Природно-математички факултет

Универзитет ,,Св. Кирил и Методиј‘‘

Етика на научноистражувачката работа поврзана со

генетски инженеринг на примарни клеточни
култури и анимални експериментални модели

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и

примери во подрачјето на молекуларна биологија и генетика

Студент: Ментор:
Проф. Др. Благоја
Дино Атанасов 28.06.2019 Велјановски
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 2 од 16

Апстракт

Научно-истражувачката работа поврзана со третиот циклус студии што ќе се

спроведува на катедрата за физиологија опфаќа нови аналитички методи, и
воспоставува нова перспектива во проучувањето на физиолошките процеси на
молекуларно ниво кај хипертрофичните кардиомиопатии. Аналитичките методи и
лабораториски процедури кои ќе се користат вклучуваат генетски инженеринг на
клеточни култури и користење на анимални експериментални модели како неизбежни
техники за генерирање податоци во ова научно истражување. Целта на овој труд е да
ја анализира етичката оправданост на методите и ресурсите кои ќе се користат во
истражувањето.

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 3 од 16

Содржина
Апстракт ................................................................................................................................................. 2

Цели на истражувањето ....................................................................................................................... 4

Мултиплекс детекција на внатреклеточни јонски протоци при индуциран оксидативен стрес со

користење на генетски инженирани внатреклеточни сензори и/или хемиски маркери .............. 6

Етички аспекти на генетскиот инженеринг ......................................................................................... 7

Етички аспекти на користењето на фетален телешки серум ............................................................ 9

Етички аспекти на користењето анимални модели во научното истражување ............................ 10

Етички аспекти на спроведувањето на експериментите со лабораториски стаорци ................... 15

Листа на референци ............................................................................................................................ 16

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 4 од 16

Цели на истражувањето

Потребата за истражување на кардиоваскуларните патолошки состојби

произлегува од фактот дека 31% од сите причини за смрт, односно 17.9 милиони луѓе
годишно умираат како резултат на кардиоваскуларни болести (WHO, 2019). 85% од
овие смртни случаи се резултат на срцев или мозочен удар, но првичните симптоми на
заболување најчесто се присутни долго пред настапувањето на смрт. Меѓу оние кои
имаат најизразен ризик за смрт од кардиоваскуларни заболувања, се оние кои имаат
хипертензија, односно покачен крвен притисок. Од севкупната човечка популација на
планетата, една милијарда и сто милиони луѓе имаат хипертензија, односно имаат
значителен ризик од предвремена смрт како резултат на кардиоваскуларни
заболувања.
Денес ги знаеме безмалку сите механизми на внатреклеточна и меѓуклеточна
интеракција за пренос на информации за одлучување на механизам на одговор на
различните интерни и екстерни влијанија што влијаат на кардиоваскуларниот систем, и
срцето специфично. Но, на ниво на една срцева клетка постојат десетици интринзични,
и екстринзични механизми на регистрирање и процесирање на информации за истата
одлука, што го прави процесот на одлучување многу комплексен. Дополнително,
различните механизми на процесирање на информации имаат и променливо влијание
врз крајната одлука, во зависност од специфичната средина во која се наоѓа срцевата
клетка во одреден момент. Значително влијание имаат и други ткива кои не содржат
кардиомиоцити, а имаат влијание врз нив. Така што на ниво на орган бројот на
интеракции кои произлегуваат од регистрирањето, размената и одлучувањето за
различни информации од милиони клетки истовремено, го прават
кардиоваскуларниот систем многу комплексен.
Комплексноста на патолошките состојби на кардиоваскуларниот систем, секако
произлегува и од комплексноста на овој систем кога е и во здрава состојба.
Програмираното клеточно самоубиство е еден од најбитните детерминанти на
различни проблеми со срцевата контракција што се појавуваат кај различни патолошки
состојби (Das, 2009). Истовремено постојат голем број индикации дека патолошкиот
развој на кардиолошките дисфункции се тесно поврзани со редокс балансот во
кардиоваскуларниот систем, и појавата на реактивни кислородни форми (РКФ). Преку
истражување на појавата на апоптозата кај хипетрофичните кардиомиопатии, и
нивната зависност од реактивни кислородни форми, со ова научно истражување се
збогатува знаењето за значителното влијание што овие интеракции го имаат врз
севкупниот патофизиолошки развој на различните видови кардиомиопатии.
Реактивните кислородни форми се еден од најизразените маркери за стрес во
мамалиските клетки, кои иако имаат висок потенцијал за оштетување на клетката, исто
така имаат и важна улога во многу внатреклеточни биохемиски и сигнални процеси.
РКФ претставуваат еден од споредните производи на процесот на оксидативна
фосфорилација, но нивната главна продукција се должи на состојбата на оксидативен
стрес индуциран од различни фактори (радијација, чад, токсини, патофизиолошки
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 5 од 16

