương pháp phân tích công cụ có độ
nhạy cao (GF-AAS; ICP-MS; GC-MS; LC-MS,…).
Trong các chương sau sẽ giới thiệu một số phương pháp phân tích hiện đại ứng
dụng trong định lượng các phụ gia và độc tố thực phẩm.
-7-
Chương 2.
PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ UV-Vis
Đây là phương pháp phân tích được ứng dụng rất rộng rãi trong phân tích thực
phẩm. Phương pháp này dựa trên hiện tượng hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử chất
nghiên cứu.
II.1. Sự hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử:
Chiếu một chùm bức xạ đơn sắc có bước sóng thích hợp đi qua một hệ đồng nhất
(ở thể khí hay dung dịch) chứa các phân tử chất nghiên cứu. Nếu năng lượng của bức
xạ sử dụng tương ứng với năng lượng cần cung cấp để chuyển dời các electron trong
phân tử từ trạng thái cơ bản (mức năng lượng thấp nhất: E 0) lên trạng thái kích thích
(có mức năng lượng cao hơn: E*) thì sẽ xảy ra hiện tượng hấp thụ ánh sáng:
E*
h = E = E* - E0
E0
Hình 2.1. Điều kiện để xảy ra hiện tượng hấp thụ ánh sáng
Hình 2.2. Các kiểu chuyển dời electron cơ bản trong phân tử hợp chất hữu cơ
Khi phân tử bị kích thích bởi bức xạ UV hay Vis, có thể xảy ra một số các kiểu
chuyển dời electron trong phân tử chất hữu cơ khi bị kích thích:
- Chuyển dời σ σ*: xảy ra ở những hợp chất có liên kết đơn, đòi hỏi năng
lượng lớn nhất, ứng với vùng UV xa (λ < 190 nm)
- Chuyển dời π π*: rất quan trọng, xảy ra ở những hợp chất có liên kết bội và
có cấu trúc nối đôi liên hợp (các hợp chất thơm). Chuyển dời này ứng với bức
-8-
xạ có bước sóng khoảng 200 nm. Mạch liên hợp phân tử càng dài thì bước sóng
hấp thụ càng chuyển về vùng sóng dài.
- Chuyển dời n σ* hay n π*: liên quan tới những phân tử chứa cặp electron
không phân chia trong các dị tố N, O, xảy ra ở vùng gần 300 nm.
Những bước sóng hấp thụ trên thay đổi đáng kể khi có mặt các nhóm thế trong
phân tử.
Cùng một mức năng lượng điện tử, trong phân tử còn có nhiều mức năng lượng
dao động và quay. Do đó, phổ hấp thụ điện tử của phân tử khá rộng (là phổ đám,
không phải phổ vạch)
Trong phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng dãi bức xạ thuộc
vùng tử ngoại gần (λ = 200 – 400 nm) hay vùng khả kiến (λ = 400 – 800 nm).
II.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis - Định
luật Bouguer – Beer - Lambert
Chiếu một chùm ánh sáng đơn sắc (cường độ I 0) vuông góc với một cuvet (chậu
đo) đựng dung dịch chứa các phân tử chất nghiên cứu. Trên đường đi của tia sáng, có
thể xảy ra các hiện tương sau:
- sự phản xạ ánh sáng trên bề mặt cuvet
- sự hấp thụ ánh sáng bởi vật liệu làm cuvet
- sự hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử có trong dung dịch
Kết quả là cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch sẽ giảm đi.
Nếu xem rằng không xảy ra sự phản xạ ánh sáng trên bề mặt cuvet (sử dụng có bề
mặt rất nhẵn) và sự hấp thụ ánh sáng bởi vật liệu làm cuvet (chọn vật liệu thích hợp)
thì:
I0 = IA + IT
trong đó:
IA: cường độ bức xạ bị hấp thụ
IT: cường độ bức xạ sau khi đi qua dung dịch
l
I0 I
(λ) T
I
A
Dung dịch hấp thụ (nồng
độ C)
Sự hấp thụ ánh sáng tuân theo các định luật của Bouguer (1729), Beer (1760) và
Lambert (1852):
-9-
Độ giảm cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch tỷ lệ với bề dày lớp dung
dịch ánh sáng truyền qua và nồng độ chất hấp thụ:
IT = I0.e- k C l ( : hệ số tỷ lệ)
I0
hay: lg Cl
IT
Để đánh giá cường độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch, người ta dùng các đại
lượng sau:
- Độ truyền suốt (transmitance, ký hiệu là T): là tỷ số giữa cường độ tia ló (I T)
và cường độ tia tới (I0)
IT IT
T T% .100%
I0 I0
- Độ hấp thụ (absorbance ; ký hiệu là A) hay còn gọi là mật độ quang (optical
density, ký hiệu là OD):
A = .l.C
Vậy :
IT
A = - lg = - lg T
I0
Hệ thức A = .l.C thường được gọi là biểu thức toán học của định luật Lambert-
Beer.
được gọi là hệ số hấp thụ, nó chỉ phụ thuộc vào bản chất của phân tử chất hấp
thụ, vào bước sóng tia tới, dung môi sử dụng và nhiệt độ.
Nếu [l] = cm, [C] = mol/lít thì [] = lít.mol– 1.cm– 1 được gọi là hệ số hấp thụ
mol (hay hệ số tắt phân tử gam)
Nếu [l] = cm, [C] = g/lit thì [] = lít.g– 1.cm– 1 được gọi là hệ số hấp thụ
riêng.
Đối với một dung dịch chất hấp thụ khảo sát, khi bề dày dung dịch không đổi (cố
định bề dày cuvet) thì quan hệ A - C là tuyến tính: A = k.C. Đây chính là cơ sở của
phép định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis.
II.2. Một số lưu ý khi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis:
1/ Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng đơn sắc sử dụng
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của vào bước sóng λ được gọi là phổ hấp thụ
của chất nghiên cứu (Hình II.2). Phổ hấp thụ của các phân tử chất hữu cơ trong vùng
UV-Vis thường là một dãi rất rộng gây ra bởi rất nhiều chuyển dời của các electron
giữa các mức năng lượng rất gần nhau. Phổ hấp thụ của các chất thường có một hay
vài cực đại. Bước sóng tại đó xảy ra sự hấp thụ cực đại được gọi là bước sóng hấp thụ
cực đại (wavelength of maximum absorbance ; ký hiệu là λmax). Giá trị λmax phụ thuộc
- 10 -
bản chất của phân tử chất hấp thụ, đây là một trong các đặc trưng để nhận biết một hợp
chất.
Để tăng độ nhạy và độ chính xác của phép định lượng lượng bằng phương pháp
đo quang UV – Vis, cần đo ở độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng ứng với sự hấp thụ
cực đại của chất nghiên cứu.
λ (nm)
λma
Hình 2.3. Phổ hấp thụ phân
x tử UV-Vis
* Máy 2 chùm sáng (dual beam / double beam): ánh sáng sau khi qua bộ đơn sắc
được tách thành 2 chùm tia song song y hệt nhau (1 chùm đi qua ngăn chứa dung dịch
nền; 1 chùm đi qua ngăn chứa dung dịch mẫu)
Cách vận hành:
- Mở máy.
- Chọn đèn (nếu máy có 2 đèn)
- Chọn bước sóng đo. Chờ 15 -30 min rồi bắt đầu đo.
- Dùng màn chắn đen (shutter) để ngăn toàn bộ ánh sáng chiếu vào cuvet. Điều
chỉnh %T = 0%.
- Đưa 2 cuvet chứa dung dịch nền vào cả 2 ngăn đựng mẫu. Điều chỉnh
%T = 100% (hay: độ hấp thụ A = 0).
- Cho dung dịch mẫu vào cuvet trong ngăn chứa dung dịch mẫu. Đọc kết quả đo
Hệ thống 2 chùm sáng đắt tiền hơn hệ 1 chùm sáng nhưng cho kết quả chính xác hơn.
Lưu ý:
dA
Độ chính xác của phép đo độ hấp thụ .100% phụ thuộc vào thiết bị đo quang
A
và vào bản chất của phân tử chất hấp thụ. Khi độ hấp thụ của dung dịch quá cao
(A > 1) cường độ bức xạ đi đến detector rất nhỏ, do đó cần khuếch đại tín hiệu lên rất
nhiều lần để đo được nên sai số lớn. Ngược lại, nếu độ hấp thụ quá nhỏ (A < 1) thì ảnh
- 15 -
hưởng của nhiễu nền đến tín hiệu đo sẽ lớn. Vì vậy, để sai số tương đối của phép định
dC
lượng .100% nhỏ thường chỉ nên đo độ hấp thụ trong khoảng A = 0,1 – 1,0.
C
Hình 2.8. Sự phụ thuộc của sai số
dC
.100% vào độ hấp thụ với các loại
C
detector khác nhau:
a) photovoltaic detector;
b) photomultiplier detector
II.4. Các cách định lượng trong phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis
Các phương pháp này đều dựa trên việc áp dụng định luật Lambert-Beer:
A = .l.C
II.4.1. Phương pháp trực tiếp:
Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch nghiên cứu rồi tính nồng độ chất hấp thụ theo
công thức:
Ax
Cx
.l
- Để áp dụng được phương pháp này, nồng độ của dãy chuẩn và của dung dịch
mẫu phải nằm trong vùng tuyến tính này phải nằm trong vùng nồng độ tuyến tính của
định luật Lambert – Beer.
