Структура на антителата

110-130
амино к-ни

• Протеини/гликопротеини
• Имуноглобулини бидејќи мигрираат во γ-глобулинската фракција
• Тежок синџир – 50-75 000; Лесен синџир – 23 000; (пр., ИгМ – 1 000 000
RMM)
Структура на антителата
Isotype Structure Placenta Activates Additional features
transfert complement

No Yes First Ab in development and response

IgM

No No B-cell receptor
IgD

Yes Yes Involved in opsonization and ADCC.

IgG Four subclasses; IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4

No No Involved in allergic responses

IgE

No No Two subclasses; IgA1, IgA2. Also found

IgA as dimer (sIgA) in secretions.
• Антитела
• Лизини
• Опсонини
• Аглутинини
• Преципитини
• Антиген-антитело интеракции
• Клуч (антиген) и брава (антитело) концепт
• Нековалентни врски
• Реверзибилност
• Антигенски детерминанти
• Епитоп – специфичен сегмент од антигенот
• Вообичаено околу 1 до 6 моносахариди или амино
киселини на површината од антигенот
• Имунореактивноста кон епитопите може да зависи од
примарната, секундарната и терциерната структура на
антигенот
• Антителата, сами по себе претставуваат и антигени
• Антиген-антитело интеракција
• Водородни врски
• Електростатско привлекување
• Van der Waals-ови сили
• Хидрофобни интеракции
• Голем број на слаби врски → стабилен комплекс
• Афинитет на врзување
• Сила на реакцијата помеѓу единечна антигенска
детерминанта и единечно врзувачко место на
антителото
• Сума на сите привлечни и одбивни сили помеѓу
антигенската детерминанта и врзното место на
антителото
• Вообичаено има висока вредност
• Авидитет на врзување
• Мерка за вкупната сила на врзување помеѓу антиген
кој поседува повеќе детерминанти и мултивалентни
антитела
• Зависи од валентноста и на антигенот и на
антителото
• Не е едноставна сума од индивидуалните
афинитети
• Специфичност на реакцијата
• Способност на дадено врзувачко место во рамките
на антителото да реагира само со одредена
детерминанта
• Способност на дадена популација на антитела да
реагираат само со еден антиген
• Вкрстена реактивност
• Способност на дадено врзувачко место во рамките
на антителото да реагира со повеќе од една
(различна) антигенска детерминанта
• Способност на дадена популација на антитела да
реагираат со повеќе од еден антиген
• Вкрстено-реагирачкиот антиген поседува заеднички
епитопи со имунизирачкиот антиген
• Вкрстено-реагирачкиот антиген поседува епитопи
кои се структурно слични со епитопи на
имунизирачкиот антиген (мултиспецифичност)
• Пример – вкрстена реактивност кај АBO
• Фактори кои влијаат врз интеракцијата антиген-
антитело и можноста за детекција на формираниот
комплекс
• Афинитет
• Авидитет
• Концентрациски сооднос антиген : антитело
• Физичка форма на антигенот (растворлив/
нерастворлив)
• Употреба на антителата во научни и клиничко-
дијагностички цели
• Одредување (во крв) на нивото на:
• Хормони
• Антитела
• Ензими
• Метаболити
• Антитела против непротеински антигени
• Специфични оштетувања на DNA
• Шеќери
• Липиди
• Витамини
• Јод
• Дијагностика
• Детекција на пептиди и други молекули при разни
заболувања
• Ендокрини: хиперинсулинемија,
хиперпаратироидизам
• Туморски антигени: p53 тумор супресор, α-
фетопротеин
• Антитела против вирусни протеини (HIV,
хепатитис)
• Терапевтски цели
• „Неутрализирачки антитела“
• Анти-ErbB2 за канцер на дојка и овариуми
• Анти-CD20 за B-клеточна лимфома
• Антисеруми и антитела (за вируси и отрови)
• Терапевтски цели
• Антисеруми и противотрови (за убоди од змии и
пајаци)
• Антитела поврзани со токсини, специфични за
туморски антигени
• Антитела против автоимуни антитела
• Вакцини
• Анти IgE и анти IgM за третман на алергии
• Биотероризам?
• ...

