Методи за докажување на протеини во урина

За докажување на протеините постојат повеќе методи. Протеините се доста

лабилни соединенија кои лесно се таложат. Според тоа сите реакции се
темелат на својството на протеините да се таложат. Таложењето може да
биде под дејство на температура (висока температура до вриење или собна
температура) или со к-ни при што се формира заматување или талог.
Според промените кои настануваат во молекулот на протеинот таложните
реакции можат да бидат: реверзибилни и иреверзибилни.
Кај реверзибилните реакции не доаѓа до подлабоки (структурни) промени во
молекулот на протеинот и добиените талози обично се раствараат во
првобитниот растворувач најчесто водата. Притоа протеините ги задржуваат
своите почетни природни особини и не се денатурираат.
Реверзибилните реакции на таложење може да се предизвикаат под дејство
на соли на лесни метали (NaCl; (NH4)2SO4 и др.).
За ваквиот тип на таложење се користи терминот исолување.
Дејството на овие соли се базира на нивната способност да ја намалат
растворливоста на протеините. Тие ја одземаат хидратационата обвивка
околу молекулите на протеините при што доаѓа до истовремено сузбивање
на електричниот полнеж, слепување на честичките и нивно таложење.
Различни протеини се таложат со различна концентрација на сол. Така
серумските глобулини полесно се таложат од албумините. Постои зависност и од
природата на употребената сол. NaCl има послаб ефект на исолување од
(NH4)2SO4 што се должи на послабата дехидратациона способност на NaCl. Во
реакциите на исолување одредено влијание има и pH на растворот.
Протеините реверзибилно се таложат и под дејство на алкохол. Етанолот има
голем афинитет кон водата, со неа се меша во сите односи. На протеините
делува слично како солите на лесните метали односно ги таложи протеините со
тоа што ја одзема хидратационата обвивка околу нивните молекули. Меѓутоа
таложењето со етанол може да биде и иреверзибилно доколку првобитниот
растворувач (водата) не се додаде на исталожените протеини првите 10 минути
од таложењето.Реверзибилните реакции на таложење имаат големо значење
во изучувањето на протеините бидејќи овозможуваат одделување на
различни протеински фракции без да се нарушат нивните природни
(биолошки и физичко-хемиски) особини.
Кај иреверзибилните реакции настануваат подлабоки промени во
структурата на протеините при што тие ги губат своите природни особини
(биолошки и физичко-хемиски), а добиените талози не можат повторно да се
растворат.
Иреверзибилните реакции на таложење можат да се предизвикаат под
дејство на различни физички и хемиски средства како што се загревање,
концентрација, минерални (неоргански) к-ни, карбоксилни (органски к-ни),
соли на тешки метали и др.
Загревањето на протеините  во растворот доведува до губење на нивната
хидратациона обвивка со што настанува слепување (окрупнување на
честичките), но тие го задржуваат електричниот полнеж, не се таложат на
дното и го прават растворот опалесцентен (заматен). За да дојде до полесно
исталожување на протеините при загревање потребно е pH на растворот да
се доведе до нивната изоелектрична точка која за поголем број протеини е
слабо кисела средина. Во таква средина го губат и електричниот полнеж и се
таложат на дното.
Концентрирани минерали к-ни HCl, H2SO4, HNO3 и други ги таложат протеините во
вид на нерастворливи комплексни соединенија.
Под дејство на органски к-ни како сулфосалицилна, пикринска, трихлороцетна и
други протеините се таложат во вид на бели талози. Во оваа реакции протеините
во вид на катјони реагираат со анјоните на органските к-ни при што се добиваат
нерастворливи соли.
Солите на тешките метали како CuSO4, HgCl2, FeCl3, (CH3СОО)2Pb ги таложат
протеините во вид на нерастворливи метал протеинати. Во оваа реакција
протеините се однесуваат како слаби к-ни и со катјоните на тешките метали
градат соли нерастворливи во вода.
Мерењето на протеинуријата игра есенцијална улога во евалуацијата на
реналната функција. Присуството на протеинурија е клучен наод во многу
ренални заболувања.

Хемиски методи за одредување протеини во урина

Испитувањето на општите особини на протеините главно се базира на 2

групи реакции:
1. Реакции на таложење на протеините кои се врзани со физичко-
хемиските особини (растворливост во вода и раствори на неоргански соли,
електричен полнеж, големина на молекулот).
 2. Обоени реакции поврзани со нивната хемиска природа која се
карактеризира со релативно голема реактивност (присуство на голем број
активни групи од кои голем дел се слободни и овозможуваат протеините да
реагираат со разнородни соединенија).
Со хемиска анализа на патолошка урина се докажуваат супстанци кои
нормално се присутни во неа и се бараат отстапувања од нормалните
вредности. Главно овие методи се квалитативни но може да се користат и
квантитативни.
Квалитативни методи за докажување на протеини се:
1. Метода со варење
Принцип - загревањето на протеините во раствор доведува до губење на нивната
хидратациона обвивка и коагулирање на протеините што резултира со
заматување.
2. Метода со сулфосалицилна к-на
Принцип - сулфосалицилната к-на се врзува со +наелектризираните протеински
групи и предизвикува структурна промена на протеинот што доведува до нивно
таложење.
3. Метода со концентрирана HNO3-Хелерова метода
Принцип - протеините под дејство на HNO3 преминуваат во металпротеинати кои
создаваат талог и се нерастворливи во концентрирани минерални к-ни.

