LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, Hóa sinh đã phát triển rất mạnh mẽ và được coi như là một ngành
khoa học mũi nhọn, đã xâm nhập vào nhiều ngành khoa học khác nhau và được
các ngành khoa học này tiếp nhận như là một công cụ sắc bén để giải quyết những
nhiệm vụ của ngành mình.
Trong y học, Hóa sinh có một vai trò đặc biệt không chỉ trong phạm vi để
mở rộng và nâng cao chất lượng đào tạo của ngành mà còn là một công cụ không
thể thiếu được trong chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh.
Vì vậy, những kiến thức về hóa sinh cần trang bị cho học viên không chỉ
khi họ còn đang được đào tạo trong nhà trường mà còn cần phải bổ túc thường
xuyên cho họ trong quá trình công tác.
Để nắm được kiến thức về hóa sinh và vận dụng được trong thực tiễn thì
phần thực hành hóa sinh là không thể thiếu được. Thực hành hóa sinh không chỉ
để chứng minh, minh hoạ cho lý thuyết mà nó còn giúp cho học viên nắm được
nguyên lý và giá trị của các xét nghiệm hóa sinh lâm sàng, rèn luyện kỹ năng tay
nghề cho học viên để họ có thể phục vụ được ngay sau khi họ rời khỏi ghế nhà
trường. Đó là những mục đích chính của giáo trình "Thực tập hóa sinh" này.
Đối tượng chính của giáo trình "Thực tập hóa sinh" là học viên đại học đào
tạo bác sỹ đa khoa. Tuy nhiên trong khi biên soạn, các tác giả cũng đã chú ý bổ
sung những vấn đề chuyên sâu, hiện đại và cập nhật để làm tài liệu tham khảo cho
học viên sau đại học cũng như cho cán bộ và kỹ thuật viên phục vụ cho công tác
giảng dạy hoá sinh và các labô hoá sinh làm lâm sàng.
Nội dung chính của "Thực tập hóa sinh" là 7 bài thực tập của 2 học phần.
Trong đó từ bài 1 đến bài 4 nằm trong chương trình của học phần 1: "Hoá sinh cơ
sở". Từ bài 5 đến bài 7 nằm trong chương trình của học phần 2:"Hoá sinh chức
năng và lâm sàng". Ngoài ra các tác giả còn biên soạn thêm bài "Mở đầu" để giới
thiệu một số phương pháp phân tích hoá sinh chính và phụ lục để giới thiệu một
số vấn đề như: Hệ thống đơn vị SI, nồng độ dung dịch, giá trị tham chiếu của các
xét nghiệm hoá sinh...để làm tài liệu tham khảo.
Tái bản lần này các tác giả đã sửa chữa và bổ xung một số xét nghiệm mới
phù hợp với chương trình đào tạo. Tuy đã có nhiều cố gắng nhưng có thể còn có
những thiếu sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của bạn đọc để giáo trình "Thực
tập hoá sinh" được hoàn chỉnh hơn.

Ngày 10 thánh 3 năm 2006

Thay mặt các tác giả
PGS.TS. Hoàng Quang

9
 Bài mở đầu
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA SINH

1. Phương pháp đo quang (Đo màu định lượng).

Đo quang là một phương pháp phân tích định lượng dựa trên cường độ màu của
bản thân chất cần định lượng hoặc được tạo ra bằng các phương pháp thích hợp.
1.1. Cơ sở của phương pháp: Định luật Lambert–Beer.
1.1.1. Cơ sở:
Khi chiếu một tia sáng đơn sắc có cường độ I0 qua một dung dịch màu có chiều
dày l, thì một phần ánh sáng bị phản xạ (IP), một phần bị hấp thụ bởi dung dịch
màu (IH), phần còn lại ló ra ngoài (IL).

----- l -----
I0 IL

IH
IP

Hình 1: Sự phân bố của tia sáng đơn sắc khi chiếu qua một dung dịch.

Như vậy: I0 = IP + IH + IL (1)

Trong các dung dịch màu nước thường gặp trong phân tích đo màu thì IP rất
nhỏ, có thể bỏ qua.
Do đó : I0 = IH + IL (2)
Từ đó, thấy rằng:
- IL chính là phần ánh sáng không bị hấp thụ, đi qua dung dịch, đập vào mắt ta,
gây ra cảm giác về màu của dung dịch.
- Vì I0 không đổi, nên khi IH càng lớn thì IL càng nhỏ. IH càng lớn nếu trên đường
đi ánh sáng gặp nhiều phân tử chất màu hay là khi nồng độ chất màu càng lớn và
chiều dày dung dịch càng lớn. Và ngược lại, khi IH càng nhỏ thì IL càng lớn.
Thiết lập mối quan hệ giữa I0, IH, IL là nội dung cơ bản của định luật hấp thụ
ánh sáng của dung dịch màu.

10
 1.1.2. Định luật Lambert – Beer:
Định luật Lamber - Beer phát biểu như sau: Lôgarit của tỷ số giữa cường độ
ánh sáng tới (I0) và cường độ ánh sáng ló (IL) tỷ lệ thuận với nồng độ phân tử chất
màu (C) và với chiều dày của lớp dung dịch (l) mà ánh sáng truyền qua:
I0
lg = k.C.l
IL
I0
Đại lượng lg đặc trưng cho khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch hay
IL
đặc trưng cho nồng độ chất màu của dung dịch, được gọi là mật độ quang học, ký
hiệu là E (hoặc D):
I0
E/D = lg = k.C.l
IL

k là số tắt, phụ thuộc vào bản chất của chất màu, bước sóng () của ánh sáng
tới và nhiệt độ, không phụ thuộc vào nồng độ dung dịch.
Khi cố định k và l, thì E tỷ lệ thuận với nồng độ C.
E ~C

Đây là hệ quả quan trọng của định luật Lambert-Beer để hiểu phương pháp đo
màu định lượng: khi nồng độ chất màu càng lớn thì mật độ quang học đo được
càng lớn và ngược lại.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến màu của dung dịch và làm sai lệch định luật
Lambert–Beer:
+ Phương pháp đo màu thường được tiến hành như sau:
- Cho chất thử X cần định lượng có trong dung dịch kết hợp với thuốc thử R
để tạo thành phức hợp RX có màu:
X + R XR
(không màu) (không màu) (có màu)

- Đo mật độ quang học (E) của dung dịch, xác định nồng độ XR và suy ra nồng
độ của X.
Do mật độ quang học E chỉ tỷ lệ thuận với nồng độ XR, nên phải chuyển được
toàn bộ X thành XR và màu của XR phải bền vững, không bị pha tạp bởi màu của
các chất khác.
+ Những điểm cơ bản cần chú ý:
- Thuốc thử R:
Đối với mỗi một chất cần định lượng X, phải chọn được thuốc thử R thích hợp
để phức hợp XR tạo thành có màu bền vững, ít phân ly. Nói một cách khác, XR

11
phải có hằng số không bền khá nhỏ để có thể coi nồng độ phức hợp XR bằng nồng
độ chất cần định lượng X.
Trong phần lớn trường hợp, phức hợp XR chỉ được tạo thành sau một khoảng
thời gian (quá trình sinh màu), đạt cực đại rồi giảm dần (quá trình phai màu). Sự
đo màu chỉ chính xác và nhạy nhất khi đo trong khoảng thời gian cường độ màu
đạt cực đại và ổn định nhất. Do đo, cần xác định trước khoảng thời gian này.
- Pha loãng dung dịch phức hợp màu:
Do phản ứng tạo thành và phân ly của XR là một quá trình thuận nghịch và
cường độ màu của dung dịch phụ thuộc vào tỷ số nồng độ giữa các dạng có màu
và không màu, nên khi pha loãng (hay làm giàu) dung dịch sẽ làm sai lệch định
luật Lambert-Beer. Vì vậy, khi cường độ màu của dung dịch vượt quá giới hạn đo
thì phải pha loãng mẫu thử và làm lại xét nghiệm.
Có thể hạn chế ảnh hưởng này bằng cách dùng chính thuốc thử R khi pha loãng
dung dịch màu (chứ không dùng nước cất) để hạn chế sự tăng độ phân ly của XR.
- pH của dung dịch:
Sự thay đổi pH (tăng hay giảm nồng độ H+) của dung dịch làm thay đổi màu
của dung dịch. Do :
. pH ảnh hưởng đến sự tạo thành phức hợp XR và do đó làm thay đổi màu.
Ví dụ, ở pH=1,8–2,5, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức
monosulfosalicylat [Fe(Sal)]2+ có màu đỏ; còn ở pH=8-11, ion Fe3+ kết hợp với
sulfosalicylat tạo thành ion phức sulfosalixylat [Fe(Sal)3]2+ có màu vàng.
. pH ảnh hưởng đến sự phân ly và phân huỷ phức hợp màu.
. H+ trực tiếp tham gia vào phản ứng dẫn đến làm đổi màu của dung dịch. Ví
dụ, trong phản ứng:
2 CrO42 - + 2 H+ CrO2 - + H2O
(vàng) (da cam)

Do đó, người ta phải nghiên cứu trước các dung dịch màu chuẩn để tìm ra
khoảng pH thích hợp.
- Ảnh hưởng của ion lạ:
Ion lạ có thể có màu riêng, có thể kết hợp với R thành một phức hợp có màu
làm ảnh hưởng đến màu của phức hợp XR, có thể tạo với R một phức hợp không
màu làm hao hụt thuốc thử R gây giảm sự tạo thành phức hợp XR.
Để loại bỏ ảnh hưởng này, có thể:
. Dùng một lượng R vừa đủ để tạo thành phức hợp XR nếu XR bền hơn phức
hợp của R với ion lạ hoặc cho thừa nhiều R nếu XR kém bền hơn phức hợp của R
với ion lạ.
. Dùng một hợp chất khác để tạo với ion lạ một phức hợp bền vững, gọi là
“khoá ion lạ”.

12
 . Thêm vào dung dịch chuẩn một lượng ion lạ bằng lượng ion lạ có trong dung
dịch cần định lượng.
. Tách riêng ion lạ bằng các phương pháp thích hợp trước khi định lượng X.
. Đo màu ở bước sóng đặc hiệu của XR.
Do tất cả những yếu tố trên, nên trong phân tích so màu phải tuân thủ chặt chẽ
thành phần và liều lượng thuốc thử, pH của dung dịch, thời gian đo màu, bước
sóng của ánh sáng tới, dung dịch đối chiếu...
1.2. Máy đo quang:
Có nhiều loại máy đo quang: quang kế (Photometer), quang phổ kế
(Spectrophotometer)... với các bước sóng cố định (dùng kính lọc) hoặc có thể thay
đổi (dùng cách tử)... Nói chung, cấu tạo của các máy đo quang đều gồm các bộ
phận chính sau:
+ Nguồn sáng: dùng đèn thường, đèn thuỷ ngân, đèn halogen, đèn cực tím.
+ Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc: kính lọc hoặc cách tử
+ Cóng đo (cuvette): có chiều dày (l) không đổi (0,5 cm, 1 cm); bằng thạch
anh, thuỷ tinh, nhựa.
+ Tế bào quang điện: để biến đổi quang (ánh sáng ló) thành dòng điện.
+ Bộ phận khuếch đại.
+ Bộ phận đo và hiện kết quả: thang đo hoặc màn hình hiện số.
Sơ đồ cấu tạo đơn giản của các máy đo quang như sau:

1 2 3 4 5 6
Nguồn sáng Kính lọc Cóng đo Tế bào Khuếch đại Hiện kết
(Đèn) hoặc cách tử quang điện quả
Hình 2: Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy đo quang

Ngoài các bộ phận chính trên, các máy còn có thể có thêm các phần khác như
các bộ phận điều chỉnh, các bộ phận gá lắp thêm...
1.3. Các phương pháp đo màu:
1.3.1. Đo màu bằng mắt:
Dùng khi không có máy đo quang hoặc khi chỉ cần đánh giá tương đối.
1.3.1.1. Phương pháp dùng thang mẫu (hoặc gam màu mẫu):
+ Điều chế một dãy ống dung dịch chuẩn (ống chuẩn) có nồng độ tăng dần đã
biết (CS) đựng trong các ống nghiệm đồng chất.
+ Điều chế một ống dung dịch thử (ống thử) có nồng độ chưa biết (CT) theo
các điều kiện giống hệt như khi điều chế các dung dịch chuẩn và đựng trong ống
nghiệm đồng chất với các ống nghiệm của dung dịch chuẩn.

13
 + So màu của ống thử với các ống chuẩn để tìm ống chuẩn có cường độ màu
bằng cường độ màu của ống thử.
Nồng độ của ống chuẩn chính là nồng độ của ống thử.
Tuỳ theo từng dung dịch mà người ta có các cách quan sát cường độ màu khác
nhau.
1.3.1.2. Phương pháp hoà loãng:
So màu của dung dịch thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết (CT)
với một dung dịch chuẩn cũng chứa chất đó có nồng độ đã biết (C S). Màu của hai
dung dịch được tạo ra trong cùng điều kiện.
+ Lấy ở mỗi ống ra x ml dung dịch cho vào 2 ống nghiệm đồng chất tương ứng.
+ Cho thêm thuốc thử R (hoặc nước cất) vào ống nào có cường độ màu lớn
hơn (thường là ống thử) cho tới khi thấy cường độ màu của 2 ống bằng nhau. Ghi
số ml thuốc thử R (hoặc nước cất) cho thêm (y).
+ Tính độ hoà loãng (d):
x + y
d =
x
+ Tính nồng độ của ống thử (CT) theo công thức:
CT = d. CS

1.3.2. So màu bằng máy:

1.3.2.1. Phương pháp so sánh (hay phương pháp dùng ống chuẩn):
+ Điều chế song song một dung dịch chuẩn chứa chất cần xác định có nồng độ
đã biết (CS) và một dung dịch thử chứa chất cần xác định có nồng độ chưa biết
(CT) theo cùng một qui trình.
+ Đo mật độ quang học (E) của ống chuẩn và ống thử trong cùng điều kiện
(máy, bước sóng, cóng ...), được ES và ET tương ứng.
+ Tính kết quả theo công thức:

ET
CT = x CS
ES

1.3.2.2. Phương pháp biểu đồ mẫu:

+ Điều chế một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần định lượng có nồng độ đã
biết (CS) tăng dần.
+ Đo mật độ quang học (E) của từng ống, được các ES tương ứng.
+ Biểu diễn sự phụ thuộc của ES theo CS trên trục toạ độ, được một đường thẳng.
ES

ET

14
 CT CS
Hình 3: Phương pháp xác định nồng độ một dung dịch bằng biểu đồ mẫu.
+ Điều chế một ống thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết CT theo
cùng một qui trình như đối với ống chuẩn.
+ Đo mật độ quang học của dung dịch thử, được ET.
+ Từ đồ thị tính được nồng độ CT .
Chú ý : . ET phải nằm trong khoảng của các ES.
. Biểu đồ mẫu phải dựng hàng ngày.
1.3.2.3. Phương pháp hệ số:
+ Điều chế một dãy ống chuẩn có nồng độ CS đã biết và tăng dần.
+ Đo mật độ quang của các ống chuẩn được các ES tương ứng.
+ Tính hệ số  (hoặc F) theo công thức:
 CS
=
 ES
+ Điều chế một ống thử có nồng độ chưa biết (CT).
+ Đo mật độ quang của ống thử, được ET.
+ Tính nồng độ ống thử (CT) theo công thức:

CT = . ET

Chú thích:
Trong dung dịch màu có các hợp chất khác (có trong thuốc thử để tạo hợp chất
màu) khi đo màu cũng cho một mật độ quang học nhất định. Vì vậy, khi định lượng
bằng đo màu, người ta thường đối chiếu ống thử và ống chuẩn với một ống trắng
để loại trừ ảnh hưởng này, khi đó E đo được là do chất màu cần định lượng gây ra.
1.3.2.4. Đo bằng quả cầu Ulbricht:
Gần đây, trong phương pháp hoá sinh khô, người ta sử dụng các que thử để
định lượng các chất trong máu hoặc bán định lượng các chất trong nước tiểu.
Que thử có thể gồm một hoặc nhiều ô thử, mỗi que thử thử một thông số (như
máy Refotron) hoặc nhiều thông số (như máy Clinitek). Trong mỗi ô thử có sẵn
các chất cần thiết cho phản ứng tạo màu đặc hiệu. Khi ô thử tiếp xúc với huyết
thanh hoặc nước tiểu thì phản ứng xảy ra, màu được tạo thành và việc đo màu định
lượng được thực hiện trên các máy có quả cầu Ulbricht.
Quả cầu Ulbricht là một quả cầu bằng thuỷ tinh có khe hở, mặt trong được
tráng gương. Bên trong quả cầu chứa:

15
 + Nguồn sáng là đèn diode. Ánh sáng phát ra từ đèn này được chiếu lên thành
bên trong quả cầu rồi phản xạ qua khe hở đi tới băng thử (Io) và được băng thử
hấp thu một phần, còn một phần thì phản xạ trở lại (Ip).
+ Hai đầu dò (detector): một đầu dò qui chiếu để đo ánh sáng tới (Io), một đầu
dò khác để đo ánh sáng phản xạ từ vùng thử (Ip).
Hệ số phản xạ (R) tỷ lệ với tỷ số Io/Ip.
Nồng độ chất thử (C) phụ thuộc R và được tính theo công thức Kubelka-Munk:
C = - (S/) + (S/2) + (S/2)R-1
- là hệ số hấp thu; S- là hệ số phân tán.
Kết quả được hiển thị trên màn hình.

Quả cầu

Đầu dò
qui chiếu

Diod phát sáng

Đầu dò đo

Ổ thử

Hình 4: Sơ đồ quả cầu Ulbricht.

2. Phương pháp điện di.

2.1. Nguyên lý:
Protein là những phân tử tích điện, khi đặt trong điện trường, sẽ di chuyển về
phía điện cực trái dấu với chúng.
2.2. Độ di động điện di:
Khi một hạt tích điện Ne được đặt trong điện trường E, nó chịu một lực F được
tính theo định luật Coulomb:
F = Ne . E

Hạt sẽ di chuyển và đạt tới vận tốc giới hạn v khi lực ma sát bằng lực Coulomb:
f. v = - Ne. E

Độ di động điện di của hạt được tính như sau:

16
  = v/E = Ne/F

Đối với các phân tử đơn giản, được coi là hình cầu, như protein globulin của
huyết thanh, hệ số ma sát f có giá trị là:
f = 6. ..r

Trong đó r là bán kính của cầu và  là độ nhớt của dung môi.

Thực tế, các phân tử protein được bao bọc bởi một lớp ion và nước, làm biến
đổi điện tích thực và bán kính của nó. Vì vậy, để trao đổi ion, pH phải lớn và phải
xa pH đẳng điện - pHi (ở pHi hạt không di chuyển). Ví dụ như, tất cả protein huyết
thanh di chuyển trong điện trường về phía cực dương (anode) khi được đặt ở pH =
8,6.
2.3. Dòng gây nhiễu:
Trên một chất giá rắn, có các hiện tượng khác can thiệp vào độ di động thực
của phân tử:

Đệm

Ngưng tụ

Bốc hơi

Dòng điện thẩm

Nguồn điện

Giá đỡ

Giấy hoặc màng

Hình 5: Sơ đồ điện di cổ điển trên giấy hoặc

cellulose acetat và dòng gây nhiễu

+ Dòng điện thẩm thấu (electro-osmose): khi đặt một hiệu điện thế giữa hai
đầu của một đoạn chất rắn được thấm ướt bởi chất điện ly, sẽ có sự di chuyển của
dung môi về một trong các cực, do sự tạo thành một lớp điện tích, thường là âm, ở
bề mặt của các kênh của bề mặt lỗ. Khi đó, chất điện ly có thừa điện tích dương và
sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode). Ảnh hưởng này phụ thuộc vào điện thế cuả
lớp kép được tạo ra ở bề mặt của mao quản. Điện thế này lại phụ thuộc vào bản
chất của chất có lỗ được dùng, vào điện trường được đặt, vào lực ion của chất điện
ly và độ nhớt của chúng. Có thể hạn chế đáng kể hiện tượng này bằng một số cách,
như dùng một màng bán thấm để bọc chất giá ở mức độ điện cực, hoặc dùng một
dòng thuỷ động ngược và chất bù trừ.

17
 + Dòng điện đối lưu (electrorheophorese): là một dòng hơi do sự bốc hơi của
dung môi bởi nhiệt. Để hạn chế hiện tượng này, khi chạy điện di điện thế thấp (230
V) dùng trong thực hành lâm sàng hàng ngày, người ta dùng nắp có mái để đậy
máy; còn khi chạy điện di điện thế cao (trên 1000 V), người ta phải đặt trong hệ
thống làm lạnh.
2.4. Áp dụng:
+ Có nhiều kiểu điện di được dùng trong phòng thí nghiệm cũng như trong
công nghiệp, tuỳ theo mục đích và điều kiện phân tích. Trong hoá sinh y học
thường ngày, điện di thường được dùng để phân tích các protein huyết thanh, nước
tiểu cũng như các dịch sinh học khác. Sự di chuyển của protein phụ thuộc vào bán
kính r của nó, vào pH đẳng điện − pHi (pH mà ở đó, protein không mang điện tích
hay có tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương).
+ Để nhận biết các protein đã phân chia, người ta dùng nhiều phương pháp tuỳ
theo kỹ thuật điện di được sử dụng:
- Thông dụng nhất là dùng các chất nhuộm màu đặc hiệu (đỏ Ponceau, Amido
đen, xanh Croomassie…), sau đó định lượng các phần đã phân chia.
- Dùng kỹ thuật miễn dịch nhậy và đặc hiệu.
Các acid nucleic cũng có thể phân chia bằng điện di, nhưng gần đây người ta
thường dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hơn.
+ Phân tích kết quả: bằng densitometor.
Densitometor cho phép đọc mật độ quang học của các băng và biểu thị theo
nguyên lý đo quang phổ. Cấu tạo của densitometor gồm: nguồn sáng, kính lọc (có
bước sóng thích hợp với màu của băng), bộ nhân quang, bộ ghi, bộ tính toán và bộ
in.
Khi chiếu ánh sáng đơn sắc vào băng màu, một phần ánh sáng bị hấp thụ, phần
còn lại bị phản xạ. Phần hấp thụ càng lớn khi mật độ chất màu ở băng màu càng
lớn và do đó phần phản xạ càng nhỏ. Đo ánh sáng phản xạ và biến đổi thành dòng
điện đo được sẽ xác định được mật độ chất màu (xem hình 6).

Thấu kính

Nguồn sáng

Lưới

Khe

Gương Gương

Đầu dò (phản xạ)

Tấm gel điện di

Đầu dò (truyền qua)

18
 Hình 6: Nguyên tắc đọc densitometor.
2.5. Các phương pháp điện di:
2.5.1. Điện di trong lòng dịch và điện di giấy,:
+ Điện di trong lòng dịch: đã được Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia protein
huyết thanh. Hiện nay, nó không còn được dùng nữa, nhưng vẫn còn được xem
như một qui chiếu để đo độ di động điện di thực, vì không có dòng thuỷ động gây
nhiễu và không có sự can thiệp của chất giá.
+ Điện di giấy: giấy là chất giá rắn được dùng lần đầu tiên, nhưng nay ít dùng vì
đã có các chất giá có khả năng giải quyết tốt hơn và thực tế hơn, song nó vẫn có
những ưu điểm (ví dụ, trong phân loại rối loạn lipoprotein máu theo Fredrickson).
2.5.2. Điện di trên màng cellulose acetat:
Màng cellulose acetat là chất giá quen thuộc để phân chia protein huyết thanh
trong xét nghiệm hàng ngày. Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màng cellulose
acetat dưới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng. Sau khi chạy điện
di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làm trong bằng sấy
khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor).

