Клиничка биохемија

ТАТЈАНА РУШКОВСКА
КЛИНИЧКА БИОХЕМИЈА
Штип, 2019
Татјана Рушковска
Автор: проф. д-р Татјана Рушковска
Рецензенти:
проф. д-р Слобода Џекова-Стојкова
проф. д-р Ицко Ѓоргоски
Лектор: проф. д-р Толе Белчев
Оригинални фотографии: Коста Замановски
Илустрации и дизајн на корици: Вебмастер, Охрид

http://www.webmaster.mk
Техничко уредување: Татјана Рушковска
Издавач: Универзитет „Гоце Делчев” - Штип
Објавено во е-библиотека: https://e-lib.ugd.edu.mk
CIP - Каталогизација во публикација

Национална и универзитетска библиотека "Св. Климент Охридски", Скопје
577.1:61(075.8)
616-074(075.8)
РУШКОВСКА, Татјана
Клиничка биохемија [Електронски извор] / Татјана Рушковска. -
Штип : Универзитет 'Гоце Делчев"-Штип, Факултет за медицински науки,
2019
Начин на пристап (URL): https://e-lib.ugd.edu.mk/804. - Текст во PDF

формат, содржи 248 стр., илустр. - Наслов преземен од екранот. - Опис на
изворот на ден 07.02.2019. - Библиографија: стр. 231-233. - Регистар
ISBN 978-608-244-599-1
а) Клиничка биохемија - Високошколски учебници

COBISS.MK-ID 109555722
УНИВЕРЗИТЕТ „ГОЦЕ ДЕЛЧЕВ” – ШТИП
ФАКУЛТЕТ ЗА МЕДИЦИНСКИ НАУКИ
проф. д-р Татјана Рушковска
Штип, 2019
ПРЕДГОВОР
Учебникот „Клиничка биохемија“ почнав да го создавам во сега веќе далечната 2009

година кога за прв пат бев ангажирана на Факултетот за медицински науки при
Универзитетот „Гоце Делчев“ во Штип, токму на предметот Клиничка биохемија. Уште
на самиот почеток од мојот ангажман почнав да подготвувам материјали во текстуална
форма со цел на студентите да им го олеснам совладувањето на наставните содржини.
Во годините што следуваа збирката предавања и вежби претрпуваше промени. Се
трудев материјалите да бидат што поконцизни, а во исто време сеопфатни и
квалитетни; да претставуваат израз на моето долгогодишно работно искуство, но во
исто време вистински да им бидат од корист на студентите. На тој начин, со текот на
годините, полека се оформуваше овој учебник.
Учебникот „Клиничка биохемија“ е наменет првенствено за студентите од студиската
програма по фармација кои предметот Клиничка биохемија го слушаат како
задолжителен предмет во седмиот семестар, со фонд на часови 2+2+1. При
пишувањето на овој учебник особено настојував материјата да ја обработам на начин
што соодветствува со структурата и целите на оваа студиска програма. Учебникот го
опфаќа комплетниот материјал за теоретска и практична настава, од причина што
претходните обиди за раздвојување на материјата се покажаа како непрактични.
Освен студентите по фармација, овој учебник можат да го користат и студентите од
студиската програма по општа медицина, студентите од стручните студии за
медицински лаборанти (прв и втор циклус), како и сите останати студенти од Факултетот
за медицински науки кои имаат интерес за клиничката биохемија.
Години наназад, голем дел од материјалот што е содржан во овој учебник студентите
го користеа во форма на скрипта за интерна употреба. Исто така, еден дел од оваа
материја беше инкорпориран во скриптата и практикумот со наслов „Основи на
биохемија“. Но, во сегашнава форма, учебникот „Клиничка биохемија“ претставува
значаен исчекор напред. За ова огромен придонес имаат и сугестиите дадени од страна
на рецензентите на учебникот, почитуваните проф. д-р Слобода Џекова-Стојкова и
проф. д-р Ицко Ѓоргоски, за што искрено сум им благодарна.
Ја изразувам својата благодарност и кон моите соработници Викторија Максимова,
Павлинка Кокошкарова и Милкица Јанева, како и кон студентите Коста Замановски и
Александар Лонгуров кои ми помогнаа при конечното техничко оформување на
учебникот.
Позната е изреката дека најдобрата книга е онаа што не е напишана. Навистина,
секогаш може подобро, поквалитетно, поиздржано. Најверојатно е така и со овој
учебник. Годините што доаѓаат ќе бидат испит за неговиот квалитет, а јас со
задоволство ќе ги слушнам мислењата и сугестиите од читателите.
Од авторот
СОДРЖИНА
1. ВОВЕД ВО КЛИНИЧКАТА БИОХЕМИЈА................................................................................................ 1

