‫مثال من الهندسة الوراثية لألحياء الدقيقة‬

‫الجنس وانتقال الصفات الوراثية في البكتريا‬

‫• قبل عملية انقسام النهائي للخلية البكتيرية يتضاعف كروموسوم الخلية إلى نسختين‬
‫متماثلتين ويذهب كل كروموسوم الى خلية بنوية جديدة ويختلف حجم هذا الكروموسوم‬
‫حسب نوع الخلية البكتيرية حيث تمتلك بكتريا ‪ Escherichia coli‬كروموسوما له القدرة‬
‫على تخليق ‪ 4000‬مركب تقريبا إضافة الى الكر وموسوم فان بعض انواع البكتريا‬
‫تمتلك اجزاء حلقية منفصلة من الحامض النووي ‪ DNA‬تستطيع تكرار نفسها بصورة‬
‫منفصلة من الكر وموسوم وهي ليس لها اي دور في تضاعف وتكاثر البكتريا االانها‬
‫تكسب البكتريا صفات هامة كالمقاومة للمضادات الحيوية وإكساب البكتريا القدرة على‬
‫تكوين االسواط واألوبار ‪.‬‬
‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫مثال من الهندسة الوراثية لألحياء الدقيقة‬
‫انتقال المادة الوراثية من خلية بكتيرية الى خلية اخرى‬ ‫•‬
‫ظاهرة التحويل ‪ : transformation‬انتقال حامض نووي يمتلك صفات وراثية الى خلية‬ ‫•‬
‫اخرى محدثا تغيرات وراثية في الخلية الجديدة‪ .‬فينشأ عن ذلك تغيير الطراز الجيني للخلية‬
‫أو الكائن الحي بنقل حمض نووي غريب ‪.Foreign DNA‬‬
‫ظاهرة التوصيل ‪ : transduction‬تشبه سابقتها غير انها تحصل بواسطة عامل مساعد‬ ‫•‬
‫قد يكون فيروسا‬
‫ظاهرة االقتران ‪ :conjugation‬وفيها تلتصق خليتان بكتيريتان مع بعضهما وتنتقل‬ ‫•‬
‫المادة الوراثية وذلك بمساعدة بالزميدات خاصة‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫تجربة التحويل الوراثي‬
‫‪Transformation‬‬
‫‪ -1‬تجربة عزل البالزميد البكتيري‬
‫‪ -2‬تجربة تحضير الخاليا المستقبلة ‪ Competent Cells‬بطريقة كيميائية‬
‫‪ -3‬تجربة الكشف عن الخاليا التي تم فيها التحويل الوراثي‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪5‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫التحويل الوراثي‬
‫‪Transformation‬‬
‫• يتم عن طريق البالزميد وهو كروموسوم (حمض نووي ‪ )DNA‬خارجي يتواجد في معظم‬
‫الخاليا البكتيرية وبعض الخمائر‪.‬‬
‫• *معظم البالزميدات ‪ Plasmids‬حلقية الشكل ‪ circular‬وتختلف في الحجم والعدد داخل‬
‫الخلية الواحدة‪.‬‬
‫• يتم تطويعها ‪ modified‬الستخدمها كنواقل ‪ vectors‬للحمض النووي المعاد تكوينه‬
‫‪ )rDNA( recombinant DNA‬الهام في تطبيقات الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية‪.‬‬
‫• إن عملية تغيير الطراز الجيني ‪ genotype‬للخاليا أو الكائن الحي بنقل حمض نووي‬
‫غريب ‪ foreign DNA‬تسمى بالتحول الوراثي ‪.Transformation‬‬
‫• الحمض النووي المنقول قد يظل داخل الخلية كعنصر خارج الكروموسوم ‪extra-‬‬
‫‪ chromosomal elements‬أو يتداخل مع الجينوم الخلوي ‪. Integrated‬‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪6‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫تجربة عـــــزل البـــالزميــــــــــــد‬
‫‪Experiment: PLASMID ISOLATION‬‬
‫‪Extraction of Bacterial Plasmid DNA from Escherichia coli‬‬
‫الهدف‬
‫• عزل الحمض النووي منقوص األكسجين البالزميدي ‪ plasmid DNA‬من‬
‫خاليا بكتيريا القولون‪ .‬يحتوي هذا البالزميد على جين المقاومة للمضاد الحيوي‬
‫‪ Ampicillin‬مثل البالزميد ‪.pUC 18‬‬
