Phần chữ màu xám là phần nguyên bản do không biết nên dịch như thế

nào@@ hoặc sợ có thể hiểu nhầm ý của câu đó.

Discovery of miRNAs and RNAi (trang 722+723)

Năm 1989, Richard Jorgensen, làm việc tại công ty công nghệ sinh học
Advanced Genetic Science ở Oakland, California, đã cố gắng tạo ra giống cây
dã yên thảo có hoa màu tím đậm hơn so với các dòng cây ban đầu. Phương pháp
này có vẻ đơn giản: anh ta sẽ đưa vào loài cây này một bản sao bổ sung của gen
sắc tố (encoding chalcone synthase) dưới sự kiểm soát của một strong promoter.
Những cây này sẽ tạo ra nhiều synthase chalcone và hoa sẽ có màu tím hơn.
Những gì anh ta thực sự thấy là những cây hoa này có nhiều cấp độ màu tím
khác nhau của hoa nhưng là tím nhạt đi, nhiều cây được chia vùng với các vùng
màu tím và trắng và thậm chí một số cây hoàn toàn màu trắng (Hộp 20-2 Hình
1).Mặc dù thất vọng, nhưng kết quả này lại kích thích sự tò mò của ông. Để
hiểu được những gì đang diễn ra, Jorgensen đã phát hiện ra nhiều đặc điểm khác
nhau của hiện tượng này, được gọi là cosupressure-đồng ức chế (vì biểu hiện
của cả transgene và endogenous bị kìm hãm). Biểu hiện của transgene càng
lớn,lượng chalcone synthase tạo ra càng ít; điều này có đúng là biểu hiện gen
tăng lên do lượng bản sao của transgene ở mức tối ưu hay do sử dụng stronger
promoter điều khiển transgene. Một điều cũng được ghi nhận rằng một số loài
thực vật có kiểu hình đa dạng về pig-mentation, và các kiểu hình khác nhau đó
có thể được tìm thấy ở những bông hoa khác nhau trên cùng một cây. Những
kiểu hình này đôi khi được di truyền, nhưng trong những trường hợp khác rõ
ràng đã có sự thay đổi một cách ngẫu nhiên. Những quan sát này đã gợi ý cho
Jorgensen và những người khác (đặc biệt là Marjori Matzke, người cũng đang
nghiên cứu hiện tượng này) rằng họ đang gặp phải một hiện tượng epige-netic.

Các nhà nghiên cứu khác đã cố gắng làm cho thực vật kháng nhiễm virus. Một
cách tiếp cận là biểu hiện quá mức ở thực vật một dominant-negative derivative
của nhân tố sao chép virus phổ biến: protein này được mong đợi là sẽ ngăn chặn
sự sao chép của bất kỳ virus gây bệnh nào mà sử dụng cơ chế sao chép phổ biến
này. Mặc dù sản phẩm virus dominant-negative đã ngăn chặn sự sao chép của
virus khoai tây từ nơi bắt nguồn , nhưng tính đặc hiệu của virus dominant-
negative đã bị hạn chế chặt chẽ bởi virus potato đó(Although the dominant-
negative viral product blocked replication of the potato virus from which it was
derived, its specificity of action was surprisingly tightly restricted to that virus
)Người ta cũng chứng minh rằng bản thân protein thậm chí là không cần
thiết,chỉ cần RNA.( It was also shown that the protein itself was not even
needed—just the RNA.)
Trong khi đó, các nhà nghiên cứu khác đang sử dụng RNA antisense để ngăn
chặn sự biểu hiện của gen par-1 ở giun. Mục đích của họ là chứng minh rằng
gen này đảm nhiệm chức năng biểu hiện cho một kiểu hình cụ thể. RNA
antisense được tạo ra trong ống nghiệm và được tiêm vào con giun đang phát
triển gây ra kiểu hình được dự đoán cho sự mất biểu hiện par-1. Nhưng người ta
thấy rằng RNA sense cũng có tác dụng tương tự. Tất nhiên, điều này chỉ kể đến
trong thí nghiệm như một sự kiểm soát tiêu cực; nó không được mong đợi sẽ có
bất kỳ ảnh hưởng nào đến biểu hiện. RNAs không liên quan đến gen par-1 thì
không có tác dụng.

