Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama

epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Mikronukleus citom test u ćelijama epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i

nepušača

Čamdžić Arnela

Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Sarajevu, studentica I ciklusa, smjer Genetika

Apstrakt

Glavni cilj ovog istraživanja bio je utvrditi štetno dejstvo duhanaposmatrajući parametre
genotoksičnosti i citotoksičnosti primjenom mikronukleus citom test ćelija epitela bukalne
sluznice (BMCyt).Mikronukleus citom test je minimalno invazivna metoda za proučavanje
biomarkera DNK oštećenja, hromozomskih nestabilnosti, ćelijske smrti, proliferacije,
diferencijacije i regenerativnog potencijala humanog tkiva bukalne sluznice. Zahvaljujući
brojnim prednostima kao što su brzina, jednostavnost, senzitivnost, pouzdanost te pristupačna
cijena, ova metoda se sve više primjenjuje u genotoksikološkim studijama i
testiranjima.Posmatrana je i ispitivana frekvencijamikronukleusai ostalih citogenetičkih
oštećenja poput nukleusnih pupova, binuklearnih ćelija, kondenzovanoghromatina, karioreksije,
piknoze, kariolize, kod studenata Prirodno-matematičkog fakulteta u Sarajevu. Dob ispitanika
iznosila je između 22 i 25 godina, a ispitanici su podijeljeni u sljedeće skupine: pušači (N=7) i
nepušači (N=19).Ćelijesu analizirane pod uvećanjem od 400x pomoću elektronskog
svjetlosnogmikroskopa, čime je utvrđenafrekvencijasvihmarkeragenotoksičnostinanajmanje 500
ćelijapouzorku. Na osnovu dobijenih rezultata učestalosti mikronukleusakod pušača (p=0,2603),
nukleusnih pupova (p=0,2756), binuklearnih ćelija (p=0,6583), kondenzacije hromatina
(p=0,1899), karioreksije (p=0,3152), piknoze (p= 0,3524) i kariolize (p=0,9111) zaključujemo
da ne postoji statistički značajna razlika među ispitivanim skupinama.

Ključne riječi: oštećenja DNK, genotoksičnost, duhan, mikronukleus-test, bukalna sluznica

 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Sadržaj

1. Uvod ......................................................................................................................................................... 1

1.1. Mikronukleusi .................................................................................................................................... 1

1.2. Nastanak mikronukleusa .................................................................................................................... 4

1.3. Građa oralne sluznice ........................................................................................................................ 4

2. Materijal i metode ................................................................................................................................... 5

2.3. Ispitanici ............................................................................................................................................ 7

2.4. Prikupljanje uzoraka .......................................................................................................................... 7

2.5. Protokol za izradu i analiza preparata .............................................................................................. 8

Analiza preparata ..................................................................................................................................... 8

2.6. Statistička obrada podataka ............................................................................................................ 10

3. Rezultati ................................................................................................................................................. 11

4. Diskusija ................................................................................................................................................ 13

5. Zaključci ................................................................................................................................................ 15

6. Sažetak ................................................................................................................................................... 16

7. Literatura............................................................................................................................................... 17
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

1. Uvod

Različiti agensi koji narušavaju molekularnu ili ćelijsku strukturu i organizaciju genetičkog
materijala i/ ili ćelijski ciklus, nazvani su jednom rječju genotoksini. Prema porijeklu obuhvataju
one koji potiču iz organizma- endogeni i one koji u organizam unose iz vanjske sredine-
egzogeni. Svi genotoksini koji mogu izazvati bilo kakve promjene podijeljeni su na biološke,
fizičkei hemijske agense. Ljudi su danas sve više izloženi štetnom djelovanju različitih agenasa.
Najštetnije efekte ispoljavaju fizički agensi, odnosno zračenja, te hemijski agensi, kakvi su
duhanski proizvodi(Haverić i sar. 2018).

Citotoksičnost se odnosi na oštećenje pojedine ćelije, naprimjer u kulturama ćelija te

predstavlja održivost ćelijskog života. Različite metode i parametri koji se koriste u određivanju
citotoksičnosti mogu se svrstati u sljedeće kategorije ocjenjivanja: (a) ocjenjivanje oštećenja
ćelija prema morfološkim osobinama, (b) mjerenje oštećenja ćelija, (c) mjerenje rasta ćelija i (d)
mjerenje specifičnih aspekata staničnog metabolizma (Camargo i sar. 2014).

