Вовед во хроматографија

Хроматографијата најчесто се користи во биотехнологијата за прочистување на

биолошките молекули, како протеините, во медицина или други намени.
Хроматографијата овозможува одвојување на одделни компоненти од комплексни
мешавини. Хроматографијата се состои од мобилна фаза (растворувач и молекулите што
треба да се одвојат) и стационарна фаза или хартија (во хартиена хроматографија), или
стаклени мониста, наречена смола (во колона хроматографија), низ која минува
мобилната фаза. Молекулите патуваат низ стационарната фаза со различни стапки
заради нивната хемија.
Видови на хроматографија
Во гел-филтрационата хроматографија, вообичаено, наречена хроматографија
за исклучување на големината (SEC), микроскопските честички што содржат ситни дупки
се спакувани во колона. Кога мешавина од молекули се раствора во течност, а потоа се
нанесува на колона со хроматографија која содржи порозни мониста, големи молекули
брзо минуваат околу монистра, додека помалите молекули влегуваат во ситните дупки во
мониста и побавно минуваат низ колоната. Во зависност од молекулите, протеините
можат да се одвојат, врз основа на нивната големина, и може да се соберат фракции што
содржат изолирани протеини.
Во афинитетна хроматографија, биомолекулата (често антитело) која ќе се
врзува за протеинот што треба да се прочисти е прикачена на монистра. Во колоната се
додава мешавина од протеини и сè поминува, освен протеинот од интерес, кој се врзува
за антителото и се задржува на цврстата поддршка. За да се добие протеинот кој ќе се
елуира од колоната, се користи друг пуфер за да се наруши врската помеѓу протеинот од
интерес и антителото. Честопати, овој пуфер за елуирање содржи високи концентрации
на сол или киселина.
Во хроматографијата за размена на јони, стаклените мониста на колоната имаат
полнеж врз нив (или + или -). Во колоната се додава мешавина од протеини и сè
поминува, освен протеинот од интерес. Ова е затоа што монистрата која се избира треба
да има спротивен полнеж од протеинот од интерес. Ако полнењежот на монистрата е
позитивен, тоа ќе врзува молекули со негативен полнеж. Оваа техника се нарекува
анјонска размена. Ако монистрата е негативно наполнета, тие врзуваат молекули со
позитивно наполнетост (размена на катјони). Така, научникот избира смола што треба да
се користи врз основа на својствата на протеинот од интерес. За време на
хроматографијата, протеинот се врзува за спротивно наполнетите мониста. Кога
загадувачот е одвоен од протеинот на интерес, се користи пуфер со висока с=сол за да се
добие саканиот протеин за да се елуира од колоната.
Принципи на хроматографија за исклучување на големината (SEC)
Хроматографијата за исклучување на големината е многу моќна техника за
физичко раздвојување на молекулите врз основа на големината. Во оваа постапка,
мешавина на молекули растворени во течност (мобилна фаза) се нанесува на колоната
за хроматографија која содржи цврста подлога во форма на микроскопски порозни сфери
или „мониста“ (стационарна фаза). Монистата делува како „стапици“ иимаат функција да
филтрираат мали молекули кои остануваат привремено заглавени во порите. Поголеми
молекули минуваат наоколу или се „исклучени“ од монистра. Овој комплет содржи осум
колони кои се преполни со монистра кои ефикасно ги одделуваат или „фракционираат“
молекулите кои се под 60,000 далтони. Како што течноста тече низ колоната, молекулите
под 60,000 далтони влегуваат во монистра и побавно минуваат низ колоната. Колку е
помал молекулот, толку побавно се движат низ колоната. Молекули поголеми од 60,000
минуваат околу монистра и се исклучени од колоната - исто така се нарекува граница за
исклучување на колона.
Течноста што се користи за растворање на биомолекулите за да се направи
мобилната фаза се нарекува пуфер. Смесата на биомолекули растворени во пуферот се
нарекува примерок. Примерокот е поставен на лежиштето во колоната и биомолекулите
во рамките на пуферот влегуваат во горниот дел од лежиштето на колоната, се
филтрираат низ и околу порозните мониста и на крајот поминуваат низ мал отвор на
дното на колоната. За да се заврши овој процес, дополнителен пуфер се става во
колоната, откако примерокот влезе во лежиштето. Мобилната фаза (течност) се собира
како капки во серија цевки за собирање. Поставен број капки се собира во секоја цевка.
Поголемите молекули што брзо поминуваат низ колоната ќе завршат во раните цевки или
„фракции“. Помалите молекули кои продираат во порите на стационарната фаза
завршуваат во подоцнежните фракции.
Хемоглобинот и витамин Б12 се двете биомолекули во вашиот примерок.
Хемоглобинот, кој е кафеав, има молекуларна тежина од 65,000 далтони. Витаминот Б12
е розов и има молекуларна тежина од 1.350 далтони. Шематскиот подолу ја илустрира
диференцијалната фракција на големи и мали молекули на колоната за исклучување на
големината.
СЛИКА
Лекција 1Б Примерокот
Хемоглобин
Хемоглобинот, протеин што се наоѓа во црвените крвни клетки, функционира за да
го транспортира кислородот до ткивата на телото. Хемоглобинот користен во овој
експеримент е хемоглобин на говеда. Употребата на хемоглобин на говедата (наместо
човечкиот колега) ја избегнува потенцијалната опасност по здравјето претставена при
употреба на производи за крв во крв. Хемоглобинот е составен од четири полипептиди
(мали протеини) кои се здружуваат за да формираат голем, глобуларен протеин.