Đường chấm
mầu

Globullnos

Albumlne

Albumlne

Albumlne

Hình 7: Kết quả phân chia protein trên màng cellulose acetat
và định lượng bằng densitometor.
Ghi chú: Bên trái là điện di đồ protein huyết thanh, bên phải là hình ảnh sau khi đọc trên
densitometor

19
 2.5.3. Điện di trên gel:
2.5.3.1. Điện di trên gel acrylamid (PAGE):
Phương pháp này sử dụng một gel có lỗ thu được bằng sự copolymer hoá
acrylamid và N-N’-methylen bis-acrylamid nhờ một phản ứng gốc dưới ánh sáng
với sự có mặt của một chất xúc tác như persulfat ammon hoặc riboflavin.
|
CH2
|
NH
|
CO
|
−CH2−CH−[−CH2−CH−]n− CH2−CH−]−CH2−CH−]n−CH2−
| | |
CO CO CO
| | |
CH2 CH2 NH2 NH NH2
|| || |
CH CH CH2
| | ánh sáng |
CO CO NH
| | |
NH2 NH CO
| |
CH2 −CH2−CH−[−CH2− CH−]n− CH2− CH−]− CH2− CH−]n− CH2−
Acrylamide | | | |
NH CO CO CO
| | | |
CO NH NH 2 NH2
| |
CH CH2
|| |
CH2 NH
|
Bis-acrylamide CO
|

Kích thước của lỗ gel phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối giữa hai thành phần trên
và vào tỷ lệ phần trăm acrylamid. Các gel acrylamid dùng để phân chia protein
huyết thanh thường chứa 7-12% acrylamid. Có thể tạo ra gradient nồng độ
acrylamid liên tục (ví dụ, từ 4 đến 30%) hoặc không liên tục.
Các gel acrylamid dễ chuẩn bị trong các phòng xét nghiệm, nhưng cần thận
trọng vì acrylamid là một chất độc thần kinh.
Có nhiều kỹ thuật được dùng:

Điện di trên gel acrylamid

Nguồn điện

Khớp nối

Ống

Làm lạnh

Đệm (a)

Đệm

gel

Các hố
20 Khoang

Kẹp

Các giếng

gel (b)
 Hình 8: Các kỹ thuật điện di.

+ Điện di gel trong ống thuỷ tinh (điện di cột): (a) thường dùng ống dài 5-10 cm,
đường kính 0,5- 0,8 mm.
+ Điện di gel giữa hai tấm thuỷ tinh (b) hoặc điện di phiến gel (slab - gel
electrophorese): cho phép so sánh dễ dàng giữa các mẫu thử vì được tiến hành
trong cùng điều kiện giống hệt nhau.
Kích thước của tấm có thể thay đổi: thường rộng từ 8-15 cm, cao 8-20 cm. Các
gel được dùng để xác định trình tự của acid nucleic thì dài hơn (30-40 cm) so với
để phân chia protein. Chiều dày của gel thường dùng là 0,75 đến 2,5 cm. Các hố
được đục nhờ một que nhựa nhét vào giữa hai tấm thuỷ tinh khi polymer hoá. Trên
thị trường có bán các tấm có sẵn để dùng.
+ Điện di gel trên phim nhựa: mẫu thử được đặt trong các hố nằm trong gel
hoặc ở bề mặt gel để khuếch tán trong gel trước khi đặt trong điện trường.
+ Điều kiện điện di: trong lưới gel acrylamid, các phân tử được phân chia theo
kích thước (trọng lượng phân tử) và điện tích của chúng. Do đó có hai kiểu điện di
được dùng:
- Điện di không biến tính: trong một gel có lỗ hằng định, cả hai thống số kích
thước và điện tích đều can thiệp vào sự di chuyển của các protein. Còn trong một
gel với gradient của acrylamid thì chỉ có kích thước là thông số can thiệp: các
protein không qua được lỗ do kích thước của chúng lớn hơn kích thước lỗ. Đối với
các lipoprotein, người ta dùng một gel với 2 lớp acrylamid có nồng độ khác nhau
(gradient không liên tục): lớp thứ nhất, nồng độ thấp hơn, có lỗ lớn hơn, chỉ cho
các phân tử lớn (chylomicron) đi qua; lớp thứ hai có nồng độ acrylamid cao hơn,
giữ lại các phân tử nhỏ hơn một chút (VLDL) và cho qua các phân tử nhỏ mà khi
phân chia theo kích thước và điện tích của chúng sẽ thành LDL và HDL. Như vậy,
người ta tách được các lipoprrotein thành 4 lớp có ý nghĩa chẩn đoán và tiên lượng
khác nhau. Sự phân chia cũng được thực hiện bằng kỹ thuật siêu ly tâm nhưng có
thể thực hiện với nhiều mẫu thử, tốn ít thời gian và dùng ít mẫu hơn.

chylomicrons

VLDL 21

LDL

HDL
 gel 2 %

gel 3 %

Hình 9: Điện di lipoprotein huyết thanh theo gradient

không liên tục của acrylamid.

- Điện di biến tính: làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung
dịch chứa các chất khử (như -mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một
chất tẩy, natri dodecyl-sulfat (SDS). SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng
tích điện âm. Sự di chuyển của protein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc
duy nhất vào trọng lượng phân tử của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh,
chính xác và thực tế được dùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly
tâm phân tích, khếch tán ánh sáng…) trong xác định trọng lượng protein. Gần đây,
cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã được đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó
tương đối giữ được hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không.
2.5.3.2. Điện di trên các gel khác:
Gel tinh bột và gel agarose thu được bằng đun nóng sau đó làm lạnh là những
polymer glucid. Nó không có tác dụng sàng phân tử như acrylamid, nhưng kích
thước lỗ lớn của gel cho phép nhận biết enzym. Vì so với giấy hoặc màng cellulose
acetat, chiều dày của gel cho phép chứa một lượng mẫu thử lớn hơn.
2.5.4. Điện di hội tụ (Electrofocalisafion):
Đó là một kiểu điện di thực hiện trong gradient pH. Các thành phần di chuyển
theo điểm đẳng điện và dừng lại ở vùng có pH tương ứng với pH đẳng điện của
chúng. Gradient pH được tạo ra trong quá trình điện di bởi một hỗn hợp của một
số lớn các hạt aminoacid có pH đẳng điện khác nhau (ampholytes). Tuỳ theo thành
phần của hỗn hợp, người ta thu được một thang pH nào đó và như vậy một khả
năng giải quyết tốt hơn.
Có thể thực hiện theo 2 cách:
+ Hoặc trong môi trường lỏng, trong cột, gradient được tạo ra bởi gradient
saccharose.
+ Hoặc trong môi trường rắn: trên một gel (agarose hoặc acrylamid).

22
 Anode được tạo bởi acid, còn cathode được tạo bởi một base. Sử dụng điện thế
rất lớn: 1000 đến 2000 V và cần hệ thống làm lạnh.
Phương pháp này được dùng trong nghiên cứu vì khả năng giải quyết của nó
trong hoá sinh protein rất lớn.
2.5.5. Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell):
Thực hiện 2 lần điện di theo 2 hướng vuông góc với nhau. Có thể kết hợp điện
di acrylamide-agarosse, điện di đơn và điện di hội tụ…. Trong thực hành, đầu tiên
người ta thực hiện điện di hội tụ theo một hướng, rồi điện di gel acrylamide-SDS
theo hướng thứ hai.
2.5.6. Điện di mao quản (Electrophorese capillaire):
Gel acrylamide hoặc gel khác bền trong môi trường điện di và hạn chế được độ
rộng của băng khi phân chia. Các mao quản (có đường kính trong từ 10-100m)
cho phép phân chia trong một thời gian ngắn và giá rẻ hơn. Dùng mao quản sẽ làm
tăng tỷ lệ bề mặt/thể tích làm cho dễ thoát nhiệt được sinh ra khi điện di và hạn
chế sự khuếch tán do nhiệt.
Trong điện di mao quản vùng, các nhóm sinanol của mao quản bị khử proton,
cho một bề mặt âm tính. Các cation của đệm di chuyển theo bề mặt này: bề mặt
của dịch trở nên tích điện dương và di chuyển về phía cathode. Các chất tan trung
tính di chuyển với tốc độ của điện thẩm thấu; các chất tan tích điện dương di
chuyển nhanh hoặc chậm hơn tuỳ theo điện tích của chúng; các chất tan tích điện
âm ngược lại bị hãm ít hoặc nhiều hơn.
Khả năng phân chia phụ thuộc vào điện thế, hệ số khuếch tán, độ di động điện
di và dòng thẩm thấu.
Cột mao quản có đường kính 0,05 mm  50 cm có thể tích bên trong 852 nl:
thể tích đặt mẫu có thể vài nl. Sự tích điện của thể tích nhỏ này có liên quan với:
+ Sự di chuyển điện: phụ thuộc vào điện tích và độ di động của chất tan được
phân chia.
+ Thuỷ động:
- Khi đặt một áp lực trên khoang mẫu ở đầu vào của mao quản.
- Khi đặt một giảm áp ở đầu ra.
- Bằng một siphon: đầu vào của mao quản ngâm trong mẫu.
- Theo lượng được tiêm vào, sự phát hiện phải rất nhạy. Điều này liên quan
đến các kỹ thuật kinh điển (hấp phụ, huỳnh quang), vì vậy độ nhậy và độ chính
xác có thể được tăng lên:
. Ở mức độ cơ chất, bởi sự chênh lệch (trước và sau mao quản)
. Ở mức độ nguồn (dùng laser)
. Giới hạn thực tế đạt được trong vùng 10-18 – 20-20 mol.
Có thể dùng các gel (điện di gel mao quản) hoặc các ampholyte (hội tụ điện
mao quản).

23
 Sử dụng lượng nhỏ và phân chia nhanh (tối đa vài phút) cho phép thực hiện
nhiều thử nghiệm và tối ưu hoá qui trình. Kỹ thuật vi phân tích này được dùng hạn
chế trong lâm sàng, ví dụ để phân tích aminoacid huyết thanh.
2.5.7. Điện di miễn dịch:
Điện di miễn dịch được thực hiện trong gel agarose trên một lam kính hoặc
trên phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử. Kỹ thuật này kết hợp
2 giai đoạn kế tiếp:
+ Điện di trong một trường thứ nhất: các protein được phân chia bởi điện di
bắt đầu từ một hố nhỏ được đục trong gel agarose. Vì thế, mỗi protein được phân
chia có hình ellip kéo dài.
+ Khuếch tán miễn dịch trong một trường thứ hai: trong một máng được đục
song song với hướng của giai đoạn một, người ta đặt một kháng huyết thanh vào
đó, nó sẽ khuếch tán vuông góc với máng. Các protein đã phân chia cũng khuếch
tán bắt đầu từ vết thu được sau điện di. Ở điểm cân bằng, sẽ xuất hiện một cung
kết tủa. Cung này dễ nhận thấy khi nhuộm màu protein.
Đây là một phương pháp phân tích rất hay dùng vì có khả năng phân chia cao.
Nó có thể phân chia được gần 30 protein huyết thanh nhờ một kháng huyết thanh
cừu kháng protein huyết thanh người. Những bất thường về số lượng và chất lượng
protein huyết thanh của bệnh nhân có thể phát hiện dễ dàng bằng cách so sánh với
một huyết thanh chứng bình thường được đặt đối xứng qua máng và cùng chạy.
Để đánh giá chính xác các bất thường, người ta dùng kháng thể monoclon đặc hiệu.
3. Các phương pháp sắc ký.
Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng trong các phương pháp
phân tích hoá sinh. Sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau
như là được sử dụng để định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác
định các hằng số hoá lý, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác... Ngoài ra
nó còn được áp dụng ở các ngành có liên quan tới hoá học như y dược, nông
nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường, luyện kim, dầu mỏ địa chất...
3.1. Những khái niệm chung:
3.1.1. Định nghĩa:
Sắc ký là quá trình tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự phân bố
không đồng đều của chúng giữa pha cố định (pha tĩnh) và pha di động khi cho pha
di động đi xuyên qua pha cố định .
3.1.2. Phân loại:
Do tính đa dạng của các phương pháp sắc ký cho nên việc phân loại sắc ký là
rất cần thiết. Có các cách phân loại chính sau đây:
+ Phân loại theo pha di động: theo cách này tất cả các phương pháp sắc ký
được phân thành 2 loại:
- Sắc ký lỏng.

24
 - Sắc ký khí.
+ Phân loại theo pha cố định: dựa vào hình dạng giá tựa của pha cố định có thể
có các loại sắc ký như sau:
- Sắc ký cột.
- Sắc ký giấy.
- Sắc ký lớp mỏng.
Hoặc được phân thành 2 loại: sắc ký cột và sắc ký phẳng.
+ Phân loại theo cơ chế của quá trình tách: phương pháp phân loại này dựa vào
sự tương tác của chất được sắc ký với pha cố định và pha di động. Theo cơ chế này
có 4 loại sắc ký như sau:
- Sắc ký hấp phụ: sự phân tách các chất là do ái lực khác nhau của chất phân
tách đối với chất hấp phụ là chất rắn (pha cố định).
- Sắc ký phân bố: sự phân tách các chất là do sự hoà tan khác nhau (hay là sự
phân bố khác nhau) của các chất giữa pha cố định là lỏng (được giữ bởi chất mang
rắn) và pha di động. Độ hoà tan phụ thuộc vào độ phân cực, do đó độ phân cực của
chất được sắc ký cũng như của pha cố định và pha di động có ảnh hưởng đến quá
trình tách.
- Sắc ký trao đổi ion: sự phân tách các ion là do các ion được phân tách trong
dung dịch có ái lực khác nhau với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên
chất rắn là pha cố định. Các chất đó gọi là các chất trao đổi ion mà thông thường
nhất là các nhựa trao đổi ion.
- Sắc ký rây phân tử: loại sắc ký này người ta dùng các vật rắn có độ xốp lớn,
độ xốp đó được tạo ra bởi các lỗ (mắt lưới) có kích thước cố định để rây chọn lọc
các cấu tử. Tuỳ theo kích thước và hình dạng của phân tử mà các chất di chuyển
với tốc độ khác nhau. Các chất xốp có thể là các chất xốp vô cơ, hữu cơ, các
polymer tổng hợp ưa nước như là các loại sephadex được dùng để tách các chất có
hoạt tính sinh học.
Ngoài ra còn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxy hoá - khử...
nhưng chúng ít có giá trị trong thực tế.
3.1.3. Sắc đồ, sắc phổ, đường cong xuất:
+ Sắc đồ và sắc phổ:
Kết quả của quá trình phân tách sắc ký là các cấu tử được phân tách thành các
vùng riêng biệt có màu hoặc không có màu trên cột hay trên mặt phẳng được gọi
là sắc đồ (xem hình 10).

25
 Sắc đồ (trên cột) Sắc phổ

Sắc đồ (trên giấy) Sắc phổ

Hình 10: Sắc đồ và sắc phổ.

Những chất không màu sau khi tách ta chưa nhìn thấy sắc đồ bằng mắt thường;
để hiện sắc đồ phải cho thêm 1 hoặc vài loại thuốc thử tác dụng với chất không
màu đó để tạo thành chất có màu.
Bằng các quang phổ kế người ta có thể ghi được sự phân bố nồng độ các cấu
tử dọc theo cột (trường hợp sắc ký cột) hoặc trên mặt phẳng (trường hợp sắc ký
giấy hay sắc ký lớp mỏng), gọi là sắc phổ.
Trong trường hợp sắc ký cột, nếu biểu diễn bằng đồ thị sự phụ thuộc của nồng
độ chất đi ra khỏi cột sắc ký vào thể tích dung môi rửa giải thì sẽ thu được một
đường cong xuất hay đường cong rửa giải (còn gọi là đường cong giải hấp).
3.2. Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột:
3.2.1. Nguyên tắc sắc ký hấp phụ lỏng:
Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa vào tính chất hấp phụ khác nhau của các
chất trong hỗn hợp cần phân tách. Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ vào
nồng độ của nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi
đường đẳng nhiệt hấp phụ.
Có thể xem hấp phụ như là sự tập trung các phân tử chất khí hoặc chất lỏng ở
ranh giới 2 pha: rắn-khí hay rắn-lỏng. Trong sắc ký hấp phụ lỏng, sự tách xảy ra ở
26
ranh giới rắn-lỏng. Trong đó pha di động là chất lỏng, pha cố định là chất rắn ở
trạng thái xốp, mịn. Các hợp chất phân cực bị hấp phụ mạnh hơn các hợp chất
không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực.
3.2.2. Chọn hệ sắc ký hấp phụ lỏng:
Để tách được tốt hỗn hợp các chất bằng sắc ký hấp phụ lỏng cần phải chú ý
các yếu tố sau: chất hấp phụ; pha di động; lượng mẫu; phương pháp định lượng.
Trong đó việc lựa chọn chất hấp phụ và pha di động là quan trọng nhất.
+ Chọn chất hấp phụ:
Chất hấp phụ phải đáp ứng được các yêu cầu sau:
- Yêu cầu chủ yếu là chất hấp phụ không có tương tác hoá học giữa chất hấp
phụ và các cấu tử cần tách, không có hoạt tính xúc tác để tránh các phản ứng phụ.
- Có tính chọn lọc, có nghĩa là ái lực hấp phụ của các cấu tử đối với chất hấp
phụ khác nhau càng nhiều càng tốt.
- Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt (độ mịn) phải thích hợp. Hạt càng
bé, cân bằng hấp thụ thiết lập càng nhanh và càng hiệu nghiệm; nhưng mặt khác
lại cản trở tốc độ pha di động. Để khắc phục có thể dùng kỹ thuật chân không hay
cao áp.
- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hoá để thu được các kết quả
trùng lặp.
Một số chất hấp phụ thường sử dụng là:
. Nhôm oxyt: là hợp chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất để phân tách hỗn
hợp các chất phân cực cũng như không phân cực.
. Silicagel: cũng như nhôm oxyt, silicagel được sử dụng rất rộng rãi, là chất
hấp phụ tốt nhất để tách các sản phẩm dầu mỏ, các acid béo và ête của chúng, các
amin thơm và nhiều hợp chất hữu cơ khác.
. Than hoạt tính: có khả năng hấp phụ rất tốt, nhưng tính chất không ổn định
và màu đen nên khó quan sát các vùng màu của sắc đồ. Than hoạt tính thường dùng
để tách các chất cao phân tử hoặc dùng để tách các chất thuộc một dãy đồng đẳng.
+ Chọn dung môi (pha di động):
Trong sắc ký hấp phụ, việc chọn đúng dung môi là rất quan trọng. Khi chọn
dung môi cần chú ý các yếu tố sau:
- Dung môi hoà tan tốt tất cả các cấu tử phân tích.
- Bị hấp phụ tối thiểu trên pha cố định (chất hấp phụ).
- Không phản ứng hoá học với chất tan cũng như chất hấp phụ.
- Dung môi phải tinh khiết, nhất là khi dùng các dung môi không phân cực, nó
không được chứa các dung môi phân cực.
3.2.3. Thiết bị sắc ký:
Chọn đúng kích thước cột cũng có ý nghĩa quan trọng. Nếu chọn ngắn quá thì
không đủ khả năng tách, nếu dài quá sẽ kéo dài thời gian tách.

27
 Vật liệu làm cột thường là thuỷ tinh, đôi khi là thép, nhôm, đồng, chất dẻo...
Thường dùng cột dạng hình trụ, hình nón... cột có thể dài vài centimét đến 10-
20 mét. Đường kính có thể vài milimét đến 10-20 centimét. Hiện nay người ta chưa
có cơ sở lý thuyết để chọn kích thước cột, phải chọn bằng thực nghiệm. Tỷ lệ chiều
dài cột và đường kính tối ưu là từ 40 đến 100.
Có thể dùng phương pháp đi xuống (hình 11a) hoặc đi lên (hình 11b).
Phương pháp đi lên tách tốt hơn vì hiệu ứng thành nhỏ, nhưng phương pháp đi
xuống có thiết bị đơn giản nên được dùng phổ biến hơn.
Để làm tăng tốc dòng có thể dùng biện pháp thay đổi áp suất bằng kỹ thuật cao
áp (hình 11c) hoặc kỹ thuật chân không (hình 11d).
Tuy nhiên rất nhiều trường hợp dùng cột đơn giản (ví dụ: dùng buret chuẩn độ)
cho kết quả tách cũng rất tốt. Chỉ cần chú ý phải lắp cột thẳng đứng để giảm hiệu
ứng thành.

a b c d
a b c d

Hình 11: Các loại cột sắc ký

3.2.4. Lấy mẫu và phân tích mẫu:
Có 2 phương pháp để đánh giá kết quả phân tích sắc ký, đó là: xác định trực
tiếp các cấu tử ngay trên cột và phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột.
+ Phân tích trực tiếp trên cột:

28
 Có thể phân tích định lượng một số chất theo sắc đồ trên cột. Nhưng cách này
bị hạn chế đối với chất không màu, trong trường hợp này cần phải nhờ sự phát
huỳnh quang của các chất đó hoặc thêm thuốc thử để tạo màu. Có thể áp dụng phân
tích trực tiếp trên cột đối với các chất phóng xạ hoặc các chất chứa các nguyên tử
đánh dấu.
+ Phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột:
Trong thực tế, người ta hay dùng phương pháp này hơn vì thiết bị và thao tác
đơn giản. Có 2 cách: phân tích từng phân đoạn và phân tích liên tục.
- Phân tích từng phân đoạn: có thể lấy từng thể tích xác định dung dịch chảy
ra khỏi cột và xác định hàm lượng các chất đó. Phương pháp này đơn giản nhưng
tốn nhiều công sức, do đó người ta tạo ra các máy thu phân đoạn tự động, gồm một
số lớn ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn hay hàng dọc. Dung dịch chảy ra
khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và sau một thể tích xác định máy tự động di
chuyển sang ống khác theo dãy đã sắp xếp.
- Phương pháp phân tích liên tục: người ta hướng dung dịch chảy ra khỏi cột
đi vào máy xác định nồng độ theo nguyên tắc đo chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, mật
độ quang, độ phóng xạ... Trong trường hợp này phải dùng các cuvet có cấu trúc
đặc biệt để có thể đo được liên tục.
3.2.5. Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng trên cột:
Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột thường được sử dụng để phân tách các hydrocarbon
thơm, tách hỗn hợp parafin - naphten, xác định các thành phần dầu mỏ, tinh chế
clobenzen, xác định các alcaloid, tách các sắc tố lá cây...
3.3. Sắc ký phân bố trên cột:
3.3.1. Cơ sở lý thuyết:
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký phân bố là dựa trên sự phân bố của các
chất tan giữa 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, khi một chất lỏng là pha di động
chuyển qua pha cố định cũng là một chất lỏng nhưng được hấp phụ trên bề mặt
chất rắn (chất mang). Thông thường pha cố định cũng là nước hoặc dung môi phân
cực khác. Đôi khi pha cố định là chất lỏng ít phân cực hơn, khi đó pha di động
phải là dung môi phân cực hơn.
Do sự phân bố của các chất tan trong hỗn hợp giữa 2 pha là khác nhau, chất
nào tan (phân bố) nhiều trong pha di động hơn pha cố định sẽ di chuyển nhanh,
còn chất nào tan nhiều trong pha cố định hơn pha di động sẽ di chuyển chậm hơn.
Vì vậy sau một thời gian sắc ký các chất tan sẽ phân tách thành các vùng khác nhau
trên cột.
3.3.2. Tiến hành kỹ thuật:
+ Chuẩn bị pha cố định:
Người ta sử dụng chất lỏng mang (hấp phụ) trên bề mặt chất rắn xốp làm pha
cố định. Cách làm như sau: Hoà tan một lượng chất lỏng pha cố định vào dung môi
dễ bay hơi, sau đó cho chất mang vào dung dịch đó để tẩm trước. Cho dung môi
bay hơi. Trong quá trình làm bay hơi trộn đều chất mang, chất lỏng và dung môi

29
để cho chất lỏng phân bố đều trên bề mặt chất mang. Đun nóng hoặc hút chân
không để đuổi hết dung môi.
Phương pháp chuẩn bị pha cố định liên kết hoá học phức tạp hơn nhiều, phải
xử lý các nhóm hydroxyl bề mặt chất mang xốp.
+ Tải năng của pha lỏng và lượng mẫu:
Tải năng của pha lỏng là lượng chất lỏng được giữ trên một đơn vị khối lượng
chất mang. Đối với pha lỏng không liên kết hoá học, tải năng khoảng 1 - 40 phần
trên 100 phần chất mang.
Lượng chất lỏng trên pha cố định quyết định lượng mẫu. Nói chung, lượng
chất lỏng càng lớn thì lượng mẫu có thể phân tách được càng lớn. Đối với cột có
tải năng lớn, lượng mẫu có thể lên tới 10 mg. Nếu mẫu quá lớn thì khả năng tách
giảm. Nếu cột có tải năng nhỏ, lượng mẫu khoảng 1mg.
3.3.3. Ứng dụng của sắc ký phân bố:
Sắc ký phân bố có thể sử dụng để phân tách các acid béo bay hơi như acid
formic, acid acetic, acid maloic. Cũng có thể dùng để phân tách các halogenat như
là NaClO3, NaBrO3 , NaIO3...
3.4. Sắc ký rây phân tử:
Sắc ký rây phân tử (còn gọi là sắc ký lọc gel, sắc ký thẩm thấu gel) có khả năng
lớn để tách các hợp chất cao phân tử (như protein, polymer) cũng như nghiên cứu
tính chất, kích thước và trọng lượng phân tử của chúng.
Sắc ký rây phân tử có thể dùng các gel hữu cơ loại dextran mạng (sephadex)
với các kích cỡ lỗ khác nhau và hoạt tính hấp thụ không đáng kể. Tuy nhiên gel
hữu cơ bị trương lên trong các dung môi nên gây khó khăn cho kỹ thuật. Dùng các
rây phân tử vô cơ không có nhược điểm đó như là thuỷ tinh xốp, silicagel nhưng
rây phân tử vô cơ có nhược điểm là khả năng hấp phụ lớn; do đó phải làm biến
tính hoá học bề mặt của chúng.
3.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử:
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử là dựa trên sự phân bố của
chất tan giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp. Dung
môi tự do là pha di động, còn dung môi nằm trong các hốc là pha cố định. Mức độ
xâm nhập của phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của
chúng. Chất tan nào mà kích thước phân tử lớn hơn kích thước lỗ của rây phân tử
thì không thể xâm nhập vào các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào kẽ hở giữa
các hạt rắn, do đó chúng di chuyển ra khỏi cột nhanh hơn. Còn chất tan có kích
thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ thì chúng có khả năng xâm nhập vào lỗ của
hạt; khi pha di động đi qua, các phân tử đó đi ra khỏi lỗ và di chuyển cùng với pha
di động ra khỏi cột chậm hơn.
Như vậy, trong sắc ký rây phân tử, các cấu tử được ra khỏi cột theo thứ tự giảm
dần kích thước phân tử của chúng. Những chất có cấu trúc không gian gần giống
nhau thì thứ tự phân tách theo chiều giảm trọng lượng phân tử. Điều này chỉ đúng
khi hiệu ứng hấp phụ không đáng kể.

