Biyolojik Saat Laboratuvarı Staj Defteri

T.C.
GEBZE TEKNİK ÜNİVERSİTESİ

TEMEL BİLİMLER FAKÜLTESİ
STAJ DEFTERİ
Öğrencinin;
Adı, Soyadı Ebru AKHARMAN

Numarası 142204026
Bölümü Moleküler Biyoloji ve Genetik
Staj Yaptığı Yer Biyolojik Saat Laboratuvarı
Staj Tarihleri 16.07.2018-17.08.2018
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI: Literatür Araştırması Yapmak
16.07.2018 Sirkadiyen Ritim Nedir?
1.GÜN
Sirkadiyen Ritim Nedir?
Stajın ilk haftasında öncelikle çalışma alanı ile ilgili araştırma yapılıp genel olarak bilgi
edinilmiştir.
Biyolojik Ritimler
Canlıların biyolojik faaliyetlerinin düzenlenmesinde belirli bir ritmin gözlendiği çok eski
zamanlardan beri bilinmektedir. Bu biyolojik ritimler, periyot, sıklık, büyüklük ve faz gibi
özellikler gösteren, tekrarlayıcı olaylar olarak tanımlanır. Canlılardaki biyolojik ritimler
genellikle çevre şartlarından döngüsel özellik gösterenlerle eşzamanlı olarak yürür. Eğer canlı dış
ortamla ilişkili ise ve biyolojik ritimlerini dış dünyadan gelen uyarılarla düzenliyorsa böyle
ritimlere bağlı “entrained” ritimler denir. Eğer canlı çevresel uyarılardan arındırılmış bir
laboratuar ortamında iç ritmini oluşturup sürdürebiliyorsa bu ritmlere de serbest “free-running”
ritimler adı verilir.
Canlılar dış ortamdan aldığı bazı sinyalleri ritimlerin düzenlenmesi için bir işaret olarak kullanır.
Canlı gece gündüz göstereceği davranışların düzenlenmesi için ışık ve karanlığı bir çevresel
ipucu olarak kullanır. Biyolojik ritimlerin düzenlenmesinde yer alan çevresel ipuçlarına
“zeitgeber” (Almanca zeit=zaman geber=verici) veya “ritim verici” adı verilmektedir. Bu ritim
verici faktörler arasında en önemlisi ışıktır. Yılın mevsimleri, ay dönümleri, güneşin durumu
diğer ritim verici faktörler arasında sayılabilir.
Biyolojik ritimler döngü sürelerine göre 4 alt gruplara ayrılır
1. Ultradian ritimler: Bir günde birden fazla döngüsü olan ritimlerdir. Kalp hızı, solunum
sayısı, mide hareketleri, yeme, içme, idrar çıkarma ve dışkılama, REM/non-REM uyku dönemleri
ultradiyen ritimler arasındadır.
2. Sirkadiyen ritimler: Yaklaşık bir gün süren ritimlerdir. İnsanların en belirgin sirkadiyen
ritmi uyku ve uyanıklık döngüsüdür. Vücut ısı dalgalanmaları, kan basıncı, bazı hormonların
salınımları da sirkadien bir ritim izler.
3. İnfradiyen ritimler: Döngü süresi haftalar veya aylar süren ritimlerdir. Kadınlardaki
menstrual döngü ve erkeklerdeki 21-28 günlük testosteron salınım döngüsü yer alır.
4. Sirkannular ritimler: Yaklaşık bir yılık ritimlerdir. İnsan ve memeli hayvan doğumları,
hayvanların göç ve kış uyku döngüleri yer alır.
Şekil 1: Sirkadiyen Ritimin Saatlere Bağlı Olarak Değişimi

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin
Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

YAPILAN İŞİN;
17.07.2018 Sirkadiyen Ritim
2.GÜN
Sirkadiyen Ritim
Evrim, tüm canlıları mevcut varlıklarına göre şekillendirdi ve ince bir şekilde ayarladı. Deniz,
orman ya da dağ gibi farklı ortamlara adaptasyonlar yüzgeçler, kanatlar ya da kuyruklarda ortaya
çıkmış ve böylece yaratılanların yeni toprakları ele geçirmelerine ve boş ekolojik nişlerini
bulmalarına imkan sağlanmıştır. Ortamın bir parametresi, genellikle ihmal edilmediği veya kabul
edildiği için çok açıktır - bu parametre gündüz ve gecenin günlük olarak değişmesidir.
Yeryüzünün kendi ekseni etrafında her 24 saatte bir dönüşü, günlük ritmik ışık ve sıcaklık
değişimlerine neden olur. Bu gezegendeki hemen hemen tüm canlı varlıklar bu ışık ve sıcaklık
değişimlerine maruz kalmaktadır ve bu yüzden bu 24 saatlik ritime adapte olmuşlar ve yeni
ekolojik bir nişler yapmışlardır.
Tek hücreli canlılardan, bitkilere, kuşlara ve insanlara kadar birçok organizma fizyolojilerini ve
davranışlarını gece ve gündüz döngülerine göre
senkronize eden endojen bir zamanlama sistemi geliştirmiştir.
Bu sistem sirkadiyen saat olarak bilinmektedir. Latince‟de “circa” yaklaşık, “diem” bir gün
anlamına gelmektedir. Sirkadiyen ritimler, metabolizmadan karmaşık davranışlara kadar çoğu
vücut fonksiyonları üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Tüm bu biyolojik süreçlerin günün saati ile
optimize edilmesini sağlar. Davrnışlar gün uzunluğuna endojen moleküler osilatörler tarafından
üretilirler. Bu moleküler saatler, ışık şiddeti ve sıcaklık gibi çevresel döngülerle senkronize edilir.
Drosophila melanogaster, genetik, moleküler ve nöral devreler seviyesinde sirkadiyen ritimlerin
nasıl üretildiğini, çevresel ipuçlarıyla nasıl senkronize edildiğini ve lokomotor ritimleri gibi
davranış döngülerini nasıl yönlendirdiğini anlamak için bir model organizma olmuştur. Bu
moleküler kalp pilleri, organizmaların ortamlarındaki ritmik değişiklikleri doğru bir şekilde
tahmin etmelerine ve böylece onların formlarını değiştirmesine izin verir.
Beynindeki bir ana saat, tüm biyolojik saatleri, canlılarda koordine ederek, saatlerin senkronize
olmasını sağlar. İnsan dahil omurgalı hayvanlarda, ana saat, suprakiazmatik çekirdeği veya SCN
olarak adlandırılan bir yapı oluşturan yaklaşık 20.000 sinir hücresi (nöron) grubudur. SCN,
hipotalamus adı verilen beynin bir kısmında bulunur ve gözlerden doğrudan girdi alır.
Bilim adamları, insanları, meyve sineklerini veya fareleri inceleyerek benzer biyolojik saat
genleri olan organizmaların sirkadiyen ritimlerini öğrenirler. Bu deneyleri yapan araştırmacılar,
aydınlık ve karanlık dönemleri değiştirerek canlının çevresini kontrol edebilirler. Daha sonra gen
aktivitesindeki veya diğer moleküler sinyallerdeki değişiklikleri ararlar. Bu tür araştırmalar
biyolojik saatlerin nasıl çalıştığını ve zamanın nasıl tutulduğunu anlamaya yardımcı olur.


YAPILAN İŞİN;
18.07.2018 Hayvan ve Bitki Kriptokrom’ u ve Çeşitleri
3.GÜN
Hayvan ve Bitki Kriptokrom’ u ve Çeşitleri
Kriptokromlar, Arabidopsis'te keşfedilen ancak daha sonra diğer bitkilerde, mikroplarda ve
hayvanlarda bulunan fotoliyaz benzeri mavi ışık reseptörleridir. Arabidopsisin, sırasıyla mavi ışık
altında hipokotil uzama ve çiçek başlangıcında fotoperiyodik kontrolün mavi ışık inhibisyonuna
aracılık eden CRY1 ve CRY2 kriptokramları tarafından gerçekleştirildiği keşfedilmiştir. Ayrıca,
kriptokromlar, sirkadiyen ritimler, tropik büyüme, stoma açılması, nöbetçi hücre gelişimi, kök
gelişimi, bakteriyel ve viral patojen tepkileri, abiyotik stres tepkileri, hücre döngüleri,
programlanmış hücre ölümü, meyve ve ovül gelişimi, tohum dormansisi, manyetorepsifikasyon,
apikal baskınlık da dahil olmak üzere bir düzine başka ışık yanıtını da düzenler. Kriptokromların
iki domaini vardır: FAD kromoforuna bağlanmış (flavin adenin dinükleotid) N-terminal PHR
bölgesi (Fotoliyaz-Homolog Bölge) ve kendiliğinden yapılandırılmamış görünen ancak
kriptokromların işlevi ve düzenlenmesi için kritik olan CCE (CRY C-terminal Uzantısı) domaini.
Çoğu kriptokrom çekirdekte birikmekte ve mavi ışığa bağımlı fosforilasyon veya ubikitinasyon
geçirmektedir. Fotonların flavin molekülünün elektronlarını uyardığı, redoks reaksiyonu veya
dairesel elektron mekiği ve fotoreseptörlerin konformasyonel değişiklikleriyle sonuçlandığı
varsayılmaktadır.
Foton ile uyarılmış kriptokrom, transkripsiyonel ve posttranslasyonel seviyelerde ve sonuç olarak
bitkilerin metabolik ve gelişimsel programlarında gen ekspresyonunu değiştirmek için sinyalleme
füzyon proteinleri ile etkileşime giren açık bir konformasyon için fosforile edilir. Ayrıca
kriptokromlar, hayvan beyinlerinde merkezi sirkadiyen osilatörün ayrılmaz parçaları ve
bitkilerdeki mavi veya ultraviyole (UV-A) ışığa yanıt olarak fotomorfojenezi kontrol eden
reseptörler olarak görev yaparlar. Kriptokromlar, muhtemelen, ışıkla aktive edilmiş DNA-onarım
enzimleri olan DNA fotoliyazların evrimsel olarak arkasından gelirler ve bitki kriptokromları,
hayvan kriptokromları ve CRY-DASH proteinleri olmak üzere üç gruba ayrılır. Kriptokromlar ve
fotoliyazlar, bir a / β domaini ve bir helikal domain ile karakterize edilen benzer üç boyutlu
yapılara sahiptir. Yapı ayrıca bir kromofor olan flavin adenin dinükleotidi (FAD) içerir. Helikal
domainin FAD erişim alanı, fotoliyazların katalitik bölgesidir ve kriptokrom mekanizmasında da
önemli olduğu tahmin edilmektedir.
Sirkadiyen biyolojik saatleri, her 24 saatte bir başa dönen ışığa ve diğer çevresel sinyallere maruz
kalmak suretiyle sıfırlanabilen biyokimyasal osilatörlerdir. Hayvanlarda beyinde, tüm
organizmanın sirkadiyen davranışını ve bazı dokulardaki periferal osilatörleri kontrol eden
merkezi bir osilatör vardır. Osilasyon, timeless(Tim), periyot (Per), clock (Clk) ve Bmal1'in yanı
sıra kriptokromları içeren bir dizi saat transkripsiyon faktörünü içeren bir transkripsiyonel
feedback döngüsünden kaynaklanır. Kriptokromlar, tüm organizmaların organlarında ve
dokularında her yerde bulunur ve bunlar genellikle gen ekspresyonunu düzenleyen nükleer
proteinlerdir. En yoğun çalışılan hayvan kriptokromları Drosophila kriptokromu olan Cry, fare
kriptokromları Cry1 ve Cry2, Arabidopsis kriptokromları CRY1 ve CRY2' dir.

YAPILAN İŞİN;
19.07.2018
Biyolojik Saat Proteinlerin Etkileşimi
4.GÜN
Biyolojik Saat Proteinlerin Etkileşimi
Sirkadiyen saat, mantarlardan siyanobakterilere, zebra balıklarına veya farelere kadar birçok
farklı model organizmada incelenmiştir. Drosophila‟nın genleri neredeyse yüz yıllardan beri
incelenmektedir, böylece moleküler, karmaşık ve biyokimyasal teknikler ve araçlar artık
moleküler bazda karmaşık davranışları incelemek için kullanılabilir. Meyve sineği, büyük ölçekli,
ölçülebilir sirkadiyen davranış kalıplarını çok farklı ve kolay bir şekilde gösterir. Özellikle
lokomotor aktivitesi burada belirtilmelidir. Bir krepuskular hayvan olarak Drosophila iki aktivite
tepesi gösterir - biri sabah ve diğeri akşamdır. Bu ritmik aktivite sürekli koşullar altında devam
eder. Diğer saatlerde düzenlenmiş davranışlar arasında eksilyon, koku duyarlılığı, yumurtlama,
olfaktory duyarlılığı ya da öğrenme ve hafıza yer almaktadır. Diğer önemli bir faktör de
Drosophila'nın nöronal ağ organizasyonunun basitliğidir. Beyin yarıküresi başına yaklaşık 150
clock hücresi henüz yönetilemez ve bu nedenle beyindeki tek hücrelerin veya hücre kümelerinin
işlevinin diseksiyonuna izin verir. Drosophila, bu avantajları nedeniyle biyolojik saat
araştırmalarında bilim insanları tarafından tercih sebebi olmuştur. Drosophila'da sirkadiyen
saatlerin iki ayrı grubu vardır, clock nöronları ve clock genleri. Onlar, 24 saatlik dinlenme ve
aktivite döngüsünü üretmek için birlikte hareket ederler.
Işık, saatlerin aktivasyon kaynağıdır. Bileşik gözler, ocelli ve Hofbauer-Buchner göz kapakları
(HB halkaları) doğrudan dış fotoreseptör organlarıdır. Ama sirkadiyen saat sürekli karanlıkta
çalışabilir. Bununla birlikte, fotoreseptörler gün uzunluğunu ölçmek ve ay ışığını tespit etmek
için gereklidir. Bileşik gözler, uzun günleri sabit ışıktan ayırmak ve ışığın ışıkla ve karanlık
tarafından engellenmesiyle aktivitenin indüklenmesi gibi ışığın normal maskeleme etkileri için
önemlidir. Alacakaranlıkta M (sabah için) zirvesi ve E (akşam için) zirvesi olarak adlandırılan iki
ayrı aktivite tepesi vardır. Yılın farklı mevsimlerindeki farklı gün uzunluklarını izlerler. Gözdeki
ışığa duyarlı proteinler, rhodopsinler (rhodopsin 1 ve 6), M ve E osilasyonlarını aktive etmekte
çok önemlidir. Çevre ışığı tespit edildiğinde, beyinde yaklaşık 150 nöron (Drosophila beyinde
yaklaşık 100.000 nöron vardır) sirkadiyen ritmi düzenler. Clock nöronları merkezi beyindeki ayrı
kümelerde bulunur. En iyi anlaşılan saat nöronları, optik lobun büyük ve küçük lateral ventral
nöronlarıdır. Bu nöronlar, farklı clock nöronları arasında sirkadiyen nöromodülatör olarak hareket
eden bir nöropeptid olan pigment dispersiyon faktörü (PDF) üretirler. Drosophila Cry' ı, sitozolde
de bulunabilse de ağırlıklı olarak çekirdeksel bir proteindir. Saatin negatif feedback döngüsünü
baskılamak için doğrudan Tim proteini ile etkileşime girerek sirkadiyen saati düzenler. Işık Cry-
Tim etkileşimini uyarır bu durum Tim' in proteozoma bağlı degradasyonunu ve ubikitinasyonunu
destekler böylece Per-Tim heterodimer formasyonunu baskılanır. Clock ve Cycle proteinlerinin
heterodimerlerinin Per-Tim heterodimeri tarafından inhibe edilmesi sirkadiyen osilasyon
aşamasını sıfırlar.
Drosophila, kullanım kolaylığı ve gelişmiş moleküler ve genetik araç kiti sayesinde sirkadiyen
ritim araştırmasına öncülük etmiştir. Moleküler sirkadiyen saat, Drosophila' dan insanlara yüksek
ölçüde korunmuştur ve transkripsiyonel negatif feed back döngülerinden oluşmaktadır. Bu
döngülerin merkezinde, PERIOD (PER) ve TIMELESS (TIM) ifadesini etkinleştiren,
heterodimer oluşturan CLOCK (CLK) ve CYCLE (CYC) transkripsiyon faktörleri vardır. PER ve
TIM, çekirdekte CLK / CYC'nin heterodimerik represörü olarak işlev görür. İkinci bir
transkripsiyonel feedback döngüsünde, CLK ve CYC, sırasıyla clk transkripsiyonunu baskılayan
ve aktive eden VRILLE (VRI) ve PAR DOMAIN PROTEIN1ε (PDP1ε) ifadesini uyarır. İki
transkripsiyonel feed back döngüsü, çoklu clock kontrollü genleri (ccgs) kontrol eder, ancak
ilginç bir şekilde anti-faz mRNA salınımları oluşturur.


