Универзитет “Св.

Кирил и Методиј”
Природно-математички факултет
Институт за биологија

Предмет: Микробна биотехнологија

Тема: Микробен раст и исхрана

Ментор: Изработил:
Проф. д-р Наталија Атанасова-Панчевска Габриела Атанасовска 16502
Скопје, Мај, 2019 година

2
 МИКРОБЕН РАСТ И ИСХРАНА

Микробна исхрана
Биосинтезата на клеточните компоненти кои се неопходни за раст, репродукција и
одржување бара извор на енергија и снабдување со основните хранливи материи.
Нутритивната класификација се воспоставена врз основа на специфични извори на
енергија, електрони/водород и јаглерод што се користат во организмот. Табела 2.1
Микроорганизмите развиле широк спектар на механизми за да се здобијат со енергија, но
во суштина се поделени во две категории. Хемотрофите добиваат енергија со оксидација
на органски или неоргански соединенија, додека фототрофите користат енергија
добиена од светлина. И двата имаат два можни извори на водородни атоми или
електрони. Органотрофовите оксидираат претходно формирани органски молекули, како
што се шеќерите, за да добијат електрони или водород, додека литотрофите се
здобиваат со електрони од редуцирани неоргански молекули, вклучувајќи ги водород
сулфидот и амонијакот. Јаглеродната исхрана е поделена на две класи. Автотрофите го
користат CO2 како свој единствен или примарен извор на јаглерод, додека разните
хетеротрофите користат широк спектар на редуцирани органски молекули, вклучувајќи
јаглеводороди, липиди, органски киселини, едноставни шеќери и полисахариди.

Микробните клетки мора да добијат широк спектар на хемиски елементи за да ги

исполнат нивните нутритивни барања. Четири од овие, макронутриентите, јаглерод,
водород, кислород и азот, мора да бидат достапни во грам количини по литар на медиум
за раст. Овие елементи, заедно со фосфорот и сулфурот, се главни компоненти на
главните клеточни полимери: липиди, нуклеински киселини, полисахариди и протеини
(Табела 2.2). Други мали елементи, вклучувајќи калциум, железо, калиум и магнезиум, се
потребни на ниво од неколку милиграми на литар; елементите во трагови, првенствено
кобалт, бакар, манган, молибден, никел, селен и цинк, се потребни само во микрограми.

Табела 2.1 Хранливи категории на микроорганизмите

Физиолошки тип Енергија Електрони Јаглерод

Хемотрофи Хемиска

Фототрофи Светлина

Органотрофи Органски
соединенија

Литотрофи Неоргански
молекули

Автотрофи CO2

Хетеротрофи Органски
соединенија

3
Хемооргано (хетеро) троф Органски Органски Органски
(животни, габи, протозои, многу соединенија соединенија соединенија
бактерии)

Хемолито (авто) троф Неоргански Неоргански CO2

(некои бактерии) молекули молекули

Фотолито (авто) троф Светлина Неоргански CO2

(растенија, алги, некои бактерии) молекули

Фотооргано (хетеро) троф Светлина Органски Органски

(алги, некои бактерии) соединенија соединенија

Табела 2.2. Состав на типичен микроорганизам

Вода 70-80%

Протеини 15-18%

Полисахариди 1-3%

Липиди 1-2%

Нуклеински киселини 3-7%

Неоргански соли 1-2%

Главен елементски клеточен состав = C4H7O2N

Макронутриенти

Автотрофните ферментации кои користат CO2 се ретко користени на индустриско

ниво: речиси сите вклучуваат хетеротрофски раст. Во хетеротрофните ферментации,
изворот на јаглерод е потребно во релативно високи медиумски концентрации (околу 10-
20 g/L или повеќе), бидејќи тие обезбедуваат јаглеродни "скелети" за биосинтеза, а исто
така повеќето служат како извор на енергија. Генерално, шеќерите се добри јаглеродни и
енергетски извори, особено глукозата, претпочитаниот супстрат на повеќето
микроорганизми.

Водород и кислород може да се добијат од водата и органски соединенија. Сепак,

многу организми исто така зависат од молекуларниот кислород како терминален акцептор
во аеробното дишење и за синтеза на специфични соединенија, како што се незаситените
стероли.

Микроорганизмите може да содржат повеќе од 15% азот, главно содржан во

структурните и функционални протеини, како и во нуклеинските киселини. За да се
задоволат овие барања, вообичаено се доставува извор на азот во медиумот за раст во
4
концентрација од 1-2g/L. Амониумовите соли често се претпочитаат како изворот на азот,
но понекогаш се користат и нитрати, амино киселини или соединенија богати со азот, како
што е уреата. Покрај тоа, некои специјализирани азотофиксирачки бактерии, особено
Azotobacter и Rhizobium, можат да користат молекуларен азот.

Мали елементи

Фосфорот генерално се обезбедува како неоргански фосфатни јони, често како pH

пуфер. Овој елемент е од суштинско значење за синтезата на нуклеинските киселини,
меѓупроизводите на метаболизмот на јаглени хидрати и соединенијата кои се вклучени во
трансдукцијата на енергија, на пр. аденозин трифосфат (ATP) и никотинамид аденин
динуклеотид фосфат (NADP). Медиумските концентрации обично не треба да бидат
поголеми од 100 mg/L.

Сулфурот е потребен за производство амино киселини во кои е содржан како

цистин, цистеин и метионин, и некои витамини. Често се испорачува како неоргански
сулфат или сулфид со концентрација од 20-30 mg/L.

Другите мали елементи, главно калциумот, железото, калиумот и магнезиумот,

мора да се обезбедат во релативно мали, но значајни количини, обично помали од 10-20
mg/L. Неколку од овие елементи се од суштинско значење за специфичните ензимски
активности. На пример, железото е од суштинско значење за оксидативните-редукциони
ензими, особено цитохромите, како и калиумот им е потребен на ензимите кои се
вклучени во синтеза на протеините и како контра-јон за ДНК фосфатнниот 'рбет. Други
елементи имаат структурни улоги: магнезиумовите јони се вклучени во стабилизацијата
на рибозомите, а некои се неопходни за одржување на клеточниот ѕид и мембранскиот
интегритет. Натриум и калиум се користат во хемиосмотски енергетски пумпи.

Елементи во трагови

Елементите во трагови вклучуваат кобалт, бакар, манган, молибден, никел, селен

и цинк. Овие елементи обично се потребни со концентрација од 0,1-1 mg/L или помалку,
за одреден број на специфични ензими. Овие барања ги исполнуваат со нивните
нормални концентрации во снабдувањето со вода, или како загадувачи во други
медиумски состојки.

Целокупната побарувачка на хранливи материи варира за различни

микроорганизми. Многу бактерии можат да растат во медиуми што содржат само јаглерод
и извори на енергија, како и основени минерални елементи. Микроорганизмите кои можат
да растат во овој минимален медиум се нарекуваат прототрофи. Сепак, на другите
микроорганизми мора да им се дадат специфични соединенија. Оние кои не можат да
растат без дополнителни органски супстанции, како што се амино киселини или витамини,
се нарекуваат ауксотрофи. Култивираните медиуми за многу органотрофни
5
микроорганизми често бараат присуство на одредени додатоци како витамини и фактори
на раст, особено Б витамините (тиамин, Б1, рибофлавин, Б2, пиридоксин, Б6, кобаламин,
Б12, биотин, никотинска киселина и пантотенска киселина). Неколку микроорганизми
бараат витамини кои се растворливи во масти (А, Д, Е и К); како и витамин Ц, кој иако
често го подобрува растот, не е вистински микробиолошки фактор за раст.

Користење на хранливи материи

Нутриентите од околината мора да се транспортираат преку клеточната мембрана

во клетката. Ова важен лимитирачки чекор каде се врши конверзија на суровите
материјали во продукти и затоа придонесува големо значење за индустриските процеси
на ферментација. Навлегувањето на неколку хранливи материи се врши со пасивна
дифузија, која не бара транспортери. Таквите хранливи материи обично се растворливи
во липиди и можат да навлезат во хидрофобната мембрана, на пр. глицерол и уреа.
Сепак, тоа не е ефикасен механизам, бидејќи стапката на навлегување преку мембраната
зависи од големината на концентрациониот градиент. Повеќето растворени супстанции
мора да се транспортираат преку специфични активни механизми, бидејќи мембраните се
селективно пропустливи. Исто така, микроорганизмите обично населуваат природни
средини, каде концентрациите на хранливите материи се ниски. Бидејќи
интрацелуларните концентрации на соединенија често се повисоки од нивоата на
животната средина тие развиле механизми да можат да акумулираат раствори наспроти
концентрацискиот градиент.

Повеќето растворени супстанции вклучуваат транспортни протеини (пермеази) кои

ја опкружуваат мембраната. Тие учествуваат во олеснената дифузија која нема потреба
од енергија туку игра улога исклучиво концентрацискиот градиент. Сепак, навлегувањето
на хранливите материи во клетката продолжува, бидејќи нивната интрацелуларна
концентрација е помала и при самиот влез, веднаш се метаболизираат. Овој механизам,
ретко се среќава кај прокариотите и се користи за транспорт на шеќери и аминокиселини,
а нивните селективни транспортери обично функционираат за група на поврзани
супституции. Тие значително ја зголемуваат стапката на дифузија, барем до
концентрациите во кои транспортниот протеинот станува заситен со неговите нутриенти.

Активниот транспорт ни овозможуваат акумулација на материи наспроти

градиентот на концентрација, што е важен во средини каде нивоата на хранливи материи
се ниски. Некои системи овозможуваат акумулација и до 100-1000 пати поголема од
надворешната концентрација. Сепак за да се врши транспорт, овие механизми бараат
директен внес на значителни количини на метаболичка енергија, АТП или протонски
пумпи. Како и кај олеснетата дифузија, и тука се вклучени протеински носачи; повеќето се
високо специјализирани, додека други функционираат со групи на сродни соединенија.
Кога се вклучени протонските пумпи, хранливите материи што влегуваат во клетката, како
шеќери, амино киселини или молекули на органска киселина, истовремено се
транспортираат со протони, транспортот се нарекуваат симпорт. Протонските пумпи,
исто така, може да се користат за да се изнесат натриумовите јони низ мембраната. Така
6
натриумовите јони ја напуштаат клетката а истовремено влегуваат протони или нутриенти
како амино киселини или шеќери, овој транспорт се нарекува антипорт.

Некои соединенија може да се модификуваат за време на користењето. Шеќерите,

на пример, може да се фосфорилираат со користење на фосфоен-пируват (PEP) како
донор на фосфати. Ова е познато како групна транслокација, која се изведува од страна
на многу прокариотски клетки.

За време на периоди кога концентрациите на хранливи материи се многу ниски,

како и за време на стационарната фаза на серија култури, некои организми
произведуваат метаболити кои се способни за отстранување на преостанатите метални
јони. Сидерамини, кои вклучуваат хидроксамат ферихром, се добро познати примери.
Алтернативно, некои микроорганизми може да произведат in vivo соединенија чија улога е
да ги направат нивните мембрани попрепустливи за одредени метални јони, на пр.
макротетралидите.

Искористување на материјали со висока молекуларна маса

Употребата на полимерни супстрати (полисахариди, протеини и липиди) бара

дополнителни активности. Протозоа и други еукариотски организми кои што се без
клеточни ѕидови можат да внесат релативно големи парчиња хранливи материи од
нивната животна средина со процес на фагоцитоза, која потоа станува вакуола обвиткана
со мембрана и исполнета со храна. Потоа хидролитичките ензими се секретираат во
вакуолата за да се разрушат полимерите на нивните конститутивни мономери. За
организми кои имаат цврст клеточен ѕид ова обично не е можно. Тие мора да лачат
екстрацелуларни хидролитички ензими (протеази, амилази, целулази и сл.) директно во
околината и потоа ги земаат добиените хидролизирани производи. Многу од овие
екстрацелуларни ензими имаат голема индустриска важност.

Кинетика на микробен раст

Микробниот раст може да се дефинира како уредно зголемување на клеточните
компоненти, што резултира со зголемување на клетките и на крајот доведува до клеточна
делба. Оваа дефиниција не е строго дефинирана, бидејќи вели дека како последица на
растот на клетките секогаш се зголемува нивниот број. Сепак, под одредени услови
растот може да се појави без клеточна делба, на пример, кога клетките синтетизираат
соединенија за складирање, како гликоген или поли-β-хидроксибутират. Во вакви

7
ситуации бројот на клетки останува ист, но концентрацијата на биомасата продолжува да
се зголемува. Ова исто така важи и за ковеноцитните организми, како што се некои габи,
кои не се поделени во одделни клетки туку нивниот раст резултира со зголемена
површина.