Lời giải thích cho sự ức chế gen RNA-dependent này đã được Andrew Fire và
Craig Mello cung cấp trong các thí nghiệm mang lại cho họ giải thưởng Nobel
về sinh lý học hoặc y học năm 2006. Họ đã chỉ ra rằng, trên thực tế, cả RNA
sense vàRNA antisense đều không làm bất hoạt biểu hiện gen, mà là do
DSRNA được tạo ra bởi sự kết hợp của cả hai. Nó chỉ ra rằng RNA
preparations của sense hoặc antisense đều bị nhiễm một lượng nhỏ của chuỗi
còn lại, và kết quả tạp ra một tập hợp các sợi kép gây ra sự bất hoạt. Khi các
DSRNA được chuẩn bị trước 1 cách có chủ ý, chúng trở nên có hiệu lực trong
việc ức chế biểu hiện của gen đích. Từ đó, RNAi đã được khám phá ,được công
bố vào năm 1998.

Những hiểu biết cơ học (mechanistic insights) từ một số phòng thí nghiệm trở
nên dày đặc và nhanh chóng. Đầu tiên, người ta thấy rằng các DSRNA gây ra
sự thoái hoá của các mRNAs tương đồng trong phần chiết ra từ các tế bào
Drosophila, một xét nghiệm dẫn đến việc xác định RISC. Việc xác định
siRNAs, một loại RNAs định hướng RISC tới gen mục tiêu, đã được reported ở
thực vật vào năm 1999. Dicer-nuclease tạo ra chúng, được mô tả vào năm 2001.
Và thành phần chính cuối cùng của pathway,Slicer, đã được xác định vào năm
2005, khi cấu trúc tinh thể của Argonaute khám phá ra 1 loại protein được gọi là
RNase.

Ngoài sự cần thiết của việc tạo ra siRNA, Dicer cũng rất cần thiết để miRNA
hoạt động trong quá trình phát triển. miRNA đầu tiên và vai trò của nó đã được
mô tả vào năm 1993, bởi Victor Ambros và Gary Ruvkun. Vào thời điểm đó,
nghiên cứu này được xem là một sự kỳ quặc đến lập dị; gen lin-4 đã mã hóa một
small RNA- RNA hoạt động trên gen mục tiêu, gen lin-14, nhờ vào sự bổ sung
trình tự giữa miRNA và các vùng 30-UTR của gen đích (Box 20-2 Hình 2). Sau
đó, các miRNA khác được tìm thấy ở giun, một số có tương đồng với các gen
tương tự ở động vật và thực vật, cho thấy cơ chế điều hòa này đã phổ biến hơn.
Do đó, the picture xuất hiện một thế giới các small RNA liên quan đến điều hòa
gen, một số được cung cấp bên ngoài, một số khác gắn liền với các programs
điều hòa gen được sử dụng trong quá trình phát triển. Lĩnh vực này phát triển
rất nhanh, chuyển từ obscure phenomenology sang giải thưởng Nobel và có
1chương riêng trong sách, chỉ trong 15 năm. Tiến bộ tăng tốc có lẽ phần lớn là
kết quả của một loạt các loài (nấm men, thực vật và giun) được nghiên cứu và
phương pháp tiếp cận (di truyền học, hóa sinh, nghiên cứu cấu trúc và tin sinh
học) được sử dụng.

