Napomene o opštem poglavlju

Opšta revizija poglavlja je nastala posle višegodišnjeg iskustva.

Velike promjene su u :

Definicijama.
IUPAC terminologija se koristi kad je god to moguće. Dodatne definicije su uvedene,
posebno za parametre i veličine isključene hromatografije, i zapremime zadržavanja.
(zajedno sa metodam za određivanje).
Odnos SIGNAL-ŠUM
Signal-šum odnos , posmatranje prozora na baznoj liniji, u osnovi је smanjeno na
udaljenost jednaku vremenu potrebnom za postizanje širine, na pola visine od vrha, da
samo pokriju kratko vrijeme šuma.

Podobnosti sistema.
Usvojen je zahtjev da vrh simetrije bude 0.8-1.5 I da se odnosi na vrh hromatograma
dobijenog sa referentnim standardima za kvantifikaciju i da se zahtjevi za ponovljivost
odnose samo na aktivnu supstancu, gdje je vrijednost za čistu supstancu 100%.
Zahtjev za granicu detekcije је izbrisan, on je suvišan. Pridržavanje kriterijuma
podobnosti do kraja hromatografskog procesa je suvišno.

Podešavanju hromatografskih uslova.

Izokratsko i gradijentno eluiranje u tečnoj hromatografiji se sada posmatra razdvojeno, za
oba procesa, dodata je formula za podešavanje protoka, gdje se kolone različitih
dimenzija od onih propisanih, koriste i dozvoljeno je prilagođavanje temperature kolone ,
sada ustaljeni izraz više je značajan kao apsolutan termin ( +/- 10 0C za izokratsko i + / -
50C za gradijentno eluiranje), to jest u procentima.
Za gradientno eluiranje, moguće su samo male korekcije. Vrijeme gradientne tačke može
se prilagoditi, uzimanjem u obzir razlike između zapremina zadržavanja između sistema
koji se koristi pri razrađivanju metoda I sistema koji je se koristi u praksi, kada ima
isokratski protok.

Hromatografske separacione tehnike su višestepene separacione metode kod kojih se

komponente uzorka raspodjeljuju između dvije faze, od kojih je jedna stacionarna, a
druga mobilna. Stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna, podržana na čvrstom ili gel
nosaču. Stacionarna faza može biti pakovana u koloni, kao širi sloj, ili distribuirana kao
film. Mobilna faza može biti gas, tečnost ili tečnost pod visokim pritiskom. Razdvajanje
može biti zasnovano na adsorpciji, raspodjeli prema masi, razmjeni (izmjeni ) jona, ili se
zasniva na razlikama u fizičko-hemijskim osobinama molekula kao što su veličina, masa,
zapremina.

1
Ovo poglavlje sadrži definicije i kalkulacije zajedničkih parametara i opšte važeće
zahtjeve za podobnost sistema.Principi razdvajanja, aparatura i metode dati su u sledećim
opštim poglavljima:

-Papirna hromatografija ( 2.2.26 )

-Tankoslojna hromatografija ( 2.2.27 )
-Gasna hromatografija ( 2.2.28 )
- Tečna hromatografija (2.2.29)
-Ekskluziona hromatografija (2.2.30)
-Superkritična tečna hromatografija (2.2.45)

Definicije
Kriterijumi prihvatljivosti i pogodnost sistema u monografijama su postavljeni koristeći
parametre koji su dolje definisani. Sa nekih oprema, određeni parametri
,kao što je odnos signal-šum, rezolucija mogu se izračunati pomoću programa koji su dati
od strane proizvođača opreme.Odgovornost korisnika je da osigura da su obračunske
metode koje se koriste u softeru ekvivalentne zahtjevima Evropske Farmakopeje, kao i
sve potrebne korekcije, ako to nije slučaj.

Hromatogram

Grafički prikaz ili neka druga prezentacija odgovora detektora, koncentracije otpadnih
vode ili drugih količina koristi kao mjera koncentracije otpadnih voda, u odnosu na
vrijeme ili zapreminu. Idealizovani hromatogrami su predstavljeni kao niz Gausovih
vrhova na osnovici.