1.1. Дефиниција на клиничката биохемија ............................................................................................. 1
1.2. Фази во работниот процес во клиничко-биохемиската лабораторија ................................. 1
1.2.1. Преаналитичка фаза и нејзини карактеристики .................................................................... 2
1.2.2. Аналитичка фаза ............................................................................................................................... 5
1.2.3. Постаналитичка фаза ...................................................................................................................... 6
1.3. Основни мерки за заштита при работа во хемиска лабораторија и во биохемиска
лабораторија со општа намена ................................................................................................................... 7
1.4. Заштита при работа со крв и телесни течности ........................................................................... 8
1.5. Запознавање со затворен систем за земање на крв. Земање на венска и капиларна
крв. ...................................................................................................................................................................... 10
1.6. Пипетори и техники на пипетирање ................................................................................................ 14
1.6.1. Техники на пипетирање ................................................................................................................ 15
1.6.2. Исфрлање (вадење) на продолжетоците ............................................................................... 17
1.7. Основни принципи на спектрофотометријата ............................................................................ 17
1.8. Центрифугирање .................................................................................................................................... 20
1.9. Значење на чистотата на водата во клиничко-биохемиската лабораторија ................... 21
1.10. Влијание на некои ендогени и егзогени фактори врз резултатите од клиничко-
биохемиските анализи ................................................................................................................................. 21
1.10.1. Влијание на ендогените (биолошките) фактори врз концентрацијата на клиничко-
биохемиските параметри ........................................................................................................................ 21
1.10.2. Влијание на егзогените фактори врз резултатите од клиничко-биохемиските
анализи .......................................................................................................................................................... 23
1.11. Концепт на контрола на квалитетот на резултатите во клиничко-биохемиските
лаборатории .................................................................................................................................................... 24
2. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ МЕТОДИ ЗА ДИЈАГНОСТИЦИРАЊЕ И СЛЕДЕЊЕ НА
НАРУШУВАЊАТА НА МЕТАБОЛИЗМОТ НА ЈАГЛЕХИДРАТИТЕ, СО ПОСЕБЕН ОСВРТ НА
ШЕЌЕРНАТА БОЛЕСТ ................................................................................................................................... 25
2.1. Јаглехидрати: општи карактеристики, поделба и основи на метаболизмот ................... 25
2.1.1. Моносахариди .................................................................................................................................. 26
2.1.1.1. Изомерија кај моносахаридите ........................................................................................... 26
Оптичка изомерија ................................................................................................................................ 26
Стереоизомерија .................................................................................................................................... 26
α / β-изомерија ........................................................................................................................................ 27
2.1.1.2. Хемиски реакции на моносахаридите .............................................................................. 28
Фелингова проба ................................................................................................................................... 28
2.1.1.3. Поважни моносахариди ........................................................................................................ 29
2.1.2. Олигосахариди ................................................................................................................................ 30
2.1.3. Полисахариди .................................................................................................................................. 32
2.1.3.1. Хомогликани .............................................................................................................................. 32
2.1.3.2. Хетерогликани .......................................................................................................................... 32
2.1.4. Дигестија и апсорпција на јаглехидратите ............................................................................ 32
2.1.5. Основи на метаболизмот на јаглехидратите ........................................................................ 34
2.2. Регулација на концентрацијата на глукоза во крвта ................................................................. 35
2.3. Клиничко-биохемиски методи за дијагностицирање и следење на шеќерната болест38
2.3.1. Определување на концентрацијата на глукоза во крв ...................................................... 39
2.3.1.1. Определување на концентрацијата на глукоза во серум или плазма со глукоза
оксидаза (GOD-PAP метода) .............................................................................................................. 40
Техника на пипетирање при мануелна изработка на клиничко-биохемиски анализи .. 42
2.3.1.2. Определување на концентрацијата на глукоза во серум или плазма со
методата со хексокиназа..................................................................................................................... 43
2.3.1.3. Определување на концентрацијата на глукоза во полна крв со прирачен
глукометар ............................................................................................................................................... 45
2.3.2. Определување на глукоза и кетонски тела во урината .................................................... 46
2.3.3. Орален глукоза толеранс тест – оГТТ ..................................................................................... 48
2.3.4. Дијагностичко значење на хемоглобин А1ц и негово определување ......................... 50
2.3.5. Фруктозамин ..................................................................................................................................... 53
2.3.6. Дијагностичко значење на микроалбуминуријата .............................................................. 53
2.3.7. Дијагностичко значење на инсулинот и Ц-пептидот .......................................................... 54
3. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ МЕТОДИ ЗА ПРОЦЕНКА НА ЛИПИДНИОТ СТАТУС ................... 56
3.1. Липиди: општи карактеристики, поделба и основи на метаболизмот ............................... 56
3.1.1. Триглицериди................................................................................................................................... 56
3.1.1.1. Масни киселини ....................................................................................................................... 57
3.1.2. Восоци ................................................................................................................................................ 59
3.1.3. Фосфолипиди .................................................................................................................................. 60
3.1.4. Гликолипиди..................................................................................................................................... 61
3.1.5. Стероиди ............................................................................................................................................ 62
3.1.6. Каротеноиди ..................................................................................................................................... 64
3.2. Дигестија и апсорпција на липидите ............................................................................................... 64
3.3. Основи на метаболизмот на липидите .......................................................................................... 65
3.4. Липопротеини во крвната плазма.................................................................................................... 66
3.4.1. Поделба и номенклатура на липопротеините од крвната плазма ................................ 67
3.4.2. Метаболизам на липопротеините од крвната плазма ....................................................... 69
3.4.2.1. Метаболизам на хиломикроните ....................................................................................... 69
3.4.2.2. Метаболизам на VLDL ............................................................................................................ 70
3.4.2.3. Метаболизам на LDL............................................................................................................... 70
3.4.2.4. Метаболизам на HDL .............................................................................................................. 71
3.4.3. Нарушувања на метаболизмот на липопротеините од крвната плазма ..................... 73
3.4.4. Улога на липопротеините од крвната плазма во процесот на атерогенезата .......... 74
3.5. Клиничко-биохемиски параметри за дијагностика на дислипидемиите ............................ 77
3.5.1. Определување на концентрацијата на вкупен холестерол ............................................. 78
3.5.2. Определување на концентрацијата на триглицериди ....................................................... 80
3.5.3. Определување на концентрацијата на HDL-холестерол со метода на таложење .. 82
3.5.4. Определување на концентрацијата на HDL-холестерол со директна метода .......... 84
3.5.5. Определување на концентрацијата на LDL-холестерол со директна метода .......... 86
3.5.6. Определување на концентрацијата на LDL-холестерол со метода на таложење ... 88
3.5.7. Пресметување на концентрацијата на LDL-холестерол со Friedеwald-ова формула
.......................................................................................................................................................................... 88
3.5.8. Дијагностичко значење на аполипопротеините А I И В-100 ............................................ 89
4. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ АНАЛИЗИ НА ПРОТЕИНИ ................................................................... 90
4.1. Аминокиселини....................................................................................................................................... 90
4.1.1. Општи својства на аминокиселините ...................................................................................... 90
4.1.2. Пептидна врска ................................................................................................................................ 91
4.1.3. Поделба на аминокиселините .................................................................................................... 92
4.2. Пептиди ..................................................................................................................................................... 94
4.2.1. Улога на пептидите во организмот........................................................................................... 94
4.3. Протеини ................................................................................................................................................... 94
4.3.1. Прости протеини ............................................................................................................................. 95
4.3.2. Сложени протеини.......................................................................................................................... 95
4.3.3. Денатурација на протеините ....................................................................................................... 96
4.4. Дигестија и апсорпција на протеините ........................................................................................... 96
4.5. Основи на метаболизмот на протеините ...................................................................................... 97
4.6. Протеини во крвната плазма – основен протеински статус .................................................. 98
4.7. Квантитативно определување на вкупни протеини ................................................................ 100
4.8. Квантитативно определување на албумини .............................................................................. 102
4.9. Основни принципи на имунотурбидиметријата и имунонефелометријата .................... 104
4.9.1. Реакција помеѓу антиген и антитело ...................................................................................... 104
4.9.2. Принципи на детекција ............................................................................................................... 105
4.9.3. Стандардна крива ......................................................................................................................... 106
4.9.4. Значајни елементи на квантитативната имунопреципитациона крива ..................... 106
4.10. Приказ на ласерски нефелометар: MININEPHplus ................................................................. 108
4.10.1. Начин на изработка на анализи на ласерскиот нефелометар MININEPHplus ....... 109
4.11. Дијагностичко значење на некои специфични протеини .................................................... 110
4.11.1. Определување на CRP со метода на аглутинација – Квалитативна и
семиквантитативна метода .................................................................................................................. 111
4.12. Определување на концентрацијата на фибриноген во крвната плазма ....................... 112
4.13. Протеини во урина ............................................................................................................................ 113
4.13.1. Определување на албумини во урина со тест-ленти .................................................... 115
4.13.2. Определување на протеини во урина со сулфосалицилна киселина .................... 115
4.13.3. Определување на протеини во урина со пирогалол црвено – квантитативна
метода .......................................................................................................................................................... 116
4.14. Комплетен преглед на урина ......................................................................................................... 116
5. ДЕГРАДАЦИОНИ ПРОДУКТИ ............................................................................................................... 118
5.1. Билирубин .............................................................................................................................................. 118
5.1.1. Определување на вкупен и директен билирубин во серум или плазма .................. 122
5.1.2. Определување на билирубин во урина ................................................................................ 124
5.1.2.1. Определување на билирубин во урина со тест-ленти ............................................ 124
5.1.2.2. Докажување на присуството на билирубин во урина со јод-алкохол (тест на
Rosin) ........................................................................................................................................................ 124
5.1.3. Определување на уробилиноген во урина ......................................................................... 125
5.1.3.1. Определување на уробилиноген во урина со тест-ленти ...................................... 125
5.1.3.2. Определување на уробилиноген во урината со тестот на ERLICH ..................... 125
5.2. Уреа ........................................................................................................................................................... 126
5.2.1. Определување на уреа во серум, плазма и урина (ензимско-колориметриски тест)
........................................................................................................................................................................ 127
5.3. Креатинин ............................................................................................................................................... 130
5.3.1. Определување на креатинин во серум и урина со Jaffé-ова реакција и
пресметување на креатинин клиренс .............................................................................................. 132
5.4. Мочна киселина (Аcidum uricum) ................................................................................................... 135
5.4.1. Определување на мочна киселина во серум, плазма и урина со PAP метода
(ензимско-колориметриски тест) ....................................................................................................... 137
6. КЛИНИЧКО-ЕНЗИМОЛОШКИ АНАЛИЗИ ........................................................................................... 140
6.1. Дефиниција и хемиска структура на ензимите ......................................................................... 141
6.2. Номенклатура и класификација на ензимите ............................................................................ 141
6.3. Активен центар ..................................................................................................................................... 142
6.4. Механизам на ензимските реакции................................................................................................ 143
6.5. Брзина на ензимските реакции ....................................................................................................... 144
6.5.1. Влијание на температурата ....................................................................................................... 144
6.5.2. Влијание на концентрацијата на водородните јони ......................................................... 144
6.5.3. Влијание на концентрацијата на ензимот ............................................................................ 144
6.5.4. Влијание на концентрацијата на супстратот ...................................................................... 144
6.5.5. Влијание на ефекторите ............................................................................................................. 145
6.6. Основи на клиничката ензимологија ............................................................................................ 147
6.6.1. Физиолошки основи на дијагностичкото значење на ензимите .................................. 147
6.6.2. Општи принципи на методите за определување на каталитичката активност на
ензимите ..................................................................................................................................................... 150
6.6.3. Единици за изразување на ензимската активност ........................................................... 152
6.7. Аспартат аминотрансфераза ........................................................................................................... 153
6.8. Аланин аминотрансфераза .............................................................................................................. 158
6.9. Креатин киназа ...................................................................................................................................... 162
6.10. α-Амилаза ............................................................................................................................................. 166
6.11. γ-Глутамил трансфераза ................................................................................................................. 169
6.12. Лактат дехидрогеназа ...................................................................................................................... 172
6.13. Алкална фосфатаза .......................................................................................................................... 175
6.14. Некои други позначајни ензими за хуманата in vitro дијагностика .................................. 178
6.14.1. Липаза ............................................................................................................................................. 178
6.14.2. α-Хидроксибутират дехидрогеназа ...................................................................................... 178
6.14.3. Глутамат дехидрогеназа .......................................................................................................... 178
6.14.4. Кисела фосфатаза...................................................................................................................... 179
6.14.5. Холинестераза ............................................................................................................................. 179
7. МАКРОЕЛЕМЕНТИ И ЖЕЛЕЗО ............................................................................................................. 181
7.1. Електролити ........................................................................................................................................... 183
7.1.1. Натриум ............................................................................................................................................ 183
7.1.2. Калиум .............................................................................................................................................. 184
7.1.3. Определување на натриум и калиум ..................................................................................... 185
7.1.4. Хлорид .............................................................................................................................................. 187
7.1.5. Определување на осмолалност на крвната плазма и урината .................................... 187
7.1.6. Бикарбонат ...................................................................................................................................... 188
7.1.7. Изработка на гасни анализи...................................................................................................... 190
7.2. Калциум, фосфор и магнезиум ....................................................................................................... 193
7.2.1. Калциум ............................................................................................................................................ 193
7.2.2. Фосфор ............................................................................................................................................. 196
7.2.3. Магнезиум ........................................................................................................................................ 199
7.3. Железо ..................................................................................................................................................... 202
7.3.1. Серумско железо .......................................................................................................................... 208
7.3.2. TIBC (Total Iron Binding Capacity) и UIBC (Unsaturated Iron Binding Capacity) ......... 210
7.3.3. Пресметување на сатурацијата на трансферинот ............................................................ 212
7.3.4. Феритин ............................................................................................................................................ 212
8. ЕНЗИМСКО-ИМУНОХЕМИСКИ МЕТОДИ ВО КЛИНИЧКАТА БИОХЕМИЈА.............................. 213
8.1. Основни принципи на ензимско-имунохемиските методи ................................................... 213
8.1.1. Компетитивни ензимско-имунохемиски методи со фотометриска детекција ........ 214
8.1.1.1. Определување на концентрацијата на кортизол со компетитивна ензимско-
имунохемиска метода со фотометриска детекција ................................................................ 215
8.1.2. Сендвич ензимско-имунохемиски методи со фотометриска детекција ................... 219
8.1.2.1. Определување на концентрацијата на Ц-пептид со сендвич ензимско-
имунохемиска метода со фотометриска детекција ................................................................ 220
8.1.3. Основни принципи на хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски методи .. 222
8.1.3.1. Определување на концентрацијата на кортизол во серум со автоматизирана
хемилуминисцентна ензимско-имунохемиска метода ........................................................... 223
ЛИСТА НА КРАТЕНКИ ................................................................................................................................. 227
ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................. 231
ПРЕДМЕТЕН АЗБУЧЕН ИНДЕКС ............................................................................................................. 234
1. ВОВЕД ВО КЛИНИЧКАТА БИОХЕМИЈА
1.1. Дефиниција на клиничката биохемија
Биохемијата e природна наука што го проучува хемискиот состав на живите