30
 3.4.2. Kỹ thuật tiến hành sắc ký rây phân tử:
Thiết bị dùng trong sắc ký rây phân tử thực tế không khác các dạng sắc ký lỏng
khác. Có thể sử dụng các cột sắc ký thông thường. Có thể dùng các cột thuỷ tinh kích
thước khác nhau, dài từ 20 - 200 cm, đường kính từ 5 - 50 mm. Nạp chất hấp phụ vào
cột phải đồng đều, muốn vậy phải dùng các hạt hình cầu cùng kích thước.
Lượng mẫu cho vào không được quá tải năng của cột. Chú ý khi đưa mẫu
polymer đặc vào cột, độ nhớt cao sẽ làm giảm tốc độ dòng.
3.4.3. Ứng dụng của sắc ký rây phân tử:
Sắc ký rây phân tử được sử dụng để tách các hợp chất cao phân tử cũng như
các chất có phân tử lượng nhỏ. Sắc ký rây phân tử có thể dùng để xác định phân tử
nhanh chóng đối với tất cả các polymer có thể tan được trong dung môi nào đó.
Các rây phân tử có kích thước lỗ gần bằng 5A0 thì hấp thụ được các hydrocacbon
mạch thẳng, còn các hydrocarbon mạch nhánh không bị hấp phụ. Sử dụng tính chất
đó người ta có thể tách rời hỗn hợp các hydrocarbon như hỗn hợp octan và isooctan.
3.5. Sắc ký trao đổi ion:
3.5.1. Định nghĩa và phân loại ionit:
Những chất có khả năng trao đổi ion gọi là ionit. Ionit là những đại phân tử
acid hoặc base không tan trong nước và các loại dung môi, chúng chứa trên mạng
lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo đương lượng và thuận nghịch
với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly khi tiếp xúc (hình 12). Ionit có
thể ở dạng rắn hay dạng lỏng.
Dựa vào dấu điện tích của ion trao đổi, người ta phân chia thành cationit,
anionit hay ionit lưỡng tính.

Hình 12: Các ionit

a) Trạng thái ban đầu; b) Trạng thái tiếp xúc

31
 Khi ion trao đổi (gọi là ion linh động) mang điện tích dương (ion cố định của
mạng lưới không mang điện tích âm), ionit tương ứng là cationit, chúng có công
thức chung là HR, NaR, CaR2, MgR2 .
Phản ứng trao đổi của cationit như sau:
2NaR + CaCl R2 Ca + 2 NaCl
Rắn Dung dịch Rắn Dung dịch
Khi ion trao đổi mang điện tích âm (ion cố định của mạng không mang điện
tích dương), ionit tương ứng là anionit, chúng có công thức chung: ROH, RCl,
R2CO3 , R2SO4... Phản ứng trao đổi của anionit như sau:
2RCl + Na2SO4 R2SO4 + 2 NaCl
Rắn Dung dịch Rắn Dung dịch
Các ionit lưỡng tính có thể trao đổi cả ion mang điện tích dương lẫn ion mang
điện tích âm cùng một lúc.
3.5.2. Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion:
3.5.2.1. Chọn cột trao đổi ion:
Cột chứa ionit dùng trong phòng thí nghiệm là các
cột thuỷ tinh hoặc thuỷ tinh hữu cơ có kích thước khác
nhau. Phần dưới của cột để bông thuỷ tinh (3 - 10 mm) để
đỡ cho ionit không rơi xuống. Phía trên cùng của cột để
hở hoặc đóng bằng phễu nhỏ giọt (hình 13), hoặc bằng
dụng cụ đặc biệt để dẫn dung dịch rửa.
Ionit sau khi được ngâm trong nước, rót vào cột cùng
với nước để tránh bọt khí lẫn trong ionit. Lượng ionit chỉ
cho khoảng 2/3 thể tích cột. Trên lớp ionit nên để lớp
bông thuỷ tinh dày 3 - 5 mm và 1 lớp bi thuỷ tinh dày 1
- 2 cm để giữ cho ionit khỏi bị xáo trộn khi rót dung dịch
vào.
3.5.2.2. Các giai đoạn của trao đổi ion:
+ Giai đoạn 1: hấp phụ ion của dung dịch phân tích Hình 13:
trên cột ionit. Các loại cột trao đổi ion
Để giữ toàn bộ ion trong dung dịch phân tích cần sử
dụng 1 lượng ionit lớn hơn lượng tính toán. Nếu sử dụng cationit acid yếu dạng
RH hay anionit base yếu dạng ROH thì dung dịch chảy qua lớp ionit sẽ mang tính
acid hay base, làm thay đổi pH của dung dịch, dẫn đến sự thay đổi giá trị trao đổi
năng của ionit.
+ Giai đoạn 2: giải hấp ion bị hấp thu trên ionit. Trong giai đoạn này ion bị hấp
thu được tách ra khỏi ionit bằng những dung dịch thích hợp như bằng acid có nồng
độ khác nhau, hoặc 1 số chất hữu cơ có khả năng tạo phức với ion cần tách.
+ Giai đoạn 3: rửa ionit sau khi giải hấp; rửa ionit bằng các dung dịch thích
hợp để đuổi hết dung dịch giải hấp còn nằm lại giữa kẽ hở của các hạt ionit.

32
 + Giai đoạn 4: tái sinh ionit. Giai đoạn này đưa ionit về dạng ban đầu (RH,
ROH...) bằng cách cho chảy qua cột cationit dung dịch HCl 2 - 4%, qua cột anionit
dung dịch NaOH 2 - 4%.

+ Giai đoạn 5: rửa ionit đã được tái sinh: Rửa bằng nước cất để đuổi hết dung
dịch tái sinh còn nằm lại trong cột.
3.5.2.3. Ứng dụng của sắc ký trao đổi ion:
+ Khử độ cứng của nước: độ cứng của nước là các loại muối tan của canxi và
magiê tạo thành. Có thể khử độ cứng của nước bằng phương pháp trao đổi ion, sử
dụng cationit dạng RH hoặc RNa.
2 RH + Ca(HCO3)2 = CaR2 + 2 H2O + 2CO2
2 RH + Mg(HCO3)2 = MgR2 + 2 H2O + 2CO2
2 RH + CaCl2 = CaR2 + 2 HCl
2 RH + MgCl2 = MgR2 + 2 HCl

+ Khử độ khoáng của nước: là loại hoàn toàn cation và anion có trong nước
có thể bằng sắc ký trao đổi ion. Cation trong nước bị hấp thụ trên cationit acid
mạnh.
+ Tinh chế thuốc thử hoá học: có thể loại sắt ra khỏi acid chlohydric, tinh chế
chất không điện ly ra khỏi chất điện ly (như tinh chế glucose, glycerol khỏi các tạp
chất vô cơ).
+ Điều chế các hợp chất hoá học: Ví dụ, có thể điều chế phân bón hoá học dạng
lỏng từ nước thải...
+ Xác định hàm lượng chất: ví dụ, xác định hàm lượng apatit trong quặng
giầu apatit
+ Làm giàu các nguyên tố vi lượng: bằng phương pháp trao đổi ion người ta
dễ dàng làm giàu các nguyên tố vi lượng (nguyên tố vết), vì ionit có khả năng trao
đổi với nguyên tố có một lượng nhỏ trong dung dịch như Cu2+ trong nước khi qua
cột cationit acid mạnh.
2 RH + Cu2+ = CuR2 + 2 H+

3.6. Sắc ký khí:

Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một trong những phương pháp sắc ký quan
trọng nhất để phân tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu các thông số hóa, lý như:
hệ số hoạt độ, entanpi, nhiệt hóa hơi, hệ số khuyếch tán phân tử, động học xúc
tác... Sắc ký khí được coi là phương tiện đầu tay của các nhà hóa học, đặc biệt là
các nhà hóa học hữu cơ.
3.6.1. Nguyên lý hoạt động của sắc ký khí:
Mẫu phân tích sau khi được hóa hơi, nhờ có khí mang được chứa trong bom
chứa dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt, quá trình sắc ký xảy ra ở đây.

33
Khi mẫu đi vào cột tách, chúng nhanh chóng phân bố vào 2 pha: pha lỏng là pha
cố định và pha khí là pha di động. Do các chất trong hỗn hợp có hệ số phân bố
khác nhau vào 2 pha cho nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau. Sau khi các
cấu tử rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử này lần lượt đi vào
detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch
đại rồi được chuyển sang bộ phận ghi (loại máy đơn giản thường dùng) hoặc
chuyển sang phân tích kế có máy tính, các tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang
bộ phận in kết quả (loại máy hiện đại). Thiết bị máy sắc ký được mô tả trên hình
14.

Hình 14: Sơ đồ máy sắc ký khí

1: Bom chứa khí mang. 5: Bộ khuếch đại.
2: Buồng hóa hơi. 6: Bộ phận ghi.
3: Cột tách. 7: Phân tích kế.
4: Detector. 8: Máy in.

Tư liệu của quá trình sắc ký chính là sắc đồ. Mỗi một đỉnh (pic) của sắc đồ ứng
với một hoặc một nhóm cấu tử của hỗn hợp cần phân tách.
3.6.2. Các loại khí sử dụng trong sắc ký khí:
Các khí thường được sử dụng trong sắc ký khí là khí argon, heli, nitơ, hydro...
Khi chọn khí mang cần chú ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết và yêu cầu tách...
Khí mang được dùng phải không được thay đổi trạng thái lý, hóa khi đi qua máy
sắc ký.
+ Khí hydro thương mại thường đạt đủ tiêu chuẩn cho sắc ký khí. Khi sử dụng
khí hydro làm khí mang cần dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột tách trước.
Khí hydro dùng cho các cột tách làm việc ở dưới 200oC.
+ Khí heli là khí trơ về hóa học cho nên rất thích hợp cho sắc ký khí ở nhiệt độ
cao. Khi sử dụng detector ion hóa bằng tia phóng xạ phải sử dụng heli tinh khiết.
+ Khí argon, cũng như các khí trơ khác không có hoạt tính hóa học, được dùng
cho sắc ký ở nhiệt độ cao và ngày càng được sử dụng nhiều làm khí mang.
+ Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ làm tinh khiết nên khí nitơ được
sử dụng rất nhiều trong sắc ký khí.
3.6.3. Pha cố định:
Trong sắc ký khí-lỏng, pha cố định đóng vai trò chính trong việc tạo nên tương
tác cần thiết để các cấu tử được tách khỏi nhau. Chất lỏng (pha cố định) không
được phản ứng không thuận với khí mang, với chất mang rắn và với các cấu tử cần
phân tách.
34
 Không có qui tắc vạn năng nào để chọn pha cố định thích hợp với điều kiện tối
ưu nhất. Hiện nay đã có gần 700 pha cố định được sử dụng. Điều quan trọng là
phải biết kết hợp một số qui tắc cơ bản với kinh nghiệm. Có một nguyên tắc cơ
bản cho việc lựa chọn pha cố định là: các chất giống nhau thì hòa tan tốt vào nhau.
Ví dụ, để tách alcol phải chọn các pha lỏng phân cực, ngược lại để tách
hydrocarbon no mạch thẳng phải dùng các pha lỏng không phân cực.
3.6.4. Các chất mang:
Người ta thường sử dụng đất diatomit làm chất mang. Nung loại chất này với
CaCO3 ở 9000C người ta thu được chất bột có diện tích bề mặt khoảng 1-4 m2/g.
Thành phần chủ yếu là SiO2 và một ít Al2O3; ngoài ra còn chứa một số ít oxyt kim
loại kiềm và kiềm thổ. Sau khi xử lý loại đất này bằng các phương pháp khác nhau
người ta được các loại chất mang có đặc tính khác nhau và đem tẩm pha cố định.
Trong quá trình tẩm, bề mặt ngoài và trong của chất mang được phủ đầy bởi pha
cố định.
3.7. Sắc ký trên giấy:
Đầu tiên, sắc ký trên giấy chỉ dùng để phân tách các aminoacid, nhưng sau đó
đã được phát triển và trở thành một trong những phương pháp phổ biến nhất trong
hóa sinh và trong hóa học nói chung.
3.7.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký trên giấy:
Hiện tượng hóa lý xảy ra trong sắc ký trên giấy cũng tương tự như trong sắc
ký phân bố nói chung, tức là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2
pha: pha cố định thường dùng là nước được giữ ở trên giấy sắc ký (ở khí quyển
bão hòa hơi nước, giấy có thể giữ tới 15 - 22% nước tính theo trọng lượng giấy);
pha di động thường là một dung môi hữu cơ bão hòa nước. Dung môi hữu cơ di
chuyển trên tờ giấy sắc ký theo mao dẫn. Giấy đóng vai trò là giá tựa cho dung
môi cố định (pha cố định).
Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ...) mỗi chất được đặc
trưng bởi một trị số nhất định gọi là hệ số Rf:
Rf = A/B
A : là khoảng cách di chuyển của chất phân tách.
B : là khoảng cách di chuyển của dung môi.

Có sự tương quan chặt chẽ giữa Rf và hệ số phân bố của chúng trong 2 pha
dung môi. Chất nào càng ít tan trong pha cố định (nước) và tan nhiều trong pha di
động (dung môi hữu cơ) thì tốc độ di chuyển càng nhanh, có nghĩa là Rf lớn. Ngược
lại, chất nào càng tan nhiều trong pha cố định và tan ít trong pha di động thì tốc độ
di chuyển càng chậm, Rf càng nhỏ.
3.7.2. Các bước chuẩn bị trong sắc ký giấy:
+ Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Mẫu phân tích nào có chất cần phân tích có nồng độ cao và có cách hiện màu
nhạy thì có thể cho chạy sắc ký ngay không cần chuẩn bị gì trước.

35
 - Mẫu phân tích nào có nồng độ chất phân tích loãng hoặc có các tạp chất mà
ảnh hưởng đến việc tách và hiện màu thì phải cô đặc mẫu và loại bỏ các yếu tố ảnh
hưởng bằng hút chân không, bằng thẩm tích, kết tủa bằng nhiệt, bằng dung môi
hữu cơ...
+ Chọn giấy sắc ký:
Yêu cầu về giấy như sau: giấy phải tinh khiết, trung tính về hóa học, đồng nhất về
tỷ trọng. Thông thường dùng các loại giấy Whatman số 1, hoặc Schleicher-Schull
2043 a và b...
Để tách tốt cần chú ý hướng sợi giấy trùng với hướng chuyển động của dung môi.
Các loại giấy thường ưa nước, do đó nếu dùng nước làm pha cố định thì không
cần phải làm ẩm. Nếu để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước, cần
chuyển giấy từ ưa nước thành kỵ nước bằng cách tẩm các chất kỵ nước khác nhau
và acetyl hoá.
+ Chọn dung môi:
Chọn dung môi làm pha cố định và pha di động là yếu tố quan trọng nhất để
tách các chất trong sắc ký giấy. Dung môi di động thường là hỗn hợp của một dung
môi hữu cơ chính và nước; có thể thêm một số thành phần khác như acid hay base
để làm tăng hay giảm độ hòa tan của một số chất. Nếu tan nhiều quá trong dung
môi di động, chất tan sẽ chuyển động theo tuyến dung môi; nếu tan ít quá, chất
phân tách sẽ gần như không di chuyển và dừng ở ngay vị trí xuất phát. Trong sắc
ký aminoacid trên giấy hỗn hợp, dung môi thích hợp nhất là: butanol-acid acetic-
nước với tỷ lệ 4:1:5.
3.7.3. Kỹ thuật chạy sắc ký:
Trong sắc ký giấy có thể tiến hành sắc ký một chiều đi lên hoặc đi xuống, sắc
ký hai chiều hoặc sắc ký vòng nằm ngang. Kỹ thuật chạy sắc ký gồm các bước sau:
+ Chấm mẫu thử:
Vị trí chấm mẫu thử được đánh dấu trước bằng bút chì, nơi chấm tuỳ thuộc vào
kiểu sắc ký và kích thước bình sắc ký. Giữa các vết chấm phải cách nhau 2,5-3
cm để tránh chập vào nhau khi hiện hình. Vết chấm phải tròn và nhỏ (đường kính
tối đa là 10 mm), hoặc có thể chấm thành vạch ngang.
Lượng mẫu thử cần chấm tuỳ thuộc vào độ nhậy của thuốc hiện hình. Ví dụ,
với aminoacid mỗi loại cần 5-10 mg, các đường đơn cần 5-50 mg cho mỗi chất.
Dùng các pipet vi lượng như loại dùng trong huyết học để chấm. Khi chấm dùng
máy sấy tóc để sấy khô mỗi lần chấm. Tốt nhất là làm trên tủ chuẩn bị sắc ký.
+ Chạy sắc ký:
Trong sắc ký một chiều đi lên, dung môi di động đặt ở đáy bình sắc ký. Đầu tờ
giấy có chấm mẫu thử nhúng vào dung môi di động sao cho các vết chấm cách mặt
dung môi khoảng 2 cm.
Trong sắc ký một chiều đi xuống, dung môi di động chứa trong máng được
treo ở phía trên của bình sắc ký. Đầu giấy có chấm mẫu nhúng vào dung môi di
động và vắt qua một đũa thuỷ tinh nằm ngang, dùng đũa thuỷ tinh to khác để chặn
tờ giấy cho khỏi tụt xuống.

36
 Trong trường hợp sắc ký 2 chiều, chấm mẫu thử vào một góc tờ giấy vuông
cách mỗi bờ vài cm. Chạy với dung môi 1. Sau đó lấy tờ giấy ra phơi khô rồi cho
chạy với dung môi 2 (có thành phần khác với dung môi 1), chiều chạy của dung
môi này thẳng góc với dung môi 1. Sắc ký 2 chiều cho phép tách được các chất có
cấu tạo hóa học gần giống nhau tức là có Rf rất gần nhau.
Để đảm bảo bão hòa dung môi trong bình, bình sắc ký phải có nắp đậy thật kín,
có thể để trong bình sắc ký cốc đựng nước đã bão hòa dung môi di động để đảm
bảo độ ẩm của giấy.
Thời gian chạy tuỳ thuộc vào kích thước của giấy, khi nào dung môi di động
di chuyển đến gần hết tờ giấy thì lấy ra đánh dấu bằng bút chì vị trí tiền tuyến của
dung môi. Đem sấy khô tờ giấy và làm hiện hình.
+ Hiện hình các vết:
Sắc ký đồ sau khi chạy xong lấy ra phơi khô cho bay hết dung môi ở nhiệt độ
thường hoặc ở 800C. Nếu dung môi là phenol phải để khô ở nhiệt độ phòng để
tránh phá huỷ các chất.
Hiện hình có thể bằng phương pháp lý hoặc hóa học. Ví dụ, chất phân tách có
thể phát huỳnh quang khi chiếu vào ánh sáng tử ngoại (thường dùng bước sóng
254-370 nm). Nhưng phổ biến nhất vẫn là hiện hình bằng các thuốc thử hóa học
thích hợp. Thuốc thử này được phun đều đủ làm ẩm tờ giấy sắc ký, không phun
nhiều quá làm ướt sũng tờ giấy. Hoặc tráng nhanh vào thuốc thử hiện màu. Trong
trường hợp sắc ký aminoacid, khi phun thuốc thử ninhydrin xong thường phải sấy
khô ở 80-1000C.
+ Phương pháp xác định các chất:
Có thể xác định các chất bằng các phương pháp sau:
- Căn cứ vào hệ số Rf để xác định vị trí của từng chất cần phân tách. Tuy nhiên,
cùng một hệ dung môi Rf có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như là: độ dày, độ
xốp, độ tinh khiết của giấy và nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phân bố giữa 2 pha.
Các tạp chất và tỷ lệ các chất trong hỗn hợp dung môi cũng làm thay đổi Rf. Cho
nên phương pháp này ít được dùng.
- Thông thường và chính xác là dùng các chất chuẩn. Các mẫu chuẩn có thể
chấm bên cạnh mẫu thử hoặc có thể trộn ngay vào mẫu thử. Đối với mẫu thử mà
chưa loại hết tạp chất thì việc trộn lẫn mẫu chuẩn vào mẫu thử là rất cần thiết vì Rf
có thể bị ảnh hưởng bởi các tạp chất nên sẽ gây nhầm lẫn chất nọ với chất kia.
+ Phương pháp định lượng các chất trong sắc ký đồ:
- Phương pháp làm thôi màu các vết bằng dung môi thích hợp rồi đo màu là
phương pháp thông dụng và chính xác hơn cả. Cắt các vết màu thành từng phần
riêng biệt, nếu vết nào có diện tích lớn thì cắt nhỏ tiếp. Cho các mẫu cắt này vào
từng ống nghiệm đã chứa dung môi thôi màu, thỉnh thoảng lắc cho thôi hết màu
khỏi giấy sau đó đem đo màu trên quang kế. Đối chiếu với mẫu chuẩn cùng cho
chạy sắc ký như trên để tính kết quả.
- Phương pháp chiết rút các chất ra khỏi giấy:

37
 Có trường hợp phải chiết rút các chất ra khỏi giấy để đảm bảo tính nguyên vẹn
về cấu trúc hóa học, không được nhuộm bằng thuốc hiện màu như trong trường
hợp chiết rút để đo hoạt tính sinh học. Phương pháp này được làm như sau: trên
cùng một tờ giấy sắc ký cho chạy song song ở 2 đầu 2 vết mẫu chuẩn và mẫu thử,
một vết mẫu thử nữa ở giữa. Sau khi chạy sắc ký, cắt dọc 2 băng nhỏ ở 2 bên đem
hiện hình. Để xác định vị trí các vết cần tìm, dùng 2 băng đã lên màu làm chuẩn
để cắt ngang băng có chứa chất nghiên cứu. Cho các mảnh giấy có chứa chất nghiên
cứu vào các ống nghiệm có chứa dung môi chiết rút, thỉnh thoảng lắc. Sau đó loại
giấy đi. Nếu cần thiết chiết rút 1 lần nữa bằng một ít dung môi trên.
3.8. Sắc ký lớp mỏng:
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp cải biên của sắc ký trên cột và sắc ký
trên giấy. Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:
+ Chỉ cần dùng một lượng rất ít mẫu thử.
+ Khả năng phân tách tốt hơn sắc ký giấy.
+ Thời gian rất nhanh chỉ cần 20-30 phút là đã nhận được kết quả.
+ Có thể dùng để phân tách các chất kỵ nước như là lipid...
+ Có thể dùng thuốc hiện màu acid hay base mạnh ở nhiệt độ cao (100-2000C).
Tuy nhiên, sắc ký lớp mỏng khó bảo quản sắc ký đồ và độ lặp lại của hệ số Rf
của các chất rất khó thực hiện.
3.8.1. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng:
Là dựa trên sự phân bố của các chất giữa 2 pha: pha cố định là chất hấp phụ
được rải rộng trên phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là một dung
môi thích hợp. Khi dung môi di chuyển sẽ làm chuyển dịch các thành phần trong
mẫu thử. Sau khi dung môi chạy xong, để bay hơi hết dung môi trên sắc ký đồ
rồi hiện màu như trong sắc ký giấy. Nói chung, lý thuyết của sắc ký lớp mỏng là
một phần dựa trên lý thuyết của sắc ký hấp phụ và một phần dựa trên lý thuyết
sắc ký giấy.
3.8.2. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng:
+ Chọn chất hấp phụ: cũng tương tự như sắc ký cột có thể dùng các chất hấp
phụ là silicagel, nhôm oxyt, bột cellulose, tinh bột, sephadex...
Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, người ta cho thêm chất dính
vào chất hấp phụ. Chất dính thường là CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10%.
+ Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính:
Các phiến kính thường có cỡ 20  5 cm, 20  20 cm, 7,5  2,6 cm. Rửa sạch,
sấy khô trước khi rải. Cân 5 g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10 ml nước
cất, lượng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20  5 cm. Sau đó rải ngay lên phiến
kính bằng tay hoặc bằng máy. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000C từ 30
- 120 phút tuỳ theo yêu cầu. Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm.
+ Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như sắc ký giấy, các mẫu thử cần có cách
chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc mẫu. Dùng ống vi quản chấm mẫu
38
cách bờ dưới phiến kính khoảng 1 - 2 cm. Vết chấm phải nhỏ, đường kính 2 - 5
mm cách xa nhau ít nhất 1 cm.
3.8.3. Chạy sắc ký:
Sau khi chấm mẫu thử xong cho vào bình sắc ký có kích thước thích hợp, đậy
nút mài hoặc nắp kín.
Đầu dưới phiến kính ngập vào dung môi khoảng 0,5 - 1 cm (vết mẫu thử không
ngập vào dung môi). Để bão hòa dung môi trong bình, có thể lót giấy lọc xung
quanh bình để dung môi thấm đều trên khắp tờ giấy.
Khi dung môi di chuyển lên phiến kính sắc ký lớp mỏng được 10 - 11 cm thì lấy
ra, đánh dấu tiền tuyến dung môi rồi để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng.
Sắc ký lớp mỏng có thể chạy đi lên (thông dụng nhất), đi xuống hoặc 2 chiều
như sắc ký giấy.
3.8.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ:
Nói chung, các phương pháp phát hiện các chất trên sắc ký lớp mỏng cũng
tương tự như sắc ký giấy. Phương pháp tốt nhất vẫn là nên chạy song song những
chất mẫu chuẩn trên cùng phiến kính đó. Việc dựa vào Rf trong sắc ký lớp mỏng
còn kém tin cậy hơn sắc ký giấy.
Để phát hiện các chất hữu cơ, có thể dùng hơi iod. Đặt phiến kính vào bình kín
trong đó để một ít tinh thể iod. Sau một thời gian ngắn, nền sẽ có màu tím, còn các
hợp chất chưa no sẽ không màu, các hợp chất no khác có màu nâu.
Việc định lượng các chất cũng tương tự như sắc ký giấy như: đo diện tích của
vết màu, đo màu bằng densitometer. Cách tương đối chính xác nhất là cạo vùng
sắc ký đồ có vết cần phân tích, sau đó dùng dung môi thích hợp để chiết rút rồi làm
phản ứng màu.
4. Hướng dẫn sử dụng một số dụng cụ phương tiện trong phòng thí nghiệm.
4.1. Một số dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm:
4.1.1. Dụng cụ đo thể tích:
Gồm ống đong (eprouvete), bình cầu (ballon), bình định mức (ballon jaugé),
ống hút (pipette), buret (burette).
+ Cách xác định thể tích dung dịch:
- Để mắt nằm trên cùng mặt phẳng ngang của mặt khum của dung dịch.
- Đối với phần lớn dung dịch: vạch định mức phải tiếp tuyến với mặt khum
lõm xuống của dung dịch.
- Đối với các dung dịch màu đậm đặc: vạch định mức phải tiếp tuyến với mặt
khum cong lên của dung dịch.
Nếu mắt để trên hoặc dưới mặt phẳng ngang sẽ đọc sai thể tích.

39
 Hình 15: Đọc đúng (a) và đọc sai (b).
+ Ống đong, cốc đong.
- Dùng để đong một thể tích dung dịch hoặc để pha dung dịch
- Thường dùng loại có dung tích 5 - 10 - 20 - 30 - 50 - 100 - 125 - 250 - 500 -1000 ml.
- Chia vạch 1ml đối với loại nhỏ; 5 - 10 - 100 ml đối với loại to.
- Thường chỉ có dung tích toàn phần của ống đong là đúng.
- Không dùng loại quá lớn để đo một thể tích nhỏ. Đong 5 ml nên dùng loại
10ml hoặc 15 ml là cùng.
- Không đun, không nghiền chất rắn bằng ống đong, cốc đong.
+ Bình định mức.
- Có các loại 5 - 10 - 25 - 50 - 100 - 250 - 500 - 1000 ml.
- Có loại đáy tròn hoặc đáy phẳng.
- Có cổ nhỏ so với phần thân (bầu) phình rộng, có nút mài.
- Trên cổ có một vạch định mức để chỉ đúng thể tích của dung dịch ứng với
vạch đó. Có loại còn có thêm một vạch phụ để pha loãng nhanh chóng như 50 và
55 ml, 100 và 110 ml.
- Cách dùng:
Cầm cổ bình, không cầm bầu để tránh làm thay đổi nhiệt độ của bình.
Dùng phễu rót dung dịch vào bình gần đến vạch (cách vạch 1 - 2 cm).
Dùng ống hút nhỏ thêm từng giọt dung dịch cho đến vạch định mức.
Không để dung dịch lâu trong bình, không đun nóng, không đong dung dịch
phát nhiệt khi hoà tan mà phải để nguội rồi mới đong.

Hình 16: Ống đong (a), bình định mức (b) và cốc đong (c).
+ Ống hút (pipet).
- Ống hút thuỷ tinh.
. Ống hút chia độ:
Để đo gần đúng thể tích của dung dịch.
Có các vạch định mức để phân chia thể tích

40
 Thường dùng các dung tích : 0,01 - 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 - 5 - 10... ml.
Có 2 loại:
Loại thả hết: hút dung dịch đến vạch định mức và thả hết (không thổi)
Loại không thả hết: hút dung dịch đến vạch định mức và thả đến vạch dưới
(không thả hết).
. Ống hút định mức:
Để đo đúng thể tích của dung dịch.
Có 2 loại:

Hình 17: Ống hút thả hết và không thả hết (a), 1 vạch và 2 vạch (b).

41
 . Loại có 1 vạch: hút dung dịch đến vạch, để thẳng đứng, dựa vào thành bình
chứa, mở cho dung dịch chảy đến hết, không thổi. Không được làm gãy đầu nhọn
của ống hút.
. Loại có 2 vạch: hút đến vạch trên, mở cho dung dịch chảy từ từ đến vạch dưới
thì dừng lại.
. Khi dùng ống hút cần thực hiện 3 đúng:
Đúng thuốc thử: pipette nào thuốc thử ấy.
Đúng lượng: chọn ống hút thích hợp với lượng dung dịch cần lấy.
Đúng qui cách sử dụng.
- Ống hút tự động.
Để lấy chính xác một lượng nhỏ dung dịch.
Có cấu tạo tương tự như bơm tiêm có lò xo để đẩy kéo piston. Đầu trên có các
bộ phận điều chỉnh. Phần thân dài, đầu dưới có cổ để lắp với đầu hút (tip) thích
hợp, có thể tháo ra thay thế dễ dàng.
Có 2 loại:
Loại có thể tích cố định (10, 20, 50 100, 200, 500, 1000 l...): Đầu trên chỉ có
nấc hút (1) và nấc xả (2), có số chỉ thể tích. Những ống hút có dung tích dưới 100
l thì có tip màu vàng, trên 100 l thì có tip màu xanh.
Loại có thể tích thay đổi (từ 5 - 200 Plston với Núm điều chỉnh
nấc hút và xả thể tích
l...): Đầu trên, ngoài 2 nấc hút (1) và xả nẫy xả đầu típ
(2), còn có thêm núm điều chỉnh thể tích
và nẫy để xả đầu tip. Thân có rãnh hiện số
Thân
thể tích khi điều chỉnh.
+ Ống nghiệm: Rãnh hiện số

Để làm các phản ứng, lấy máu, ly

tâm... Có nhiều loại khác nhau:
Loại nhỏ: < 5ml.
Loại vừa: 5 - 10 ml.
Đầu típ
Loại to: >10 ml.

Hình 18:
Ống hút tự động có thể tích thay đổi.

Có đáy tròn hoặc vuông.

Có loại thường (không chia độ) và loại chia độ.

43
 Có loại có nút (cao su hoặc nút mài) và không nút.
Có loại chuyên dụng (barcode).
Được đặt trên giá thích hợp (giá ống nghiệm).
Khi dùng: không đổ đầy quá 2/3 chiều cao ống.
Cầm ống nghiệm bằng ngón 1, 2 và 3 tay trái (như cầm bút viết) ở 1/3 trên.
Trộn đều dịch trong ống nghiệm bằng cách:
Quay tròn cổ tay trái.
Dùng ngón 2 (ngón trỏ) tay phải đập nhẹ vào phần dưới ống nghiệm.
Đập nhẹ đáy ống nghiệm vào lòng bàn tay phải: khi mặt ngoài ống nghiệm khô,
sạch.
Khuấy bằng que thuỷ tinh nhỏ.
Văn ống nghiệm giữa 2 lòng bàn tay: khi tránh sủi bọt.
+ Burette.
Cho biết thể tích dung dịch đã nhỏ ra, thường dùng để chuẩn độ.
Có các loại 1 - 5 - 10 - 15 ml chia vạch 1/20 ml, loại 20 - 25 ml chia vạch 1/10ml.
Có loại không có khoá (được nối với ống cao su có bi thuỷ tinh hoặc kẹp Mohr
để điều chỉnh) và loại có khoá nút mài.
Khi dùng: cho dung dịch vào burette từ từ, tránh bọt, cao hơn vạch 0 từ 3-4
cm, mở khoá để về 0. Mở khoá bằng tay trái, cho dung dịch chảy từ từ, không cho
chảy quá nhanh, tránh sai kết quả. Ghi số ml đã dùng.

Hình 19: Buret và giá.

4.1.2. Một số dụng cụ khác:
+ Bình cầu:

44
 Thường dùng loại thể tích 1/2 - 1l.
Có loại đáy phẳng và đáy tròn, có cổ ngắn hoặc dài.
Đáy phẳng: để pha dung dịch, đun nóng, đựng nước cất.
Đáy tròn: để cất, đun sôi. Khi đun: cặp cổ bình trên giá đỡ, đặt trên lưới amiang.
Đun xong, đặt bình trên lưới amiang cho đến khi nguội mới tháo bình, không
đặt ngay trên bàn.
+ Bình nón:
Còn gọi là bình tam giác, chủ yếu dùng để chuẩn độ.
Có loại không nút và có nút mài.
Có thể đun trực tiếp (loại dày, chịu nhiệt) hoặc đun trên lưới amiang (loại mỏng,
không chịu nhiệt).
Khi cần trộn đều dịch chứa: cầm cổ bình và quay tròn.

(a) (b)

Hình 20: Các loại bình chứa

a): Bình cầu đáy tròn và đáy bằng; b): Bình nón không nút và có nút.

+ Cốc thuỷ tinh.

- Cốc có mỏ:
Có nhiều loại 25 - 50 - 100 - 250 - 500 - 100 ml.
Có loại chia độ hoặc không.
Có loại chịu nhiệt (dày, đun được) và không (mỏng, phải đun qua lưới amiang).
Dùng để: rót chất lỏng, để hoà tan, rửa tủa, cân hoá chất.
- Cốc không mỏ:
Không chịu nhiệt, không đựng dung dịch nóng và không được đun.
Dùng để đựng nước bẩn, chất thải.
+ Phễu.
- Phễu thuỷ tinh:
Để lọc, rót chất lỏng.
Được đặt trên giá có vòng đỡ hoặc cắm vào bình hứng.
Rót dung dịch vào phễu qua que thuỷ tinh.
Không đổ dung dịch quá đầy (cách miệng 10 - 15 mm).

45
 Khi lọc: dàn giấy lọc cắt sẵn sao cho kín hết bề mặt trong của phễu để tăng tốc
đọ lọc. Lọc lấy tủa: dùng giấy không gấp nếp, Lọc lấy dịch: dùng giấy gấp nếp.
- Phễu Busne.
Bằng sứ hoặc thuỷ tinh dày, có màng lọc, để lọc dưới áp lực âm.

(a) (b) (c)

Hình 21: (a): Cốc thuỷ tinh có mỏ và không mỏ
(b): Phễu thuỷ tinh; (c): Phễu Busne.
+ Bình gạn.
Để tách riêng các lớp dung dịch, như trong chuẩn bị dung môi sắc ký.
Gồm một bầu, đầu trên có nút mài, đầu dưới có khoá để gạn.
Cho hỗn dịch vào bình, lắc rồi để yên cho tạo lớp phân cách.
Mở khoá và hứng lấy lớp dịch phía dưới.
+ Bình kết tinh.
Để kết tinh, làm bốc hơi, ngâm rửa tiêu bản, nhuộm tiêu bản.
Dáng thấp, có đáy phẳng, mặt đáy rộng,
+ Bình rửa.
Để rửa tủa, tách tủa ra khỏi bình đựng, giấy lọc, rửa cóng đo.
Có 2 ống thuỷ tinh xuyên qua nút cao su, một ống để thổi, một ống để rửa.
Không đun khi còn đậy nút. Muốn đun, phải bỏ nút ra.
+ Bình Bunsen.
Để lọc dưới áp suất giảm, có một vòi ra.
Phễu lọc (Busne) được cắm xuyên qua nút bình. Nối vòi ra của bình với một
nhánh của bình 2 nhánh, nhánh kia nối với máy hút chân không.

46
 Hình 22: a): Bình gạn; b): Bình rửa.
c): Bình kết tinh; d): Bình Bunsen.

+ Bình hút ẩm.

Có 2 loại: loại hút ẩm thôngthường và loại hút ẩm dưới áp lực âm (có vòi nối
với máy hút và có khoá).
Nắp bôi vaselin. Mở nắp bằng cách rê sang bên và để ngửa.
Đáy bình để chất hút ẩm: silicagen, CaCl2, H2SO4…
Ngăn trên để chất cần làm khô.
+ Ống sinh hàn.
Để ngưng tụ hoặc làm lạnh.
Gồm ống ngoài: cho nước đi qua để làm lạnh, ống trong thường xoắn ruột gà
để cho hơi đi qua.
Có loại sinh hàn thẳng và sinh hàn ngược.
Khi két bẩn: rửa ống ngoài bằng acid 10%, rồi rửa lại bằng nước cất.
+ Cối chày sứ, bát sứ.
- Cối chày sứ: để tán nghiền hoá chất hoặc tổ chức của động vật thí nghiệm.
- Bát sứ: để đun khô, cô khô, đun chảy (parafin).
+ Đèn cồn.
Thường dùng để đun nhanh ống nghiệm, cốc có mỏ, bình cầu.
Châm đèn bằng diêm, đóm. Tắt đèn bằng chụp.
Khi đun, tránh đánh đổ hoặc làm vỡ đèn, có thể gây cháy nổ.
+ Bếp đun.
- Có nhiều loại bếp để đun:
Bếp cát.
Bếp điện.
Bếp gas.
Bình cách thuỷ.
- Khi dùng tránh cháy, nổ, điện giật.
4.2. Một số thao tác cơ bản:
4.2.1. Hút thuốc thử:
+ Bằng ống hút thuỷ tinh:
Chọn ống hút và chai thuốc thử cần lấy tương ứng.
Cầm ống hút bằng các ngón 1, 3, 4 tay phải, nếu cần thì đỡ thêm bằng ngón 5;
ngón 2 (ngón trỏ) tự do để sẵn sàng bịt mở đầu trên của ống hút.
Cầm quả bóp bằng các ngón 2, 3, 4, 5 tay trái; ngón 1 (ngón cái) tự do (để bịt
đầu van nếu quả bóp có van một chiều).

47
 Cắm đầu dưới (nhọn) của ống hút thẳng đứng và gần sát xuống đáy chai thuốc
thử.
Dùng sức bóp của các ngón tay và lòng bàn tay trái bóp để đẩy hơi trong quả
bóp ra. Cắm thẳng đứng đầu nhọn của quả bóp vào đầu trên ống hút sao cho khít.
Mở quả bóp ở tay trái từ từ để hút thuốc thử vào ống hút và quan sát. Khi thuốc
thử vượt qua vạch 0 thì nhanh chóng rút quả bóp ra theo phương thẳng đứng, khi
đầu nhọn của quả bóp ra khỏi đầu trên cuả ống hút thì nhanh chóng đưa sang ngang.
Nhanh chóng bịt đầu ống hút bằng ngón 2 tay phải. Chỉnh cho thuốc thử về đúng
vạch 0.
- Tay trái cầm ống nghiệm. Tay phải để ống hút thẳng đứng, mở ngón 2 tay
trái từ từ để thuốc thử chảy vào ống nghiệm khi tới vạch định mức thì bịt lại. Để
nguyên tay, thả hết thuốc thử dư trong ống hút vào chai đựng. Đặt ống nghiệm và
ống hút vào đúng vị trí trên giá.
Cho chảy từ từ theo thành ống: để nghiêng ống nghiệm một góc 30 - 45o, cắm
thẳng đầu ống hút vào thành ống, mở ngón 1 từ từ để dung dịch chảy theo thành
ống xuống dưới. Thao tác này để tạo bề mặt phân cách giữa 2 lớp dung dịch.
+ Bằng ống hút tự động.
- Lắp đầu tip thích hợp vào đầu dưới ống hút sao cho khít.
- Cầm ống hút tự động bằng các ngón 2, 3, 4, 5 tay phải; ngón 1 tự do để nhấn
thả các nấc hút (1) và nấc xả (2) giống như tư thế cầm dao găm.
- Đặt thể tích hút:
. Đối với ống hút có thể tích thay đổi: vặn núm điều chỉnh thể tích ở đầu trên
theo chiều ngược kim đồng hồ cho đến khi hiện đúng thể tích mong muốn ở rãnh
hiện số trên thân ống hút.
. Đối với ống hút có thể tích cố định: không thực hiện bước này.
Dùng ngón 1 tay phải nhấn piston đến nấc hút (1) và giữ nguyên tư thế.
Để ống hút thẳng đứng, cắm đầu tip của ống hút ngập xuống dưới bề mặt dung
dịch khoảng 2 - 3 mm.
Mở ngón 1 từ từ đến hết để cho dung dịch được hút vào đầu tip theo áp lực âm,
tránh mở quá nhanh vì khi hút dễ tạo bọt.
Rút cẩn thận ống hút ra, chạm nhẹ đầu tip vào thành bình chứa để loại bỏ dịch
thừa bám ở mặt ngoài đầu tip (cũng có thể lau bằng gạc hoặc giấy thấm).
Cắm thẳng ống hút vào trong ống nghiệm, cách bề mặt dung dịch (nếu có)
khoảng vài cm, nhấn nấc 1 (hút) từ từ cho dịch chảy ra, dừng một vài giây, nhấn
tiếp nấc 2 (xả), dừng một vài giây cho dịch ra hết, giữ nguyên tư thế, rút ống hút ra.

48
 Hình 23: Cách sử dụng ống hút tự động.

Lưu ý:
Kiểm tra đầu tip trước khi lắp để loại bỏ các tip tắc, vỡ, hở, toè đầu.
Xả xong, trong đầu tip phải không còn dịch hay có bọt.
Thay đầu tip cho mỗi lần hút một dịch khác bằng tay hoặc bằng cách nhấn nẫy
tháo đầu tip trên thân ống hút (nếu có).
4.2.2. Đun:
+ Đun ống nghiệm.
Dùng kẹp kẹp ống nghiệm ở 1/3 trên của ống.
Hướng miệng ống về phía không người hoặc không có đồ vật.
Đun ở 1/3 trên của ngọn lửa đèn cồn (nơi có nhiệt độ cao nhất).
Lắc đều ống để ống nóng đều.
Vừa đun vừa quan sát, tránh phụt dịch ra ngoài.
Đun xong, dùng chụp để tắt đèn.
Đặt ống nghiệm vào giá, mở kẹp để nhả ống nghiệm.
Lưu ý: đun lần lượt từng ống một, không đun 2 - 3 ống trên cùng một đèn.
+ Đun bình cầu, cốc có mỏ, chén sứ.
Khi đun bình cầu, cốc có mỏ bằng đèn cồn phải đặt trên lưới amiang.
Có thể đun trên bình cách thuỷ hoặc trên bếp cát khi cần làm bay hơi từ từ,
tránh được sự nung đỏ làm hỏng mẫu thử hoặc làm văng dịch thử ra ngoài.
4.2.3. Cô bốc hơi:
Làm đậm đặc dung dịch: để loại bớt nước, acid bay hơi ra khỏi dung dịch,
Đựng dung dịch trong chén sứ và đun trên bếp cát.
Làm bay hơi đến khô (cô cạn): dùng bếp cát, cách thuỷ, tủ ấm hoặc tủ xấy
Nung khô: dùng chén nung, nung trong tủ nung.
4.2.4. Lọc:
Để tách riêng tủa và dịch.
Thường dùng phễu trong lót giấy lọc để lọc.
Đổ dịch cần lọc vào phễu qua que thuỷ tinh.
Để lọc và rửa tủa nhanh hơn, thường để cho tủa lắng xuống đáy bình chứa, gạn
hết dịch nổi vào phễu, đổ tiếp nước rửa vào phễu để rửa tủa khi phải rửa tủa, sau
đó mới đổ tủa vào phễu, tráng bình đựng và đổ hết vào phễu.