(slika 2.2.46.-1)

2
Pik ( vrh )

Dio hromatograma za snimanje odgovora detektora kada je jedna komponenta (ili dvije
ili više neriješenih komponenti) izlučena iz kolone.

Vrh može biti definisan površinom vrha ili visinom vrha (h) I širinom vrha na polu visini
(wh) ili visini (h) I širinom vrha između tačaka fleksije (wi). Kod Gausovih vrhova
(Figura 2.2.46-1) postoji odnos:

. Wh = 1.18wi

Retenciono vrijeme tr
Vrijeme potrebno za izlučenje iz komponente (Figura 2.2.46-1, referentnoj mjeri u
minuti).

Retenciona zapremina Vr

Zapremina mobilne faze potrebne za izlučenje iz komponente. Može se izračunati iz

retencionog vremena I koeficijenta toka (F) u mililitrima po minuti:

VR= tRx F

Vrijeme zadržavanja tM

Vrijeme potrebno za izlučenje nezadržive komponente (Figura 2.2.46-1, referentnoj mjeri

u minuti). Za isključenja po veličini u hromatografiji, koristi se simbol ti.

Zapremina zadržavanja VM

Zapremina mobilne faze potrebne za izlučenje iz komponente. Može se izračunati iz

vremena zadržavanja I koeficijenta toka (F) u mililitrima po minuti:

VM = tM x F

Za isključenja po veličini u hromatografiji, koristi se simbol Vo.

Retencioni faktor ( faktor zadržavanja ) k

Faktor zadržavanja (takođe poznat I kao maseni distribucioni odnos D ili faktor
kapaciteta k ) se definiše kao:
količina komponente u stacionarnoj fazi
k= /
količina komponente u mobilnoj fazi

Kc – distribuciona konstanta (takođe poznata I kao ravnotežni distribucioni koeficijent )

Vc- zapremina stacionarne faze

3
Vm- zapremina mobilne faze

Faktor zadržavanja komponente se može utvrditi iz hromatograma pomoću izraza:

( tr – tm )
k=
tm

Ukupno vrijeme mobilne faze tt

Za isključenja po veličini u hromatografiji, retenciono vrijeme komponente čiji su

molekuli manji od najmanjih gel pora.

Ukupna zapremina mobilne faze Vt

Za isključenja po veličini u hromatografiji, retenciona zapremina komponente čiji su

molekuli manji od najmanjih gel pora. Može se izračunati iz ukupnog vremena mobilne
faze I koeficijenta toka (F) u mililitrima po minuti:

V t = tt x F

Retenciono vrijeme ne zadržavanih komponenti ( jedinjenja ) t0

Za isključenja po veličini u hromatografiji, retenciono vrijeme komponente čiji su

molekuli veći od najvećih gel pora.

Retenciona zapremina ne zadržavanih komponenti ( jedinjenja ) V0

Za isključenja po veličini u hromatografiji, retenciona zapremina komponente čiji su

molekuli veći od najvećih gel pora. Može se izračunati iz retencionog vremena
nezadržive komponente I koeficijenta toka (F) u mililitrima po minuti:

V0 = t 0 x F

Distribuciona konstanta К0

Za isključenja po veličini u hromatografiji,karakteristike izlučivanja iz komponente u

određenoj koloni mogu biti dati preko distributivne konstante (takođe poznata I kao
distributivni koeficijent), koja se izračunava iz izraza:

K0 = ( tR – t0 ) / ( tt – t0 )

4
Slika 2.2.46.-2

Faktor razdvajanja RF

Faktor retardacije (poznatri kao retencioni faktor Rt), koji se koristi u planarnoj
hromatografiji, je koeficijent distance od tačke aplikacije do centra samog mjesta I
distance koju pređe rastvor od tačke aplikacije.