‫• أمثلة على البالزميدات‪bacteriophage lambda, pBR322, and :‬‬
‫‪pUC19‬‬
‫• ‪plasmid DNA‬‬
‫• يحتوي البالزميد ‪ pUC18‬على تتابع لجين ‪ Lac Z‬الذي يشفر إنزيم‬
‫الجاالكتوسيداز ‪.b-galactosidase‬‬
‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪7‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫مبدأ العمل‬
‫‪:Principle‬‬
‫يتم فصل البالزميد ‪ pUC18‬من مزرعة نقية لخاليا بكتيريا القولون ‪ Escherichia coli‬بطريقة النحلل الخلوي‬ ‫•‬
‫بالمواد عالية القلوية ‪.Alkaline Lysis Method‬‬
‫تعتمد على تعريض معلق الخاليا البكتيرية إلى منظف عالي القطبية في وسط عالي القلوية مما يساعد على تحلل‬ ‫•‬
‫الجدار الخلوي وتشويه الحمض النووي الكرموسومي ‪ DNA‬والبروتينات المختلفة بينما ينطلق البالزميد سابحا ً في‬
‫الرائق ‪.supernatant‬‬
‫بالرغم من تعرض الحمض النووي الكروموسومي للتشوه ‪ denature‬نتيجة لوجود المحلول القلوي ال تتمكن‬ ‫•‬
‫البالزميدات الحلقية من االنفصال عن بعضها ألنها متداخلة ومتطابقة في الشكل‪.‬‬
‫خالل عملية التحلل‪ ،‬يبقى كل من الحمض النووي الكروموسومي المشوه والبروتينات البكتيرية وبقايا الجدار الخلوي‬ ‫•‬
‫مشتركة في معقدات كبيرة مغلفة داخل المادة المنظفة من ‪ .SDS‬يتم ترسيب هذه المركبات جيدا ً عند استبدال أيونات‬
‫البوتاسيوم بأيونات الصوديويم في محلول ترسيب البروتينات‪ .‬بعد التخلص من المواد المشوهة بالترسيب والطرد‬
‫المركزي يمكن ترسيب الحمض النووي البالزميدي ‪ plasmid DNA‬النقي من الرائق‪.‬‬
‫يمكن استخدام طريقة المحلول القلوي بكفاء عند فصل البالزميد منكل سالالت بكتيريا القولون او حجم من المزرعة‬ ‫•‬
‫يتراوح بين ‪ 1‬مل حتى ‪ 500‬مل‪ .‬حيث يكون البالزميد المفصول بهذه الطريقة خالي من الحمض النووي‬
‫الكروموسومي‪.‬‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪8‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫ثانيا‪ :‬تجربة تحضير الخاليا القابلة الستقبال البالزميد‬
‫‪Experiment: PREPARATION OF COMPETENT CELLS‬‬
‫الهدف‬
‫• تحضير الخاليا المستقبلة* ‪ TOP 10 Competent cells‬بطريقة كلوريد الكالسيوم‬
‫‪.Calcium chloride‬‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪9‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫المبدأ‬
‫• بالرغم من إمكانية حدوث التحول الوراثي طبيعيا ُ إال أن خاليا بكتيريا القولون يجب‬
‫معالجتها كيميائيا ً للتحول إلى خاليا قابلة الستقبال الحمض النووي الغريب‪.‬‬
‫• تعرف الخاليا المستقبلة ‪ Competent‬بقابلية الخلية الستقبال حمض نووي خارجي من‬
‫الوسط الذي تنمو فيه هذه الخلية‪ .‬يمكن حث هذه القابلية صناعيا ً بمعالجة الخاليا بمحلول من‬
‫كلوريد الكالسيوم قبل إضافة الحمض النووي ‪ DNA‬للوسط‪.‬‬
‫• يقلل الكالسيوم من ثبات الغشاء الخلوي ويلتصق بسطح الجدار الخلوي مما يكون ثقوب‬
‫تسمح بدخول الحمض النووي الغريب ‪.foreign DNA‬‬
‫• تتم بزرع خاليا في مرحلة الطور اللوغاريتمي وتعريضها لكلوريد الكالسيوم في الحمام‬
‫الثلجي‪.‬‬
‫• للبالزميد ‪( pUC18‬المفصول من التجربة السابقة)‪.‬‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪10‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫ثالثا‪ :‬تجربة الكشف عن الخاليا التي تم فيها التحويل الوراثي‬