49
 Lọc giấy: khi muốn lấy tủa, dùng giấy không gấp nếp. Khi chỉ lấy dịch lọc:
dùng giấy gấp nếp.
Lọc qua phễu Busne: không bị hỏng do acid hoặc base, có thể hoà tan tủa ngay
trong phễu lọc bằng dung môi thích hợp, phía dưới có thể hút chân không để tăng
tốc độ lọc.
4.2.5. Sử dụng cân phân tích:
Có nhiều loại với độ chính xác cao, thường dùng loại 2 quang.
Những bộ phận chính của cân:
+ Bộ phận dao động:
- Cán cân, trên đó có dao cân, kim, ốc chỉnh, thước đặt con mã.
- Quang cân, gồm 2 quang, treo trên cán cân.
- Các quả cân và núm vặn để đặt quả cân (ở bên trái).
+Bộ phận cố định:
- Cột cân.
- Tay cân.
- Bảng số.
- Đèn.
- Bộ phận hãm.
- Đế cân và các ốc điều chỉnh.
- Lồng cân.
+ Một cân tốt phải bảo đảm: đúng, tin và nhạy:
- Cân đúng: trọng lượng của vật cân phải đúng bằng trọng lượng của các quả
cân. Để cân đúng thì 2 cánh đòn cân phải tuyệt đối bằng nhau.
- Cân tin: khi đặt vật cân ở các vị trí khác nhau trên cùng một đĩa cân, kết quả
vẫn giống nhau. Để cân tin, đòn cân phải cứng, dao cân phải song song.
- Cân nhạy: khi cho thêm một lượng rất nhỏ lên đĩa cân, cân bị mất thăng bằng.
Để cân nhậy, cạnh của dao cân phải sắc, mặt tựa phải thật nhẵn và cứng, đòn cân dài
và nhẹ.
+ Quy tắc sử dụng cân:
- Cân phải được đặt thăng bằng trên bề mặt phẳng ở nơi cố định, hạn chế di chuyển.
- Không sờ tay vào đòn cân, dao cân, quang cân và các bộ phận khác của cân.
- Không cân trực tiếp trên đĩa cân mà phải dùng giấy cân, mặt kính đồng hồ
hoặc cốc thuỷ tinh để cân
- Dùng kẹp để gắp quả cân, không dùng tay.
- Đặt vật cân ở đĩa bên phải, quả cân ở đĩa trái.
- Cửa cân luôn phải đóng, chỉ mở khi đưa vào hoặc lấy vật cân và quả cân ra.
- Cân xong, tắt cân và lau chùi sạch sẽ.
+ Cách cân:
50
 - Trước khi cân, phải kiểm tra ở điểm độ chính xác của cân (theo hướng dẫn riêng)
và kim phải ở điểm 0.
- Đặt vật đựng (bì) lên đĩa cân bên phải và chỉnh thăng bằng (về 0) bằng cách
hạ các quả cân hoặc cho thêm các mẩu giấy hay bìa.
- Hạ các quả cân ở đĩa bên phải tương ứng với trọng lượng định cân.
- Cho vật định cân vào vật đựng cho đến khi kim về 0.
4.2.6. Đo pH của dung dịch:
Có 2 cách:
+ Đo bằng pH kế (pHmeter)
- Nguyên lý: xác định hiệu điện thế giữa 2 điện cực:
. Điện cực qui chiếu là điện cực calomel nhúng trong dung dịch KCl bão hoà,
có điện thế xác định, không đổi.
. Điện cực thuỷ tinh (điện cực đo), nhúng vào dung dịch cần đo, có điện thế
thay đổi tuỳ theo pH (nồng độ H+) của dung dịch.
Khi đo, hệ thống hoạt động như một pille. Dòng điện được khuếch đại và đo
bằng mV và pH tương ứng.
- Trình tự đo:
. Chỉnh về 0.
. Đo và đọc kết quả.
+ Đo bằng chất chỉ thị pH.
Chất chỉ thị được coi là những acid yếu hoặc base yếu, phân ly:
Hin H+ + In-
(màu A) (màu B)
+ -
KIn = ([H ].[In ])/[Hin]
Khi ở môi trường acid, màu của chất chỉ thị là dạng Hin; khi ở môi trường
base, màu của chất chỉ thị là dạng In-
Phương trình/pH của chất chỉ thị:
pH = p KIn + log [base]/[acid].
Vùng đổi màu hữu hiệu là 2 đơn vị pH, nghĩa là: pH = p KIn  1.
Có các loại chỉ thị pH acid (xanh thymol, xanh bromoihymol, đỏ methyl, xanh
bromocrezol…); base (phenolphtalein, indigo carmin..) và vạn năng. Khi đo,
nhúng que chỉ thị vào dung dịch và đọc kết quả theo bảng màu mẫu.

51
 Bài 1
HOÁ HỌC PROTID, GLUCID, LIPID

1. Phản ứng ninhydrin.

Phản ứng ninhydrin là phản ứng màu đặc trưng của -aminoacid.
1.1. Nguyên lý:
Các -aminoacid tác dụng với ninhydrin tạo thành phức hợp có màu xanh tím
(riêng prolin và hydroxyprolin cho màu vàng).
Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: khi tác dụng với ninhydrin, các -aminoacid loại nước, khử
CO2 và phân cắt tạo thành dicetohydrindamin và một aldehyd, phản ứng như sau:

52
 + Giai đoạn 2: dicetohydrindamin mới tạo thành ngưng tụ với một phân tử
ninhydrin nữa, loại nước và biến đổi thành một phức hợp có màu xanh tím, phản
ứng xảy ra như sau:
O O O O
H H
+ O N=
NH2
H2O
O O O O
Dicetohydrindamin

O O O O

N= +
N= + H

OH O O O
Phøc hîp xanh-tÝm

1.2. Chất thử nghiệm và thuốc thử:

+ Dung dịch protein 10% (dung dịch lòng trắng trứng).
+ Dung dịch ninhydrin 0,1%.
1.3. Cách tiến hành:
+ Cho vào ống nghiệm nhỡ (loại có  = 1cm, dài 15 cm):
- Dung dịch protein 10%: 2 ml.
- Dung dịch ninhydrin 0,1 %: 1 ml.
+ Lắc đều, đun sôi 30 giây đến 1 phút, quan sát sự thay đổi màu, ghi nhận xét
và giải thích kết quả thu được.
1.4. Ứng dụng:
Phản ứng ninhydrin có ứng dụng thực tiễn như:
+ Nhận biết (phát hiện) aminoacid trong sắc ký aminoacid trên giấy.
+ Xác định (định lượng) tỷ lệ % hàm lượng aminoacid trong phương pháp
aminoacid tự động.
1.5. Cách pha thuốc thử và nguyên liệu:
Dung dịch ninhydrin 0,1%: hoà tan 0,1g ninhydrin trong 100 ml alcol etylic.
Dung dịch protein 10%: Pha 10 ml lòng trắng trứng vào 100 ml nước cất, khuấy
nhẹ, đều, lọc qua giấy lọc, để tủ lạnh 2 - 40C.
2. Phản ứng Biurê.
Phản ứng Biurê để xác định liên kết peptid trong phân tử protein, là phản ứng
màu của protein.

53
 2.1. Nguyên lý:
Các liên kết peptid kết hợp với ion đồng II ( Cu++) trong môi trường kiềm tạo
thành phức hợp màu xanh tím. Cường độ màu (đậm hay nhạt) phụ thuộc vào số
lượng liên kết peptid (nhiều hay ít) có trong phân tử protein.
Cơ chế của phản ứng tương tự như 2 phân tử Biurê tác dụng với Cu++ trong
môi trường kiềm cho nên gọi là phản ứng Biurê. Các peptid có từ 2 liên kết peptid
trở lên đều cho phản ứng này. Phức hợp màu có dạng như sau:

2.2. Thuốc thử và nguyên liệu:

Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
Dung dịch CuSO4 1%.
Nguyên liệu: Dung dịch protein 10%.
2.3. Tiến hành: cho vào ống nghiệm nhỏ.
+ Dung dịch protein 10%: 1 ml.
+ Dung dịch NaOH 10%: 0,5 ml.
+ Dung dịch CuSO4 1%: 0,5 ml.
Lắc đều, quan sát màu xuất hiện. Nhận xét và giải thích kết quả.
2.4. Ứng dụng:
Phản ứng Biurê là cơ sở để định lượng protein huyết thanh.
2.5. Chuẩn bị nguyên liệu và thuốc thử:
+ Dung dịch protein 10% (xem 1.6).
+ Dung dịch NaOH 10%: hoà loãng 42 ml dung dịch NaOH bão hoà với 300 ml
nước cất đun sôi để nguội.
+ Dung dịch CuSO4 1%: hoà tan 1 gam CuSO4 trong 100 ml nước cất.
3. Phản ứng kết tủa protein.
3.1. Kết tủa bằng acid nitric (HNO3) đậm đặc:
+ Nguyên lý:

54
 Các acid hữu cơ hoặc vô cơ như acid nitric đậm đặc (HNO3) làm biến tính
protein, phá vỡ lớp áo nước, gây kết tủa protein.
+ Nguyên liệu và thuốc thử:
- Dung dịch protein 1%.
- Acid nitric đậm đặc.
+ Tiến hành:
- Lấy 1 ml HNO3 đậm đặc cho vào ống nghiệm nhỏ, nghiêng ống nghiệm
khoảng 45O, cho thêm:
- 1 ml dung dịch protein 1% (cho nhẹ nhàng, từ từ theo thành ống nghiệm, và
không lắc), đặt đứng ống nghiệm lên.
- Quan sát một lớp tủa trắng ở mặt phân cắt giữa HNO3 và dung dịch protein.
Nhận xét và giải thích kết qủa thu được.
+ Ứng dụng:
Sử dụng tính chất kết tủa protein bởi HNO3 đậm đặc làm cơ sở cho xét nghiệm
phát hiện protein niệu trong một số bệnh lý thận khi màng siêu lọc cầu thận bị tổn
thương. Ví dụ như: thận hư nhiễm mỡ, viêm cầu thận cấp, suy thận cấp do nhiễm
độc hoá chất, nhiễm độc thuốc.
+ Chuẩn bị nguyên liệu và thuốc thử:
- Dung dịch protein 1%: pha loãng dung dịch protein 10% bằng nước cất, để
tủ lạnh (2 - 4OC).
- Acid nitric đậm đặc.
3.2. Kết tủa bằng muối kim loại nặng:
+ Nguyên lý:
Các ion kim loại nặng (Cu 2+, Hg 2+, Pb 2+) kết hợp với protein, trung hoà điện
tích, tạo phức hợp bền, không tan, gây tủa không thuận nghịch.
+ Nguyên liệu và thuốc thử:
- Dung dịch protein 1%.
- Dung dịch clorua thuỷ ngân (HgCl2) 0,1%.
+ Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm nhỏ:
- 1ml dung dịch protein 1%.
- 1ml dung dịch HgCl2 0,1%.
Lắc đều, xuất hiện tủa đục mờ (để thời gian tăng lên thì tủa sẽ lắng dần xuống
đáy ống nghiệm).
+ Ứng dụng: giải độc cho bệnh nhân bị nhiễm độc muối kim loại nặng (CuSO4,
HgCl2..) bằng cách cho uống dung dịch protein như sữa hoặc dung dịch lòng trắng
trứng và rửa dạ dày.
+ Chuẩn bị thuốc thử và nguyên liệu:
- Dung dịch protein 1% (xem 3.1).
- Dung dịch HgCl2 0,1%: hoà tan 100 mg trong 100 ml nước cất.
55
 4. Phản ứng Fehling.
Phản ứng Fehling là thử nghiệm về tính khử của monosaccharid.
+ Nguyên lý:
Trong môi trường kiềm và nhiệt độ 100OC, các monosaccharid (glucose) có
tính khử, khử ion đồng II (Cu2+) thành ion đồng I (Cu+) dưới dạng Cu2O tủa màu
đỏ gạch. Quá trình phản ứng xảy ra như sau:
O O
C C
H ONa
HCOH HCOH
HOCH HOCH
+ 2 CuSO44 + 5 NaOH + 2 CuOH + 2 Na2SO44 + 2H2O
HCOH HCOH
HCOH HCOH
CH2OH CH2OH

2 CuOH Cu2O + H2O

+ Thuốc thử:
- Thuốc thử Fehling.
- Dung dịch glucose 1%.
+ Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm nhỡ:
- 1 ml dung dịch glucose 1%.
- 1 ml thuốc thử Fehling.
Lắc đều, đun sôi khoảng 1 phút, quan sát màu và tủa hình thành, nhận xét và
giải thích kết quả.
+ Ứng dụng:
Phản ứng Fehling được sử dụng để phát hiện đường niệu (glucose trong nước tiểu).
+ Chuẩn bị thuốc thử:
- Dung dịch glucose 1%: hoà tan 1 gam glucose trong 100 ml nước cất.
- Thuốc thử Fehling: Pha 2 dung dịch A và B:
Thuốc thử A: tán nhỏ 17,5 gam CuSO4.5H2O, hoà tan trong 200 ml nước cất,
thêm 2,5 ml H2SO4 đậm đặc (PA), hoàn thành 500 ml bằng nước cất.
Thuốc thử B: Hoà tan 100 gam Na-K-Tactrat, và 75 gam NaOH, nước cất vừa
đủ 500 ml.
Khi dùng pha thuốc thử A vào B theo tỷ lệ 1/1 được thuốc thử Fehling.
5. Phát hiện đường trong nước tiểu (glucose niệu).
+ Nguyên lý:

56
 Dựa vào tính khử của glucose như trong phản ứng Fehling ở trên (mục 4).
+ Thuốc thử:
Thuốc thử Benedict (định tính).
+ Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm cỡ 15  1,5 cm:
8 giọt nước tiểu.
5 ml thuốc thử Benedict.
Đun sôi cách thủy 5 phút.
Để đơn giản, có thể lấy 8 giọt nước tiểu bằng cách như sau: lấy nước tiểu vào
ống nghiệm, đổ nhanh hết nước tiểu ra cốc thải, dựng đứng ống nghiệm lên, nước
tiểu còn lại trong ống tương đương với 8 giọt.
+ Đọc kết quả:
- Dung dịch trong ống nghiệm vẫn giữ nguyên màu xanh nước biển là âm tính (-).
- Dung dịch có màu xanh lá cây: dương tính (+) (vết).
- Dung dịch có màu vàng nhạt: dương tính (++) (khoảng 1 g%).
- Dung dịch có màu da cam: dương tính (+++) (khoảng > 1 g%).
- Dung dịch có màu đỏ da cam: dương tính (++++) (khoảng > 2 g%).
+ Ý nghĩa lâm sàng:
Glucose niệu có thể xuất hiện thoáng qua trong một số trường hợp như gây mê,
dùng thuốc nào đó như loại glucocorticoid, khi có thai, rối loạn xúc cảm, hoặc do
ăn một lúc quá nhiều đường.
Glucose xuất hiện liên tục gặp trong một số trường hợp bệnh lý như: bệnh đái
tháo đường tụy do đường máu quá cao vượt quá khả năng tái hấp thu của thận;
hoặc trong trường hợp đường máu không cao nhưng ngưỡng của thận đối với
glucose thấp (đái tháo đường do thận).
Các đường khác trong nước tiểu cũng có thể gặp như đường lactose, fructose,
galactose,…
+ Cách pha thuốc thử:
Thuốc thử Benedict (định tính): cho vào bình cầu khoảng 800 ml nước cất, đun
nóng đến 70OC, sau đó cho vào:
Na2CO3 100 g (hoặc Na2CO3.10 H2O : 200 g)
Natri citrat 173 g
Khuấy đều cho tan hết. Để lạnh đến nhiệt độ phòng. Hòa tan 17,3g CuSO4. 5
H2O trong 100 ml nước cất. Đổ dung dịch CuSO4 này vào bình cầu và hoàn thành
đến 1 lít bằng nước cất. Dung dịch này để được vô thời hạn.
6. Chiết xuất và xác định thành phần của lecithin.
Lecithin là tên gọi của phosphatidylcholin. Khi thủy phân lecithin bằng enzym
hoặc kiềm, sản phẩm cuối cùng thu được là glycerol, acid béo, phosphat và cholin.

57
 6.1. Chiết xuất lecithin từ lòng đỏ trứng:
+ Nguyên lý:
Dựa vào tính chất của lecithin là tan trong cồn (alcol etylic) sôi và tủa trong
aceton lạnh để chiết xuất lecithin từ lòng đỏ trứng.
+ Nguyên liệu và thuốc thử:
- Lòng đỏ trứng (vịt hoặc gà) đã loại hết lòng trắng.
- Alcol etylic 96%.
- Aceton.
+ Tiến hành:
- Cho 15 ml alcol etylic vào bình tam giác, nút bằng bông mỡ, đun cách thuỷ
hoặc cách cát đến khi alcol bắt đầu sôi. Đổ ngay hết 15 ml alcol sôi vào cốc có mỏ
đã chứa sẵn 1/3 lòng đỏ trứng. Dùng que thuỷ tinh khuấy nhẹ và đánh nhuyễn, mục
đích là làm cho lecithin tan hết trong cồn sôi.
- Gạn dịch qua phễu lọc (qua 1 lớp giấy lọc hoặc qua lớp bông mỡ), dùng que
gạn, ép tủa cho dịch chảy hết. Dịch lọc thu được là dịch lecithin và các lipid khác
tan trong cồn sôi.
- Cô cách thuỷ dịch lecithin trong cồn đến khi thành dịch sánh, để nguội, thêm
vào 15 ml aceton lạnh, khuấy đều, nhẹ thấy có kết tủa lecithin. Gạn bỏ dịch aceton
chứa các lipid khác ở trên, giữ lại tủa lecithin.
- Thêm 5 ml alcol etylic vào cốc chứa tủa lecithin vừa thu được, đặt lên bếp
đun cách thuỷ, khuấy nhẹ đến tan hết tủa, kết quả thu được là dung dịch lecithin
tan trong cồn sôi.
6.2. Thủy phân lecithin:
+ Nguyên lý:
Trong môi trường kiềm và nhiệt độ 100OC, lecithin bị thuỷ phân tạo nên các
thành phần gồm: glycerol, muối của acid béo, cholin và phosphat.
+ Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm to: 2 ml dung dịch lecithin/cồn.
3 ml dung dịch KOH 10%.
Nút nhẹ bằng bông mỡ, đun sôi cách thuỷ 30 - 60 phút, chú ý không nút bông
chặt quá, khi sôi tạo áp lực lớn dễ phụt gây bỏng.
Sau 60 phút lấy dịch lecithin/KOH ra để xác định các thành phần.
6.3. Xác định các thành phần:
+ Phát hiện cholin:
Khi lấy ống nghiệm thuỷ phân lecithin ra khỏi nguồn đun, mở nút ống nghiệm,
lấy tay phẩy nhẹ vào mũi sẽ ngửi thấy mùi tôm khô đặc trưng cho trimetylamin được
tạo ra từ cholin trong quá trình thuỷ phân, phản ứng xảy ra như sau:
CH3 CH3
HO-CH2 -CH2 -N CH3 OH N CH3 + HO- CH2 - CH2 - OH
CH3 CH3
Trimetylamin
58 (mùi tôm khô)
 + Phát hiện acid béo:
- Acid béo tạo thành ở dịch thuỷ phân tồn tại dưới dạng muối kali (muối xà
phòng), công thức chung là R1COOK và R2COOK, đây là các muối dễ hoà tan
trong nước. Khi cho acid chlorhydric vào dịch thuỷ phân sẽ tạo thành acid béo tự
do không tan trong nước. Phản ứng xảy ra như sau:
RCOOK + HCl RCOOH + KCl
RCOOH là acid béo bậc cao, không tan trong nước, trông giống như bóng váng
mỡ trên nước.
- Tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ theo bảng sau:
Thuốc thử Ống 1 Ống 2
Dịch thuỷ phân lecithin 0,5 ml -
H2O 0,5 ml 1 ml
HCl 0,5 N 5 giọt 5 giọt

Lắc đều từng ống, so sánh độ đục giữa 2 ống trước và sau khi cho HCl, giải
thích kết quả (độ đục) ở 2 ống 1 và ống 2.

+ Phát hiện glycerol:

Dùng thử nghiệm acrolein để phát hiện glycerol
- Nguyên lý:
Khi đun nóng glycerol với chất hút nước như kalibisulfat (KHSO4), sẽ tạo nên
acrolein. acrolein có mùi khét và làm đỏ giấy có tẩm thuốc thử Schiff.
Phản ứng sẽ xảy ra như sau:
CH2OH CH2OH CHOH CH2
| KHSO4 | | ||
HO- CH CH CH2 CH
| || OH | O | O
H- COH H2O C C H2O C
| _ H H H
H
Glycerol Acrolein

- Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm khoảng 1 gam KHSO4 (bằng hạt ngô), thêm vào đó 5 giọt
dịch thuỷ phân lecithin. Đậy ống nghiệm bằng giấy lọc đã tẩm thuốc thử Schiff.
Hơ đáy ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn.
Quan sát khói bốc lên có mùi khét và làm đỏ giấy lọc có thuốc thử Schiff.
+ Phát hiện phosphat:
- Nguyên lý:

59
 Acid phosphoric trong dịch thuỷ phân lecithin tác dụng với molipdatamoni tạo
thành muối phosphomolipdatamoni (tủa màu vàng). Muối này tác dụng với
Euconogen (hoặc vitamin C, thiếc chlorua) tạo nên phức hợp màu xanh.
- Nguyên liệu và thuốc thử:
. Dịch thuỷ phân lecithin.
. Thuốc thử molipdat.
. Thuốc thử Euconogen.
- Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm nhỏ:
0,5 ml dịch thuỷ phân lecithin,
0,5 ml thuốc thử molipdat.
Lắc đều, đun sôi, thêm 0,5 ml thuốc thử Euconogen.
Lắc đều, quan sát sự thay đổi màu, nhận xét và giải thích kết quả.
- Chuẩn bị thuốc thử:
. Dung dịch KOH 10% (không có carbonat): hoà loãng 42 ml dung dịch KOH
bão hoà trong 300 ml nước cất đun sôi để nguội.
- Dung dịch HCl 0,5N:
Lấy số X ml HCl đặc có C% và d ( trị số cụ thể ghi trên lọ hoá chất) để pha 1
lít HCl 0,5N là:
X (ml) = 18,25. 100/C.d

- Thuốc thử Schiff: hoà tan 2 gam fuccin base trong 200 ml nước sôi, lắc 5
phút, để nguội đúng 50 C, lọc, thêm 20 ml HCl 1N. Làm lạnh đến 25 C và thêm 1
O O

gam natri hoặc kalimetabisulfit. Để dung dịch 14 - 24 giờ ở chỗ tối, thêm 2 gam
than hoạt (than động vật), trộn đều 1 phút, lọc, bảo quản ở chỗ tối và từ 0 - 4OC. Trước
khi sử dụng đưa ra nhiệt độ phòng.
- Thuốc thử molipdat:
. Cho 12,5 g muối molipdatamoni [(NH4)2 MoO4] trong 100 ml nước cất, cho từ
từ, vừa cho vừa khuấy đến hết 75 ml acid sulfuric (H2SO4) đặc, hoàn thành 500 ml
bằng nước cất. Hoặc dùng acid nitric đặc thì pha theo cách dưới.
. Cho 3,75 gam [(NH4)2 MoO4] vào 50 ml nước cất, khuấy nhẹ, thêm 50 ml
acid nitric (HNO3) đặc (32%, d  1,2), hoà tan hoàn toàn muối molipdatamoni khi
cho hết acid nitric.
- Thuốc thử Euconogen (1-amino, 2-naphtol, 4-sulfonic acid):
Hoà tan 500 mg Euconogen trong 100 ml nước cất, có thể đun nóng nhẹ, để tủ
lạnh 24h, gạn hoặc lọc lấy dịch trong, cho thêm 1gam Na2SO3 và 30 gam Nabisulfit
(NaHCO3) khan, nước cất vừa đủ 200 ml. Dùng chai màu để đựng và bảo quản
thuốc thử Euconogen.

60
 Bài 2
ENZYM
1. Tác dụng của catalase.
1.1. Nguyên lý:
Dựa trên tác dụng phân huỷ peroxid hydrogen của catalase:
Catalase
2H2O2 2H2O + O2 (mới sinh)
Nhận biết O2 mới sinh bằng sự bùng cháy của tàn đóm đỏ.
1.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Dịch gan nghiền 10%.
+ Dd H2O2 3%.
1.3. Tiến hành:
+ Cho vào một ống nghiệm to: 1 ml dịch gan nghiền 10% và 5 ml nước cất,
lắc đều.
+ Cầm ống nghiệm bằng ngón 2, 3, 4 tay trái, ngón 1 (ngón cái) ở tư thế sẵn
sàng để bịt kín miệng ống nghiệm.
+ Cho nhanh 5ml Dd H2O2 3% (đã lấy sẵn trong một ống nghiệm khác) vào
ống nghiệm chứa dịch gan nghiền và nhanh chóng dùng ngón cái bịt ngay miệng
ống lại.
+ Lộn ngược ống nghiệm và nhúng ngập miệng ống vào trong một chậu nước.
+ Từ từ mở ngón cái để cho dịch trong ống chảy hết vào chậu nước.
+ Nhấc ống nghiệm ra khỏi chậu nước ở tư thế úp ngược.
+ Tay phải cầm một que đóm dài, châm lửa, để cháy cho đến khi đầu que có
tàn than đỏ thì tắt lửa để lại tàn than đỏ.
+ Đưa nhanh tàn than đỏ vào trong ống nghiệm.
+ Tàn than sẽ bùng cháy thành ngọn lửa nếu trong ống nghiệm có oxy mới sinh.
1.4. Cách pha thuốc thử:
+ Dịch gan nghiền 10%: Cân 50g gan lợn tươi, cho vào cối sứ, cho thêm một
ít cát thuỷ tinh. Nghiền kỹ bằng chày sứ để phá vỡ tế bào. Cho thêm 500ml Dd.
NaCl 0,9%. Trộn đều. Lọc qua bông, lấy dịch lọc. Bảo quản trong tủ lạnh.
+ Dd H2O2 3%: pha loãng Dd H2O2 30% 10 lần bằng nước cất.
2. Tác dụng của lipase tụy.
2.1. Nguyên lý:
Lipase tuỵ thuỷ phân lipid trung tính (triglycerid) thành glycerol và các acid
béo. Muối mật nhũ tương hoá lipid tạo điều kiện tốt cho lipase hoạt động. Acid
béo tạo thành làm thay đổi pH của môi trường và làm đổi màu chất chỉ thị. Nhận
biết tác dụng thuỷ phân lipid của lipase thông qua sự đổi màu của chất chỉ thị.