состојби и слично). Поради зависноста на поголем број биохемиски патеки од

присуството и концентрацијата на РКФ, трансдукцијата на физиолошките сигнали кои
произлегуваат од зголемена концентрација на РКФ се ефектуира преку сигнални
патеки кои вклучуваат ензимски модификации и неколку катјонски градиенти преку
кои се одржува клеточната хомеостаза.
Под претпоставка дека интринзичните апоптотски патеки доминираат при
индукцијата на апоптозата при хипертрофичната кардиомиопатија, хипотезата што ќе
се истражува е дека РКФ-зависните апоптотски патеки се водечки механизам за
ефектуирање на апоптозата кај хипертрофичните кардиомиопатии. Користејќи го
анималниот модел на лабораториски стаорец ќе се предизвика изопротеренол-
индуцирана хронична хипертензија која води до хипертрофична миопатија. Со помош
на пропидиум јодид како маркер за селективно обојување, ќе се обидеме да го
одредиме процентот на оштетени клетки по пат на некроза и апоптоза кај хистолошки
препарати на примероци од срцата на лабораториските стаорци.

Стандардите што ќе се користат за анализа како кардиомиоцитите се

однесуваат при исопротеренол-индуцирана хипертрофија, во споредба со други
клеточни линии што имаат експресија на бета-адренергични рецептори ќе помогнат во
разбирањето како реагираат кардиомиоцитите во споредба со клеточни линии кои се
изолирани од канцерогени ткива. Клеточните линии што ќе се користат за позитивна
контрола во голем дел веројатно ги имаат изгубено и интринзичните сигнални патеки
за индукција на апоптоза, но компаративните нивоа на оксидативен стрес потребни за
да изумре клетката ќе се компарираат во двете сценарија.
Дополнително, ќе ја истражиме меѓусебната интеракција помеѓу зголемената
концентрација на РКФ во митохондриите и пренесувањето на внатреклеточните
резерви на калциум од ендоплазматичен/сакроплазматичен ретикулум на
митохондриите во зависност од интринзичната апоптотска патека која води до
активирање на каспазите. За оваа цел ќе користиме флуоресцентни проби како што се
дихлорофлуоресцеинот и калцеиниот, како и генетски инженирани рекомбинантни
интрамолекуларни FRET проби сензитивни на РКФ или Ca2+, со специфична
внатреклеточна локализација, кај примарни клеточни култури од кардиомиоцити
изолирани од новородени лабораториски стаорци.
Иако постојат хемикалии кои слично како и флуоресцентните проби се користат
за внатреклеточна детекција на РКФ, истите најчесто се токсични, фотосензитивни и
неселективни кон различните видови на РКФ. Користењето на флуоресцентни или
биолуминисцентни гени известувачи кои со генетски инженеринг се фузирани со
протеински мотив што селективно врзува РКФ, овозможува промена на целокупната
тродимензионална конфигурација на протеинот во активна конформација при
детекција на РКФ, со што се генерира детектабилен сигнал. Ваквиот вид методи на
детекција на РКФ се толку сензитивни што овозможуваат детекција и на поединечни
пикови во продукцијата на супероксидни анјони (супероксидни блесоци).

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 6 од 16

Меѓу наведените аналитички методи кои се планирани за експерименталниот

дел на научното истражување, постојат неколку кои заслужуваат евалуација на нивната
етичка оправданост. За време на научното истражување ќе се користат возрасни
лабораториски стаорци кај кои ќе се индуцира хипертрофична кардиомиопатија, со
цел хистолошка анализа на присутноста на апоптоза. Исто така, ќе се користат
новородени лабораториски стаорци од кои ќе се изолира срцето со цел засејување на
клеточни култури на кардиомиоцити. Дополнително, за да се воспостави и одржи
клеточната култура ќе се користат медиуми кои содржат фетален телешки серум. За
генерирање на податоците кои се потребни за ова научно истражување од клеточните
култури, веројатно неизбежно ќе биде и користењето на сензитивни аналитички
методи со користење на генетски инженеринг.

Мултиплекс детекција на внатреклеточни јонски протоци при индуциран

оксидативен стрес со користење на генетски инженирани
внатреклеточни сензори и/или хемиски маркери

Фузијата на секвенци за локализација заедно со гени известувачи, какви што се

луциферазите и флуоресцентните протеини, е техника во синтетичката биологија која
во последните 20 години има воспоставено нов стандард за анализа и работа во
молекуларната биологија. Со помош на овој вид протеини-известувачи се овозможува
генерирање на сигнал во специфични, однапред дефинирани услови, при одредени
физиолошки промени во клетката. Преку техниките на молекуларно клонирање, во
генот на известувачките протеини се овозможува додавање на дел од полипептидна
секвенца, која кај природните гени од интерес служи за локализирање на целиот
протеин. Ваквиот вид гени односно протеини, овозможуваат неприкосновен извор на
информации за структурната биологија, протеомот и молекуларната физиологија на
клетката.
Постојат многу методи на детекција на различни внатреклеточни интеракции
преку контрола на условите во кои се генерира сигналот, или пак преку користење на
флуоресцентен (FRET) или биолуминисцентен (BRET) резонантен енергетски трансфер.
Техниките за селективно генерирање на сигнали вклучуваат интермолекуларни FRET
проби, интрамолекуларни FRET проби, интермолекуларни BRET проби,
интрамолекуларни BRET проби, интермолекуларна реконститутивна комплементација
на протеини, и интрамолекуларна реконститутивна комплементација. Можноста за
креирање на локализирани сигнали со помош на секвенци за локализација
овозможува мултиваријабилно креирање на податоци за внатреклеточните процеси.
Исто така, користењето на варијабилна транскрипција преку додавање на фактори на
транскрипција овозможува дополнителен каскаден систем за контрола, со што нивото
на комплексност и количината на податоци што се генерираат при следење на
клетките се неколкукратно поголеми во споредба со обичното следење со помош на
локализирани известувачки протеини. Овде наведените примери за аналитички