- Phương pháp này chỉ cho kết quả đúng nếu mẫu có thành phần nền đơn giản
(chỉ chứa ít cấu tử hay không có cấu tử ảnh hưởng).
II.4.4. Phương pháp thêm
Đối với trường hợp mẫu có thành phần nền phức tạp (chứa nhiều cẩu tử ảnh
hưởng đến phép đo hay chưa biết có cấu tử nào có trong nền mẫu) thì nên định lượng
bằng phương pháp thêm. Trong phương pháp này mẫu chuẩn thêm được pha chế bằng
- 17 -
cách lấy chính dung dịch phân tích làm nền và thêm vào đó lượng xác định dung dịch
chuẩn của chất phân tích.
Có 2 trường hợp áp dụng phương pháp thêm:
a) Phương pháp thêm một mẫu chuẩn
Giả sử cần xác định nồng độ chất X trong một mẫu phân tích (có nồng độ Cx).
Pha chế dung dịch chuẩn thêm bằng cách thêm một lượng chính xác (CX) của
chất nghiên cứu vào dung dịch phân tích. Vậy, nồng độ chất X trong dung dịch chuẩn
thêm sẽ là: C0 = Cx + CX
Tạo màu rồi đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu trong điều kiện
y hệt nhau.
Gọi A0 và Ax lần lượt là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu, ta có:
Ax = lCx Ax
A0 = lC0 = l (Cx + C) Cx C
A0 Ax
b) Phương pháp đường chuẩn thêm
Pha chế một dãy n dung dịch chuẩn thêm bằng cách lấy một lượng mẫu nhất định
rồi thêm những lượng xác định C1, C2, ..., Cn của chất phân tích (lượng thêm tăng
theo cấp số cộng).
Tạo màu và đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và mẫu trong cùng điều kiện.
Dựng đường chuẩn thêm: A = f (C).
Nồng độ chất nghiên cứu trong mẫu phân tích có thể được xác định bằng các
phương pháp sau:
- Cách 1: Kéo dài đồ thị về bên trái, cắt trục hoành tại đâu, đó là Cx.
- 18 -
- Cách 2: Từ O kẻ 1 đường phụ song song với đồ thị. Từ Ao kẻ 1 đường thẳng
song song trục hoành, cắt đường phụ tại M. Từ M kẻ vuông góc trục hoành đó tại Cx.
- Cách 3: Dùng phần mềm EXCEL xác định được phương trình đường chuẩn
thêm có dạng: A = aC + b. Có thể chứng minh được rằng:
CX = b/a
II.4.5. Định lượng một hỗn hợp cấu tử bằng phương pháp đo quang UV –
Vis
Xét một dung dịch chứa 2 cấu tử (I) và (II), có cực đại hấp thụ tương ứng là 1 1 và
2.
Gọi A1 và A2 lần lượt là độ hấp thụ của dung dịch đã cho đo ở bước sóng 1 và 2
với cuvet có bề dày l = 1 cm. Dựa vào tính chất cộng tính của độ hấp thụ, ta có:
A 1 ( I1) .C ( I ) ( II1 ) .C ( II )
A 2 ( I2) .C ( I ) ( II2 ) .C ( II )
hấp thụ của các dung dịch chuẩn của các cấu tử (I) và (II) lần lượt ở các bước sóng 1
và 2. Giải hệ phương trình 2 ấn trên sẽ tính được nồng độ của các cấu tử (I) và (II)
trong dung dịch.
Dựa trên nguyên tắc này, có thể định lượng các hỗn hợp nhiều cấu tử. Hiện nay,
một số máy đo quang hiện đại đã cài đặt các phần mềm cho phép định lượng đồng thời
hỗn hợp 8 cấu tử.
II.5. Đánh giá phương pháp đo quang UV – Vis:
- Độ đúng và độ chính xác:
Độ đúng của phương pháp đo quang UV-Vis phụ thuộc vào 3 yếu tố: thiết bị, hóa
chất, phương pháp phân tích và người phân tích. Trong điều kiện lý tưởng (xem rằng
sử dụng thiết bị và hóa chất tốt nhất, phương pháp đúng ; người phân tích có thành
thạo) thì kết quả phân tích có thể đạt độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối) khoảng
0,5%.
- Giới hạn phát hiện (LOD : limit of detection):
Giới hạn phát hiện (LOD) của một phương pháp phân tích là nồng độ nhỏ nhất
có thể cho tín hiệu ghi nhận được.
Đối với phương pháp trắc quang, theo định luật Lambert - Beer :
Amin
C min
max .l
- 19 -
Đối với đa số chất hấp thụ, ta có: max 103 l.mol –1 .cm –1 . Nếu dùng thiết bị đo
hoàn thiện nhất (với độ chính xác của thang đo độ hấp thụ là 0,001), ch và cuvet có bề
dày 1 cm, thì:
10 3
LOD C min 10 6 M
10 .1
3
- Độ chọn lọc: không cao do cùng một thuốc thử tạo phức màu có thể tác dụng
với một số ion khác nhau tạo nên màu sắc gần giống nhau. Để tăng độ chọn lọc của
phép phân tích trong một số trường hợp phải tách chiết để loại bỏ cấu tử cản trở.
II.6. Mộ số ứng dụng của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trong
phân tích thực phẩm
Do thiết bị tương đối rẻ tiền, thao tác khá đơn giản, nhanh chóng nên phương
pháp này có ứng dụng rộng rãi trong phân tích nói chung và phân tích thực phẩm nói
riêng.
Nhờ sử dụng các thuốc thử tạo phức màu, phương pháp cho phép định lượng đa
số các ion vô cơ (Fe2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Sn2+, …) và một số hợp chất hữu cơ (dung dịch
protein, peptid, acid amin, acid nuleic,…) ở hàm lượng vi lượng.
II.6.1. Định lượng protein:
1) Phương pháp Biuret :
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa protein và Cu+2 trong môi trường kiềm tạo
phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540 nm.
Phương pháp này được sử dụng đối với dung dịch mẫu phân tích có hàm lượng
protein tương đối lớn (khoảng 20 – 2.000 µg/ml)
Các acid amin, protein và peptid đều chứa nhóm chức amin bậc 1. Tuy nhiên,
phản ứng decarboxyl hóa (phản ứng đầu tiên) chỉ xảy ra khi có mặt -amino acid tự do
nên chỉ có thể dùng phản ứng này để định tính hay định lượng dung dịch acid amin tự
do. Độ hấp thụ của sản phẩm tạo ra phụ thuộc tuyến tính vào số lượng nhóm amin tự
do nên có thể dùng phương pháp trắc quang – so màu (dựng đưởng chuẩn) để định
lượng hàm lượng acid amin tự do.
Dung dịch protein hay peptid có thể được định lượng bằng cách thủy phân trong
môi trường kiềm tạo thành amino acid rồi định lượng như trên (chuẩn bị mẫu trắng là
mẫu chứa dịch protein hay peptid chưa bị thủy phân)
II.6.3. Định lượng một số kim loại nặng
a) Xác định Cu2+ bằng phương pháp trắc quang-so màu với thuốc thử natri
dietyldithiocacbamat (NaDDC; DDC)
Nguyên tắc:
Trong môi trường kiềm yếu (pH = 9 – 9,2), ion Cu2+ tạo với thuốc thừ DDC phức
càng cua (chelate) có màu đỏ nâu khó tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi
hữu cơ như CHCl3, CCl4. Trong CHCl3 phức có màu đỏ nâu ánh vàng (λmax = 430 nm).
Cường độ màu của phức Cu-DDC sau khi chiết tỷ lệ với nồng độ Cu2+ trong một
khoảng khá rộng.
Do đó, để định lượng Cu2+ bằng thuốc thử DDC, người ta dùng phương pháp
chiết – trắc quang như sau:
Cho Cu2+ tạo phức với DDC trong môi trường NH4OH kiềm có mặt amonicitrat
và complexon III để che các ion cản. Chiết phức Cu-DDC sang CHCl 3 rồi đo quang ở
430 nm.
b) Xác định Zn2+ bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizone
(DTZ)
Dithizon (tức Diphenylthiocacbazone) là thuôc thử hữu cơ có khả năng tạo với
nhiều ion kim loại các phức dithizonat khó tan trong nước nhưng tan tốt trong các
dung môi hữu cơ như CHCl3, CCl4. DTZ tan trong CCl3 tạo thành dung dịch có màu
- 22 -
xanh, không cản trở việc đo quang các phức tạo thành. Do đó, người ta thường dùng
phương pháp chiết trắc quang với DTZ để xác định chúng.
Nguyên tắc:
Trong môi trường pH = 4 – 7, Zn 2+ tạo với DTZ một phức có màu đỏ kém tan
trong nước nhưng tan tốt trong CCl4. Ở pH này các ion Cu2+, Cd2+, Pb2+, Co2+, Bi3+,
Hg2+, Ag+ … cũng tạo phức với DTZ. Để tránh ảnh hưởng của các ion này, tiến hành
tạo phức Zn-DTZ ở pH = 5 có dư SCN - và CN-. Loại các chất có khả năng oxy hóa
DTZ (Cl2, Br2, I2, H2O2) bằng cách đun sôi dung dịch. Một số hợp chất vô cơ gây đục
dung dịch CCl4 được loại bằng cách vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4, HNO3, H2O2. Đo độ
hấp thụ của phức Zn-DTZ ở 530 nm.
c) Xác định Pb2+ bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizone
Nguyên tắc:
Tạo phức Pb-Dithizonate (Ký hiệu: Pb-DTZ) trong môi trường pH = 8 – 9 có mặt
-
CN để che các ion kim loại khác. Chiết phức Pb-DTZ sang dung môi CCl 4 rồi đo độ
hấp thụ ở 520 nm.