Кинетиката на раст на хомогените едноклеточни суспендирани култури може да се

моделира со помош на диференцијални равенки во континуиран модел. Сепак,
филаментозниот раст и растот во хетерогени клеточни агрегати и групи, особено
биофилмови, колонии, flocs, mats and pellicles, е многу посложен. Всушност,
хетерогените системи бараат многу поинаков пристап како користење на модел на
клеточен автомат и модели на Swarm систем. Кинетика на раст на филаментозни
организми и хетерогени системи нема да се дискутираат.

Моделот за раст кој ќе се испитува е бактериска бинарна фисија во хомогени

суспензивни култури, каде со клеточната делба се создаваат идентични ќеркини клетки.
Секој пат кога клетката ќе се подели се нарекува генерација, а времето потребно за
разделувањето на клетките се нарекува генерациско време. Затоа, генерациското време
е времето потребно за удвојување на микробиолошката популација. Теоретски, по една
генерација, и популацијата на микробиолошките клетки и концентрацијата на биомасата
двојно се зголемуваат. Сепак, како што претходно беше наведено, под одредени услови
растот може да се поврзе само со зголемување на биомасата, но не и бројот на клетки.
Исто така, генерациското време за време на микробениот раст во суштина е просечна
вредност, бидејќи клетките нема да се делат со иста стапка. Во секое време постојат
клетки со различни фази во нивниот клеточен циклус. Ова се нарекува асинхронизиран
раст. Сепак, под одредени услови синхрониот раст може да се индуцира, така што сите
клетки ќе се делат истовремено, ова е корисно при истражувања во микробиолошка
физиологија.

Микробните ферментации во течни медиуми може да се вршат под различни

работни услови, пр. сериски раст, fed-batch growth или континуиран раст. Серискиот раст
вклучува затворен систем каде што сите хранливи материи се присутни на почетокот на
ферментацијата во фиксен волумен. Единствено дополнително може да се додадат
киселини или бази за контрола на рН или гасови (на пример, аерација, ако е потребно).
Во fed-batch systems постојано се внесуваат свежи медиуми или медиумските
компоненти, кои можат да бидат додадени наизменичено или како единечен додаток, а
волуменот на серијата ќе се зголемува со текот на времето. Континуираните
ферментации се отворени системи каде свежиот медиум континуирано се внесува во
садот за ферментација, но волуменот останува константен како потрошен медиум и
клетките се отстранети со иста стапка.

Сериски раст

За време на сериските ферментации, популацијата на микроорганизми поминува

низ неколку различни фази на раст: застој (лаг-фаза), забрзување, експоненцијален раст,
8
 забавување, стационарност и смрт (Фигура2.1). Во лаг-фазата практично нема раст и
микробната популација останува релативно константна. Сепак, тоа е период на
интензивна метаболичка активност, бидејќи микробениот инокулум се прилагодува на
новата средина. Кога клетките се инокулираат во свежиот медиум, можат да имаат
дефицит на некои ензими, витамини или кофактори и сл. кои мора да се синтетизираат
со цел да се искористат достапните хранливи материи, пред да настане клеточна делба.
Хемискиот состав на медиумот за ферментација влијае на должината на фазата на
заостој. Обично е подолга ако инокулумот е израснат со користење на јаглероден извор
за разлика од оној во свежиот медиум, бидејќи клетките мора да ги синтетизираат
ензимите потребни за да го катаболизираат новиот супстрат. Физиолошкиот стрес, исто
така, може да има влијание, особено кога клетките се пренесуваат од инокулум во
медиум со низок осмотски притисок (ниска концентрација на раствор) во свеж медиум со
повисок осмотски притисок (висока концентрација на раствор). Други фактори кои влијаат
врз должината на лаг-фаза се возраста, концентрацијата, одржливоста и морфологијата
на инокулумот. Општо земено, лаг-фазата е пократка кога инокулумот е подготвен од
клетки собрани во експоненцијална фаза на раст (период на најбрз раст) отколку оние
што се испитувани во следните фази.

Микроорганизмите се способни за
Број на клетки во лаг (клетки/ml)

спорулација, продуцираат спори за

да преживеат за време на
Стационарна
стационарната фаза
Забавување
или лаг биомаса (g/L)

Експоненцијална

Забрзување Фаза на смрт

Лаг Идиофаза*
(секундарен метаболизам) Фигура 2.1 Раст на
Набљудуван само кај некои
Трофофаза* микроорганизмите во
микроорганизми
(примарен метаболизам) сериската култура.
*Трофофаза и идиофаза.
Време (h)
Откако клетките ќе се прилагодат на нивната нова средина, тие влегуваат во фазата
на забрзување. Поделбата на клетките се јавува со зголемена фреквенција додека не се
достигне максималната стапка на раст (μmax) за специфичните услови на сериската
ферментација. Во овој момент почнува експоненцијалниот раст и бројот на
клетките/биомасата се зголемува со константна стапка. Математички, овој
експоненцијален раст може да се опише со два методи: еден е поврзан со биомасата (x),
а другиот со број на клетки (N). За клеточна биомаса, растот може да се смета како
автокаталитичка реакција. Затоа, стапката на раст зависи од концентрацијата на

9
биомасата, односно катализаторот, кој е присутен во дадено време. Ова може да се
опише на следниов начин:

стапката на промена на биомасата е dx / dt = μx (2.1)

каде x = концентрација на биомаса (g / l), μ= специфична стапка на раст (на час) и t =

време (h).

Кога графикот е нацртан од клеточна биомаса наспроти времето, производот е крива со

постојано растечки наклон (Слика 2.2а).

Равенката 2.1, исто така, може да се преуреди за да се процени специфичната стапка на

раст (μ):

μ= 1/x*dx/dt (2.2)

За време на секој период на вистински експоненцијален раст, равенката 2.1 може да се

интегрира за да се обезбеди следната равенка:

xt=xoeμt (2.3)

каде xt = концентрација на биомаса после времето t, xo = концентрација на биомаса во

почетниот експоненцијален раст, и e = база на природниот логаритам.

Природни логаритми, loge (ln), дава

ln xt= ln xo + μt

Оваа равенка е форма на y = c (интерцепт на y оската) + mx каде m = градиент (μ во

равенка 2.4), што е општа равенка за праволиниски график.

За клетките во експоненцијална фаза, нацртот на природниот логаритам на

концентрација на биомаса наспроти времето, полу-логаритамски график, треба да даде
права линија со наклон (градиент) еднаков на μ (Слика 2.2б), или

μ= (ln xt – ln xo)/t (2.5)

(Забелешка: кога се прават вредностите за log10 наместо природниот логаритам,

градиентот на полу-логаритамскиот график е еднаков на μ / 2.303, види слика 2.2ц).
(а) (б)
Клеточна бимаса или

клеточна биомаса или

Природен лог (In) или
број на клетки

број на клетки

Градиент = μ

10
 Време (мин) Време (мин)

Слика 2.2 Експоненцијален

раст на едноклеточен (в)
микроорганизам со време

log10 клеточна биомаса

на удвојување од 20мин
(а) аритметички график, (б)

или број на клетки

полу-логаритамски график
користејќи природни
логаритми и (в) полу-
Градиент =
логаритамски график
користејќи логаритам кон
основата 10 (μ = Време (мин)
специфична стапка на
раст).

Вториот пристап е да се испита растот во однос на бројот на клетките, каде што

бројот на клетки на почетокот на експоненцијалниот раст е N o. Ако хипотетички се земеме
случај каде популацијата на микробиолошките клетки во точката на експоненцијален раст
е еден (No = 1), бинарна фисија можеме да ја опишеме на следниов начин:

Број на делби 0 1 2 3 n

Број на клетки 1 2 4 8 2n

Математички No No2 No2*2 No2*2 *2 –

– No21 No22 No23 No2n

Следствено, по период на експоненцијален раст, времето (t), бројот на клетки (Nt) е даден

Nt= No2n (2.6)

каде n = бројот на поделби, No = почетен број на клетки.

Природни логаритам дава

ln Nt= ln No + n ln 2 (2.7)

Затоа, бројот на поделби (n) што се случиле е даден со

(2.8)

11
Бројот на поделби за единица време за време на овој период на експоненцијален пораст
се
определува со делење на временскиот период (t):

(2.9)

каде n / t = константна стапка на поделби (просечен број на генерации во час).

Често, ние не сме заинтересирани за бројот на поделби во час, во единица време време,
туку не интересира средното време на генерирање или удвојување (t d), односно времето
потребно за да една генерација ја удвои популацијата. Така,

(2.10)

За време на експоненцијалниот раст, кога сите хранливи материи се во вишок,

постои директна врска помеѓу бројот на клетки и концентрацијата на биомасата,
претпоставувајќи дека средната големина на клетката е константна. Ова е балансиран
раст, и може да се воспостави директна врска помеѓу специфичната стапка на раст и
времето на удвојување. Сепак, во услови кога есенцијалните хранлива состојка се
ограничени, се јавува неурамнотежен раст и се појавуваат варијации во бројот на
клетките (N) и биомасата (x).

Ако ја разгледаме ситуацијата каде што во времето нула, клеточната биомаса е x o,

тогаш по фиксен временски период (t) на експоненцијален раст, што е еквивалентно на
времето за удвојување (td), микробиолошката биомаса ќе се удвои до 2xo, односно xt = 2xo,
кога t = td. Од тука равенката 2.3 дава

2xо = xo eμtd (2.11)

Според природниот логаритам произлегува

ln2xo= ln xo + μtd (2.12)

или

μtd = ln 2 (2.13)

Затоа, во овој случај

(2.14)

Равенката 2.1, стапката на промена на биомасата (dx / dt = mx), предвидува дека растот
ќе се случи во неодредено време. Сепак, за време на серискиот раст, микроорганизмите

12
 континуирано ја метаболизираат финалната набавка на хранливи материи достапни од
ферментацијата. По извесно време стапката на раст се намалува и на крајот ќе престане.
Овој прекин на растот може да се должи на намалувањето на есенцијалните хранливи
материи (извор на јаглерод, есенцијални аминокиселини и сл.) или на создавањето на
токсични метаболити, како што се етанол и млечна киселина, или комбинација од двете
(исцрпеност на хранливите материи и акумулација на токсини). Монод покажал дека
стапката на раст е приближно хиперболична функција на концентрацијата на хранливите
материи кои го ограничуваат растот (Слика 2.3). Ова влијание на есенцијалното
присуство на хранливи материи врз растот може математички да се опише со равенката
Монод, во форма слична на онаа што се користи во биохемијата, каде што Михаелис-
Ментен-овата кинетика ја дефинира стапката на ензимски катализирана реакција во
однос на неговата концентрација на супстрат:

(2.15)

каде μmax = максимален специфичен раст (на час) на клетките, т.е. кога концентрацијата
на супстратот не е лимитирачка;

S = концентрација на лимитирачки супстрат (g / l); К S = константа на сатурација,

концентрација (g / L) на лимитирачка хранлива материја која овозможува раст на
половина од максималната специфична стапка на раст, односно μ = 1/2 μ max,и е мерка за
афинитетот на клетките за оваа хранлива материја.
Специфична стапка на раст/h

Сл. 2.3 Односот помеѓу

концентрацијата на
Концентрација на супстрат (g/L)
супстратот и специфичната
Кога микроорганизмот има обезбедено лимитирачки супстрат во концентрација
стапка на раст.
многу поголема од КS и со сите други нутриенти во вишок, микроорганизмот
експоненцијално ќе расте со максимална стапка, т.е. кога S >> КS, тогаш μ = μmax. Сепак, со
оглед на тоа што нивото на супстратот се намалува, на крајот станува ограничувачки и
повеќе не може да го одржи μmax. Ова е почеток на фазата на забавување. Бидејќи
преостанатата концентрација на лимитирачкиот супстрат се приближува до КS и потоа
13
паѓа под оваа концентрација, придружно со постепено намалување на стапката на раст
(μ). Стапката на раст на микроорганизмот со многу висок афинитет за ограничување на
брзината на супстратот (т.е. низок КS) нема да биде засегната додека концентрацијата на
супстратот стане многу ниска. Меѓутоа, кога има низок афинитет за ограничувачкиот
супстрат (т.е. висок КS), стапката на раст ќе почне да паѓа дури и при релативно високи
концентрации на супстратот и организмот покажува подолга фаза на забавување.