4. Тест ленти
Тест лентите се најчесто користени во последните 10 години. Со една тест лента
се одредуваат 8-10 важни уринарни параметри во тек на 1-2 минути. Тест лентата
е пластична лента со димензии од 0,5 и 12cm. На едната страна се наредени 8-
10 квадратни зони од целулозни перничиња со димензии 0,5 и 0,5cm на
оддалеченост од 0,2cm. Секое хартиено перниче е импегрирано до различни
хемиски супстанци и служи за докажување на одредени уринарни параметри.
Тест лентите го користат принципот на технологијата позната како ,,сува хемија"
која претставува аналитичка постапка на претходно подготвени реагенси на суви
носачи. На тој начин се елиминира потребата од подготовка на реагенси пред
самата постапка.
Под изразот ,,сува хемија" едноставно се подразбира дека сите реагенси и
помошни материи потребни за реакцијата се сместени на хартиени или пластични
носачи во сува состојба. Но за да започне реакцијата овие постапки бара
растворувач, а во овој случај тоа е водата од примерокот урина која ги растворува
реагенсите врзани за носачот во сува агрегатна состојба. Со тоа ги активира
реагенсите и започнува хемиската реакција.
Со нив ориентационо се одредува количеството на протеини во урината. Во
денешно време во клиничките лаборатории за прецизно одредување на
концентрацијата на протеини се користи електрофорезата и фотометриските
методи.
Реакцијата за докажување на протеини се темели на реакција помеѓу индикаторот
и амино групата на протеините. При оваа реакција индикаторот ја менува бојата
од жолта во зелена.
Определување на албумини во урина со тест-ленти
Определувањето на албумини во урина со тест-ленти се базира на принципот на
протеинска грешка на индикаторот. Имено, при константна вредност на рН,
променат на бојата на индикаторот е резултат на неговата реакција со
албумините што се присутни во примерокот за анализа.
Како индикатор обично се користи тетрабромфенол сино. Бојата на полето се
менува од жолта во зелена до зеленосина, а интензитетот на обојување е
правопропорционален со концентрацијата на албумини во примерокот.
Тестот главно ги детектира албумините.
Методата е семиквантитативна.
За анализа се користи свежа, нецентрифугирана, добро промешана урина.
Албумините формираат обојување со индикаторот реагирајќи пропорционално за
разлика од глобулините и парапротеините, кои покажуваат помала застапеност од
реалната.

-Присуството се означува семиквантитативно со (+), (++), (+++), додека отсуството

со (-).
-Најниската концентрација на албумини што може да се измери со оваа метода
варира кај тест-лентите од различни производители, но обично изнесува околу
100-150mg/L.
Доколку урината во која се определуваат албумини со оваа метода е алкална
(рН>9), тогаш се добива лажно позитивен резултат. Контаминацијата на
примерокот со остатоци од детергенти и дезинфициенси може исто така да даде
лажно позитивен резултат.
5. Сепарација на уринарни протеини со градиентна SDS-PAGE (4-22%).
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis)
Градиентниот гел на почетниот дел кој е предвиден за апликација на примерокот
има концентрација на полиакриламид од 4%, а потоа линеарно се зголемува до
22%. На тој начин се формира мрежеста структура со особини на молекуларно
сито, односно во почетокот гелот има најголеми пори кои линеарно се намалуваат
кон спротивниот крај. Протеините патувајќи низ него се сепарираат според
молекуларната големина така што најбавно патуваат протеините со најголем
молекул, останатите патуваат подалеку соодветно на намалувањето на нивната
релативна молекуларна маса за најдалеку да отпатува протеинот со најмал
молекул. Всушност, протеините продирајќи низ гелот се сепарираат и набивајќи се
се фокусираат во тенки фракции. Ова фокусирање овозможува визуелизирање
дури и кога се наоѓаат во минимални фракции. Целата постапка трае 48h.
Резултатите се запишуваат на SDS-PAGEелферограм. Нејзината сепарација и
прецизна идентификација на присуството на секој поединечен протеин е од
голема важност во идентификување и дијагностицирање на различни видови
протеинурија. Интересен е фактот дека оваа метода од целиот Балкан се користи
единствено кај нас, поточно во “Институтот за експериментална и медицинска
биохемија”.

Квантитативни методи за одредување на протеини во урината се:

 Езбахова метода
 Роберт-Сталникова метода
 Полариметриско одредување - кај оваа метода се користи својството на
протеините да ја вртат рамнината на планарно поларизираната светлина за
определен агол на лево.