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 7 од 16

методи во науката отсликуваат само дел од можностите што генетскиот инженеринг го

овозможува.

Етички аспекти на генетскиот инженеринг

Според законските дефиниции за тоа што е генетски инженеринг, а и

општественото сфаќање на поимот, генетскиот инженеринг е името на група техники
во молекуларната биологија што се користат за директна генетска модификација на
организам со рекомбинирање на ДНК или други нуклеински киселини. Овие техники
типично вклучуваат процедури за модифицирање, реплицирање и рекомбинирање на
ДНК која потекнува од различни организми, или е хемиски синтетизирана. Како
аналитичка техника генетскиот инженеринг на клеточни култури се користи во сите
современи сфери на биотехнологијата, што вклучува оптимизација на производни
процеси од хемиската индустрија, развој на нови генерации лекови, и нови алатки за
проучување на животот на планетата.
Најголемиот етички конфликт од генетскиот инженеринг на клеточни култури
произлегува од ризикот генетската модификација која се применува на културата на
клетки да го загрози здравјето на човекот или животната средина. Овој ризик може да
се однесува на генетски инженеринг што индуцира патогени карактеристики на
организмот, и притоа може да го загрози здравјето на вработените, и пошироката
јавност. Алтернативно, гореспоменатиот ризик може да се однесува на ненамерно
пренесување на генетската модификација на други организми. Поради можноста
молекуларните техники во биологијата да бидат злоупотребени за развој на нови
патогени и/или вирулентни организми со значително зголемени патогени
карактеристики, воведени се многу механизми за контрола на пристап до потребните
реагенси и опрема за спроведување на техники од молекуларната биологија.
Во историјата на човековото организирање, ретки се примерите на проактивно
воведување регулативи за контрола на ризиците со кои се соочува општеството. Но
генетскиот инженеринг е регулиран уште при првите валидации на физибилноста на
концептот. Во Асиломар во 1975 е организирана првата конференција каде експертите
и пионерите на технологиите за создавање рекомбинантна ДНК воведуваат рамка и
правилници за дозволена употреба и истражување со генетски инженеринг, иако во
времето кога овие регулаторни рамки се воведени, генетски инженеринг во легалната
смисла на зборот, безмалку и да не постоел на планетава. Со воведувањето на
Картагена протоколот за биосигурност, и негово усвојување во Обединетите Нации се
воведува регулација на работата со генетски модифицирани организми на глобално
ниво.
Дополнително, начинот на кој се задоволуваат сите критериумски барања за
осигурување на биосигурноста се дефинира со национални законски решенија, кои
секако се усогласени со начелата усвоени во Обединетите Нации. Еден од
механизмите на заштита е класифицирањето на генетски модифицираните организми
кои се користат во научното истражување во 4 класи, врз основа на степенот на ризик
дека генетски модифицираниот организам би можел да влијае на човекот и животната
средина. Барањата за физичката изолираност врз основа на класата на ГМО со кој се
работи се строго дефинирани, и прогресивно потешки за имплементација.
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 8 од 16

