Универзитет ‘’Гоце Делчев’’ – Штип

Земјоделски факултет - Биологија

ПРЕДМЕТ:ОСНОВИ НА МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЈА

СЕМИНАРСКА РАБОТА НА ТЕМА:

ОСНОВНИ МЕТОДИ ВО МОЛЕКУЛАРНАТА БИОЛОГИЈА-СЕКВЕНЦИОНИРАЊЕ
НА ДНК

Штип, јуни 2023

СОДРЖИНА

ВОВЕД.............................................................................................................................3

Секвенционирање на ДНК.............................................................................................4

1. Структура на ДНК.................................................................................................... 4

2. Што е секвенционирање на ДНК............................................................................5

3. Методи на секвенционирање на ДНК.....................................................................7

Заклучок........................................................................................................................ 10

Користена литература................................................................................................. 12

2
ВОВЕД

Молекуларната биологија користи повеќе методи во своето рабтење,

помеѓу ко се вбројува и секвенционирањето на деоксирибонуклеинската киселина
(ДНК). Оваа киселни практично се состои од ланец од нуклеотиди, односно четири
видовинуклеотиди: аденин (А), цитозин (C), гванин (G) и тимин (Т). ДНК исто
постои како двојнонишковидна молекула, извиена во форма на двојна завојница.
Секој нуклеотид во ДНК се спарува со својот партнерски нуклеотид на
спротивната нишка: А се спарува со Т, а C со G. Како резултат на ова, во својата
двојнонишковидна форма, секоја нишка ефикасно ја содржи целата потребна
информација. Оваа структура на ДНК е физичката основа за наследување: со
репликацијата на ДНК се дуплицира генетската информација со одвојување на
нишките и со користење на секоја нишка како шаблон за синтеза на нова
партнерска нишка.

Една од најфундаменталните технологии развиени со цел да се усоврши

проучувањето на генетиката на организмите е секвенционирањето на ДНК. Овој
процес овозможува да се одреди низата од нуклеотиди во ДНК фрагментите.
Развиена во 1977 од страна на Фредерик Сангер и неговите соработници,
секвенционирањето со терминација на веригата денес рутински се употребува во
сите порцеси на молекуларната биологија, и со помош на оваа технологија
истражувачите биле во можност да ги проучат молекуларните низи поврзани со
многу заболувања на човекот.

Со поевтинувањето на секвенционирање, секвенционирани се геномите на

многу организми со користење на компјутерски алатки за да се закрпат низите од
многу различни фрагменти (процес познат како геномско асемблирање). Овие
технологии се искористени за секвенционирање на човечкиот геном, што довело
до довршување на проектот за човечкиот геном.

3
 Секвенционирање на ДНК

1. Структура на ДНК

За да се разберат методите и техниките што се користат за

секвенционирање на ДНК, потребно е да се знаат одредени клучни аспекти на
структурата и составот на молекулата на оваа киселина. ДНК е биомолекула која
се наоѓа кај сите живи суштества, од бактерии до големи водни животни.
Органелите - како митохондриите и хлоропластите - имаат кружна ДНК молекула
внатре. Дури и кај некои вируси денес е пронајден генетски материјал е ДНК.

Структурно, ДНК претставува колекција на нуклеотиди. Секој е составен од

јаглени хидрати, азотна база (А, Т, Ц или Г) и фосфатна група. Целта на ДНК
секвенционирање е да се открие редоследот по кој се наредени и четирите азотни
бази во низата.

Новите технологии денес, значително ја намалуваат цената на ДНК и

секвенционирањето на истата, што им дава надеж на истражувачите да ја доведат
цената на повторно секвенционирање на човечкиот геном до одредена и
прифатлива сума. Големото количество на достапни податоци од
секвенционирањето довело до создавање на геномиката, поле на истражување
кое користи компјутерски алатки за откривање и анализирање на закономерности
во целосниот геном на организмите.