YAPILAN İŞİN;
19.07.2018 Biyolojik Saat Proteinlerin Etkileşimi
4.GÜN
PER ve TIM sentezi ve bozunması gün boyunca sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu karmaşık
düzenleme sirkadiyen kalp pili hızını ayarlamak için çok önemlidir.
Moleküler sirkadiyen saat, belirli saat proteinlerinin kendi mRNA'larının transkripsiyonunu
düzenlediği, böylece gen ifadesinin döngülerini koruduğu feed back döngülerinden oluşur.
Drosophila'daki ana döngü, her ikisi de transkripsiyonel aktivatörler CLOCK (CLK) ve CYCLE
(CYC) aktivitesini inhibe ederek transkripsiyonel ve ritmik olarak transkripsiyonu düzenleyen
PERIOD (PER) ve TIMELESS (TIM) proteinlerinden oluşur. PER ve TIM'in sirkülasyonu,
sirkadiyen ritimler için çok önemlidir ve organizma için zaman tutmayı sağladığı
düşünülmektedir. PER-TIM seviyelerinin günün saat sinyallerini oluşturduğu fikri ile tutarlı
olarak, ışık bu moleküllerin seviyelerini değiştirerek saatin zamanını ayarlar. Böylece, moleküler
saatin ışık ile değişmesi, TIM proteininin ışık kaynaklı bozunmasına aracılık eder. Işığa yanıt
olarak, TIM proteini F-box protein JETLAG (JET) içeren bir E3 ubiquitin ligaz kompleksi ile
ubikitin-proteazom yolağına sürüklenir. Ubikuitin-proteazom yolu ayrıca serbest çalışma
koşulları altında döngüyü sağlayan ışıktan bağımsız PER-TIM bozulmasını da etkileyebilir.
dCRY‟ nin C-terminusu fotoreseptör fonksiyonu için çok önemlidir. Çünkü C-terminusun
silinmesi, sineklerde aritmiye neden olan konstitütif aktif bir form oluşturur. dCRY ile temsil
edilen Tip 1 CRY‟ ler sadece bazı böceklerde(meyve sineği, sivri sinek vb.) bulunur ve
fotoreseptör olarak işlev görür. Tip 2 CRY‟ ler omurgalılarda(balık, fare, vb.) ve bazı böceklerde
bulunur ve çekirdek saatte çalışır. Bazı memeli olmayan omurgalılarda(balık, kurbağa, kuşlar vb.)
Tip 4 CRY vardır ve bunların işlevleri tam olarak bilinmemektedir.
Şekil 2: Biyolojik Saat Proteinlerin Etkileşimi


YAPILAN İŞİN;
20.07.2018 Optogenetik Nedir?
5.GÜN
Optogenetik Nedir?
Gen ekspresyonunun düzenlenmesi, belirli bir genin üretimini arttırmak veya azaltmak için
hücreler tarafından kullanılan birçok mekanizmayı içerir. Gen ekspresyonunu ve protein
aktivitesini düzenlemek için farklı araçlar vardır. Bu araçlar, canlı hücrelerde bazı olayları
düzenlemek için kimyasal veya fiziksel ajanlar kullanır. Kimyasal bazlı gen regülasyon
sistemlerinde, kontrol edilebilir bir transkripsiyon faktörü veya transkripsiyon faktörleri,
genellikle kimyasal varlığında promoter bölgelerine bağlanarak hedef gen ekspresyonunu kontrol
eden memeli hücrelerinde ifade edilir. Başka bir yaklaşım, işlevi düzenlemek için proteinin
oligomerizasyonunu düzenlemektir. Bu sistemler genellikle kimyasal veya fiziksel bir baskı
gerektirir. Bununla birlikte, bu uygulamalar bir miktar stres yaratmakta ve hatta bazen hücrelerde
bir şok veya toksisiteye neden olmaktadır. Ayrıca, bu araçlar invazivdir ve regülasyonların
çözünürlüğü o kadar düşüktür ki, saatler sürer. Hücrelerdeki gen veya protein aktivitesini
düzenlemek için ışık gibi non-invaziv ve hassas ajanların geliştirilmesi çekici bir alandır. Işık
eşsiz mekansal zamansal çözünürlük sunar. Her ne kadar canlı hücrelerde belirli sinyal yollarını
düzenlemek için ışık kullanan bazı yeni sistemler olsa da, genellikle karmaşık ekipman veya özel
ışık kaynakları gerektirir. Bu nedenle, basit bir ışık kontrol aracı, moleküler biyoloji ve genetik
alanında geniş bir uygulama bulacaktır.
Işığın bağlı veya yayılabilir kromoforlarla emilimi, doğal ve yapay fotoreseptör proteinlerinde
konformasyonel yeniden düzenlemelere neden olur. Bu yeniden düzenlemeler, iyon nakil
yollarının açılması veya kapanması, bağlanma partnerlerinin birleşmesi veya ayrışması, katalitik
aktivitenin arttırılması veya bastırılması veya genetik bilginin transkripsiyonu ile birleştirilir.
Fotoreseptör proteinlerini eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış hücrelerin, dokuların
veya organizmaların ışığa maruz bırakılması mükemmel hücresel ve moleküler özgüllük ile
biyokimyasal ve elektriksel sinyalleri bozmak için kullanılabilir. İlk olarak 2002 yılında ortaya
konan bu optogenetik kontrol prensibi, sinirsel devrelerin organizasyonu ve davranışsal nöral alt
tabakaların tanımlanması için doğrudan ve sıkı bir yol sağladığı nörobilim üzerinde derin bir
etkiye sahip olmuştur. Işığın fotonları emildiğinde, saçıldığında veya yansıtıldığında, enerji
biyolojik maddeye aktarılır. Genellikle tamamen gözlemsel olarak düşünülen optik yöntemler de
müdahale için yararlıdır: Işık mekanik güçler üretebilir ve elektrik akımlarını değiştirebilir;
Genetik bilginin transkripsiyonunu düzenleyebilir ve biyokimyasal yollardaki substrat ve sinyal
akışını kontrol edebilir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
23.07.2018 Moleküler Klonlama Çalışması
6.GÜN
Moleküler Klonlama
Moleküler klonlama, önemli bir ürün veya protein sentezini kodlayan genin (genellikle
restriksiyon endonükleaz enzimleri ile) ait olduğu prokaryotik veya ökaryotik hücre
genomundan özel bir yöntemle gerçekleştirilebilir; bu, bir taşıyıcı ile kombine edilerek
bir alıcı prokaryotik veya ökaryotik hücrelere transfer edilir. Vektör DNA, alıcı hücrede
genetik olarak ifadeyi sağlar. Bakteriyel transformasyon, hücrelerin düşük frekansta
çevreden yabancı DNA aldıkları doğal bir süreçtir. Transformasyondan sonra, hücreler,
genetik çeşitlilik kaynağı olarak hizmet edebilen ve potansiyel olarak konakçıya fayda
sağlayan (örneğin, antibiyotik direnci) edinilmiş genetik bilgiyi ifade edebilir. Moleküler
klonlama ile, transformasyon işlemi kullanılmıştır ve DNA alımı için "competent" veya
daha geçirgen hale getirilmiş olan bakteriyel suşlara rekombinant plasmid DNA'yı
sokmak için geliştirilmiştir. Bu deneyin amacı, competent hücrelere DNA eklenmesidir.
DNA replikasyonu, çift sarmalın her bir kordonunun kopyalanmasını içerir ve oluşan her
iplikçik double helix yapısına sahip olur. replikasyon, orijin denilen belirli bir sırada
başlar. Replikasyon bir orjin dizisinde başladıktan sonra, tüm diziler ne olursa olsun bilgi
çoğaltılır. Bu prensip, moleküler klonlama veya rekombinant DNA fikrine yol açar.
Klonlama, büyük miktarlarda tek bir DNA dizisinin üretilmesini sağlar. Bir rekombinant
DNA iki kısımdan oluşur: bir vektör ve insert dizileri. Bir vektöre katıldıktan sonra,
herhangi bir insert dizisi çoğaltılabilir. Vektörü birleştirme ve DNA'ları ekleme işlemi
ligasyon olarak adlandırılır. DNA ligaz, vektör ile insert arasında fosfodiester bağı
yapmak için ATP enerjisi kullanılarak ligasyon gerçekleştirir. Vektör ve insert DNA
fragmanları aynı restriksiyon endonükleazın etkisi ile üretilirse, baz eşleştirmeye
katılırlar. Blunt end ligasyonlarında, 5 'fosfat gruplarının ve 3' hidroksil gruplarının
birleşmesi, cohesive end ligasyonlarından daha geçicidir. Cohesive end' lerin hidrojen
bağı stabilizasyonundan yoksun olduklarından, künt uç ligasyonları reaksiyon
koşullarına, özellikle reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonlarına daha duyarlıdır.
Klonlanması düşünülen gen ile vektör aynı RE ile kesilir.
Vektör DNA ile, DNA parçaları tek-iplikçikli komplementer (uyumlu) sonları olup; bu
parçalar birbirleri ile birleşmeye hazır haldedirler. T4 DNA ligase kullanılarak, arada
kovalent fosfodiester bağı oluşması suretiyle stabilizasyon sağlanır. Sonuçta rekombinant
plazmidler transformasyon ile bakteriye sokulur. Vektör DNA taşıyan bakteri, üzerindeki
antibiyotik direnci ile seçilir. Eğer bir RE, vektör hazırlamada kullanılırsa; DNA,5'fosfat
gruplarını ortadan kaldırmak için calf intestinal alkalin fosfataz ile muamele edilir.
Böylece ligasyon sırasında, resirkülarizasyona engel olunabilir. Doğru restriksiyon
parçasının klonlandığının saptanabilmesi için, insert DNA değişik yöntemler kullanılarak
(PAGE, low melting agarose, geneclean v.b.) saflaştırılır. Vektör ve Insert DNA‟nın
Ligasyon' u için Vektör ve Insert DNA oranının hesaplanması gerekmektedir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
24.07.2018 Restriksiyon Enzimleri ile DNA Kesimi
7.GÜN
Restriksiyon Enzimleri ile DNA Kesimi
Bir restriksiyon enzimi, bir restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan DNA'daki spesifik bir
nükleotid çifti dizisini tanır ve DNA'yı bu dizinin içinde veya yakınında parçalara ayırır. Tüm
restriksiyon enzimleri, karbon ve fosfodiester bağının fosfat parçası arasındaki DNA'yı keserler
ve böylece restriksiyon enzim kesimi ile üretilen parçaların fosfat ve hidroksilleri vardır. En iyi
restriksiyon enzimleri optimal olarak DNA' yı keser. Restriksiyon enzimleri, klonlanacak bir
DNA parçası havuzu üretmek için kullanılır. Restriksiyon enzimleri ayrıca bir klonlanmış DNA
parçasında veya genomdaki bir DNA segmentinde restriksiyon mevkilerinin konumlarını analiz
etmek için kullanılır. Böyle bir kesim, aynı organizmanın her bir genom kopyasını aynı büyük
parçalara böler. Üç farklı tipte restriksiyon enzimi vardır. Tip I, DNA'yı tanıma alanından 1000
veya daha fazla baz çiftine kadar rastgele yerlerde keser. Tip III, bölgeden yaklaşık 25 baz
çiftinde keser. Tip I ve III ATP gerektirir ve çok sayıda alt birim ile büyük enzimler olabilir.
Ağırlıklı olarak biyoteknolojide kullanılan tip II enzimler, tanımlı dizilimde ATP' ye gerek
kalmadan DNA'yı keser ve daha küçük ve daha basittir. Tip II restriksiyon enzimleri, izole
oldukları bakteriyel türlere göre adlandırılır. Örneğin, EcoRI enzimi E. coli' den izole edildi. Tip
II kısıtlama enzimleri, her iki iplikçiği tanıma dizisinin merkezinde veya her bir iplikçiğin tanıma
dizisinin bir ucuna daha yakın kesilmelerine bağlı olarak iki farklı kesim türü üretebilir. Bu kesim
türleri sonucunda yapışkan veya küt uçlar oluşur.
Şekil 3: Restriksiyon Enzim Kesimleri

Aşırı standart olmayan koşullar altında, restriksiyon endonükleazların tanımlanmış tanıma dizileri
ile benzer ama aynı olmayan dizileri parçalayabildiği gösterilmiştir. Bu değişmiş veya
rahatlatılmış özgüllüğe star aktivite denir. Star aktivitesinin, restriksiyon endonükleazların genel
bir özelliği olabileceği ve herhangi bir restriksiyon endonükleazının, bazı ekstrem koşullar
altında, kanonik olmayan bölgelerin kesilmesine neden olabileceği belirlenmiştir. Enzimin
özgünlüğünün değiştirilme şekli, enzime ve star aktiviteyi indüklemek için kullanılan koşullara
bağlıdır. Değiştirilen aktivitenin en yaygın türleri, tek bazın kesilmesi, tanıma dizisinden farklı
alanların kesilmesi ve gereğinden fazla kesim yapılması gösterilebilir. Star aktiviteye neden olan
durumlara, yüksek gliserol konsantrasyonu, DNA oranının yüksek olması, düşük iyonik güç,
yüksek pH, organik çözücülerin varlığı, magnezyum iyonunun diğer divalent katyonlarla
değiştirilmesi örnek verilebilir.

YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
25.07.2018 Agaroz Jel Hazırlama
8.GÜN
Agaroz Jel Elektroforezi
Elektroforez genel anlamda, özel bir sıvı ortamda, parçacıkların içerdikleri elektriksel yüke göre
farklı hızda ve farklı yönde hareket etmesi sonucu, bütün bir maddenin yapısındaki farklı
maddelerin ayırt edilebilmesini sağlayan bir inceleme yöntemidir. Bir hedef DNA bölgesinden
birçok kopya çıkararak, bir PCR reaksiyonu veya bir DNA klonlaması yapıldığında ve bir geni
halkasal bir plazmid DNA' sına eklendiğinde, PCR'ın işe yarayıp yaramadığını veya plasmidin
içine genin eklenmiş olup olmadığını kontrol etmek istenildiğinde, uygulanacak en kolay ve ucuz
yöntem jel elektroforezi yöntemidir. Jel elektroforezi, DNA parçalarını veya RNA ve proteinler
gibi diğer makromolekülleri boyut ve yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir.
Elektroforezde ilgili molekülleri içeren bir jele bir akım uygulanır. Böylece moleküllerin
boyutları ve yükleri temel alınarak farklı yönlerde veya farklı hızlarda jelden geçmeleri suretiyle
birbirlerinden ayrılmaları sağlanır. Tüm DNA moleküllerinin kütle başına aynı miktarda yükü
vardır. Bu nedenle DNA parçalarının jel elektroforezi onları yalnızca boyuta göre ayırır.
Elektroforez kullanarak bir numunede kaç farklı DNA parçasının bulunduğunu ve birbirlerine
göre ne büyüklükte oldukları ayırt edilebilir. Ayrıca bir DNA parçasının mutlak boyutunu, bilinen
boyuttaki DNA parçacıklarından oluşan standart bir "ölçüt" işareti ile bulunabilir. Kullanılan bu
standartlar DNA marker ya da DNA ladder olarak bilinirler. Adından da anlaşılacağı üzere, jel
elektroforezi bir jel içerir. DNA ayrıştırması için jeller genellikle agaroz adı verilen , kuru, toz
haline getirilmiş bir polisakaritten üretilir . Agaroz bir tamponda ( genellikle TAE ve TBE
isimleriyle kısaltılan çözeltiler içerisinde ) ısıtılıp soğutulduğunda, katı bir jel oluşturacaktır.
Moleküler düzeyde, jel hidrojen bağlarıyla bir arada tutulan ve küçük gözenekler oluşturan bir
agaroz molekül matrisidir. DNA ayrıştırmaları için en çok kütle/hacimce %1 veya %2 lik agoroz
karışımları kullanılır. Jelin bir ucunda, DNA numunelerinin yerleştirileceği kuyucuk adı verilen
cep benzeri girintiler bulunur. DNA örnekleri uygun derisimde yukleme boyalarıyla karıştırılarak
bu kuyucuklara yüklenirler. Ancak yükeleme yapılmadan önce jel, içerisinde yine TAE ve TBE
gibi bir tampon bulunduran bir tank içerisine yerleştirilir. Tankın bir ucu pozitif bir elektrota
bağlanırken diğer ucu negatif bir elektrota bağlanır. Bu elektrotlara güç uygulandığında şeker
fosfat omurgasındaki fosfat grupları nedeniyle negatif yüke sahip olan DNA eksiden artıya doğru
jel boyunca hareket etmeye başlar. Bu hareket sırasında daha uzun yani molar ağırlığı daha
yüksek DNA parçacıkları arkada kalırken görece kısa DNA parçacıkları öne geçerek jelin sonuna
daha çabuk ulaşacaklardır. Moleküllerin ağırlıklarına bağlı olarak hızlarında oluşacak bu farklılık
onların birbirinden ayrılmalarını sağlayacaktır. Elektrotlara uygulanacak olan güç akım veya
gerilim değerleriyle belirlenebilir, laboratuarlar da DNA ayrıştırması için 100 V gerilim
uygulanır.
Parçacıklar ayrıldıktan sonra, jeli inceleyebilmek için bir DNA bağlayıcı boyaya ve onu görünür
kılacak UV ışığa ihtiyaç duyulur. Laboratuarlarda en çok kullanılan boya etidyum bromürdür.
Etidyum bromür DNA ya bağlanma özelliği dolasıyla mutajenik bir ajan olarak kabul edilir ve
teması kesinlikle engellenmelidir. Laboratuvarda etidyum bromür kullanmanın alternatifleri
vardır. Örneğin, bazı araştırmacılar SYBR-temelli boyalar kullanırlar. SYBR boyalarının
EtBr'den daha az kanserojenik olduğu, boyamanın daha duyarlı ve yüksek kontrastlı olduğu
bulunmuştur. Ancak, bu boyaların DMSO içinde çözülmesi gerekir, bu çözücü ise kolaylıkla
deriye nüfuz eder.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
25.07.2018 Agaroz Jel Hazırlama
8.GÜN
EtBr'nin dezavantajlarına rağmen çoğu araştırmacı daha ucuz olduğu için EtBr kullanmayı tercih
eder. Etidyum bromür jel hazırlanırken direk olarak karışıma eklenebileceği gibi, etidyum bromür
ile boyama elektroforez işlemi sonunda jelin içine konulacağı bir çözelti yardımıyla da
gerçekleştirilebilir. Boyama işleminden sonra jel UV ışık altında fotoğraf çekebilen bir system
içerisine yerleştirilir. UV nin zararlı etkilerinden dolayı bu ışık yakıldığında jele çıplak göz ile
bakılmamalıdır. Başarılı bir ayrıştırma işlemi sonunda bu aşamada üzerinde birbirinden ayrı
bantlar görünen bir fotoğraf elde edilir. Yüklenen örneklerde görülen bantlar DNA markerindaki
bantların boyutlarıyla karşılaştırılarak deneyin başarısı hakkında daha gerçekçi bir yorum
yapılabilir.
Agaroz Jel Elektroforezi Nasıl Yapılır?
1. 40 ml %1‟ lik klonlama jeli için
 0,4 gram agaroz
 40 ml 1X TBE buffer ve 5 ml 𝑑𝐻2 𝑂
 2 mikrolitre redsafe / pronosafe
2. 0,4 gram agaroz 40 ml 1X TBE ile çözünür ve çözelti 2 dakika mikrodalgada şeffaf hale
gelene kadar bekletilir.
3. Şeffaf hale gelen çözelti biraz soğuduktan sonra 0,8-2 mikrolitre redsafe çözeltiye
eklenir.
 Klonlama jeli için küçük tank küçük plate kullanılır.
 2 tarak kullanılır. Bu taraklar, üstte 12‟ lik, ortada bantlı geniş tarak kullanılır.
4. Hazırlanan çözelti tankın bir kenarından dökülür ve eğer baloncuk oluşmuşsa pipet
ucuyla patlatılmalıdır.
5. Jel tankın içerisinde donduktan sonra taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılır ve örnekler
oluşan kuyulara yüklenebilir.

YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
26.07.2018 Kompetan Hücre Nedir?
9.GÜN
Kompetan Hücre Hazırlama
Kompetan hücreler, yabancı DNA' yı kolaylıkla geçirebilecek kadar fazlaca değiştirilmiş hücre
duvarlarına sahip olan bakteri hücreleridir. Çoğu tip hücre, kompetan hale gelmesi için özel
kimyasal veya elektriksel işlemlere maruz kalmadıkları sürece, DNA' yı verimli bir şekilde
alamazlar. DNA' yı alabilecek bakteriyi yapmak için standart yöntem, kalsiyum iyonları ile
müdahale etmektir. Hücrelerin bir elektrik alanına kısa süre maruz kalması, bakterilerin DNA' yı
almasına izin verir ve bu işlem elektroporasyon olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bazı bakteri
türleri doğal olarak dönüştürülebilir, bu da özel bir müdahale gerektirmeden çevrelerinden DNA
alabilmeleri anlamına gelir. Magnezyum klorür yönteminde, yüksek konsantrasyonda kalsiyum
içeren bir çözelti içinde süspansiyon haline getirilerek bakteri hücrelerinde gözenekler
oluşturarak yetkinlik elde edilebilir. DNA, daha sonra dönüşüm prosesi için 42 santigrat
derecesinde ısı şoku muamelesi ile konak hücreye uygulanabilir.
Doğal Kompetanlık:
Bakteriler çevrelerinden DNA'yı üç şekilde alabilirler; konjugasyon, transformasyon ve
transdüksiyon. Transformasyonda DNA doğrudan hücreye girer. Transformasyon ile DNA'nın
alınması, alıcı hücrelerin, kompetan durum olarak adlandırılan özel bir fizyolojik durumda
olmasını gerektirir. Bakterilerde oldukça düzenlenmiştir ve kompetan ilgili faktörler cinsler
arasında farklılık gösterir. Üretilen kompetanlık proteinleri bir miktar homolojiye sahiptir, ancak
Gram negatif ve Gram pozitif bakterilerde farklıdır. DNA hücre sitoplazmasına getirildikten
sonra, nükleaz enzimleri tarafından bozunabilir veya hücrelerin kendi DNA'larına çok benziyorsa,
DNA tamir eden enzimler onu kromozomla yeniden birleştirebilir.
Şekil 4: Kompetan Hücre Hazırlama
Yapay Kompetanlık:
Yapay kompetanlık hücrenin genlerinde kodlanmamıştır. Bunun yerine, normal olarak doğada
bulunmayan koşullar ile, hücrelerin DNA'ya geçirgen hale getirildiği bir laboratuar prosedürüdür.
Bu prosedür nispeten kolay ve basittir ve bakteriler genetik mühendisliğinde kullanılabilir, ancak
genel olarak transformasyon verimliliği düşüktür. Kompetan hücrelerin hazırlanması için iki ana
yöntem vardır. Kalsiyum klorür metodu ve elektroporasyon. Hızla büyüyen hücreler diğer
büyüme aşamalarındaki hücrelerden daha kolay bir şekilde üretilir. Bu yüzden prosedür
başlamadan önce hücrelerin kütle haline getirilmesi gereklidir. Hızlı büyümedeki (log fazı)
hücreler yaşamakta, sağlıklı ve aktif olarak metabolize olmaktadır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
27.07.2018 Bakteriyel Transformasyon Yapımı
10.GÜN
Bakteriyel Transformasyon
DNA, bakteriler arasında üç yöntemle değiştirilebilir: transformasyon, transdüksiyon ve
konjugasyon. Transformasyon, moleküler genetiğin en popüler tekniklerinden biridir, çünkü
deneysel olarak değiştirilmiş DNA'yı tekrar hücrelere eklemenin en iyi yoludur. Bu teknik, ilk
olarak bakteri içinde keşfedilmiştir, ancak başka türler de birçok hayvan ve bitki hücresini
dönüştürmek için tasarlanmıştır. Transformasyon, keşfedilen bakteriyel gen değişiminin ilk
mekanizmasıydı. Patojenik suşlar tarafından yapılan koloniler agar plakaları üzerinde pürüzsüz
görünmektedir, çünkü bakteriler bir polisakkarid kapsülü salgılarlar. Bakteriyel transformasyon,
Pneumococcus, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis ve diğer bazı bakterilerde geniş çapta
araştırılmıştır. Transformasyon süreci sırasında, genler bir bakteriden diğerine "naked" DNA
çözeltisi olarak aktarılır. Doğada, belki de ölümden ve hücre parçalanmasından sonra bazı
bakteriler DNA'larını çevreye bırakırlar. Diğer bakteriler daha sonra DNA ile karşılaşabilir ve
belirli türlere ve büyüme koşullarına bağlı olarak DNA parçalarını toplar ve bunları
rekombinasyonla kendi kromozomlarına entegre eder. Transformasyon, verici ve alıcı hücreler
çok yakından ilişkili olduğunda en iyi şekilde çalışır.
Bir transformasyon sisteminde iki eleman gereklidir. İlk eleman uygun bir konakçı bakteridir.
Bunun için, genellikle E.coli' yi konakçı organizması olarak kullanıyoruz. E.coli suşu
laboratuarda kültürlenmiştir ve moleküler biyoloji laboratuvarında özellikle yararlı
özelliklerinden dolayı kullanılır. Plazmid, transformasyon sistemindeki diğer önemli unsurdur.
Plazmid, transformasyondan sonra bakteride eksprese edilen bazı enzimleri ve antibiyotiğe
dirençli marker' leri kodlar. Transformasyon meydana geldiğinde, transfer edilen DNA genellikle
bir plazmiddir: birçok bakteride doğal olarak bulunan küçük, dairesel DNA. Plazmid ekstra
kromozomal DNA olarak bulunur ve bakterinin normalde sahip olamayacağı bazı genleri içerir.
Bu ekstra genler, amilaz, beta-laktamaz gibi bir enzim salgılayarak insert edilen DNA' nın
eksprese edildiğini anlatabilir.
İki tür transformasyon vardır: doğal ve yapay, her süreç organizmanın DNA'yı konakçı hücrelere
transforme etme yeteneğine bağlıdır. Doğal transformasyonda bakteriler doğal olarak DNA'yı
kullanabilirler, bu da DNA'yı çevrelerinden doğrudan alabilmeleri anlamına gelir. Bu tür
bakteriler doğal olarak dönüştürülebilir olarak adlandırılır. Yapay dönüşümde, bakteriler
çevreden DNA'yı almayan doğal olarak transforme edemezler. Bakteriyel hücreler, onları daha
geçirgen hale getirmek için belirli kimyasal veya elektriksel işlemlere maruz kalmıştır ve sonra
sadece geçirgen hücreler DNA'yı verimli bir şekilde alabilmektedir. Bakteriler, elektroporasyon,
ısı şoku, hücrelere kalsiyum iyonu ile müdahele etmek ve DNA'nın protoplast alımı gibi farklı
teknikler kullanarak yapay olarak DNA alabilirler. Bu tekniklerde, kalsiyum iyonu müdahelesi ile
DNA'ya geçirgen hale getirilmiş hücreler, hem tek iplikli hem de çift iplikli DNA' yı alacaktır. Bu
nedenle, hem lineer hem de çift iplikli halkasal plazmidler kimyasal olarak işlemden geçirilmiş
hücrelere verimli bir şekilde sokulabilir. Bu gerçek, klonlama ve plazmid ve faj DNA'sının
hücreye sokulmasını gerektiren diğer uygulamalar için çok yararlı kalsiyum iyonu kaynaklı
kompetantlık sağlamıştır.
Bakteriler, transformasyon olarak adlandırılan yeterlilik için duyarlı olabilmeleri için gerekli
moleküler özelliklere sahip olmalıdır. Doğal olarak kompetant bakterilerin plazmid veya faj
DNA'sı ile transformasyonu, genellikle sadece uzun konstantörlere dimerize edilen veya
multimerize edilen DNA'larla meydana gelir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
27.07.2018 Bakteriyel Transformasyon Yapımı
10.GÜN
Dimerize veya multimerize DNA, molekülün iki veya daha fazla kopyasının baş ve kuyruğa bağlı
olduğu bir DNA'dır. Eğer dimerlenmiş bir plazmid veya faj DNA'sı sadece bir kez kesilirse, yine
de plazmidin geri dönüşümü için yeniden birleştirilebilen tamamlayıcı sekanslara sahiptir.
Tasarlanan plazmid DNA'nın bakteriyel transformasyonu ve otonom replikasyon işlemi,
bakteriyel konakçı içinde ilgilenilen DNA'nın büyük miktarlarının üretilmesine izin verir. Bu,
klonlanmış DNA'nın daha fazla manipülasyonuna veya bakterinin kendi içindeki ilgili genin
ekspresyonuna izin verir. Üretilen protein yeni bir bakteriyel fenotipe neden olabilir veya
proteinin kendisi istenen son ürün olabilir.
 Transformasyon için kullanılacak bench % 70‟ lik etanol ile temizlenir.
 -80 santigrat derece de bekleyen kompetan hücreler dondurucudan çıkarılır.
 Isıtıcı 42 santigrata ayarlanır.
 1 mikrolitre ligasyon ürünü, 50 veya 100 mikrolitre kompetan hücrelerin üzerine
eklenir ve 20 dk buz üzerinde bekletilir.
 Ardından 1 dk 42 derecede kompetan hücrelerin porlarının açılması için bekletilir.
 1 dk ısı şokundan sonra tekrar 1 dk buzda bekletilir.
 1 dk sonunda hücrelere LB besiyeri eklenir ve 37 derecede 1 saat shaker‟ da inkübe
edilir.
 Antibiyotik(ampisilin, streptamisin) içeren LB agar plate‟ lere inkübe edilen hücreler
ekilir ve bütün gece büyütülür.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
30.07.2018 Rekombinant DNA’ ya Sahip Kolonileri Toplama
11.GÜN
LB Agar Plate’ lerden Koloni Toplama
Transformasyon için kullanılan ligasyon ürünü bir lentivirüs promotoru, reporter, antibiyotik
direnç geni ve Cry geni içermektedir. Ligasyon ürününde yer alan insert DNA‟ ların özellikleri şu
şekilde açıklanabilir.
Lentivirüs Promotoru: Bir lentiviral vektörün yeteneklerini anlamak için, enfeksiyon sürecinin
biyolojisini göz önünde bulundurmak gerekir. Lentivirüs bir retrovirüstür, yani bir ters
transkriptaz enzimine sahip tek iplikçikli bir RNA genomuna sahiptir. Lentivirüsler ayrıca,
konakçı hücrenin dış zarına tutunmaya yardımcı olan çıkıntılı glikoproteinlerle birlikte bir viral
zarf içerir. Virüs, hücreye girdikten sonra viral genetik materyalin transkripsiyonunu
gerçekleştirmek için bulunan bir ters transkriptaz molekülü içerir. Viral genom içinde, viral
sekansların konak hücre genomuna dahil edilmesini kolaylaştıran spesifik proteinleri kodlayan
RNA sekansları vardır. Virüsün kapsid, matriks, nükleoproteinler gibi yapısal bileşenleri için
"gag" domaini, ters transkriptaz ve integraz enzimleri için "pol" domaini, virüsün yüzeyindeki
glikoproteinleri ve zarfı için "env" domaini vardır. Viral materyal konakçı hücrenin
sitoplazmasına enjekte edilir. Sitoplazmada, viral revers transkriptaz enzimi, viral DNA
genomunu oluşturmak için viral RNA genomunun ters transkripsiyonunu gerçekleştirir. Viral
DNA daha sonra konakçı hücrenin çekirdeğine gönderilir, burada konakçı hücrenin genomuna
viral enzim entegrasyonu yardımıyla dahil edilir. Bundan sonra, konakçı hücre tüm viral RNA'yı
transkribe etmeye ve yapısal viral proteinleri, özellikle viral kapsidi ve zarfı oluşturanları ifade
etmeye başlar. Lentiviral RNA ve viral proteinler bir araya getirilmeden ve yeni oluşturulmuş
viryonlar yeterli olduğunda konakçı hücreden patlar. Promoterler, vektörün transgeni ve ayrıca
antibiyotik direnç geni gibi vektördeki diğer genlerin transkripsiyonunu yürütmek için kullanılır.
Antibiyotik Direnç Geni: Antibiyotik, herhangi bir mikroorganizma tarafından, başka bir
mikroorganizmayı öldürmek veya çoğalmasını durdurmak için üretilen her türlü madde.
Antibiyotikler etkili oldukları mikropların metabolik işlemlerine müdahale ederek çalışırlar.
Antibiyotikler müdahale ettikleri metabolik işlemlere göre spesifiktir. Bu metabolik işlemlere
örnek olarak; protein sentezi, hücre çeperi sentezi, nükleik asit sentezi veya hücre zarı
fonksiyonlarını verilebilir. Antibiyotik direnci, bir antibiyotik, bakteriyel büyümeyi etkili bir
şekilde kontrol etme veya öldürme yeteneğini yitirdiğinde ortaya çıkar; Başka bir deyişle,
bakteriler "dirençli" dir ve bir antibiyotiğin terapötik seviyelerinin varlığında çoğalmaya devam
ederler. Antibiyotik direnç geninin görevi ise antibiyotik bulunduran LB agar' da çoğalan
kolonilerin rekombinanat koloniler olduğunu göstermektir.
Cry Geni: Bu gen rekombinant sistemin mavi ışığa yanıt vermesini sağlayarak biyolojik saat
proteinlerini uyarır.
Koloni Toplama:
 1000X Ampisilin‟den 100 mikrolitre 100 mililitre LB mediumun içerisine eklenir.