организми и хемиските процеси што се одвиваат во нив. Таа е хемија на живата
материја, односно хемија на животот.
Биохемијата може да се подели во две главни области:

1. Статичка (дескриптивна) биохемија, која го проучува хемискиот состав на
живата материја и врската помеѓу хемиската структура и биолошката функција
и
2. Динамичка биохемија, која ја проучува севкупноста на хемиските реакции
кои се одвиваат во живите организми, односно го проучува метаболизмот.
Биохемијата може да се подели и на друг начин и тоа на:
1. Биохемија на растенијата,
2. Биохемија на животните,
3. Биохемија на микроорганизмите,
4. Компаративна биохемија, која се занимава со споредување на хемискиот
состав и хемиските процеси кај разни видови организми и
5. Клиничка биохемија.
Според дефиницијата која е дадена од страна на Интернационалната федерација за

клиничка хемија (IFCC – International Federation of Clinical Chemistry) клиничката хемија
ги проучува хемиските аспекти кај здравите и болните лица со примена на
хемиско-лабораториски методи, на кој начин се доаѓа до резултати од
испитувањата кои се користат за превенција на заболувањата, дијагноза и
контрола (следење) на третманот на заболувањето.
Според тоа, клиничката биохемија истовремено е и фундаментална и применета наука
која се занимава со проучување на хемискиот состав на телесните течности и ткива.
Со оглед на тоа што биохемијата како наука се дефинира како „хемија на животот“,
клиничката биохемија слободно може да се дефинира како „хемија на здравјето и
болеста“.
Термините „клиничка биохемија“, „медицинска биохемија“ и „клиничка хемија“ се
синоними.
1.2. Фази во работниот процес во клиничко-биохемиската лабораторија
Со цел да се добијат точни лабораториски резултати, во поранешните години