Дополнително, механизмите за контрола на пуштање на пазар на ГМО се

воспоставени да ја контролираат и ограничуваат интеграцијата на ГМО во животната
средина на неколку нивоа. И покрај тоа што има законски дефиниран процес со многу
механизми на анализа и контрола на потенцијални ризици од пуштање на ГМО на
пазарот, следливоста на имплементацијата на регулативата е исто така на многу
високо ниво, со тоа што започнува со следење на основните биохемиски реактанти
потребни за било каков генетски инженеринг.
Контролата на ГМО кои се пуштени на пазар е специфицирана врз основа на
видот на ГМО, и можноста и/или ризикот генетската модификација која е воведена во
родителскиот организам, да се прошири во природната популација на тој вид преку
размножувањето. Биотехнологијата, а со тоа и примената на генетски инженеринг е
категоризирана врз основа на крајниот потрошувач како индустриска, медицинска, и
агрикултурна биотехнологија. Како посебна категорија што ги спојува овие сектори на
биотехнолошката индустрија е научното истражување во молекуларната биологија,
што во современите методи во огромен дел зависи од генетски инженеринг. Генетски
модифицираните организми кои се пуштаат на пазар за користење во било кои од
горенаведените крајни корисници, се од многу различна природа, а и нивната
можност за било каква интеграција во животната средина зависи од специфичните
генетски модификации што ги содржи конкретниот генетски модифициран организам.
Пуштањето на ГМО на пазар генерално е дозволено само доколку конкретниот
генетски модифициран организам е од класа 1 и не претставува ризик за човековото
здравје, или животната средина. Некои исклучоци се прават во медицината, и
научното истражување во медицината, но сите овие исклучоци задоволуваат
значително повисоки стандарди за контрола на ризиците. Од друга страна, најчестата
загриженост на јавноста се појавува од користењето на генетски модифицирани
растенија, кои иако се безопасни за животната средина, постои загриженост дека овие
организми можат да се интегрираат во популација на диви организми од истиот вид, а
со тоа и генетската модификација што ја носат да ја пренесат на целокупната
популација. За да се спречи ова, освен позитивните генетски модификации кои се
внесуваат, често се внесуваат и карактеристики што ефективно ги стерилизираат
генетски модифицираните растенија кои се одгледуваат. Сепак, поради загриженоста
на јавноста, и отсуството на едукативни програми за тоа што е генетски инженеринг, во
многу земји храната што содржи ГМО е забранета, а во многу земји и регулативите за
користење на ГМО во медицината и научното истражување се значително
рестриктивни со што ефективно го оневозможуваат користењето на ГМО.
Иако некои филозофски сфаќања го сметаат генетскиот инженеринг за не
етички со тоа што е неприродна појава, односно вештачка алатка создадена од
човекот, ограничувачката дефиниција на генетскиот инженеринг како метод на
користење на рекомбинантни техники, е исто така етички проблематичен.
Гореспоменатото ограничено сфаќање за тоа што е генетски инженеринг, ги
,,апстинира’’ од одговорност различниот вид човечки активности кои водат до
адаптивна еволуција на непроценливо голем број видови, што секако се ефектуира
преку генетски мутации во геномот на овие видови.
Човечкото влијание преку загадувањето, и емисијата на гасови кои го
зајакнуваат ефектот на стаклена градина, го менува хемискиот состав на атмосферата,
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 9 од 16

но и сите екосистеми на планетата. Антропоценото геолошко време, односно

периодот од лансирањето на првата атомска бомба, е дефинирано пред сè од
најбрзото истребување на видови во последните 65 милиони години, во
таканареченото ,,шесто истребување’’. Во овој незначајно мал период во геолошко
време, 7% од сите видови на планетата се веќе истребени, светската популација на
животни е намалена за повеќе од 50%, а популацијата на диви цицачи е намалена за
повеќе од 83% (Ceballos et al. 2017; Régnier et al. 2015).
Конкретен пример за имплементацијата на ,,генетскиот инженеринг” на
глобално ниво е начинот на кој ги избираме и размножуваме растенијата и животните
како земјоделски, односно сточарски производи. Преку современата земјоделската и
сточарската индустриска гранка на глобално ниво се комодифицираат животните и
растенијата како пазарни добра кои имаат вредност само врз основа на количината и
квалитетот на хранливи состојки што ги нудат. Со ова природен еволутивен развој на
голем дел од животната средина се прекинува, и значајно видоизменува врз основа на
структурната поставеност на овие индустрии кои преку индустријализација на овие
природни процеси, истите ги имаат извештачено. Типичен пример се сточарските
фарми. Домашните животни се размножуваат селективно за фаворизирање на
животни со зголемена телесна маса, или производство на млеко. Во голем дел од
сточарските фарми природна инсеминација веќе и не постои (Bols et al. 2010). Меѓу
другото, индустријализираното сточарство е и главна причина за дефорестација на
планетата, и најголемиот предизвикувач на шестото истребување.
Во најголем дел, овие факти се резултат на тоа дека животната средина во
голем дел од биосферата се менува значително побрзо од еволутивниот тек на
адаптација на живите организми. Eкстремно високиот еволутивен притисок на
антрополошките влијанија врз биосферата води и до ,,неприродно‘‘ честа појава на
генетски дрифт и други еволутивни притисоци кои водат до значајна промена на
геномот на огромни популации кај најголем дел од видовите. Сите горенаведени
процеси резултираат со значајни промена во генетскиот материјал што заеднички го
сочинуваат сите организми на планетата, но според дефиницијата за тоа што е
генетски инженеринг, шестото истребување е ,,природна појава‘‘ и не е ,,генетски
инженеринг‘‘.
Реалноста на новите генерации на Земјата е трката за тоа кој генетски
инженеринг ќе има поголем ефект врз планетата. Дали ќе преовладува шестото
истребување, или преку биотехнологијата ќе се трансформира хемиската индустрија,
односно начинот на кој ги екстрахираме, преработуваме, и рециклираме природните
ресурси. Поради ова, користењето на генетски инженеринг во примарни клеточни
култури на кардиомиоцити нема значителни етички предизвици, особено земајќи го
во предвид етичкиот проблем што би се појавил доколку не се истражуваат нови
методи на лечење на кардиоваскуларните заболувања.