Досега, техниките за секвенционирање овозможуваат добивање на низа на

целосни геноми, од мали прокариоти и квасеци до човечки геном.Денес, со сите
достигнувања во науката, секвенционирањето на ДНК е рутинска операција во
многу лаборатории ширум светот благодарение на придонесот на скоро 50 години
истражување во оваа област. Во однос на должината на ланецот, до милиони

4
базни парови може да се секвенцираат за многу кратко време.Претходно,
секвенционирањетона ДНК-жицатасесметашезабавна и скапаактивност,
штоовозможиидентификувањенасамонеколкубазнипаровивоолигонуклеотидите.

2. Што е секвенционирањена ДНК

Секвенционирањето на ДНК е основен процес кој вклучува одредување на

прецизниот редослед на нуклеотиди во молекулата на ДНК. Нуклеотидите, имено
аденин, гванин, цитозин и тимин, го сочинуваат генетскиот код и обезбедуваат
витални информации за особините и карактеристиките на организмот. Со
доаѓањето на методите за брзо секвенционирање на ДНК, оваа научна техника
направи револуција во различни области како што се биологијата, медицината,
биотехнологијата, форензиката, вирусологијата и систематиката.

Во основните биолошки истражувања, секвенционирањето на ДНК стана

неопходна алатка. Тоа им овозможува на научниците да ги откријат мистериите на
животот со проучување на генетските информации кодирани во ДНК. Тој одигра
клучна улога во проекти како што е ДНК Генографскиот проект, кој има за цел да
ја следи миграциската историја на луѓето.

Сл.1.Секвенционирање на молекулата на ДНК

5
 Покрај тоа, секвенционирањето на ДНК е широко употребувано во
применети полиња како медицинската дијагноза, каде што помага да се
идентификуваат генетските мутации поврзани со различни болести, вклучително и
различни видови на рак. Со споредување на здрави и мутирани секвенци на ДНК,
здравствените работници можат точно да дијагностицираат болести и да развијат
приспособени планови за лекување на пациентите.Дополнително,
секвенционирањето на ДНК најде апликации во карактеризирањето на
репертоарите на антитела, овозможувајќи подлабоко разбирање на имунолошкиот
систем и развој на насочени терапии. Брзата брзина на технологиите за
секвенционирање на ДНК го олесни секвенционирањето на целосни геноми,
вклучувајќи го и човечкиот геном и геномите на различни животински, растителни
и микробни видови. Овој пробив значително го унапреди нашето знаење за
генетскиот состав на различниорганизми,
отворајќигопатотзанапредоквообластитекакоштосееволутивнатабиологија,
земјоделството и заштитата.

Сепак, развојотнаметодитезасеквенционирањебазиранинафлуоресценција,
заеднососеквенционеритена ДНК, гореволуционизирааполето на истражување.
Овиемодернитехникигонаправијасеквенционирањетона ДНК полесно, поефикасно
и побрзо. Истражувачитесегаможатдадобијатсеопфатнисеквенцина ДНК
воделодвреметопотребно, штоовозможувапобрзинаучниоткритија,
персонализиранамедицина и идентификација и
каталогизирањенапоголембројорганизми.

Генерално, секвенционирањетона ДНК е

виталенпроцескојимовозможувананаучницитедагодешифрираатгенетскиоткод и
дагиоткријаттајнитенаживотот.
Тојтрансформирашеразличниобластипрекуобезбедувањенаувидвоосновнитебиол
ошкипроцеси, овозможувајќимедицинскинапредок и
олеснувањенаистражувањетонагенетскатаразновидност.
Соконтинуираниотнапредоквотехнологиитезасеквенционирањена ДНК,

6
можемедаочекувамедополнителниоткритијакоиќејаобликуваатиднинатанабиологиј
ата, медицината и пошироко.

3. Методинасеквенционирањена ДНК

Секвенционирањетона ДНК е
клучнатехникаштосекористиворазличниобластинабиолошкоистражување и во
молекуларната биологија како техника,
дозволувајќиимнанаучницитедагиоткријатгенетскитеинформациикодиранивомолек
улитена ДНК. Дваосновниметоди, хемискиотметод и
методотназавршувањенасинџирот, сеширококористенизасеквенционирањена
ДНК.