 Transformasyondan sonra LB agar plate‟ e ekilen rekombinant bakterilerden tek koloni
seçilip 5 mililitre ampisilin içeren LB besiyerine mikropipet ucu ile ekilir.
Plasmid izolasyonu deneyi için 37 santigrat derece de tüm gece inkübe edilerek bakteriyel
çoğalma sağlanır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
31.08.2018 Laboratuar Malzemelerini Tanıma ve Kullanma
12.GÜN
Biorad Transblot Turbo Transfer

Sistem Kullanım Talimatı
1. Cihazın fişi takılır.
2. On / Off düğmesine basılarak
cihaz açılır.
3. Cihazın çekmecesine örnek
hazırlanıp yerleştirilir.
4. Gerekli ayarlamalar ekran
üzerinden, tuşlarla yapılarak cihaz
çalıştırılır.
5. Program bittikten sonra
çekmeceden örnek çıkarılarak,
cihaz temizlenir.
6. Cihazın düğmesine basarak
kapatınız ve fişini çekiniz.
pH Metre Kullanım Talimatları

1. On / Off anahtarına basarak cihaz
açılır.
2. Solüsyon içerisindeki PROB‟ u
çıkararak saf distile su ile yıkanır.
3. Prob pH‟ ın ölçüleceği solüsyon
içerisine daldırılır ve ölçüm
yapılır.
4. İşlem bittikten sonra prob saf
distile su ile temizlenir ve
saklandığı solüsyon içerisine
yerleştirilir.
5. Cihaz düğmesine basılarak
kapatılır.
6. pH metrenin ölçüm probunun
zarar görmemesine, kurumasına ve
kirli kalmamasına dikkat
edilmelidir. Saklama solüsyonu
sıklıkla kontrol edilmelidir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
12.GÜN
Manyetik Karıştırıcı Kullanım
Talimatları
2. On / Off düğmesine basılarak
cihaz açılır ve örnek cihazın
üzerine bırakılır.
3. MODE tuşunu kullanarak
döndürme hızı, sıcaklık ve
zaman ayarı yapılabilir. Düğme
çevirilerek istenilen ayarlar
yapılabilir.
4. İşlem bittikten sonra On / Off
düğmesine basılarak cihaz
kapatılır.
5. Cihaz fişten çekilir.
Soğutmalı Ependorf Santrifüj

(VWR Microstar 17R) Kullanım
Talimatı
2. On / Off anahtarına basılarak
cihaz açılır.
3. “OPEN” düğmesine basılarak
kapak açılır ve örnek
yerleştirilip kapak kapatılır.
4. Cihaz üzerindeki “SPEED”
tuşundan RPM/RCF ayarlarını
ve “TIME” tuşundan süreyi ve
“TEMPERATURE” tuşundan
sıcaklık ayarlanır. Cihazın
önceden soğuması istenilirse
“COOL” tuşuna basılmalıdır.
5. Program bittikten sonra
“OPEN” tuşuna basarak örnek
çıkarılır.
düğmesine basılarak cihaz
kapatılır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
12.GÜN
Ependorf Santrifüj (VWR Microstar
17) Kullanım Talimatları
2. On / Off anahtarına basılarak cihaz
açılır.
3. “OPEN” düğmesine basılarak kapak
açılır ve örnek yerleştirilip kapak
kapatılır.
4. Cihaz üzerindeki “SPEED” tuşundan
RPM/RCF ayarlarını ve “TIME”
tuşundan süreyi ve
sıcaklık ayarlanır. Cihazın önceden
soğuması istenilirse “COOL” tuşuna
basılmalıdır.
5. Program bittikten sonra “OPEN”
tuşuna basarak örnek çıkarılır.
düğmesine basılarak cihaz kapatılır.
Soğutmalı Santrifüj (Thermo Hereus

Megafuge 8R) Kullanım Talimatları
açılır.
3. “OPEN” düğmesine basılarak kapak
açılır ve örnek yerleştirilip kapak
kapatılır.
4. Cihaz üzerindeki “SPEED” tuşundan
RPM/RCF ayarlarını ve “TIME”
tuşundan süreyi ve
sıcaklık ayarlanır. “SOFT ACC” ve
“SOFT DEC” tuşundan
hızlanma/frenlenme ayarı yapılabilir.
Cihazın önceden soğuması istenilirse
“COOL” tuşuna basılmalıdır.
6. İşlem bittikten sonra kapak
kapatılıp, On / Off düğmesine
basılarak cihaz kapatılır.

YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
13.GÜN
Isı Bloğu Kullanım Talimatları
açılır.
3. “DERECE” işaretli tuştan sıcaklık,
“SAAT” işaretli tuştan zaman
ayarı yapılır. “STAR” tuşuna
basılarak istenilen sıcaklığa
ulaşılması beklenir.
5. İşlem bittikten sonra kapak
kapatılıp, On / Off düğmesine
basılarak cihaz kapatılır.
Güç Kaynağı (Biorad)

Kullanım Talimatları
1. Cihazın fişi takılır ve
On / Off düğmesinden
cihaz açılır.
2. Cihazın ön kısmında
sol ve sağda bulunan
kırmızı-siyah kısımlara
uygun bağlantılar
yapılır.
3. İlgili ayarlar cihazın
üzerindeki tuşlar
kullanılarak yapılır.
Daha sonra “RUN”
tuşuna basılarak işlem
başlatılır.
4. İşlem bittikten sonra
cihaz kapatılır ve
cihazın fişi çekilir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
13.GÜN
Etüv Kullanım Talimatları

1. Cihazı On / Off tuşuna
basılı tutularak açılır.
2. Menüden sıcaklık
butonuna(en üstte yer
alan) bastıktan sonra
“OK” tuşu kullanılarak
sıcaklık ayarı yapılır.
Malzemeler veya örnek
cihaza yerleştirilir.
cihaz boşaltılır.
4. Kapak kapatıldıktan
sonra, cihaz düğmesine
basılarak kapatılır.
Orbital Shaker Kullanım

Talimatları
2. On / Off tuşuna basılı
tutularak cihaz açılır.
3. Kapak kaldırılarak
numunenin
yerleştirileceği bölmeye
örnekler yerleştirilir ve
bölme kapatılır.
4. Gerekli ayarlamalar
ekran üzerinden, tuşlarla
yapılarak cihaz
çalıştırılır.
kapak kaldırılarak
örnekler çıkarılır.
6. Kapağı kapattıktan
sonra cihaz düğmesine
basılarak kapatılır ve fiş
çekilir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
02.08.2018 Hücre Kültürü Besiyerinin Özelliklerini Tanıma
14.GÜN
Hücre Kültürü Besiyerleri:
Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini
sürdürebilmeleri için gerekli olan mikro çevreyi sağlayan besleyici solüsyonlardır. Hücre kültürü
besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini
desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH sıcaklık ve nemin
sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite
ve pH‟ı da sağlarlar. Besiyeri ihtiyacı hücrelerin tipine, adaptasyon kabiliyetine ve hücre kaynağı
organizmanın türüne göre farklılık gösterir. Hücreler farklı besiyerlerinde farklı davranabilirler.
Bu yüzden çalışmanın amacına göre hücrenin besiyeri ihtiyaçlarının belirlenmesi gerekir.
Hücrelerin canlılıklarının devamı ve çoğalmaları için aminoasitler, karbonhidratlar, lipidler,
vitaminler, iyonlar ve proteinlerin ortamda bulunması şarttır. Standart bir besiyerinde yukarıdaki
bileşenlerin sağlanması için iki temel solüsyon uygulanır:
1) Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)

Hücre kültürlerinde olması gereken temel aminoasit kombinasyonu ilk defa Eagle tarafından
1955‟de tanımlanmıştır. Kendi ismini taşıyan Minimum Eagle‟s Medium (MEM) isimli besiyeri
bazı modifikasyonlarla bugüne kadar gelmiştir. Dulbecco tarafından modifiye edilen MEM
solüsyonu bugün somatik hücre kültürlerinde en sık kullanılan besiyeri bileşenidir.
DMEM hücrelerin beslenebilmeleri için gerekli glukoza, canlılıklarını sürdürebilmeleri için
uygun ozmolarite ve pH‟a, fonksiyonlarını görebilmeleri için gerekli aminoasitlere ve vitaminlere
sahiptir. Ancak tek başına hücre gelişimi için yeterli değildir.
2) Fetal Bovine Serum

Serum hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak
tanımlanmamış zengin bir protein çözeltisidir. Bu protein çözeltisinin içinde hormonlar, enzimler,
hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesini
sağlayan hücreler arası matris proteinleri bulunur. Hücre çeşidine ve uygulamalara göre
besiyerindeki serum oranı değişebilir. Standart bir somatik hücre kültüründe serum oranı %10
„dur. Serum üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Sığır embriyolarının kanlarının toplanmasıyla
hazırlanan serumların üretiminde bir standart yoktur. Farklı hayvanlardan elde edilen serumlar
birbirlerinden farklılık gösterirler. Bu da deneylerin sonuçlarını etkilemektedir. Bu
dezavantajlarından dolayı bazı laboratuarlar serumsuz besiyerlerini kullanmaktadırlar. Serum
kullanılmayan bir besiyerinin çeşitli büyüme ve tutunma faktörleriyle desteklenmesi gerekir, bu
da çalışmaya göre serumdan daha pahalı olabilir.
3)Schneider's Drosophila Medium