Lưu ý:
- Trong môi trường ph = 8 – 9, Sn2 và Bi3+ cũng bị chiết cùng với Pb-DTZ nên
trước đó phải chiết các phức Sn-DTZ và Bi-DTZ trong môi trường acid (Pb-DTZ
không bị chiết, còn lại trong pha nước). Tách Sn2+ và Bi3+ trước như sau:
Thêm hidrazin vào dung dịch mẫu nước, đun nóng để khử Sn 4+ về Sn2+ và khử
các chất khác. Để nguội, thêm dung dịch natri tactrat vào và chỉnh pH về 2,5 – 3 bằng
dung dịch axit tactric. Tiến hành chiết nhiều lần, mỗi lần bằng 5 ml dung dịch
Dithizone 0,1% trong CHCl3 cho đến khi pha hữu cơ vẫn giữ nguyên màu xanh của
Dithizone. Cuối cùng, lắc pha nước vài lần với CHCl 3 đến khi pha hữu cơ không còn
màu xanh. Bằng cách này có thể loại bỏ cá Hg2+, Ag+, Cu2+.
- Nếu trong mẫu nước chứa lượng đáng kể các chất hữu cơ, cần phải vô cơ hóa
chúng bằng cách cho vào vài ml HNO3 đặc và HClO4 đặc rồi cô mẫu đến khô, sau đó
tẩm ướt bằng HNO3 và hòa tan bằng nước cất.
- Các chất có khả năng oxy hóa được khử trước bằng hidrazin.
d) Xác định Cd bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizon
Nguyên tắc:
Tạo phức Cd-Dithizonate trong môi trường kiềm mạnh có mặt tartrat rồi chiết
sang dung môi CCl4. Đo độ hấp thụ của dung dịch phức tạo thành (có màu đỏ) ở bước
sóng 515 nm. Loại các ion cản (Ag+, Ni2+, Co2+, Cu2+) bằng cách chiết chúng bằng
Dithizone trong môi trường acid trước khi xác định Cd2+.
- 23 -
Chương 3.
PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ NGUYÊN TỬ
III.1. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
(AAS: Atomic Absorption Spectrophotometry)
III.1.1. Nguyên tắc phương pháp :
Khi chiếu một chùm bức xạ đơn sắc có bước sóng thích hợp qua một đám hơi
nguyên tử thì các nguyên tử sẽ hấp thụ một phần năng lượng của chùm bức xạ này và
chuyển từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. Đó là hiện tượng hấp thụ
nguyên tử.
E*
h = E = E* - E0
E0
Sự hấp thụ nguyên tử chỉ xảy ra nếu như năng lượng của các photon trong chùm
bức xạ sử dụng đúng bằng hiệu các mức năng lượng kích thích và năng lượng cơ bản
của bước chuyển dời trong nguyên tử :
E* - E0 = h = hc/λ
Do đó, mỗi nguyên tố chỉ có thể hấp thụ một số bức xạ có tần số xác định đặc
trưng cho cấu trúc electron của nguyên tố đó. Dựa vào tần số của bức xạ bị hấp thụ, có
thể định tính các nguyên tố có trong mẫu phân tích.
Ngoài ra, do hiện tượng hấp thụ, cường độ của ánh sáng sau khi qua dung dịch sẽ
bị giảm đi. Độ hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các nguyên tử gây ra hiện tượng hấp
thụ, tức là phụ thuộc vào nồng độ nguyên tử và đoạn đường ánh sáng đã đi qua đám
hơi nguyên tử. Thực nghiệm cho thấy giữa độ hấp thụ A và nồng độ nguyên tố hấp thụ
trong mẫu phân tích có mối mối quan hệ sau:
A = - lg (I/ I0) = k.a.Cb (*)
trong đó :
A : độ hấp thụ
I0, I : cường độ tia tới và tia ló
k : hệ số hấp thụ, đặc trưng cho bản chất của nguyên tố hấp thụ
a : hằng số, phụ thuộc vào cấu tạo thiết bị và điều kiện phân tích
C : nồng độ các nguyên tử hấp thụ có trong đám hơi nguyên tử
b : hệ số phụ thuộc vào nồng độ các nguyên tử hấp thụ có trong đám hơi (nếu C
đủ nhỏ thì b = 1 ; nếu C lớn thì 0 < b < 1)
Hệ thức (*) chính là cơ sở của phép định lượng bằng phương pháp AAS.
- 24 -
III.1.2. Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị AAS
Sơ đồ cấu tạo thiết bị AAS được trình bày ở hình 3.1, gồm những bộ phận chính
sau đây:
II.1.3.3. Bộ phận nguyên tử hóa (atomization device): cho phép tạo ra một đám
hơi đồng nhất chứa các nguyên tử tự do ở trạng thái cơ bản (hạn chế tối đa hiện tượng
ion hóa) từ dung dịch cần đo.
Hiện nay có một số kỹ thuật nguyên tử hóa sau:
a) Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (FAAS: Flame Atomic Absorption
Spectrophotometry):
Hệ thống nguyên tử hóa bằng ngọn lửa bao gồm:
* Buồng phun sương (Nebulizer): trong đó dung dịch đo được phân tán thành sol
khí chứa các giọt chất lỏng nhỏ li ti có kích thước khá đồng nhất.
Dung dịch mẫu được hút vào
buồng phun nhờ một dòng khí áp
suất cao gồm bởi khí đốt. Khi ra khỏi
đầu ống hút, chất lỏng bị đập vào
một bầu thủy tinh (glass impact
bead) tạo ra aerosol. Các hạt lớn sẽ bị
loại bỏ và thải ra nhờ một hệ thống
cản đặc biệt.
Hình 3.7. Buồng phun sương, buồng phối trộn và đầu đốt trong đèn đốt trộn trước
Để ngăn cản hiện tượng tái kết hợp thành các phân tử (recombination) và hiện
tượng ion hóa (ionization), sự kích thích nguyên tử bởi nhiệt của ngọn lửa tạo nên sự
phát xạ, cần chọn nhiệt độ ngọn lửa thích hợp cho việc định lượng nguyên tố đã cho
bằng cách thay đổi bản chất khí đốt và chất oxy hóa cũng như điều chỉnh lưu lượng và
tỷ lệ của chúng. Để đạt được nhiệt độ ngọn lửa cỡ 2300 0C, người ta thường dùng hỗn
hợp không khí – acetylen với lưu lượng acetylen là 1,6 m/s. Muốn có nhiệt độ ngọn
lửa cao hơn (khoảng 3000°C) thì dùng hỗn hợp C2H2 + O2 hay C2H2 + N2O (Bảng 3.1)
Hình 3.8. Các giai đoạn nguyên tử hóa bằng ngọn lửa
Hệ thống nguyên tử hóa ngọn lửa có ưu điểm là độ lặp lại tốt, dễ tối ưu hóa điều
kiện nguyên tử hóa mẫu. Nhược điểm là độ nhạy thấp do hiệu suất nguyên tử hóa kém.
Nguyên nhân là do đa số các hạt aeerosol tạo ra khá lớn để có thể đốt cháy bằng khí
đốt (95% mẫu không thể đi đến ngọn lửa) và sự pha loãng mẫu đáng kể bởi khí đốt.
Ngoài kỹ thuật nguyên tử hoá bằng ngọn lửa như trên, có thể dùng các kỹ thụật
nguyên tử hóa không ngọn lửa.
- 29 -
b) Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa: ra đời sau kỹ thuật nguyên tử hóa
bằng ngọn lửa, nhưng phát triển rất nhanh và hiện nay đang được ứng dụng rất phổ
biến. Ưu điểm của kỹ thuật này là cho phép định lượng một cách chọn lọc, có độ nhạy
rất cao (cỡ ppb), định lượng được các nguyên tố cấu tạo nên các hợp chất rất bền nhiệt.
mà kỹ thuật FAAS không cho phép (Bảng 3.2). Vì vậy, kỹ thuật này thường dùng để
phân tích các vết kim loại, đặc biệt là khi xác định các loại mẫu y học, sinh học, dược
phẩm, thực phẩm…
*Nguyên tắc và các giai đoạn của quá trình nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa
Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa nhiệt điện (ETA:
electrothermal atomization), trong đó quá trình nung nóng, hóa hơi và nguyên
tử hóa mẫu phân tích xảy ra rất nhanh (60 – 80 giây) trong một ống graphit nhỏ (GF:
Graphite furnace) hay trong một thuyền tantan (Ta) nhỏ. Nguồn năng lượng thường
dùng là dòng điện có cường độ dòng rất cao (50 – 600 A) và thế thấp (< 12V) hay
năng lượng của dòng cao tần cảm ứng (ICP). Dưới tác dụng của các nguồn năng lượng
này, cuvét chứa mẫu sẽ được nung nóng đỏ tức khắc, hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu để
tạo ra các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc tạo ra
phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
Như vậy, hệ thống nguyên tử hóa mẫu theo kỹ thuật không ngọn lửa gồm có:
- Buồng nguyên tử hóa: là cuvét chứa mẫu phân tích.
- Nguồn năng lượng để nung nóng đỏ lò graphit đến nhiệt độ nguyên tử hóa
mẫu.
- Bộ điều khiển để cài đặt chương trình và kiểm soát quá trình nguyên tử hóa
mẫu.