61
 2.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Sữa hộp.
+ Dịch nghiền tuỵ 10%.
+ Mật lợn.
+ D.d. Phenolphtalein 0,1%.
+ D.d. Xanh bromothymol 0,1%.
+ D.d. NaOH 10%.
+ D.d. NaOH 0,1N.
2.3. Tiến hành:
2.3.1. Trung tính hoá sữa:
+ Cho vào một bình nón:
15 ml sữa 10% (pha từ sữa hộp).
10 giọt phenolphtalein 0,1%.
1 giọt D.d.NaOH 10%.
+ Lắc kỹ, cho thêm từng giọt NaOH 0,1N và lắc cho đến khi có màu hồng nhạt.
+ Dùng sữa đã trung tính hoá này để làm phản ứng.
2.3.2. Phản ứng:
Cho vào 3 ống nghiệm:

Ống số Sữa Dịch tuỵ Dịch mật Nước cất D.d. Xanh
trung tính nghiền 10% bromothymol

1 5 ml 1 ml 1 ml 0 ml 5 giọt

2 5 ml 1 ml 0 ml 1 ml 5 giọt

3 5 ml 0 ml 1 ml 0 ml 5 giọt

Để ở 370C trong 15 phút.

Nhận xét sự thay đổi màu của các ống và giải thích.
2.4. Cách pha thuốc thử :
+ Dịch tụy nghiền 10%: cân 50g tuỵ lợn tươi, cho vào cối sứ, cho thêm một ít
cát thuỷ tinh. Nghiền kỹ bằng chày sứ để phá vỡ tế bào. Cho thêm 500 ml d.d.
NaCl 0,9%, trộn đều. Lọc qua bông lấy dịch lọc. Bảo quản trong tủ lạnh.
+ Dung dịch phenolphtalein 0,1%: cân 0,10 g phenolphtalein cho vào bình định
mức 100 ml. Hoà tan và hoàn thành 100 ml bằng alcol ethylic 95%.

62
 + Dung dịch xanh bromothymol 0,1%: cân 0,1g xanh bromothymol cho vào
bình định mức 100 ml. Hoà tan và hoàn thành 100 ml bằng nước cất.
+ Dung dịch NaOH 10%: cân 100g NaOH cho vào bình định mức 1l đã có
khoảng 800 ml nước cất. Hoà tan. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Cho vào bình định
mức 1l và hoàn thành 1l bằng nước cất. Trộn đều.
+ Dung dịch NaOH 0,1N: cân 4 g NaOH cho vào bình định mức 1l đã có
khoảng 800 ml nước cất. Hoà tan. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Hoàn thành 1l
bằng nước cất. Trộn đều.
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzym.
3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase nước bọt :
3.1.1. Nguyên lý:
Dựa trên sự thuỷ phân tinh bột của amylase nước bọt. Đánh giá hoạt độ enzym
thông qua màu của tinh bột và các sản phẩm thuỷ phân của nó với iod.

Amylase Amylase Amylase Amylase Amylase

Tinh bột → Amylodextrin → Erythrodextrin → Acrodextrin → Maltose →Glucose

I2 I2 I2 I2 I2 I2

Xanh Tím Đỏ nâu Vàng nâu Không màu Không màu

Tuỳ theo nhiệt độ của môi trường mà enzym có hoạt độ khác nhau: Enzym hầu
như không hoạt động ở 00C, hoạt động tốt nhất ở 370C (nhiệt độ tối thích), hoàn
toàn không hoạt động ở 1000C (do bị biến tính).
3.1.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Amylase nước bọt (NB)1/10:
Nhổ nước bọt vào một ống nghiệm to. Lấy 1ml phần nước của nước bọt cho
sang một ống nghiệm khác. Cho thêm 9ml nước cất, lắc đều rồi lọc qua bông được
dịch lọc là dung dịch amylase nước bọt 1/10. Dùng dung dịch này để làm các thí
nghiệm đánh giá hoạt độ enzym dưới ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau.
+ D.d. Hồ tinh bột 0,2%.
+ D.d. iod 0,1N.
3.1.3. Tiến hành:
Cho vào 3 ống nghiệm:

Thuốc thử Ống 1 Ống 2 Ống 3

63
 D.d. amylase 0,5 ml 0,5 ml 0,5ml
NB 1/10
(đã để trước 5 phút ở 00C) (đã đun sôi) (đã để trước 5 phút ở
370C)

D.d. hồ tinh bột 3 ml 3 ml 3 ml

0,2%

Để 20 phút ở 00C Để 20 phút ở 370C Để 20 phút ở 370C

D.d. iod 0,1N 5 giọt 5 giọt 5 giọt

Nhận xét màu của các ống và giải thích.

3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase nước bọt:
3.2.1. Nguyên lý:
Dựa trên phản ứng thuỷ phân tinh bột của amylase nước bọt.
Amylase có hoạt độ cao nhất ở pH tối thích (pH = 6,8-7), hoạt độ của enzym
càng giảm khi pH của môi trường ở càng xa pH tối thích.
3.2.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Amylase nước bọt 1/10.
+ D.d. Hồ tinh bột 0,2%.
+ D.d. iod 0,1N.
+ D.d. iod 1N.
+ D.d. Hcl 1N.
+ D.d. NaOH 0,5N.
3.2.3. Tiến hành:
Cho vào 3 ống nghiệm to:
Thuốc thử Ống 1 (pH = 2) Ống 2 (pH = 7) Ống 3 (pH =10)
D.d. amylase NB 1/10 0.5 ml 0,5 ml 0,5 ml
D.d. HCl 1N 0,5 ml O ml 0 ml
Nước cất 0 ml 0,5 ml 0 ml
D.d. NaOH 0.5N 0 ml 0 ml 0,5 ml
D.d. hồ tinh bột 0,2% 3 ml 3 ml 3 ml
Lắc đều. Để cả 3 ống ở 37 0C
trong 20 phút
D.d. iod 0,1N 5 giọt 5giọt
D.d. iod 1N 5 giọt
Nhận xét màu của các ống và giải thích.
3.3. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá, chất ức chế đến hoạt độ amylase nước bọt:

64
 3.3.1. Nguyên lý:
Dựa trên phản ứng thuỷ phân tinh bột của amylase nước bọt.
Amylase nước bọt được hoạt hoá bởi ion Cl-, bị ức chế bởi ion Cu2+
3.3.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Amylase nước bọt 1/10.
+ D.d. hồ tinh bột 0,2%.
+ D.d. iod 0,1N.
3.3.3. Tiến hành:
Cho vào 3 ống nghiệm to:
Thuốc thử Ống 1 Ống 2 Ống 3
D.d. amylase NB 1/10 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
D.d. NaCl 1% 0,5 ml 0 ml 0 ml
Nước cất 0 ml 0,5 ml 0 ml
D.d. CuSO4 1% 0 ml 0 ml 0,5 ml
D.d. hồ tinh bột 0,2% 3 ml 3 ml 3 ml
Lắc đều. Để cả 3 ống ở nhiệt độ phòng trong 20 phút
D.d. Iod 0,1N 5 giọt 5 giọt 5 giọt

Lắc đều các ống. Nhận xét và giải thích.

3.4. Cách pha thuốc thử :
+ D.d. hồ tinh bột 0,2%:
Đun khoảng 900 ml nước cất đến sôi. Hoà tan 2g tinh bột trong khoảng 20ml
nước cất rồi đổ vào nước đang sôi, khuấy đều cho đến khi sôi lại. Để nguội đến
nhiệt độ phòng. Cho vào bình định mức 1l và hoàn thành 1l bằng nước cất.
+ D.d. iod 1N: I2 tinh thể: 12,7 g;
KI 20,0 g;
Nước cất vừ đủ 100 ml;
Đựng trong lọ màu.
+ D.d. iod 0,1N: pha loãng dung dịch iod 1N 10 lần.
+ D.d. HCl 1N: lấy (thận trọng) 8,4 ml D.d. HCl đặc cho từ từ vào bình định
mức 100 ml đã có sẵn 70 ml nước cất. Hoà tan và hoàn thành 100 ml bằng nước
cất. Trộn đều.
+ D.d. NaOH 0,5N: cân 20 g NaOH cho vào ống đong hoặc cốc có mỏ. Hoà
tan trong khoảng 800 ml nước cất. Để nguội. Cho vào bình định mức 1l và hoàn
thành 1l bằng nước cất. Trộn đều.
+ D.d. NaCl 1%: cho 10 g NaCl vào bình định mức 1l đã có khoảng 800 ml
nước cất. Hoà tan và hoàn thành 1l bằng nước cất. Trộn đều.
+ D.d. CuSO4 1%: cân 1g CuSO4.5H2O cho vào bình định mức100 ml. Hoà
tan và hoàn thành 100 ml bằng nước cất. Trộn đều.

65
 4. Tính đặc hiệu của enzym.
4.1. Nguyên lý :
Amylase chỉ thuỷ phân tinh bột, không thuỷ phân saccharose.
Saccharase chỉ thuỷ phân saccharose, không thuỷ phân tinh bột
Dùng phản ứng Fehling để xác định sản phẩm thuỷ phân của amylase và saccharase.
4.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Amylase nước bọt 1/10.
+ D.d. saccharase.
+ D.d. hồ tinh bột 0,2%.
+ D.d. saccharose 5%.
+ D.d. NaOH 10%.
+ D.d. CuSO4 10%.
4.3. Tiến hành :
Cho vào 3 ống nghiệm:
Thuốc thử Ống 1 Ống 2 Ống 3
D.d. amylase NB 1/10 1 ml 0 ml 0 ml
D.d. Saccharase 0 ml 1 ml 1 ml
D.d. Hồ tinh bột 0,2% 5 ml 5 ml 0 ml
D.d. Saccharose 0 ml 0 ml 5 ml
Lắc đều. Để ở 37 C trong 30 phút
0

D.d. CuSO410% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

D.d. NaOH 10% 1 ml 1 ml 1 ml
Đun sôi từng ống trên đèn cồn. Nhận xét màu của các ống và giải thích.
4.6. Cách pha thuốc thử :
+ D.d. saccharase: lấy khoảng 50 g men bia, cho vào cối sứ, thêm một ít cát
thuỷ tinh, nghiền kỹ bằng chày sứ. Cho thêm 100 ml nước cất, trộn đều. Lọc qua
bông, lấy dịch lọc. Bảo quản trong tủ lạnh.
+ D.d. hồ tinh bột 0,2%: Xem mục 3.4.
+ D.d. saccharose 5%: cho 50,0g saccharose vào bình định mức 1 lít; hoà tan
và hoàn thành 1lit bằng nước cất; trộn đều.
+ D.d. NaOH 10%: Xem mục 2.4.
+ D.d. CuSO4 10%: cân 100 g CuSO4.5H2O cho vào bình định mức 1 lít; hoà
tan và hoàn thành 1lit bằng nước cất.
5. Xác định hoạt độ amylase máu và nước tiểu.
5.1. Phương pháp Wohlgemuth:
5.1.1. Nguyên lý:
Dựa trên phản ứng thuỷ phân tinh bột của amylase.
66
 Xác định độ pha loãng 1 ml huyết thanh hoặc nước tiểu có khả năng thuỷ phân
hết 2 mg tinh bột sau 30 phút ở 370C và pH = 6,8 để suy ra hoạt độ enzym có trong
1 ml huyết thanh hoặc nước tiểu.
5.1.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Huyết thanh.
+ Nước tiểu.
+ D.d. NaCl 0,9%.
+ Đệm phosphat, pH = 6,8.
+ D.d. iod N/50.
5.1.3. Tiến hành:
+ Lấy 10 ống nghiệm, đánh số từ 1 đến 10.
+ Cho vào mỗi ống:
1 ml D.d. NaCl 0,9 % (nếu dùng huyết thanh).
hoặc 1 ml D.d. đệm phosphat, pH = 6,8 (nếu dùng nước tiểu).
+ Cho vào ống số 1: 1 ml huyết thanh (hoặc nước tiểu). Trộn đều bằng cách
hút lên thả xuống vài lần.
+ Hút 1ml trong ống 1 cho vào ống 2 rồi trộn đều như trên.
+ Hút 1 ml dịch trong ống 2 cho vào ống 3 rồi trộn đều như trên.
+ Cứ tiếp tục làm như vậy cho đến ống số 10.
+ Hút bỏ 1ml trong ống số 10.
Như vậy, huyết thanh hoặc nước tiểu từ ống số 1 đến ống số 10 đã được pha
loãng theo tỷ lệ tương ứng như sau:
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

+ Đặt các ống vào cách thủy 37OC trong vài phút.
+ Cho vào mỗi ống 2 ml D.d. hồ tinh bột 0,1% (tương ứng với 2 mg tinh bột).
+ Trộn đều rồi để ở cách thuỷ 37OC đúng 30 phút.
+ Lấy ra, cho ngay vào mỗi ống 2 giọt D.d. iod N/50 và lắc đều.
+ Tính kết quả:
Tìm ống đầu tiên có màu xanh hoặc nâu (ví dụ ống số 5).
Tính kết quả theo ống đứng trước ống đó (ví dụ ống số 4): lấy độ pha loãng
của ống này nhân với 2.
Ví dụ: ống số 4 có độ pha loãng là 16, hoạt độ amylase sẽ là 16  2 = 32 đơn
vị Wohlgemuth.
5.1.4. Giá trị tham khảo:
Bình thường, hoạt độ amylase ở:
Huyết thanh: 16 – 32 đơn vị Wohlgemuth.

67
 Nước tiểu: 32 – 64 đơn vị Wohlgemuth.
5.1.5. Cách pha thuốc thử:
+ D.d. NaCl 0,9%: Cân 9 g NaCl cho vào bình định mức 1 lít. Hoà tan và hoàn
thành 1 lít bằng nước cất.
+ Đệm phosphat, pH = 6,8: D.d. KH2PO4 9,070/00: 510 ml
D.d. Na2HPO4 11,87%o: 490 ml
+ D.d.Iod 1N: I2 tinh thể: 12,7 g
KI 20,0 g
Nước cất vừa đủ 100 ml
Đựng trong lọ màu.
+ D.d. Iod N/50: Pha loãng D.d. iod 1N 50 lần
5.2. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học:
5.2.1. Nguyên lý:
-amylase thủy phân 2-chloro-4-nitrophenyl-maltotriosid (CNPG3) thành 2-
chloro-4-nitrophenol (CNP), 2-chloro-4-nitrophenyl-maltodiosid và glucose (G):
-Amylase
5 CNPG3 ⎯⎯⎯⎯→ 3 CNP + 2 CNPG2 + 3 G3 + 2 G
Sự giải phóng của CNP từ cơ chất và sự tăng độ hấp thụ của nó tỷ lệ thuận với
hoạt độ -amylase trong mẫu thử.
5.2.2. Thuốc thử và chất thử:
+ Kit thuốc thử amylase (hãng Human).
+ Huyết thanh hoặc nước tiểu.

5.2.3. Tiến hành:

+ Chuẩn bị máy 4010: Chương trình : K60.
Kính lọc : 405.
Nhiệt độ : 37OC.
Hệ số : 24820.
+ Cho vào ống nghiệm:
+ 1 ml thuốc thử amylase.
+ 10 l huyết thanh (hoặc nước tiểu).
Trộn đều, ủ 1 phút ở 37OC. Đổ vào cóng. Nhấn nút Result, ghi kết quả hiện
trên màn hình.
5.2.4. Giá trị tham khảo:
+ Hoạt độ amylase huyết thanh: < 220 U/l.
+ Hoạt độ amylase nước tiểu: < 1000 U/l.
5.3. Ý nghĩa:
Tăng hoạt độ amylase máu và nước tiểu gặp trong:

68
 + Viêm tụy cấp: tăng rất cao, có thể hơn 30 - 40 lần so với bình thường, tăng sau
3 - 6h từ khi phát bệnh, đạt cực đại sau 20 - 30h và trở về bình thường sau 2 - 8
ngày. Đồng thời, tăng amylase nước tiểu sau 6 - 12h (do được đào thải qua thận).
+ Viêm tụy mãn và ung thư tụy, nhưng không tăng cao như trong viêm tụy cấp.
+ Viêm tuyến nước bọt mang tai, do virut, đặc biệt là quai bị.
+ Trong các hội chứng đau bụng khác (như loét dạ dày - tá tràng, tắc ruột ở
đoạn trên, sỏi mật, chấn thương bụng, vỡ lách, vỡ chửa ngoài dạ con…) nhưng
mức tăng vừa phải.

Bài 3
CHUYỂN HÓA GLUCID, LIPID

1. Định lượng đường máu.

Đường máu là các đường khử có trong máu mà chủ yếu là đường glucose. Có thể
định lượng glucose máu theo 2 phương pháp Folin- Wu và phương pháp enzym.
1.1. Theo phương pháp Folin-Wu:
+ Nguyên lý:
Trong môi trường kiềm (OH-) v à nhiệt độ sôi (100OC), đường khử (glucose)
khử ion đồng II (Cu++) thành ion đồng I (Cu+). Ion đồng I tác dụng với
phosphomolibdic (không màu) thành phức hợp màu xanh là phosphomolibdơ.
Cường độ màu xanh tỷ lệ với nồng độ glucose có trong máu.
+ Thuốc thử và chất thử nghiệm:
Thuốc thử:
- Dung dịch glucose chuẩn 5,5 mmol/l.
- Dung dịch Na-tungstat 10%.
- Dung dịch H2SO4 2/3 N.
- Dung dịch đồng- kiềm.
- Dung dịch phosphomolibdic.
Chất thử nghiệm: huyết thanh thỏ hoặc huyết thanh người bình thường.
+ Tiến hành:
Đây là kỹ thuật gồm 2 bước là khử tạp và làm phản ứng.
- Khử tạp:
Cho thuốc thử vào 2 ống nghiệm nhỏ theo bảng sau:

Thuốc thử Ống chuẩn (S) Ống thử (T)

69
 H2O 3,5 ml 3,5 ml
Dung dịch glucose chuẩn (5,5 mmol/l) 0,5 ml -
Huyết thanh (huyết tương) - 0,5 ml
D.d Na-tungstat 10% 0,5 ml 0,5 ml
D.d H2SO4 2/3N 0,5 ml 0,5 ml

Lắc đều cả 2 ống, ly tâm ống thử 2500 - 3000 vòng/phút, trong 5 phút, lấy dịch
trong của 2 ống để làm phản ứng.
- Phản ứng:
Cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm to theo bảng dưới đây:
Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
Nước cất 1 ml - -
Dịch trong của ống chuẩn - 1 ml -
Dịch trong của ống thử - - 1 ml
Dung dịch đồng- kiềm 1 ml 1 ml 1 ml

Lắc đều, đun sôi cách thuỷ 8 phút, làm lạnh

D.d phosphomolibdic 1 ml 1ml 1 ml
Lắc đều, đun sôi cách thuỷ 2 phút, làm lạnh
Nước cất 2 lần 4 ml 4 ml 4 ml

Lắc đều, đo mật độ quang học ống chuẩn (Es), ống thử (Et) ở bước sóng ()
420 nm đối chứng với ống trắng.
Tính kết quả:
Kết quả nồng độ đường máu được tính theo công thức sau:
ET ET
CT = .C S = . 5,5 (mmol/l)
ES ES
+ Giá trị tham khảo:
Bình thường nồng độ đường máu lúc đói từ 4,4 - 6,1(mmol/l).
1.2. Theo phương pháp enzym quang học (GOD- PAP):
+ Nguyên lý:
Xác định nồng độ glucose sau khi oxy hoá glucose bằng glucooxidase (GOD),
peroxide hydrogen được tạo thành tác dụng với 4-aminoantipyrin và phenol nhờ
xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp màu quinoimin, theo các phản ứng
sau:
Glucose oxidase
Glucose + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯→ Gluconic acid + H2O2
Peroxidase
70
 H2O2 + Phenol + 4-aminoantipyrin ⎯⎯⎯⎯→ Quinonimin + 4 H2O
(đỏ quinon)

Đo mật độ quang ở bước sóng 546 nm, so với glucose chuẩn sẽ tính được kết quả.
+ Thuốc thử và chất thử:
- Thuốc thử: loại thuốc thử của hãng Human, thành phần gồm có:
- Đệm phosphat (pH = 7,5) 250 mmol/l.
- Phenol 5 mmol/l.
- 4-aminoantipyrin 0,5 mmol/l.
- Glucooxidase (GOD)  10 kU/l.
- Dung dịch glucose chuẩn 5,55 mmol/l (1g/l).
- Chất thử: huyết thanh, huyết tương chống đông bằng Heparin hoặc EDTA.
+ Tiến hành: trên máy 4010.
- Đặt chế độ máy: chương trình C/St.
Bước sóng 500 nm hoặc 546 nm.
Nhiệt độ 20, 25OC hoặc 37OC.
Hệ số (F): 5,55.

- Tiến hành: cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm nhỏ theo bảng sau:

Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)

Thuốc thử 1 ml 1 ml 1 ml

H2O 10 l - -

D. d glucose chuẩn 5,55 mmol/l - 10 l -

Huyết thanh (hoặc huyết tương) - - 10 l

Trộn đều, ủ 20 phút/20 - 25OC hoặc 10 phút/37OC.

Đo theo các bước sau:
- Đổ ống trắng vào cuvet: nhấn Zero, hút bỏ.
- Đổ ống chuẩn vào cuvet: nhấn Standard, hút bỏ.
- Đổ ống thử vào cuvet: nhấn Result, ghi kết quả.
Nếu đo theo chế độ A so với ống trắng, được mật độ quang của ống chuẩn (ES),
ống thử (ET), kết quả tính theo công thức:

71
 ET ET
CT = . Cs = . 5,55 (mmol/l)
Es Es

Tuy nhiên đo theo chế độ A phải tính bằng máy tính cá nhân, lâu và không tiện
bằng đo theo chế đô C/St như trên.
+ Ý nghĩa lâm sàng:
- Glucose máu tăng trong một số bệnh như:
.Tiểu đường (khi hôn mê glucose máu có thể tăng tới 16,7 mmol/l, thậm chí có
thể lên tới 44,5 mmol/l và luôn kèm theo đường niệu dương tính).
.Viêm tuỵ cấp và mãn.
. Các bệnh cường tuyến yên và thượng thận.
. Nhiễm độc tuyến giáp nặng.
. Choáng chấn thương do gẫy xương đùi, chấn thương sọ não.., sau nhồi máu
cơ tim, bỏng nặng.
- Đường máu giảm gặp trong một số trường hợp như:
. Các u tuỵ đảo như đa sản, u adenoma, carcinoma.
. Hôn mê do dùng quá liều insulin theo dõi không chặt chẽ.
. Thiểu năng tuyến nội tiết vỏ thượng thận, tuyến giáp, tuyến yên.
. Tổn thương vùng dưới đồi.
- Suy gan, xơ gan nặng, nhiễm độc các chất hữu cơ như asen(As), tetrachloruacarbon
(CCl4), chloroform.
2. Định lượng triglycerid huyết thanh theo phương pháp enzym.
2.1. Nguyên lý:
Thuỷ phân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra
bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyrin và 4-
chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Lipase
Triglycerid ⎯⎯⎯⎯→ Glycerol + acid béo
GK
Glycerol + ATP ⎯⎯⎯⎯→ Glycerol-3-phosphat + ADP
GPO
Glycerol-3-phosphat + O2 ⎯⎯⎯⎯→ Dihydroxyacetonphosphat + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminoantipyrin + 4-chlorophenol ⎯⎯→ Quinonimin + HCl + H 2O

Đo mật độ quang quinonimin ở bước sóng 546nm, so với chuẩn sẽ tính được kết
quả.
Tên các enzym viết tắt như sau:
GK- Glycerolkinase.
72
GPO- Glycerol-3phosphat oxidase.
POD- peroxidase.
2.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Chất thử:
Huyết thanh hoặc huyết tương (chống đông bằng heparin hoặc EDTA)
+ Thuốc thử:
Thuốc thử của hãng Human, thành phần gồm có:
- Đệm pipes pH = 7,5 50 mmol/l
- 4-chlorophenol 5 mmol/l
- 4-aminoantipyrin 0,25 mmol/l
- Ion magie 4,5 mmol/l
- ATP 2 mmol/l
- Lipase  1300 U/l.
- Peroxidase  500 U/l.
- Glycerolkinase  400 U/l.
- Glycerol-3phosphat oxidase  1500 U/l.
Dung dịch chuẩn triglycerid 2,28 mmol/l.
2.3. Tiến hành:
Xét nghiệm được thực hiên trên máy 4010 của Hãng Boehringer Mannheim.
+Đặt chế độ máy:
- Chương trình: C/St (xác định nồng độ chất theo chuẩn).
- Bước sóng: 546 nm.
- Nhiệt độ: 37OC (hoặc nhiệt độ phòng 20 - 25OC.
- Hệ số (F): 2, 28.
+Tiến hành: cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm theo bảng sau:
Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
Thuốc thử 1 ml 1 ml 1 ml
H2O 10 l - -
D.d triglycerid chuẩn 2,28 mmol/l - 10 l -
Huyết thanh (hoặc huyết tương) - - 10 l

- Lắc đều, ủ 5 phút/37OC (hoặc để ở nhiệt độ phòng trong10 phút).