• Потенцијални проблеми при употребата на mAb

од глушец за терапевтски цели кај луѓе?
 FDA APPROVED MONOCLONAL ANTIBODIES
Date of FDA Antibody
Company Name Name of Product(1) Indications Approval Type (2)
Ortho Biotech Orthoclone-OKT® Organ Transplant Rejection 1986 M
J&J/Eli Lilly ReoPro® Acute Cardiac Conditions 1994 C
BiogenIdec/Genentech/Roche Rituxan® Non-Hodgkin’s Lymphoma 1997 C
BiogenIdec Zevalin™ Non-Hodgkin’s Lymphoma 2002 M
PDLI Zenapax® Acute Transplant Rejection 1997 H
MedImmune/Abbott Synagis® Viral Respiratory Disease 1998 H
Genentech/Roche Herceptin® Breast Cancer 1998 H
Avastin ® Colorectal Cancer 2004 H
J&J Remicade® Crohn’s, Rheumatoid Arthritis 1998 C
Novartis Simulect® Acute Transplant Rejection 1998 C
Wyeth Mylotarg™ Acute Myleoid Leukemia 2000 H

Schering /ILEX Oncology Campath® Chronic Lymphocytic Leukemia 2001 H

Abbott/CAT Humira™ Rheumatoid Arthritis 2002 PD
Novartis/Genentech/Tanox Xolair® Asthma 2003 H
Genentech/Xoma Raptiva™ Psoriasis 2003 H
Corixa/GlaxoSmithKline Bexxar® Non-Hodgkin’s Lymphoma 2003 M
BMS/ImClone Systems Erbitux ™ Colorectal Cancer 2004 C
 Market Analysis & Forecast
• Industry participants forecast of the market vary
widely, however, a consensus is emerging that
the market should reach US$26 billion by the end
of the decade. This is a conservative estimate
implying an average annual growth rate of 18%.

• By 2008, mAbs should account for 32 percent of

all revenue in the biotech market

• 100 mAb Expected By 2010

• mAb contributing to the in vitro diagnostics

market expected to be worth $34 Billion this year
 Why should we be interested ?
• mAbs drive the development of multibillion dollar
biotechnology industry.

• Many of the leading pharmaceutical companies

have entered the mAb sector, attracted by quicker
and less costly development, higher success rates,
premium pricing, and a potentially reduced threat
from generics