Quá trình nguyên tử hóa mẫu: xảy ra theo 3 giai đoạn kế tiếp nhau: sấy khô
mẫu, tro hóa luyện mẫu, nguyên tử hóa mẫu.
* Sấy khô mẫu: phải đảm bảo dung môi hòa tan mẫu bay hơi nhẹ nhàng và hoàn
toàn, không làm bắn mẫu, mất mẫu. Nhiệt độ và thời gian sấy khô của mỗi mẫu phụ
thuộc vào bản chất của các chất ở trong mẫu và dung môi hòa tan nó. Thực nghiệm
- 30 -
cho thấy rằng không nên sấy khô quá nhanh ở nhiệt độ quá cao. Nói chung, nhiệt độ
sấy khô phù hợp với đa số các mẫu vô cơ trong dung môi nước vào khoảng từ 100 -
150oC trong thời gian từ 25 - 40 giây với lượng mẫu bơm vào cuvét nhỏ hơn 100 μl.
Các mẫu hữu cơ trong dung môi hữu cơ phải sấy ở nhiệt độ thấp hơn và tốc độ tăng
nhiệt độ cũng phải chậm hơn.
* Tro hóa luyện mẫu: là giai đoạn tiếp theo để đốt cháy các hợp chất hữu cơ và
mùn có trong mẫu sau khi đã sấy khô, đồng thời cũng để nung luyện mẫu ở một nhiệt
độ thuận lợi cho giai đoạn nguyên tử hóa tiếp theo đạt hiệu suất cao và ổn định. Giai
đoạn này ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả phân tích nếu chọn điều kiện tro hóa không
phù hợp.
Thực nghiệm cho thấy mỗi nguyên tố đều có một nhiệt độ tro hóa luyện mẫu tối
ưu, đó là nhiệt độ mà sự tro hóa luyện mẫu tại nhiệt độ đó hoặc nhỏ hơn nó thì cường
độ vạch phổ hấp thụ là không đổi, còn nếu tro hóa ở nhiệt độ lớn hơn thì cường độ
vạch phổ bị giảm và không ổn định (điều này có thể lý giải là do mẫu bị phân hủy
mất). Nhiệt độ tro hóa tối ưu của mỗi nguyên tố phụ thuộc vào bản chất, dạng hợp chất
mà nguyên tố đó tồn tại, kể cả matrix mẫu (nền mẫu). Nói chung, các nguyên tố bền
nhiệt và tồn tại ở dạng hợp chất bền nhiệt thường phải tro hóa luyện mẫu ở nhiệt độ
tương đối cao. Ví dụ: Si có nhiệt độ tro hóa tối ưu là 1100oC; Ni: 1000oC, Pb: 600oC…
Ngoài ra, tốc độ tăng nhiệt trong quá trình tro hóa luyện mẫu cũng rất quan
trọng vì nếu tốc độ tăng nhiệt quá lớn sẽ làm bắn mẫu. Thông thường, người ta dành
1/3 tổng thời gian tro hóa luyện mẫu được dùng để gia nhiệt từ nhiệt độ sấy mẫu đến
nhiệt độ tro hóa (tốc độ khoảng 60oC ÷ 100oC/giây); còn 2/3 thời gian còn lại là giữ
nhiệt độ không đổi đã chọn để luyện mẫu. Đối với những mẫu của hợp chất hữu cơ
hay trong dung môi hữu cơ thì giai đoạn này càng phải cẩn thận để tránh sự bay hơi
trước của nguyên tố phân tích ở dạng hợp chất cơ kim. Nói chung, với mỗi loại mẫu,
trong mỗi loại dung môi đều phải khảo sát để phát hiện nhiệt độ tro hóa, tốc độ tăng
nhiệt độ cho phù hợp.
* Nguyên tử hóa mẫu: là giai đoạn quyết định cường độ vạch phổ và bị ảnh
hưởng bởi hai giai đoạn trên. Giai đoạn này được thực hiện trong thời gian rất ngắn
(thường từ 3- 6 giây, đôi khi 8 - 10 giây) nhưng tốc độ gia nhiệt độ rất lớn (1800 oC ÷
2500oC/giây hay tốc độ tối đa mà máy có thể cho phép) để đạt ngay tức khắc nhiệt độ
nguyên tử hóa.
Trong các tài liệu kèm theo thiết bị AAS thường giới thiệu để người sử dụng
tham khảo về nhiệt độ sấy mẫu, nhiệt độ tro hóa luyện mẫu và nhiệt độ nguyên tử hóa
mẫu. Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu cụ thể nên dựa vào các giá trị đó để khảo sát
hoặc kiểm tra lại.
- 31 -
Kỹ thuật hóa hơi lạnh (CV-AAS: Cold Vapour AAS)
Một số nguyên tố có thể được nguyên tử hóa bằng cách sử dụng phản ứng hóa
học để tạo thành hợp chất dễ bay hơi ở nhiệt độ thường.
Ví dụ: As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Te, Pb tạo thành hydrur dễ bay hơi khi phản ứng
với NaBH4 trong môi trường acid. Sau đó, hơi hydrur được một dòng khí trơ dẫn đến
ngọn lửa hay một cuvet thạch anh được đốt nóng đặt trên đường đi của chùm sáng của
hệ thống đo mẫu (kỹ thuật Hydride Gas AAS = HG-AAS)
Thủy ngân có thể được xác định bằng phương pháp hóa hơi lạnh (Cold Vapour
AAS = CV-AAS), trong đó nó được khử về Hg kim loại (dạng hơi) SnCl 2 sau đó hơi
Hg đượcmột dòng khí trơ dẫn đến một cuvet đựng mẫu không đốt nóng đặt trên đường
đi của chùm sáng của hệ thống đo mẫu.
Việc chọn bước sóng phân tích được chọn lựa tùy thuộc vào nồng độ nguyên tố
phân tích trong mẫu và sao cho đạt độ nhạy cao nhất, vạch phổ ít bị cản trở bởi các yếu
tố vật lý (phát xạ nền của nguồn sáng) và hóa học (sự có mặt của các nguyên tố khác).
c) Chọn phương pháp xử lý mẫu phân tích: Kỹ thuật FAAS và ETA-AAS điều đòi
hỏi mẫu ở dạng lỏng hay dung dịch. Do đó, mẫu rắn cần được hòa tan trong
dung môi thích hợp hay vô cơ hóa bằng HNO3, H2SO4, hay HClO4 (dùng bếp
điện, lò vi sóng). Mẫu lỏng có thể phân tích trực tiếp hoặc được pha loãng bằng
dung môi hoặc được chiết - làm giàu chất cần phân tích nếu nền mẫu chứa các
thành phần cản trở việc phân tích.
Ví dụ: Chiết và làm giàu Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, Pb2+, Ni2+, Zn2+ bằng dung dịch
ammonium pyrrolidine dithiocarbamate trong methyl isobutyl ketone (MIBK)
- 34 -
d) Tối thiểu hóa các yếu tố ảnh hưởng quang phổ và hóa học
* Tối thiểu hóa ảnh hưởng quang phổ:
- Nếu vạch hấp thụ của nguyên tố cản chồng lấp vạch hấp thụ của nguyên tố cần
phân tích chồng thì chọn bước sóng phân tích sao cho không bị ảnh hưởng.
- Sự hấp thụ do các phân tử có trong ngọn lửa (do sự nguyên tử hóa chưa hoàn
toàn) hay sự tán xạ bởi các hạt kích thước lớn (tập hợp nguyên tử) có thể xảy ra. Đặc
biệt, sự hấp thụ và tán xạ bởi các phân tử hydoxid hay oxid của các chất có trong nền
mẫu xảy ra mạnh ở < 300 nm. Trong những trường hợp này, độ truyền suốt kém và
làm tăng biểu kiến sự hấp thụ của mẫu. Nếu thành phần nền của mẫu đã biết thì có thể
loại trừ ảnh hưởng này bằng cách phân tích mẫu trắng, chuẩn bị các mẫu chuẩn có
thành phần nền giống mẫu phân tích. Nếu thành phần nền không biết rõ thì có thể hiệu
chỉnh sự hấp thụ nền (sự hấp thụ gây ra do nền mẫu) bằng cách tăng nhiệt độ ngọn lửa
để phân ly các oxyt, hydroxid (ví dụ: tăng lưu lượng nhiên liệu – chất oxy hóa, điều
chỉnh tỷ số nhiên liệu: chất oxy hóa, thay đổi tổ hợp nhiên liệu - chất oxy hóa…). Biện
pháp khác là hiệu chỉnh nền bằng đèn phát xạ liên tục D2.
* Tối thiểu hóa ảnh hưởng hóa học:
Việc định lượng một số nguyên tố rất phức tạp do ảnh hượng của các yếu tố hóa
học trong quá trình nguyên tử hóa.
- Ảnh hưởng của dung môi:
Nếu dùng dung môi là nước thì quá trình nguyên tử hóa xảy ra chậm do tốn nhiều
năng lượng để hóa hơi nước, do đó phép đo kém nhạy. Để nâng cao độ nhạy của phép
đo, thường dùng dung môi MIBK (methyl isobutyl keton). Khi đó, quá trình chuyển
hóa xảy ra nhanh hơn do dung môi này dễ hóa hơi và phản ứng đốt cháy chất hữu cơ
sinh ra một lượng nhiệt đáng kể, làm tăng độ nhạy phép đo lên từ 2 - 6 lần so với dùng
dung môi nước.