централно внимание им било посветувано само на мерните процедури и постапки,
односно на аналитичката фаза од лабораториската работа.
Меѓутоа, во последно време преовладува ставот дека за добивање на точни
лабораториски резултати целокупниот процес на работа треба да биде прецизно
дефиниран, стандардизиран и контролиран, и тоа почнувајќи од земањето, транспортот
и подготовката на примерокот, односно преаналитичката фаза, па сè до проверката и
издавањето на лабораториските резултати, односно постаналитичката фаза.
Од целокупниот лабораториски дијагностички процес, на преаналитичката фаза
отпаѓа околу 57%, при што 20% надвор од лабораторијата и 37% во самата
лабораторија, 25% отпаѓаат на аналитичката фаза и 18% на постаналитичката фаза.
Со цел резултатите од клиничко-биохемиските испитувања да бидат точни и да
се изработат и издадат на време, неопходна е одлична организација на работата и
тимско работење.
1
1.2.1. Преаналитичка фаза и нејзини карактеристики
Како што е кажано погоре, преаналитичката фаза ги опфаќа процесите на

земање, транспорт и подготовка на примерокот за анализа.
Работниот процес во клиничко-биохемиските лаборатории започнува со прием
на пациентите во лабораторијата кој се состои од:
 Административен дел и
 Земање и / или оставање на материјал за анализа.
Административниот дел од приемот на пациентот ги опфаќа (1)
идентификацијата на пациентот и на анализите што е потребно да се изработат, и (2)
нивното евидентирање во лабораторискиот протокол.
Потоа следува постапката на земање, односно оставање на материјал за
анализа. (Од пациентот се зема крв за анализа, а истиот остава урина за анализа.) Во
оваа фаза пациентот треба добро да се информира за начинот на земање (оставање)
на материјалот за анализа, како и за времето потребно за изработка на анализите.
Посебно внимание во оваа фаза треба да се обрне на пристапот кон децата,
изнемоштените лица и лицата со посебни потреби. Просторијата за земање на крв
треба да биде чиста, светла и проветрена, и да располага со специјален стол за земање
на крв. Особено внимание треба да се посвети на одржување на хигиената на работната
површина, која треба редовно да се чисти и дезинфицира. Санитарниот јазол за
оставање на примероци урина исто така треба редовно да се чисти и дезинфицира.
Во некои клиничко-биохемиски лаборатории се анализираат и примероци кои не
се земаат (оставаат) во самата лабораторија, туку во неа се донесуваат, најчесто од
болничките одделенија или пак од истурени пунктови на самата лабораторија. Во
таквите случаи медицинскиот персонал од одделенијата и истурените пунктови
треба да биде добро обучен за правилно земање и транспорт на материјалот за
анализа. Исто така, медицинскиот персонал од одделенијата и истурените
пунктови треба да биде запознаен и со влијанието на преаналитичката фаза врз
точноста на резултатите од клиничко-биохемиските анализи, со цел да обрне
поголемо внимание на овие постапки.
Клиничко-биохемиските параметри најчесто се определуваат во примероци од

крв. За анализа може да се користи венска, артериска или капиларна крв. Сепак,
најчесто се анализираат примероци од венска и капиларна крв, додека артериската крв
се користи поретко, на пример за изработка на гасни анализи во единиците за
интензивна нега.
При земањето на крв треба да се води особена грижа за времето на земање на
примерокот, од причина што концентрацијата на некои аналити значајно се менува во
текот на денот. Така на пример, концентрацијата на серумското железо е највисока
наутро, а може да варира и до 70% во текот на денот. Концентрацијата на кортизолот
исто така е највисока наутро. Овие варијации кај железото и кортизолот се резултат на
циркадијалниот ритам. Од друга страна варираат и концентрациите на глукозата и
триглицеридите, во прв ред поради влијанието на редовните оброци во текот на денот.
Поради тоа најдобро е крв да се зема наутро, после „ноќно гладување“. По исклучок,
крв за анализа може да биде земена и во било кое време од денот или ноќта, кај
пациенти кај кои тоа е неопходно (акутни состојби, трауми и сл.).
Ако крвта се зема надвор од лабораторијата, на пример во болничките
одделенија, неопходно е примероците веднаш да бидат доставени во лабораторијата,
со означен датум и време на земањето на крв. Пролонгираниот контакт на серумот со
крвниот коагулум, односно на плазмата со крвните клетки, влијае врз концентрацијата
на некои аналити како што се на пример глукозата (намалување на нејзината
концентрација) и калиумот (зголемување на неговата концентрација).
При самото земање на крв, а и потоа, во процесот на обработка на примероците,
треба да се води особена грижа да не дојде до хемолиза - прскање на еритроцитите и
ослободување на нивната содржина во серумот, односно плазмата. Хемолизата може
2
да настане при земањето на крв кај пациенти со тенки, фрагилни и/или колабирани вени,
каде земањето на крв е отежнато, односно кога крвта не тече со рамномерен млаз, туку
капка по капка. Втора причина за појава на хемолиза е силното мешање на крвта после
венепункцијата. Поради тоа е важно правилно да се манипулира со епруветите по
земањето на крв. Замрзнувањето на полна крв задолжително резултира со силна
хемолиза.
Хемолизата интерферира при одредувањето на најголемиот број рутински
клиничко-биохемиски параметри.
Дури и кога се работи за блага хемолиза, таа може да предизвика зголемување
на концентрацијата на некои состојки во серумот (плазмата) доколку истите се наоѓаат
во високи концентрации во крвните клетки. Таков е случајот со калиумот, магнезиумот,
лактат дехидрогеназата, трансаминазитe. Како резултат на хемолизата ќе се добијат
пониски концентрации од реалните за оние состојки кои ги има помалку во еритроцитите
во однос на серумот. Во случај на изразена хемолиза обојувањето од хемоглобинот
може да предизвика методолошка интерференција кај некои анализи.
По земањето на крв следува обработка на примероците, која зависи од типот

на примерокот и од тоа кои анализи треба да бидат изработени.
Серумските епрувети веднаш по земањето на крв се превртуваат само еднаш
(за да се оствари подобар контакт помеѓу крвта и активаторот на коагулација), а потоа
се оставаат во вертикална положба 20-30 минути, време кое е потребно за да коагулира
крвта. Процесот на коагулација е забавен ако епруветата после земањето на крв се
држи на мраз, што е потребно за изработка на некои специфични анализи.
Потоа следува процесот на центрифугирање, 10 минути со релативна
центрифугална сила од 2000 х g на 20ºС, со што се врши одвојување на серумот од
крвниот коагулум. При центрифугирањето епруветите секогаш мора да бидат затворени
поради тоа што при центрифугирање на отворени епрувети се создаваат аеросоли кои
претставуваат ризик за инфекција кај лабораторискиот персонал, а истовремено доаѓа
и до испарување на примерокот, што може да влијае врз точноста на резултатите.
Вака подготвените примероци:
а) Можат директно да бидат внесени во автоматски анализатори кои имаат
техничка можност да работат со примарни епрувети,
б) Од нив може да се издвои серумот кој ќе се внесе во анализатор на соодветни
носачи или
в) Можат да се употребат за мануелна изработка на определени анализи.
Епруветите со антикоагуланс веднаш по земањето на крв благо се