• The outlook for monoclonal antibody therapeutics

is healthy. The ongoing success of existing
products, combined with a bulging pipeline of new
products awaiting approval and limited generic
erosion, point towards robust growth in this
segment
• Поликлонални антитела
• Продуцирани по пат на имунизација на животно со
соодветен антиген
• Колекција на серум од животното и пречистување
на антителата
• Многу поефтини за продукција, во споредба со
моноклоналните антитела
• Корисни во намалување на
имуниот одговор кај
автоимуни заболувања
• Поликлонални антитела
• Продуцирани од страна на различни клонови на Б
клетки
• Смеса од имуноглобулински молекули, од кои секој
препознава ист антиген, но реагира со различна
антигенска детерминанта (епитоп) во рамките на
антигенот
• Проблеми поврзани со специфичноста
• Моноклонални антитела
• Сите препознаваат само еден епитоп
(моноспецифични антитела)
• Б лимфоцитите (клонови) кои ги продуцираат, водат
потекло од една единствена клетка-мајка
(лимфоцит)
• Најчесто се добиваат преку имунизација на глувци
(може да се користат и кокошки, зајаци, ајкули...)
• Моноклонални
антитела
• Општ
принцип на
продукција
• Моноклонални антитела
• Техниката на
продукција за прв пат е
опишана во 1975 год.
(Kohler и Milstein)
• Нобелова награда во
1984 год.
• Континуирано
усовршување на
техниката
• Phage Display
Production?
• The Plantibody
Approach?
• Chimeric Ab design?
• Моноклонални антитела
• Прв чекор во продукцијата е процесот на
имунизација
• Треба да се определи
• Хаптен?
• Начин на апликација на антигенот (супкутано,
интравенозно, интраперитонеално,
интрамускулно, орално)
• Временски период помеѓу поединечни
имунизации
• Животно (глушец, кокошка, зајак, овца...)
• Тип на антигенот (клетка, дел од клетка, смеса
од протеини, чист протеин...)
• Моноклонални антитела
• Имунизација
• Имуниот одговор треба да се насочува преку:
• Количината на аплициран антиген
• Временски период помеѓу поединечните
имунизации
• Неопходен број на повторувања на
имунизацијата
• На адекватни временски антервали, проверка на
имуниот одговор преку тестирање за
присуството на специфични антитела во
примероци земени од животното (крв, жолчка
од јајце...)
• Моноклонални антитела
• Пример – интраперитонеална имунизација на
глувци
• Старост: 7 – 8 недели
• Три пати повторување
• 1) 200 µl мешавина од антиген и комплетен
Freund-ов адјуванс
• 2) Три недели подоцна, 200 µl мешавина од
антиген и некомплетен Freund-ов адјуванс
• 3) Три недели подоцна, 50 µl антиген
• Моноклонални антитела
• Адјуванси – минерални масла со (комплетен) или
без (некомплетен) додаток на мртви микобактерии
• Улога на адјувансот
• Делува како депо на антигени од кое истите се
ослободуваат во рамномерни временски
интервали
• Спречува отстранување на антигенот
• Стимулира фагоцитоза
• Има митогено дејство врз лимфоцитите
• Freund-ов адјуванс
• Комплетен (минерално масло Bayole, емулзиско
средство, мртви микобактерии)
• Алуминиум фосфат/хидроксид
• Моноклонални антитела
• Пример – интраперитонеална имунизација на
глувци
• Проверка на имуниот одговор во примерок од
серум (DIBA, ELISA тестови)
• Позитивна и негативна контрола
• Моноклонални антитела
• Пример – интрамускулна имунизација на кокошки
(во случај кога имуниот одговор кај цицачи е слаб
или отсутен)
• Старост: непосредно пред полова зрелост
• Три пати повторување
• 1) 1 ml мешавина од антиген и комплетен
адјуванс
• 2) Седум дена подоцна, 1 ml мешавина од
антиген и некомплетен адјуванс
• 3) Седум дена подоцна, 60-80 µl антиген
• Моноклонални антитела
• Пример – интрамускулна имунизација на кокошки
• Погодности
• Кокошките се еволутивно многу оддалечени
од цицачите (можност за појава на силен
имун одговор кон антиген од цицач)
• IgG од кокошка имаат многу слаба вкрстена
реакција со IgG од цицач и не го активираат
комплементот
• IgG се акумулираат во жолчката од јајцето
(висок титар, пр. 9 mg/ml)
• Моноклонални антитела
• Втор чекор во продукцијата е процесот на
воспоставување на хранителски култури на клетки
• После фузија, клетките се осетливи и нестабилни
и бараат оптимални услови за раст и
размножување
• Во медиумот мора да бидат додадени цитокини
или истите да бидат излачувани од
хранителските култури (најпогодни за работа се
културите од макрофаги)
• Макрофагите излачуваат цитокини и вршат
фагоцитоза, со што ја чистат подлогата
• Моноклонални антитела
• Воспоставување на хранителски култури на клетки
• Изолација на макрофаги (3 до 4 дена пред
фузијата и клонирањето)
• Вбризгување на медиум во перитонеалната
празнина → масажа на абдоменот → жртвување
на животното → собирање на вбризганиот
медиум и трансфер во стерилна епрувета →
центрифугирање → ресуспендирање во ладен
медиум → подесување на концентрацијата на
клетки и посадување во бунарчиња на
микротитар плоча (по 200 µl во бунарче од
медиум кој содржи 5000 клетки/ml)
• Моноклонални антитела
• Трет чекор во продукцијата е процесот на изолација
на лимфоцити од имунизираното животно
• Избор на животни со најдобар имун одговор
• Три дена пред изолацијата се врши последна
имунизација
• Се изолира слезенката на животното →
мацерација → изолација на суспензија на
лимфоцити и броење на клетките
• Миелома клетките треба да бидат подготвени за
фузија (експоненцијална фаза на раст)
• Моноклонални антитела
• Четврт чекор во продукцијата е воспоставувањето
на култура од миелома клетки
• Водат потекло од клетки од тумор на коскена
срцевина
• Поседуваат способност за неограничено
размножување („бесмртност“)
• Моноклонални антитела
• Петти чекор во продукцијата е
процесот на фузија и селекција
• Фузија – здружување на две
клетки во една хибридна
клетка (хибридома)
• Посакувана комбинација:
миелома клетка и клетка
која ги продуцира
антителата од интерес
• Селекција – избор на
хибридоми кои се способни
да излачуваат антитела
• Моноклонални антитела
• Фузија и селекција
• Фузија на миелома клетки и клетки изолирани
од слезенката на животното може да се постигне
на повеќе начини
• Во присуство на Sendai вирусот кој доведува
до слевање на две мембрани
• Слично својство има полиетилен гликолот
• Со употреба на електропоратор
(електрофузија)
• Моноклонални антитела
• Фузија и селекција
• Фузијата е случаен процес
• Може да се спојат било која од клетките во
слезенката и миелома клетка
• Голем број на комбинации
• Моноклонални антитела
• Фузија и селекција
• За процесот на селекција се искoристуваат
следните својства на клетките:
• Миелома клетките имаат способност за
непречен раст во in vitro култура и не го
поседуваат ензимот хипоксантин
фосфорибозил трансфераза (HPRT)
• Б лимфоцитите од слезенката немаат
можност за неограничен раст, но го
поседуваат ензимот HPRT
• HPRT, во присуство на хипоксантин и
тимидин овозможува алтернативен пат на
синтеза на DNA (основниот пат е блокиран со
Aminopterin)
Two different pathways to synthesis nucleotide in mammalian cells