Genotoksičnost se opisuje kao štetni učinak na genomski materijal, a može biti izazvana
oštećenjem DNK bez direktnog dokaza za mutacije (Yadav i Jaggi, 2015). Prenos genetskog
oštećenja na sljedeće generacije ćelija može se izbjeći programiranom smrti ćelije (apoptoza). U
slučaju da je došlo do prenosa genetičke pogreške na sljedeću generaciju govorimo o
mutagenosti. Mutagenost nam služi kao pokazatelj "moguće" kancerogenosti tvari koja je oštetila
DNK (Thomas i sar. 2009).

1.1. Mikronukleusi

Mikronukleusi su samostalne hromatinske strukture koje su potpuno odvojene od jedra.

Izgledaju poput dodatnog samostalog jedra smještenog unutar citoplazme, ali znatno manje
veličine koja mora biti između 1/6 i 1/3 promjera jedra te istog obojenja kao i jedro (Dhawn
2013).

Prisutnost mikronukleusa smatra se kvantitativnim pokazateljem postojanja strukturnih i/ili

numeričkih aberacija hromosoma koje su u ciljnim ćelijama nastale pod utjecajem različitih
genotoksičnih agensa u uslovima in vitro i/ili in vivo. Osim broja mikronukleusa, broj
nukleoplazmatskih mostova i broj nuklearnih pupova, mogu upućivati na biološke učinke koji
potencijalno prethode pojavi različitih bolesti. (Thomas i sar. 2009).

1
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

U ovom istraživanju procjenjuje se genotoksični učinak duhana na epitelne ćelije bukalne

sluznice. Neke se od tih ćelija se mogu preobraziti u:

• kondenzacije hromatina koje predstavljaju fazu apoptoze, u kojoj se događa brza

proteoliza proteina nuklearnog matriksa,

• ćelije sa fragmentiranim nukleusom (karioreksne ćelije) koje su tipične u kasnoj fazi

apopotoze,

• ćelije sa malim ili skupljenim nukleusom s dijametrom otprilike 1/3 normalne ćelije
(piknotičke ćelije),

• ćelije koje su kompletno izgubile nukleusni materijal (kariolitičke ćelije), koje se nalaze u
uznapredovaloj fazi nekroze i apoptoze,

• ćelije koje su blokirane u binuklearnoj fazi u kojima imamo prisutnost dva nukleusa slične
veličine, intenziteta bojenja i nalaze se u neposrednoj blizini ili se dodiruju,

• ćelije koje mogu pokazivati nuklearne pupove (poznate kao „slomljena jaja“) koji su
biomarkeri amplifikacije gena te su iste teksture i intenziteta bojenja kao glavni nukleus i spojeni
su s njim nukleoplazmičnom vezom, ali imaju manji dijametar od glavnog nukleusa (Kashyap
2012).

Ovi biomarkeri genomskog oštećenja

(npr. mikronukleusi, nuklearni pupovi) i
ćelijske smrti (npr. apoptoza, karioliza)
mogu pružiti bolju sveobuhvatnu
procjenu genomskog oštećenja u odnosu
na mikronukleuse u kontekstu
citotoksičnog i citostatičnog efekta (Slika
1.)

Slika 1. Dijagram različitih tipova ćelija epitela bukalne sluznice koje se analiziraju u BMCyt
testu (Thomas 2009).

2
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Faktori koji utječu na mikronukleuse u bukalnim ćelijama uključuju razlike u prikupljanju

uzoraka ćelija (vrijeme i sredstva koja se koriste), tehnike fiksiranja i bojenja, odabir i broj ćelija,
kriterij bodovanja i ostale anomalije nukleusa u normalnim i promijenjenim ćelijama. Koriste se
brojne metode bojenja, a u provredenom ispitivanju korišteno je Giemsa bojenje. Među ostalim
metodama bojenja je preferirana DNK specifična boja za bojenje nukleusa, mikronukleusa i
ostalih anomalija nukleusa u odljuštenim bukalnim ćelijama. Feulgen–Fast Green bojenje
omiljeno je od strane mnogih istraživača zbog svoje DNK specifičnosti i jasnog transparentnog
izgleda citoplazme, što omogućava jednostavnu identifikaciju mikronukleusa. Ostale boje
uključuju fluorescentne boje, diamidino2-fenilindol DAPI, akridin narandžastu, Hoechst,
propidij jodid. (Slika 2.)

Slika 2. Mikronukleus obojen May-Grunwald Giemsinom (Giemsinom) bojom -fotomikrografija

(Kashyap 2012).