RNAi Is a Defense Mechanism That Protects against Viruses and

Transposons (đoạn cuối tr721 và full trang 724)
Bộ máy RNAi xuất hiện chủ yếu ở sinh vật nhân thực, mặc dù không phổ biến.
Nó không xảy ra ở S. Cerevisiae. Tuy nhiên, người ta tin rằng ít nhất là hệ thống
này tồn tại trong tổ tiên chung gần đây nhất đối với tất cả các sinh vật nhân thực
nhưng sau đó đã bị mất trong một số dòng dõi.
Nhưng RNAi làm gì, về mặt sinh học? Tất nhiên, có các miRNA, và tất nhiên
RNAi machinery phải sản xuất và sử dụng regulators đó nhưng một số sinh vật
có RNAi và không có miRNA (bao gồm cả S. pombe). Trên thực tế, người ta tin
rằng miRNA đã tiến hóa để tận dụng sự có mặt của RNAi machinery chứ không
phải là nguyên nhân RNAi machinery tồn tại. Một chức năng cổ xưa của RNAi
machinery có thể đã thực hiện (và vẫn thực hiên) là bảo vệ các sinh vật khỏi gen
nhảy và virus.
Chúng tôi trước đó đã mô tả hệ thống cas CRISPR ở vi khuẩn (xem hình 20-9
trước đó). Trong trường hợp đó, trình tự DNA có nguồn gốc từ DNA ngoại lai
(phage hoặc plasids) được tích lũy trong các vùng của genome mà sau đó có thể
được biểu hiện dưới dạng các phân tử small RNA nhằm phá hủy axit nucleic
tương đồng nếu chúng(các axit nucleic này) xâm chiếm lại tế bào. Mặc dù hệ
thống CRISPR không có thành phần chung với RNAi machinery ở sv nhân thực
(ngoài việc sử dụng các small RNA để định hướng các phức hợp protein phá
hủy axit nucleic đích), theo nhiều cách, chức năng và logic của hai hệ thống rất
giống nhau. Điều này đặc biệt đúng với piRNA system.
Như chúng ta đã thấy, piRNA là yếu tố thứ ba của small regulatory RNA (sau
siRNA và miRNA); chúng phát sinh từ các bản sao của các sợi đơn, dài trong
cụm piRNA trong genome, mà không cần có sự tác động của Dicer.
Giống như CRISPR, các piRNA dường như nhắm vào ký sinh trùng axit
nucleic, nhưng trong khi các mục tiêu chính của CRISPR là lây nhiễm phage,
đối với genome động vật, các mối đe dọa chính là gen nhảy. Gen nhảy được tìm
thấy trong tất cả các sinh vật nhân thực và, trong một số trường hợp, chiếm một
lượng đáng kể của bộ gen (xem Chương 8 và 12). Ở người, chẳng hạn, 45% bộ
gen của chúng ta được tạo thành từ các chuỗi đã từng là gen nhảy. Gen nhảy
thường bị ức chế phiên mã và được xử lý thành heterochromatin. Tuy nhiên,
trong một số đột biến RNAi, các sửa đổi histone liên quan đến ức chế gen nhảy
bị mất. Ngoài ra, ở thực vật và giun, một số siRNA đã được xác định có phản
ứng với gen nhảy. Và trong một số trường hợp ở cả hai sinh vật này, việc mất
RNAi sẽ kích hoạt lại các gen nhảy, khiến chúng hoạt động, và dẫn đến tình
trạng đột biến tự phát cao. Tuy nhiên, không có nhiều gen nhảy được kích hoạt
lại như đã biết để tạo siRNA. Điều này có thể phản ánh một tình huống tương tự
như tình huống được mô tả ở trên đối với ức chế kiểu giao phối ở S. pombe:
RNAi có thể rất cần thiết để bắt đầu ức chế một số gen nhảy,nhưng sự ức chế
sau đó trở nên tự duy trì mà không cần thêm siRNA.
Các piRNA dường như đặc biệt dành riêng cho nhiệm vụ bảo vệ các tế bào khỏi
gen nhảy và được biểu hiện chủ yếu trong germline (các tế bào mà sự bảo vệ
của nó là quan trọng nhất). Các cụm piRNA chứa các bit và các mảnh của gen
nhảy mà chúng được mô tả là các “transposon graveyards” và do đó các piRNA
được tạo ra từ các bản sao của các vùng này(vùng “transposon graveyards”)
thường nhắm vào các bản sao được tạo bởi các gen nhảy có hoạt tính, ngăn cản
hoạt động của chúng. Như chúng ta đã thấy, hệ thống CRISPR bao gồm một hệ
thống tích cực thu nhận các mẫu DNA ngoại lai và sử dụng nó để tạo ra các
mảnh CRISPR để tạo ra các small RNA, các small RNA sẽ nhắm vào các chuỗi
có trình tự tương tự có thể xuất hiện trở lại trong tế bào. Hệ thống piRNA
dường như thiếu tính năng này, nhưng các chuỗi DNA end up trong các cụm
piRNA có lẽ đến đó bằng cách tự di chuyển vào khu vực đó, do đó các cụm sẽ
được làm tăng cường các chuỗi gen nhảy (xem hình 20-19).