- Đo:
. Đổ ống trắng vào cuvet: nhấn Zero, hút bỏ
. Đổ ống chuẩn vào cuvet: nhấn Standard, hút bỏ.
. Đổ ống thử vào cuvet: nhấn Result, ghi kết quả.

73
 2.4. Ý nghĩa lâm sàng:
Bình thường: nồng độ triglycerid huyết tương < 2,30 mmol/l.
Triglycerid tham gia vào thành phần của các lipoprotein huyết tương. Nó tăng
khi rối loạn lipid máu, dẫn tới xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành, viêm tụy, tiểu
đường.
+ Giới hạn cho biết nguy cơ tăng triglicerid máu:
- Nghi ngờ tăng nếu triglycerid > 1,71 mmol/l.
- Tăng nếu triglycerid > 2,29 mmol/l.
+ Tăng bệnh lý gặp trong một số bệnh như:
- Hội chứng tăng lipid máu, thường nhận thấy huyết thanh đục, chủ yếu là do
tăng triglycerid, mức tăng có thể tới 5 lần so với bình thường.
- Xơ vữa động mạch.
- Hội chứng thận hư.
- Tiểu đường.
+ Giảm bệnh lý:
- Xơ gan.
- Một số bệnh mạn tính, suy kiệt.
- Cường tuyến giáp.
Triglycerid máu tăng là chỉ số giúp phân biệt các thể tăng lipid máu. Điều chỉnh
bằng ăn uống phòng nguy cơ gây xơ vữa động mạch và nhồi máu cơ tim (ăn dầu
thực vật, không ăn mỡ động vật).
3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh.
3.1. Theo phương pháp Liebermann- Burchard:
+ Nguyên lý:
Cholesterol toàn phần (tự do và este) kết hợp với anhydrit acetic và acid
sulfuric tạo phức hợp màu xanh lục. Đo mật độ quang học màu xanh lục tạo thành
so với cholesterol chuẩn để tính kết quả.
+ Chất thử và thuốc thử:
- Chất thử: huyết thanh, huyết tương (chống đông bằng heparin, hoặc EDTA).
- Thuốc thử: . Liebermann
. Dung dịch cholesterol chuẩn 5,2 mmol/l.
+ Tiến hành: cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm to theo bảng sau:

Thuốc thử Ống trắng (- Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
)

74
 Thuốc thử Liebermann 5 ml 5 ml 5 ml
H2O 100 l - -
D.d cholesterol chuẩn (5,2 mmol/l) - 100 l -
Huyết thanh (hoặc huyết tương) - - 100 l

Lắc đều, kỹ nhưng tránh tạo bọt, để yên 25 phút.

Đo mật độ quang ống chuẩn, ống thử so đối chiếu với ống trắng được Es, Et ở
bước sóng 602 nm.
+ Tính kết quả: nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh (CT) được tính theo
công thức sau:
ET ET . 5,2
CT = .Cs = (mmol/l)
Es Es

+ Giá trị tham khảo:

Bình thường nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh từ 3,9 - 4,9 mmol/l,
cholesterol este hoá chiếm 60 - 75%. Cholesterol tăng theo tuổi.
+ Chuẩn bị thuốc thử:
- Thuốc thử Liebermann: đặt cốc có mỏ vào chậu nước đá và cho vào:
. Acid acetic (PA): 50 ml.
. Anhydrit acetic: 100 ml.
. Acid sulfuric đặc (PA): 33 ml (vừa cho vừa khuấy).
Trộn đều, bảo quản trong chai màu, để trong tủ lạnh.
- Dung dịch cholesterol chuẩn 5,2 mmol/l: hoà tan 200 mg cholesterol (PA)
vào trong 100 ml acid acetic tinh khiết (PA).

3.2. Theo phương pháp enzym đo màu:

+ Nguyên lý:
Định lượng cholesterol sau khi thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol
esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxidase (CHO). Đo mật độ quang của
quinoimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide (H2O2) với 4-
aminophenazone và phenol nhờ sự xúc tác của peroxidase (POD), các phản ứng xảy
ra như sau:
CHE
Cholesterol este + H2O ⎯⎯⎯⎯⎯→ Cholesterol + acid béo
CHO
Cholesterol + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯→ Cholestene-3-one + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminophenazone + phenol ⎯⎯⎯→ Quinonimin + H2O
Đo mật độ quang của quinonimin so với ống chuẩn để tính được kết quả.
+ Chất thử và thuốc thử:
75
 - Chất thử: huyết thanh hoặc huyết tương (chống đông bằng heparin; EDTA).
- Thuốc thử:
Thuốc thử của hãng Human, thành phần gồm có:
. Đệm phosphat (pH = 6,5) 100 mmol/l.
. 4-aminophenazone 0,25 mmol/l.
. Phenol 5 mmol/l.
. Peroxidase > 5 kU/l.
. Cholesterolesterase > 150 U/l.
. Cholesteroloxidase > 100 U/l.
. Natri azide 0,05%.
Dung dịch cholesterol chuẩn 5,17 mmol/l.
+ Tiến hành: trên máy 4010 của hãng Boehringer Mannheim (Đức).
- Đặt chế độ máy: chương trình C/St.
Bước sóng 546 nm (hoặc 500 nm).
Nhiệt độ 37OC (hoặc nhiệt độ phòng 20 - 25OC).
Hệ số 5,17.
- Cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm theo bảng sau:
Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
Thuốc thử 1 ml 1 ml 1 ml
H2O 10 l - -
D.d cholesterol chuẩn (5,17 mmol/l) - 10 l -
Huyết thanh ( hoặc huyết tương) - - 10 l

- Trộn đều, ủ 5 phút/37OC (hoặc 10 phút ở 20-25OC).

- Đo:
. Đổ ống trắng vào cuvet: nhấn Zero, hút bỏ
. Đổ ống chuẩn vào cuvet: nhấn Standard, hút bỏ,
. Đổ ống thử vào cuvet: nhấn Result, ghi kết quả.
+ Giá trị tham khảo (theo hoá chất của Human):
- Nghi ngờ tăng, nếu > 5,7 mmol/l.
- Tăng, nếu > 6,7 mmol/l.
Theo Hiệp hội Xơ vữa động mạch châu Âu, nồng độ cholesterol ở người lớn dưới
30 tuổi có thể tăng tới 4,65 mmol/l, tăng trên 5,2 mmol/l đối với người trên 30 tuổi.
+ Ý nghĩa lâm sàng:
Cholesterol tham gia vào thành phần các lipoprotein như VLDL (lipoprotein
có tỷ trọng rất thấp), LDL (lipoprotein có tỷ trọng thấp), và HDL (lipoprotein có
tỷ trọng cao). Khi tăng VLD, LDL và giảm HDL có ý nghĩa dự báo về nguy cơ xơ
vữa động mạch, bệnh mạch vành, nghẽn mạch.
- Tăng bệnh lý: cholesterol máu tăng trong một số bệnh như:

76
 . Các bệnh về gan như vàng da tắc mật, viêm ống mật tiến triển.
. Các bệnh thận: thận hư nhiễm mỡ (10 - 20 mmol/l), viêm thận cấp.
. Các bệnh về tuỵ như sau phẫu thuật tuỵ, thiếu insulin (tiểu đường).
. Nhược năng tuyến giáp.
. Các rối loạn về lipid, xơ vữa động mạch, cao huyết áp.
- Giảm bệnh lý:
. Các tổn thương gan nặng:
Xơ gan giai đoạn cuối.
Hoại tử gan cấp và bán cấp.
Nhiễm độc thuốc, hoá chất như chloroform, CCl4.
Khi gan bị tổn thương nặng cholesterol toàn phần giảm, cholesterol este hoá
giảm mạnh, đôi khi bằng không.
. Nhiễm urê huyết giai đoạn cuối.
. Nhiễm trùng huyết.
. Cường tuyến giáp.
. Các chứng thiếu máu:
Thiếu máu ác tính.
Thiếu máu huỷ huyết.
Thiếu máu nhược sắc nặng.
. Suy thượng thận.
4. Phát hiện ceton niệu.
4.1. Nguyên lý:
Các thể ceton (chủ yếu là -hydroxybutyrat) tác dụng với natrinitroprussiat trong
môi trường kiềm (NH4OH) tạo thành phức hợp màu đỏ tím. Creatinin cũng tạo
phức hợp màu tương tự với natrinitroprussiat nhưng phức hợp màu này bị phá huỷ
bởi acid acetic.
4.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Chất thử:
- Nước tiểu người khoẻ mạnh (NT1).
- Nước tiểu có thể ceton (NT2).
+ Thuốc thử:
- Dung dịch natrinitroprussiat 10%.
- Acid acetic đậm đặc.
4.3. Tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ các thuốc thử theo bảng sau:
Thuốc thử Ống 1 Ống 2

77
 Nước tiểu 1 1 ml -
Nước tiểu 2 - 1 ml
Dung dịch natrinitroprussiat 10% 5 giọt 5 giọt
Acid acetic đặc 0,5 ml 0,5 ml

Lắc đều, cho từ từ theo thành ống nghiệm vào từng ống, 1 ml NH 4OH đậm
đặc. Quan sát màu ở mặt phân cắt giữa nước tiểu và NH4 OH.
4.4. Đọc kết quả:
+ Kết quả âm tính: nếu ở bề mặt phân cắt có một lớp bóng mờ.
+ Kết quả dương tính: nếu ở bề mặt phân cắt có một vòng đỏ tím.
4.5. Ý nghĩa lâm sàng:
+ Bình thường: trong nước tiểu các thể cetonic có ở nồng độ rất thấp cho kết quả
âm tính.
+ Kết quả dương tính gặp trong một số trường hợp sau:
- Tiểu đường.
- Sau phẫu thuật tụy.
- Sốt kéo dài.
- Nhiễm kiềm: sau nôn mửa kéo dài làm mất dịch vị dạ dày.
5. Phát hiện muối mật trong nước tiểu.
5.1. Nguyên lý:
Các muối mật làm giảm sức căng bề mặt tương đối của nước tiểu. Dùng bột
lưu huỳnh thăng hoa để đánh giá (phát hiện) hiện tượng này.
5.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Chất thử:
- Nước tiểu người khoẻ mạnh (NT1).
- Nước tiểu có muối mật (NT2).
+ Thuốc thử:
- Bột lưu huỳnh thăng hoa.
5.3. Tiến hành:
Cho vào cốc có mỏ: 50 ml NT1 vào cốc 1.
50 ml NT2 vào cốc 2 .
Rắc nhẹ nhàng một ít bột lưu huỳnh thăng hoa lên bề mặt nước tiểu mỗi cốc. Quan
sát bột lưu huỳnh thăng hoa ở 2 cốc, ghi lại hiện tượng và giải thích kết quả.
5.4. Kết quả:
+ Âm tính: bột lưu huỳnh thăng hoa vẫn nổi trên bề mặt nước tiểu, gõ nhẹ vào
thành cốc bột lưu huỳnh thăng hoa cũng không rơi xuống đáy cốc nước tiểu.

78
 + Dương tính: nếu bột lưu huỳnh thăng hoa tự rơi xuống đáy cốc nước tiểu. Nếu
nồng độ muối mật thấp thì gõ nhẹ bột lưu huỳnh thăng hoa sẽ rơi xuống đáy cốc
nước tiểu.
5.5. Ý nghĩa lâm sàng:
+ Bình thường: trong nước tiểu có một lượng rất nhỏ (coi như không có) muối
mật, cho phản ứng âm tính.
+ Phản ứng dương tính gặp trong một số trường hợp như tắc mật, viêm gan.

Bài 4
CHUYỂN HOÁ PROTID

1. Định lượng Protein toàn phần huyết thanh (Phương pháp Gornall).
1.1. Nguyên lý:
Dựa trên phản ứng Biurê: các liên kết peptid trong phân tử protein tạo với ion
Cu trong môi trường kiềm thành phức hợp có màu xanh tím. Cường độ màu tỷ
2+

lệ thuận với số lượng liên kết peptid hay nồng độ protein.

1.2. Chất thử và Thuốc thử :
+ Huyết thanh.
+ D.d. protein chuẩn có nồng độ đã biết (CS).
+ D.d. NaCl 0,9%.
+ Thuốc thử Gornall.
1.3. Tiến hành:
Cho vào 3 ống nghiệm:

Thuốc thử Ống trắng (B) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)

79
 Huyết thanh 0 ml 0 ml 50 l
D.d. protein chuẩn 0 ml 50 l 0 ml

D.d. NaCl 0,9% 1 ml 0,95 ml 0, 95 ml

T.T. Gornall 4 ml 4 ml 4 ml

Lắc đều; để yên 30 phút.

Đo quang ở bước sóng 530 nm. Đối chiếu với ống trắng. Được mật độ quang
học của ống chuẩn (ES) và mật độ quang học của ống thử (ET)
Tính kết quả: nồng độ protein ống thử (CT) được tính theo công thức:
ET
.
CT = CS
Es
1.4. Giá trị tham khảo:
Bình thường, nồng độ protein huyết thanh là 60 – 80 g/l.
1.5. Ý nghĩa:
+ Giảm protein huyết thanh thường gặp:
- Do thiểu dưỡng: ăn không đủ protein, suy dinh dưỡng, Kwashiorkor.
- Do tiêu hoá và hấp thu kém: gặp trong một số bệnh đường tiêu hoá, thiếu hụt
enzym tiêu hoá, thiếu hụt hệ thống vận chuyển aminoacid.
- Do giảm tổng hợp: chủ yếu gặp trong bệnh gan như xơ gan, viêm gan mãn
do gan tổng hợp 100% albumin, 80% globulin huyết thanh. Ngoài ra còn gặp trong
hội chứng viêm, trong tăng tổng hợp bất thường các protein khác (ví dụ như rối
loạn globulin đơn dòng).
- Do mất protein:
. Bệnh thận: điển hình là hội chứng thận hư, đào thải nhiều albumin gây giảm
protein và albumin máu dẫn đến giảm áp lực thẩm thấu gây phù. Ngoài ra còn gặp
trong viêm cầu thận mạn, suy thận.
. Mất qua da: như trong bỏng nặng.
. Các trường hợp chảy máu, mất máu nói chung.
+ Tăng protein huyết thanh: ít gặp, như trong các trường hợp máu cô (tăng
tương đối), một số rối loạn protein máu, như tăng globulin máu đơn dòng.Tăng
protein máu còn gặp trong trường hợp xuất hiện loại protein bất thường nào đó,
ví dụ trong bệnh đa u tuỷ xương xuất hiện protein Bence-Jones (protein nhiệt tan)
làm cho protein máu tăng cao, có thể tới 160 g/l.
1.6. Cách pha thuốc thử :
+ Thuốc thử Gornall:
CuSO4.5H2O 1,5 g.
Na,K-tartrat 6,0 g.

80
 NaOH 30 g (hoặc 42 ml NaOH bão hoà).
KI: 1,0 g.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Bảo quản trong lọ nhựa tối.
+ D.d. NaCl 0,9%: Cân 9 g NaCl cho vào bình định mức 1 lít. Hoà tan và hoàn
thành 1 lít bằng nước cất.
2. Điện di protein huyết thanh (kiến tập).
2.1. Điện di protein huyết thanh trên giấy:
2.1.1. Nguyên lý:
Các phân tử protein tích điện (âm hoặc dương) trong dung dịch (đệm) có pH
khác với pHi của chúng. Khi đặt trong điện trường một chiều, chúng sẽ di chuyển
về phía điện cực trái dấu với điện tích của chúng. Sự di chuyển của các phân tử
protein dưới tác dụng của dòng điện một chiều gọi là điện di protein.
Khi điện di, các phân tử protein di chuyển với vận tốc khác nhau. Tốc độ di
chuyển của protein trong điện trường phụ thuộc vào:
+ Điện tích của phân tử protein: các protein có pHi càng xa pH môi trường thì
di chuyển càng nhanh. Ngược lại, các protein có pHi càng gần pH môi trường thì
di chuyển càng chậm.
+ Kích thước phân tử protein: các phân tử protein có trọng lượng phân tử
càng nhỏ thì sẽ di chuyển càng nhanh; ngược lại, trọng lượng phân tử càng lớn
thì di chuyển càng chậm.
+ Hình dạng phân tử của protein: các phân tử protein dạng tròn di chuyển nhanh
hơn các phân tử không tròn.
+ Ngoài ra, tốc độ di chuyển của protein còn phụ thuộc vào thế hiệu, lực ion, nhiệt
độ...
Do đó, từ khi xuất phát từ cùng một điểm, sau một thời gian chạy, các phân tử
protein sẽ tách thành các phân đoạn ở các vị trí khác nhau.
2.1.2. Dụng cụ và thuốc thử:
+ Dụng cụ:
- Máy điện di: có 2 bộ phận chính:
. Chậu điện di: gồm 2 máng để chứa dung dịch đệm. Mỗi máng có 1 điện cực
(sợi platin) ngâm trong dung dịch đệm.
Ngoài ra còn có giá đỡ các băng giấy, các bộ phận điều chỉnh băng giấy và
nắp máy.
. Máy chỉnh lưu: tạo dòng điện một chiều và nối với 2 điện cực.
- Giấy điện di: là loại giấy đặc biệt, chuyên dùng. Giấy được cắt thành từng
băng nhỏ, tuỳ theo kích thước chậu điện di, miễn sao 2 đầu của băng giấy đủ ngâm
trong dung dịch đệm có trong 2 máng.
- Pipet chấm điện di: thường dùng các loại micropipet dài khoảng 10 cm, có
chia vạch, đầu dưới nhỏ, phẳng và nhẵn.
81
 Ngoài ra còn có các chậu, máng, giá đỡ để ngâm rửa và phơi băng điện di.
+ Thuốc thử:
- Dung dịch đệm Veronal pH = 8,6.
- Dung dịch nhuộm .
- Dung dịch rửa 1 và 2.
- Dung dịch chiết rút màu.
2.1.3. Tiến hành:
2.1.3.1. Chạy điện di:
+ Chuẩn bị:
- Máy: đặt ở vị trí cân bằng. Đổ dung dịch đệm vào 2 máng. Kiểm tra điện cực,
dây nối.
- Băng giấy: dùng bút chì kẻ một vạch xuất phát ở một đầu. Ghi số mẫu hoặc
tên bệnh nhân.
Nhúng ướt đều băng giấy bằng dung dịch đệm, sau đó thấm bớt dung dịch trên
bộ băng giấy bằng cách ép vào giữa 2 tờ giấy lọc.
Đặt băng giấy lên giá và chỉnh cho thật phẳng. 2 đầu của băng giấy phải được
nhúng trong dung dịch đệm ở hai máng, vạch xuất phát ở phía cực âm.
+ Chấm mẫu:
Dùng micropipet lấy huyết thanh chấm thành một đoạn thật đều trên vạch xuất
phát. Cách 2 bên rìa băng giấy 0,5 cm. Lượng huyết thanh được chấm phụ thuộc
vào băng giấy và kinh nghiệm, thường từ khoảng 5 l – 10 l.
Có thể dùng các băng giấy nhỏ thấm huyết thanh và đặt trên vạch xuất phát để
thay cho chấm mẫu.
+ Chạy điện di:
Đậy nắp và bật điện để chạy. Người ta thường chạy với cường độ dòng điện
khoảng 0,5 mA/một băng giấy và hiệu điện thế 10 Volt/cm chiều dài băng giấy.
Thời gian chạy: từ 3 - 4h. Để theo dõi, người ta chấm một giọt xanh bromophenol
vào mép ngoài của vạch xuất phát và cho chạy cùng với huyết thanh.
2.1.3.2. Cố định và nhuộm:
Ngắt điện, lấy băng điện di ra, ngâm ngay vào chậu dung dịch nhuộm (chứa
xanh bromophenol), trong khoảng 14 - 16h.
2.1.3.3. Rửa và làm khô:
Lấy băng điện di ra, cho vào chậu rửa chứa dung dịch acid axetic 2%.
Sau 5 phút thay dung dịch axetic mới hoặc chuyển băng giấy sang chậu rửa
khác, để rửa băng (thường khoảng 3 lần) cho sạch hết dung dịch nhuộm.
Sau đó, phơi hoặc sấy nhẹ các băng giấy cho khô, ta được một điện di đồ với
các phần protein bắt màu xanh trên băng giấy.
Khi điện di trên giấy, thường tách được 5 phần là albumin, 1-globulin,
2-globulin, -globulin và -globulin.
82
 Hình 24: Điện di đồ
2.1.3.4. Chiết rút màu và định lượng:
Cắt rời từng vạch màu, sau đó cắt nhỏ và cho vào từng ống nghiệm tương ứng
chưá 2ml dung dịch chiết rút màu. Lắc kỹ cho màu tan vào dung dịch, phần giấy
sẽ trắng hết.
Đo mật độ quang từng ống ở bước sóng 560 nm – 600 nm. Được các mật độ
quang (E) riêng phần tương ứng.
Tính kết quả: cộng các E riêng phần được E toàn phần. Tính tỷ lệ phần trăm
các phần theo công thức:
E riêng phần
% riêng phần = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯  100
E toàn phần
2.1.4. Giá trị tham khảo:
Thông thường tỷ lệ các phần như sau:
Albumin 50 – 60% (0,50 – 0,60).
1-globulin 3 – 5% (0,03 – 0,05).
2-globulin 6 – 10% (0,06 – 0,10).
-globulin 9 – 15% (0,09 – 0,15).
-globulin 12 – 20% (0,12 – 0,20).
2.1.5: Ý nghĩa:
Sự thay đổi tỷ lệ các phần có giá trị chẩn đoán trong một số hội chứng (xem
điện di protein huyết thanh trên màng cellulose acetat)
2.1.6: Cách pha thuốc thử:
+ D.d. đệm Veronal, pH = 8,6, lực ion 0,075 .
Veronal: 2,76 g.
Natri Veronal: 15,40 g.