Tolbert i saradnici razvili su kriterije za odabir ćelija i oni se najčešće primjenjuju. Sastoje se
od sljedećih parametara: 1. netaknuta citoplazma i relativno ravan položaj stanica na stakalcu, 2.
malo ili bez preklapanja sa susjednim ćelijama, 3. s malo ili bez debrisa, 4. nukleus normalan i
netaknut, nuklearan obujam gladak i izrazit. Predloženi su kriteriji za identifikaciju
mikronukleusa kako slijedi: (a) zaobljen, gladak obujam koji ukazuje na membranu; (b) manje
od jedne trećine promjera pripadajućeg nukleusa, ali dovoljno velik da se razluči oblik i boja; (c)
Feulgen pozitivan, odnosno ružičasto osvjetljenje širokog polja; (d) intenzitet bojanja sličan
onom od nukleusa; (e) tekstura slična onoj od nukleusa; (f) ista žarišna ravnina kao od nukleusa;
(g) odsutnost preklapanja s nukleusom. Također su preporučili analiziranje najmanje 1000 ćelija,
s povećanjem na 2000-3000, ako je manje od 5 mikronuklearnih ćelija zabilježeno nakon
prebrojavanja navedenih 1000 ćelija (Kashyap 2012).

3
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

1.2. Nastanak mikronukleusa

Prisutnost mikronukleusa jasan je pokazatelj postojanja aberacija u prethodnoj diobi ćelije.

Nastanak mikronukleusa mogu potaknuti genotoksične tvari u ćelijama izloženog organizma na
dva načina: Prvi je aneugeni učinak – nakon što ćelija uđe u diobu zbog oštećenja i
nefunkcionalnosti mikrotubula diobenog vretena, onemogućeno je putovanje jednog ili više
hromosoma na pol ćelije. Nakon citokineze zaostali će hromosomi u citoplazmi ćelije kćeri
kondenzacijom formirati mikronukleuse. (Channarayappa 1992).

Drugi je klastogeni učinak – mikronukleus nastaje od acentričnih fragmenata hromosoma

(hromatida i hromosoma) nastalih uslijed loma hromosoma. Spontanom nastanku mikronukleusa
doprinose mutacije kinetohornih proteina, centromera i diobenog vretena koje mogu izazvati
nejednaku raspodjelu hromosoma ili gubitak čitavih hromosoma tokom anafaze i nepopravljene
hromosomske lomove koji dovode do stvaranja acentričnih fragmenata, a nastaju djelovanjem
endogenih faktora ili pod vanjskim utjecajem. Međutim, kvantifikacija mikronukleusa ne govori
o mehanizmima koji su doveli do njihovog nastanka te su potrebna daljnja ispitivanja koja
određuju sadržaj mikronukleusa (npr. metoda C- pruganja) (Natjaran 2002).

Dakle, mikronukleusi koji sadrže fragmente hromosoma nastaju: (I) direktnim oštećenjem,
npr zbog loma molekule DNK; (II) udvostručavanjem DNK na osnovu informacije sadržane u
oštećenom kalupu, (III) inhibicijom sinteze DNK. Mikronukleusi koji sadrže čitave hromosome
nastaju ponajprije usljed oštećenja diobenog vretena, oštećenja kinetohora ili drugih dijelova
mitotskog aparata, oštećenja hromosomskih substruktura, promjena u fiziologiji ćelije ili
mehaničkih oštećenja (Channarayappa 1992).

1.3. Građa oralne sluznice

Bukalne ćelije predstavljaju prvu barijeru za inhalacijski i ingestijski put i sposobne su

metabolizirati najbliže kancerogene i reaktivne produkte. Dakle, moglo bi se tvrditi da oralne
epitelne ćelije predstavljaju ciljno mjesto za genotoksične događaje izazvane kancerogenim
agensima koji dospijevaju u tijelo. Oralni epitel se sastoji od 4 sloja strukturne, progenitorske i
maturacijske populacije ćelija – bazalnog sloja (stratum germinativum), trnastog sloja (stratum
spinosum), zrnastog sloja (stratum granulosum) i keratiniziranog sloja na površini (stratum
corneum) (Slika 3.). Niz prstolikih struktura, nazvanih „zupci pile“, protežu se iz lamine proprie
u epidermalni sloj i tvore valoviti efekt bazalnog sloja.

4
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Oralni epitel se održava kontinuiranom obnovom ćelija, čime nove ćelije, proizvedene u
bazalnom sloju pomoću mitoze, migriraju na površinu i zamjenjuju one koje su odbačene.
Bazalni sloj sadrži matične ćelije koje mogu izraziti genetska oštećenja (gubitak ili lom
hromosoma) kao mikronukleuse tokom podjele nukleusa. Ćelije kćerke, koje mogu i ne moraju
sadržavati mikronukleuse, na kraju se diferenciraju u trnasti sloj ćelija i keratinizirani površinski
sloj i zatim se odljušte u usnu šupljinu (Junqueira i sar. 1999).