- Ảnh hưởng của sự ion hóa:
Ở nhiệt độ cao, những nguyên tố có năng lượng ion hóa thấp (ví dụ: các kim loại
kiềm hay kiềm thổ) chủ yếu tồn tại ở trạng thái ion. Vì vậy, khi định lượng những
nguyên tố này, cần thêm vào mẫu đo một lượng dư muối của các nguyên tố dễ bị ion
hóa hơn (thường dùng muối K+, Cs+).
- Ảnh hưởng của dạng anion liên kết:
Một số anion (như PO4 3-, SO42-,…) có thể tạo với ion kim loại cần phân tích các
hợp chất bền nhiệt nên khó bị ngyên tử hóa. Trong trường hợp này, cần thêm vào dung
dịch phân tích một lượng dư chất tạo phức bền dễ bay hơi với ion kim loại cần phân
tích (gọi là tác nhân bảo vệ: protecting agent) hay thêm các muối của các nguyên tố
khác có thể kết hợp với các anion trên những hợp chất bền nhiệt (gọi là tác nhân phóng
thích: releasing agent).
- 35 -
Những muối được thêm vào với một lượng dư nhằm ổn định sự nguyên tử hóa
các nguyên tố như trên được gọi chung là chất đệm hóa - quang phổ (spectrochemical
buffer).
Ví dụ:
- Khi định lượng Pb có thể thêm EDTA vào dung dịch đo để tạo phức bền PbY 2 –
nhằm tránh tạo thành các muối bền nhiệt Pb(NO3)2, Pb3(PO4)2, PbCO3,...
- Khi định lượng Calci thêm một lượng thừa LaCl 3 vào dung dịch Ca2+ để tạo
thành LaPO4 nhằm tránh tạo hợp chất bền nhiệt Ca3(PO4)2.
e) Chọn phương pháp định lượng
Có thể dùng 1 trong 3 cách sau:
Phương pháp đường chuẩn:
Trong thực tế, khi định lượng bằng phương pháp AAS, đường chuẩn A = f (C)
chỉ tuyến tính trong một khoảng nồng độ khá giới hạn. Trong một số trường hợp, cần
phải xây dựng đường chuẩn không tuyến tính có dạng bậc 2 hay bậc 3 (có ít nhất 8
điểm chuẩn).
Khi sử dụng phương pháp đường chuẩn này cần lưu ý pha chế mẫu chuẩn có
tính chất nguyên tử hóa giống như mẫu phân tích. Nếu không, cần điều chỉnh thành
phần nền mẫu chuẩn cho tương ứng bằng các chất đệm quang phổ.
Phương pháp kẹp chuẩn: áp dụng khi nồng độ chất phân tích trong mẫu đo
nằm ngoài vùng tuyến tính của đường chuẩn
A Trong phương pháp này, chỉ dùng 2 mẫu chuẩn
có nồng độ nguyên tố cần phân tích là C 1 và C2 rất
gần với nồng độ có trong mẫu phân tích (C x). Khi
đó, có thể xem là xảy ra sự tuyến tính A – C trong
khoảng nồng độ (C1; C2) có thể tính nồng độ chất
phân tích trong mẫu theo công thức:
C A A
C x C1 x 1
.(C 2 C1 )
C1 Cx C2 A2 A1
- 36 -
Khe đo 1 nm
Chiều cao đầu đốt Chế độ auto (5 - 6 mm)
Khí ngọn lửa Không khí nén & Acetylen & Ar
Tôc độ dẫn mẫu 5 – 6 mL/phút
Chương trình nhiệt độ cho lò Graphite T (oC) Time Heat mode Flow rate
1 150 20 Ramp 0,1
2 250 10 Ramp 0,1
3 600 10 Ramp 1,0
4 600 10 Step 1,0
5 600 3 Step 0,0
6 2200 2 Step 0,0
7 2400 2 Step 1,0
Nếu thu và phân ly chùm bức xạ này thành các bức xạ đơn sắc, sẽ thu được phổ
phát xạ nguyên tử của nguyên tố bị kích thích.
Dựa vào hiện tượng này, người ta đã xây dựng phương pháp quang phổ phát xạ
nguyên tử, cho phép định tính và định lượng hơn 60 nguyên tố khác nhau.
- Định tính: Phổ phát xạ của một nguyên tố gồm các vạch phát xạ đặc trưng
nguyên tố đó. Nhờ đó, có thể nhận biết sự có mặt của các nguyên tố có trong mẫu phân
tích.
Thông thường, để nhận biết sự có mặt của một nguyên tố nào đó trong mẫu
thường dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của các vạch phân tích hay vạch cuối cùng
của nguyên tố nghiên cứu, đó là các vạch rất nhạy và đặc trưng cho nguyên tố đã cho
(chúng là một hay vài vạch còn lại trong quang phổ của nguyên tố đó khi hàm lượng
của nguyên tố khảo sát trong mẫu phân tích giảm xuống đến một giới hạn nào đó).
- Định lượng: Cường độ của vạch phát xạ tỷ lệ với số nguyên tử ở trạng thái kích
thích và do đó phụ thuộc vào nồng độ nguyên tố phát xạ. Lomakin đã tìm được mối
quan hệ này như sau: Iλ = kCb
trong đó:
k là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào điều kiện hóa hơi
mẫu và kích thích nguyên tử. Nếu cố định các điều kiện này thì k
= const
b: hằng số phụ thuộc vào bản chất
nguyên tố, bước sóng của vạch phát xạ
và nồng độ của nguyên tố trong mẫu.
Đối với mỗi nguyên tố trong điều kiện
đo xác định thì tồn tài một giá trị nồng
độ tới hạn C0 trong đó khi Cx < C0 thì
đường biểu diễn Iλ – C là tuyến tính (tức
b = 1x) và khi Cx > C0 thì đường biễu
Hình 3.13. Quan hệ giữa cường độ vạch diễn không tuyến tính (b < 1). Nồng độ
phát xạ và nồng độ nguyên tố trong mẫu C0 gọi là nồng độ giới hạn của cùng
tuyến tính.
Dựa vào quan hệ Iλ – C, có thể xác định được nồng độ nguyên tố phát xạ trong
mẫu bằng cách đo cường độ vạch phát xạ đặc trưng của nguyên tố đó.
Để định lượng, người ta thường dùng phương pháp kẹp chuẩn, phương pháp
đường chuẩn hay phương pháp thêm tương tự như trong phương pháp AAS.
Hình 3.15. Cấu tạo và nhiệt độ các vùng của ngọn lửa đèn khí
b) Thiết bị quang phổ phát xạ nguyên tử dủng hồ quang điện và tia lửa điện: sử
dụng các nguồn kích thích sau:
- Hồ quang điện (arc): dùng sự phóng điện liên tục giữa 2 điện cực (kim loại hay
graphite) để làm bay hơi và kích thích nguyên tử.
Nếu mẫu là thanh kim loại thì nó được dùng làm 1 điện cực phóng điện
Nếu mẫu không dẫn điện thì nó được nghiền với bột than chì và nhồi vào phần
rỗng bên trong điện cực graphite.
- 43 -
Chương 4.
PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ
Phương pháp này sau đó bị lãng quên trong một thời gian dài. Mãi đến năm
1931 và về sau, nhờ những công trình của Vinterstin, Lederer, Izmailov, Shraiber,
Synge, Martin,... nghiên cứu cơ sở lý thuyết của quá trình tách sắc ký và phát triển các
thiết bị ghép đầu ra của cột sắc kí với những detector cho phép định tính và định
lượng các cấu tử tách ra thì phương pháp này mới được chú ý. Từ đó đến nay, phương
pháp sắc ký đã phát triển mạnh mẽ và trở thành phương pháp rất hiệu nghiệm để định
tính và định lượng các cấu tử trong mẫu thuộc nhiều đối tượng phân tích khác nhau
(vô cơ, hữu cơ, sinh học, thực phẩm, môi trường,...)
IV.2. MỘT SỐ KHÁI NIỆM LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ
- Pha tĩnh (stationary phase): là pha rắn, xốp, đứng yên, gồm các hạt mịn,
được nhồi vào một cột (bằng thủy tinh kim loại) hay là một pha lỏng được phủ hay gắn
lên bề mặt một chất mang rắn nào đó.
- Pha động (mobile phase): là pha lỏng hay khí được di chuyển liên tục qua
pha tĩnh dưới tác dụng của một trường lực nào đó như trọng lực (ví dụ: trong phép sắc
ký cột cổ điển), lực mao dẫn (như trong sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng), hoặc nhờ áp
suất (sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí,...)
- Rửa giải (elution): là quá trình tách các cấu tử phân tích được lưu giữ trên
pha tĩnh bằng cách cho một pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh.
Hình 4.2. Sự tách hỗn hợp cấu tử trong quá trình sắc ký và sắc ký đồ
IV.3.3. Các đại lượng cơ bản trong sắc ký - Tối ưu hóa quá trình sắc ký
IV.3.3.1. Các đại lượng cơ bản trong sắc ký :
a) Khả năng lưu giữ của một cấu tử trên một hệ sắc ký được đặc trưng bằng các
đại lượng sau
* Thời gian lưu (tR: retention time): là thời gian cần thiết để một cấu tử nào đó đi
từ đầu cột đến cuối cột và được phát hiện bởi detector. Tùy thuộc bản chất của pha tĩnh
và pha động có trong hệ sắc ký mà mỗi cấu tử sẽ bị lưu giữ khác nhau và do đó có thời
gian lưu tR khác nhau.
