FREE T4 ELISA Kit

Вовед
Тироксин, хормон кој се синтетизира во тироидната жлезда што е најважната
компонента на ендокриниот систем. Повеќе од 99% од тироксин (Т4) кој циркулира во
крвта е поврзан со протеински носачи; врзувачки тироксин глобулин (TBG), албумин и
преалбумин. Сепак, само слободниот (неврзан) дел од Т4 е одговорен за биолошкото
дејство. Понатаму, концентрациите на протеинските носачи се менуваат во многу
клинички услови, како што е бременоста. При нормална функција на тироидната жлезда
како што се менуваат концентрациите на носачите вкупното ниво на Т4 се менува, додека
концентацијата на слободниот Т4 останува константна. Така, мерењата на слободна
концентрација на Т4 се поврзани со сигурност со клиничкиот статус од вкупното ниво на
Т4. Зголемувањето на вкупните нивоа на Т4 поврзано со бременоста, оралните
контрацептиви и естрогенската терапија резултира во повисоки нивоа на Т4 додека
концентрација на слободниот Т4 останува во основа непроменета.

Принцип
Принципот на тестот се заснова на конкурентна техника ЕЛИСА. Во оваа техника,
бунарите се премачкуваат со одредена количина на анти-Т4 моноклонално антитело
(Anti-T4 mAb). Измерена количина на серум на пациентот, стандарди и постојана
количина на коњугат T4-HRP се додаваат на микротитарското бунарче. За време на
инкубацијата, слободните Т4 и конјугираниот Т4 се натпреваруваат за ограничени места
за врзување на бунарите. Бунарите се целосно измиени за да се отстрани
неограничената слободниот Т4. Потоа се додава и се инкубира раствор на хромоген-
супстрат, што резултира во развој на сина боја. Развојот на бојата е запрен со додавање
на стоп-раствор, а апсорпцијата се мери спектрофотометриски на 450 nm. Интензитетот
на формираната боја е пропорционален со количината на присутен ензим и е обратно
поврзана со количината на неозначениот слободен Т4 во примерокот.
Материјал
1. Бунари обложени со антитела (1 чинија, 96 бунари): Бунари од микротрит
обложени со моноклонален анти тироксин
2. Ензимски конјугат (1 шишенце, 6 ml): Тироксин обележан со HRP во пуфер што
содржи протеин како стабилизатор и Thiomerosal како конзерванс, подготвен за
употреба.
3. Стандарден сет (0,5 ml / шишенце): Содржи 0,0 (1 ml), 0,2, 0,8, 2, 4 и 8 ng / dl на
слободен тироксин во пуфер кој содржи протеини како стабилизатор и тиомерозал
како конзерванс, подготвен за употреба.
4. Контролен серум (1 шишенце, 1 ml): Содржи одредена количина на слободен
тироксин во пуфер што содржи протеин како стабилизатор и тиомерозал како
конзерванс, подготвен за употреба.
5. Проба пуфер (1 ампула, 6ml): Содржи фосфатен пуферски раствор со протеин
како стабилизатор и Kathon CG како стабилизатор, подготвени за употреба.
6. Реагенс на хромоген супстрат (1 шишенце, 12 ml): Содржи тетра метил бензидин и
водород пероксид, подготвен за употреба.
7. Раствор за миење (1 шишенце, 50 ml концентриран 20x): Содржи фосфатен пуфер
раствор со 0.05% Tween 20
8. Стоп раствор (1 шишенце, 12 ml): Содржи хлороводородна киселина (1М).
9. Засилувач

Прибирање примероци и подготовка

Китот е за употреба со серум или плазма. Серумот или плазмата треба да бидат
подготвени од примерок од цела крв, добиен со одобрена асептичка техника. Ако
тестирањето не може да се направи во рок од еден час по собирањето на примерокот,
веднаш ладирајте го (максимум 48 часа) примерокот и оставете го да се врати на собна
температура пред тестирањето. Доколку е потребно продолжено чување, примероците
треба да се чуваат на -20ºC (максимум 30 дена). За време на складирањето избегнувајте
замрзнување на одмрзнување на примероците.
Раствор за миење работни места: разредете го концентриран раствор за миење 1:20 со
дестилирана вода пред употреба.

Проба постапка (Assay)

1. Прицврстете го посакуваниот број на обложени бунари во држачот и чувајте ги
преостанатите со средства за сушење во цврсто затворена затворена кеса.
2. Дистрибуирајте 25 µl од секој стандард, серумска контрола и примерок во
соодветни бунари.
3. Додадете 50 µl Assay пуферот во бунарите.
4. Add 50 µl of T4-HRP conjugate into the бунарчињата.
5. Протресете ги бунарите со микрофлати нежно 15 секунди за да измешате добро
содржина. Покријте ги микрофлетите на бунарите со заптивка од картон,
обезбеден со комплет и инкубирајте го 1 час на собна температура.
 6. Отстранете ја мешавината за инкубација со прскање на содржината на плочата во
контејнер за отпад.
7. Измијте ги микрофлатите бунари 5 пати (секој пат со 300 μl раствор за миење
работни места). Секој чекор за перење се состои од три фази на плакнење, нежно
тресење и истурете го растворот за миење во сад за отпадоци. Остро удирајте ги
бунарите на абсорбента хартија за да ги отстраните остатоците од капките за
миење.
8. Додадете 100 µl хромоген раствор на подлогата во бунарите
9. Инкубирајте ги бунарите 15 минути на собна температура и темно.
10. Додадете 100 µl стоп-раствор во бунарите за да престанете со реакција на
ензимот.
11. Read OD at 450 nm with ELISA reader within 30 minutes

Резултат
1. Измерете ја апсорпцијата на стандардите и примероците на 450 nm и пресметајте
ја средната вредност на примероци со дупликат
2. Конструирајте ја стандардната крива од точка до точка со зацртување на средната
апсорпција добиена за секој референтен стандард против неговата концентрација
во ng / dl на линеарна графичка хартија, со апсорпција на вертикалната (y) оска и
концентрација на хоризонталната оска.
3. Користејќи ја средната вредност на апсорпција за секој примерок, утврдете ја
соодветната концентрација на СЛОБОДНИОТ Т4 во ng / dl од стандардната крива.
Реф.вредност 0.7-1.8 ng / dl (FREE T4)