Slika 3. Prikaz poprečnog presjeka slojeva u kojima se nalaze bukalne ćelije (Kashyap 2012).

2. Materijal i metode

Kao što je već spomenuto, ovo istraživanje bilo je usmjereno na citotoksične i genotoksične
efekte duhana na humane ćelije bukalne sluznice. Istraživanje se provodilo na odsjeku za
Biologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Sarajevu.

5
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

2.1. Hemijski sastav duhana

Budući da je jedan od agenasa kojima je bukalna sluznica često izložena duhan, kao i sve
štetne materije koje se nalaze unutar duhana, naše istraživanje bazirat će se upravo na
genotoksično dejstvo duhana i supstanci sadržanih u njemu. Duhan se sastoji iz skupine otrovnih
materija, a ne samo od nikotina. Hemijski sastav duhanskog dima je veoma složen, jer se u
njemu nalazi oko 1400 različitih supstanci.

Među njima su najotrovniji: nikotin, bronhijski nadražljivci, ugljični oksidi, katrani,

radioaktivni polonij, arsen .Velik broj aditiva se dodaje za poboljšanje okusa, konzerviranje, za
vlažnost, za poboljšanje izgaranja i povezanost sastojaka a to su prije svega amonijum hlorid koji
pojačava djelovanje nikotina, zatim šećeri i glikol, koji karameliziraju zajedno s amonijakom i
utječu na okus, mentol, kao i razni spojevi glikola.

2.2. Test koji je korišten- Mikronukleus citom test u ćelijama epitela bukalne sluznice (BMCyt)

Mikronukleus esej u ćelijama epitela bukalne sluznice je jednostavna, brza, senzitivna, jeftina
i pouzdana metoda koje se upotrebljava u komparativnim genotoksikološkim studijama i
monitorinzima ljudskih populacija u kojima se utvrđuje izloženost genotoksičnim agensima u
životnoj sredini, ali i u različitim epidemiološkim te farmakološkim ispitivanjima (Haverić i sar.
2018).

Učestalost mikronukleusa može se utvrđivati u različitim vrstama ćelija, bilo izravno, bilo
nakon uzgoja u ćelijskoj kulturi. U novije vrijeme u biološkom nadzoru sve veću važnost ima i
primjena raznih vrsta “ne-krvnih” ćelija koje su lako dostupne uzorkovanju (ćelije bukalne i
nosne sluznice, stanice iz folikula dlake, stanice bronhoalveolarnog epitela, epitela kolona,
cerviksa, mokraćnih puteva kao i muške spolne ćelije). (Fenech i sar. 2003).

BMCyt je minimalno invazivna metoda za proučavanje biomarkera DNK oštećenja,

hromozomskih nestabilnosti, ćelijske smrti, proliferacije, diferencijacije, te genotoksičnih efekata
različitih agenasa koji djeluju na ćelije bukalne sluznice. Sve više se primjenjuje pri
molekularno- epidemiološkim studijama, gdje se u obzir uzimaju faktori poput prehrambenih
navika, načina života, te izloženosti toksičnim agensima (Thomas i Fenech 2011).

6
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Posebna mu je prednost što omogućuje otkrivanje oštećenja na razini DNA/hromosoma i

diobenog vretena. Ovaj test obuhvata analizu frekvencija normalnih bazalnih i diferenciranih
ćelija, binukleusnih, mikronuklearnih i ćelija sa nukleusnim pupovima i mostovima te karioliza,
piknoza i karioreksija u uzorcima epitela bukalne sluznice. (Mateuca i sar. 2006; Haveric i sar.
2018).

Mikronukleus test je test koji otkriva gubitak hromosoma ili oštećenje diobenog vretena
uzrokovanih aneugenim mehanizmima. Ova metoda se temelji na sljedećim principima i
zapažanjima: u anafazi acentrična hromatida i hromosomski fragmenti počinju zaostajati kada se
centrični elementi kreću prema polovima vretena. Nakon telofaze neoštećeni hromosomi, kao i
centrični fragmenti, dovode do redovne kćeri nukleusa.

Zaostajući su elementi, također, uključeni u ćelije kćeri, ali značajan se udio transformiše u
jedan ili nekoliko sekundarnih nukleusa, koji su, u pravilu, znatno manji od glavnog nukleusa i
stoga se nazivaju mikronukleusi. Dakle, mikronukleusi su fragmenti ili cijeli hromosomi koji
nisu dosegli polove diobenog vretena tokom mitoze i ostali su inkapsulirani u telofazi u
odvojenom nukleusu (Kashyap 2012).