(Folic acid analog)

Myeloma cells used in
hybridoma technology are
double mutants, they lack the
HGPRTase and lose the ability
to produce Ig
• Моноклонални антитела
• Фузија и селекција
• Моноклонални антитела
• Фузија и селекција
• Во текот на процесот на селекција, клетките
растат во медиум кој содржи хипоксантин,
тимидин и аминоптерин (HAT medium)
• Процесот трае околу 10 дена
• Мора да се утврди во кои бунарчиња се наоѓаат
клонови од интерес (клетки кои го излачуваат
посакуваното антитело)
• Моноклонални антитела
• Шести чекор во продукцијата е процесот на
клонирање
• Клоновите од интерес се издвојуваат од
останатите хибридоми на повеќе начини
• Клонирање на агарна подлога
• „Limiting dillution“ клонирање
• „Single cell“ микроманипулација
• Моноклонални антитела
• Клонирање
• „Limiting dillution“ клонирање
• На принцип на разредување на суспензијата
од клетки, до теоретски број од 1 клетка по
бунарче
• Се одредува бројот и вијабилноста на
хибридомите и се посадуваат во бунарчиња
кои содржат хранителни култури
• Со помош на DIBA или слична техника, се
детектира во кои бунарчиња е присутно
антителото од интерес
• Хибридомите (клетки - „фабрики“) од тие
бунарчиња се одгледуваат во in vitro култури
или како тумори во животни
 (Most common screening
techniques are ELISA and RIA)

Low concentration High concentration

(1-20 ug/ml) (1-10 mg/ml)
• Моноклонални антитела
• Пред финална комерцијализација, антителата мора
да се изолираат и пречистат од медиумот во кој се
излачени (да бидат отстранети клетките, факторите
за раст, цитокините...)
• Филтрација на медиумот во кој растат
хибридомите (отстранување на клетки, липиди и
други покрупни компоненти)
• Пречистување на антителата со помош на
имуноафинитетна хроматографија,
јоноизменувачка хроматографија,
имунопреципитација...
• Ви благодарам за вниманието!