Специфичната стапка на раст на микроорганизмот продолжува да се забавува

додека сите достапни ограничувачки супстрати се метаболизираат. Растот повеќе не е
одржлив и клетките влегуваат во стационарна фаза. Во овој момент, целокупната стапка
на раст се намалува до нула и не постојат нето промени во бројот на клетките /
биомасата (стапката на клеточната делба е еднаква на стапката на клеточна смрт).
Сепак, микроорганизмите се уште се метаболитички активни, вклучени во
метаболизирањето на интрацелуларните резервни соединенија, користејќи ги хранливите
материи ослободени од лизираните клетки, а во некои случаи продуцираат и секундарни
метаболити. Времетраењето на стационарната фаза варира во зависност од вклучените
микроорганизми и условите на животната средина. За клетките кои не можат да
преживеат со формирање на спори, се проследени со фаза на експоненцијална смрт
кога клетките умираат со константна стапка и често се подложени на лиза.

ПРИМЕНА НА СЕРИСКИТЕ ФЕРМЕНТАЦИИ

За време на сериската ферментација, одредени услови на животната средина

постојано се менуваат, особено концентрациите на хранливи материи и продуктите, како
и специфичната стапка на раст, бидејќи клетките мора да минат низ низата од фази на
раст опишани погоре. Како резултат на тоа, системот никогаш не постигнува услови на
стабилна состојба. Друг недостаток е тоа што неколку различни практични фази се
поврзани со работата на сериската ферментација:

1. полнење на ферментот со свеж медиум;

2. стерилизација на ферментот и медиумот;

3. инокулација на ферментот;

4. производство на микробни производи;

5. собирање на биомаса и потрошена ферментациска супстанца; и, конечно

6. чистење на садот.

Ова има големи економски импликации во индустриските процеси. Во значителен

временски период садот за ферментација иако не се користи за микробиолошки
производи, треба се чисти, полни, стерилизира, итн. Непродуктивниот период се нарекува
надолно време на ферментот.

14
ОПТИМИЗАЦИЈА НА СЕРИСКИТЕ ФЕРМАМЕНТАЦИИ

Во текот на развојот на серискиот процес може да се утврдат параметрите за

клучните растенија кои овозможуваат да се оптимизира производството на даден
микробиолошки производ, без разлика дали тоа е самата биомаса или специфичен
метаболит. Важен параметар е коефициентот на принос (Y), кој се одредува врз основа
на количината на лимитирачки нутриенти, нормален извор на јаглени хидрати,
конвертиран во микробиолошкиот производ. Во однос на биомасата, тој е дефиниран како

x = Yx/S (S – Sr) (2.16)

каде што x = концентрација на биомаса (g / L), Yx/S = коефициент на принос (g биомаса / g

супстрат кој се користи), S = почетна концентрација на супстратот (g / L) и S r = остаток на
супстратната концентрација (g / L).

Во случај на производство на биомаса, коефициентот на принос се однесува на

количината на произведена биомаса по грам супстрат што се користи. Затоа, колку е
поголем коефициентот на принос, толку е поголем процентот на оригиналниот супстрат
претворен во микробиолошка биомаса. За микробиолошки метаболички производи (р)
коефициентот на принос е поврзан со количеството на метаболитот произведен во однос
на количината на супстрат што се користи (Y p/S). Одредувањето на коефициентите на
принос е од витално значење бидејќи трошокот од медиумот за ферментација, особено
изворот на јаглерод, може да биде значителен дел од вкупната цена на производство.

Со изведување на низа експерименти под различни истражувачки услови, може да

се утврдат различни состојби и концентрации на медиум, pH, температура, итн.,
оптимални услови за раст / производство. Исто така, важно е да се одреди максималната
специфична стапка на раст (μmax) на организам. Ова е особено точно за примарните
метаболити, каде формирањето на производ е поврзано со растот. За да се оптимизира
севкупната продуктивност на системот, микроорганизмот обично мора да расте во μmax.
Како што беше претходно наведено, концентрацијата на оперативните супстрати има
големо влијание врз стапката на растот на микроорганизмот. Преку серија сериски
ферментации, секој со различна почетна концентрација од лимитирачкиот супстрат, може
да се одреди специфичната стапка на раст (μ) за секој експеримент. Овие податоци потоа
може да се искористат за да се процени и μmax и константа на сатурација (КS) со
едноставно земање на реципрочните вредности во равенката на Монод преуредување на
равенката 2.15 за да се добие

(2.17)

Или

15
И

(2.18)

На крај, 1/μ наспроти 1/S треба да создаде права линија со пресретнување на y-оската на
1/ μmax и градиент еднаков на Ks/μmax. Затоа, сите клучни кинетички параметри можат лесно
да се одредат и кога се познати вредностите на Ks, μmax и Y, може да се даде комплетен
квантитативен опис за растот кој настанал за време на сериската култура.

Континуирана кинетика на раст

Континуираните културни ферментации имаат многу апликации како за лабораториски

истражувања, така и за индустриските процеси. Студиите може да се изведуваат од сите
аспекти како клеточен раст, физиологија и биохемија. Тие се корисни за еколошките
студии, како и во генетиката за испитување на стапките на мутација, мутагени ефекти итн.
Примената во индустриските ферментации ги надминува многуте ограничувања на
сериските процеси.

Првично, континуираните ферментации започнуваат како сериски култури, но

експоненцијалниот раст потоа може да продолжи на неодредено време, во теорија, преку
континуирано додавање на свежи ферментациски медиум. Реакторот континуирано се
меша и се одржува константен волумен со инкорпорирање на преливен слој или друг
уред за нивелирање (Сл.2.4). Свеж медиум континуирано се додава и се дислоцира
еднаков волумен на потрошена ферментациона супа и клетки со иста стапка како во
свежиот медиум. Преовладуваат услови на стабилна состојба, каде што стапката на
пораст на микробните клетки е еднаква на брзината со која клетките се поместуваат од
садот.

излез на воздух
воздух
Стерилен филтер за воздух

Преливник
16
 Резервоар

за исхрана
Ферментер

Сл.2.4 Апарат за континуирана

култура.

Собирен
резервоар

Како и со сериските ферментации, специфичната стапка во која микроорганизмот

расте во континуирана култура е контролирана од достапноста на лимитирачки хранливи
супстанци. Затоа, стапката на додавање на свежиот медиум ја контролира стапката на
раст на микроорганизмите. Сепак, вистинската стапка на раст не зависи само од
волуметрискиот проток во медиумот на реакторот, туку и од стапката на разредување
(D). Ова е еднакво на бројот на волуменот на реакторот што минува низ реакторот во
единица време и се изразува во единици на реципрочно време, на час.

(2.19)

каде што D = стапка на разредување (на час), F = проток (L / h) и V = волумен на

реакторот (L).

Терминот D е реципрочен од средното резидентно време или времето на

хидраулично задржување, и се користи во третмани со отпадна вода. Додавањето на
свеж медиум во реакторот може да се контролира со фиксна вредност, па затоа стапката
на додавање на лимитирачка хранлива супстанција е константна. Во одредени граници,
стапката на раст и стапката на губење на клетките од ферментерот ќе се определат со
стапката на средно внесување. Затоа, во услови на стабилна состојба, билансот на нето-
биомасата може да се опише како

(2.20)

Или

(2.21)

17
Под услови на стабилна состојба стапката на раст = стапката на загуба, па оттука d x / dt =
0 и затоа

μx = Dx (2.22)

μ=D (2.23)

Следствено, при фиксни стапки на проток и стапки на разредување под постојани

физички и хемиски услови на работа, односно во услови на стабилна состојба,
специфичната стапка на раст на микроорганизмот зависи од оперативната разредувачка
брзина, до максимална вредност еднаква на μmax (сл. 2.5). Ако стапката на разредување е
зголемена над μmax, се случува комплетно измивање на клетките, бидејќи клетките немаат
доволно време да се "дуплираат". Точката во која ова е едноставно се избегнува се
нарекува критична стапка на разредување (Dcrit).

Биомаса (клеточна концентрација)

Резидуална супстратна
Биомаса (g/L)

концентрација (g/L)
Резидуална супстратна
Сл. 2.5. Раст на
концентрација
микроорганизам во
континуирана хемостатска
култура.
Стапката на разредување (D)

За секоја дадена стапка на разредување, под услови на стабилна состојба,

концентрацијата на резидуалниот супстрат во реакторот може да се предвиди со
заменување на D во μ во равенката на Монод (равенка 2.15):

(2.24)

каде што Sr е концентрацијата на резидентен супстрат во реакторот со фиксната стапка

на разредување. Со реорганизирање се добива

D(Ks + St) = μmax St или DKs + DSt = μmax St

Со делење на St, се добива

18
Оттука,

(2.25)

Следствено, концентрацијата на резидуалниот супстрат во реакторот е контролирана со

стапката на разредување. Секоја промена на оваа стапка на разредување резултира со
промена на стапката на раст на клетките што ќе зависи од достапноста на супстратот при
новата стапка на разредување. Така, растот е контролиран од достапноста на
лимитирачките хранливи материи. Овој систем, каде што концентрацијата на
лимитирачките хранливите материи што влегуваат во системот е фиксирана, често се
опишува како хемостат, наспроти турбидостат, каде што хранливите материи во
медиумот не се лимитирачки. Во овој случај, се следи заматеност или апсорпција на
културата и се одржува со константна вредност преку регулирање на стапката за
разредување, односно концентрацијата на клетките се одржува константна.

При ниски стапки на разредување со фиксни концентрации на супстрат,

концентрацијата на преостанатиот супстрат ќе биде ниска (слика 2.5). Сепак, со оглед на
тоа дека D се приближува до μmax, концентрацијата на преостаната супстрат се зголемува
заедно со стапката на раст на микроорганизмот. Надвор од Dcrit, влезната концентрација
на супстратот ќе биде еднаква на излезната концентрација, бидејќи сите клетки се
изгубени од системот. Така, овој континуиран реактор може да се опише како
саморегулирачки нутриент-лимитирачки хемостат.

Концентрацијата на биомаса или на микробниот метаболит во континуиран

ферментер под услови на стабилна состојба може да биде поврзана со коефициентот на
принос, опишан во делот за сериска ферментација. Со вметнување на равенката за
резидуален супстрат (равенка 2.25) во равенката за биомаса или равенката на
коефициентот за принос на метаболички производи (равенка 2.16), во овој случај за
стабилна биомаса x, дава

(2.26)

каде SR е концентрацијата на супстратот од преливниот медиум или

(2.27)

Затоа, концентрацијата на биомаса под услови на стабилна состојба се контролира со

концентрацијата на подлогата и стапката на оперативно разредување. Под не-
инхибиторни услови, кога не постои инхибиција на супстратот или производот,
концентрацијата на храната е поголема, концентрацијата на биомасата е поголема и
концентрацијата на резидуалниот супстрат останува константна. Сепак, колку е поголема
19
брзината на разредување, толку побрзо ќе пораснат клетките, што резултира со
истовремено зголемување на концентрацијата на преостанатите супстрати и
последователното намалување на концентрацијата на биомаса во стабилна состојба.
Како што D се приближува до μmax, концентрацијата на биомасата станува уште помала,
но клетките растат побрзо и постои истовремена зголемување на резидуалната
концентрацијата на супстанцијата (слика 2.5).