промешуваат со превртување 2-3 пати, после што можат да се остават во
хоризонтална, вертикална или пак искосена положба (стандардно се работи со затворен
систем за земање на крв, така што нема опасност од излевање на крвта надвор од
епруветата).
Понатамошната обработка ќе зависи од тоа дали за изработката на анализите
ќе ни биде потребна полна крв или пак крвна плазма. Доколку ни е потребна полна крв
(на пример за определување на брзина на седиментација на еритроцитите, изработка
на хемограм, определување на хемоглобин А1ц), епруветите со антикоагуланс треба
добро да се промешаат пред изработката на анализите, најдобро на специјална
мешалка (Слика 1.1.). Доколку ни е потребна крвна плазма (на пример за определување
на концентрацијата на фибриноген, за изработка на коагулационен статус), тогаш
епруветите со антикоагуланс се центрифугираат.
3
Слика 1.1. Изглед на мешалка за крвни епрувети
(Извор – Sarstedt, Германија)
Во широка употреба се следните антикоагуланси: етилендиаминтетраоцетна

киселина (EDTA), цитрат, хепарин, оксалат и флуорид.
EDTA најчесто се користи во облик на калиумови и натриумови соли.
Нејзината антикоагулантна активност се должи на тоа што создава хелати со
калциумовите јони. Обично се користи за хематолошки испитувања (изработка на
комплетна крвна слика, односно хемограм).
Натриум цитратот има својство да го трансформира калциумот во
растворлива, нејонизирана форма, на што се должи неговото антикоагулантно
дејство. Го има во епруветите за хемостаза и во оние за одредување на брзината
на седиментација на еритроцитите.
Антикоагулантната активност на хепаринот се должи на неговото
својство да го инхибира трансформирањето на протромбинот во тромбин.
Хепаринот е супериорен во однос на останатите антикоагуланси поради фактот
што не интерферира со повеќето методи. Недостаток му е високата цена. Се
користат натриумови, калиумови или литиумови соли на хепарин. Хепаринот како
антикоагуланс најчесто се користи при изработка на гасни анализи.
Од оксалатите најчесто се користи калиум оксалат, поради својата
растворливост. Оксалатите го врзуваат калциумот и на тој начин ја спречуваат
коагулацијата.
Натриум флуоридот во концентрација од околу 10 mg/mL крв ја спречува
коагулацијата. Вообичаено натриум флуоридот попрво се користи како конзерванс
отколку како антикоагуланс. Ја инхибира гликолизата со што ја стабилизира
концентрацијата на глукоза во примерокот. Најчесто се користат смеси од 3 дела
оксалат и 1 дел флуорид или пак 1 дел EDTA и 2 дела флуорид.
За клиничко-биохемиски анализи можат да се користат и различни видови

примероци на урина и тоа:
1. Прва утринска урина,
2. Било кој поединечен примерок на урина и
3. Урина која е собирана во точно определен временски интервал.
Првите два вида примероци обично се користат за квалитативни испитувања
(иако има и исклучоци како што е на пример определувањето на концентрацијата на
коскениот маркер дезоксипиридинолин кое се врши во втора утринска урина), а третиот
вид за квантитативни испитувања.
4
Првата утринска урина се користи за изработка на т.н. комплетен преглед на
урина, кој се состои од два дела а) хемиски преглед, кој вообичаено се изработува со
помош на тест-ленти за урина и б) микроскопски преглед на седиментот. Ова е едно
од најчестите клиничко-биохемиски испитувања воопшто. Првата утринска урина е
најконцентрирана и поради тоа е најпогодна за микроскопски испитувања. Пред
оставањето на овој вид на примерок неопходна е соодветна хигиена (тоалета) на
пациентот. Најдобро е да се користат садови за урина за еднократна употреба. Кај
пациенти со акутна болка (ренална или абдоминална колика) комплетен преглед на
урина може да се изврши и во било кој поединечен примерок на урина. Комплетниот
преглед на урината треба да се изврши веднаш, а најдоцна за два часа по оставањето
на примерокот, пред сè заради нестабилноста на елементите на седиментот, но и
поради развој на бактерии во примерокот.
Урината може да се собира и во точно определен временски интервал и тоа
најчесто во период од 2, 12 или 24 часа. При тоа целата урина треба да се собира во
еден сад со соодветен волумен. Собирањето на ваков примерок на урина се врши на
следниот начин (примерот е даден за 24-часовна урина):
Првата утринска урина на почетокот на испитувањето се фрла, а потоа се
собираат сите останати порции на урина во текот на денот и ноќта, како и првата
утринска урина од наредниот ден. Поединечните порции на урина се собираат во
посебен чист сад, а потоа се претураат во садот во кој се собираат сите останати порции
на урина. Во текот на собирањето урината треба да се чува на 4°C. За изработка на
некои анализи потребно е во садот за собирање на урината да се стави соодветен
конзерванс чија улога е да го спречи бактерискиот раст или хемиското разлагање на
поодделни состојки. На крајот од собирањето целата урина добро се промешува, се
мери нејзиниот волумен (диуреза) и се одвојува примерок од околу 10 – 15 mL кој се
носи во лабораторијата за квантитативна анализа.
Освен крв и урина, во клиничко-биохемиските лаборатории може да се

анализираат и други телесни течности како што се: цереброспинална течност
(ликвор), амнионска течност, плеврална течност, перикардијална течност,
перитонеална течност, синовијална течност, семена течност, плунка.
Во клиничко-биохемиските лаборатории се анализираат и фецес, бубрежни
камчиња, хемолизат на еритроцити и примероци од ткива.
За анализа на содржината на елементи во траги можат да се користат и
примероци од коса и нокти.
1.2.2. Аналитичка фаза
Аналитичката фаза ги опфаќа самите лабораториски испитувања, односно

мерните процедури и постапки.
Освен за правилното поставување на методите и редовната калибрација и
контрола, во оваа фаза треба да се води сметка и за следното:
a) Лабораториската стакларија треба да биде добро измиена со детергент и вода
со чистота на реагенс тип 3, а потоа задолжително да биде исплакната со вода со
степен на чистота кој соодветствува со анализите кои треба да се изработуваат со таа
стакларија и исушена во сушара. Садовите за еднократна употреба не се мијат.
б) Пипеторите треба да бидат исправни и редовно да се калибрираат и
одржуваат.
в) Реагенсите кои се подготвуваат во лабораторијата треба да се јасно означени,
со забележен датум кога се подготвени.
г) На комерцијалните реагенси исто така јасно треба да се означи датумот на
отворањето и/или растворањето. Секогаш треба точно и доследно да се следат
препораките кои се дадени од страна на производителот на реагенсите за рокот и
температурата на нивното чување пред и после отворање / растворање. Ако во
5
пакувањето на комерцијален реагенс има повеќе шишенца со ист реагенс, тогаш она
кое е отворено треба јасно да се обележи.
д) Лабораториската опрема треба правилно да се користи, со доследно
следење на сите препораки на производителот. Стручниот персонал во
лабораторијата мора да биде обучен веднаш да ја забележи и пријави секоја
неисправност и секое отстапување од вообичаената работа на опремата. За секој
апарат е неопходно да се води уредна евиденција за сите дефекти и сервисни
интервенции.
1.2.3. Постаналитичка фаза
Во постаналитичката фаза се врши проверка и издавање на резултатите.