Tokom posljednje decenije primjena ovog eseja u epitelnim ćelijama bukalne sluznice prilikom
genotoksikoloških monitoringa humanih populacija postala je učestala u brojnim istraživačkim
laboratorijama, a kao jedinstven i optimiziran metod uspostavljen je nakon međunarodnog
multicentričnog projekta Micronucleus frequency in human exfoLiated cells (HUMNXL) 2011.
godine. (Haverić i sar. 2018).

2.3. Ispitanici

Istraživanje je provedeno na 26 studenata, 25 žena i 1 muškarca, starosne dobi između 22-26

godina. Svi ispitanici su studenti završne godine prvog ciklusa navedenog fakulteta. Ispitanici su
na osnovu toga da li konzumiraju cigarette podijeljeni u dvije skupine: pušači (N=7) i nepušači
(N=19). Pojedinci koji su pušili tri ili više cigareta dnevno najmanje godinu dana smatrani su
pušačima. Kriteriji uključenja su zdravi studenti bez sistemskih oboljenja.

2.4. Prikupljanje uzoraka

Uzorak ćelija bukalne sluznice se prikupljao pomoću plastične spatulice, prethodno sterilisane
(UV), a potom je stavljen u plastičnu tubicu sa pripremljenim fiksativom. Prikupljanje uzoraka
vršeno je u laboratoriji Instituta za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju u Sarajevu.

7
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

2.5. Protokol za izradu i analiza preparata

Najprije smo pripremili odgovarajuće količine fiksativa od apsolutnog etanola i glacijalne

sirćetne kiseline (3+1). Potom smo napravili 5% otopina Giemsa boje u fosfatnom (Gurr) puferu,
nakon čega je vršena sterilizacija (UV) plastične spatule za uzimanje uzorka brisa epitela
bukalne sluznice. Uzorkovanje brisa rađeno je plastičnom spatulom. Uzorak je stavljen u
plastičnu tubicu sa 3 ml fiksativa (Haverić i sar. 2018).

Uzorkovane ćelije fiksirane su u acetik-alkoholnom fiksativu inkubacijom u frižideru na +4°C

u trajanju od 15 minuta. Uzorak je centrifugiran na 1100 rpm 10 minuta, nakon čega smo
odstranili supernatant i u ostatku tečne faze (oko 300 µl) resuspendirali ćelije.

Nanijeli smo po 3 kapi suspenzije fiksiranih ćelija na predmetno staklo te napravili po jedan
preparat za svaki uzorak. Preparati su osušeni na sobnoj temperaturi. Nakon što su se osušili na
zraku preparate smo obojili 5% otopinom Giemsa boje (otopina u fosfatnom Gurr puferu) u
trajanju od 7 minuta. (Haverić i sar. 2018).

Analiza preparata

Preparati se analiziraju pod povećanjem 400x uz pomoć elektronskog svjetlosnog

mikroskopa, s time da su svaki mikronukleus i ostale nuklearne anomalije dodatno provjereni
pod povećanjem od 1000x. Za svakog ispitanika je analizirano 1000 epitelnih ćelija.

Bazalne ćelije uočavaju se kao ćelije manjeg dijametra i većeg omjera nukleus:citoplazma u
odnosu na diferencirane ćelije, ovalnog oblika, sa jednolično obojenim nukleusom. Diferencirane
ćelije razlikujemo kao veće spljoštene ćelije, manjeg omjera nukleus:citoplazma, poligonalnog
su oblika i jednolično obojenog okruglog nukleusa.(Haverić i sar. 2018).

Učestalost pojavljivanja nuklearnih abnormalnosti, poput binuklearnih ćelija, kariolize,

karioreksije, mostova i nukleusnih pupova, procijenjena je i kvalifikovana prema Tolbert i sur.
(Kashyap 2012).

8
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Da bi se mikronukleus računao kao takav morao je ispuniti sljedeće uvjete: a) morao se

sastojati od nuklearnog materijala, b) morao je biti potpuno odvojen od matičnog nukleusa, c)
morao je biti manji od 1/3 promjera glavnog nukleusa d) morao je biti glatkog, ovalnog ili
okruglog oblika, e) morao je biti u istoj ravnini fokusa i f) morao je biti iste boje i teksture kao i
glavni nukleus.

Ćelije s dva nukleusa su smatrane binuklearnim. Nuklearne anomalije, kao što su karioreksija
(nuklearni raspad), karioliza (otapanje jedra), nukleusni pupovi (prethodnici mikronukleusa) i
nukleoplazmatski mostovi bilježile su se odvojeno (Tabela 1).