Ở thực vật, RNAi là cần thiết để kiểm soát gen nhảy, như chúng ta đã đề cập, và
nhiễm virus cũng cần thiết như vậy. Tác dụng bảo vệ của RNAi đối với nhiễm
virus ở thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi. Thật vậy, các hiệu ứng đã được
công nhận từ lâu trước khi RNAi được biết đến là một cơ chế cơ bản. Khi một
chiếc lá trên cây bị nhiễm virut, nhân tố có thể ngăn chặn sự nhân lên của virut
được lan truyền một cách có hệ thống trên toàn bộ cây. Nhân tố này không bảo
vệ lá bị nhiễm ban đầu, nhưng nó ngăn chặn sự lây lan của virus. Ở những cây
bị đột biến ở gen Argonaute hoặc Dicer, nhiễm trùng lây lan không bị ngăn
chặn và sự nhân lên của virus cao hơn nhiều. Tín hiệu bảo vệ có chứa siRNA
được tạo ra từ chính genome của virus. Virus đã trả đũa: chúng thường mang
các gen có chức năng bảo vệ các virus có khả năng lây nhiễm khỏi RNAi của
vật chủ. Một ví dụ là HcPro từ virus khoai tây Y, có tác dụng làm giảm khả
năng tạo ra sỉNA hoặc sự ổn định của siRNA. Các virus products khác ảnh
hưởng đến các bước khác trong cơ chế phòng vệ, bao gồm cả sự lan truyền của
siRNAs.

RNAi Has Become a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression

(trang 725,726) RNAi đã trở thành một công cụ mạnh mẽ điều khiển biểu hiện
gen

Việc phát hiện ra RNAi bắt nguồn từ các nghiên cứu được thực hiện bởi các nhà
nghiên cứu đang cố gắng điều khiển biểu hiện gen (xem Box 20-2). Trong cả 2
trường hợp đồng ức chế ở thực vật và RNA antisense ở giun, người ta đã cố
gắng tìm hiểu những điểm bất ngờ trong điều khiển biểu hiện gen dẫn đến sự
phát hiện RNAi. Do đó, có lẽ không có gì đáng ngạc nhiên khi RNAi đã nhanh
chóng được khai thác như một công cụ để điều khiển biểu hiện gen. Trong giun,
điều này đã sớm được thực hiện thường xuyên. Các thư viện mã hóa các
DSRNA có thể nhắm bất kỳ gen nào trong genome của giun và do đó có thể
được sử dụng để sàng lọc giun như là kết quả của việc ức chế biểu hiện của bất
kỳ gen nào. Cách tổng quát được thực hiện được thể hiện trong Hình 20-20.
Giun ăn vi khuẩn. Trong phòng thí nghiệm, chúng được cho ăn E. coli và hóa ra
con đường nhanh nhất đến bộ gen của giun là thông qua dạ dày của nó: bất kỳ
DSRNA mong muốn nào cũng có thể được biểu hiện trong E. coli mà giun ăn
và điều này cung cấp đủ cơ chất để phản ứng RNAi được kích hoạt trong các tế
bào của sâu, switch off các gen tương đồng với DSRNA ban đầu.
Tất nhiên, nó sẽ mang lại lợi ích lớn cho việc sàng lọc các gen theo cách này
trong các tế bào động vật có vú, nơi mà các sàng lọc di truyền truyền thống
không khả thi. Người ta đã xác định rằng siRNA tổng hợp nhân tạo, được tạo ra
trong ống nghiệm và đưa vào tế bào động vật có vú trong nuôi cấy, kích hoạt
phản ứng RNAi và điều chỉnh các gen đích 1 cách thích hợp, nhưng hiệu quả
của việc transfection (đưa RNA vào tế bào) là thấp. Các phân tử DSRNA dài
hơn cũng có vấn đề vì chúng kích hoạt một phản ứng‘tắt’ tất cả quá trình dịch
mã trong tế bào, đây là một phản ứng tiến hóa để ngăn chặn sự nhân lên của
virus vì nhiều virus có bộ gen RNA.
Thay vì cố gắng đưa DSRNA vào các tế bào, các nhà nghiên cứu nhận thấy nó
hiệu quả hơn khi bắt chước các miRNA. Cuối cùng, các thư viện đã được tạo ra
trong đó các gen ngắn được tổng hợp dưới dạng oligonucleotide và được nhân
bản trong các plasmids. Mỗi gen ngắn được thiết kế để đưa ra một bản phiên mã
sẽ cuộn gấp thành dạng stem-loop. Chúng được xử lý bởi Dicer trong tế bào để
tạo ra siRNA, siRNA trực tiếp làm ức chế các gen đích của nó. Những gen tổng
hợp ngắn này được gọi là gen short hairpin RNA (shRNA). Bằng cách sử dụng
một shRNA được thiết kế phù hợp, bất kỳ gen riêng lẻ nào trong bộ gen đều có
thể được nhắm đích. Hoặc, với một thư viện phù hợp,việc sàng lọc gen có thể
được thực hiện. Trong một thư viện như vậy, chẳng hạn, mỗi plasmid sẽ mã hóa
một shRNA được định hướng chống lại một gen khác. Toàn bộ thư viện được
transfected vào trong tế bào sao cho mỗi tế bào nhận được một shRNA khác
nhau. Các tế bào có kiểu hình cụ thể được chọn và gen mà bị ức chế dẫn đến
kiểu hình đó có thể được xác định.