Доколку има потреба, се врши повторување на некои анализи кај определени
примероци.
Се проверува исто така и интегритетот на секој примерок, односно се проверува
дали има присуство на хемолиза, липемија и/или иктерус (Слика 1.2.). Доколку ги има,
тоа се назначува на наодот, со коментар за потенцијалните интерференции.
Хемолизата е значаен фактор кој влијае врз точноста на резултатите. За неа

претходно е веќе кажано.
Липемична плазма или серум – се среќава кај пациенти со висока концентрација

на триглицериди. Плазмата е заматена до млечно бела, зависно од концентрацијата на
триглицеридите и видот на липопротеинските партикули кои се присутни во најголем
број. Истото се однесува и за серумските примероци. Високите концентрации на
триглицериди пречат при изработката на повеќето анализи. Најпрвин, самата липемија
може да предизвика нехомогеност на примерокот поради тоа што хиломикроните, кои
имаат висока процентуална застапеност на триглицериди, доколку се присутни, се
издвојуваат на површината. Од друга страна липемијата предизвикува и оптичка
интерференција, поради растурањето на светлината на скоро сите бранови должини.
Понатаму, липопротеинските партикули содржат инхибитори на α-амилазата, поради
што кај липемични примероци активноста на α-амилазата се намалува.
Иктерична плазма или серум – се среќава кај пациенти со висока концентрација

на билирубин. Билирубинот исто така пречи при изработката на некои анализи.
Карактеристичната жолта боја на иктеричниот серум / плазма, која доаѓа од покачената
концентрација на билирубинот, може да интерферира при фотометрирањето во
видливиот дел од спектарот, што се нарекува оптичка интерференција. Освен тоа
билирубинот може да интерферира и хемиски, на пример при определување на
концентрацијата на креатинин со Jaffé-ова реакција. Во овој случај лажно пониски
концентрации на креатинин се добиваат заради реакцијата на билирубинот со
алкалната компонента на реагенсот и создавањето на безбојни продукти.
6
Слика 1.2. Изглед на хемолитичен, иктеричен, липемичен и нормален серум
На крај, особено важен сегмент од работата во клиничко-биохемиската лабораторија е

континуираното одржување на условите во работната средина. Работните
површини, апаратурата и воопшто целиот работен простор треба да се одржуваат чисти
и редовно да се дезинфицираат.
1.3. Основни мерки за заштита при работа во хемиска лабораторија и во

биохемиска лабораторија со општа намена
Постојат низа опасности кои се присутни при работа во хемиските лаборатории и во

биохемиските лаборатории во кои се испитуваат неинфективни примероци.
Тие опасности генерално можат да се класифицираат на следниот начин:
 Опасност од хемиски агенси,
 Опасност од струен удар и
 Опасност од пожар.
Со цел да се создадат услови за безбедна работа, мора да се почитуваат основните
правила за работа во лабораторија.
Основни правила за работа во лабораторија:

 Користење на соодветна работна облека.
 Одржување на ред и хигиена во лабораторијата.
 Функционално подредување на работното место.
 Правилна манипулација со реагенсите:
- испарливите и запаливи реагенси да не се држат близу пламен,
- епруветите и реагенсите да не се држат близу до очите,
- при загревање на епрувета да се користи мал пламен,
- рамномерно да се загрева епруветата,
- да не се мешаат реагенси кои даваат експлозивни смеси (HNO3 и глицерол,
HNO3 и фенол),
- при разредување на H2SO4 не смее да се додава вода во киселина!!!
 Познавање на основните правила за прва помош при повреди:
- при изгореници со киселини - промивање со Na2CO3,
- при изгореници со бази - промивање со разредена оцетна киселина.
7
1.4. Заштита при работа со крв и телесни течности
При дефинирањето на улогата и значењето на клиничката биохемија беше

нагласено дека таа претставува наука која се занимава со проучување на хемискиот
состав на телесните течности и ткива. Во практиката, како материјал за анализа
најчесто се користи крвта, а веднаш потоа следи урината.
Токму од таа причина, во клиничко-биохемиските лаборатории, покрај
спроведувањето на општите мерки за заштита при работа во лабораторија, треба да се
обрне големо внимание и на примената на специфичните мерки за заштита при работа
со крв и телесни течности. Тие мерки всушност се однесуваат на заштита од инфекција
со патогени микроорганизми кои се присутни во биолошкиот материјал од хумано
потекло.
Инфекцијата може да се пренесе:
 од пациент на здравствено лице,
 од здравствено лице на пациент и
 од пациент на пациент.
При сите овие можни начини на трансмисија ризикот зависи од:
 преваленцијата на инфицирани лица во популацијата,
 фреквенцијата на експозицијата,
 природата на експозицијата,
 релативната инфективност на патогениот микроорганизам и
 концентрацијата на патогениот микроорганизам.
Стратегијата за превенција на трансмисијата на патогени микроорганизми кои се
присутни во биолошкиот материјал од хумано потекло во здравствените институции е
следната: секој пациент (примерок за анализа) да се смета за потенцијално
инфициран (инфективен).
Доколку се практикуваат сите препорачани мерки на претпазливост,

трансмисијата на патогени микроорганизми кои се присутни во биолошкиот материјал
од хумано потекло ќе биде избегната. Се препорачуваат следните мерки на
претпазливост:
1. После употребата, иглите никогаш не смеат да се виткаат или да се кршат.
Веднаш по употребата иглите треба да се фрлат во цврст пластичен контејнер за
еднократна употреба кој е сместен веднаш до местото каде се користат иглите.
Употребените игли не смеат да се фрлаат во пластична кеса. Кога контејнерот ќе се
наполни најмногу до 2/3 од неговиот волумен истиот треба да се затвори и да се фрли,
на начин на кој се постапува со останатиот медицински отпад.
2. Да се избегнува непотребно подавање на игли и останати контаминирани
остри предмети. Да не се практикува затворање со капаче на веќе употребена игла, туку
таа веднаш да се фрли во пластичен контејнер за таа намена. Ако веќе мора да се
затвори употребената игла, тогаш капачето треба да се остави на работната површина,
а иглата треба да се вметне во него. Дури потоа со рака може да се притисне капачето
врз иглата.
3. Повредената кожа и отворените рани да се прекријат со водоотпорен фластер.
4. Да се носат заштитни ракавици за еднократна употреба секогаш кога се
очекува експозиција на крв и други телесни течности и секогаш кога се работи со
биолошки материјал од хумано потекло. Заштитни ракавици за еднократна употреба
задолжително да се носат при вадење на крв.
5. Пред напуштање на работната просторија заштитните ракавици да се
отстранат и да се одложат во канта наменета за медицински отпад.
6. По отстранувањето на заштитните ракавици задолжително е рацете добро да
се измијат со вода и сапун. Честото миење на рацете ја прави кожата сува и поради тоа
послабо заштитена од зараза, па затоа треба да се користи заштитен крем за раце.
7. Во сите лаборатории во кои се работи со крв и останати телесни течности
пипетирањето со уста да се замени со механичко пипетирање.
8
8. Да се користат заштитни кабинети секогаш кога во тек на работниот процес се
создаваат аеросоли. Центрифугите треба редовно да се чистат и дезинфицираат.
9. Транспортот на примероци од крв или други телесни течности да се врши во
добро затворени контејнери, со цел да се спречи нивното истекување.
10. Во работните простории не е дозволено јадење, пиење и пушење, како и
држење на прибор за јадење. Во фрижидерите во кои се чуваат реагенси не е дозволено
чување на храна и пијалаци.
11. Во случај на контаминација на кожата со биолошки материјал истиот веднаш
треба да се отстрани, а контаминираното место да се дезинфицира.
12. По директна контаминација со крв или други телесни течности, површините
кои се контаминирани (подови, работни маси и сл.) се преливаат со концентриран
хлорен препарат, а потоа, по 10-20 минути, се бришат и дезинфицираат.
13. Санитарните простории треба редовно да се чистат и дезинфицираат.
14. Медицинскиот отпад треба да се одложува во склад со законските регулативи
и правилникот на здравствената организација.
Медицинскиот отпад се дефинира како единствена форма на течен и цврст отпад