RF = b/a

b= migraciona distanca analita

a= migraciona distanca prednjeg rastvora

5
A-front mobilne faze B-pređena put analita C-startna linija
slika 2.2.46.-3

Broj platoa N

Performansa kolone (očita efikasnost) može se izračunati iz podataka dobijenih iz

izotermičkih, izokratičkih ili izodensičnih stanja, u zavisnosti od tehnike, kao broj platoa
(takođe poznat I kao broj teoretskih platoa) iz sledećeg izraza, vrijednosti tr I wh izražene
istim jedinicama:

N = 5.54 ( tR/wh )2

tr= retenciono vrijeme vrha koje odgovara komponenti

wh= širina vrha na polu visini

Broj platoa varira sa komponentama kao I kolonama, temperaturom kolone, mobilne faze
I retencionog vremena.

Zapremina zadržavanja D

Zadrživa zapremina (poznata I kao zapremina gradijenta odlaganja) je zapremina između

tačke u kojoj se izlučivači susreću I vrha kolone. Može se odrediti koristeći sledeću
proceduru:

Kolona:zamijeniti hromatografsku kolonu odgovarajućom kapilarnom cijevi (napr 1m x

0.12 mm)

6
Mobilna faza:
-mobilna faza A: voda
-mobilna faza B: 0.1 % rastvora acetona u vodi:

Vrijeme mobilna faza A mobilna faza B

(min) ( % V/V ) ( % V/V )
0-20 100→0 0→100
20-30 0 100

Brzina protoka: da bi se dobio dovoljan povratni pritisak (napr 2ml/min)

Detekcija: spektrofotometar na 265 nm

Određuje vrijeme t0.58min) kada je apsorpcija 50% od konačne apsorpcije, I vrijeme

tg(min) kada se postigne nivo konačne apsorpcije.

D=td x F

gdje je:

td=t0.5-0.5tg(min)
F= koeficijent protoka(ml/min)

Faktor simetrije (As)

Faktor simetrije vrha (slika 2.2.46.-4.) izračunava se iz izraza:

As=w 0.5 / 2d

w 0.5 = širina vrha na visni jedan-dvanaest

d= distanca između pada okomitosti od vrha maksimuma I vodeća ivica vrha na visini
jedan-dvanaesti

As vrijednost 1.0 označava simetriju. Kada As>1.0, vrh je jalov. Kda je As<1.0 vrh
prednjači.

7
Slika 2.2.46.-4
Rezolucija R

Rezolucija između pikova dvije komponentne (slika 2.2.46.-1) može se izračunati iz

izraza:

Rs = (1.18α (tr2-tr1) / (wh1 + wh2)

tr1, tr2 =retenciona vremena vrhova

wh1,wh2=širina vrhova na polu visini

U kvantitativnoj planarnoj hromatografiji, koristeći gustinometar, migracione distance se

koriste umjesto retencionih vremena I rezolucija između vrhova I dvije komponente se
može izračunati koristeći izraz:

Rs= 1.18a(Rf2 – Rf1)/(wh1+wh2)

Rf1= faktor retardacije vrhova

wh1,wh2= širina vrhova na polu visini
a=migraciona distanca prednjeg rastvora

Odnos (koeficijent ) pik /dolina

Koeficijent vrh-dolina može da se koristi kao kriterijum sistema pogodnosti u testu za

slične supstance kada se osnovica razdvajanja između dva vrha ne postigne. (slika
2.2.46.-5.)

8
p/V = Hp/He

Slika 2.2.46.-5.
Hp- visina iznad ekstrapolirane osnovice na manjem vrhu
Hv- visina iznad ekstrapolirane osnovice na najnižoj tački krive koja razdvaja manje I
veće vrhove

Relativno zadržavanje ( retencija ) r

Relativno zadržavanje se izračunava kao procjena iz izraza:

r = ( tRi – tRm ) / ( tRst - tM )

tri= retenciono vrijeme interesantnog vrha

trst= retenciono vrijeme referentnog vrha (obično vrha koji odgovara supstanci koja se
ispituje)
tm= vrijeme zadržavanja

Neprilagođena relativna retencija (rg) se izračunava iz izraza:

rG = tRi/tRst

Ukoliko nije drugačije naznačeno, vrijednosti za relativnu retenciju u monografima

odgovara neprilagođenoj relativnoj retenciji.