Етички аспекти на користењето на фетален телешки серум

Во врска со горенаведените етички проблеми кои произлегуваат од

индустријализацијата на сточарството, еден од нуспојавите е и користењето на
животните кои се жртвуваат за производство на фармацевтски или научно-

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 10 од 16

истражувачки цели. На пример, сите клеточни култури на клетки од цицачи во светот

се култивираат во медиум што мора да содржи фетален телешки серум (Valk, 2018).
Овој серум се произведува со екстрахирање на крвта од фетусот што се наоѓа во
бремените крави кои се пратени во кланици. Законски регулираните протоколи за
производство на фетален телешки серум вообичаено не дозволуваат одгледување на
крави за нивниот фетус, така што сточарите кога ги праќаат тие крави во кланици,
вообичаено и не знаат дека кравата е бремена. Но дури и да знаат дека се бремени,
кравите кои се одгледуваат поради млекото што го произведуваат секако вештачки се
оплодуваат постојано, со цел постојано да произведуваат млеко. Така што,
производството на фетален телешки серум е овозможено од индустриското
сточарство, а не причина за истото.
Во оваа фаза отсуството на комерцијализирани технолошки алтернативи за
користењето на фетален телешки серум станува проблем за научното истражување, и
за развојот во последниве неколку години на технологии за растење на телешко или
пилешко месо во биореактори. Со производство на месо во биореактори, целосно би
се избегнала потребата од убивање на животни за исхрана. Но, според некои
пресметки за да се израсне 10 грами култура на мускулно ткиво е потребно 500мл.
серум од телешки фетус, што веројатно е жртвуван исклучиво за да се произведе таа
количина серум (Catts & Zurr, 2008).
Сепак, во последните неколку години се направени значителни напори за
рекреирање на хемиски дефинирани медиуми, што не содржат неидентификувани
компоненти, како што е феталниот телешки серум. Во таа насока направени се и
значителни достигнувања, но процесот на прилагодување на различните состави на
медиуми за да се задоволат сите потреби кои ги имаат различни ткива се уште е во
развој. Многу е веројатно дека поради отсуството на комерцијализирани медиуми без
серум, за одгледување на клеточни култури на кардиомиоцити неизбежно ќе биде
користењето на овие стандардизирани медиуми што содржат фетален телешки серум.

Етички аспекти на користењето анимални модели во научното

истражување

Дали еутаназијата за научно истражување е различна од индустриското

сточарство за растење на животни кои постојат само да бидат убиени, за исхрана на
луѓето? Можеби и најдобриот аргумент за ова прашање кај домородните населенија
во светот што се уште живеат на ист или сличен начин како и десетици или стотици
генерации пред нив, е дека тие го убиваат пленот со кој се хранат, а со тоа ја знаат и
вредноста на неговиот живот. Слично е и во лабораториски услови, а можеби и
поетички од било кој лов. Во лабораториски услови не постои агресијата или желбата
за успех на ловот, а истовремено лабораторискиот техничар е одговорен за одземање
на животот на едно живо суштество. Од друга страна, за разлика од
индустријализираната индустрија за месо каде на одредени работни места касапите
убиваат животни по цел ден со години, а со тоа и се десензитираат од она што го
работат, речиси и да не постојат лаборатории каде постојат лабораториски техничари
што неселективно убиваат животни по цел ден.
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 11 од 16

Освен фактот дека анималните модели се клучни за многу аспекти од научното

истражување, експериментите со животни се дел и од предклиничката фаза на развој
на лекови. Особено при развојот на нови лекови, лабораториските животни во голем
дел служат и за да го минимизираат потенцијалниот ризик од несакани ефекти за
време на клиничките студии, каде податоци и експерименти се прават со луѓе. Првата
фаза од клиничките студии ја опфаќаат истражувања за безбедноста на лекот кои се
спроведуваат на здрави возрасни лица кои се компензираат за ризикот што го
превземаат. Секако до таа фаза податоците за безбедност и дозирање на лековите се
превземаат, анализираат и обработуваат од студии со животни. Така што, студиите во
првата клиничка фаза кај мала група на луѓе во голем дел е валидација на сите
хипотези за сите биохемиски интеракции истражени во клеточни линии и валидирани
во студиите со животни.

Слика 1. Процесот на развој на нови лекови преку фази на клинички студии

(превземено од NIH, 2019).
Патот на развој на еден лек, и спроведување на сите потребни истражувања се
до негово одобрување за користење следи неколку фази наведени во сл. 1.
Предклиничката фаза ги опфаќа сите истражувања кои се спроведуваат пред да
започнат клиничките студии кај луѓето. Првата клиничка фаза се спроведува кај мала
група на здрави индивидуи, со цел да се анализира безбедносниот профил на лекот,
дали постојат некои претходно неидентификувани споредни ефекти на лекот, и да се
валидираат сите претпоставки од предклиничката фаза за апсорпцијата,
дистрибуцијата, метаболизмот и екскрецијата на лекот. Втората фаза од клиничките
студии се спроведува на малку поголема група на учесници кои ја имаат клиничката
слика за која лекот е дизајниран да ја лекува или менаџира. Третата клиничка фаза е
уште поголема група на пациенти со истото заболување. Во овие две фази најмногу
податоци се добиваат за ефикасноста на терапијата, и евентуално некои ретки
споредни ефекти кои би ги имал лекот. После третата фаза, надлежните агенции за
лекови и медицински средства одлучуваат дали предложената терапија ги задоволува
стандардите за истата да биде пуштена на пазар. Доколку е одобрено пуштањето на
пазар на терапијата или лекот, се следат и податоците кои произлегуваат од
користењето кај голема група на пациенти. Иако во пракса ова ретко се случува, но