Birçok böcek doku kültür ortamı, spesifik böceklerin vücut sıvısının ana fiziko-kimyasal
özelliklerini taklit edecek şekilde formüle edilmiştir. L-Glutamin ile birlikte Schneider'in
Drosophila Ortamı, meyve, muz, meyve ezmesi, sirke ve şarap sineği olarak bilinen Drosophila
melanogaster'den türeyen primer ve yerleşik hücre kültürlerinin hızlı büyümesini desteklemek
için tasarlanmış ve optimize edilmiş bir ortamdır. Bu ortam, orijinal olarak diğer çift kanatlılar
türlerin hücre kültürüne ek olarak Drosophila embriyolarından Schneider tarafından türetilen
hücre dizilerinin büyümesi ve korunması için kullanılmıştır. Drosophila melanogaster, genetik
araştırma dünyasında muhtemelen en tanıdık ve iyi bilinen bir böcektir ve genetik, davranış,
yaşlanma, gelişim biyolojisi ve evrimin ilerlemesine büyük ölçüde katkıda bulunan kilit bir
modeldir.
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
02.08.2018 Hücre Kültürünü Tanıma
14.GÜN
Hücre Kültürü
Memelilerin bilimsel deneylerde kullanılmasının mümkün olduğunca kısıtlanması gerekliliği,
biyomedikal çalışmaların farklı pek çok alanında hücre kültürlerinin geliştirilmesi ve
kullanılmasına yol açmıştır. Hücre kültürleri mikrobiyolojide özellikle virüslerin üretilmesi ve
tanımlanması, virüs aşılarının üretimi amacıyla kullanılmaktadırlar. Yeni yüzyılda ise kanser
araştırmalarının hız kazanması ile özellikle kanser ilaçlarının geliştirilmesinde, etkilerinin
saptanmasında hücre kültürleri özellikle büyük önem kazanmıştır.
Hücre hattı nedir?
Hücre kültürü bitki veya hayvanlardan ekstrakte edilen hücrelerin daha sonrasında yapay bir
ortamda büyütülmesi olarak adlandırılmaktadır. Hücreler dokudan direk veya enzimatik ve
mekanik yöntemlerle parçalara ayrılarak kültüre alınabilirler. Primer hücre kültürü hücrelerin
dokudan izole edildiklerinden sonraki aşamayı ve uygun koşullar altında hücre çoğalması için
ortamdaki tüm ulaşılabilir substratları kullanmasını ifade eder. Bu aşamada hücrelerin
büyümesini devam etmesi için yeni medium ve daha fazla alan içeren yeni kaba aktarılması
yoluyla alt kültüre alınması gereklidir. İlk alt kültürden sonraki primer kültür hücre hattı veya alt
klon olarak bilinen hale dönüşür. Primer kültürden elde edilen hücre hatları sınırlı yaşam ömrüne
sahiptir ve en yüksek büyüme kapasitesine sahip predominant hücrelerden dolayı pasajlandıkça
populasyon genotipik ve fenotipik olarak homojen hale gelir.
Normal hücreler çoğunlukla çoğalma kabiliyetlerini kaybetmeden önce sınırlı sayıda bölünme
yeteneğine sahiptir. Bu durumu genetik olarak belirlenmiştir ve hücresel yaşlanma olarak
bilinmektedir. Bu yüzden bu hücre hatlarının sınırlı olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, bazı
hücre hatları spontan, viral ya da kimyasal uyarılma yoluyla transformasyon süreci sırasında
ölümsüz hale gelmektedir. Eğer sınırlı hücre hattı transformasyona uğrar ve sınırsız sayıda
bölünme yeteneği kazanırsa, sürekli hücre hattı haline gelir.
Hücre kültür türleri
Süspansiyon hücre kültürü; süspansiyon hücreler ortamda asılı durmuş şekilde büyürler. Bu
hücreler, kültür şişesine bağlanmadan hayatta kalabilir ve çoğalabilirler. Kan, dalak, kemik iliği
ve özellikle tam gelişmemiş hücreler süspansiyon şeklinde büyüme eğilimindedirler. Süspansiyon
içindeki hücreler küçük toplar gibi görünürler. Süspansiyon büyümenin avantajı çok sayıda
hücreyi büyütebilmek ve kolayca kültürden toplayabilmektir.
Yapışkan hücre kültürü; yapışkan hücreler tek tabaka halinde, yüzeye tutunarak büyürler.
Ektodermal ve endodermal embryonik hücre tabakalarından türeyen hücreler yapışkan bir şekilde
büyüme eğilimindedirler. Bunlar, fibroblast ve epitel hücrelerini içerir. Yapışkan hücreler değişik
şekillerde olabilirler, fakat genellikle düzdürler. Süspansiyon halde büyütülen aynı hücreler
yuvarlak olabilirler. Yapışkan büyümenin avantajı, hücreleri lamel gibi yüzeylere yayabilmek ve
yapıştırabilmektir. Bu özellikler, mikroskop, hibridizasyon ve fonksiyonel testlerde kolaylık
sağlar.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
03.08.2018 Hücre Kültür Ortamı ve Kültür Şartları
15.GÜN
Hücre kültür ortamı ve kültür şartları
Gerekli besinleri, büyüme faktörlerini ve hücre büyümesi için gerekli hormonları sağladıklarında
dolayı kültür ortamı kültür çevresinin en önemli bileşenidir. İlk hücre kültürü deneyleri doku
ekstraktları ve vücut sıvılarından elde edilen kültür ortamı ile gerçekleştirilmesine rağmen kültür
ortamında standartizasyona ihtiyaç vardır. Kültür ortamları destek olarak kullanılan serum
ihtiyacına göre; Temel medium, Serum-azaltılmış medium ve Serumsuz medium olmak üzere üç
sınıfa ayrılırlar. Serum; büyüme, adezyon faktörleri, hormonlar, lipidler ve mineral kaynağı
olarak temel besiyerinde ki kültür hücreleri için son derece önemlidir. Ek olarak serum hücre
membranı geçirgenliğini düzenler ve lipidler, enzimler, mikrobesinler ve eser elementlerin
taşıyıcısı olarak görev alır.
Bununla birlikte serum kullanımının yüksek maliyet, standartizasyon problemleri, spesifiklik,
değişkenlik ve büyümenin ve/veya hücresel fonksiyonların uyarılması-baskılanması gibi
istenmeyen etkilere yol açması gibi dezavantajları vardır.
Temel medium: Hücre hatlarının büyük çoğunluğu amino asitler, vitaminler, inorganik tuzlar ve
glukoz gibi karbon kaynakları içeren temel besiyeri içinde iyi gelişirler. Fakat temel besiyeri
içeriği serum ile desteklenmelidir.
Serumu azaltılmış medium: Hücre kültürü deneylerinde istenmeyen etkileri azaltmanın bir yolu
serum azaltılmış medium kullanımıdır. Serum azaltılmış medium temel medium içeriğinin
besinler ve hayvan kaynaklı faktörlerle zenginleştirilmesiyle oluşur. Bu durum serum ihtiyaç
miktarının azalmasına sebep olur.
Serumsuz medium: Serumsuz medium (Serum-free media, SFM) serum yerine uygun besinsel
ve hormonal içeriklerin formulasyona koyulmasıyla hayvan serumundan doğacak durumların
önüne geçer. Serumsuz medium formulasyonları çoğu primer kültür ve hücre kültürler için vardır.
Serumsuz medium kullanımının büyük avantajlarından biri uygun büyüme faktörlerinin
kombinasyonuyla kültür ortamını seçici hale getirerek spesifik hücre tiplerinin seçilebilmesine
olanak sağlamasıdır. Normal memeli hücre hatlarının çoğu pH 7.4‟te iyi gelişirler ve farklı hücre
soylarında çok az değişiklik olabillir. Bununla birlikte transforme hücre hatları hafif asidik
ortamda (pH 7.0-7.4) daha iyi büyüme gösterirler ve bazı normal fibroblast hücre hatları hafif
bazik ortamı (pH 7.4-7.7) tercih ederler.
Büyüme medium‟u pH‟ı kontrol eder ve kültürdeki pH değişimlerine karşı hücreler tampon
oluşturur. Genellikle organik (örneğin HEPES) veya 𝐶𝑂2 -bikarbonat tamponlar kullanılır.
Medium‟un pH‟ı çözünmüş karbondioksit (𝐶𝑂2 ) ve bikarbonat (HCO3-) dengesine bağlıdır ve
atmosferik 𝐶𝑂2 değişimi medium pH‟ını değiştirebilir. Bununla birlikte 𝐶𝑂2 -bikarbonat
tamponlar kullanılırken dışarıdan 𝐶𝑂2 kaynağı kullanımı gereklidir.
Hücre kültürü optimal sıcaklığı, hücreleri izole edildiği konakçının büyük oranda vücut
sıcaklığına bağlıdır ve anatomik varyasyonlara göre az derecede değişiklikler olabilir (örneğin
deri sıcaklığı iskelet kası sıcaklığına göre daha düşük olabilir). Hücre kültürünü aşırı ısıtma az
ısıtmaya göre daha ciddi bir problemdir, bu yüzden inkübatör sıcaklığı optimal sıcaklığın çok az
altına ayarlanabilir. Çoğu insan ve memeli hücre hatları optimal büyüme için 36-37oC sıcaklığa
ihtiyaç duyar.

YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
16.GÜN
Hücre Kültüründe Kullanılan Malzemeler
 Flasklar (25‟ lik ve 75‟ lik)
 Multi-well plate(6,12,24,96 well plateler)
 Pipetler ve pipetörler
 Besiyeri / Medium
Ekipmanlar
 Laminar flow kabin(Hücre kültür kabini)
 İnkübatör(𝐶𝑂2 𝑖𝑛𝑘ü𝑏𝑎𝑡ö𝑟)
 Santrifüj
 Inverted mikroskop
 Su banyosu
 Buzdolabı ve Derin dondurucu
Hücre kültürü mutlaka hava akışlı kabinler içerisinde çalışılır. Kabin açıldıktan sonra % 70‟ lik
alkol ile yüzey ve kabine alınacak malzemeler temizlenir. İnkübatör hücrelerin büyümesi için
gereken ortama sahiptir. % 5 𝐶𝑂2 seviyesi ve 37 oC‟ ye ayarlıdır. Hücreler inverted mikroskopta
her gün kontrol edilir. Gerekli ise besiyerleri değiştirilir veya başka flasklara aktarılırlar. Bunun
dışında laboratuarlarda kullanılan başka aletler de mevcuttur. pH metre, ısıtıcılı manyetik
karıştırıcı, hassas terazi, shaker, elektroforez sistemleri, mikroplate okuyucu, ChemiDoc
Kemilüminesans Görüntüleme Cihazı, ışık mikroskopu, floresan mikroskopu.
Stoktan Hücre Açma

Hücreler gelecekte kullanılmak için dondurulup bir stok oluşturulur. 6 ay veya daha kısa süre
içerisinde kullanılmak üzere dondurulan hücreler -80 oC de saklanırken daha uzun süre
kullanılmak istenen hücreler sıvı nitrojen (-196 oC) içinde muhafaza edilir.
Hücreler donarken yavaş yavaş, çözerken hızlı bir şekilde çözünürler. Çünkü dondururken
kullanılan DMSO hücrelerin arasına girerek donar ve çözüldüğünde hücrelere zarar verir.
Hücreleri DMSO‟ dan uzaklaştırmak için çözme işlemi mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
1. Kriyotüp -80 oC‟ den alınıp avuç içinde ısıtılarak eritilir.
2. Hücrelerin bulunduğu kriyotüp hood‟ un içinde açılır ve 1 ml frozen mix içinde
dondurulan hücreler alınıp 15 ml flaska aktarılır.
3. Hücre için kullanılan uygun medium flaska osmotik basıncı dengelemek için damla
damla eklenir. Santrifüje koymadan önce falkonlardaki miktarların eşit olup olmadıkları
kontrol edilir. Eğer eşit değilse medium eklenerek eşit miktara getirilirler ve santrifüje
dengeli bir şekilde yerleştirilirler.
4. Hücreler 1500 rpm‟ de 5 dakika santrifüj edilir ve hücreler pellet olarak falkonun dibine
çöker.
5. Santrifüj esnasında hücrelerin konulacağı T25‟ lik flasklar etiketlenir. Her birinin üzerine
hücre adı, pasaj numarası, tarih ve açan kişinin adı yazılır.
6. T25‟ lik flaska 4 ml medium eklenir.(Hücreler stoktan ilk açıldıklarında 25‟ lik flasklara
eklenirler. Çünkü büyümeleri ve çoğalmaları için birbirlerinden sinyal almaları gerekir.
25‟ lik flaskta birbirlerine yakın büyürler ve gerekli sinyalleri alabilirler. Daha sonra
pasajlandıklarında T75‟ lik flasklara alınırlar. T25‟lik flask 5 ml medium alır. Hücreler 1
ml medium ile çözüldüğü için 4 ml medium+ 1ml hücre süspansiyonundan alınır.)


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
16.GÜN
7. Çözüldükten sonra hücre süspansiyonu flaska eklenir ve yatay şekilde çevrilirler.(Bu
şekilde hücreler tüm yüzeye yayılabilir.)
8. Flask yatay şekilde tutularak hücrelerin tüm yüzeye dağılması için çevrilir. Mikroskopta
kontrol edildikten sonra flaskın ağzı alkollenerek inkübatöre kaldırılır.
Medium Değiştirme
Memeli hücrelerinin genellikle 2-3 günde bir besiyerlerinin değiştirilmesi gerekir. Mediumları
yenilenmediğinde hücreler ölmeye başlar. Hücreler mikroskopta kontrol edilir ve eğer
pasajlanmaları gerekmiyorsa (konfluentlikleri %90-100‟ e ulaştığında mutlaka pasajlanmaları
gerekir.) hücrelerin mediumu değiştirilir. Hücrelerin durumu her gün önce gözle sonra
mikroskopla kontrol edilir. Flask içindeki besiyeri sarıya dönmüşse ortam asitlenmiştir.
Hücrelerin mediumu mutlaka değiştirilmelidir yada gözle görünebilen bir bulanıklık varsa fungal
kontaminasyon olmuştur medium değiştirilmelidir. Gözle kontrollerden sonra mikroskopla da
hücrelerin durumu kontrol edilmelidir. Hücreler pasajlanması gerekiyorsa pasajlanır yada
mediumları değiştirilerek taze besin kaynağı sağlanır.
1. Medium 37 oC‟ ye ısıtılır.(Mediumlar +4 oC‟ de saklanır. Hücrelere eklenmeden önce
ısıtılmalıdır yoksa hücrelere şok etkisi yaratabilir ve hücreleri kaldırabilir.)
2. Hood‟ un içi alkolle temizlenir ve tüm materyaller alkollenerek alınır.
3. Hücrelerin mikroskopta yaşayıp yaşamadıkları ve konfluentleri kontrol edilir.
4. Flasktan eski medium çekilir ve PBS eklenir.
5. PBS ile yüzey birkaç kere yıkandıktan sonra uzaklaştırılır.
6. Flaskın ebatına göre yeni medium eklenir.(T25‟ lik flask 5 ml medium alırken, T75‟ lik
flask 10 veya 15 ml medium alabilir.)
7. Flask yatay bir şekilde hafifçe çalkalanır ve mediumun her tafra yayılması sağlanır.
8. Hücreler mikroskopta kontrol edildikten sonra inkübatöre yerleştrilir.
Hücre Pasajlama
Hücreler büyüdükleri flaskta belli bir konfluentliğe ulaştıkları zaman pasajlanırlar. Hücrelerin
pasajları geciktiği taktirde besin ve alan yetersizliğinden dolayı büyümeleri durur ve zamanla
birbirlerine toksik etki göstermeye başlarlar. Hücreler yüzeyi kapladıklarında pasaj yapılmaları
uygundur. Pasajlama süresi hücre tipinden tipine farklılık gösterir. Bazı hücreler 3-4 günde
pasajlanması gerekirken bazıları bir haftada pasajlanabilir.
1. Hücre mediumu, PBS ve tripsin-EDTA su banyosunda 37 oC‟ ye ısıtılır.
2. Hücreler 𝐶𝑂2 inkübatöründen alınır ve mikroskopta incelenir.
3. Flasklar açılır ve serolojik pipetle medium yavaşça çekilir.
4. Hücre tabakasına zarar vermeden flaska PBS eklenir, yüzey yıkanır ve PBS yavaşça
çekilir. Yüzeyden PBS birkaç kez çekilerek hücreler iyice yıkanır.
5. Yeni bir pipet ile ortama tripsin-EDTA eklenir ve flask 2-3 dakika 𝐶𝑂2 inkübatöründe
tutulur. Bazı hücreler 5 dakikada kalkarken bazıları 1-2 dakika içinde kalkabilir.
6. İnkübatörden alındıktan sonra hücrelerin kalkması için flaska el yardımıyla alt
köşesinden çok sarsmadan kuvvet uygulanır. Mikroskopta hücrelerin kalkıp kalkmadığı
kontrol edilir.
7. Hücreler serbest ise flaska tripsinin yaklaşık 2-3 katı miktarda yeni medium eklenir ve
santrifüj tüpüne aktarılır.(Mediumun içindeki FBS tripsini inhibe eder, tripsinin
hücrelerer zarar vermemesi için tripsinden daha fazla medium ile santrifüj yapılır.)


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
17.GÜN
8. Hücreler 1500 rpm‟ de 5 dakika santrifüj edilirler.
9. Santrifüj sırasında hücrelerin aktarılacağı yeni flasklara hücre hattı ismi, pasaj numarası,
pasaj tarihi yazılır ve yeni medium eklenir.
10. Supernatant dökülür geri kalan medium pipet yardımıyla uzaklaştırılır. Hücre pelletini
çözmek için tüpün dibine birkaç defa hafifçe vurulur.
11. Tüpe 1 ml yeni besiyeri eklenerek pellet pipetlenir ve iyice çözülmesi sağlanır.
12. Hücre süspansiyonu yeni flaska eklenir ve flask yatay şekilde hafifçe çalkalanıp
hücrelerin tüm yüzeye dağılması sağlanır.
13. Hücreler mikroskopta kontrol edilir ve flaskların ağız kısımları alkollenerek inkübatöre
kaldırılır.
Hücre Dondurma
Gelecek çalışmalarda kullanmak için hücre hatları stoklanabilir. Hücreleri muhaza etmek
senesense girmelerinden kaçınmak ve kontaminasyon riskini düşürmek amacıyla hücre hatları
uzun süreli saklanmak için dondurulabilir. Hücreler dondurulurken mutlaka kriyoprotektanlar
kullanılır. Çoğunlukla DMSO tercih edilir. Bunun dışında gliserol, sükroz, etilen glikol vb. de
kriyoprotektan olarak kullanılabilir. Hücreler kriyotüp deniel -196 oC‟ ye kadar dayanıklı tüpler
içerisinde dondurulur.
DMSO: Dimetil sülfoksit. Hücre kültüründe % 10 olarak hücreleri dondurmak için kullanılır.
Donarken oluşan buz kristallerinin sivri uçları hücrelerin patlamasına neden olur. DMSO bu
sivrileşen kısımların hücrelere zarar vermesine engel olur. Donarken hücrelerin arasına girerek
donar ve eridiğinde hücreler için toksik etki yapar.
Frozen Mix: %10 DMSO + % 90 FBS(yatak oluşturur ve donarken üst üste gelen hücreler
patlamazlar)
1. İnkübatörden dondurulacak hücrelerin flaskları alınır ve mediumları boşaltılır.
2. Hücrelerin üzerine PBS eklenir. PBS ile flaskın yüzeylerinden birkaç kez geçilerek
yıkanır.
3. PBS uzaklaştırılıp tripsin-EDTA eklenir.
4. Flasklar inkübatöre yerleştirilip hücrelerin kalkması için bir süre beklenir.
5. Hücrelerin kalkıp kalkmadıkları kontrol edildikten sonra hücreler 15 ml falkona aktarılıp
üzerlerine medium eklenir.
6. 5 dakika 1500 rpm‟ de santrifüj yapılır.
7. Santrifüj sırasında hücrelerin kaldırılacakları kriyotüpler etiketlenir. Santrifüjden sonra
üst sıvı uzaklaştırılıp pellet 1 ml frozen mix ile çözülür.
8. Kriyotüpler -80 oC‟ ye kaldırılırlar.(Hücreler 6 aya kadar -80 oC‟ de muhafaza
edilebilirler. 6 aydan daha fazla saklanması için sıvı nitrojene(-196 oC) kaldırılır)