Kod planarne hromatografije, retardacioni faktor Rfst I Rfi se koriste umjesto trst I tri.

rG = tRi/tRst

9
Odnos signal-šum S/N
Kratkotrajni šumovi utiču na tačnost kvantifikacije. Koeficijent signala šuma izračunava
se iz sledeće jednačine:

S/N = 2H/h

Slika. 2.2.46.-6.

H= visina vrha odgovara komponenti, u hromotogramu dobijena uz pomoć propisanog

referentnog rastvora, mjerena od maksimuma vrha do ekstrapolirane osnovice signala
primijećenog distancom jednakom kao 5 puta širina na polu visini.

h= raspon šuma u hromatogramu, dobijen nakon ubrizgavanja ili aplikacije, u

hromotogramu dobijena uz pomoć propisanog referentnog rastvora, mjerena od
maksimuma vrha do ekstrapolirane osnovice signala primijećenog distancom jednakom
kao 5 puta širina na polu visini, I ako je moguće smještenim jednako oko mjesta gdje se
ovaj vrh može naći.

Ponovljivost sistema
Ponovljivost odgovora se izražava kao procenat relativne standardne devijacije (sr(%))
uzastopnih serija mjerenja za ne manje od 3 ubrizgavanja ili aplikacije referentnog
rastvora I izračunava se iz sledećeg izraza:

Sr (%) = (100/ÿ) x (

Yi= individualne vrijednosti izražene kao površina vrha, visina vrha, ili koeficijent
površina internim standardizacionim metodama
Y= sredina individualnih vrijednosti
N= broj individualnih vrijednosti

10
Pogodnost sistema

Različite komponente opreme koja se koristi moraju biti kvalifikovane I sposobne za

postizanje potrebnih radnji za sprovođenje testa ili ispitivanja.
Test pogodnosti sitema predstavlja sastavni dio metoda I koristi se kako bi se osigurao
adekvatni performans hromatografskog sistema. Očigledna efikasnost, faktor retencije
(koeficijent distribucije), rezolucija, relativna retencija I faktor simetrije su parametri koji
se često koriste u procjeni performansi kolone. Faktori koji mogu uticati na
hromatografsko ponašanje uključuju:

-sastav, jonsku snagu, temperaturu I očigledni pH mobilne faze

-koeficijent prtoka, dimenzije kolone, temperatura I pritisak kolone

-karakteristike stacionarne faze uključujući tip hromatografske podrške ( partikle ili

monolitičke), partikle ili makropore veličine, poroznost, specifična površina

-povratna faza I ostale površinske modifikacije stacionarne faze, dodatak hemijske

modifikacije (kao što je izraženo pokrovnim slojem, gomilanjem ugljenika isl.)

Sledeći zahtjevi I bilo koji suplementarni zahtjevi dati u individualnom monografu

moraju biti ispunjeni osim ukoliko nije drugačije propisano:

-kod testova sličnih supstanci, za vrh u hromatogramu dobijenom sa referentnim

rastvorom koji se koristi za kvantifikaciju, faktor simetrijeje između 0.8 I 1.5, osim ako
nije drugačije propisano.

- u ispitivanju aktivnih supstanci gdje je vrijednost 100%za čistu supstancu,

maksimalna dozvoljena relativna odstupanja za definisani limit je izračunata za
serije ubrizgavanja referentnog rastvora koristeći sledeći izraz:

sr (%)max = ( KBn1/2 ) / t90%,n-1

K- konstanta(0.349) dobijena iz izraza K= 0.6/2 x t90%.5/6 gdje 0.6/2 predstavlja traženi

procenat relativne standardne devijacije nakon 6 ubrizgavanja za B

B- gornji limit dat u definiciji individualnih monografa minus 100%

n- broj repliciranih unošenja referentnog rastvora (3≤n≤6)

t90%,n-1- studentsko t na 90% nivou vjerovatnoće (dvostrani) sa n-1 stepenom slobode

Osim ukoliko to nije drugačije propisano, maskimalna dozvoljena relativna devijacija ne

prelazi odgovarajuće vrijednosti date u Tabeli 2.2.46-1. Ovi zahtjevi nijesu primjenljivi
na testove za relativne supstance.