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 12 од 16

може и во оваа фаза да произлезат нови откритија поврзани со лекот и/или терапијата
кои се специфични за пациенти со ретка клиничка слика.
Предклиничките испитувања вообичаено се последната етапа од долгиот
мултидисциплинарен процес на лабораториската научноистражувачка работа за развој
на лекови, која започнува со откривање на карактеристиките на патофизиолошката
состојба. И покрај сензитивноста на модерните молекуларни техники за следење на се
што се случува во една клетка, или култура на клетки, речиси е невозможно следењето
на сите интеракции што се појавуваат во патофизиолошките состојби. Затоа кај
анималните модели, иако не можат да се следат сите биолошки функции во реално
време, при развој на било која болест, секако се следат симптомите кои ја
карактеризираат истата. Од тука произлегува потребата и за користење на анимални
модели за следење на ефектот на индивидуални или групни интеракции во клетката
врз целокупниот организам, и болеста која се развива во него.
Постојат неколку стандардизирани анимални модели кои се користат за
истражување на различните нивоа на комплексност кои постојат за целокупна
контрола на регулација на биологијата на ниво на цел организам. Секако преку овие
истражувања се откриваат и молекуларните механизми на создавање на заболувања
и/или различни патофизиолошки симптоми кај човекот. Преку проучување на истите
физиолошки интеракции на различни нивоа на комплексност кај различни организми,
се овозможува ретроактивно откривање на еволутивно најстабилните карактеристики,
а со тоа и најстари интеракции што формираат затворен круг на регистрирање,
процесирање и реагирање на одредена состојба. Обидите да се откријат што е можно
повеќе информации, од што е можно по едноставни организми оди во прилог и на
етичкиот пристап во научното истражување, со што се практикува избегнување на
нанесувањето болка што е можно повеќе. Секако користењето животни во
лабораториското истражувања треба да биде објективно разгледано и одобрено од
научни комитети кои ги разгледуваат предлозите за експерименти, и одлучуваат врз
основа на научен консензус дали постои етичка оправданост.
Клеточните линии, или едноклеточните организми се клучни за откривање на
многу внатреклеточни биохемиски патеки, клеточни структури, и основни
меѓуклеточни интеракции. Наједноставните живи суштества, бактериите немаат
дефинирани органели, а со тоа и комплексноста на биохемиските интеракции што
можат да ги спроведуваат истовремено е ограничена. Escherichia coli е типичен
пример, и организам што се користи за откривање на најосновни биохемиски патеки, и
основни внатреклеточни механизми за одржување во живот. Во однос на главните
разлики кои постојат помеѓу прокариотските и еукариотските организми еден од
најчесто користените организми е едноклеточната квасна габа Saccharomyces
cerevisiae. Голем дел, од ензимите кај човекот што не можат да се произведат кај
бактериите успешно се произведуваат кај S. cerevisiae.

На ниво на мултиклеточни организми еден од најчесто користените, а воедно и

наједноставен организам е Caenorhabditis elegans. Човечкото тело кај возрасните има
околу три трилиони клетки, со што интеракциите меѓу клетките на ниво на организам
се одвиваат на неколку нивоа паралелно, и секоја од клетките има интеракција со
стотици, илјадници, милиони, или милијарди клетки истовремено. Од друга страна,
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 13 од 16