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
18.GÜN
Hücre Sayımı
Hücre sayısını belirlemek genellikle hücre konsantrasyonunun bulunması için gerekir.
Hemositometre hücre sayısını belirleme yöntemlerinden birisidir.
1. Hücreler pasajlama metodunda anlatıldığı gibi tripsin ile kaldırılır. Santrifüjle çöktürülür
ve hücre pelleti elde edilir.
2. Pellet yoğunluğuna göre medium eklenir ve çözülür.
3. Lamel ve hücrelerin sayıldığı bölüm alkolle silinir.
4. Hücre süspansiyonundan 10 mikrolitre hemositometreye eklenir.
5. Inverted mikroskop altına hemositometre yerleştirilir ve 10X objectifte hücreler gözlenir.
6. Ortadaki daha yoğun kareli olan bölgedeki(1𝑚𝑚2 ) hücreler sayılır.( Hücreler sayılırken
el sayacı kullanılır.)
7. Ml başına hücre sayısını hesaplamak için hücre sayısı 104 ile çarpılır. Her bir kare 1x1
mm‟ dir ve derinlik 0,1 mm‟dir.
8. Örnekler dublike olarak hazırlanır ve sayılan hücre sayısının ortalaması alınır.
Sayılan hücre miktarı 104 ile çarpılıp 1 ml de okadar hücre olduğu kabul edilir. Buradan yola
çıkılarak deneylerde gerekli hücre konsantrasyonları hesaplanır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
09.08.2018 Kültür Edilen Hücrelerin Gözlemlenmesi
19.GÜN
Kültür Edilen Hücrelerin Gözlemlenmesi
Hücreler, yeni şişelere her transfer edileceklerinde veya deneyler için her
kullanılacaklarında mikroskopik ve makroskopik olarak gözlenmelidir. Eğer hücreler
sağlıklı değilse, deneyler de yolunda gitmez. Hücre kültürü şişesi inkübatörden
çıkarıldığında şunlar dikkatle incelenmelidir:
Birçok besiyeri ortamında asidik koşullarda sarıya, bazik koşullarda ise mora dönüşen pH
indikatörü vardır. Fazlasıyla asidik, ya da bazik ortam, kontaminasyonun, fazla büyümüş
kültürün, ölü kültürün ya da hatalı 𝐶𝑂2 dağılımının göstergesi olabilir. Ortamın
bulanıklığı kontaminasyonu veya aşırı büyümüş kültürü haber verir. Hücreler, şişede
veya petri kabında büyütülüyorsa invert mikroskopta 40X‟te gözlendikten sonra
deneylerde kullanılmalıdır. Yapışkan hücreler, yüzeyde düz bir tabaka şekinde yayılmış
olmalıdır. Süspansiyon hücreler ise küreseldir, fakat bazı hücreler yüzeye tutunmuş
olabilir. Kültürdeki hücrelerin morfolojilerinin düzenli olarak incelenmesi başarılı hücre
kültürü deneyleri için temeldir. Ek olarak hücrelerin sağlık durumunu doğrulamak, her
seferinde hücreleri göz ve mikroskopla incelerken kontaminasyon sinyallerininin erken
safhada belirlenmesini ve laboratuardaki diğer kültürlere yayılmasının engellemesini
sağlar. Nükleus çevresindeki granüler yapıları içeren bozulma işaretleri kültürün
kontaminasyonu, hücre hattının yaşlanması, mediumda toksik maddelerin bulunması
veya kültürün medium değişimine ihtiyaç duyduğunun işaret eden sebeplerden
kaynaklanabilir. Bozulmalara izin vermek geri dönüşümsüz etkilere yol açar.
Hücre Morfolojileri
Çoğu memeli kültür hücreleri morfolojilerine göre 3 temel kategoriye ayrılabilir.
Fibroblastik (veya fibroblast benzeri) hücreler bipolar veya multipolardırlar ve uzamış
şekile sahiptiler. Substrata bağlı olarak büyürler.
Epitel benzeri hücreler poligonaldır, daha düzgün boyutlu şekilleri vardır. Ayrık
kümeler halinde gelişirler.
Lenfoblast benzeri hücreler küresel şekillidirler ve yüzeye ihtiyaç duymadan
süspansiyon da büyüyebilirler.
Bu temel kategorilere ek olarak belirli hücreler konak da özelleştikleri spesifik morfolojik
karakterleri gösterirler. Nöronal hücreler farklı şekillerde ve büyüklükte olabilirler fakat
iki morfolojik kategoriye ayrılırlar. Tip I sinyalleri uzunluğu boyunca ileten uzun aksonlu
olanlar ve tip II aksonsuz olanlar. Tipik nöron hücreleri dendrit denilen hücre
gövdesinden uzanmış dallar şeklinde uzantılar gösterirler.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
09.08.2018 Kültür Edilen Hücrelerin Gözlemlenmesi
19.GÜN
Hücre Kültürü Kontaminasyonları
Hücre kültürü kontaminasyonunun iki ana formu vardır; Kimyasal ve biyolojik
kontaminasyonlar. Kimyasal hücre kültürü kirlenmesi, kültür sistemi üzerinde olumsuz
bir etkiye sahip olmayan hücre dışı bir madde ile bir hücre kültürünün karıştırılması
anlamına gelir. Bu maddeler;
1. Su, düzgün saflaştırılmış su da, aşırı derecede saf su da olabilir. Son derece saf su
aslında çok reaktiftir ve hücre kültürlerini oluşturmak ve sürdürmek için
kullanılan ekipmandan toksik kimyasalların sızmasına neden olabilir.
2. Bazı serum türleri, protein açısından oldukça zengindir.
3. Gram-negatif bakterilerin toksinleri olan endotoksinler.
4. Bazı besiyeri türleri floresan ışığa maruz kaldığında oluşan serbest radikaller.
5. Ağır metaller.
6. Plastik depolama tankları ve borularıdan plastik materyaller.
7. Ekipman üzerinde kalan deterjanlar ve dezenfektanlar.
Diğer ana hücre kültürü kontaminasyon türü, hücre kültürlerinin canlı organizmalar
yoluyla karıştırılması olan biyolojik hücre kültürü kirlenmesinden kaynaklanmaktadır:
1. Bakteriler
2. Maya
3. Küfler
4. Virüsler
5. Mycoplazma
6. Tek hücreli hayvanlar
7. Omurgasızlar
8. Diğer hücre hatlarından çapraz kontaminasyon
Bu biyolojik kirleticilerin kaynakları, uygun olmayan dezenfekte edilmiş malzemelerden
ve ortamdan havadaki parçacıklara kadar her şeyi içerir.
Şekil 5: Hücre Kültürü Kontaminasyonları


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
10.08.2018 RIPA Lysis Buffer Hazırlama ve Kullanma
20.GÜN
RIPA Lysis Buffer
RIPA (Radyo-İmmünopresipitasyon Deneyi) Lizis Tamponu, hem yapışık hem de süspansiyon
kültürlü memeli hücrelerinden proteinlerin hızlı bir şekilde, verimli hücre lizizi ile
çözündürülmesini sağlar. Pek çok antikor ve protein antijeni bu tamponun bileşenlerinden
olumsuz etkilenmediği için, uzun süredir geniş çapta kullanılan bir lizis ve yıkama tamponudur,
immünopresipitasyon gibi küçük ölçekli afinite düşürme uygulamaları için kullanılmaktadır.
Buna ek olarak, RIPA Lizis Tamponu, spesifik proteinlerin etkileşimini mümkün kılarken,
spesifik protein-bağlanma etkileşimlerini en aza indirirken, belirli protein-protein etkileşimleri ile
ilgili çalışmaları mümkün kılar. Aşağıdaki RIPA Lizis Tamponu bileşenleri, aşağıdaki etkilere
sahiptir:
Tris-HCI, bir tamponlama ajanı protein denatürasyonunu önler,
NaCl, spesifik olmayan protein toplanmasını önleyen bir tuzdur,
NP-40, proteinleri çıkarmak için iyonik olmayan bir deterjandır;
Na-deoksikolat ve SDS, proteinleri çıkarmak için iyonik deterjanlardır; ve
Sodyum azid, bakteriyel büyümeyi geciktirmek için eklenen bir bakteriyostatik ajandır. RIPA
Lizis Tamponu, hazırlık gerektirmeyen kullanıma hazır bir çözüm olarak tedarik edilir.
Kullanıcının kullanmadan önce bu ürüne dahil olmayan proteaz ve fosfataz inhibitörleri eklemesi
gerekir.
RIPA Tampon Özellikleri:
• Kullanışlı - kullanıma hazır solüsyon; bileşenler sonradan eklenmezamaya gerek yok
• Esnek - raportör tahlilleri, protein deneyleri, immünodeneyler ve protein saflaştırma da dahil
olmak üzere birçok uygulama için kullanılır
• Çok yönlü - sitoplazmik, membran ve çekirdek proteinlerinin ekstraksiyonunu sağlar
• Formülün açıklığı - tamponun içeriği açık bir şekilde belirtilmiştir.
 1% (w/w) Nonidet P-40 (NP-40)
 1% (w/v) sodium deoxycholate
 0.1% (w/v) SDS
 0.15 M NaCl
 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2
 2 mM EDTA
 50 mM sodium fluoride (NaF)
 0.2 mM fresh sodium orthovanadate
 100 U/ml protease inhibitor
Western blotting, ELISA, immünofloresan, İmmünopresipitasyon; protein arıtma; SDS-PAGE;
protein ifadesi, aktivite, modifikasyon, profil oluşturma, karakterizasyon ve kantitatif ölçüm için
analizler; epitop etiketleme; raportör gen analizi gibi alanlarda kullanılabilir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
10.08.2018 RIPA Lysis Buffer Hazırlama ve Kullanma
20.GÜN
Proteazlar, hücre içinde kan pıhtılaşması, besin sindirimi, apoptoz ve otofaji gibi birçok
önemli rol oynamaktadır. Bu süreçler hayati öneme sahiptir ve bu nedenle proteazlar,
organizmaların hayatta kalmasını sağlamak için verimli bir şekilde çalışmalıdır. Her
organizmanın her hücresinde birçok farklı proteaz türü vardır ve bu enzimler hücrenin
çeşitli bölgelerinde, farklı özellik ve etki mekanizmalarıyla çalışır.
Proteaz inhibitörleri, proteazların aktivitesini bloke eden moleküllerdir ve tipik olarak

