Вежби

Хумана генетика 1
БЛОК 3
Д-р Теодора Брњарчевска Блажевска
1. Должински полиморфизам на
рестрикциски фрагменти
2. Реверзна хибридизација
3. Вестерново дамкосување
1. Должински полиморфизам на рестрикциски фрагменти

 ДПРФ или RFLP (restriction fragment length polymorphism) како термин има 2
значења:
• Карактеристика на ДНК молекулите по која може да се разликуваат
• Лабораториска техника која ги користи овие карактеристики за споредба на ДНК
молекулите
 ДПРФ како техника се користи за:
• Генетски фингерпринтинг
• Тест на татковство
• Детекција на точкести мутации
 1. Должински полиморфизам на рестрикциски
фрагменти

Оваа техника се состои од неколку чекори

• Изолација на ДНК ✓
• Полимеразно верижна реакција ✓
• ДНК фрагментација
• Гел електрофореза ✓
Методот на ДПРФ започнува со екстракција и пурификација на ДНК од индивидуата
која ја тестираме. Пурифицираната ДНК се амплифицира со ПВР. Потоа ДНК
молекулата се сече со рестрикциски ензими и притоа се добиваат рестрикциски
фрагменти. Рестрикциските фрагменти понатаму се сепарираат по должина со агарозна
гел електрофореза и се анализираат.
 1. Должински полиморфизам на рестрикциски
фрагменти
 ДНК фрагментација- фрагментирање на молекулата на ДНК со помош
на рестрикциски ендонуклеази
• Рестрикциски ендонуклеази- се ензими кои ја сечат двоверижната ДНК
молекула, овие ензими се способни да направат две засекувања на ДНК
молекулата низ секој фосфатен скелет без да направат оштетување на
базите. *Се развиле во бактериите како механизам за одбрана од бактериофаги
• Места на сечење- засекувањето настанува само во секвенцата која е
позната како препознавачка секвенца, одредена специфична
нуклеотидна секвенца (обично тоа се места со големина од 4-6 бп)
• Растојанието помеѓу рестрикциските места се разликува кај различни
индивидуи (како резултат на базни супституции, додавања, делеции
или преуредување на секвенците), некои од овие промени продуцираат
нови рестрикциски места или ги отстрануваат постоечките, а со тоа се
разликува и должината на добиените фрагменти.
 1. Должински полиморфизам на рестрикциски
фрагменти

Примена на техниката:
• Докажување на татковство- должината на фрагментите добиени со ДПРФ може да се
користи за докажување на генетска врска меѓу индивидуите бидејќи децата ги
наследуваат генетските елементи од своите родители.
Пример:
Да се одреди дали Јован е татко на Горан.
Во ова сценарио, ДНК е изолирана од
3 пациенти (мајка, дете и евентуален татко)
и подложена на ДПРФ анализа.
Според резултатите од сликата Јован е
можен татко, бидејќи Горан го има фрагментот 12.4кб
од Ивана, и фрагментот 4.3кб од Јован. Сепак постои
можност и друг човек да има сличен ДПРФ. За да се добие посигурен
резултат се тестираат многу повеќе локуси.
Мала е веројатноста двајца мажи да имаат ист
ДПРФ за повеќе локуси, па во тој случај татковството може
да се докаже.
 1. Должински полиморфизам на рестрикциски
фрагменти

• Детекција на точкести мутации со ДПРФ

Многу точкести мутации создаваат или укинуваат постоечко рестриктивно место. Па
ДПРФ техниката овозможува детекција и карактеризирање на овие мутации.

Во дадениот пример, точкестата мутација доведува

до губење на рестрикциското место за одреден
рестрикциски ензим што резултира со различно
долги фрагменти кај пациентите со нормална копија
На генот за разлика од пациентите кои имаат мутација.
На сликата е даден пример за тоа како би изгледале
фрагментите кај нормални и кај хомозиготи за мутацијата.
Кај индивидуите кои се хетерозиготни за дадената
мутација на гел електрофорезата би се појавиле сите три
фрагменти.
 2. Реверзна хибридизација
 Хибридизација- поврзување на комплементарни едноверижни ДНК или РНК молекули за да се
добие хибридна двоверижна молекула.
 Хибридизацијата може да настане:
• Во раствор, каде нуклеинските киселини се присутни како едноверижни нишки;
• Со целна нишка имобилизирана на филтер мембрана, и друга нишка присутна во раствор;
• Ин ситу, каде целната нишка е фиксирана на ткивни пресеци, клетки или хромозоми, а пробата е присутна во
раствор.

Во главно молекулската хибридизација подразбира

мешање на обележана нуклеинска проба
и необележана целна ДНК.
 2. Реверзна хибридизација
 Фактори кои влијаат врз хибридизацијата:
Зголемена хибридна Намалена хибридна
стабилност стабилност
Молекулски карактеристики
Должина на хибридот Долг Краток

Содржина на G-C Висока Ниска

Број на несоодветни спарувања
Мал Голем
(mismatches)
Услови на растворите
Температура Ниска Висока
Концентрација на соли (NaCl) Висока Ниска
pH Ниска Висока
Концентрација на денатурантни
Ниска Висока
раствори
 2. Реверзна хибридизација
 Метод на реверзна хибридизација
Во оваа техника се користат нитроцелулозни ленти на кои линеарно се имобилизирани
едноверижни ДНК олигонуклеотидни проби, кои треба да хибридизираат со обележани
ПВР продукти ( за таа цел се користат биотинилирани прајмери).

Чекор 1: Во кадичка се аплицира нитроцелулозната

лента и обележаниот ПВР продукт. Се врши
денатурација на двоверижните ПВР продукти со
NaOH.
Чекор 2: Се овозможуваат специфични
хибридизациски услови, при кои обележаните ПВР
продукти се врзуваат на за нив комплементарните
имобилизирани проби.
Чекор 3: Присуството на врзан ПВР продукт врзан за
специфичната проба се детектира со стрептавидин-
horseradish пероксидаза и хромоген супстрат кој го
обојува местото на позитивна проба.
 2. Реверзна хибридизација
 Интерпретација на резултатите

Пример: На нитроцелулозните ленти се аплицирани повеќе олигонуклеотидни проби

за нормални и мутирани варијанти од испитуваниот ген.
Во зависност од тоа каде има пребојување(односно комплементарно поврзување
на пробата со ПВР продуктот), го отчитуваме генотипот на пациентот.
Можните варијанти се нормален, хетерозигот и хомозигот за испитуваната мутација.
 3. Вестерново дамкосување​

 Дамкоување (blotting)означува трансфер на биолошки примероци од гел на мембрана
, и нивно последователно детектирање​
 Western blot рутинска алатка за квалитативна анализа на протеини (во основа на оваа
техника лежи имунолошка антиген-антитело реакција)
 
Оваа техника се изведува во неколку чекори:​
• Раздвојување на протеините на гел електрофореза, најчесто на полиакриламиден гел​
• Трансфер на вака сепарираните протеини на нитроцелулозна мембрана​
• Инкубација на мембраната со неколку раствори, со кои ​ќе се детектира специфичниот протеин.​
 3. Вестерново дамкосување​
 Во зависност од тоа колку антитела се користат разликуваме 2 начина на детекција
на протеините: директен и индиректен​

• Кај директниот метод се користи обележано примарно антитело,

кое се врзува за протеинот нанесен на мембраната (антиген),
реагира со супстрат и создава сигнал кој може да се детектира.
• Кај индиректниот метод, примарното антитело специфично за
протеинот е необележано, а се додава секундарно антитело
обележано со ензим, кое се врзува за примарното создавајќи
видлив продукт.
3. Вестерново дамкосување​