Tabela 1. Pregled markera koji se posmatraju u sklopu mikronukleus citom testa u ćelijama
bukalne sluznice (BMCyt

POSMATRANI MARKER KARAKTERISTIKE POSMATRANOG MARKERA

Mikronukleus (MN) Manji nukleus ovalnog oblika, jednakog intenziteta obojenosti

kao i normalni nukleus (obuhvata 1/16 do 1/3 prečnika
normalnog nukleusa)

Nukleusni pup (NP) Pup u vidu suženja istog intenziteta obojenosti kao nukleus
kojeg veže (pup obuhvata 1/4 do 1/2 prečnika nukleusa)

Binuklearne U ćeliji smještena dva nukleusa slične veličine i ujednačenog

intenziteta obojenosti
ćelije (BN)

Kondenzacija hromatina (CC) Područja skupljenog hromatina unutar nukleusa

Karioreksija (KR) Izrazito skupljen hromatin unutar nukleusa, te je moguća

fragmentacija nukleusa

Piknoza (P) Mali nukleus (obuhvata 1/3 do 2/3 prečnika normalnog

nukleusa), kondenzovan, uniformno iintenzivno obojen

Karioliza (KL) Blijedo obojen nukleus zbog osiromašenja DNK

9
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Slika 4. Epitelne ćelije bukalne sluznice pokazuju različite anomalije nukleusa na 1000x

(A) normalna ćelija; (B) mikronukleus; (C) 5 mikronukleusa; (D) binuklearna ćelija;

(E) „slomljeno jaje“; (F) karioreksija; (G) karioliza; (H) piknoza (Yaday 2015).

2.6. Statistička obrada podataka

Za statističku obradu podataka korišteni su Excel, dio programskog paketa Microsoft Office
(Microsoft, Redmond, Washington, SAD) i programski paket STATISTICA (Dell Software,
Kalifornija, SAD). Deskriptivna statistika je korištena za određivanje osnovnih statističkih
parametara (medijana, minimalne,maksimalne vrijednosti).

Mann-Whitney testom nezavisnih uzoraka utvrđeno je postojanje/nepostojanje statistički

značajne razlike između srednjih vrijednosti za svaki mjereni parametar (mikronukleus,
binuklearna ćelija itd) za pojedine uzorke iz testiranih skupina. U svim je testovima korištena
statistička značajnost p<0,05. Ovo je neparametarski test za provjeravanje spadaju li dva uzorka
u populaciju s istim medijanom. Po smislu je sličan medijan testu, ali mu je snaga veća.

Značajnost dobivenog rezultata provjerava se uz pomoć z-vrijednosti normalne distribucije ili

uz pomoć tablica. Mann-Whitney U test je neparametrijski alternativni test nezavisnog uzorka t-
testa koji se koristi kada nisu ispunjeni uslovi za primjenu tog testa (raspodjela numeričkih
podataka nije normalna, ili se radi o ordinalnim ili rangiranim podacima). Služi za usporedbu dva
nezavisna uzorka koji su uzeti iz iste populacije.

10
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

3. Rezultati

U istraživanju je sudjelovalo 26 ispitanika, od kojih 25 žena i 1 muškarac (Slika 5.), u dobi od

22 do 25 godina. Od ukupog broja ispitanika 7 je svrstano u kategoriju pušača, a 19 u kategoriju
nepušača (Slika 6).

Spol

0 5 10 15 20 25 30

Muškarci Žene

Slika 5. Grafički prikaz broja ispitanika po spolu

Status konzumiranja duhana

0% 0%

27%

73%

Pušači Nepušači

Slika 6. Prikaz pušačkog statusa ispitanika

11
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Rezultati mikronukleus citom testa epitela bukalne sluznice prikazani su u Tabeli 2.

Posmatrani su sljedeći parametri: mikronukleusi, nukleusni pupovi, binuklearne ćelije,
kondenzacija hromatina, karioreksija, piknoza i karioliza. Izračunali smo i unijeli frekvencije
navedenih parametara kod pušača i nepušača, u programu Excel, (Slika 7.) zatim smo te
vrijednosti unijeli u program STATISTICA, a dobijeni rezultati predstavljeni su ispod. Prilikom
ispitivanja moguće je pratiti više varijabli, budući da različiti agensi mogu utjecati na epitelne
ćelije bukalne sluznice, npr. žvakaće gume, sredstva za oralnu higijenu, međutim mi smo se
opredijelili isključivo za posmatranje efekata duhana.

Tabela 2. Konačni rezultati BMCyt testa

12
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Slika 7. Frekvencije posmatranih parametara kod pušača i nepušača u Excelu

4. Diskusija

Sprovedenim ispitivanjem uzoraka bukalne sluznice nije potvrđena hipoteza da konzumacija

duhana uzrokuje povećan broj mikronukleusa, nukleoplazmatskih mostova, nukleusnih pupova i
ostalih posmatranih parametara. Hipoteza je smatrala da postoji statistički značajna razlika među
skupinama.