11
U testovima vezanih supstanci, limit kvantitacije (koji odgovara koeficijentu signala
šuma 10) je isti ili manji od zanemarljivog limita..

Slaganje sa kriterijumima pogodnosti sistema zahtijeva se kroz hromatografsku

proceduru. U zavisnosti od različitih faktora, kao što su učestalost procedure sa
hromatografskim sistemom, analitičar treba da odabere odgovarajuće verifikacione šeme
kako bi ti ispratio.

tabela 2.2.46.-1

Broj individualnih injektiranja

3 4 5 6
B(%) Maksimalna dozvoljena standardna devijacija
2.0 0.41 0.59 0.73 0.85
2.5 0.52 0.74 0.92 1.06
3.0 0.62 0.89 1.10 1.27

Podešavanje hromatografskih uslova

Granice do kojih različiti parametri hromatografskog testa mogu da se podešavaju kako
bi zadovoljili kriterijum pogodnosti sistema sa osnovnim modifikujućim metodama
izlistane su u daljem tekstu. Podešavanje uslova sa gradijent izlučivačima je više kritično
nego sa izokratičnim, jer može dovesti do smjena u vrhovima, I tako voditi do
nepravilnog uposlenja vrha, I do maskiranja vrhova ili smjene kao da se izlučivači pojave
prije propisanog vremena za izlučivanje. Promjene koje nijesu naznačene zahtijevaju
revalidaciju metoda. Hromatografski uslovi koji su opisani su procjenjivani tokom
elaboracije monografa.

Testovi pogodnosti sistema su uključeni kako bi verifikovali to da je separacija potrebna

za zadovoljavajući performans testa ili ispitivanja postignuta. Pošto je stacionarna faza
opisana na opšti način I pošto postoje različitosti dostupne komercijalno, sa promjenama
u hromatografskom ponašanju, neka podešavanja hromatografskih uslova mogu biti
neophodna kako bi se postigli propisani zahtjevi pogodnosti sistema. Sa metodom
obrnute vodene faze, u suštini, podešavanje različitih parametara neće uvijek rezultirati
zadovoljavajućom hromatografijom. U tom slučaju, može biti potrebno zamijeniti kolonu
sa drugom istog tipa (napr oktadecilsililsilica gel), koja proizvodi željeno hromatografsko
ponašanje. Baza podataka na EDQM web sajtu obično sadrži informacije o kolonama
koje se koriste tokom monografske elaboracije.

Za kritične parametre podešavanja su definisana jasno u monografu kako bi se osigurala

pogodnost sistema.

Tankoslojna I papirna hromatografija

Sastav mobilne faze: količina manjeg rastvornog sastojka može biti smanjena do +/- 30%
relativno I +/-2% apsolutno, koje god je veće; ta manje sastojke na 10% mobilne faze,
30% relativnog podešavanja dozvoljava raspon od 7-13% dok 2% apsolutnog

12
podešavanja dozvoljava taspon od 8-12%, I stoga je relativna vrijednost veća; za manje
sastojke na 5% mobilne faze, 30% relativnih podešavanja dozvoljava raspon od 3.5-6.5%
dok 2% apsolutnog podešavanja dozvoljava raspon od 3-7%, I u ovom slućaju je
apsolutna vrijednost veća. Ni jedan drugi sastojak nije mijenjan više od 10% apsolutnoto.

pH vodenog sastojka mobilne faze +/-2pH, osim ako nije drugačije propisano,ili +/-1.0
pH kada se ispituju nejonizirajuće supstance.

Koncentracija soli u sastojku mobilne faze: +/- 10%.

Primjenjiva zapremina: 10-20% propisane zapremine ukoliko se korite platoi fine
veličine (20-10)

Tečna hromatografija: izokratsko eluiranje

Sastav mobilne faze: količina manjeg rastvornog sastojka može biti podešena do +/-30%
relativno I +/-2% apsolutno, koje god je veće(pogledaj primjer iznad). Nijedan drugi
sastojak se ne mijenja više od 10% apsolutno.

pH vodenog sastojka mobilne faze +/-2pH, osim ako nije drugačije propisano,ili +/-1.0
pH kada se ispituju nejonizirajuće supstance.