Trên sắc ký đồ (Hình 4.3), thời gian lưu của
một cấu tử (tR) là khoảng thời gian từ lúc bắt đầu
bơm mẫu (t0 = 0) đến lúc cấu tử đó ra khỏi cột
sắc ký và được phát hiện bằng detector (ứng với
lúc xuất hiện đỉnh của peak sắc ký tương ứng)
Nếu hỗn hợp sắc ký chứa một cấu tử hoàn
toàn không bị lưu giữ trên cột thì nó sẽ đi ra khỏi
cột ngay cùng với pha động và cho một peak đầu
Hình 4. 3. tiên. Thời gian lưu của cấu tử này rất nhỏ, được
Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử gọi là thời gian chết (ký hiệu là tm).
với một cấu tử không bị lưu giữ
Thời gian chết chính là thời gian cần thiết để pha động đi từ đầu cột đến detector
nên:
- 49 -
L
tm
u
trong đó :
L - chiều dài pha tĩnh
u : tốc độ tuyến tính trung bình của pha động
Để đánh giá thời gian lưu thực sự của một cấu tử trong pha tĩnh phải dùng thời
gian lưu hiệu chỉnh tR’:
tR’ = tR – tm
* Thừa số dung lượng của một cấu tử i trên pha tĩnh được định nghĩa bởi công
thức:
' mS C .V V
ki S S KD S
mM C M .VM VM
với:
mS, mM và CS, CM: khối lượng và nồng độ cấu tử i trong pha tĩnh và pha động
VS, VM - thể tích của pha tĩnh và pha động
KD = CS/CM : hằng số phân bố của i giữa pha tĩnh và pha động
' t Ri t m t R'
Có thể chứng minh được rằng: ki
tm tm
Vậy, có thể tính được k' của một cấu tử dựa vào sắc ký đồ.
Giá trị k' tối ưu cho quá trình tách sắc ký: k’= 1- 5
Với hỗn hợp phân tích phức tạp có thể chấp nhận: k’ = 1 - 10
b) Hiệu năng của cột sắc ký: Hiệu năng của một cột sắc ký là khả năng tách các
cấu tử trong hỗn hợp ra khỏi nhau, nó được đặc trưng bởi các đại lượng sau:
* Số đĩa lý thuyết:
Theo lý thuyết đĩa (Martin và Synge, 1942), mỗi cấu tử A trong hỗn hợp sắc ký sẽ
di chuyển liên tục trên pha tĩnh theo những bước rất nhỏ, trong mỗi bước như vậy thiết
lập rất nhanh một cân bằng phân bố của A giữa pha tĩnh và pha động:
AS AM
Mỗi phần pha động đưa thêm vào sẽ làm chuyển dịch cân bằng trên và tách một
phần cấu tử A trong pha tĩnh chuyển sang bước tiếp theo, tại đó lại thiết lập một cân
bằng phân bố mới. Mỗi bước chuyển dời ứng với một cân bằng phân bố được thiết lập
giữa pha tĩnh và pha động được gọi là một đĩa lý thuyết. Quá trình cứ tiếp diễn liên
tục, kết quả cấu tử A sẽ được phân bố trên một số đĩa theo phân bố Gauss, trong đó
nồng độ A đạt sẽ cực đại ứng với các đĩa ở bố giữa.
- 50 -
Như vậy, một cột sắc ký có chiều dài L được tưởng tượng chia thành N đĩa lý
thuyết có cùng độ cao H được đánh số từ 1 đến N (H được gọi là chiều cao của một đĩa
lý thuyết ).
L
Vậy: H
N
Hiệu năng tách của cột sắc ký càng cao nếu N càng lớn (hay H càng nhỏ).
Điều này cũng được thể hiện trên sắc ký đồ: Hiệu năng tách của hệ thống sắc ký
càng tốt thì các peak sắc ký thu được càng nhọn, hẹp, không bị giãn rộng.
Có thể tính được số đĩa lý thuyết dựa vào sắc ký đồ thu được theo công thức:
2 2
t t
N 16 r 5,54 r
W
W: độ rộng chân peak
: độ rộng ứng với một nửa chiều cao của peak
Độ phân giải của cột (resolution - ký hiệu Rs)
2(t r 2 t r1 )
Rs
W2 W1
Rs N (*)
4 1 k '
Trong sắc ký khí, k' thường rất lớn (từ 30 - 50), nên:
1 1
Rs N
4
IV.3.3.2. Tối ưu hóa quá trình sắc ký: nghĩa là chọn điều kiện sắc ký như nhiệt
độ, pha tĩnh (bản chất pha tĩnh, kích thước hạt, độ xốp, chiều dài cột), pha động (bản
chất pha động, tôc độ, lưu lượng pha động, chế độ rửa giải,...) sao cho đạt được độ
phân giải tốt nhất cón thể được với thời gian chấp nhận được.
Thông thường, thay đổi các thông số trên như sau:
- Thay đổi k' và α: bằng cách thay đổi nhiệt độ (đặc biệt hay dùng trong sắc ký
khí) hay thay đổi thành phần pha động (hay dùng trong sắc ký lỏng)
- Thay đổi N bằng cách thay đổi một hay vài thông số như: chiều dài cột sắc
ký (L), tốc độ pha động (u), chiều cao đĩa lý thuyết H (thay đổi kích thước hạt pha
tĩnh, độ nhớt pha động, thay đổi bề dày lớp film mỏng tráng trên pha tĩnh.
- 52 -
IV. 4. Phân loại các phương pháp sắc ký
Các cách phân loại được sử dụng nhiều nhất là:
a) Phân loại theo trạng thái tập hợp của pha động
Đây là cách phân loại được sử dụng rộng rãi nhất
- Sắc ký khí (viết tắt GC: Gas Chromatograhy): pha động ở trạng thái khí
- Sắc ký lỏng (viết tắt LC: Liquid Chromatograhy): pha động ở trạng thái lỏng
- Sắc ký siêu tới hạn (viết tắt SFC: Supercritical Fluid Chromatograhy): pha
động là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn (ví dụ: CO2 ở 500C, áp suất 150 bars)
b) Phân loại theo phương tiện tách:
- Sắc ký cột (Column Chromatograhy): pha tĩnh được nạp vào cột (thủy tinh, kim
loại) hay được tráng ở thành bên trong của cột mao quản.
- Sắc ký phẳng (Plannary Chromatograhy): pha tĩnh được tráng lên bề mặt của
một bản phẳng (ví dụ: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng)
c) Phân loại theo cơ chế tách: dựa trên bản chất tương tác giữa chất sắc ký với
pha tĩnh và pha động.
- Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography): dựa trên khả năng hấp phụ khác
nhau của pha tĩnh (rắn) đối với các cấu tử trong hỗn hợp sắc ký.
- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography): sử dụng khả năng phân bố (hay độ
tan) khác nhau của các cấu tử đối với pha tĩnh (lỏng) và pha động (lỏng).
- Sắc ký trao đổi ion (Ionic Chromatography): dựa trên khả năng trao đổi ion
khác nhau của các ion trong hỗn hợp sắc ký với các ion linh động trên bề mặt pha tĩnh
- Pha tĩnh ở đây là các chất hấp phụ trao đổi ion (thường là các nhựa trao đổi ion tổng
hợp)
- Sắc ký loại trừ (Size-Exclusion Chromatography): là phương pháp tách dựa trên
sự khác nhau về kích thước phân tử của các cấu tử phân tích.
IV.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐƠN GIẢN (Đọc thêm)
IV.5.1. Sắc ký cột (CC: Column Chromatography)
Đây là phương pháp sắc ký cổ điển nhất, đã được Tswett áp dụng lần đầu tiên vào
năm 1903.
IV.5.1.1. Phương tiện tách: là các cột hình trụ bằng thủy tinh, kim loại hay hợp
kim, chất dẻo... đầu dưới có khóa (tương tự một burette), Đường kính khoảng 1- 2 cm
trở lên. Tỷ lệ giữa chiều dài L và đường kính d của cột phải theo tỷ lệ thích hợp để đạt
hiệu quả tách tốí ưu.
Pha tĩnh được cấu tạo từ các hạt mịn được nhồi vào cột sắc ký.
- 53 -
IV.5.1.2. Kỹ thuật triển khai sắc ký cột: thường dùng phương pháp rửa giải
(elution)
- Chuẩn bị cột: Lót một lớp
bông thủy tinh dày 2 - 3 mm vào đầu
dưới của cột rồi nhồi pha tĩnh vào cột
(nhồi khô hay nhồi ướt; chú ý không làm
nứt cột). Đầu trên của cột pha tĩnh cũng
lót một lớp bông thủy tinh để tránh làm
xáo trộn pha tĩnh khi rửa giải. Cho dung
môi trơ thích hợp đi qua cột để thấm ướt
pha tĩnh.
- Nạp mẫu: Mẫu cô đặc được
cho lên đầu cột pha tĩnh.
- Rửa giải: Cho pha động liên tục đi
qua cột, hỗn hợp sắc ký sẽ được tách
thành các vùng khác nhau trên cột và lần
lượt ra khỏi cột. Để tăng hiệu quả tách và
rút ngắn thời gian sắc ký, có thể tăng dần Hình 4.5. Chuẩn bị cột sắc ký với
lực rửa giải của pha động sử dụng (thay pha tĩnh là silicagel
đổi độ phân cực của pha động).