Takoreći, nismo dobili potvrdu o genotoksičnim efektima duhana na epitelne ćelije humane
bukalne sluznice.Međutim, treba imati na umu da je utjecaj ispitivan samo na epitelnim ćelijama
bukalne sluznice, dok utjecaj na neku drugu vrstu ćelija može biti drugačiji.

13
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

Ovim ispitivanjem nije potvrđeno da pušenje povećava broj hromozomskih aberacija tj. broj
hromozomskih oštećenja. Posmatrani parametri kod pušača nisu se značajnije mijenjali u odnosu
na parametre kod nepušača. Dobijeni rezultati se ne poklapaju sa brojnim istraživanjima i
literaturnim izvorima o efektima duhana na ljudsko zdravlje. U obzir treba uzeti i činjenicu da je
pripremu i analizu preparata obavio svaki student ponaosob, što usljed nedovoljne stručnosti
zapažanja dovodi u pitanje konzistentnost rezultata.

Na osnovu dobijenih rezultata učestalosti mikronukleusa kod pušača (p=0,2603), nukleusnih

pupova (p=0,2756), binuklearnih ćelija (p=0,6583), kondenzacije hromatina (p=0,1899),
karioreksije (p=0,3152), piknoze (p= 0,3524) i kariolize (p=0,9111) zaključujemo da ne postoji
statistički značajna razlika među ispitivanim skupinama.

Rezultati nisu statistički značajni jer su dobijene vrijednosti veće od p=0,05. Statistička
značajnost je postavljena na p<0,05. Z testom je također odbačena hipoteza, tako što se vrši
poređenje Z-vrijednosti s kritičnom vrijednošću. Kritična vrijednost je Z 1-α / 2 za dvostrani test,
a Z 1-α za jednostrani test. Za dvostrani test, ako je apsolutna vrijednost Z-vrijednosti veća od
kritične vrijednosti, hipoteza se odbacuje.

Naše rezultate možemo tumačiti činjenicom da je prikupljen jako mali broj uzoraka (N=26).
Budući da je ispitivanje nemoguće vršiti na cijeloj populaciji zbog velikih materijalnih troškova,
gubitka vremena, izabrali smo jedan njen podskup na kom ćemo vršiti istraživanje. Broj
elemenata tog skupa nazivamo obim uzorka. Broj naših uzoraka nije bio dovoljan za donošenje
objektivnih zaključaka.

Zaključci izvedeni na osnovu uzorka bit će kvalitetniji što je uzorak veći. Ovo pravilo naziva
se jos i “zakon velikih brojeva”. No , bitno je da uzorak uvijek bude reprezentativan. Dvije
komparirane grupe nisu bile jednake po veličini, što također može utjecati na rezultat statističkih
analiza i zaključak uopće.

14
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

5. Zaključci

U današnje vrijeme životni i radni okoliš čovjeka predstavlja nepredvidivu mješavinu

hemijskih spojeva od kojih neki mogu djelovati mutageno ili kao aneugeni karcinogeni. (Yadav
2015). Duhan, duhanski proizvodi, i duhanski dim su agensi kojima je pojedinac često izložen.
Ispitivanja, poput ovoga, koristeći savremene metode, koje uključuju utvrđivanje mikroskopskih
vidljivih oštećenja hromosoma ćelija u uvjetima in vitro, omogućuju procjenu genotoksičnosti
navedenih hemikalija te kako one utječu na ljudski genom.

S obzirom na dobijene rezultate provedenog istraživanja hromozomskih aberacija i oštećenja

primjenom mikronukleus citom testa epitelnih ćelija bukalne sluznice, mogu se izvesti sljedeći
opći zaključci:

 u ispitivanim uzorcima nije uočena učestalija frekvencija mikronukleusa i drugih

posmatranih parametara kod pušača
 učestalost mikronukleusa, nukleusnih pupova, kondenzacije hromatina, karioreksije,
piknoze i kariolize nije značajno odstupala između kompariranih skupina pušača i
nepušača
 u skladu sa prethodno navedenim, nema razlike u parametrima citotoksičnosti i
genotoksičnosti na ćelijama bukalne sluznice dobijenih mikronukleus testom
 rezultati istraživanja nisu od statističke značajnosti
 da bi došli do objektivnih zaključaka o genotoksičnim efektima pušenja neophodno je
prikupiti znatno veći broj uzoraka