83
 Hoà tan trong khoảng 800 ml nước cất. Chỉnh pH đến 8,6. Hoàn thành 1000 ml
bằng nước cất.
+ Dung dịch nhuộm:
Xanh bromophenol: 0,1 g.
HgCl2: 50 g.
Acid acetic tinh khiết: 50 ml.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Cách pha:
Đun nóng cho tan hết 50 g HgCl2 trong khoảng 800 ml nước cất. Cho thêm 0,1
g xanh bromophenol và khuấy kỹ cho tan hết. Để nguội. Thêm 50 ml acid acetic.
Hoàn thành 1 000 ml bằng nước cất.
+ Dung dịch rửa 1: Acid acetic 2% trong nước.
+ Dung dịch rửa 2:
Natri acetat tinh khiết: 10,0 g.
Acid acetic tinh khiết: 20,0 ml.
Nước cất vừa đủ : 1000 ml.
+ Dung dịch chiết rút màu:
Na2CO3 khan: 20,0 g.
Methanol: 300 ml.
Nước cất: 700 ml.
2.2. Điện di protein huyết thanh trên màng cellulose acetat:
2.2.1. Nguyên lý:
Nguyên lý điện di protein huyết thanh trên màng cellulose acetat
cũng tương tự như điện di protein huyết thanh trên giấy; chỉ có khác là giấy
được thay bằng màng cellulose acetat. Ngay sau khi phân chia, các phân
đoạn protein được nhuộm và định lượng bằng densitometer.
2.2.2. Mẫu thử và thuốc thử:
+ Mẫu thử:
- Huyết thanh: để được 8 ngày ở 2 - 10OC.
- Nước tiểu, dịch não tuỷ: đã cô đặc để có nồng độ protein 20 - 30 g/l.
+ Thuốc thử:
- Đệm Tris-tricin, pH = 11,0.
- Dung dịch nhuộm Amido-đen: độc, ăn mòn và dễ cháy.
- Dung dịch nhuộm đỏ Ponceau: tránh tiếp xúc với da và mắt.
- Dung dịch phai màu Amido-đen: tránh tiếp xúc với da và mắt.
- Dung dịch phai màu đỏ Ponceau: tránh tiếp xúc với da và mắt.
- Dung dịch làm trong: A + B, khi dùng trộn 90 ml A + 10 ml B, bền trong 10
ngày ở 15 - 30OC.

84
 + Methanol khan.
+ Máy.
- Ổn áp.
- Máy điện di.
- Bộ chấm mẫu chuyên dụng.
- Densitometer.
- Các phụ kiện.
2.2.3. Tiến hành:
+ Lấy các màng cellulose acetat ra khỏi túi và ngâm trong dung dịch đệm
(50 ml/một băng) trong 10 - 20 phút.
+ Lấy dải màng ra khỏi đệm và thấm giữa 2 tờ giấy lọc.
+ Dàn dải màng trên cầu đỡ, đặt đúng vị trí để đầu qui chiếu ở góc dưới phải
hoặc ở góc trên trái, mặt hấp phụ (mờ) nằm ở phía trên.
+ Đặt cầu đỡ vào đúng vị trí ở buồng điện di. Hai đầu màng phải ngập trong
dung dịch đệm (khoảng 140 ml/1 khoang).
+ Dùng pipette nhỏ huyết thanh theo thứ tự đánh số vào các hố thích hợp của
khay mẫu: 20 l đối với vi phân chia hoặc 30 l đối với bán vi phân chia.
+ Lấy bộ phận có đầu chấm mẫu và đặt đúng vị trí vào rãnh của khay mẫu.
+ Nhấn vài lần thanh hãm xuống tới đáy của hàng hố đã có mẫu để chuyển
mẫu tới đầu chấm mẫu.
+ Lấy bộ chấm mẫu ra và đặt nó nằm trên đầu cực âm (cathod) của giá đỡ đã
có các dải băng căng phẳng.
+ Nhấn thanh hãm trong vài giây để mẫu thấm hết xuống màng cellulose acetat.
+ Lấy bộ chấm mẫu ra đặt vào khay chứa mẫu và rửa ngay bằng nước muối
sinh lý. Thấm khô đầu chấm mẫu bằng giấy lọc.
+ Đậy nắp máy và bật điện. Điều chỉnh điện thế tới 200V và chạy điện di trong
25 phút (đối với vi phân chia) hoặc 35 phút (đối với bán vi phân chia).
+ Sau khi chạy xong, tắt điện, lấy các dải màng ra và ngâm chúng vào trong dung
dịch nhuộm, mặt mờ ở dưới, trong 10 phút, lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy khuấy.
+ Rửa thuốc nhuộm thừa vài lần bằng dung dịch phai màu. Phải rửa sạch, sao
cho nền của dải màng trắng hoàn toàn.
+ Loại nước khỏi dải màng bằng cách ngâm trong anhydrid methanol trong 1 phút.
+ Ngâm các dải màng vào trong dung dịch làm trong mới pha và khuấy trong
1 - 2 phút. Lấy các dải màng ra và đặt chúng trên các tấm thuỷ tinh sạch đặt bề mặt
mờ ở dưới. Tách các bọt khí bằng cách lăn nhẹ một que thuỷ tinh hoặc con lăn trên
dải màng.
+ Đặt tấm thuỷ tinh ở 60 - 700C cho đến khi dải màng trong ra (cũng có thể để
ở nhiệt độ phòng trong 1h). Sau đó để ở nhiệt độ phòng (ít nhất 30 phút) trước khi
ép phẳng các dải màng.

85
 + Quét các dải màng ở 570 nm (đối với Amido-đen) hoặc 525 nm (đối với đỏ
Ponceau) trên Densitometer BTS- 235.
2.2.4. Giá trị tham khảo:
Bình thường:
Albumin: 57 - 65%.
1-globulin: 1 - 4%.
2-globulin: 6 - 10%.
-globulin: 8 - 12%.
-globulin: 12,5 - 19,5%.
2.2.5. Ý nghĩa:
Sự thay đổi tỷ lệ các thành phần protein huyết thanh có giá trị chẩn đoán. Dựa
trên điện di đồ, người ta chia thành các hội chứng sau:
+ Hội chứng suy gan hoặc suy dinh dưỡng:
- Albumin giảm , 1- và 2-globulin giảm, -globulin đôi khi giảm.
- -globulin không đổi hoặc giảm.
Hình ảnh này cũng thấy trong trong hấp thu kém và không tiêu hoá được protein.
+ Hội chứng viêm:
- Albumin bình thường (có thể hạ nếu có suy dinh dưỡng hoặc kèm suy gan).
- -1 globulin tăng (nhưng khó đánh giá vì nồng độ thấp so với protein toàn phần).
- 2-globumin tăng cao: dấu hiệu nhạy của hội chứng viêm.
- - và -globulin không đổi
+ Hội chứng đáp ứng miễn dịch:
- Albumin, 1-, 2- và -globulin bình thường.
- -globulin tăng cao.
+ Hội chứng nhiễm trùng + viêm:
- Albumin bình thường hoặc hạ.
- 1- và đặc biệt là 2-globulin tăng.
- -globulin không đổi.
- -globulin tăng.
+ Hội chứng ký sinh trùng:
Một biến thể của hội chứng nhiễm trùng, với -globulin tăng, có thể rất cao.
+ Hội chứng xơ gan:
- Albumin, 1-, 2-globulin giảm hoặc rất thấp.
- -globulin tăng có thể trùm lên cả phần -globulin.
+ Hội chứng thận hư:
- 2- và -globulin tăng cao, trong khi các phần khác giảm.
- Albumin rất thấp, 1- globulin không có, -globulin thấp.
+ Hội chứng không có -globulin máu (agammaglobulinemia):

86
 -globulin rất giảm, hoặc không có trên điện di đồ.
+ Hội chứng rối loạn globulin máu (dysproteinemia):
Thường xuất hiện một băng mảnh, có đỉnh cao, phủ trên các phần protein
khác vốn đã giảm, thường là phủ trên -globulin, đôi khi cả trên - và -
globulin. Đó là protein M.

3. Định lượng urê trong máu và nước tiểu.

3.1. Định lượng urê bằng phương pháp Bousquet:
3.11. Nguyên lý:
Trong môi trường acid, có chất oxy hoá (Fe3+) và đun sôi, urê phản ứng với
diacetylmonoxim (DAM) cho một phức hợp có màu vàng. Thiosemicarbazid (TSC)
chuyển màu của phức hợp thành đỏ. Đo màu định lượng.
3.1.2. Chất thử và thuốc thử :
+ Huyết thanh, huyết tương, máu chống đông.
+ Nước tiểu 24h: đo thể tích (ml), pha loãng 100 lần bằng nước cất.
+ D.d. Urê chuẩn 5 mmol/l (hoặc 7,5 mmol/l, 10 mmol/l).
+ D.d. acid trichloracetic (TCA) 3%.
+ Hỗn hợp DAM-TSC (thuốc thử 1).
+ D.d. FeCl3-H2SO4 (thuốc thử 2).
3.1.3. Tiến hành:
+ Khử tạp:
Cho vào 2 ống nghiệm:

Thuốc thử Ống chuẩn (S) Ống thử (T)

D.d trichloracetic (TCA) 3% 1,8 ml 1,8 ml

D.d urê chuẩn 5 mmol/l 0,2 ml 0 ml

Huyết thanh hoặc nước tiểu pha loãng 0 ml 0,2 ml

Trộn đều. Ly tâm 4.000 vòng trong 5 phút. Lấy dịch trong.
+Phản ứng:
Cho vào 3 ống nghiệm to:

87
 Thuốc thử Ống trắng (B) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
Nước cất 0,2 ml 0 ml 0 ml
Dịch trong của ống chuẩn 0 ml 0,2 ml 0 ml
Dịch trong của ống thử 0 ml 0 ml 0,2 ml
Thuốc thử 1 3 ml 3 ml 3 ml
Thuốc thử 2 3 ml 3 ml 3 ml

Lắc đều.
Đặt trong cách thuỷ sôi đúng 10 phút. Lấy ra, để nguội đến nhiệt độ phòng.
Đo quang (trong vòng 30 phút kể từ khi lấy ở cách thuỷ ra): Bước sóng 520 nm,
cóng 1 cm, đối chiếu với ống trắng, được mật độ quang học của ống chuẩn (Es) và
của ống thử (ET).
Tính kết quả theo công thức:
ET
Nồng độ urê (mmol/l) = CS
ES
Đối với nước tiểu: nhân với độ hoà loãng.
3.1.4. Giá trị tham khảo:
Nồng độ urê bình thường.
Máu: 2,5- 7,5 mmol/l.
Nước tiểu: 250-500 mmol/l.
3.1.5. Ý nghĩa:
+ Giảm nồng độ urê máu < 2 mmol/l và giảm nồng độ urê nước tiểu ở người
lớn thấy ở giai đoạn cuối của suy gan nặng (do gan giảm chức năng tổng hợp urê)
đi kèm với tăng nồng độ amoniac và hôn mê.
+ Tăng nồng độ urê máu và giảm nồng độ urê nước tiểu gặp trong suy thận
cấp và mạn. Người ta thường kết hợp định lượng urê trong máu và nước tiểu
24h để tính độ thanh lọc urê. Urê và creatinin là hai thông số không thể thiếu
trong đánh giá suy thận.
Tăng urê máu thường do các nguyên nhân như sau:
- Do thận:
. Viêm thận mãn: urê máu tăng liên tục. Nồng độ urê máu có thể tới 50 - 60 mmol/l.
Nồng độ urê cho phép đánh giá tiến triển của bệnh. Tăng urê luôn đi kèm với rối
loạn bài tiết thận.
. Bệnh thận toàn bộ và mãn: không chỉ gây rối loạn đào thải urê mà còn đào
thải phosphat, sulphat, ion H+.

88
 . Viêm cầu thận cấp: urê tăng vừa phải.
. Viêm ống thận (ví dụ nhiễm độc thuỷ ngân): trong thời kỳ vô niệu ure tăng
liên tục tới ngày thứ 5 và đạt tới 30 - 50 mmol/l, khi có bài niệu thì lúc đầu giảm
chậm sau đó giảm nhanh.
. Bệnh khe thận: tăng urê thuần tuý hoặc đi kèm với tăng huyết áp.
. Bệnh thận đa nang.
. Xơ mạch thận.
. Bệnh tổ chức liên kết thận: lupus ban đỏ, viêm nút quanh động mạch.
. Bệnh thận do bệnh chuyển hoá: Gout, rối loạn globulin máu (myelom, bệnh
Waldenstrom).
- Các nguyên nhân khác: tăng urê ngoài thận.
Trước khi chẩn đoán viêm thận mạn cần loại trừ: thiểu niệu đơn thuần, tăng
urê do tăng dị hoá, tắc cơ học đường dẫn niệu, chế độ ăn giàu protid...
+ Urê máu còn là thông số theo dõi có thai ở bệnh nhân thận.
3.1.6. Cách pha thuốc thử :
+ D.d. acid trichloracetic (TCA) 3% trong nước:
Khó cân chính xác, vì acid trichloraxetic hấp phụ hơi nước trong không khí rất
nhanh. Vì vậy có thể pha từ những ống đã có sẵn một lượng tinh thể acid trichloracetic
đã xác định trọng lượng, từ đó đem hoà tan và pha thành dung dịch có nồng độ mong
muốn.
Chú ý: TCA thuộc loại acid mạnh, có thể gây bỏng nặng, nên cần tránh vương
ra tay, bắn vào da, quần áo...
+ D.d. diacetyl monoxim (DAM) 2,5%:
Cân 25,0 g diacetyl monoxim (2,3-butan-dion-2-oxim) cho vào bình định mức
1 lít. Cho thêm khoảng 500 ml nước cất và hoà tan. Hoàn thành 1 lít bằng nước
cất. Lọc và đựng trong lọ nâu.
+ D.d. thiosemicarbazid (TSC) 0,5%:
Cân 5,0 g thiosemicarbazid cho vào bình định mức 1 lít đã chứa sẵn khoảng
500 ml nước. Hoà tan và hoàn thành 1 lít bằng nước cất. Đựng trong lọ nâu.
+ D.d. DAM-TSC: (thuốc thử I):
D.d. DAM 2,5% : 1 thể tích.
D.d. TSC 0,5% : 1 thể tích.
+ D.d. FeCl3-H3PO4:
Hoà tan 15 g FeCl3.6H2O trong khoảng 30 ml nước cất. Chuyển vào ống đong
dung tích 500 ml. Cho thêm từ từ 300 ml H3PO4 85%. Hoàn thành 450 ml bằng
nước cất và trộn đều. Đựng trong lọ nâu.
+ D.d. H2SO4 20%:

89
 Cho khoảng 600 ml nước cất vào một cốc có mỏ 1 lít rồi đặt trong nước đá
khoảng 10 phút. Cho thêm từ từ 200 ml H2SO4 p.a đậm đặc và khuấy đều. Để nguội
đến nhiệt độ phòng. Chuyển vào bình định mức 1 lít . Hoàn thành 1 lít bằng nước
cất và trộn đều.
+ Hỗn hợp Fe-H2SO4 (thuốc thử II):
Cho 1 ml D.d.FeCl3-H3PO4 vào bình định mức 1 lít. Hoà loãng và hoàn
thành bằng D.d. H2SO4 20%. Trộn đều. Đựng trong lọ nhựa polyethylen.
+ D.d. acid benzoic bão hoà:
Cho khoảng 2 g acid benzoic vào một cốc có mỏ đã có 500 ml nước cất. Khuấy
bằng máy khuấy qua đêm. Lọc và đựng trong chai nhựa.
+ Dung dịch urê chuẩn gốc 10 mg/ml (166,67mmol/l):
Cho 1 g urê p.a vào bình định mức 100 ml. Hoà tan và hoàn thành 100 ml bằng
D.d. benzoic bão hoà.
+ D.d. urê chuẩn làm việc (5 mmol/l, 7,5 mmol/l, 10 mmol/l) pha từ D.d. urê
chuẩn gốc, trong bình định mức 100 ml, theo bảng sau:
D.d urê chuẩn làm việc D.d. urê chuẩn gốc D.d. benzoic bão hoà
D.d. urê chuẩn 5 mmol/l 3,0 ml Hoàn thành đủ 100 ml
D.d. urê chuẩn 7,5 mmol/l 4,5 ml Hoàn thành đủ 100 ml
D.d. urê chuẩn 10 mmol/l 6,0 ml Hoàn thành đủ 100 ml

3.2.. Định lượng urê bằng phương pháp enzym động học.
3.2.1. Nguyên lý:
Urê được thuỷ phân tạo thành amoniac và CO2 nhờ urease xúc tác.
Amoniac tạo thành kết hợp với -cetoglutarat và NADH thành glutamat và
NAD+ nhờ glutamatdehydrogenase (GLDH) xúc tác. Đo sự giảm mật độ
quang của NADH ở bước sóng 340mm

Urê + H2O Urease 2NH4+ + CO32-

- Cetoglutarat + NH4+ GLDH L-glutamat + NAD+ + H2O

+NADH

3.2.2. Chất thử và thuốc thử.

+ Chất thử: huyết thanh, huyết tương chống đông bằng heparin, nước
tiểu pha loãng 1+ 100 với nước cất (kết quả nhân với 101).
+ Thuốc thử
- Thuốc thử 1 (R1) đã pha sẵn
90
 Đệm tris(pH=7,8): 120mmol/l
ADP : 750 mmol/l
Urease : > 40 KU
GLDH : > 0,4 KU
- Thuốc thử 2 (R2) đã pha sẵn
-Cetoglutarat : 25 mmol/l
NADH : 1,2 mmol/l
Khi làm trộn lẫn R1 và R2 theo tỷ lệ hướng dẫn ghi trên hộp.
- Dung dịch urê chuẩn: 13,3 mmol/l (80 mg/dl)
3.2.3.Tiến hành:
Cho vào các ống nghiệm nhỏ các theo thứ tự như sau:
Thuốc thử ống trắng ống chuẩn/thử
Dung dịch chuẩn/huyết thanh 10 l
Hỗn hợp thuốc thử 1000 l 1000 l
Trộn đều, đọc mật độ quang sau 30 giây (A1). Chính xác sau 60
giây đọc mật độ quang (A2)
Cách tính kết quả:
Achuẩn/thử = A2 - A1
C = Athử / Achuẩn . 13,3 (mmol/l)
Chú ý: Có thể tiến hành trên máy bán tự động Stat Fax đã cài đặt chương
trình như trên. Khi làm, đo mật độ quang của ống trắng trước. Sau đó đưa vào
ống chuẩn máy sẽ tự động đo và tính ra hệ số. Tiếp đó đưa theo thứ tự các ống
thử vào máy sẽ tự động đo và tính ra kết quả hiện trên máy hoặc in ra giấy.
4. Định lượng hemoglobin trong máu (phương pháp Crosby).
4.1. Nguyên lý:
Oxy hoá tất cả các hemoglobin và các dẫn xuất của hemoglobin thành
methemoglobin. Biến đổi methemoglobin thành cyanmethemoglobin có màu. Đo
màu và dựa vào biểu đồ mẫu để tính kết quả.
Kaliferricyanid
Hemoglobin (Fe2+) Methemoglobin (Fe3+)
Kalicyanid
Methemoglobin Cyanmethemoglobin

4.2. Chất thử và thuốc thử :

+ Máu tươi.
+ Thuốc thử Drabkin.
4.3. Tiến hành:
+ Cho vào một ống nghiệm nhỏ:

91
 Thuốc thử Drabkin: 5 ml.
Máu tươi: 20 l.
Lắc đều.
+ Đo mật độ quang học ở bước sóng 540 nm, đối chiếu với thuốc thử Drabkin,
được ET.
+ Tính kết quả theo biểu đồ mẫu.
4.4. Giá trị tham khảo:
Bình thường, nồng độ hemoglobin:
Nam: 126 – 150 g/l.
Nữ: 117 – 141 g/l.
4.5. Ý nghĩa:
Giảm trong giảm tổng hợp, thiếu máu cấp, mạn và mất máu.
4.6. Cách pha thuốc thử :
Thuốc thử Drabkin:
Natribicarbonat 1 g.
Kalicyanid 0,052 g.
Kaliferricyanid 0,198 g.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Đựng trong lọ màu, tránh ánh sáng.
5. Phát hiện hemoglobin trong nước tiểu.
5.1. Nguyên lý:
Dựa trên hoạt tính peroxydase của hemoglobin:
Hemoglobin
Benzidin + H2O2 Acid benzidinic + H2O
Oxy giải phóng sẽ oxy hoá benzidin thành acid bezidinic (có màu xanh).
5.2. Chất thử và thuốc thử:
+ Nước tiểu.
+ D.d. H2O2 3%.
+ D.d. Benzidin bão hoà.
5.3. Tiến hành:
Cho vào một ống nghiệm to:
Nước tiểu: 2 ml.
D.d.benzidin bão hoà: 3 ml.
Trộn đều. Cho thêm:
D.d. H2O2 3%: 1 ml.
Trộn đều.

92
 Phản ứng dương tính nếu có màu xanh.
5.5. Ý nghĩa:
Hemoglobin niệu (huyết sắc tố niệu) có thể gặp trong thiếu máu tan máu, sốt
đái huyết sắc tố, sốt rét, thương hàn, truyền máu khác nhóm, ngộ độc,…
5.6. Cách pha thuốc thử :
+ D.d. H2O2 3%: Pha loãng dung dịch D.d. H2O2 10% bằng nước cất. Giữ trong
tủ lạnh khi không dùng.
+ D.d. benzidin bão hoà, trong acid acetic băng:
Cho 4 g benzidin vào một chai màu nâu.
Cho thêm 50 ml acid acetic băng. Lắc kỹ để hoà tan. Dùng trong 1 tháng.
6. Định lượng acid uric trong máu và nước tiểu.
6.1. Nguyên lý:
Acid uric bị oxy hóa bởi uricase. H2O2 tạo thành, dưới sự xúc tác của
peroxidase, phản ứng với acid 3.5-dichloro-2-hydroxybenzensulfonic (DCHBS) và
4-aminophenazon (PAP) tạo thành quinonimin có màu đỏ tím.
Uricase
Uric + O2 + 2 H2O Allantoin + CO2 + H2O2

Peroxidase
H2O2 + DCHBS + PAP N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonat-p- benzoquinon
imin (quinonimin) + HCl + 4 H2O

6.2. Chất thử và thuốc thử :

+ Huyết thanh, huyết tương.
+ Nước tiểu pha loãng 10 lần (1+9) bằng nước cất.
+ Thuốc thử trắng.
+ D.d. acid uric chuẩn 476 mol/l (8 mg/dl).
6.3. Tiến hành:
6.3.1. Chuẩn bị:
Nhiệt độ: 20 - 25OC hoặc 37OC.
Kính lọc: 546.
Chương trình: C/ST.
Hệ số: 476.
6.3.2. Phản ứng:
Cho vào các ống:

93
 Thuốc thử Ống trắng (B) Ống chuẩn Ống thử (T)
(S)

Thuốc thử trắng 1 ml 1 ml 1 ml

D.d. chuẩn acid uric 476mol/l 20 l

Huyết thanh hoặc nước tiểu pha loãng 1/10. 20 l

Trộn đều, ủ 10 phút ở 20 - 250C hoặc 5 phút ở 370C

6.3.3. Đọc kết quả:

Trong vòng 15 phút.
Đổ ống trắng vào cóng. Nhấn nút ZERO. Chờ hiện 0000. Hút bỏ.
Đổ ống chuẩn vào cóng. Nhấn nút STANDARD. Hút bỏ.
Đổ ống thử vào cóng và nhấn nút RESULT. Ghi kết quả. Hút bỏ.
Đo tiếp các ống thử khác.
Khi nồng độ acid uric > 1190 mol/l (20 mg/l) thì phải pha loãng mẫu và làm
lại. Nhân kết quả với độ pha loãng.
Đối với nước tiểu phải nhân kết quả với 10.
6.4. Giá trị tham khảo:
+ Nam: 200 - 420 mol/l (3,4 - 7,0 mg/dl).
+ Nữ: 140 - 340 mol/l (2,4 - 5,7 mg/dl).
+ Nước tiểu: 1,5 - 4,5 mmol/l (250 - 750 mg/dl).
6.5. Ý nghĩa:
+ Acid uric được lọc và tái hấp thu gần như hoàn toàn, bài tiết rất ít.
+ Tăng acid uric máu chủ yếu gặp trong:
- Bệnh Gout.
- Suy thận mạn.
- Bệnh ống thận.
- Ngoài ra còn tăng do chế độ ăn.
6.6. Cách pha thuốc thử :
+ D.d. uric chuẩn: kit có sẵn để dùng.
+ Thuốc thử trắng (gồm đệm, uricase, peroxidase, DCHBS,
4-aminophenazon): kit có sẵn để dùng.

94