Để định tính và định lượng các cấu tử trong hỗn hợp sắc ký, ở đầu ra của cột,
ngưới ta hứng các phân đoạn ứng với từng cấu tử tách được rồi đem xác định bằng các
phương pháp phân tích thích hợp.
IV.5.1.3. Ứng dụng và hạn chế của phương pháp sắc ký cột:
Ứng dụng: dùng để tách và điều chế các cấu tử từ một hỗn hợp
Hạn chế:
Hình 4.7.
Sắc ký bản mỏng đi lên
Sắc ký hai chiều: Mẫu sắc ký được chấm ở 1 góc của một bản mỏng hình vuông
và lần lượt triển khai theo hai chiều vuông góc với nhau hai hệ dung môi khác nhau
sao cho các vết cấu tử tách ra phải nằm ở phần bên trong của bản
Kỹ thuật này cho phép tách tốt hơn hỗn hợp phân tích nhằm tránh nhầm lẫn trong
nhận biết các vết chất.
Rf phụ thuộc vào bản chất của từng chất, bản chất của pha tĩnh và pha động. Do
đó, về nguyên tắc, có thể nhận biết các chất trong hỗn hợp sắc ký dựa vào việc so sánh
giá trị Rf xác định bằng thực nghiệm và giá trị đã được công bố.
Tuy nhiên, Rf còn thay đổi theo điều kiện sắc ký (nhiệt độ, độ ẩm,...) nên tốt hơn
là dùng phương pháp đồng sắc ký mẫu và chất chuẩn trên cùng một bản mỏng.
- 62 -
Định lượng:
Tiến hành đồng sắc ký mẫu và chuẩn (có nồng độ các chất cần định lượng đã biết
chính xác). Sau khi phát hiện các vết chất, có thể định lượng bằng các cách sau:
- Đo diện tích các vết bằng máy đo diện tích (densitometer): diện tích vết chất
CM S
tỷ lệ với hàm lượng của nó trong mẫu : M
CC SC
Do đó, có thể định lượng bằng phương pháp so sánh hay phương pháp đường
chuẩn
- Cạo các vết chất mẫu và chuẩn tương ứng và hòa tan bằng dung môi thích
hợp và định lượng chúng bằng các phương pháp phân tích công cụ nào đó (ví dụ: trắc
quang)
Ứng dụng
Phương pháp này thường dùng để nhận biết các cấu tử trong một hỗn hợp hay
kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất tách được.
Ưu điểm của phương pháp này là:
- nhanh, đơn giản
- phân giải khá tốt, có khả năng tách và nhận biết đồng thời nhiều cấu tử
- có độ lặp lại và độ chọn lọc cao
- Ngày nay, nhờ ghép nối với các thiết bị cho phép nhận biết và định lượng
các cấu tử tách được (ví dụ: TLC-HPLC), phương pháp này đã trở nên rất hiệu nghiệm
trong việc phân tích các mẫu sinh học.
a) Thiết bị HPLC
2
gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao chính xác hơn vì hiệu quả tách và phân tích cao của hệ thống HPLC không
phải quyết định bởi áp suất cao mà do nhiều yếu tố : cấu tạo pha tĩnh nhồi cột, hệ thống detector, hệ thống bơm
mẫu, hệ thống bơm cao áp,…
- 63 -
Thiết bị HPLC gồm những bộ phận quan trọng sau: hệ thống bơm cao áp, cột sắc
ký, detector, hệ thống thu nhận và xử lý tín hiệu.
- Hệ thống bơm cao áp: có thể là một bơm hay nhiều bơm dùng để bơm pha động
từ bình chứa vào cột .
Các loại bơm cao áp hiện nay được chế tạo với kỹ thuật hiện đại nhằm đảm bảo
tốc độ dòng của pha động ổn định liên tục.
Có 2 chế độ bơm là đẳng áp (constant pressure) và đẳng dòng (constant flow)3.
Tùy thuộc vào chế độ rửa giải, có thể dùng một hay nhiều bơm .
+ Rửa giải isocratic: pha động có thành phần không đổi (được chuẩn bị sẵn trong
các chai đựng dung môi) chỉ cần dùng một bơm
+ Rửa giải gradient: thành phần pha động thay đổi trong quá trình rửa giải.
Có 2 trường hợp :
- Gradient áp suất thấp (low pressure gradient): các dung môi từ các bình chứa
được hút và trộn với nhau ở áp suất thấp trong bộ trộn dung môi (mixer) theo tỷ lệ xác
định (tỷ lệ này thay đổi trong quá trình sắc ký theo một chương trình lập sẵn, gọi là
chương trình gradient dung môi), sau đó mới được bơm qua cột bằng một bơm cao áp
- Gradient áp suất cao (high pressure gradient): mỗi dung môi trong thành phần
pha động được hút vào các bơm cao áp riêng rẽ, sau đó mới được trộn với nhau ở áp
suất cao trong bộ trộn dung môi theo tỷ lệ xác định (theo chương trình gradient dung
môi) rồi đi qua cột sắc ký cần nhiều bơm
Lưu ý: Để tránh làm hỏng cột sắc ký và xảy ra hiện tượng nhiễu nền,.trước khi
bơm dung môi pha động vào cột sắc ký, cần khử các bọt khi hòa tan trong pha động
(degass) bằng cách siêu âm, hút chân không, hay sục khí He (helium purge) qua dung
môi. Để tránh sử xâm nhập của không khí, nên giữ dung môi dưới khí quyển He.
3
Thường sử dụng chế độ constant flow hơn
- 64 -
- Bộ phận bơm mẫu (injector): có khả năng bơm lượng mẫu cỡ 0,1 – 100 ml với
độ lặp lại tốt (sai số không quá 0,2%) và phải làm việc dưới áp suất cao đến 7000 psi.
Muốn vậy, thường dùng valve bơm mẫu (injector valve) hay bộ phận bơm mẫu tự
động (autosampler)
Loại valve này có 6 cổng, với 1 vòng chứa mẫu có thể tích xác định tuỳ chọn (gọi
là loop, có nhiều loại 10, 20, 50, 100 μl,…). Một núm xoay cho phép chuyển đổi
valve từ vị trí nạp mẫu vào vòng chứa mẫu (LOAD) sang bơm mẫu vào cột (INJECT):
+ khi để núm xoay ở vị trí LOAD (Hình 4.13, a), nạp mẫu vào (dùng syringe
Hamilton), mẫu sẽ được chứa trong loop (thể tích mẫu thừa sẽ được thải ra ngoài).
+ Nạp mẫu xong, lập tức xoay núm vặn của valve (xoay cùng chiều kim đồng hồ)
sang vị trí INJECT (Hình 4.13, b) - đồng thời bấm nút START để hệ thống bắt đầu tính
thời gian phân tích. Khi đó mẫu sẽ được bơm cao áp đẩy qua cột sắc ký cùng với pha
động.
a) b)
Hình 4.13. Valve Rheodyne 6 cổng với các vị trí:
a) NẠP MẪU (LOAD); b) BƠM MẪU (INJECT)
Việc chuẩn bị mẫu trong sắc ký lỏng cao áp rất quan trọng. Mẫu phải được chuẩn
bị ở dạng dung dịch. Các mẫu rắn nên được hòa tan trong dung môi thích hợp (tốt nhất
là bằng dung môi pha động), sau đó phải loại bỏ các hạt rắn không tan (bằng cách siêu
lọc hay ly tâm) trước khi bơm vào cột để tránh làm nghẹt hệ thống bơm mẫu hay cột
sắc ký. Những cấu tử cản trở quá trình phân tích cũng cần đươc loại bỏ bằng các
phương pháp chiết tách thích hợp.
- Cột sắc ký: là một ống thẳng thường làm bằng một loại thép không gỉ đặc biệt,
dài cỡ 3 – 25 cm, đường kính trong từ 2,6 – 4,6 mm (đối với cột phân tích) hay từ 6,4
– 12,7 mm (đối với cột sắc ký điều chế).
Các hạt pha tĩnh được nhồi vào cột và được giữ giữa 2 đĩa xốp ở hai đầu cột. Đối
với cột có đường kính trong 2,6 mm, kích thước hạt pha tĩnh thích hợp là 30 μm. Pha
tĩnh nhồi trong cột có thể có bản chất khác nhau tùy thuộc vào kỹ thuật tách sử dụng
(sắc ký hấp phụ rắn- lỏng, sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký lỏng trao đổi ion, sắc ký
rây phân tử).
- 66 -
Để kết quả phân tích ổn định, đặc biệt khi phân tích định lượng hay phân tích các
polymer bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử, cột sắc ký thường được giữ trong lò điều
nhiệt (dao động nhiệt độ không quá 0,2 0C) chứa không khí nóng tuần hoàn với tốc độ
cao.
Để tăng tuổi thọ cột sắc ký, trước cột phân tích được lắp thêm một cột bảo vệ
(guard column) dài khoảng 1 cm để giữ những tạp chất không mong muốn và giảm bớt
tác động xấu đến cột do sự thay đổi áp suất đột ngột. Lưu lượng pha động không nên
vượt quá vài ml/phút.
- Detector: Sau khi qua cột sắc ký, các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ được tách
thành từng phân đoạn và đi vào detector ghi nhận tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ
được thể hiện dưới dạng các peak trên sắc ký đồ.