возрасното тело кај хермафродитските C. elegans секогаш има 969 клетки, а кај
припадниците на машкиот пол, секогаш 1031 клетка.
Многу од основните генетски постулати на развојот на човечкиот ембрион се
проучени кај куќните муви Drosophila melanogaster, рибите Danio rerio, и жабата
Xenopus tropicalis. За следење на биолошките функции кои се карактеристични за
цицачите, најчесто користените анимални модели се лабораторискиот глушец (Mus
musculus) и лабораторискиот стаорец (Rattus norvegicus domestica).
Секако кај некои болести специфични за приматите, како што се повеќето
неуродегенеративни и имунолошки заболувања, освен кај луѓето тие експерименти
можат да се спроведуваат и на други примати, како што се Шимпанзата. Поради
компаративно високиот степен на интелигенција што го имаат приматите, како
Шимпанзата и Бонобото, за етички да се оправда користењето на овие животни како
експериментални модели потребно е да се задоволи многу висок праг на неможност
истражувањата да се спроведат на други анимални модели. Етичките комитети за
користење на приматите како експериментален анимален модел ги оценуваат
предлозите врз основа на претходно зададени критериуми кои се водат од следните
принципи:
1. Добиеното знаење мора да е есенцијално за унапредување на јавното здравје
2. Не смее да постои друг истражувачки модел преку кој ова знаење може да се
добие, а истовремено етички е недозволиво истражувањето да се спроведе на
луѓе.
3. Животните што се користат во предложениот научноистражувачки комитет
мора да се чуваат во соодветни физички и социјални средини, или во природна
животна средина.
Користењето на шимпанзата во експерименти за компаративна геномика и
бихевиористички студии e дозволено доколку следните два критерериуми се
задоволени:
1. Студијата произведува откритија во компаративната геномика, нормалното и
абнормално однесување, ментално здравје, емоции, или умствени процеси,и
2. Сите експерименти се спроведуваат исклучиво на животни кои соработуваат,
односно се спремни да ги прифатат сите експериментални активности без да
бидат присилувани, користејки минимално инвазивни техники, на начин што
минимизира болка и неудобност.
Голем дел од државите во светот имаат воведено легислативни правила кои
безмалку целосно го забрануваат користењето на приматите како експериментални
модели. Во Европската Унија последните истражувања на шимпанзи завришиле во
1999, а последната установа во која домуваат шимпанзи има преќинато во 2004.
Дополнително, веќе се развиени методи и за индуцирање на човечки болести
кај лабораториски стаорци, со што се избегнува потребата од користење на примати.
Со помош на нови методи во генетскиот инженеринг со користење на ендонуклеази
кои се специфични на кластерите на регуларно оддалечени палеондромски
повторувања (,,CRISPR’’) е овозможено специфично воведување на мутации во
геномот. Преку овие техники за индуцирање на специфични мутации кај
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 14 од 16

лабораторискиот стаорец е овозможено вештачко реплицирање на патолошките

карактеристики од специфичните болести од кај луѓето во лабораторискиот стаорец.
Истовремено ваквите таргетирани мутации овозможуваат истражувања како одредени
локализирани или сеприсутни биохемиски интеракции влијаат на целокупниот
организам. Ова е уште еден метод преку кој се избегнува користењето на
поинтелигентни модели на организми, и се користи наједноставниот можен модел.
Покрај законските рамки за регулирање на експериментите со животни,
постојат и значителни економски и оперативни проблеми при експериментирањето со
животни што дополнително го ограничуваат експериментирањето со животни.
Животните кои се користат за експериментирање се купуваат од специјализирани
установи кои ја гарантираат геномската стабилност и униформност, и достапност до
секвенците зачувани како биоинформатички податоци за геномот што го има
популацијата на лабораториски глувци која се користи во истражувањата. За
репродуцибилност на истражувањата на глобално ниво, типично овие специфични
соеви се потребни во истражувањата со лабораториски стаорци.
Поради горенаведените причини, краткиот животен циклус и поради фактот
дека во просек околу 85% од кодирачката секвенца на гените кај глувците и луѓето е
идентична, лабораториските глувци и стаорци се користат во многу научни
истражувања (NIH, 2010). Само во САД годишно се жртвуваат околу 100 милиони
лабораториски глувци и стаорци за научни цели (Schipani, 2019). За проучување на
кардиоваскуларниот систем соодветен, и широко користен анимален модел е
лабораторискиот стаорец. За време на научното истражување ќе се користат возрасни
лабораториски стаорци кај кои ќе се индуцира хипертрофична кардиомиопатија, со
цел хистолошка анализа на присутноста на апоптоза. Исто така, ќе се користат
новородени лабораториски стаорци од кои ќе се изолира срцето со цел засејување на
клеточни култури на кардиомиоцити. Досегашните истражувања покажуваат дека се
уште не постои алтернативен пристап од користењето на лабораториски стаорци во
истражувањето на механизмите на дејствување на кардиоваскуларниот систем.
Преку развојот на технологијата за 3Д принтање, се овозможи развојот и на
технологијата за масовно производство на микрофлуидни системи со висока
резолуција кои овозможуваат вештачко рекреирање на сите ткива што ги содржи еден
орган со што се овозможува градење на вештачки репликати, таканаречени орган на
чип (organ-on-chip). Традиционалното одгледување на култури на ткива најчесто
дозволува одгледување на само еднослојни култури, со што меѓу другото се
ограничува и бројот на интеракции што тие клетки ги имаат во изолација во споредба
со истите клетки кога се инкорпорирани во ткива, органи, и целокупниот организам,
каде постојано овие клетки зависат и се прилагодуваат на контекстот на интеракциите
на кои се изложени.
Сепак, степенот на развој на овие технологии се уште не е на доволно
напреднато ниво за овие вештачки репликати доследно да ги отсликуваат
интеракциите што се случуваат во крајно диференцираните клетки, како што се
кардиомиоцитите. Дополнително, самиот процес на изолација, засејување и
индуцирана диференцијација кај ваквиот вид крајно диференцирани ткива, воведува
Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето
на молекуларна биологија и генетика
Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 15 од 16

шокови и промени кај овие клетки, со што ги насочува да се прилагодуваат на средина

што се разликува од автентичната, и како таква може да произведе грешни податоци
за тоа како вистински функционира автентичниот систем.