кој настанува при дијагностицирање, третман и превенција на болестите кај човекот.
Тука спаѓаат: крв и крвни продукти, други телесни течности, игли, системи за инфузија,
скалпели, ракавици, газа, човекови ткива и органи. Освен тоа во медицински отпад
спаѓаат и остатоците од калибратори, контроли и реагенси од хумано потекло,
односно сите оние компоненти на китовите кои имаат ознака biohazard
(инфективен материјал, опасност од зараза), прикажана на Слика 1.3.
Слика 1.3. Симбол за инфективен материјал
9
1.5. Запознавање со затворен систем за земање на крв. Земање на венска и
капиларна крв.
Точноста на резултатите од лабораториските испитувања зависи не само

од технички добро изработената анализа, туку и од правилниот начин на земање
на материјалот за анализа.
Во клиничко-биохемиските лаборатории, како и во медицинските установи
воопшто, стандардно се користи затворен систем за земање на крв. Овој систем
обезбедува врвна заштита на медицинскиот персонал бидејќи, освен во ретки случаи,
со негова употреба се оневозможува излегување и на најмало количество крв надвор
од системот. Од исто толкаво значење е и максималната заштита на пациентите која ја
овозможува овој систем.
Затворените системи за земање на крв кои денеска се во широка употреба
насекаде во светот, генерално можат да се поделат во две категории:
1. Затворен систем за земање на крв со вакуум и
2. Затворен систем за земање на крв со двојна можност: вакуум и рачна
аспирација.
Супериорноста на затворениот систем со двојна можност (вакуум и рачна
аспирација) се состои во посебниот дизајн кој овозможува користење на рачна
аспирација кај пациентите со тенки, фрагилни и/или колабирани вени, со што се
избегнуваат повторните венепункции, како и хемолизата на примероците.
Епруветите од затворениот систем за земање на крв што најчесто се користат во
рутинските клиничко-биохемиски лаборатории се прикажани во Табела 1.1. Различните
видови епрувети имаат капачиња со различна боја, што е особено корисно за нивна
полесна идентификација во текот на рутинската работа. Постојат два начини на обоено
кодирање на епруветите – европски и американски код, кои исто така се прикажани во
Табела 1.1.
Табела 1.1. Најчесто користени епрувети за земање на крв во рутинските

клиничко-биохемиски лаборатории
Европски код за Американски код за

Вид на епрувета идентификација на идентификација на
епруветите епруветите
Серумска епрувета, со
БЕЛА ЦРВЕНА
активатор на коагулација
Епрувета со антикоагуланс
ЦРВЕНА ВИОЛЕТОВА
EDTA (за хемограм)
цитрат (1 дел цитрат + 4
дела крв), за определување ВИОЛЕТОВА ЦРНА
на брзина на седиментација
на еритроцитите
цитрат (1 дел цитрат + 9
ЗЕЛЕНА СИНА
дела крв), за коагулационен
статус
Освен тоа постојат и епрувети за специјална намена, како што се епрувети за

изработка на гасни анализи, епрувети за анализа на елементи во траги и др.
10
На Сликите 1.4. и 1.5. се прикажани двата типа затворен систем за земање на крв.
Слика 1.4. Затворен систем за земање на крв со вакуум

(Извор – Greiner Bio-One, Соединети Американски Држави)
Слика 1.5. Затворен систем со двојна можност: вакуум и рачна аспирација

(Извор – Sarstedt, Германија)
Процесот на земање на крв за анализа се означува како флеботомија, а

стручното лице кое е обучено за земање на крв се нарекува флеботомист. Како што
беше кажано претходно, може да се анализира венска, капиларна или артериска крв.
Најчесто се користи венска крв, поретко капиларна, а артериската вообичаено се
користи само за изработка на гасни анализи.
За да се добие примерок од венска крв се врши венепункција, најчесто на
медијалната кубитална вена во антекубиталната вдлабнатина. Исто така за
венепункција може да се искористат и вените од дорзалната страна на дланката, кои
сепак не се толку погодни и треба да се избегнуваат кај лица со лоша периферна
циркулација.
11
Пациентот на кој треба да му се изврши венепункција треба да биде во седната
положба извесно време пред интервенцијата (најмалку 5 минути), од причина што
промената на положбата на телото влијае врз вредноста на некои аналити.
Венепункција никогаш не се изведува на пациент во стоечка положба.
Релативно честа грешка во преаналитичката фаза што се прави во болнички
услови е земање на крв над местото на кое е вклучена инфузија, при што доаѓа до
контаминација на примерокот за анализа. Поради тоа треба, колку што е можно, да се
избегнува земање на крв додека пациентот прима инфузија. Доколку сепак мора да се
земе крв од пациент кој прима инфузија, најдобро е тоа да се направи од другата рака
и задолжително во листата да се забележи дека крв е земена додека пациентот бил на
инфузија.
Местото каде ќе се изврши венепункцијата треба да се дезинфицира со
дезинфициенс чија употреба е одобрена од здравствената установа. Иако постојат
различни видови дезинфициенси кои се погодни за оваа намена, кај нас вообичаено се
користи 70% етанол.
Дезинфицирањето на местото на венепункција се врши со кружни движења. По
дезинфекцијата местото треба да се исуши на воздух. Доколку на местото на
венепункција остане дезинфициенс, тој може да предизвика хемолиза на примерокот.
По дезинфекцијата, местото за венепункција повеќе не смее да се допира.
Над местото на венепункција се врзува подврска (езмарх). Кога крвта ќе почне