benzer etki mekanizmalarına sahip proteaz sınıfları üzerinde işlev görürler. Proteaz
inhibitörleri ya proteinler, peptitler ya da küçük moleküller biçiminde olabilir. Doğal
olarak meydana gelen proteaz inhibitörleri genellikle proteinler veya peptitlerdir.
Deneysel çalışmalarda veya ilaç geliştirmede kullanılan proteaz inhibitörleri genellikle
sentetik peptit benzeri veya küçük moleküllerdir. Birçok farklı proteaz inhibitörü, hem in
vitro hem de in vivo analizlerde ve protein saflaştırmasında deneysel olarak kullanmak
üzere ticari olarak temin edilebilir.
Monolayer Memeli Hücre Kültüründe Liziz Prosedürü
1. Adherent hücreler, medium ile pipetaj yapılarak kaldırılıp toplanır ve santrifüj ile
dikkatlice medyumu uzaklaştırılır.
2. Hücreler iki kez soğuk 500 mikrolitre PBS ile yıkanır.
3. Hücrelere soğuk 150 mikrolitre RIPA Buffer ve 25 mikrolitre proteaz inhibitörü
eklenip 20 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
4. Hücre laıntılarını peletlemek için 15 dakika boyunca ~ 14,000 x g'de santrifüj
yapılır.
5. Hücre proteinleri supernatant da bulunur. Bradford protein assay ile
supernatanttaki proteinlerin konsantrasyonu bulunur.
Süspansiyon Memeli Hücre Kültüründe Liziz Prosedürü
1. Hücreler, 5 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüj ile peletlenir ve süpernatant
atılır.
2. Hücreler iki kez soğuk 500 mikrolitre PBS ile yıkanır. 5 dakika boyunca 2500 x
g'de pelet hücreleri santrifüj edilir.
3. Hücrelere soğuk 150 mikrolitre RIPA Buffer ve 25 mikrolitre proteaz inhibitörü
eklenir ve hücre pelleti iyice çözülür 20 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
4. Hücre kalıntılarını peletlemek için 15 dakika boyunca ~ 14,000 x g'de santrifüj
yapılır.
5. Hücre proteinleri supernatant da bulunur. Bradford protein assay ile
supernatanttaki proteinlerin konsantrasyonu bulunur.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
13.08.2018 BCA Protein Assay ile Protein Konsantrasyonunu
Belirleme
21.GÜN
BCA Protein Assay
Enzim kinetiklerini incelemeden, hücre fragmanlarının protein içeriğini belirlemeden ya da bir
çözeltinin bağlanma sabitini belirlemeye çalışmadan önce, çözeltinin protein konsantrasyonunun
ölçümü ile başlamak gerekir. Bir solüsyonun ne kadar protein içerdiği bilindiğinde, bir deneyin
sonuçları bir diğeriyle daha iyi karşılaştırılabilir. Bir dış etkinin protein üzerindeki etkisi daha iyi
incelenrbilir. Protein konsantrasyonunu ölçmek ve hesaplamak için üç standart yöntem vardır: 1.)
280 nm'de absorbans, 2.) BCA testi ve 3.) Bradford testi. Bu deneyde Brandford testini
kullanacağız.
BCA protein testi, bir örnekte toplam proteinin miktar tayini için kullanılır. Bu yöntemin
prensibi, proteinlerin, bir alkali solüsyonda (biuret reaksiyonu) Cu + 2 den Cu + 1 'e indirgenmesi
ve bicinchoninic asit ile mor renk oluşumunun ortaya çıkmasıdır. Bakırın indirgenmesi esas
olarak protein moleküllerinde bulunan sistein veya sistin, tirozin ve triptofan dahil olmak üzere
dört amino asit residuesinden kaynaklanır. Renk gelişim reaksiyonunun ikinci aşamasında,
bisinkoninik asit (BCA), birinci adımda oluşturulan indirgenmiş (bakır) katyon ile reaksiyona
girer. Yoğun mor renkli reaksiyon ürünü, iki BCA molekülünün bir bakır iyon ile şelasyonundan
kaynaklanır. BCA / bakır kompleksi suda çözünürdür ve artan protein konsantrasyonları ile 562
nm'de güçlü bir doğrusal absorbans sergiler. BCA reaktifi, ilk reaksiyonun soluk mavi renginden
yaklaşık 100 kat daha hassastır (saptama alt sınırı). Bununla birlikte, Coomassie boya-bağlama
yöntemlerinden farklı olarak, evrensel peptid omurgası aynı zamanda renk oluşumuna da katkıda
bulunur ve protein bileşimindeki farklılıkların neden olduğu değişkenliği en aza indirmeye
yardımcı olur. Bradford tahlili ile kıyaslandığında, BCA testi daha çok hedeflenmiştir çünkü
evrensel peptid omurgası aynı zamanda renk oluşumuna da katkıda bulunmaktadır. Bradford
tahlili ile karşılaştırıldığında BCA testinin bir dezavantajı, protein numunelerinde bulunan bazı
kimyasalların (DTT ve beta-merkaptoetanol), bakır şelatlayıcıların (EDTA, EGTA) ve yüksek
konsantrasyonlu tamponların dahil olduğu, enterferansa karşı duyarlı olmalarıdır.
Bicinchoninic Acid Protein Test Kiti
 Hazırlama Talimatları
BCA Working Reagent, 50 part A Reaktifi ile 1 part B Reaktifinin karıştırılmasıyla hazırlanır.
BCA Working Reagent, açık yeşil renkte oluncaya kadar karıştırılır. Standart deneyde, 20 part
BCA Working Reagent daha sonra 1 part protein numunesi ile karıştırılır. 96 well plate testi için,
8 part BCA Working Reagent, 1 part protein numunesi ile karıştırılır. Numune, bir BSA protein
standardı veya bilinmeyen bir örnektir. Blank, sadece buffer içerir, içerisinde protein yoktur.
BSA protein standardı, bilinen bir sığır serum albümini konsantrasyonundan oluşur ve
bilinmeyen numune, tahlil edilecek solüsyondur. BCA deneyleri rutin olarak 37 ° C'de
gerçekleştirilir. Renk gelişimi hemen başlar ve yüksek sıcaklıklarda inkübasyon ile hızlandırılır.
Daha yüksek hassasiyet veya daha uzun inkübasyon süreleri, artan hassasiyet için kullanılabilir.
Düşük sıcaklıklarda inkübasyon renk gelişimini yavaşlatabilir. 562 nm'de absorbans kaydedilir ve
protein konsantrasyonu belirlenip standart bir eğri oluşturulur. Standart eğriye bağlı olarak
protein konsantrasyonu belirlenir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
14.08.2018 Western Blot Aşamalarını Öğrenme ve Uygulama
22.GÜN
Western Blot
Western Blot, belirli bir örnekte bulunan belirli bir proteini tespit etmek için kullanılan kalitatif
ve yarı kantitatif analitik bir tekniktir. Yarı kantitatiftir çünkü tespit edilen proteinin tam miktarını
değil, hedef protein konsantrasyonunun kaba bir tahminini verir. Kullanılan örnek, çoğunlukla,
hücre, doku, bakteri veya virüsten ekstrakte edilen farklı proteinlerin bir karışımıdır. Bu teknik
kullanılarak, sadece bir proteinin yokluğu veya varlığı bilenmez, aynı zamanda spesifik bir
proteinin, yarı-kantitatif konsantrasyonu da bilinebilir. Western Blot da dört ana adım vardır:
1. Liziz ile örnek hazırlama - Hücreleri / Dokulardaki proteinleri çıkarmak için
2. Jel elektroforezi (SDS-PAGE) - proteinleri ağırlıkları temelinde ayırmak için
3. Blotting - Proteinleri numunenin içinden bir membrana transfer etmek
4. Tespit - bir raportör molekül ile etiketlenmiş antikorları ile proteinleri problama
Örnek Hazırlama
1. Örnek sayısı kadar ependorf hazırlanıp, etiketlenir.
2. 6 well plate‟ de bulunan örnekler pipetaj yapılarak kaldırılıp toplanır.
3. Örnekler , 5 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüj ile peletlenir ve süpernatant atılır.
4. Hücreler soğuk 500 mikrolitre PBS ile yıkanır. 5 dakika boyunca 2500 x g'de pelet
hücreleri santrifüj edilir.(Bu şekilde hücreler, besiyerinde bulunan serumdan
temizlenir.)
5. 5X Ripa solüsyonu 1,5X‟ e seyreltilir. Bu durumda 300 mikrolitre Ripa solüsyonu, 100
mikrolitre Proteaz inhibitörü, 600 mikrolitre distile su karıştırılarak liziz solüsyonu
hazırlanır.
6. Pellet haline gelen hücrelere, pelletin büyüklüğüne göre 100-150 mikrolitre arası liziz
solüsyonu eklenir ve köpürtmeden pipetaj yapılarak pellet solüsyon içerisinde çözülür.
7. Çözülen pelletler 20 dakika buz üzerinde bekletilir.
8. 20 dakika bittikten sonra hücre kalıntıları 15 dakika 13000 rpm ile santrifüj edilerek
çöktürülür.
9. Proteinler süpernatant da bulunur. Bu yüzden süpernatant toplanmalıdır.
10. 450 mikrolitre Laemli boya ile 50 mikrolitre beta-merkaptaetanol karıştırılarak 100-150
mikrolitre arasında süpernatanta eklenir.
11. Hazırlanan örnekler -20 santigrat dereceye kaldırılır.
12. Örnekler jele yüklenmek istendiğinde -20‟ den alınarak 95 santigrat derece heat blokta
10 dakika bekletilip, kısa bir spin yapıldıktan sonra kullanılabilir.
SDS Page
Makromoleküllerin bir elektrik alanında ayrılması elektroforez olarak adlandırılır. Proteinleri
elektroforez ile ayırmak için çok yaygın bir yöntem, bir destek ortamı olarak süreksiz bir
poliakrilamid jeli ve proteinleri denatüre etmek için sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanır.
Yönteme sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) denir. SDS (lauril
sülfat olarak da bilinir) anyonik bir deterjandır, yani moleküllerinin çözünmesi durumunda geniş
bir pH aralığında net bir negatif yüke sahip olur. Bir polipeptit zinciri, nispi molekül kütlesi ile
orantılı olarak SDS miktarlarını bağlar. SDS üzerindeki negatif yükler, proteinlerin karmaşık
yapısının çoğunu yok eder ve bir elektrik alanında bir anod (pozitif yüklü elektrot) yönünde güçlü
bir şekilde çekilir. Poliakrilamid jeller, daha büyük molekülleri daha küçük moleküller kadar hızlı
göç etmeye zorlamaktadır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
22.GÜN
SDS denatüre polipeptidler arasında yük-kütle oranı hemen hemen aynı olduğundan,
proteinlerin nihai ayrılması neredeyse tamamen polipeptidlerin nispi moleküler
kütlesindeki farklılıklara bağlıdır. Tekdüze yoğunluklu bir jelde, bir proteinin göreceli
göç mesafesi (Rf, bir alt simge olarak f) kütlesinin logaritması ile negatif orantılıdır.
Bilinen kütle proteinleri bilinmeyenlerle eşzamanlı olarak çalıştırılırsa, Rf ve kütle
arasındaki ilişki çizilebilir ve bilinmeyen proteinlerin kütleleri tahmin edilebilir. SDS-
PAGE ile protein ayrımı, göreceli moleküler kütleyi tahmin etmek, bir örnekte majör
proteinlerin nispi bolluğunu belirlemek ve fraksiyonlar arasında proteinlerin dağılımını
belirlemek için kullanılabilir. Protein örneklerinin saflığı değerlendirilebilir ve bir
fraksiyon veya saflaştırma prosedürünün ilerlemesi takip edilebilir. Nadir proteinleri
tespit etmek ve biyokimyasal özellikleri hakkında bir şeyler öğrenmek için farklı boyama
yöntemleri kullanılabilir. Western blotting, iki boyutlu elektroforez ve peptit haritalama
gibi özelleşmiş teknikler, çok nadir görülen gen ürünlerini tespit etmek, aralarında
benzerlikler bulmak ve proteinlerin izoenzimlerini tespit etmek ve ayırmak için
kullanılabilir.
Polimerleşme reaksiyonunda akrilamid molekülleri yanyana bağlanarak düz zincirler
oluştururlar. Bisakrilamid molekülleri ise iki akrilamid zinciri arasında çapraz
bağlanmalar oluşturur. Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir. Polimerleşme için serbest
radikal oluşumuna sebep olan amonyum per sulfat (APS) reaksiyon başlatıcı, TEMED ise
katalizör olarak rol oynar. SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki
amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri
biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda (-) yük
kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein
molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin
molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.
1. Jel için kullanılan camlar distile su ile iyice temizlenir.
2. Kalın cam arka tarafta ince cam önde olacak şekilde camlar aparata yerleştirilir.(Burada
camların iyi oturmasına ve alt kısımlarının aynı hizada olmasına jelin akıtmaması için
önem verilmelidir.)
3. Camlar yerleştirildikten sonra aparat kilitlenir.
4. Separating jel tablolarda belirtilen yüzdelere ve miktara bağlı olarak bütün malzemeler
sırasıyla eklendikten sonra bir pipet yardımıyla camlar arasına dökülür.(1 mililitre 2-
propanol, kabarcıkların oluşmasının ve kurumanın önlenmesi için jelin üst kısmı üzerinde
yayılır. Jel polimerleşirken su çıkışı olur. Çıkan su yüzeyde birikir ve kurumaya maruz
bırakılırsa jel yüzeyinin bozulmasına neden olur. Bu nedenle jel polimerleşmek üzere
doldurulduktan sonra üzerine mikropipet yardımıyla ve yavaşca bir miktar isopropanol
konulmalıdır. Böylece hem yüzeyin kuruması önlenir hem de jel yüzeyinin daha düzgün
olması sağlanır.)
5. Yaklaşık 30 dakika jelin donması beklenir. Separating jelin donmasına yakın stacking jel
hazırlanır.
6. Separating jelin üzerindeki propanol distile su ile yıkanıp kurutma kağıdı ile
kurutulduktan sonra, stacking jel dökülebilir. Ardından taraklar yerleştirilir ve stacking
jelin donması beklenir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
22.GÜN
7. Jelin polimerizasyonundan (yaklaşık 30 dakika) sonra tarak çıkarılır ve jel
𝑑𝐻2 𝑂 ile nemlendirilip, daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C'de saklanabilir veya
1X running buffer ile doldurulmuş vertical elektroforez sistemine uygun şekilde
yerleştirilir(kasetin siyah tarafı tankta siyah bölüme, kırmızı tarafı kırmızı bölüme
gelecek şekilde yerleştirilmelidir).
8. Jel, proteinler separating jele ulaşana kadar 80V' ta çalışır, sonrasında ise 120-
150V' ta yükseltilebilir.
9. Elektroforez, loading dye jelin sonuna ulaştığı zaman sonlandırılır.
Separating Jel İçin;
% 7’ lik Jel 10 ml 5 ml
𝒅𝒅𝑯𝟐 𝑶 5,55 ml 2,775 ml
% 40 Akrilamid 1,75 ml 0,875 ml
1,5 M Tris-HCl(pH 8,8) 2,5 ml 1,25 ml
%10 SDS 0,1 ml 0,05 ml
%10 APS 0,1 ml 0,05 ml
TEMED 0,008 ml 0,004 ml
𝒅𝒅𝑯𝟐 𝑶 5,3 ml 2,65 ml
1,5 M Tris-HCl(pH 8,8) 2,5 ml 1,25 ml
%10 SDS 0,1 ml 0,05 ml
%10 APS 0,1 ml 0,05 ml
TEMED 0,006 ml 0,003 ml

𝒅𝒅𝑯𝟐 𝑶 4,8 ml 2,4 ml
1,5 M Tris-HCl(pH 8,8) 2,5 ml 1,25 ml
%10 SDS 0,1 ml 0,05 ml
%10 APS 0,1 ml 0,05 ml
TEMED 0,004 ml 0,002 ml
Stacking Jel İçin:

% 5’ lik Jel 2 ml 4 ml 6 ml 8 ml
𝒅𝒅𝑯𝟐 𝑶 1,46 ml 2,92 ml 4,38 ml 5,84 ml
% 40 Akrilamid 0,25 ml 0,5 ml 0,75 ml 1,0 ml
1,5 M Tris-HCl(pH8,8) 0,25 ml 0,5 ml 0,75 ml 1,0 ml
%10 SDS 0,02 ml 0,04 ml 0,06 ml 0,08 ml
%10 APS 0,02 ml 0,04 ml 0,06 ml 0,08 ml
TEMED 0,002 ml 0,004 ml 0,006 ml 0,008 ml


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
15.08.2018 Western Blot Transfer Aşamasını Öğrenme ve
Uygulama
23.GÜN
Transfer
Protein bandının jel içinden bir membrana aktarılması, blotlama olarak adlandırılır. Membran
SDS-PAGE jel ile doğrudan ve yakın temas içine yerleştirilir. Proteinler, jelden, orijinal
konumlarını ve konsantrasyonlarını koruyarak zar üzerine hareket ederler. Proteinin membrana
aktarılması, bir elektrik akımıyla yapılır. Blot için kullanılan zar ya nitroselüloz ya da PVDF'den
(poliviniliden diflorür) yapılır. Western Blotta kullanılan her membranın kendine ait faydaları
vardır; Nitroselüloz zar ucuz ama hassastır ve tekrarlanan blotlamaya dayanamaz. Öte yandan,
PVDF pahalıdır, ancak proteinleri yıkadıktan sonra tekrar kullanılabilir. Membran, jel üzerine
yerleştirilir, bu jel-membran tabakası jel ve membranı korumak için filtre kağıdı tabakaları
arasına sıkıştırılır ve tampon çözeltisine batırılır (“transfer tamponu” olarak bilinir) ve elektrik
akımı, jel ve membranın arasında protein geçişini sağlar. Elektrik akımı uygulandığında, negatif
yüklü proteinler elektrik kaynağının pozitif terminaline doğru hareket eder. Pozitif terminale
giden yolda, PVDF / Nitroselüloz jeli içinde bulundukları pozisyonu korurken, membrana
bağlanırlar. Spesifik olmayan bağlanmadan sorumlu kuvvetler, membran ve proteinler arasında
mevcut olan hidrofobik etkileşim ve şarj etkileşimidir. Transfer için gerekli süre, jelin kalınlığı ile
doğru orantılıdır. Örneğin. 0.75 mm jel için 45 dakika sürer. Bu aşamada, tüm proteinler zarlara
bağlanır fakat görünür değildir.
Transfer Buffer Hazırlama:
 100 ml SDS
 200 ml metanol
 700 ml 𝑑𝑑𝐻2 𝑂
Yukarıda belirtilen materyaller karıştırılarak transfer buffer (blotting buffer) hazırlanır.
Transfer İşlemi İçin Aşağıdaki Aşamalar İzlenmektedir:
1. Jel, membran ve 4 adet kurutma kağıdı için 3 adet kaba transfer buffer eklenir.
2. Jel, membran ve 4 adet kurutma kağıdı buffer ile ıslatılır, transfer kullanılmak üzere rulo
da ıslatılır.
3. Jel tanktan çıkarılır. Jeli tutan camlar çıkarılır ve separating jel ile stacking jel birbirinden
ayrılıp, jel bir köşesinden işaretlenir. Bu şekilde hangi tarafın jelin ön yüzü olduğu
bilinebilir.
4. Transblot transfer makinesinin çekmecesine bir miktar transfer buffer koyulup 2 adet
kurutma kağıdı yerleştirilir. Kurutma kağıtlarının üzerinden rulo ile geçilerek
baloncukların yok olması sağlanır.
5. Membranın bir ucundan tutarak kurutma kağıtlarının üzerine yerleştirilir ve eğer
membran üzerinde baloncuk var ise rulo ile uzaklaştırılmalıdır aksi halde baloncukların
varlığı transferin sağlıklı bir şekilde gerçekleşmesine engel olur.
6. Jel membran üzerine yerleştirilir ve üzeri tekrar 2 adet kurutma kağıdı ile kapatılır.
7. Blotlama çekmecesi sıkıştırılır ve Transblot‟ a yerleştirilir.
8. Cihaz üzerindeki tuşlar ile 2,5 Amper, 12 Voltaj, 60 dakika ayarı yapılır ve transfer
başlatılır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
15.08.2018 Western Blot Bloklama ve Primer Antibody
İnkübasyonu Aşamalarını Öğrenme ve Uygulama
23.GÜN
Bloklama
Western blotta, protein veya noniyonik deterjan kullanılarak tahlilin sonraki aşamalarında
proteinlerin spesifik olmayan bağlanma miktarını azaltmak için membran üzerindeki reaksiyona
girmemiş bölgeleri bloke etmek önemlidir. Bloklama tamponları, tüm reaksiyona girmeyen
yerleri engellemelidir. Bloklama tamponları, hedef proteini zar üzerinde değiştirmemeli, hedef
protein üzerindeki epitopu bağlamamalı ve antikor veya tespit reaktifleri ile çapraz reaksiyona
girmemelidir. En tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein, jelatin ve Tween-20'dir. TBS ve /
veya PBS en sık kullanılan tamponlardır. Protein BSA, yağsız kuru süt, kazein, jelatin veya
noniyonik deterjan Tween-20 reaksiyona girmemiş bölgeleri bloke ederek spesifik olmayan
bağlanmayı azaltır. Protein yapısını koruyan Tween-20, protein emülsifikasyonu için
kullanılırken proteinler arasındaki orijinal etkileşimi azaltabilir. Yağsız kuru süt en ekonomik
seçimdir. Biotin konjuge antikorlu blotlama için bloke edici bir ayıraç olarak yağsız kuru süt
kullanmaktan kaçınılmalıdır çünkü süt değişken miktarlarda glikoprotein ve biyotin içerir. BSA,
hedef olarak fosforile protein içeren bloklamalar için uygundur. Yağsız kuru sütte bulunan
fosfataz, fosforlanmış proteinin membran üzerinde defosforilasyonuna yol açarken
fosforilatlanmış proteini tanımlamak için fosforilasyon spesifik antikor kullanılır. Yağsız kuru süt
ise alkalin fosfataz sistemine dayanan bloklamalar için uygun değildir.
Bloklama Buffer Hazırlama
 0,5 gram süt tozu
 % 5‟ lik 10 ml TBS-T veya PBS-T
Yukarıda belirtilen materyaller vortex ile homejen bir şekilde karıştırılır ve transferden çıkan
membranın üzerine yayılır. Bloklama aşaması en az 1 saat devam etmelidir. 1 saatin sonunda 5-
15-5-5‟ er dakika olmak üzere TBS-T veya PBS-T ile yıkanmalıdır.
Primer Antibody İnkübasyonu