Koncentracija soli u sastojku mobilne faze: +/- 10%.

Koeficijent toka: +/-50%. Veća podešavanja su prihvatljiva kada se mijenja dimenzija

kolone (pogledaj formulu ispod).

Parametri kolone
Stacionarna faza:
-nije dozvoljena promjena identiteta supstituenta stacionarne faze (napr. Nema zamjene
C18 sa C8).
-veličina partikle: maksimalna redukcija 50%, nema povećavanja.

Dimenzije kolone:
Dužina +/-70%
Unutrašnji prečnik +/-25%

Kada se promijene dimenzije kolone, koeficijent toka može se podesiti koliko je potrebno
koristeći sledeću jednačinu:

F1= koeficijent toka naznačen u monografu, u mililitrima po minutu

F2= promijenjeni koeficijent toka, u mililitrima po minutu
l1= dužina kolone naznačena u monografu u milimetrima
l2= dužina kolone koja se koristi u milimetrima
d1= unutrašnji prečnik naznačen u monografu, u milimetrima
d2= unutrašnji prečnik kolone koja se koristi, u milimetrima

13
Temperatura +/-10C, gdje je određena operativna temperatura, osim ukoliko nije
drugačije propisano.
Detektor dužine talasa; nijesu dozvoljene promjene.

Zapremina ubrizgavanja: može biti smanjena, obezbijeđena detekcija I ponovljivost

vrhova koji se određuju su zadovoljavajući, bez povećanja.

Tečna hromatografija: graduentno eluiranje

Podešavanje hromatografskih stanja za gradijatni sistem zahtijeva veći oprez nego kod
izokratnih sistema.

Sastav mobilne faze/gradijatno eluiranje:manja podešavanja sastava mobilne faze I

gradijenta su prihvatljiva ukoliko su:
- ispunjeni zahtjevi podobnosti sistema
- osnovni vrhovi eluiraju u roku od +/-15% naznačenog retencionog vremena
- konačni sastav mobilne faze nije slabiji u elutivnoj snazi u odnosu na propisani sastav

Gdje slaganje sa zathevima podobnosti sistema ne može biti postignuto, poželjno je

smatrati zapreminu zadrživom ili treba promijeni kolonu.

Zadrživa zapremina. Konfiguracija opreme koja se koristi može značajno uticati na

rezoluciju, retenciono vrijeme I relativne retencije. Do ovoga može doći zbog ekcesivne
zadržive zapremine. Monografi uključuju više izokratne korake prije početka gradijatnog
programa tako da usvajanje može biti napravljeno u odgovarajuće gradijtno vrijeme kako
bi se uzele u obzir različitosti u zadrživoj zapremini između sistema koji se koriste za
razvoj. Odgovornost je korisnika da adaptira dužinu izokratskih koraka analitičkoj
opremi koja se koristi. Zadrživa zapremina koja se koristi tokom elaboracije monografa
je data u monografu, tačke vremena (t min) naznačene u gradijent tabeli mogu biti
zamijenjene adaptiranim tačkama vremena (tc min) izračunatim koristeći sledeću
jednačinu:

tc = t – ( ( D – D0 )/F )

D- zadrživa zapremina u mililitrima

D0- zadrživa zapremina, u mililitrima, koja se koristi za razvoj metoda
F- koeficijent toka, u mililitrima po sekundi

Izokratični koraci za ovu svrhu mogu biti izostavljeni ukoliko su dostupni validacioni
podaci za ovu aplikaciju metoda bez ovog koraka.

pH vodenog sastojka mobilne faze: nijesu dozvoljene promjene.

Koncentracija soli u sastojku mobilne faze: nijesu dozvoljene promjene.

Koeficijent toka: podešavanja su prihvatljiva kada se mijenja dimenzija kolone (pogledaj

formulu ispod).