‫الهدف‪:‬‬
‫• تحويل (تعديل او تغيير) المادة الوراثية في الخاليا المستقبلة ‪ Competent cell‬مثل‬
‫المحضرة مسبقا ً (او ‪ )TOP 10 cells‬مع البالزميد المفصول ‪ligated product of‬‬
‫‪.)pUC18-λDNA ligated product(extracted plasmid‬‬
‫•‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪11‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫ثالثا‪ :‬تجربة الكشف عن الخاليا التي تم فيها التحويل الوراثي‬

‫المبدأ‪:‬‬ ‫•‬
‫الحمض النووي ‪ DNA‬المنقول قد يظل منفصالً عن الحمض النووي ‪ DNA‬الكروموسوم ‪extra-‬‬ ‫•‬
‫‪chromosomal elements‬للبكتيريا المستقبلة ‪ competent cell‬أو يندمج ‪integrated‬‬
‫كجزء داخل الجينوم‪.‬‬
‫في هذه التجربة‪ ،‬سوف يتحول الطراز الجيني للبكتيريا الحساسة للمضاد الحيوي األمبسلين‬ ‫•‬
‫(‪ )E.coli strain TOP10‬إلى طراز جيني مقاوم لألمبسلين عن طريق نقل البالزميد الحامل لجين‬
‫صفة المقاومة للمضاد الحيوي األمبسلين (‪ .)pUC18 plasmid‬يتم انتخاب الخاليا البكتيرية التي‬
‫يجري عليها التحويل الوراثي بزرع الخاليا على بيئة انتقائية ‪ selective‬تحتوي على المضاد‬
‫الحيوي البنسلين‪.‬‬
‫النواقل من نوع البالزميد ‪ pUC18‬بها قطعة قصيرة من الحمض النووي ‪ DNA‬الخاص ببكتيريا‬ ‫•‬
‫القولون ‪ ، E. coli‬تحتوي على التتابع المشفر والمنظم لجين ‪ Lac Z‬الذي يشفر انزيم ‪b-‬‬
‫‪.galactosidase‬‬
‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪12‬‬
‫‪2013‬‬
 ‫ثالثا‪ :‬تجربة الكشف عن الخاليا التي تم فيها التحويل الوراثي‬

‫كما تُستخدم مادة )‪ Isopropyl thiogalactoside (IPTG‬كعامل محفز للتعبير الجيني لهذا الجين‪.‬‬ ‫•‬
‫يتفاعل إنزيم مع مادة التفاعل الصبغية )‪ 5-bromo-4-chloro- β-D-Galactoside (X-gal‬وتعطي‬ ‫•‬
‫منتج أزرق اللون‪.‬‬
‫يتشكل موقع للنسخ المتعدد ‪ )multiple cloning site( MCS‬داخل منطقة التشفير للجين ‪ .Lac Z‬تكون‬ ‫•‬
‫هذا الموقع ال يؤدي إلى تعطيل إطار قراءة التعبير الجيني ‪ reading frame‬وينتج عنه مجرد إدخال عدد‬
‫من األحماض األمينية اإلضافية في القطعة الطرفية لألحماض األمينية للإلنزيم ‪.b-galactosidase‬‬
‫وبالتالي‪ ،‬تظهر المستعمرات بلون أزرق في وجود مادة التفاعل الصبغية ‪ IPTG‬و ‪.X-gal‬‬ ‫•‬
‫عند إدخال جين جديد لمنطقة النسخ المتعدد ‪ MCS‬فيصبح إدخال ضار للخواص الوظيفية لإلنزيم ‪b-‬‬ ‫•‬
‫‪ galactosidase‬وال يمكنه التفاعل مع ‪ X-gal‬وهكذا تظهر المستعمرات باللون األبيض‪ .‬ويعد هذا التفاعل‬
‫اللوني البسيط يمكن استخدامه لمسح آالف المستعمرات لتعريف الخاليا التي انتقل اليها البالزميد أو‬
‫الحمض النووي الغريب فأصبح الحمض النووي بها معاد تركيبه ‪.Recombinant DNA‬‬

‫‪Amal Alghamdi‬‬
‫‪13‬‬
‫‪2013‬‬
Amal Alghamdi
14
2013
‫النتائج‬

Amal Alghamdi
15
2013