15
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

6. Sažetak

Naslov projekta: Mikronukleus citom test u ćelijama epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i
nepušača

Cilj istraživanja: Ispitati da li postoje značajne razlike u učestalosti mikronukleusa i drugih

parametara genotoksičnosti duhana kod pušača u odnosu na nepušače

Materijal i metode: Ispitivanje je provedeno na Prirodno-matematičkom fakultetu u Sarajevu,

nad grupom studenata (N=26) završne godine prvog ciklusa. Svakom ispitaniku uzet je bris
bukalne sluznice prethodno sterilisanom (UV) spatulicom, a izrada preparata odvijala se u skladu
sa opisanim protokolom. Korišten je mikronukleus citom test u ćelijama epitela bukalne sluznice
(BMCyt), a posmatrane su frekvencije mikronukleusa, nukleusnih pupova itd, pomoću
elektronskog svjetlosnog mikroskopa.

Rezultati: Dobijeni rezultati nisu pokazali značajnu razliku u učestalosti aberacija kod pušača.
što se ne podudara sa brojnim sličnim istraživanjima i literaturom o genotoksičnim efektima
duhana. Hipoteza se odbacuje. Uzorak nije bio dovoljno velik, a studenti su pravili preparate
ponaosob, pa je nedovoljna stručnost i moć zapažanja mogla utjecati na rezultate.

Zaključak: Učestalost mikronukleusa, nukleusnih pupova, kondenzacije hromatina, karioreksije,

piknoze i kariolize nije značajno odstupala između kompariranih skupina pušača i nepušača. Da
bi došli do objektivnih zaključaka o genotoksičnim efektima pušenja neophodno je prikupiti
znatno veći broj uzoraka od ispitivanih.

Ključne riječi: oštećenja DNK, genotoksičnost, duhan, mikronukleus-test, bukalna sluznica

16
 Izvještaj projekta iz predmeta Mutageneza i genotoksikologija: Mikronukleus citom test u ćelijama
epitela bukalne sluznice (BMCyt) pušača i nepušača

maj, 2019.

7. Literatura

1. Albertini RJ, Anderson D, Douglas GR, Hagmar L, Hemminki K, Merlo F, Natarajan

AT, Norppa H, Shuker DEG, Tice R, Waters MD, Aitio A. IPCS guidelines for the
monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. Mutat Res 2000;463:111-72
2. Camargo SE, Joias RP, Santana-Melo GF, Ferreira LT, El Achkar VN, Rode Sde M.
Conventional and whitening toothpastes: cytotoxicity, genotoxicity and effect on the
enamel surface. American journal of dentistry. 2014;27(6):307-11
3. Dhawn A, Bajpayee MB. Genotoxicity Assessment: Methods and Protocols. New York:
Humana press; 2013;166-176
4. Fenech M, Chang WP, Kirsch-Volders M, Holland N, Bonassi S, Zeiger E. HUMN
project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus
assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutat Res 2003;534:65-75
5. Fenech M: The in vitro micronucleus technique; Mutation Research 455: 81-95(2000).
6. Fučić A, Mijić A. In vitro i in vivo mikronukleus metode u genotoksikološkim
istraţivanjima. Arh Hig Rada Toksikol. 1999;50: 299–306
7. Haverić, S., Haverić, A., Hadžić, M. (2018) Genotoksikologija. Univerzitet u Sarajevu –
Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, Sarajevo.
8. Junqueira LC, Carneira J, Kelley RO. Osnove histologije. Zagreb: Školska knjiga;
1999;284-290.
9. Kashyap B, Reddy PS. Micronuclei assay of exfoliated oral buccal cells: means to assess
the nuclear abnormalities in different diseases. Journal of cancer research and
therapeutics. 2012;8(2):184-91.
10. Mateuca R, Lombaert N, Aka PV, Decodier I, Kirsch-Volders M. Chromosomal changes:
induction, detection methods and applicability in human biomonitoring.
Biochemie2006;88:1515-31.
11. Salama S, Serrana M, Au WW. Biomonitoring using accessible human cells for exposure
and health risk assessment. Mutat Res 1999;436:99-112
12. Thomas P, Holland N, Bolognesi C, Kirsch-Volders M, Bonassi S, Zeiger E, et al. Buccal
micronucleus cytome assay. Nature protocols. 2009;4(6):825-37.
13. Thomas P, Wu J, Dhillon V, Fenech M. Effect of dietary intervention on human
micronucleus frequency in lymphocytes and buccal cells. Mutagenesis. 2011;26(1):69-76
14. Yadav AS, Jaggi S. Buccal Micronucleus Cytome Assay-A Biomarker of Genotoxicity.
Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 2015

17