Bloke edildikten sonra, hedef proteine özgü primer antibody, membran ile inkübe edilir. Ve
primer antibody, zar üzerindeki hedef proteine bağlanır. Western blotta, primer antibody
kullanımdan önce doğrulanmalıdır. Bir primer antibody‟ nin seçimi, saptanacak antijene bağlıdır.
Hem poliklonal hem de monoklonal antikorlar, western blot için iyi çalışır. Monoklonal
antikorlar, tek spesifik antijenik epitopu tanırlar. Böylece, daha düşük bir arka plan ile sonuçlanan
daha yüksek özgüllükleri vardır. Hedef epitopun yok edilmesi durumunda leke sonuçları
etkilenecektir. Poliklonal antikorlar daha fazla epitopu tanır ve sıklıkla daha yüksek afiniteye
sahiptirler. Birkaç epitop tahrip olsa bile, blot sonuçları stabil olacaktır.
Primer Antibody Hazırlama
 10 ml %5‟ lik süt tozu
 5 mikrolitre BMAL
 100 mikrolitre Sodyum Azid(bakteri kontaminasyonunu engellemek için)
 2 mikrolitre aktin
1. Bloklama sonunda yıkanan membrana yukarıda belirtilen materyaller karıştırılarak

eklenir.
2. Primer antibody defalarca kullanılabilir.
3. Membran, primer antibody içerisinde +4 derece de tüm gece çalkalanır.
4. Ertesi gün membran antibodyden çıkarılır ve 5-15-5-5‟ er TBS-T ile yıkanır.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
16.08.2018 Western Blot Sekonder Antibody Aşamasını Öğrenme
ve Uygulama
24.GÜN
Sekonder Antibody İnkübasyonu
Bağlanmamış primer antibodyi çıkarmak için membran yıkandıktan sonra, membran
spesifik enzim konjuge sekonder antibodye maruz bırakılır. Ve sekonder antibody, hedef
protein ile reaksiyona giren primer antibodye bağlanır. En yaygın sekonder antibodyler,
anti-mouse ve anti-rabbit immüno globülindir; çünkü primer antibodyler için konakçı
türler, esas olarak fare ve tavşandır. Goat, anti-mouse ve anti-rabbit poliklonal
antikorlarını yükseltmek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, goat anti-mouse ve
goat anti-rabbit immüno globulin, en yaygın kullanılan sekonder antibodylerdir.
Sekonder antibody seçimi, primer antibodynin alındığı hayvan türüne bağlıdır.
Sekonder Antibody Hazırlama
 0,5 gram süt tozu
 10 ml TBS-T
 2,5 mikrolitre sekonder antibody
1. Yukarıda verilen malzemeler karıştırılır ve membranın üzerine yayılır.
2. Sekonder antibody tek kullanımlıktır ve taze hazırlanmalıdır.
3. Sekonder antibody 1-2 saat uygulanabilir.
4. Zamanın sonunda membran 5-15-5-5‟ er dakika TBS-T ile yıkanır.
5. Membran görüntü almak için hazırdır.
Görüntü Alma
 Görüntü almak için ECL solüsyonu hazırlanmalıdır.
1. 50 ml falkona hazırlanır.
2. 46,0 ml 𝑑𝑑𝐻2 𝑂 (önce çözücü eklenir)
3. 3,5 ml Tris-HCl pH 8,8 eklenir.
4. 350 mikrolitre luminol yavaşça eklenir.
5. 175 mikrolitre caumuric acid eklenir.
6. Görüntü almadan önce 1,5 ml Luminol A ve 0,45 ml 𝐻2 𝑃𝑂4 eklenir ve
Luminol ışığa karşı duyarlıdır bu yüzden alüminyum folyoya sarılarak
ışık alması engellenir.
7. Membran film üzerine yerleştirilir ve 1 ml ECL karışımından eklenerek
membranın her yerine dağıtıldığından emin olunmalıdır.
8. BIORAD Molecular Imager ChemiDoc™ XRS+with Image Lab™
Software yazılımı çalıştırılır. “Select-Blot-Chemi-Biorad Ready gel”
ayarları seçilir, 1-300 arasında 25 fotoğraf alınması istenir,”Hightlight”
kaldırılmalıdır ve “No Filter” ayarında görüntü alınır.
9. Marker‟ i görüntülemek için “Filter 1” yapılmalıdır.
10. Ardından membran görüntüleme cihazına yerleştirlir. “Position gel”,
“Run Prototocol” adımları izlenir.
11. İşlem sonucunda “Kaydet” işlemi ile çekilen 25 fotoğraf bir klasöre
kaydedilmelidir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
17.08.2018 Plasmid DNA’ nın Özellikleri Öğrenme ve Plasmid
DNA İzolasyonu Kiti ile Çalışma
25.GÜN
Plasmid DNA İzolasyonu
Kimyadaki teknikler, DNA gibi hücresel bileşenlerin izolasyonunu ve saflaştırılmasını
mümkün kılar, fakat pratik olarak bu izolasyon, sadece nispeten kısa DNA molekülleri
için uygundur. İnsan kromozomal DNA'sından belirli bir geni izole etmek için, insan
genomunun diğer altı milyar temelinden birkaç yüz veya birkaç bin baz sırasının bir
dizisini izole etmek gerekir. Plazmidler tipik olarak genleri taşıyan ve kromozomal
DNA'dan bağımsız olarak replike olabilen çift iplikli DNA fragmanlarıdır. Archaea ve
ökaryotlarda bulunabilmelerine rağmen, bakteriler de çok önemli bir biyolojik olay olan
bir bakterinden diğer bakteriye geçmekte rol oynarlar. Plazmidler bir bakteriden diğerine
bir tür yatay gen transferiyle (konjugasyon) geçirilebilirler, genellikle konak için bir yarar
sağlarlar, antibiyotik direnci gibi. Bu yarar, içeriğe bağlı olabilir ve bu nedenle plazmid,
konakçı hücre ile simbiyotik bir ilişki içinde bulunur. Bakteriyel kromozomal DNA gibi,
plazmid DNA hücre bölünmesi üzerine kopyalanır ve her bir hücre, plazmidin en az bir
kopyasını alır. Rekombinant DNA teknolojisi alanında en yaygın olarak kullanılan
plazmidler, genleri çalışmak ve manipüle etmek için kullanılmaları için optimize
edilmiştir. Plazmidler, moleküler biyolojide, çeşitli nedenlerden dolayı önemli bir araç
haline gelmiştir:
 Çalışması kolay - Plazmidler, fiziksel izolasyon (arıtma) ve manipülasyon için
uygun bir boyuttadır (genellikle 1.000-20.000 baz). Mevcut klonlama
teknolojisiyle, ilgilenilen genetik elementi içeren plazmidleri yaratmak ve
değiştirmek kolaydır.
 Kendiliğinden çoğalır - Bir plazmid oluşturduktan sonra, plazmidin kopyalarını,
hücre bölünmesi sırasında plazmidleri alıp çoğaltabilen, bakteri kullanarak sonsuz
sayıda kopyalayabilirsiniz. Laboratuarda bakterilerin büyümesi kolay
olduğundan, nispeten hızlı bir şekilde bölünür ve üstel büyüme oranları gösterir,
plazmidler laboratuvar ortamında kolayca ve verimli bir şekilde çoğaltılabilir.
 Kararlı - Plazmidler ya saflaştırılmış DNA ya da gliserol stokları olarak
korunmuş bakteri hücreleri içinde uzun süreli stabil tutulabilir.
 Birçok türde işlevseldir ve çeşitli uygulamalar için faydalı olabilir -
Plazmidler, bitkileri, solucanları, fareleri ve hatta kültürlenmiş insan hücreleri de
dahil olmak üzere çok çeşitli organizmalarda gen ekspresyonunu yönlendirebilir.
Her ne kadar plasmidler başlangıçta gen fonksiyonunu anlamak için kullanılmış
olsalar da, şu anda promoterleri, küçük RNA'ları veya diğer genetik elementleri
araştırmak için kullanılan çeşitli çalışmalarda kullanılmaktadırlar.
En basit haliyle, plazmidler bakteriyel bir replikasyon kaynağı (ORI), bir antibiyotik
direnç geni ve en az bir özgün restriksiyon enzim tanıma alanı gerektirir.
Origin (ORI): Bakteriyel transkripsiyon mekanizmalarını alarak plazmid
replikasyonunun (bakteriler tarafından) başlatılmasını yöneten DNA dizisi. ORI
plazmidin bakteriler tarafından kopyalanabilmesi (çoğaltılması) için kritiktir, bu da
plazmidlerin neden kullanışlı ve kullanımı kolay olduğunu gösteren bir özelliktir.


YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: KAPSAMI:
17.08.2018 Plasmid DNA’ nın Özellikleri Öğrenme ve Plasmid
DNA İzolasyonu Kiti ile Çalışma
25.GÜN
Antibiyotik Direnç Geni: Bakteriyel konakçıya bir hayatta kalma avantajı sağlayarak plazmid
içeren bakterilerin seçilmesine izin verir. Her bir bakteri bireysel bir plazmidin çoklu kopyalarını
içerebilir ve ideal olarak bu plazmidleri kendi genomik DNA'larına ek olarak hücre bölünmesi
üzerine çoğaltacaktır. Bu ek çoğaltma yükünden dolayı, bakteri hücre bölünme oranı azalır (yani,
bu fazladan DNA'yı kopyalamak için daha fazla zaman gerekir). Bu azaltılmış kondisyondan
dolayı, plazmid içermeyen bakteriler, plazmidler ile daha hızlı ve dıştan gelen bakterileri
çoğaltabilir ve böylece bu plazmidlerin hücre bölünmesi yoluyla yayılmasına karşı seçim
yapabilirler. Plazmid DNA'nın bakteri popülasyonlarında tutulmasını sağlamak için, bir
antibiyotik direnç geni (yani, ürünü ampisilin'e direnç kazandıran bir gen) plazmid içine dahil
edilir. Bu bakteriler daha sonra ampisilin varlığında büyütülür. Bu koşullar altında, plazmid
DNA'sı olmayan bakteriler, antibiyotik müdahelesinden sağ çıkmayacağından, eklenen
replikasyon yüküne rağmen plazmid DNA'yı tutmak için seçici bir basınç vardır.
Multiple Cloning Site (MCS): Restriksiyon enzim kesimi ve ligasyonu ile DNA'nın kolayca
sokulmasını mümkün kılan, birkaç restriksiyon enzim bölgesi içeren DNA'nın kısa segmentidir.
Ekspresyon plazmidlerinde, MCS genellikle bir promotörden aşağı doğru yerleştirilir, öyle ki
MCS içine bir gen eklendiğinde, ekspresyonu promoter tarafından yönlendirilir. Genel bir kural
olarak, MCS'deki restriksiyon bölgeleri benzersizdir ve plazmid omurgasında başka yerde
bulunmazlar, bu yüzden restriksiyon enzim kesimi klonlama için kullanılabilirler.
Insert: MCS'ye klonlanan gen, promoter veya başka bir DNA fragmanıdır. Insert gen, tipik
olarak, belirli bir plazmid kullanılarak çalışma yapmak istenilen genetik elemandır.
Promoter Bölgesi: Insert genin transkripsiyonunu hızlandırır. Promoter, transkripsiyon
mekanizmalarını belirli bir organizmadan veya organizma grubundan almak üzere tasarlanmıştır.
Yüksek Kopya Plazmid DNA İzolasyonu Aşamaları:
1. Hücre Toplama: 1-5 ml doymuş bakteri kültürü bench üstü bir mikrosantrifüjde 30
saniye 11,000 x g santrifüj yapılarak pellet elde edilir.
2. Hücre Lizizi: Pellete 250 mikrolitre A1 tampon eklenir ve iyice çözdürülür. Hiçbir hücre
kümesi olmamalıdır. 250 mikrolitre A2 tamponu eklenir ve 6-8 defa ependorf alt üst
edilerek hafifçe karıştırılır. Genomik DNA‟ nın parçalanmaması için vortex yapılmalıdır.
Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. 300 mikrolitre A3 tamponu eklenir ve mavi
örnekler renksiz hale gelene kadar 6-8 defa alt üst edilerek iyice karıştırılır. Mavi rengin
kaybolması tüm kromozomal DNA‟ ların ve proteinlerin çökeltilme için nötralize edildiği
anlamına gelir.
3. Lizatın Arıtılması: Oda sıcaklığında 11,000 x g‟ de 5 dakika santrifüj yapılır.
Süpernatant berrak değilse bu işlem tekrarlanmalıdır.
4. DNA’ yı Bağlama: Bir toplama tüpüne (2 mL) NucleoSpin® Plazmid / Plazmid (NoLid)
Column‟ u yerleştirilir ve 3. aşamadan süpernatant boşaltır veya kolon üzerine
maksimum 750 µL süpernatant eklenir. Kolon 1 dakika 11,000 x g‟ de santrifüjlenir.
Altta biriken sıvı atılıp, NucleoSpin® Plazmid / Plazmid (NoLid) Kolonu toplama
tüpüne yerleştirilir. Kalan lizatın toplanması için bu adım tekrarlanır.
5. Silika Membranın Yıkanması: Yüksek düzeyde nükleaz içeren konakçı suşlardan
plazmid DNA hazırlanırsa, ek bir yıkama adımı yapılmalıdır. 500 mikrolitre AW
tamponu ile 50 °C 1 dakika 11,000 x g‟ de santrifüj edilir. Ardından 600 mikrolitre A4
tamponu eklenir. 1 dakika 11,000 x g‟ de santrifüj yapılır. Altta biriken sıvı atılıp,
NucleoSpin® Plazmid / Plazmid (NoLid) Kolonu boş toplama tüpüne geri yerleştirilir.


Biyolojik Saat Laboratuvarı Staj Defteri

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Biyolojik Saat Laboratuvarı Staj Defteri

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

T.C.

GEBZE TEKNİK ÜNİVERSİTESİ

Adı, Soyadı Ebru AKHARMAN

Şekil 1: Sirkadiyen Ritimin Saatlere Bağlı Olarak Değişimi

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Şekil 2: Biyolojik Saat Proteinlerin Etkileşimi

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Şekil 3: Restriksiyon Enzim Kesimleri

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Şekil 4: Kompetan Hücre Hazırlama

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

 1000X Ampisilin‟den 100 mikrolitre 100 mililitre LB mediumun içerisine eklenir.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Biorad Transblot Turbo Transfer

pH Metre Kullanım Talimatları

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Soğutmalı Ependorf Santrifüj

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Soğutmalı Santrifüj (Thermo Hereus

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Güç Kaynağı (Biorad)

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Etüv Kullanım Talimatları

Orbital Shaker Kullanım

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

1) Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)

2) Fetal Bovine Serum

3)Schneider's Drosophila Medium

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Stoktan Hücre Açma

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Doç. Dr. Nuri ÖZTÜRK

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin