Прва вежба:

-Однесување во микробиолошка
лабораторија
-Микроскоп, микроскопирање и
боење на микробиолошки
препарати

Асс.д-р. Кирил Михајлов

 ПРАВИЛА НА ОДНЕСУВАЊЕ ВО
МИКРОБИОЛОШКИТЕ ЛАБОРАТОРИИ

*Видови микробиолошки лаборатории

-пред влегување од лабораторија
-за време на работата во лабораторијата
(добра микробиолошка пракса)
-по излегување од лабораторија
* Што во случај на контаминација?
 Светлосен микроскоп

-оптички делови (систем од леќи) кои служат за

насочување на светлосните зраци и
зголемување на добиената слика: објектив,
окулар и кондензор со дијафрагма ( за
фокусирање на светлосните зраци и
регулирање на количината на светлина на
површината на предметното стакло).
-механичи делови: тубус, револвер, макровинт,
микровинт и масичка за поставување на
препаратот.
-извор на светлина.
 Светлосен микроскоп

• Моќта на зголемување е производ од зголемувањата

кои ги даваат објективот и окуларот. Најчесто
максималната моќ на зголемување кога се користи
објективот со имерзија кај овој микроскоп е 1000 пати.
• Резолуцијата претставува моќ на микоскопот за
разликување на две блиски точки од микроскопираниот
предмет. Таа зависи обратнопропорционално со
брановата должина на светлината која се користи и
правопропорционално со големината на аголот под кој
таа светлост паѓа на леќата на објективот (нумеричка
апертура). Резолуцијата на светлосниот микроскоп
обично е околу 220 nm
Микроскоп со темно видно поле
• Подтип на светлосен микроскоп кој има
специјален кондензор со централна
дијафрагма која ги пропушта само
латералните зраци (под агол на тотална
рефлексија), при што се добива темно
видно поле, а единствено светли се
контурите на микроорганизмот. Се користи
само за нативни препарати, најчесто за
испитување на подвижноста кај спиралните
бактерии.
 Фазно контрастен микроскоп
• Подтип на светлосен микроскоп кој има
специјален кондензор со прстенеста
дијафрагма и објектив со филтер , кои фазно
одвоените зраци (како резултат на разликите
во индексите на рефракција на структурите на
бактериската клетка) ги претвораат во разлики
на интензитетот на осветлување. Така се
добива 3Д слика и подобра видливост на
внатрешните структури на микроорганизмот.
Се користи за нативни препарати.
 Флуоросцентен микроскоп
• При микроскопирањето овде се користи УВ
светлина (живина лампа). Со самото тоа , поради
помалата бранова должина на зраците имаме
подобра резолуција. Препаратите се бојат со
флуорохроми (флуоросцеин, аурамин), материи
кои апсорбираат невидлива УВ светлина, а потоа
емитираат светлина во видливиот дел од спектарот.
Флуорохромите во препаратите е потребно да се
врзат за микроорганизмите за да бидат видливи.
Најчесто тоа се врши со посредство на антиген-
антитело комплекс и тогаш зборуваме за
имунофлуоресцентна микроскопија.
 Електронски микроскоп
• Тука наместо светлина се користи електронски
сноп, а наместо леќи имаме електромагнетни
полиња кои ги насочуваат електроните. Во тубусот
има вакум. Препаратите се изработуваат во тенок
пресек под 100 nm поради слабата продорна моќ
на електроните, а потоа контрасно се обложуваат
со тешки метали (негативно боење). Овој тип на
микроскоп има убедливо најголема моќ на
зголемување (до 100 000 пати) и резолуција (1 nm)
и поради тоа може да се користи за испитување на
вируси, па дури и молекули и атоми.
 Нативен препарат
• Нативен или необоен препарат најчесто се користи за
микроскопско испитување во паразитологијата и
микологијата. Во бактериологијата се користи поретко,
со цел да се види подвижноста на бактериите, а можно
е да се види и формата и распоредот. Тука
микроорганизмите се живи.

Нативниот препарат може да се изработи од :

-една капка, доколку станува збор за течна култура или
течен примерок од пациент;
-суспензија во капка вода од колонии на микроорганизми
израснати на цврста хранителна подлога или
примероци од пациенти земени со брис.
 Изработка на нативен препарат

а. Со еза или пипета се капнува една капка од течниот

матерјал на средината на предметното стакло или
б. На средината на предметното стакло се капнува
капка вода и со стерилна еза се прави хомогена
суспензија од една колонија од цврстата
хранителна подлога или од примерокот земен со
брис;
в. Врз суспензијата се поставува покровно стакленце
(не е пожелно да има меурчиња воздух, бидејќи ќе
се отежни микроскопирањето).
 Микроскопирање на нативен
препарат
а. Се користат суви објективи (10х и 40х)
б. Кондензорот се спушта
в. Дијафрагмата се притвора (помалку светлина
на површината на предметното стакло)
г. Со (10х) објективот се наоѓа работ на
покровното стакленце (со макровинтот), а
потоа се поставува другиот објектив (40х) во
оптичката оска и со микровинтот се изострува
сликата.
• https://www.youtube.com/watch?
v=5eL4CrjXKHM&t=1s
 Боење препарати
Бактериските клетки обично се безбојни бидејќи нивната цитоплазма е
транспарентна.
Бактериолошкото боење претставува техника која се применува со
цел :
• се овозможи подобра визуелизација на клетките и разните делови од
клетката под микроскоп (одредени боења може да ни дадат увид во
структурата и составот на бактериските клетки);
• помогне при иницијално разликување на микроорганизмите едни од
други;
• обезбеди податоци за морфологијата (формата и големината на
микроорганизмот) како и неговиот сооднос со останатите присутни
елементи во метаријалот (леукоцити, епителни клетки итн.).
 Боење препарати

- Во однос на формата обоените бактерии може да се прикажат како

стапчиња (бацили), сферични (коки) или спирални (спирохети).
Според распоредот (физичката поставеност на бактериските клетки
од ист специес) микроорганизмите може да се застапени како
единечни клетки, парови (диплококи или диплобацили), синџири,
теради (по четири), грзодови, потоа може да имаат палисаден
распоред или во фрома на кинески букви (X и Y формации).
- Сите овие податоци не ни овозможуваат целосна идентификација на
микроорганизмот но се значајни за поставување на диференцијална
идентификација. Со други зборови, изработката на обоен препарат е
еден од првите дијагностички чекори во микробиологијата.
 Бактериолошки бои
• Бактериолошките бои се раствори кои содржат обоен дел наречен хромофор. Во
зависност од електричниот полнеж на хромофорот бактериолошките бои се делат
на:
• - катјонски (базни бои со позитивно наелектризиран хромофор) кои се користат за
боење на бактериските клетки. Бактериските клетки имаат негативен полнеж на
својата надворешна површина и ги привлекуват базните бактериолошки бои што
резултира со пребојување на површината од клетката. Базни бои се: метиленско
сино, кристал виолет и сафранин.
• - анјонски (кисели бои со негативно наелектризиран хромофор) кои електростатски
се одбиваат со негативно наелектризираните бактериски клетки и служат за боење
на околината. Кисели бактериолошки бои се: еозин и кисел фушин.
• Кој тип на бактериолошка боја ќе се употреби зависи од она што барате во
препаратот, кој структурен дел сакате да го видите и што сакате да постигнете со
постапката на боење.
 Боење препарати
Постапката на боење вклучува неколку чекори:
1. Подготвување на микробиолошка размаска
На средината од чисто предметно стакло со фломастер кој не се брише се
назначува мало поле (со големина на бадем) а потоа за:
- препарат од цврста култура: во полето се капнува една капка вода а потоа со
стерилна еза се допира една колонија од цврстата хранителна подлога и се
прави суспензија во капката вода. Треба да се внимава да не се капне
премногу вода бидејќи суспенијата ќе треба да се суши на собна температура.
Исто така, треба да се внимава да не се земе цела колонија од хранителната
подлога бидејќи изработениот препарат ќе е премногу густ и боењето нема
да е ефективно.
- препарат од течна култура: откако претходно добро ќе се промеша течниот
медиум (бидејќи бактериите може да се во седиментот) со стерилна еза се
земаат една до две капки од бактерискиот бујон и се нанесуваат во полето
назначено на предметното стакло.
 Боење препарати
2. Сушење- бактериската размаска треба да ја оставите спонтано да се
исуши на собна температура без притоа дополнително да го
загревате или дувате примерокот.
3. Фиксирање со топлина- држејќи го предметно стакло за едниот крај
со внимателно, бавно движење преминете со стаклото три пати низ
средината на пламенот од бренерот или шпиртната ламба. На овој
начин се денатурираат бактериските протеини што доведува до смрт
на бактериската клетка но не и до нарушување на нејзината форма.
Мртвите бактериски клетки подобро атхерираат за предметното
стакло и подобро ги примаат бактериолошките бои.
 Видови боења
• ЕДНОСТАВНИ боења (се употребуваат за одредување на
формата/големината на бактериските клетки и нивната поставеност).
Постапката е едноставна и вклучува употреба на само една (базна)
бактериолошка боја и тоа метиленско сино, сафранин или кристал
виолет.
• ДИФЕРЕНЦИЈАЛНИ боења (се изведуваат со примена на повеќе
бактериолошки бои и како што навестува самиот назив служат за
разликување (диференцијација) на микроорганизмите. Овде се
вклучени: боењето по Грам, по Цил-Нилсен, по Љубински.
• НЕГАТИВНИ боења- најчесто се користат за прикажување на
капсулата. Се користи една боја (анјонска-кисела боја) која ќе ја
пребои околината додека пак капсулата ќе остане да се гледа како
светла непребоена зона околу бактериската клетка.
 Боење по Грам

• Боењето според Грам е една од најважните техники на боење во

микробиологијата и во поголемиот број на случаи претставува прв
чекор кон идентификација на бактериите.
• Боењето по Грам е диферинцијално боење според кое бактериите се
делат на Грам позитивни или Грам негативни.
• Процесот на боење се состои од четири дела и вклучува употреба на:
1. примарна боја-кристал виолет,
2. јод (јодот го интензивира врзувањето на примарната боја за клетката),
3. обезбојувачки агенс (ацетон или алкохол),
4. секундарна боја (сафранин или карбофуксин).
 Боење по Грам

• Грам негативните микроорганизми се разликуваат од Грам

позитивните во градбата на клеточниот ѕид.
• Во клеточниот ѕид на Грам позитивните бактерии доминира дебел
слој изграден од комплекси на протеини-јаглени хидрати познат како
пептидогликан. Пептидогликанот опфаќа 60-90% од клеточниот ѕид
на Грам позитивните микроорганизми.
• Овој слој се наоѓа и во клеточниот ѕид на Грам негативните
микроорганизми но со многу помала застапеност (10-20%). Грам
негативните бактерии во својот клеточен ѕид содржат надворешна
мембрана (која ја нема кај Грам позитивните) изградена од липиди,
полисахариди и протеини.
 Боење по Грам
• Овие разлики влијаат врз многу аспекти од функционирањето на
бактериите вклучително и врз начинот на кој бактериските клетки ги
примаат и задржуваат бактериолошките бои.
• Грам позитивните микроорганизми ќе ја примат примарната боја
(кристал виолет) која се врзува за пептидогликанот од клеточниот ѕид. Со
додавање на јодот се создава комплекс од бојата и јодот што
придонесува бојата да не може лесно да се одстрани. По додавање на
обезбојувачкото средство (алкохол) Грам позитивните бактерии ја
задржуваат примарната боја и на микроскопскиот препарат се
модри/виолетови додека пак Грам негативните ја отпуштаат односно се
обезбојуваат. Овој ефект се должи на растварање на липидите од
надворешната мембрана и отварање на пори низ кои истекува кристал
виолетот. Во последниот чекор од боењето по Грам, по додавање на
втората боја (сафранин) Грам негативните ја примаат бојата и на
микроскопски препарат се црвени.
 Боење по Грам
Постапката ги вклучува следните чекори:
1. Подготвена, исушена и фиксирана размаска се пребојува со првата боја -
најчество генцијана (кристал) виолет која се остава да стои 3 минути.
Со нежен млаз вода за околу 2 секунди, се одмива вишокот боја .
2. Размаската се прекрива со Луголов раствор (јод) во времетраење од 2 минути.
Повторно, размаската се поминува со нежен млаз вода во времетраење од 2
секунди.
3. Со помош на алкохол или ацетон, капка по капка се додека излегува боја се
прави обезбојување на размаската.
-Миење со вода.
4. Размаската се пребојува со втората боја - сафранин или карбол фуксин која се
остава да бои 30 секунди.
-Миење со вода
1. горе:бластоспори на Candida на препарат од
култура (боен по грам)
2. долу десно:Staphylococcus на директен
препарат од рана (боен по грам)
3.долу лево: Staphylococcus на препарат од
култура (боен по грам)
 Горе: Bacillus anthracis на директен
препарат (боено по Грам)
доле лево: Neisseria gonorrhoeae на
директен препарат од уретрален брис
(боено по Грам)
доле десно: Streptocococcus pneumoniae
на директен препарат од спутум
(боено по Грам)
 БОЕЊЕ ПО ЦИЛ-НИЛСЕН (Ziehl-Neelsen)

• Боењето по Цил-Нилзен е диференцијално боење кое се употребува за идентификација

на ацидо-резистентните микроорганизми кои припаѓаат на родот Mycobacterium. Ова
боење претставува “златен стандард” при дијагноза на лепра или туберкулоза. Ацидо-
резистентните микроорганизми не се составен дел од хуманата флора и детекцијата на
овие бактерии во примерок од спутум и назален брис е силно индикативна за активна
инфекција (туберкулоза или лепра).
• Ацидо-резистентните микроорганизми имаат цврст, речиси непропустлив клеточен ѕид
кој покрај пептидогликанот содржи миколична кислеина и голема количина на масни
киселини, восоци и сложени липиди. Покрај родот Mycobacterium во групата на ацидо-
алкохоло резистентни бактерии влегува и родот Nocardia (предизвикувачи на болеста
нокардиоза).
• Постапката на боење по Цил-Нилсен вклучува примена на топлина (загревање) и фенол
(бојата карболфуксин се комбинира со фенолот). Ова е со цел да се овозможи
навлегување на бојата во внатрешноста на микобактериумската клетка која инаку е
непропустлива за обичните бактериолошки бои за време на рутинските боења (како на
пр. боењето по Грам). Се смета дека главна причина за ваквата непермеабилност на
клеточниот ѕид на овие бактерии е високиот процент на восоци и масти (пред се на
миколичната кислеина!) во неговиот состав.
 БОЕЊЕ ПО ЦИЛ-НИЛСЕН (Ziehl-Neelsen)

Процесот на боење се состои од четири дела и вклучува употреба на:

• примарна боја-карболфуксин (во комбинација со фенол)-по нанесување на
бојата врз предметното стакло тоа се загрева се додека бојата не почне да
испарува, потоа се одстранува од изворот на топлина и по 5 мин. се промива
со вода. Карбофуксинот ќе се врзе за миколичната киселина од мико-
бактерискиот кл. ѕид,
• кисел алкохол-се додава за обезбојување на примерокот. По додавањето на
киселиот алкохол како силно обезбојувачко средство тој ќе ја одстрани
црвената боја (карболфуксинот) од сите клетки и микроорганизми присутни
во примерокот со исклучок на микобактериум (отука потекнува називот
ацидо-алкохоло резистентни),
• секундарна боја (малахитно зелено или метиленско сино)-втората боја ќе ја
пребои позадината со што ќе се направи контраст односно на
микроскопското видно поле бактериите од родот Mycobacterium се
прикажуваат како црвени нежни бацили на позадина каде останатите
присутни клетки се сино обоени.
Mycobacterium tuberculosis на директен препарат
обоен според Цил Нилсен
 НЕГАТИВНО ПРИКАЖУВАЊЕ НА КАПУСЛАТА СО ТУШ ПО
БУРИ

• Некои бактериски родови имаат спсобност да продуцираат капсула.

Капсулата е надворешен слој кој го штити микроорганизмот од фагоцитоза и
претставува фактор на вируленција на бактериите кои ја создаваат. Најчесто е
изградена од полисахариди, но може да се состои и од протеини. Капсулата
нема електричен полнеж односно не ги привлекува ниту анјонските ниту
катјонските балтериолошки бои.
• Најдобар начин да се прикаже капсулата е со употреба на (анјонска-кисела
боја) која ќе ја пребои околината додека пак капсулата ќе остане да се гледа
како светла непребоена зона околу бактериската клетка. Во конкретниов
пример за прикажувањето на капсулата по Бури се користи туш.
• Доколку сакаме да ја визуелизираме и бактериската клетка може да
примениме комбинација од негативно и едноставно боење. Крајниот исход е:
на црна позадина (пребоена од тушот) капсулата се гледа како светла
необоена зона околу телото на бактериската клетка кое ќе се обои со
примена на било која базна боја (на пр. карболфуксин, кристал виолет).
 Постапка на боење со туш по
Бури
1. На предметно стакленце се нанесува мала капка од бактериолошки туш, во
близина на еден од краевите на самото стакленце (прикажано на сликата)
2. Со стерилна еза се зема една колонија од културата од интерес и се
дисперзира во капката туш.
3. Со друго, чисто предметно стакленце се лизга врз предметното стакленце на
кое се наоѓа капката на следниот начин: едниот крај на чистото предметно
стакленце се позиционира на средина на предметното стакленце на кое се
наоѓа капката. Оддржувајќи остар агол, стакленцето се повлекува до
капката се додека таа не се разлее по работ на чистото стакленце, а потоа
истото се повлекува (сеуште оддржувајќи го остриот агол) во спротивна
насока со што капката се разлева во рамен, тенок и изедначен слој.
4. Предметното стакленце се суши на собна температура, не со директно
изложување на топлина
5. Размаската се облева со кристал виолет-боја која ќе ги обои бактериските
клетки, но не и нивните капсули. Се остава околу 1 минута а потоа
размаската се поставува под остар агол за вишокот боја да истече, па се
остава да се исуши. Се микроскопира со имерзија.
 Микроскопски приказ
на бактериска капсула со туш по Бури
 БОЕЊЕ ПО ЉУБИНСКИ

-Ова диференцијално боење се употребува при

идентификација на бактеријата Corynebacterium
diphtheriaе.
-Припадниците на овој специес во својата
цитоплазма имаат метахроматски гранули уште
познати како волутински гранули или Babes-
Ernst-ови зрнца. Овие гранули содржат висока
концентрација на полифосфати кои и служат како
извор на енергија на бактериската клетка.
 БОЕЊЕ ПО ЉУБИНСКИ
Боењето po Љубински се изведува етапно,
вклучувајќи ги истите чекори како и кога се бои
според Грам. Разликата е во тоа што како бои се
користат:
• примарна боја-везувин која ја пребојува
цитоплазмата на бактериската клетка во светло
окер,
• секундарна боја-пиоктанин која ги бои
метахроматските гранули темно виолетови.
БОЕЊЕ ПО ЉУБИНСКИ