Следење на микробен раст во култура

За време на ферментацијата се потребни методи за рутинско определување на
микробиолошката популација, број на клетки и / или биомаса, со цел да се следи
нејзиниот напредок. За оваа цел се достапни бројни директни и индиректни методи.
Директните методи вклучуваат определување на сувата тежина, клеточно сметање со
микроскопија и методи за броење на плочи. Индиректни методи вклучуваат
турбидемирија, спектрофотометрија, проценка на клеточните компоненти (протеини, ДНК,
РНК или АТП) и онлајн следење на производството на јаглероден диоксид или користење
на кислород. Методот усвоен во секоја дадена ситуација зависи од ферментацијата и
сите специфични барања. Треба да се земат предвид неколку фактори, како што се
степенот на точност и потребната чувствителност и времетраењето на анализата.
Проценката на едноклеточните организми, под услов да не се склони кон флокулација, е
релативно јасна, но филаментозните организми, габи и актиномицети претставуваат
дополнителни проблеми. Исто така, културните медиуми варираат во вискозитет, боја и
количеството на цврсти честички, и сите тие можат да влијаат врз изборот на методот на
следење. Брзината на анализата може да биде критична, бидејќи често се бара
моментална индикација за биомаса или концентрација на клетки. Сепак, побрзите методи
често се помалку сигурни, а подолгите постапки се генерално попрецизни.

Директни микроскопски методи за броење

Клеточните броеви во суспензијата може да се измерат, со исклучок на

филаментозни организми, со директни микроскопски броења, користејќи комори за
броење како Petroff-Hauser или Neubauer-тип. Првиот е посоодветен за броење на
бактерии. Кога комората е покриена со стаклен стакло, мрежите за броење имаат познат
обем на култура. Со броење на клетките во дел од мрежата, може да се одреди бројот на
клетки на милилитар. Директните микроскопски броења се брзи, но неспосбни за да се
направат разлика помеѓу живите од мртвите клетки, освен ако не се диференцира со
употреба на витална техника на боење. Исто така, примероците мора да содржат
релативно високи концентрации на клетки, вообичаено минимум 5 x 106 клетки / мл.

Електронски клеточни бројачи

20
 Електронската опрема за броење на клетки е исто така брза, но повеќето методи
се посоодветни за поголеми едноклеточни микроорганизми, како што се квасец, протозои
и некои алги, и помалку корисни за проценка на бактериите. На пример, Coulter Counter
се користи за броење и за одредување на големината на честичките и се базира на
мерење на промени во електричниот отпор, произведени од не-проводни честички
суспендирани во електролит. Овој метод вклучува цртање на суспензија на клетките
преку мал отвор низ која се одржува електричната струја. Како клетка минува низ отворот,
таа го дислоцира сопствениот волумен на електролит и го менува електричниот отпор.
Овие промени се детектираат и конвертираат во броен пулс. Сепак, во суштина се бројат
честички, и затоа се склони кон грешки поради клеточно натрупување и присуство на
остатоци од честички.

Техники за броење на плочи

Методите за броење на плочи ги детектирааат живите клетки, односно оние кои

можат да формираат колонии на соодветен цврст хранлив медиум. Двете методи кои
рутински се користат се spread plating и pour plating. Пред инокулацијата, неопходно е да
се подготви сериско разредување во стерилен разредувач за концентрирани клеточни
суспензии. Алтернативно, за примероци со ниски вредности на клетките, како и во
анализата на вода, потребен е чекор на концентрација.

Во spread plating, примероците, обично се шират 0,1mL на површината од агар-

базиран со нутритивен медиум со користење на стерилен уред за ширење, на пр.
свиткана стаклена прачка. Потоа плочите се инвертираат и се инкубираат со оптимална
температура на раст. Сите произлезени колонии треба да бидат добро одделени и лесно
да се бројат. Ова, исто така, овозможува изолација на чисти култури каде што е потребно.
Сепак, микроорганизмите со ниска толеранција кон кислородот не растат (освен ако не се
инкубираат под соодветни услови) и може да се користи pour plating. Овде, суспензијата
на микроорганизмите со примерок од 1 mL, се става во петриева плоча и темелно се
меша со стопена агарна средина на 48-50 ° C и е остава да се зацврсти пред
инкубацијата. pour plate резултира со развој на микробиолошки колонии низ целиот агар.
Оние организми со помала толеранција на кислород растат во агарот. Колониите на
аеробни организми често имаат варијабилни големини, бидејќи оние што се поблиску до
површината имаат подобро снабдување со кислород. Како резултат на тоа, често е
потешко да се види сличноста во колонијалната морфологија помеѓу колониите на
површината и оние во агарот. Исто така, броењето може да биде потешко отколку во
spread plate. Треба да се води грижа за да се осигура дека стопениот агар не е
презагреан, во спротивно некои микробиолошки клетки може да бидат повредени и да се
забави формирањето на видливи колонии или да бидат убиени.

За статистичка сигурност, резултатите се евидентираат само за плочи кои содржат

30-300 колонии. Потоа се врши пресметување на концентрацијата на клетките во
оригиналниот примерок, земајќи го во предвид разредувањето и обемот. Двете методи
мерат единици кои форимираат колонии (CFU). Ова може или не може да биде исто како
21
бројот на клетки во зависност од степенот на натрупување и клеточната морфологија на
микроорганизмот. Овие техники се точни, но најчесто се потребни минимум 1-2 дена
инкубација пред колониите да се бројат. Меѓутоа, постојат и побрзи техники за броење на
микроколонија.

Турбидиметриски и спектрофотометриски техники

Овие методи обезбедуваат едноставно, брзо и погодно средство за целосна

проценка на биомасата. Тие обично се изведуваат на одредена оптимална бранова
должина за секој микроорганизам. Турбидиметриските методи ја мерат светлината
расфрлана со суспензија на клетки, што е пропорционално на концентрацијата на
клетките. Алтернативно, може да се употреби спектроскопија, користејќи апсорбанца или
трансмитанца на клеточна суспензија. Некои модерни системи за мониторинг на
ферментација сега користат методи базирани на блиска инфрацрвена спектроскопија.

Турбидиметриските и спектрофотометриските методи бараат изградба на

соодветни криви на калибрација, подготвени со стандардни клеточни суспензии кои
содржат познати концентрации на клетки. Исто така, мора да се внимава кога се
толкуваат резултатите дали ферментационата супа содржи честички или е многу обоена.

Проценка на сувата тежина

Овој метод ја одредува тежината на вкупните клетки, и живи и мртви, во течни

култури. Тоа подразбира одделување на биомасата од познатиот волумен на хомогена
клеточна суспензија. Ова обично се постигнува со филтрација под вакуум, преку
превлажен мембрански филтер со големина на пора од 0.2μm или 0.45μm. Филтерот со
собрани клетки се "измива" со вода за да се отстрани секој остаток на медиум за раст и
се суши во печка на 105 °C за да се добие константна маса. Резултатите се нормално
изразени како милиграми на клетки по милилитар на култура. Очигледно, сите други
суспендирани не-клеточни материјали со големина поголема од порите на филтерот исто
така се собираат и може да доведат до грешки. Понатамошни ограничувања се времето
потребно за да се добијат резултатите и релативно големиот обем на примерокот
потребен за да се добие доволно биомаса за точни мерења, бидејќи индивидуалната
бактерија тежи само околу 10-12 g.

АТП биолуминометрија

АТП брзо се губи од мртвите клетки; следствено, тоа е многу корисно за

одредување на концентрацијата на живи микроорганизми. Количината на АТП во
примерокот може да се квантифицира со употреба на АТП биолуминометрија. Оваа
техника користи комплекс од ензим-супстрат, луцифераза-луциферин, добиен од
22

луцифераза
светулката, Photinus pyralis, која генерира фотон на светлина за секоја молекула на АТП.
Кога еден аликвотен број на луцифераза-луциферин се додава на АТП, екстрахиран од
примерок од клеточна суспензија, генерираната светлина може да се детектира во
биолуминометар. Резултирачкиот сигнал се засилува и потоа се изразува како дигитален
или аналоген податок.

АТП + О2 + луциферин оксилуциферин + АМП + СО 2 + РРi + фотон

на светлина (562 nm)

Оваа постапка е многу брза и чувствителна. Под оптимални услови може да се

детектираат 10 фемтомоли (1 фемтомола = 10-15 мола) од АТП, што е приближно еднакво
на 1 клетка од квасец или околу 10 бактерии. АТП биолуминометријата е најсоодветна за
директно мерење на примероци кои не се обоени, as quenching of light may be a problem.
Меѓутоа, бидејќи методот е многу чувствителен, примероците може да бараат значително
разредување, кое често го надминува colour quenching problem.

Онлајн проценка

Онлајн мониторингот на ферментаторите може да обезбеди проценка на

биомасата во реално време и да го минимизира условот за повторна земање на
примероци и офлајн анализа. Мониторинг системите може да вклучуваат оптичка густина
или сонди базирани на капацитивност. Исто така, микроорганизмите кои се вклучени во
повеќето процеси на ферментација или ќе имаат потреба за кислород и/или ќе
произведуваат јаглероден диоксид. Во такви случаи теоретски е можно да се воспостави
математичка врска помеѓу факторите, како што е еволуцијата на јаглерод диоксид или
искористувањето на кислородот, и концентрацијата на биомаса во биореакторот.
Проценката на концентрациите на биомасата и формирањето на производот може да се
направи преку мерење на овие параметри онлајн преку употреба на јаглероден диоксид
или кислородни детектори и биосензатори прикачени на компјутерот. Ова може да даде
точна проценка за концентрацијата на биомасата, под услов развиените математички
алгоритми да бидат сигурни.

Ефекти од еколошките услови на микробиолошкиот раст

Растот и развојот на микроорганизмите во голема мерка влијае од хемиските и
физичките услови во нивната животна средина. Сепак, микроорганизмите еволуирале за
да зафатат ниши низ целиот опсег на Земјата, дури и во екстемните делови. Како што е
прикажано во подоцнежните делови, микроорганизмите од некои од овие екстремни
средини имаат корисни својства кои може да ги експлоатираат.

Ефекти од температурата на растот

23
 Како што се зголемува температурата, стапката на хемиски реакции се зголемува.
Оваа стапка се зголемува за секои 10°C со пораст на температурата. Така, клетките
треба да растат побрзо со зголемување на температурата. Сепак, постојат максимални
граници по кои некои макромолекули чувствителни на температура (протеини, нуклеински
киселини и липиди) ќе станат денатурирани, а со тоа и не-функционални. Исто така,
постои минимална температура за раст, под која липидната мембрана не е доволно
флуидна за да функционира правилно.

Сите организми имаат оптимална температура за раст и различни групи на

микроорганизми еволуирале да растат во различни температурни опсези. Типичен
микроорганизам, познат како стенотермален, може да расте во температурен опсег од
приближно 30 °C, а еуритермалните организми растат дури и во повисоки температури.

Што се однесува до температурни оптими, мезофилите имаат оптимална

температура на раст во опсегот од 20-45 °C и минимум околу 15-20 °C (Слика 2.6).
Психрофилите обично имаат оптимални температури под 15 °C и овие организми се
убиваат со самото изложување на собна температура. Тие можат да функционираат на
ниски температури, бидејќи нивните мембрани содржат висок процент на незаситени
масни киселини. Овие молекули остануваат флуидни на пониски температури, додека
мембраните кои содржат заситени масни киселини стануваат нефункционални.
Психотрофите понекогаш се нарекуваат и факултативни психрофили. Тие растат најбрзо
на температури над 20 °C, но се способни за бавен раст и на температури до околу 0 °C.
Неколку се одговорни за расипување на храната во ладилниците.
Релативна стапка на раст

Температура (ᵒС)
Психрофили Психротрофи
Мезофили Термофили Слика 2.6 Температурни опсези за
24
микробиолошки раст.
 Екстремни термофили

Организмите со оптимум над 50 °C се нарекуваат термофили. Неколку видови

алги, протозои и габи имаат максимална температура до 55 °C. Сепак, само некои
прокариоти се навистина термофилни, бидејќи на такви високи температури не растат
еукариотски микроорганизми. Некои екстремни (хипер-) термофили можат да растат на
100 °C или повеќе. На пример, Pyrolobus fumarii има оптимална вредност од 106 °C и
продолжува да расте до 113 °C. Сите овие се археи (Табела 2.3), кои се главно
анаеробни сулфатни редуцирачи или имаат друг метаболизам со пониски барања за
термолабилни кофактори како што се NADH и NADPH. Тие имаат потенцијални
индустриски потреби во десулфуризацијата на јаглен, истекување на метали, создавање
метан и производство на комерцијални ензими, особено ДНК полимерази и рестриктивни
ендонуклеази.

Табела2.3 Примери од термофилни прокариоти и

нивната оптимална температура

Оптимална температура (ᵒС)

Археи

Methanobacterium thermoautotrophicum 65
(метаногени)

Methanococcus jannaschii (метаногени) 85

Pyrococcus furiosis (акумулира Н2) 100

25
Pyrolobus fumarii (облигатни Н2 106
хемолитотрофи)

Sulfolobus acidocaldarius (ацидофилен 75

сулфуро оксид)

Еубактерија

Bacillus stearothermophilus 60-65

Clostridium thermocellum 60
(целулолитичен анаероб)

Synechococcus lividans (цијанобактерија) 67

Thermoanaerobacter ethanolicus 70
(производител на етанол)

Изложеноста на не-термофили на високи температури обично предизвикува

оштетување на цитоплазматските мембрани, распаѓање на рибозомите, иреверзибилна
ензимска денатурација и оштетување на ДНК веригите. Тешко е да се утврди која од овие
топлински "повреди" е најмногу штетна за микроорганизмите, бидејќи сите ќе ја намалат
стапката на раст и ќе придонесат за инхибиција и, на крајот, смрт. Вистинските механизми
на термотолеранција не се целосно разјаснети. Сепак, рибосомите на термофилите
ефективно работат на повисоки температури и нивните мембрани исто така остануваат
непроменети. Ензимите од термофилите, како што се Bacillus stearothermophilus, обично
се повеќе топлински стабилни, што може да биде резултат на неколку амино киселински
промени во рамките на некој протеин кој значително може да ја зголеми
термостабилноста. Одржувањето на интегритетот на ДНК под овие услови очигледно е од
суштинско значење, а некои екстремни термофили имаат ДНК со висок сооднос на
гуанин-цитозин, што дава зголемени водородни врски кои обезбедуваат поголема
термостабилност. Тие исто така одржуваат повисоки интрацелуларни нивоа на калиумови
јони, често со необичен контра-јон, 2,3-дифосфоглицерат, кој помага да се стабилизираат
протеините.

Микробиолошките спори се особено отпорни на топлина. Овие хибернирани

структури имаат дебели спори и ниска активност на водата (види подолу). Бактериските
ендоспори (Слика 1.3) содржат високи нивоа на калциум дипиколинат, кој може да
сочинува до 15% од нивната сува маса. Се смета дека неговата улога е да ги
стабилизира нуклеинските киселини и протеините. Сепак, некои мутанти кои го немаат
ова соединение се чини дека задржуваат отпорност на топлина.

Ефекти од pH на растот

26
 Како и кај температурата, секој микроорганизам има pH оптимум и pH опсег во кој
расте. Генерално, габите имаат тенденција да растат со пониски вредности на pH (pH 4-6)
за разлика од повеќето бактерии. Вистинските ацидофили имаат pH оптима помеѓу 1 и
5.5, и често имаат механизми за исклучување на протоните, со цел да ја одржат својата
внатрешна pH вредност на повисоко ниво. Меѓутоа, поголемиот дел од микроорганизмите
се неутрофили, растат помеѓу pH 5 и 9, бидејќи повеќето природни средини спаѓаат во
овој опсег. Алкалофилите, како што се видовите Bacillus и Micrococcus, имаат pH оптимум
помеѓу 8.5 и 11.5, но заземаат протони за да ја одржат нивната внатрешна pH вредност
со помала вредност.

Ефекти од растворите и активноста на вода врз растот

Повеќето микроорганизми содржат околу 70-80% вода и бараат одредена

количина на слободна вода за извршување на специфични метаболички активности. Кога
микробните клетки со ригидни клеточни ѕидови се ставаат во хипотонични раствори
(понизок осмотски притисок од клеточната содржина), примаат вода за да станат тургидни
а оние без ѕидови се шират и пукаат. Во суви и хипертонични средини, превземањето и
задржувањето на вода е проблематично. Хипертоничните средини може да содржат
значителни количини на вода, но тоа не значи дека таа вода е на располагање. Всушност,
високите надворешни нивоа на раствори, како што се сол или шеќери, предизвикуваат
вода да излезе од повеќето клетки и растот да се инхибира.

Актуелната достапност на вода до микроорганизмот е означена со поимот

активност на водата (Aw). Ова е односот на притисок на пареата од водата во растворот
што го опкружува микроорганизмот, Psoln, и притисок на пареа од чиста вода:

односно чиста вода има Aw = 1.

Микробните видови варираат во нивната толеранција на суви услови и средини со висока

осмотична јачина. Повеќето бактерии, со неколку исклучоци, не можат да растат под A w
од 0.9, што може да обезбеди вредно средство за зачувување на храна. Многу габи кои
предизвикуваат биодетериозација на складираното жито (Aw = 0,7), вклучувајќи го
Aspergillus restrictus, се ксеротолерантни и може да растат при ниски нивоа на влага.
Сепак, вистинските ксерофилни филаментозни габи и осмофилни квасци, на пр.
Zygosaccharomyces rouxii, еволуирале за да живеат во средини каде што A w може да биде
ниско како 0,6. Некои од овие видови не може да растат во услови со висока достапност
на вода.

Морска бактерии се оптимално прилагодени на концентрацијата на сол во морска

вода (Aw = 0.98) и поседуваат ензими кои имаат специфични барања за натриумови јони.
Вистинските халофили, на пр. Halobacterium halobium, кој се наоѓа во областите на

27
Мртвото Море и Соленото езеро, нема да расте во концентрации на сол помали од 3
mol/L. Такви се археите кои имаат високо модифицирани клеточни ѕидови и необични
мембрански липиди.

Осмофилните, ксерофилните и халофилните организми акумулираат

компензирачки раствори, кои ја балансираат осмотичната јачина на надворешното
растворање. Пример полиолите; арабитолот е акумулиран од неколку габи и
филаментозни габи, а високите нивоа на глицерол се наоѓаат во халофилната алга
Dunaliella salina. Многу халофили, исто така, складираат големи количини на калиумови
јони, а некои бактерии натрупуваат амино киселини, особено пролин и глутаминска
киселина. Иако не се специјализирани, Escherichia coli синтетизира осмопротективен
бетаин (N, N, Ntrimethyl glycine), а Penicillium chrysogenum може да акумулира гликоза,
фруктоза и калиум хлорид.

Ефекти на кислород врз растот

Микроорганизмите се класифицираат во пет главни групи врз основа на нивните барања

за кислород.

1. Обликатни аероби растат само во присуство на кислород, потребен како

терминален електронски акцептор за транспорт на електрони во аеробна
респирација.

2. Факултативните анаероби функционираат со или без кислород, но растат

поефикасно кога има кислород.

3. Микроаерофилите бараат одреден кислород за биосинтезата на одредени

соединенија, но не можат да растат при нормални атмосферски концентрации на
кислород од 21% (v/v). Тие мора да имаат пониски нивоа на кислород од 2-10%
(v/v).

4. Аеротолерантните анаероби не зависат од кислородот и подеднакво растат во

присуство или отсуство.

5. Облигатни анаероби не можат да толерираат кислород; изложеноста кон него

резултира со смрт.

При изложеност на кислород, повеќето организми влегуваат во интеракција за да

произведат високо реактивни токсични производи. Овие редукциски производи на
атмосферскиот кислородот, вклучуваат супероксид (O2• -), водороден пероксид (H2O2) и
хидроксилни радикали (OH•). Во случај да не се детоксифицираат, овие производи
реагираат деструктивно со било кои органски молекули, вклучувајќи ги и липидите,
протеините и нуклеинските киселини. Три групи на ензими ги катализираат слободните
радикали за да ги направат безопасни: супероксид дисмутаза, каталаза и пероксидази:

28
 супероксид дисмутаза
супероксид (2O2• -) + 2Н+ О2 + Н2О2

каталаза
хидроген пероксидаза (2H2O2) О2 + 2Н2О2

Н2О2 + 2GSH глутатион пероксидаза 2H2O + GSSG

глутатион оксидиран
глутатион

Аеробите и сите други организми кои можат да толерираат кислород имаат

супероксидна дисмутаза, која го дисипира секој супероксид. Многу аероби, но не и
аеротолерантни организми, исто така поседуваат каталаза за елиминирање на хидроген
пероксид. Присуството на аскорбинска киселина, витамин Е и β-каротени исто така може
да биде корисно бидејќи помагаат во исфрлањето на слободни радикали по не-ензимски
пат. Строго облигатните анаероби немаат супероксидна дисмутаза и каталаза, или
производство на несоодветни количини. Како резултат на тоа, тие имаат ограничена
способност за детоксикација на кислородните радикали и не се способни да преживеат во
присуство на кислород.

Анаеробните живеалишта се прилично почести отколку што се очекува. Тие можат

да се појават од искористувањето на кислородот од факултативните анаероби и да
создадат анаеробна микросредина каде што облигатните анаероби може да растат.
Општо земено, каде и да се акумулира органската материја, микроорганизмите ќе го
искористуваат кислород побрзо отколку што го заменуваат, создавајќи анаеробна
средина.

Со цел да се растат облигатните анаероби во лабораториски услови, мора да се

користат процедури за исклучување на кислород од културата и сите манипулации мора
да се изведуваат во анаеробна атмосфера. Некои погодни постапки вклучуваат:

1. употребата на медиуми кои содржат редуцирачки агенси, како што е тиогликолат,

кој хемиски се комбинира со кислород;

2. физичко отстранување на кислородот од комората за раст, со пумпање на

воздухот со вакуумска пумпа, а потоа исфрлање на садот со азотен гас ± јаглерод
диоксид;

3. употребата на GasPak тегли, кои вклучуваат запечатување на микробните култури

во внатрешноста на теглата, заедно со паладиум катализатор и систем за
генерирање на водороден гас; кислородот се отстранува преку неговата реакција
со водородот за да формира вода; и

29
 4. анаеробни кабинети за растење и манипулација на организмите, кои се испиени со
гасна мешавина од азот: јаглероден диоксид: водород (80:10:10) и имаат "чист
систем" за отстранување на остатокот кислород.

Ефекти на зрачење врз растот

Видливата и ултравиолетова (УВ) светлина се дел од електромагнетниот спектар,

кој се протега од силн зрачење (γ-зраци) до многу слабо зрачење (топлина и радио
бранови). Дури и видливата светлина, особено енергетските виолетови и сини региони,
може да биде штетна. Може да генерира диоксиден кислород, кој е многу моќен
оксидирачки агенс и може да предизвика оштетување на клеточните компоненти дури и
да убие некои микроорганизми. УВ светлината, која е најштетна на 260nm, предизвикува
специфична штета на ДНК, особено формирање на тимински димери. Јонизирачкото
зрачење, како што се γ-зраците кои се емитираат од возбуденото јадро од 60Co, генерира
слободни радикали, OH • и H • и хидрирани електрони. Како резултат се оштетуваат
водородните врски во функционалните молекули, се оксидираат многу хемиски групи и се
оштетува ДНК веригата.

Одредени микроорганизми, особено бактеријата Deinococcus radiodurans,

покажуваат значителна природна отпорност на зрачење, како и бактериски ендоспори.

Многу бактерии што се пренесуваат преку воздух имаат одредени заштитни пигменти кои
апсорбираат зрачење, и кај другите микроорганизми во заштитата се вклучуваат
ефикасни механизми за репарација, особено на оштетената ДНК. И кај двете
Saccharomyces cerevisiae и E. coli, на пример, постојат најмалку три системи за
репарација на ДНК; мутантите кои ги немаат овие ензими за репарација покажуваат
поголема чувствителност кон зрачењето. Некои микроорганизми, вклучувајќи ја и E. coli,
исто така се помалку подложни на оштетување на радијацијата во анаеробните средини
отколку кога се наогаат во аеробни услови и може да бидат делумно заштитени од
редуцирачки агенси и соединенија на сулфидрил.

Ефекти од хидростатскиот притисок врз растот

Во природата, многу микроорганизми никогаш не се подложени на притисок

поголем од 1 atm (101.3kPa или 1.013bar) и повисоките притисоци генерално го
инхибираат растот на микроорганизмите. На пример, во производството на јаболкова
киселина, ефикасноста на квасецот е оштетена кога длабочината на ферментаторот ќе
биде поголема од 14.5 m, што создава хидростатски притисок над 1.5 atm. Сепак, тешко е
да се одреди редоследот на инхибицијата и кој процес или функција е најштетен. Често
се забележува интерференција со протеинската синтеза и трансфер на енергија од
катаболчки до биосинтетски системи, како и неспособноста на микроорганизмите да се
прилагодат на новите супстрати. Меѓутоа, многу морски организми мора да бидат

30
баротолерантни, бидејќи живеат во длабочини на океаните, каде што можат да бидат
подложени на притисок до неколку стотици атмосфери и да не растат над 200-600 atm.
Некои дури и можат да растат подобро под овие услови и се барофилни, способни да
живеат под 700-1000 atm.