Етички аспекти на спроведувањето на експериментите со лабораториски

стаорци

Постојат неколку методи за еутаназија на лабораториските стаорци, меѓу кои

најчесто користено е придушувањето со ЦО2, и со анестезија. Во последните неколку
години произлегоа и истражувања дека задушувањето со ЦО2 како метод за
еутаназија на лабораториски животни, всушност може да биде и многу болно и
трауматично за животните (Grens, 2019). Во научното истражување што ќе се
спроведува на катедрата за физиологија ќе се користи методот со анестезија. Овој
метод е похуман, а и анестезијата нема да влијае на резултатите од лабораториските
испитувања.
За воспоставување на култура на клетки од кардиомиоцити веројатно срцевото
ткиво ќе мора да се земе од млади стаорци возрасни два до три дена, каде постојат
голем број кардиомиоцити во срцевото ткиво што се уште не се целосно
диференцирани, и ја немаат изгубено можноста за делба целосно. Со изолација на
овие клетки и нивно растење во култура, ќе се овозможи репрезентативно следење на
биохемиските патеки што водат до хипертрофија, но и нивна апоптоза во срцето.
Постои значителна потреба од разјаснување на можните насоки за превенција и
заштита од кардиоваскуларните болести, а податоците што ќе се приберат и
анализираат со ова истражување може да имаат значителен позитивен ефект во таа
насока.
Од друга страна, горенаведените опсервации за можноста на користење на
алтернативен пристап, или аналитички метод, водат кон заклучокот дека единствено
предложените методи можат да ги произведат потребните податоци за анализа.
Досегашната анализа за ефектот и влијанието што предложените методи го имаат
води кон заклучокот дека жртвувањето на животните за научно истражување има
етички конфликти. Но, жртвувањето на животните за научни цели е поетично од
нивното убивање за исхрана на човештвото, или не истражување на механизми за
намалување на болката и болестите кои го мачат човештвото.

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика
 Дино Атанасов 28.06.2019 Стр. 16 од 16

Листа на референци

1. Bols, P., Langbeen, A., Verberckmoes, S., & Leroy, J. (2010). Artificial insemination in
livestock production: The Vet’s perspective. FACTS, VIEWS & VISION, 6-12.
2. Catts, O., & Zurr, I. (2008). The Ethics of Experiential Engagement with the
Manipulation of Life. Tactical Biopolitics, 125-140.
doi:10.7551/mitpress/9780262042499.003.0008
3. Ceballos, G., Ehrlich, P. R., & Dirzo, R. (2017). Biological annihilation via the ongoing
sixth mass extinction signaled by vertebrate population losses and declines.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 114(30).
doi:10.1073/pnas.1704949114
4. Das, S., Babick, A. P., Xu, Y., Takeda, N., Rodriguez-Levya, D., & Dhalla, N. S. (2010).
TNF-α-mediated signal transduction pathway is a major determinant of apoptosis in
dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 14(7), 1988-
1997. doi:10.1111/j.1582-4934.2009.00904.x
5. Grens, K. (2014, November 04). To Kill a Lab Rat. Retrieved from https://www.the-
scientist.com/news-opinion/to-kill-a-lab-rat-36470
6. Montaldo, H. H. (2006). Genetic engineering applications in animal breeding.
Electronic Journal of Biotechnology, 9(2), 157-170. doi:10.2225/vol9-issue2-fulltext-7
7. NIH. (2010, July 23). Why Mouse Matters. Retrieved from
https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome
8. NIH. (2019). Clinical Trial Definition. Retrieved June 25, 2019, from
https://aidsinfo.nih.gov/understanding-hiv-aids/glossary/144/clinical-trial
9. NRC. (2011). Chimpanzees in Biomedical and Behavioral Research. The National
Academies Press. doi:10.17226/13257
10. Régnier, C., Achaz, G., Lambert, A., Cowie, R. H., Bouchet, P., & Fontaine, B. (2015).
Mass extinction in poorly known taxa. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 112(25), 7761-7766. doi:10.1073/pnas.1502350112
11. Schipani, S. (2019, February 27). The History of the Lab Rat Is Full of Scientific
Triumphs and Ethical Quandaries. Retrieved from
https://www.smithsonianmag.com/science-nature/history-lab-rat-scientific-
triumphs-ethical-quandaries-180971533/#TDt1bQ1OeB6zcOzP.99
12. Valk, J. V. (2018). Fetal bovine serum (FBS): Past – present – future. Altex, 99-118.
doi:10.14573/altex.1705101
13. WHO. (2019, June 11). Cardiovascular diseases (CVDs). Retrieved from
https://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/
14.

Предмет: Методологија на научноистражувачка работа со примена и примери во подрачјето

на молекуларна биологија и генетика

How to Choose a DRM Software to protect your document?