Хемоглобинот го добива своето име од групата хеме, железо-содржината на
хемоглобинот што физички го врзува кислородот. Хемената група што содржи железо е
одговорна за црвено-кафеавата боја на хемоглобинот. Тесно поврзаниот протеин,
миоглобинот, се наоѓа во мускулите и е одговорен за доставување кислород до
мускулното ткиво. Мускулите кои се многу активни и бараат многу кислород се темни во
боја поради висока содржина на миоглобин. Пример би бил црвено-кафеавата боја на
темното месо од пилешко.
Хемоглобинот е главната компонента на црвените крвни клетки (РБЦ), клетките
што носат кислород на организмот. Повторно, тоа е хеме групата на хемоглобин која им
дава на РБЦ нивната карактеристична црвена боја. Различни форми на хемоглобин се
произведуваат во различни фази на развој. Фетусите произведуваат форма на
хемоглобин кој има поголем афинитет (построго врзуване) за кислород отколку во
возрасниот хемоглобин. Бидејќи фетусите зависат од нивните мајки заради снабдувањето
со кислород, важно е мајчиниот хемоглобин лесно да се откаже од својот кислород на
фетусот хемоглобин. Поради оваа причина, акушерите ги советуваат своите пациенти да
избегнуваат енергично вежбање за време на бременоста. Енергично вежбање ги
осиромашува ткивата на кислородот, што поставува конкуренција помеѓу трансферот на
кислородот кај мајките ткива или на феталниот хемоглобин.
Покрај кислородот, хемоглобинот може да врзува и јаглерод моноксид.
Хемоглобинот всушност има повисок афинитет кон јаглерод моноксид отколку за
кислород. Суфокацијата од јаглерод моноксид се јавува кога кислородот врзан за
хемоглобинот се преместува со јаглерод моноксид, што пак ги лишува телесните ткива од
кислород.
Телото може да се прилагоди на промените во животната средина кои бараат
зголемено количество испорака на кислород до ткивата. На големи височини, каде што се
намалува количината на кислород во воздухот, телото реагира со зголемување на бројот
на произведени црвени крвни зрнца. Ова ефикасно го зголемува бројот на молекули на
хемоглобин во снабдувањето со крв, што има ефект на зголемување на снабдувањето со
кислород во ткивата. Поради оваа причина, спортистите треба да тренираат на голема
височина за да го зголемат количеството на РБЦ, а со тоа да го зголемат и нивниот
кислород, што е потребно за ригорозно вежбање.
Анемија на синдром на клетки е молекуларна болест на хемоглобинот. Единечна
промена или мутација на генот што кодира хемоглобин резултира во мутација во
секвенцата на аминокиселини. Оваа мутација ја менува тридимензионалната структура
на полипептидите на хемоглобинот, поради што тие се „лепат“ заедно како структури
слични на прачка. Абнормалните молекули на хемоглобин, како прачка, ја нарушуваат
структурата на црвените крвни зрнца, предизвикувајќи им форма на срп (Српеста
анемија). За разлика од нивните кружни форми, српестиот облик на РБЦ не може
слободно да поминува низ капиларите, а со тоа тие стануваат блокирани. Блокираните
капилари на органи и ткива ја отежнуваат испораката на кислород, што резултира во
екстремен умор, па дури и смрт. Бидејќи српестата анемија е генетско нарушување кое е
резултат на мутирана генетска секвенца, во овој момент нема лек. Сепак, несаканите
ефекти на анемија на српеста клетка може да се ублажат со чести трансфузии на крв од
луѓе кои имаат нормален хемоглобин и црвени крвни клетки. Анемија на синдром на
клетки е генетска болест во која индивидуата наследила неисправен мутантен геном на
хемоглобин од двајцата родители. Поединци со својства на српеста клетка (еден
нормален еден дефектен) добиле абнормален ген само од еден родител, а единечниот
дефект всушност му дава еволутивна предност. Во Африка, изразот на генот на српести
клетки позитивно корелира со инфекции на маларија. Маларијата е смртоносна болест
предизвикана од паразит што го носи комарецот. Паразитот инфицира и на крајот убива
РБЦ. Паразитот може да инфицира нормални РБЦ, но не може да зарази српести РБЦ.
Така, карактеристиките на српестите клетки помагаат да се даде отпорност на маларија и
резултира во позитивна еволутивна адаптација. За жал, изразувањето на две копии на
генот е штетно.
Витамин Б12
Витаминот Б12 е витамин кој е од суштинско значење за луѓето и другите
'рбетници. Витаминот Б12 е основен кофактор на неколку биохемиски реакции што се
случуваат во човечкото тело. Една функција на витамин Б12 е распаѓање на мастите.
Извори богати со витамин Б12 вклучуваат јајца, млечни производи и месо. Витаминот Б12
не се наоѓа во растенијата и растителната храна. Така, луѓето кои имаат строга
вегетаријанска диета, честопати се недостаток на витамин Б12, освен ако не земаат
некои дополнителни витамини.
Чистите молекули на витамин Б12 не можат да се апсорбираат од цревата.
Витаминот Б12 мора да се врзува за протеински носач на цревниот тракт. Кога витамин
Б12 се врзува за овој протеински носач, комплексот е во состојба да помине низ цревата
и во крвотокот, каде на крајот го зафаќа црниот дроб.
Бидејќи витаминот Б12 е потребен само во минутни количини (луѓето бараат
require 3 µg / ден), недостатоците на витамин Б12 се исклучително ретки. Сепак, некои
поединци имаат генетско нарушување во кое е мутиран генот што кодира за протеинскиот
носач. Поединци со оваа мутација не го синтетизираат протеинскиот носач неопходен за
апсорпција во крвотокот. Така, и покрај тоа што овие луѓе имаат соодветно внесување
витамин Б12, тие сепак покажуваат знаци на недостаток затоа што им недостасува
потребниот протеински носач.
ПРАЖАЊА