Контрола (инхибиција) на микробниот раст

Контролата или спречувањето на микробиолошкиот раст е неопходно во многу
практични ситуации, особено во здравството, преработката и подготовката на храна, како
и во зачувувањето на материјалите. Контролата може да се постигне со употреба на
физички или хемиски агенси кои или ги убиваат микроорганизми или го инхибираат
нивниот понатамошен раст. Агентите кои ги убиваат клетки се нарекуваат "-циди",
додека "-статски" агенси го инхибираат растот на клетките без да ги убијат. Некои агенси
влијаат на група организми; терминот бактерицидно, на пример, се однесува на убивање
бактерии, а бактериостатски се однесува на инхибиција на растот на бактериските клетки.
Процедурите за стерилизација целосно ги уништуваат или ги елиминираат сите живи
организми, вклучувајќи ги и спорите, а може да се изведуваат со топлина, зрачење и
хемикалии, или со физичко отстранување на клетките.

Микроорганизмите не се убиваат веднаш при изложеноста на смртниот агенс.

Населението се намалува експоненцијално, со константна фракција во постојани
интервали, а неколку фактори влијаат на ефективноста на секој антимикробен третман.
Тоа вклучува:

1. Големината на популацијата: колку е поголема микробната популација, толку е

подолго времето потребно за да се убијат сите присутни микроорганизми;

2. составот на населението: различни микроорганизми се разликуваат во нивната

чувствителност на специфичен смртоносен агенс, а неговата ефективност може да
биде под влијание на нивната возраст, морфологија и физиолошка состојба;

3. концентрацијата на антимикробниот агенс или интензитетот на третманот:

повисоките концентрации или поголеми интензитети генерално се поефикасни, но
односот ретко е линеарен;

4. период на изложеност на смртоносниот агенс: колку е поголема изложеноста,

толку е поголем бројот на убиени организми;

5. температура: нормално повисока температура ја зголемува ефективноста на

агенсот; и

6. условите во животната средина, како што се рН, вискозитет и концентрација на

органската материја, можат да имаат големи влијанија врз ефективноста на
повеќето антимикробни агенси.

31
Контрола на микробниот раст со физички агенси

ТОПЛИНА

Секогаш кога се користи топлина за контрола на микробниот раст, мора да се земе

предвид и температурата и времето на изложување. Температурата потребна за да се
убие специфичен микроорганизам (смртоносна температура) варира. Исто така, времето
потребно за убивање зависи од неколку фактори (видете погоре). Топлината е најважното
и најшироко користеното средство за стерилизација (види термини кои се однесуваат на
стерилизација на топлина во Табела 2.4), и може да се постигне преку:

1. согорување, каде што согорувањето на 500 °C физички ги уништува организмите

и е особено корисно за некои цврсти отпадоци;

2. влажна топлина, која е погодна за стерилизирање на повеќето предмети, освен

топло-лабилни супстанции кои би биле денатурирани или уништени. Се изведува
со користење на пареа под притисок за да се постигне 121 ° C за 15 мин и се
користи во процесите на ферментација за стерилизација на садови, поврзување на
цевки и медиуми за култура; или

3. сува топлина која е помалку ефикасна од влажна топлина и бара повисоки

температури и многу подолго време на експозиција. Се изведува во печки со топол
воздух на 160 °C за 2 часа, и може да се користи за стакла, метални предмети и
материјали осетливи на влага, како што се прашоци и масла.

Табела 2.4 Термини поврзани со стерилизација на топлина што се користи во

индустријата за храна и ферментација

Времето на термичка смрт (TDT) е најкраткото време потребно за да се убијат сите

микроорганизми во примерокот на одредена температура и под дефинирани услови

Децималното време на намалување (D-вредност) е времето потребно за убивање на

90% од микроорганизмите во примерокот на одредена температура. Овој термин се
користи широко во прехранбената индустрија

Z-вредност е порастот на температурата потребна за да се намали D до 1/10 од неговата

претходна вредност

F-вредност е времето во минути на одредена температура (обично 250 ᵒF или 121.1 °C)
потребно за да се убие популацијата на клетки или спори

Del фактор (V) = ln (No / Nt), каде што No е бројот на организми на почетокот од
стерилизацијата и Nt е бројот што останува по времето t. Затоа факторот Del е мерка за
фракционо намалување на бројот на живи организми произведени со одреден режим на

32
топлина и време. Колку е поголем факторот Del, толку е поголем режимот на
стерилизација. Овој термин најчесто се користи во индустријата за ферментација

Вриењето на водени раствори или потопување на цврсти предмети во врела вода

на 100 ° C за 30 мин не гарантира стерилност. Ги убива повеќето вегетативни клетки, но
не сите ендоспори. За да се убијат ендоспорите, потребно е наизменично вриење или
тиндализација. Ова вклучува изложување на материјалот за да се покачат температурите
и да се убијат вегетативните клетки, проследено со инкубација на 37 ° C за да се
овозможи 'ртење на спорите и да формирање нови вегетативни клетки. Втората
изложеност на покачена температура ги убива новорастечките вегетативни клетки.

Топлата стерилизација најчесто се употребува при конзервирање и флаширање, а

третманите со ултра-висока температура (UHT) се користат во некои стерилни процедури
за пакување. Пастеризацијата е поблага термичка обработка која се користи за
намалување на бројот на микроорганизми во производите или храната што е
чувствителна на топлина и не можат да издржат пролонгирано изложување на високи
температури. Сериската пастеризација на 63 °C/ 30 мин се користи за полни шишиња;
сепак, флеш пастеризација на 72 °C за 15s може да биде најпосакувана за одредени
видови на храна и пијалоци. На пример, млеко и пиво бидејќи има помалку несакани
ефекти врз квалитетот или вкусот. При пастеризација на млеко, времето и температурата
што се користат се насочени кон убивање на патогените кои се пренесуваат преку
млекото, особено на стафилококи, стрептококи, Brucella abortus, Mycobacterium bovis и
Mycobacterium tuberculosis.

НИСКА ТЕМПЕРАТУРА

Овие третмани вклучуваат ладење или замрзнување. Организмите обично не се

убиваат, но се инхибира растот или расте многу бавно на температура под 5 °C. Храна
што може да се расипе се чува на ниски температури за да се забави стапката на
микробен раст и проследеното расипување. Често, тоа е психротрофи, а не вистински
психрофили, кои се причина за расипување на храна во ладилниците.

НИСКА АКТИВНОСТ НА ВОДАТА

Ова е широко користен метод за зачувување на храната, особено за овошјето,

зрнестите производи и некои производи од месо. Методите вклучуваат отстранување на
вода од производот со помош на топлина или сушење со замрзнување; алтернативно,
активноста на водата може да се намали со додавање на раствори, обично сол или
шеќер.

33
ЗРАЧЕЊЕ

Микробрановите, UV, X и γ зрачењето може да се користат за уништување на

микроорганизмите. УВ зрачењето е ефикасно, но неговата употреба е ограничена бидејќи
врши стерилизација само на површината, затоа што не продира во стакло, нечистотии,
вода и други супстанции. Третманот со јонизирачко зрачење најчесто вклучува Х-зраци
или γ-зраци. Ова е особено ефективно поради неговата способност да продира во
материјалот.

Зрачењето се користи комерцијално за стерилизирање на предмети како Петри, а

во некои земји, зачините, овошјето и зеленчукот се озрачени за да го зголемат својот век
до 500% со уништување на штетните микроорганизми. Процесот е релативно скап, и
поради природата на прехранбените материјали и дозите, не се убиваат сите организми.
Зрачење исто така може да уништи некои витамини. Во некои храни нивоата на витамин
Ц и Е може да се намалат за 5-10% и до 25%, соодветно. Таквите третмани не се
соодветни за сите производи; на пример, кога се озрачува пивото и некои шампони, може
да се генерира водороден сулфид.

Зрачењето на храна не е прифатен во целиот свет. Во моментов, околу 40 земји

имаат усвоено законодавство кое дозволува употреба за одредени материјали. Сепак,
како што времето поминува, се здобива со поголемо прифаќање, особено заради
зголемената инциденца на болести што се пренесуваат преку храна, како што се E. coli
0157:H7. Во САД, користењето на овие техники се применува при третмани на говедско,
јагнешко и свинско месо со одобрување од страна на американската администрација за
храна и лекови (FDA).

ИМПУЛСНО ЕЛЕКТРИЧНО ПОЛЕ СО ВИСОК ИНТЕНЗИТЕТ

Ова е уште еден не-термички третман и вклучува изложување на материјалот на

електрично поле од 15-20 kV/cm за само неколку милисекунди или помалку. Основниот
механизам за инактивација на клетките не е целосно разјаснет, но се смета дека вклучува
распаѓање на мембраните преку електропорација (т.е. формирање на порите во
мембраните). Се смета дека третманите со импулсно електрично поле со висок
интензитет, во иднина, би можеле да имаат неколку апликации, вклучувајќи го
зачувувањето на храна.

Стерилна филтрација

Стерилната филтрација вклучува физичко отстранување на сите клетки од течноста

или гасот. Особено е корисно за стерилизирање на топли лабилни раствори на
антибиотици и други лекови, амино киселини, шеќери, витамини, медиуми од животински
култури и некои пијалаци. Сепак, крајните производи не може да бидат без вируси па
затоа ултрафилтрација е неопходна за отстранување на вирусите. Постојат три главни
типови на стерилни филтери:

34
 1. длабинските филтри се дебели влакнести или грануларни филтри кои ги
отстрануваат микроорганизмите со физички скрининг, затворање и адсорпција;

2. мембрански филтри се тенки филтри со дефинирани големини на пора, обично

од 0,2 или 0,45 мм, преку кои микроорганизмите не можат да поминат; и

3. филтер за воздух кој ги апсорбира ПМ честичките со висок степен на

ефикасност (HEPA) се користат за биолошки безбедносни кабинети и простории
за да се стерилизира воздухот кој циркулира во заградениот простор.

Контрола на микробниот раст со хемиски агенси

Хемиските антимикробни агенси може да се користат за убивање на

микроорганизми или за инхибиција на нивниот раст и може да бидат од природно или
синтетичко потекло. Тие вклучуваат хемиски конзерванси, средства за дезинфекција,
антисептици и лекови кои се користат во антимикробната хемотерапија. Некои од нив
исто така се користат како течни и гасовити стериланти. Овие се многу токсични и ги
убиваат сите форми на живот, на пр. формалдехид, глутарилдехид, етилен оксид и
диетил пирокарбонат.

АНТИСЕПТИЦИ И СРЕДСТВА ЗА ДЕЗИНФЕКЦИЈА

Антисепсис е спречување на инфекција на живото ткиво. Се постигнува со

употреба на антисептички микробиоцидни агенси кои не им штетат на кожата и мукозните
мембрани, но не треба да се земаат внатрешно. Пример: јоден раствор, алкохоли и
кватернарни амониумски соединенија (Табела 2.5). Средства за дезинфекција се агенси
кои ги убиваат микроорганизмите, но не мора да значи дека ги убиваат и нивните спори.
Тие не се доволно безбедни за директна примена на живи ткива и се користат на неживи
предмети како што се маси, подови, прибор итн. Хлорот, хипохлорите, хлорните
соединенија и фенолите се користат како средства за дезинфекција. Дезинфициенсите и
антисептиците се разликуваат врз основа на тоа дали се безбедни за примена на мукозни
мембрани. Често, безбедноста зависи од концентрацијата на соединението. Некои
фенолни соединенија, на пример, се користат како средство за дезинфекција со висока
концентрација, но при ниски концентрации се погодни за употреба како антисептици
(слика 2.7).