 Хемискиметод: Хемискиотметод, познат и какометодМаксам-Гилберт,

годобивасвоетоимеоднаучницитекоигоразвиле.
Оваатехникасепотпиранаразличнатахемискареактивностнануклеотид
нитеврскизадасеодреди ДНК секвенцата. Воовојметод, молекулатана
ДНК е фрагментирананапомалифрагменти, а секојфрагмент е
подложеннаспецифичнихемискиреакции.
Овиереакциисенасочениконспецифичнинуклеотидниврски,
штопредизвикуванивнопрекинување.
Соанализанамоделотнараскинувањенаврските,
истражувачитеможатдајазаклучатнизатанануклеотидивооригиналната
молекулана ДНК.

7
 

Начинназавршувањенасинџирот: Оддругастрана,
методотнапрекинувањенасинџирот,
попознаткакометоднадидеоксинаСангер,
бешепионеродФредерикСангер.
Овојметодсездобисопопуларностпорадинеговатаедноставност и
брзина. Тоавклучуваензимскарепликацијанамолекулитена ДНК
воприсуствонадидеоксинуклеотиди (ddNTPs).
НаовиеddNTPимнедостасувахидроксилнагрупананивниот 3' крај,
штогоспречувапонатамошнотопроширувањенасинџиротна ДНК.
Процесотнарепликацијагенерирасеријанафрагментина ДНК
соразличнадолжинакоиодговараатнапозициитекадештобилевградени
ddNTP.

Соодвојувањенаовиефрагментиврзосновананивнатаголемина и
нивнаанализа, можедасеодреди ДНК секвенцата.

Додека и дватаметодибеаинструменталнивосеквенционира-њетона ДНК,

методотзазавршувањенасинџиротстанапрефериранизборзаповеќетоапликации.
Неговатаефикасност, релативнонискатацена и

8
компатибилностасоавтоматизиранитесистемијаправаттехникаташтосекористизаго
лемипроектизасеквенционирањена ДНК.

Сл.2. методи на секвенционирање на ДНК

СокористењенафлуоресцентноозначениddNTP и
платформизасеквенционирањесовисокапропусност,
научницитеможатбрзодасеквенционираатфрагментина ДНК,
овозможувајќисеопфатнаанализанагеномите и
идентификацијанагенетскитеваријации.

МетодотМаксам-Гилберт, познат и какометоднахемискорасцепување, е

пионерскатехникаразвиенаодАланМаксам и ВалтерГилбертво 1976-1977
годиназасеквенционирањена ДНК. Тоавклучувахемискамодификација и
последователнорасцепувањена ДНК наспецифичнибази,
овозможувајќиимнанаучницитедајаодредатнизатанануклеотидивомолекулатана
ДНК.ПрвиотчекородметодотМаксам-
Гилбертвклучуваозначувањенаедниоткрајодфрагментотна ДНК
штотребадасесеквенционирасорадиоактивенмаркер.
Оваарадиоактивнаознакаслужикакомаркерштоовозможувафрагментитедасевизуе
лизираатподоцнавопроцесотнасеквенционирање.

Поетикетирањето, фрагментотна ДНК

сепрочистувазадасеотстранатситенечистотииилизагадувачикоибиможеледасемеш
аатвореакцијатанасеквенционирање.

Додека пак методотназавршувањенасинџирот,

истотакапознаткакометоднадидеоксиСангер, е
ширококористенатехниказасеквенционирањена ДНК.
Тојнудинеколкупредностивоодноснаметодот Maxam-Gilbert,
вклучувајќизголеменаефикасност, намаленаупотребанатоксичнихемикалии и
помаликоличининарадиоактивност.