Các loại detector dùng trong HPLC bao gồm:
Detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis detector): đo cường độ hấp thụ bức
xạ tử ngoại của pha động đi ra khỏi cột sắc ký (ở một bước sóng.hay nhiều bước sóng)
Loại detector này được dùng phổ biến nhất vì dễ sử dụng, ít phụ thuộc vào nhiệt
độ và lưu lượng pha động. Tuy nhiên, nó chỉ sử dụng cho các chất có khả năng hấp thụ
bức xạ tử ngoại – khả kiến trong vùng 190 - 600 nm (pha động sử dụng phải không
hấp thụ bức xạ trong vùng bước sóng nghiên cứu)
Để phát hiện những chất không hấp thụ tử ngoại, có thể chuyển chúng thành
dạng dẫn xuất có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại.
Detector chiết suất (RI detector: Refractive index detector): đo sự thay đổi chiết
suất của của pha động ra khỏi cột sắc ký. Detector này vạn năng nhưng kém nhạy,
không chọn lọc, thường dùng trong sắc ký rây phân tử..
Detector huỳnh quang (FD: Fluorescence detector): đo sự thay đổi cường độ phát
huỳnh quang của các hợp chất phân tích sau khi hấp thụ bức xạ tử ngoại thích hợp của
pha động sau khi qua cột tách. Detector này rất nhạy và rất chọn lọc
Ngoài ra, còn có những detector khác như detector điện hóa (electrochemical
detector), detector khối phổ (mass spectrometric detector)…, nhưng chúng ít thông
dụng hơn
- Hệ thống điều khiển và xử lý dữ liệu: là máy vi tính với các phần mền chuyên
dụng và giao diện (interface) cho phép điều khiển hoạt động của từng bộ phận trong hệ
thống như điều chỉnh chế độ bơm pha động (tốc độ dòng, chế độ rửa giải), nhiệt độ
cột, bước sóng bức xạ phát ra của detector, tính kết quả phân tích, lưu trữ dữ liệu …
b) Chọn pha tĩnh và pha động trong phân tích HPLC
Việc chọn pha tĩnh tùy thuộc bản chất hỗn hợp cần tách và cơ chế sắc ký lựa chọn
và theo nguyên tắc tương tự trong sắc ký cột cổ điển.
- 67 -
Đa số trường hợp là phân tích các hợp chất hữu cơ có độ phân cực yếu hay trung
bình cơ chế tách thường là sắc ký phân bố lỏng – lỏng.
Khi đó, có thể chọn 1 trong 2 loại cột sắc ký:
- cột pha thường (normal phase) nhồi bởi các hạt pha tĩnh phân cực (cấu tạo từ
silicagel ghép với các nhóm phân cực như aminopropyle, cyanopropyl, benzyl,…).
Khi đó, pha động phải không phân cực (ví dụ: hexan) hay kém phân cực (hỗn hợp
hexan với dung môi kém phân cực như CHCl3, CH2Cl2, THF, …)
Các cấu tử sẽ lần lượt được tách ra theo thứ tự tăng dần độ phân cực.
- cột pha ngược (reversed phase): nhồi bởi các hạt pha tĩnh không phân cực (cấu
tạo từ silicagel gắn với các dây nhánh không phân cực như C8 hay C18)
Khi đó, pha động phải là dung môi phân cực (ví dụ: metanol, acetonitril) hay hỗn
hợp của chúng với nước (ví dụ MeOH : H2O 40 : 60; …) hay phân cực trung bình
Các cấu tử sẽ lần lượt được tách ra theo thứ tự giảm dần độ phân cực.
c) Ứng dụng
Phương pháp HPLC có thể được dùng để phân tích các từ kém phân cực đến
phân cực, các hợp chất ion, vô cơ hay hữu cơ với phân tử lượng từ 300 – 2000 dalton,
tức là chiếm tới 80 % các ứng dụng trong kỹ thuật sắc ký. Vì vậy, phương pháp này
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: hóa học, sinh hóa, môi trường, dược
phẩm, nông lương thực phẩm (ví dụ: kiểm tra độ tinh khiết của dược phẩm, phân tích
dư lượng và vết độc tố trong môi trường và thực phẩm,…).
(a) Sơ đồ thiết bị GC
a) b)
Hình 4.18. Microsyringe (a) và injector (b) dùng trong sắc ký khí
Hình 4.19. Cấu tạo của cột mao quản dùng trong sắc ký khí
Trong sắc ký khí, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách, do đó để đạt kết
quả phân tích chính xác, cột phải được đặt trong một lò điều nhiệt (sai số nhiệt độ
không quá 0,10C). Nhiệt độ tối ưu của lò phụ thuộc vào điểm sôi của các hợp chất
trong mẫu phân tích. Nhiệt độ lò thường cao hơn một ít so với nhiệt độ sôi của cấu tử
khó bay hơi nhất, nhưng phải thấp hơn nhiệt độ tối đa cho phép của cột khoảng vài
chục độ.
Lưu ý :
- Nhiệt độ cột càng cao thời gian sắc ký càng ngắn nhưng hiệu quả tách
giảm đi; nhiệt độ thấp có thể cho kết quả tách tốt hơn nhưng thời gian sắc ký kéo dài.
Do vậy, cần khảo sát để chọn nhiệt độ tối ưu cho quá trình tách.
- Nếu mẫu chứa các hợp chất có điểm sôi rất khác nhau thi nên rửa giải bằng
dùng chương trình nhiệt (nhiệt độ cột tăng liên tục hay từng bước trong quá trình tách)
+ Detector: có nhiều loại, với độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau.
Việc chọn detector chủ yếu phụ thuộc bản chất mẫu phân tích, ngoài ra còn phụ
thuộc bản chất khí mang sử dụng.
Bảng sau trình bày đặc tính của một số detector thông dụng.
Khả
Khí năng Khoảng
Detector Loại Độ nhạy và độ chọn lọc
sử dụng phát tuyến tính
hiện
Phụ thuộc dòng
Ion hóa ngọn lửa Vạn năng cho hầu hết các
khối lượng H2 và không
(Flame Ionization hợp chất hữu cơ có nhóm 100 pg 107
(Mass flow khí
Detector : FID) -CH2 - ; độ nhạy cao
dependent)
Đặc trưng và nhạy, dùng
cho các hợp chất hữu cơ
Bắt giữ điện tử Phụ thuộc nồng
chứa các nguyên tố âm
(Electron capture độ (Concentration Khí Ar 50 fg 105
điện (N, Cl, P, ..) phân
detector: ECD) dependent)
tích thuốc trừ sâu, thuốc
diệt cỏ, …
Phụ thuộc dòng
Hợp chât chứa N, P (phân
Nitrogen – Phosphore khối lượng H2 và không
tích dược phẩm, dư lượng 10 pg 106
detector: NPD) (Mass flow khí
thuốc trừ sấu, …)
dependent)
- 71 -
Hình 4.20. là sơ đồ detector FID.
Các cấu tử ra khỏi cột sắc ký được
trộn với khí H2 (khí mang) và không
khí, bị đốt cháy ở nhiệt độ cao, tạo
thành dòng ion và electron dẫn điện.
Các ion và electron này chuyển về các
bản cực trái dấu nằm ở 2 phía của
ngọn lửa (hiệu thế giữa 2 bản cực này
khoảng 250 – 300 V) và sinh ra dòng
điện. Dòng này được khuếc đại và ghi
nhận thành các tín hiệu dưới dạng
peak sắc ký.
Hình 4.20. Detector FID
Ngoài ra, còn có những loại detector khác như detector quang kế ngọn lửa
(Flame Photometric Detector – FPD), detector khối phổ (Mass Spectrometric Detector
– MS)
b) Ưu, nhược điểm - Ứng dụng:
Phương pháp sắc ký khí là phương pháp hữu hiệu để phân tích những hỗn hợp
phức tạp trong thời gian rất ngắn. So với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,
phương pháp này có độ nhạy cao hơn, ít tốn kém hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này chỉ áp dụng để phân tích các hợp chất dễ bay hơi
(ví dụ các ester, hợp chất trong sản phẩm hóa dầu, hương liệu,…) hay có khả năng
chuyển thành dẫn xuất dễ bay hơi (như các acid béo, …).
Đối với những hợp chất kém bền nhiệt (như các hợp chất sinh học) thì không
thể áp dụng phương pháp này mà phải dùng phương pháp HPLC.
Phương pháp GC được ứng dụng rộng rãi để phân tích thực phẩm (ví dụ: thành
phần hương liệu, acid béo trong thực phẩm; thành phần acid amin,…). Đặc biệt, dùng
kỹ thuật GC-MS cho phép phân tích dư lượng độc tố ở mức ppb (ví dụ: 3-MCPD trong
nước tương, nước mắm, phân tích dư lượng kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật,...trong
thực phẩm.).
- 72 -
Tiếng Việt:
1) Nguyễn Thị Thu Vân, Phân tích định lượng, 2004, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh.
2) Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết của phép đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, 1994,
ĐHQG Hà Nội.
3) Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử,
1999, ĐHQG Hà Nội.
4) J. H. Kenedy, Cơ sở hóa học phân tích - Ch.19-Phương pháp sắc ký, 1994,
(Hoàng Minh Châu dịch)
5) Phạm Hùng Việt, Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí, 2003, NXB.
Khoa học và Kỹ thuật
Tiếng Anh
6) L. Ebdon, E. H. Evans; A. Fisher, S. J. Hill, An Introduction to Analytical
Atomic Spectrometry, 1998, J. Wiley.
7) Marvin C. McMaster, 2003, HPLC A Practical User’s Guide, 2 Ed. 2007, J.
Wiley
8) Harold M.; Mc. Nair; James M. Miller, Basic Gas Chromatography, 1997,
J.Wiley