Табела 2.5 Заеднички хемиски антимикробни агенси кои се користат како антисептици, средства
за дезинфекција,конзерванси без храна и стериланти

35
Хемиски Акција
Алкохоли Денатурација на липиди и
Етанол (50-70%, v/v) растворувач на липиди
Изопропанол (50-
70%, v/v)
Формалдехид (50%) и Реагира со NH2, SH и COOH
Глутаралдехид (5%) групи. Високо реактивен
(ладна стерилизација)
Донор на Види формалдехид
формалдехид (на
пример, Гермал 115-
имидазолидинил уреа
ефикасен на 0,3%)
Тинктура од јодид (2% Инактивира протеини
во 70%, v/v алкохол)
Хлор (Cl2) гас Форми хипохлорна
киселина (HClO), силен
оксидирачки агенс
Cl2 + H2O → HCl + HСlO
HClO → HCl + O (насценден
кислород, моќен оксидирачки
агенс)
Сребро нитрат (AgNO3) Преципитира протеини
Меркурен хлорид Ги инактивира протеините со
реакција со сулфхидрилни
групи
Кватерни амониум Ги нарушува клеточните
соединенија, на пр. мембрани
цетримид и Катјонски сурфактанти
бензалкониум хлорид Активноста е намалена со
органска материја,
поефикасни против Грам (+)
одтколку кон Грам (-)
бактерии, квасци или мувли.
Употреба
Се користат како средства за
дезинфекција и антисептици;
не ги убива ендоспорите
Антисептик, се користи на
кожата
Дезинфициенси, ги
уништуваат и ендоспорите со
висока концентрација, може да
ја иритираат кожата; некои
канцерогени
Предности во однос на
слободниот формалдехид, се
користи во козметиката
Антисептик, се користи на
кожата
Дезинфекција на водата за
пиење; општа дезинфекција
Општ антисептик и се користи
во фармацевтските производи
за очите
Средство за дезинфекција,
иако повремено се користи
како антисептик на кожата
Антисептици на кожа и
средства за дезинфекција на
прибор за храна, ниска
токсичност. Се користи во
офталмолошки препарати на
0,001% (w / v)
36
 Брз ефект и зголемена
активност со EDTA, бензил
алкохол и некои др.
соединенија

Фенолни соединенија Денатурација на протеини и Антисептици на ниски

нарушување на клеточните концентрации, дезинфизиенси
мембрани на високи концентрации

Фенол Поефективен против Грам (+) 0,5% (w/v) во козметиката и

бактерии тоалетите; забелешка: 0.5%
(w/v) раствор се користи како
стандард со кој се мерат
другите антимикробни агенси

Орто-крезол Сличен на фенолот 0.3% (w/v) се користи во

инјективите, конзерванси за
креми и маст

Хлорокрзеол Поефективен од фенол и 0.1% (w/v) се користи во капки

орто-крезол за очи и инјективи, кожни
креми и масти
Хлороксиленол Активност против Грам (-)
бактерии зголемена со Се кристи во многу козметички
додавање на EDTA препарати

Стерилизирање на Алкилирачки агенс, особено

гасови на пр. етилен на сулфхидрилни групи
оксид, диетил Средство за дезинфекција; се
пирокарбонат користат за стерилизирање на
топлински осетливи предмети
Широк спектар против Грам како што се гума и пластика.
(+) и (-) бактерии, габи, широк Убива спори и вируси
Бронопол рН опсег од 3-8, влијае на
(2-бромо-2-нитропропан- ензимите на мембраните и Конзерванси за горива, бои,
1,3-диол) дехидрогеназите текстил и особено козметика и
лекови, кои се користат на
0.01-0.02% (w/v)

Сл. 2.7 Примери на хемиски антисептици, средства за дезинфекција и конзерванси за

храна.

37
Алкохоли

Етанол Изопропанол

Алдехиди

Формалдедхид Глутаралдехид

Фенолики

Фенол Орто-крезол Хлорокрезол Хексахлорофен Триклосан

(ди- (3,5,6-трихлоро-2- (5-хлоро-2- (2,4-

хидроксифенил) метан) дихлорофенокси) фенол)

Кватерни
амониум
соединенија

n= 12, 14 или 16 n= 8 до 18

Цетримид Бензалкониум хлорид

(мешавина на додецил-тетрадецил- и (мешавина од алкилдиметилбензил-
хексадецил-триметиламониум бромид) амониум хлориди)

Бензоични
киселини и
нивни
соединенија Бензоична киселина p-хидроксибензоат
(R = метил, етил, пропил, бутил или бензил)

38
Сорбинска
киселина и
бронпол

Сорбинска киселина Бронопол

(2,4-хексадиеноична киселина) (2-бромо-2-нитропропан-1,3-диол)

Табела 2.6 Заеднички конзерванси за храна и нивна употреба

Конзерванс Ефективна Употреба

концентрација

Оцетна киселина 0.4% (w/v) Се користи во печива

Бензоева киселина (Е210), 0.1% (w/v) Антимикробни агенси во

бензоат и парабени * 0.01–0.05% (w/v)* маргарин, јаболкова киселина,
безалкохолни пијалаци,
козметика итн.

Млечна киселина 0.3% (w/v) Антимикробно средство во

сирење, матеница, јогурт и
кисела храна

Нисин (Е234) 50–500IU/g; ефективни Се употребува во

против Грам (+) бактерии; преработеното сирење,
особено корисни против другите млечни производи и
формирање на спори конзервираните производи
кисела pH

39
Пропионска киселина (Е280) 0.3% (w/v) Антифунгално средство во леб,
и пропионати торта, сирење, суво овошје

Натриум нитрит (Е250) 0.02% (w/v) повеќе Антибактериски агенс во суво

ефикасни на месо и риба. Го забавува
pH 5.0–5.5 растот на Clostridium botulinum.
Проблеми поради формирање
на нитрозамини при готвење

Сорбинска киселина (Е200) и 0.2% (w/v) Антифунгални средства во

сорбати сирење, сирупи, колачи,
овошни сокови, итн.

Сулфур диоксид (E220), 0.02–0.03% (w/v) активната Антимикробен агенс во сувото

сулфити форма е недисоцирана овошје, грозје, меласа и
сулфурна киселина пијалоци. Ги инхибира габите и
бактериите. Голема примена
во минатото, а денес се
намалува употребата поради
индукција на астматични
напади кај чувствителни
индивидуи

АНТИМИКРОБНИ КОНЗЕРВАНСИ ЗА ХРАНА И ДРУГИ ПРОИЗВОДИ

Овие соединенија се најчесто статски агенси кои се користат за да го инхибираат

растот на микроорганизмите во храната и оние во фармацевтски или козметички
производи кои можат да се ингестираат (Табела 2.6 и Сл. 2.7). Постојат релативно малку
соединенија одобрени за овие цели. Повеќето земји користат три категории на
класификација за "конзерванси додадени во храната", врз основа на оние издадени од
FDA (Food and Drug Administration). Група 1 се природни органски киселини (млечна,
лимонска, итн.); додека групата 2 содржи супстанции кои се класифицирани како
генерално безбедни, во кои спаѓаат и други органски киселини (бензоични, пропионски,
сорбински, итн.), парабенни (естри на пара-хидроксибензоева киселина) и SO2. Други
соединенија кои се покажаа безбедни за човекот или животните, не можат да се стават во
група 1 или 2, па затоа се ставаат во друга групата 3. Обично солите, шеќерот, оцетот,
зачините и масла имаат некое дејство на конзерванси, но не се класифицирани како
"додадени конзерванси". Очигледно, секој конзерванс што се користи во храната, освен
да биде безбеден, би требало да нема ни вкус ни арома. Минималната концентрација
треба да се додаде и конзервансите не смеат да се користат за прикривање на лошата
производна пракса.

40
 Во случај на органски киселини и парабени, доаѓа до нивна недисоцирана форма
која ги покажува антимикробните својства. Нивните вредности pKa (рН во која има 50%
дисоцијација на молекули) лежат во опсегот pH 3-5. Како што pH паѓа, концентрацијата на
недисоцираната форма се зголемува, со што се зголемува антимикробната активност.
Сепак, над pH 5,5-5,8 повеќето не се ефикасни, освен сорбинска киселина и парабените.
Тие ја задржуваат антимикробната активност до pH 6,5 и pH 7,0-8,0, соодветно. Како
резултат на тоа, парабените имаат широко распространета употреба во храната,
фармацијата и козметиката, особено бидејќи се без вкус, без боја и стабилни. Парабените
имаат висок LD50 од 8 g/kg и имаат одобрение од Европската заедница и од FDA
(забелешка: LD50 е смртоносна доза на супстанција, во грамови по килограм телесна
тежина на животни за тестирање, како што се глувци, при што 50% од популацијата се
убиени). Единствен проблем со парабените е тоа што се чувствителни на ниско ниво на
сензибилизација изложени од страна на некои поединци, нивната тенденција да се
разложат на масло, особено растителни масла и нивната редуцирана ефикасност во
присуство на глицерол и етилен гликол. Парабените инхибираат многу бактерии, квасци и
габи, но се многу помалку ефикасни против Грам-негативните бактерии. Се смета дека
дејствуваат на микробни мембрани, но исто така може да влијаат на метаболизмот на
нуклеинската киселина. Ефективните концентрации на парабени вообичаено се 0.01-
0.05% (w/v). Мешавините често се користат бидејќи изгледа дека имаат синергетско
дејство, на пр. два дела метил парабен плус еден дел пропил парабен.

Само мал број микробиолошки производи, покрај органските киселини, се користат

како конзерванси за храна. Нормално, антибиотиците не се прифатливи во човечката
храна поради потенцијалниот развој на отпорни видови и можно нарушување на
микробната флора на цревата или алергиските реакции. Само низин, а во помала мера и
натамицин, во моментов имаат апликации во храната.

Други можни биолошки конзерванси се железо-врзувачки лактоферин; авидин,

хелатор на биотин; оваинхибитор, инхибитор на протеаза; и лактопероксидаза, оксидатор
на SH групи. Лизозимот, кој предизвикува лиза на бактериски клетки, може да се користи
како конзерванс, но има ограничен бактериолитички спектар. Слични бактериолитички
ензими, како што се видовите од Polysphondylium, може да бидат во крајно покорисни.

Антимикробна хемотерапија

Антимикробната хемотерапија вклучува контрола или уништување на

микроорганизмите што предизвикуваат болести во ткивата на луѓето и другите животни.
Веројатно најважното својство на клинички корисен антимикробен агенс е неговата
селективна токсичност, односно агентот дејствува да го инхибира или убие патогениот
микроорганизам, но има мал или нема никаков токсичен ефект врз домаќинот.
Селективната токсичност е полесно се постигнува при лекување на бактериска болест,
поради структурни и функционални разлики меѓу прокариотските бактериски клетки и
домаќините, еукариотските животински клетки. Главни разлики се: отсуството на клеточни

41
ѕидови во животинските клетки; големината на нивните рибозоми, освен
митохондријалните рибозоми; и специфични детали за метаболизмот.

Хемиските антимикробни агенси се од синтетичко потекло, додека

антибиотиците често се дефинираат како 'органски соединенија со ниска молекуларна
маса, произведени од микроорганизмите, кои убиваат или инхибираат други
микроорганизми'. Сепак, поширока дефиниција на антибиотикот вклучува природни
хемиски производи од било кој тип на клетки кои го убиваат или го инхибираат растот на
другите клетки. Некои антибиотици сега можат да бидат целосно хемиски синтетизирани
или природните антибиотици може да се хемиски модифицирани за да се подобрат
нивните способности.

СИНТЕТИЧКИ ХЕМИКАЛИ УПОТРЕБЕНИ ВО АНТИМИКРОБНАТА

ХЕМОТЕРАПИЈА

Многу синтетички хемотерапевтски агенси се конкурентни инхибитори кои често се

нарекуваат антиметаболити и може да бидат бактериостатски или бактерицидни.
Повеќето се "аналози на факторот за раст", кои се структурно слични на микробиолошки
фактор за раст, но не можат да ја исполнат својата метаболичка функција. Некои од нив
се аналози на пурински и пиримидински бази кои се инкорпорирани во нуклеинските
киселини, но не се во состојба да формираат функционални базни парови. Следствено,
процесите на репликација и транскрипција се нарушени.