microRNAs and Human Disease(trang 727)

1. Cancer
 Sự giảm chung về mức độ (levers) của nhiều miRNA thường thấy trong các
bệnh ung thư. Sự giảm này đã chỉ ra rằng những miRNA đó thường có tác dụng
ức chế khối u. Thay thế cho xu hướng chung này, các miRNA cụ thể khác được
điều chỉnh tăng (up-regulated) trong một số bệnh ung thư. Tương tự như các
gen mã hóa protein có liên quan đến ung thư, các miRNA trong được mô tả là
chất ức chế khối u (nếu sự vắng mặt của chúng dẫn đến bệnh ung thư) hoặc gây
ung thư (nếu biểu hiện tăng của chúng dẫn đến ung thư). Đích của chúng có xu
hướng là các gen liên quan đến sự tiến triển của chu kỳ tế bào (tăng sinh) hoặc
apoptosis.
Trong số hàng trăm miRNA được xác định ở người, hơn một nửa nằm ở các
vùng trong genome thường xuyên bị phân hủy ở các bệnh ung thư. Do đó, trong
nhiều bệnh ung thư, các gen của các miRNA này bị xóa hoặc khuếch đại, tùy
thuộc vào bản chất của sự sắp xếp lại nhiễm sắc thể. Do đó, ví dụ, miRNAs
miR-15 và miR-16 gây ra apoptosis của các tế bào bằng cách điều chỉnh
giảm(down-regulating) gen BCL2 (xem Box 20-3 Hình 1). Hình thức phổ biến
nhất của bệnh bạch cầu ở người trưởng thành ở Tây bán cầu là bệnh bạch cầu
lymphocytic mãn tính (CLL), một bệnh liên quan đến sự loại bỏ (deletions)
trong vùng nhiễm sắc thể 13 (13q14). Vùng này của genome chứa các gen
miRNA miR-15a và miR-16a; thật vậy, đây là hai gen duy nhất có trong phần
smallest deletions liên quan đến CLL. Do đó, khi các gen này bị xóa, apoptosis
được điều chỉnh xuống và các khối u có thể dễ dàng phát sinh và phát triển hơn.
Ở một vùng khác của nhiễm sắc thể 13 (13q31) ,tìm thấy miR-17-92, một
miRNA gây ung thư. So với mô bình thường, biểu hiện của gen này tăng đáng
kể ở nhiều bệnh ung thư, bao gồm cả ung thư phổi, đặc biệt là ở dạng
aggressive nhất của nó (ví dụ, ung thư phổi tế bào nhỏ). Ngoài ra, sự biểu hiện
quá mức của miRNA này ở chuột biến đổi gen gây ra khối u. Trong số nhiều
targets được dự đoán của miR-17-92 là có hai gen ức chế khối u, PTEN và RB2.
Một target xác định là điều chỉnh tiến trình chu kỳ tế bào E2F1. Cả hai loại này
và các ví dụ khác của miRNA trong bệnh ung thư được thể hiện trong Box 20-3
Hình 1.
2. Fragile X Mental Retardation
Thông qua phân tích hóa sinh của phức hợp RISC, một số protein liên quan đã
được xác định. Một trong số đó là protein Fragile X mental retardation (FMRP).
Gen mã hóa protein này (FMR1) có liên kết X và đột biến của nó là nguyên
nhân của dạng chậm phát triển tâm thần phổ biến nhất. FMRP là một protein
gắn RNA liên quan đến điều hoà gen; nó tương tác với một số miRNA liên quan
đến thần kinh. Bệnh nhân thiếu FMRP có một loạt các khiếm khuyết về thần
kinh, cũng như chậm phát triển trí tuệ, do biểu hiện gen bị gián đoạn.
Một trong những protein Drosophila Argonaute được tìm thấy có liên kết với
FMRP, trong khi các nghiên cứu riêng biệt về Argonaute cũng chỉ ra rằng
FMRP được liên kết với thành phần đó của RNAi machinery. Những phát hiện
tương tự cũng xảy ra trong các tế bào người, cho thấy sự kết nối giữa Fragile X
với sự trưởng thành và chức năng của miRNA