9
Заклучок

Какозаклучок, секвенционирањетона ДНК

играклучнаулогавоотклучувањетонамистериитенаживототкодиранивомолекулитен
а ДНК. Хемискиотметод и
методотназавршувањенасинџиротседведобровоспоставенитехникикоисекористатз
аоваанамена.
Иакохемискиотметодјакористихемискатареактивностнануклеотиднитеврски,

10
методотназавршувањенасинџирот е
широкопрефериранпорадинеговатаедноставност и брзина.
Сонапредокотвотехнологиитезасеквенционирање, секвенционирањетона ДНК
станаподостапно, револуционизирајќигиразличнитеобластикакоштосемедицината,
земјоделството и еволутивнатабиологија.

Генерално,првиотчекор е
дасеодделисекојодсинтетизиранителанциспореднивнатаголемина.
Некоиќебидатподолгиоддругите,
возависностодтоакадесевградениспецијалнитебази.Постојатразличнибиохемискит
ехникикоиовозможуваатраздвојувањенакомпонентитенасмесатакористејќијаголем
инатакакодискриминирачкосвојство. ВометодотнаСангер,
различнителанцисеодделуваатсоелектрофореза.
Вопософистициранитеваријантинатехниката,
секористикапиларнаелектрофореза.Така,
подолгитенишкипатуваатпомалкуодпократкитеваријанти.
Овојсистемпотоапоминуванизчитачкојгопрепознавамаркеротвклученвосекојдидеок
синуклеотид. Наовојначин, можедасезнаередоследотнанизата.

Оваатехникана „првагенерација“еспособнадачитафрагментина ДНК

непоголемиод 1 килобаза. Вомоментов,
методотСанџерсекористиворазличнилаборатории,
генералновонеговитесовремениваријанти.Покрајтоа,
секористизадасепотврдатрезултатитедобиенисонајсложенитетехники,
нопомалкупрецизни.

Когасеквенционирањето е неопходно,
процесотсезабрзувапрекуавтоматизација. Ова е
варијацијанаметодотназавршувањенасинџиротСанџер,
кадештобукваритесеозначенисофлуоресцентнипроизводисоцелдасеразликуваат.

Последователно, производотнареакцијасеодвивавоелектрофореза -
сетотоавоедналента. Бидејќисекојфрагментизлегуваодпоследниотделодгелот,

11
тојбрзосеидентификувасонеговотофлуоресцентнообележување, согрешкаодоколу
1%.

Најсофистициранитесистемиденес, имаатсистемдо 96
капиларницевкиуправуваниодкомпјутерспоенсоробот. Тоа е, 96 примероцина ДНК
можедасетестираатистовремено. Така, процесоткојвклучуваелектрофореза и
анализанарезултатите е целосноавтоматизиран.

Познавањетонаредоследотнануклеотидитенаеднамолекулатолкуважнакако
ДНК е вреднозабиолозите и сроднитепрофесионалци.
Овојсинџирнаполинуклеотидигисодржиситеинформациипотребнизаразвој и
одржувањенаситеформинаживот.Одовиепричини, познавањетонаовааниза е
одсуштинскозначењезабиолошкитеистражувања. Вооснова,
секвенционирањетоовозможувадасеизмериеднаоднајважнитесвојстванабиолошки
тесистеми и дасеутврдатразликимеѓунив.

Редоследот е ширококористенодтаксономистите и систематистите,

бидејќиодредени ДНК
секвенциовозможуваатутврдувањекритериумизазаклучокдалидваорганизмаприпаѓ
аатнаиствид,
покрајтоаштоможедапредложатхипотезизафилогенетскитеврскимеѓунив.

12
Користена литература

1. Секвенционирање на ДНК. (nd). Преземено од

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21119/
2. Sanger, F., Nicklen, S., &Coulson, AR (1977). Секвенционирање на ДНК со
инхибитори кои завршуваат синџир. Зборник на трудови на Националната
академија на науките, 74 (12), 5463-5467.
3. Мардис, ЕР (2008). Методи за секвенционирање на ДНК од следната
генерација. Годишен преглед на геномика и хумана генетика
4. Maxam, AM, &Gilbert, W. (1977). Нов метод за секвенционирање на ДНК.
Зборник на трудови на Националната академија на науките, 74 (2), 560-564.

13