Сулфонамидите се првите соединенија кои ги потиснале бактериските инфекции

селективно. Тие ја инхибираат синтезата на тетрахидрофоличната киселина (THF), која е
од суштинско значење за реакциите на трансфер на еден јаглерод. Фолната киселина,
исто така, функционира како коензим за синтеза на пурински и пиримидински бази во
нуклеинските киселини. Сулфонамидите се структурно слични со пара-аминобензоева
киселина (PABA) или нејзини деривати, кои служат како супстрати за ензимите во патот
за THF. Тие конкурентно ја инхибираат синтезата на фолна киселина, која го спречува
растот на микроорганизмот. Селективноста е обезбедена бидејќи животинските клетки не
ја синтетизираат сопствената фолна киселина: тие мора да го добијат претходно
направениот витамин од нивната исхрана.

42
 Кинолоните, како што е налидиксичната киселина, се синтетски хемотерапевтски
агенси кои се бактериоцидни, убивајќи главно Грам-негативни бактерии. Се врзуваат и ја
инхибираат ДНК-жиразата (топоизомераза). Овој ензим е од суштинско значење за време
на репликацијата на ДНК, бидејќи овозможува да се релаксираат и ре-формираат ДНК
суперспиралите.

АНТИБИОТИЦИ

Во моментов, повеќето клинички корисни антибиотици се произведуваат од

микроорганизмите и се користат за лекување на бактериски инфекции. Антибиотиците
можат да имаат цидни или статски ефекти врз низа микроорганизми. Тие се
класифицирани според нивниот опсег на ефективност и општата микробиолошка група на
која дејствуваат против, т.е. антибактериски, антифунгални или антипротозоални. Опсегот
на бактерии или други микроорганизми е засегнат од специфичен антибиотик и се
изразува како свој спектар на дејство. Се смета дека антибиотиците се ефективни
против широк спектар на Грам-позитивни и Грам-негативни бактерии и имаат широк
спектар. Ако тие се претежно ефикасни против Грам-позитивни или Грам-негативни
бактерии, тие имаат тесен спектар; и антибиотиците со ограничен спектар се
ефективни против само еден организам или болест.

Антибиотиците се соединенија со ниска молекуларна маса кои се произведуваат

како секундарни метаболити главно од почвените микроорганизми. Тие се не-протеински
молекули, иако постојат некои пептидни антибиотици. Повеќето продуцентски
микроорганизми формираат спора или друга хибернација. Исто така, се смета дека имаат
поврзаност, покрај временски, така и помеѓу производството на антибиотици и процесите
на спорулација. Меѓу филаментозните габи, значајни производители на антибиотици се
Penicillium и Cephalosporium (Acremonium), кои се главен извор на β-лактамски
антибиотици, на пр. пеницилин и сродни соединенија. Во рамките на бактериите,
филаментозните актиномицети, особено многу видови Streptomyces, произведуваат
различни антибиотици, вклучувајќи аминогликозиди, макролиди и тетрациклини. Bacillus
видовите кои формираат спори и некои слични на нив произведуваат полипептидни
антибиотици, како што полимиксини и бацитрацин.

Антибиотиците покажуваат четири примарни начини на дејство.

Инхибиција на синтезата на клеточниот ѕид

Инхибиторите на синтезата на бактерискиот клеточен ѕид/обвивка, обично се

насочени кон одреден чекор во формирањето на пептидогликанот. Најпознати примери се
β-лактамските антибиотици, пеницилините и цефалоспорините. Пеницилинот бил првиот
антибиотик кој бил откриен и употребен терапевтски. Природните пеницилини, како што
се пеницилин G (слика 2.8) или пеницилин V, се комерцијално произведени со

43
ферментација на Penicillium chrysogenum. Повеќето пеницилини се деривати на β-
аминопенициланска киселина и како и сите β -лактамски антибиотици, содржи β
-лактамски прстен, кој е од суштинско значење за активноста. Прицврстените странични
синџири можат да обезбедат други карактеристики, како отпорност на ензимска
деградација и механизмот на пенетрација на клеточниот ѕид. Пеницилинот G и V се
сметаат за тесен спектар, бидејќи тие не се ефикасни против Грам-негативните бацили.
Исто така, пеницилинот G е нестабилен во кисели услови, затоа оралната
администрација не е ефикасна поради ниската pH вредност во стомакот. Во обид да ги
надминат овие недостатоци, се развиваат полусинтетички форми со подобрени особини
над природните пеницилини. Главниот дел од молекулата, β-аминопенициланска
киселина, се добива со ферментација и потоа хемиски се модифицира со додавање на
различни странични синџири. Подобрените својства изложени од овие полусинтетички
пеницилини вклучуваат отпорност на пеницилиназа, соодветност за орална апликација и
зголемен спектар на активност, на пр. ефективност против Грам-негативни бацили.

Ацилен супституент 6-аминопенициланска киселина

Тиазолиден прстен

β-Лактамски прстен

Сл. 2.8 Структурата на Penicillin G.

Пеницилините ја инхибираат синтезата на пептидогликан и немаат ефект врз

утврдените клеточни ѕидови. Како резултат на тоа, тие се бактерицидни за активно
растечките клетки, кои преку дејството на пеницилинот стануваат чувствителни на
осмотски стрес. Пептидогликанот на клеточниот ѕид е направен во три фази. Третиот
чекор вклучува карбоксипептидази и транспептидази во финалното вкрстување меѓу
пептидните странични синџири, со што се формира цврста матрикс. Пеницилините имаат
структурна сличност со крајните на остатоците на D-аланин–D-аланин од малите пептиди
вклучени во пептидогликанските вкрстени врски. Така, пеницилините се чини дека
делуваат како аналогни супстрати. Тие ковалентно се врзуваат за транспептидазата
преку β-лактамскиот прстен и го спречуваат понатамошното функционирање на ензимот.
Како резултат на тоа, клеточниот ѕид кој го содржи овој лабаво формиран пептидогликан
44
е многу послаб и клетката се подложува на лиза. Исто така, пеницилините може да
предизвикаат одредени автолитички дејства.

Цефалоспорините се произведуваат од видовите на Cephalosporium (Acremonium) и

се β-лактамски антибиотици со суштински ист режим на дејство како пеницилините. Тие
имаат ниска токсичност и прилично поширок спектар од природни пеницилини и се
особено корисни за пациенти кои се алергични на пеницилини.

Ванкомицин, производ на Streptomyces orientalis, стана клинички значаен

антибиотик од појавата на метицилин-резистентни соеви на Staphylococcus aureus
(MRSAs). Тој исто така ја инхибира синтезата на пептидогликанот, но тоа го прави со
врзување за групата D-аланин–D-аланин на страничниот синџир на N-ацетил гликозамин-
N-ацетил-мурамска киселина-пентапептид субединица, инхибирајќи нивно вклучување во
новиот пептидогликан. Бацитрацин, пептиден антибиотик произведен од видовите
Bacillus, исто така ја спречува синтезата на пептидогликан. Тоj дејствува преку инхибиција
на ослободените субединици од пептидогликанот од молекулата на липид-носачот што ги
пренесува преку цитоплазма.

Инхибитори на клеточната мембрана

Кај бактериите, интегритетот на цитоплазматската мембрана е од витално

значење за транспорт на хранливи материи и за производство на енергија. Надворешните
мембрани на Грам-негативните бактерии, исто така, имаат заштитна улога. Сите агенси
што ги нарушуваат овие мембрани ги убиваат микробните клетки. Сепак, еубактериските
и еукариотските мембрани имаат слични структури и својства. Затоа, антимикробните
соединенија со овој модел на дејство се ретко доволно специфични за да им се дозволи
нивната системска употреба. Полимиксинот е единствениот клинички важен
антибактериски антибиотик кој се фокусира на мембраната. Тој дејствува со врзување на
мембрански фосфолипиди за да се интерферира со мембранската функција. Овој
антибиотик е главно ефикасен против Грам-негативни бактерии, но вообичаено е
ограничен на локална употреба поради штетните несакани ефекти.

Габичните инфекции генерално се многу потешки за лекување отколку бактериски

болести. Сличноста помеѓу габите и животински домаќин (и двете се еукариотски) ја
ограничува способноста на лекот да има селективна точка на напад. Сепак, една
потенцијална цел е ергостеролот, компонента на габични клеточни мембрани, која се
заменува со холестерол кај вишите еукариоти. Полиените макролидни антибиотици, како
што се нистатин и синтетичките азоли, ја користат оваа разлика. Азолите ја инхибираат
биосинтезата на ергостеролот, додека нистатинот се врзува за ергостеролите за
дестабилизација на габичната мембрана.

45
Инхибитори на протеинската синтеза

Синтезата на протеините е комплексен процес кој вклучува транскрипција на ДНК

во мРНК, која потоа се преведува за да формираат полипептиди преку интеракција со
рибозомите и транспортната РНК. Ова обезбедува бројни специфични цели за различни
групи на антибиотици. Неколку антибиотици се насочени кон преодниот чекор, каде што
нивниот напад е секогаш на рибозомот, наместо на стадиумот на активирање на амино
киселината или на нивната приврзаност кон тРНК. Што се однесува на селективната
токсичност, среќата е што постои голема разлика помеѓу прокариотската и еукариотската
рибозомална структура. Постои разлика во рибозомите, еукариотски 80S рибозоми, се
состојат од 60S и 40S субединица; додека прокариотски 70S рибозоми се составени од
50S и 30S субединица. Оваа разлика ја зема предвид селективната токсичност на неколку
антибиотици кои ја насочуваат оваа точка во синтезата на протеините. Мнозинството има
афинитет или специфичност за 70S, наспроти 80S, рибозоми. Меѓутоа, бидејќи
митохондриите на еукариотските клетки содржат 70S рибозоми, многу слични на оние на
бактериите, антибиотиците кои се насочени кон 70S рибозомите можат да имаат
негативни ефекти врз клетките домаќин.

Важни антибиотици со овој модел на дејство се аминогликозиди, макролиди и

тетрациклини. Аминогликозидите, особено стрептомицин, канамицин, тобрамицин и
гентамицин, се продукти од видови на Streptomyces. Тие се врзуваат за бактериските
рибозоми и го спречуваат започнувањето на протеинската синтеза. Макролиди, како што
се еритромицин и олеандомицин, содржат големи лактонски прстени поврзани со амино
киселини преку гликозидни врски. Тие се врзуваат за бактериската 50S рибосомална
субединица, која интерферира со 'издолжување' на протеинот со пептидил трансфераза
или спречува транслокација на рибозомот.

Тетрациклините исто така се продукти на Streptomyces, иако некои полусинтетски

деривати се новопроизведени. Тие вклучуваат тетрациклин, хлортетрациклин,
окситетрациклин и доксициклин, кои се широкораспространети антибиотици, активни
против двете Грам-позитивни и Грам-негативни бактерии. Овие соединенија го блокираат
врзувањето на аминоацил-тРНК на А-местото од рибозомот. Тетрациклините ја
инхибираат синтезата на протеините од изолираните 70S и 80S рибозоми. Сепак, и покрај
ова очигледно општо дејство, тие покажуваат многу ниска токсичност кај животните. Ова е
затоа што повеќето бактерии поседуваат активен транспортен систем за тетрациклин кој
резултира со интрацелуларна акумулација на антибиотикот до концентрации повисоки од
50 пати отколку во надворешниот медиум. Како последица на тоа, нивото на тетрациклин
во крвта кое е безопасно за животинските ткива, бидејќи тие не акумулираат инхибиторни
нивоа, може да ја спречи протеинска синтеза во инвазијата на бактериите.

Ефекти врз нуклеинските киселини

Неколку антибиотици можат да го блокираат растот на клетките со

интерферирање со синтезата на ДНК или РНК. Сепак, мнозинството нема терапевтска
46
употреба, бидејќи тие се неселективни, кои влијаат на и на двете, микробиолошки и
животнски клетки. Една група која покажува селективност се рифамицините од видовите
на Streptomyces. Најпознат е рифампицин, полусинтетички дериват на рифамицин. Тој е
релативно специфичен кон бактериската ДНК независна РНК полимераза, која нема
ефект врз РНК полимеразата од животинските клетки или ДНК полимеразата.
Рифампицинот ја блокира синтезата на мРНК со врзување на β-субединицата на
полимеразата. Ова се чини дека го блокира внесот на првиот нуклеотид, кој е неопходен
за активирање на ензимот.

Новобиоцин, како хинолони, е инхибитор на ДНК-жиразата. Овој антибиотик е

произведен од страна на Streptomyces niveus и има некои клинички апликации. Сепак,
обично се користи како резервен лек, кога другите антибиотици не успеале да ја излечат
инфекцијата.

47