14
Parametri kolone:
Stacionarna faza:
-nema promjene identiteta supstituenta stacionarne faze (napr. Nema zamjene C18 sa
C8).
Veličina partikle: nijesu dozvoljene promjene.
Dimenzije kolone:
Dužina +/-70%
Unutrašnji prečnik: +/-25%

Kada se promijene dimenzije kolone, koeficijent toka može biti promijenjen koliko je
potrebno koristeći sledeću jednačinu:

F1= koeficijent toka naznačen u monografu, u mililitrima po minutu

F2= promijenjeni koeficijent toka, u mililitrima po minutu
l1= dužina kolone naznačena u monografu u milimetrima
l2= dužina kolone koja se koristi u milimetrima
d1= unutrašnji prečnik naznačen u monografu, u milimetrima
d2= unutrašnji prečnik kolone koja se koristi, u milimetrima

Temperatura +/-5C, gdje je određena operativna temperatura, osim ukoliko nije drugačije
propisano.
Detektor dužine talasa: nijesu dozvoljene promjene.
Zapremina ubrizgavanja: može biti smanjena, obezbijeđena detekcija I ponovljivost
vrhova koji se određuju su zadovoljavajući, bez povećanja.

Gasna hromatografija

Parametri kolone:
Stacionarna faza:
-veličina partikle: maksimalna redukcija 50%, bez povećanja (pakovane kolone)
-debljina filma: -50% do + 100% 8kapilarne kolone)

Dimenzije kolone:
Dužina +/-70%
Unutrašnji prečnik: +/-50%
Koeficijent toka: +/-50%
Temperatura: +/-10%

Zapremina ubrizgavanja I zapremina odvajanja: mogu da se mijenjaju, obezbijeđena

detekcija I ponovljivost su zadovoljavajući.

4. 6. Superkritična fluidna hromatografija

15
Superkritična fluidna hromatografija (SFC) je metoda kod koje je mobilna faza gas na
temperaturi i pritisku iznad kritičnih vrijednosti (pod ovim uslovima mobilna faza je
superkritični fluid - niti je gas niti tečnost). Superkritični fluidi imaju viskoznost sličnu
gasovima, pa lahko prolaze kroz kapilarne i pakovane kolone bez potrebe za visokim
pritiskom kao kod HPLC metode. Gustoća superkritičnih fluida je slična tečnostima, pa
se ponašaju kao rastvarač. Najčešće se koristi CO2. Njegova kritična temperatura je 31
°C i kritični pritisak 72.9 atm što se relativno lahko postiže.[6]

Sastav mobilne faze: za pakovane kolone, količina manjeg sastojka rastvora može da se
podesi do +/-30% relativno I +/-2% apsolutno, koji god je veći. Nije dozvoljeno
podešavanje za kapilarni kolonski sistem.

Detektor dužine talasa: nema podešavanja

Parametri kolone:
Stacionarna faza:
-veličina partikle: maksimalna redukcija 50%, nema povećanja(pakovane kolone)
Dimenzije kolone:
Dužina: +/-70%
Unutrašnji prečnik:
+/-25%(pakovane kolone)
+/-50% (kapilarne kolone)

Koeficijent kolone: +/-50%

Temperatura: +/-5C, gdje je određena operativna temperatura.
Zapremina ubrizgavanja: može da se smanji, obezbijeđena detekcija I ponovljivost su
zadovoljavajući.

Kvantifikacija

Sastav mobilne faze: za pakovane kolone, količina manjeg sastojka rastvora može da se
podesi do +/-30% relativno I +/-2% apsolutno, koji god je veći. Nije dozvoljeno
podešavanje za kapilarni kolonski sistem.

Detektor dužine talasa: nema podešavanja

Parametri kolone:
Stacionarna faza:
-veličina partikle: maksimalna redukcija 50%, nema povećanja(pakovane kolone)
Dimenzije kolone:
Dužina: +/-70%
Unutrašnji prečnik:
+/-25%(pakovane kolone)
+/-50% (kapilarne kolone)

Koeficijent kolone: +/-50%

Temperatura: +/-5C, gdje je određena operativna temperatura.

16
Zapremina ubrizgavanja: može da se smanji, obezbijeđena detekcija I ponovljivost su
zadovoljavajući.

17