да тече во епруветата, подврската се одврзува, без притоа да се помрдне иглата. Многу
ретко е неопходно подврската да остане врзана подолго од една минута. Треба да се
нагласи дека доколку подврската остане врзана подолго од три минути, тоа
предизвикува значајни промени на составот на крвта.
Пумпање со дланката пред венепункцијата треба да се избегнува затоа што
предизвикува покачување на концентрацијата на калиум, неоргански фосфат и лактат.
Епруветите, особено оние со антикоагуланс, треба да се наполнат до
ознаката, со цел да се постигне потребниот сооднос крв / антикоагуланс.
Многу ретко, кај некои пациенти може да се случи враќање на крвта од
епруветата во вената (backflow), што е резултат на намалениот притисок во вената.
Враќањето на крвта се превенира на тој начин што во тек на процедурата на земање на
крв раката се држи надолу и не се дозволува контакт на крвта со капачето на
епруветата.
Кога земањето на крв е завршено, парче сува вата благо се притиска на местото
на венепункцијата, а иглата полека се вади од вената. При тоа на пациентот му се дава
инструкција ватата да ја држи со благ притисок 2-3 минути, најдобро со подигната рака.
Флеботомистот сега ги отстранува заштитните ракавици и ги фрла. Доколку
заштитните ракавици се видливо контаминирани истите се фрлаат во канта за
инфективен отпад. Доколку нема видлива контаминација, ракавиците се фрлаат во
канта за неинфективен отпад. Потоа флеботомистот треба да ги измие рацете со вода
и сапун, или пак да ги дезинфицира со дезинфекционо средство на база на алкохол,
што зависи од правилникот на здравствената организација во која работи. Дури потоа
се ставаат нови заштитни ракавици и се пристапува кон следниот пациент.
Техниката на венепункција се совладува преку практична обука која секогаш

треба да започне со користење на специјални модели – фантоми.
12
Земањето на капиларна крв претставува отворена техника на земање на крв
при што се прави убод на кожата со ланцета и се собира мало количество на крв во
соодветна капилара или микроепрувета.
Оваа техника во практиката најчесто се користи во следните случаи:
 кај мали деца, поради ограниченото количество на примерок,
 кога честите венепункции довеле до оштетување на вените,
 при тешки изгореници и повреди, кога вените не се достапни за
венепункција и
 во единиците за интензивна нега, кога примерокот директно се аплицира
во анализаторот.
Капиларна крв се зема од:

 јагодицата на прстот,
 петата, кај доенчиња или
 ушната ресичка.
На Слика 1.6. е прикажано во кој дел треба да се направи убодот.
Слика 1.6. Земање на капиларна крв – место каде треба да се направи убодот
(Прилагодено според Sarstedt, Германија)
Местото на убодот најпрвин треба да се дезинфицира. Откако дезинфициенсот

ќе се исуши, се прави убод со ланцета, длабок околу 2,5 mm. Првата капка крв се брише,
а следната капка (или следните капки - зависно од количеството потребна крв) се
собираат на начин соодветен за анализата која треба да се изработи (капилара или
микроепрувета, со или без антикоагуланс).
При слаба периферна циркулација местото на убодот не треба да се масира,

туку треба благо да се загрее.
13
1.6. Пипетори и техники на пипетирање
Пипеторите се употребуваат за пренесување на точно одмерен волумен на

течност. Во клиничко-биохемиските лаборатории најчесто се употребуваат
микропипетори. Со нив се пипетираат волумени до 1000 µL и истите можат да бидат
едноканални и мултиканални (Слика 1.7.). Освен тоа постојат и макропипетори, со кои
се пипетираат волумени над 1000 µL.
Слика 1.7. Приказ на микропипетори, мултиканален и едноканален
Пипеторите работат на принцип на истиснување на воздух. За работа со

пипеторите се користат пластични продолжетоци за еднократна употреба. Точниот
волумен што сакаме да го испипетираме е прикажан на прозорчето (дисплејот) кое се
наоѓа на рачката на пипеторот. Волуменот за пипетирање се подесува со помош на
копчето за истиснување. За да го зголемиме волуменот кој сакаме да го измериме треба
да го завртиме копчето во правец спротивен на стрелките на часовникот, додека за да
се намали волуменот го вртиме копчето во правец на стрелките на часовникот (Слика
1.8.).
а) Дисплеј на пипетор б) Подесување на волумен
Слика 1.8. Приказ на дисплеј на пипетор и подесување на волумен за пипетирање
14
После подесувањето на волуменот, а пред да се продолжи со работа, треба да
се осигуриме дека бројчињата кои го означуваат волуменот се влезени во своето
лежиште, односно се јасни и целосно видливи на дисплејот. Не смееме да подесуваме
волумени кои се надвор од областа на пипетирање која ја покрива дадениот пипетор.
1.6.1. Техники на пипетирање
Копчето за пипетирање секогаш се притиска и отпушта бавно, а особено кога

работиме со течности со голема вискозност. Никогаш не смееме да дозволиме копчето
кое веќе сме го притиснале да го отпуштиме пребрзо или да ни отскокне нагоре. Ако тоа
се случи може да дојде до навлегување на течност во телото на пипеторот и до негова
контаминација. За да се спречи контаминацијата на пипеторот кај некои пипетори има
специјални заштитни филтри кои редовно треба да се менуваат.
Пред да започнеме со пипетирање најпрвин мора да се осигуриме дека
продолжетокот е цврсто поставен на врвот на пипеторот. Пипеторот мора да се држи
вертикално во моментот кога повлекуваме од течноста. Продолжетоците, растворот
односно примерокот што треба да го пипетираме и пипеторот треба да се на иста
температура.
Основната техника на пипетирање се одвива по следниот редослед:

1. Го притискаме копчето за пипетирање до првиот степен (В) и го задржуваме тука.
2. Го внесуваме врвот на продолжетокот под површината на течноста (не премногу
длабоко, но доволно длабоко за да не се повлече воздух) и бавно го отпуштаме
копчето. Го извлекуваме продолжетокот од течноста притоа допирајќи го со
врвот ѕидот на садот од кој пипетираме за да се отстрани вишокот на течност.
3. Ја пренесуваме течноста од продолжетокот на саканото место и го притискаме
копчето до првиот степен (В), а по околу една секунда и до вториот степен (С).
Со ова ќе го испразниме продолжетокот. Го подигаме пипеторот над нивото на
течноста и го ослободуваме копчето до почетната позиција (А).
Основната техника на пипетирање е прикажана на Слика 1.9.
B
C
Слика 1.9. Основна техника на пипетирање

(Извор – Thermo Scientific, Финска)
Спротивната техника е погодна за пипетирање на течности со голема вискозност

или со тенденција да пенат. Оваа техника се препорачува и за пипетирање на многу
мали волумени. Се одвива по следниот редослед (Слика 1.10.):
1. Го притискаме копчето за пипетирање до вториот степен (С) и го задржуваме
тука.
15
копчето до почетната положба (А). Го извлекуваме продолжетокот од течноста
притоа допирајќи го со врвот ѕидот на садот од кој пипетираме за да се отстрани
вишокот на течност.
копчето до првиот степен (В).
4. Течноста која ќе остане во продолжетокот или се фрла или се враќа назад во
садот со течноста која ја пипетираме, зависно од нејзината природа.
A 1 2 3 4
B
C
Слика 1.10. Спротивна техника на пипетирање

Повторливата техника претставува брза и едноставна процедура за повторлива

испорака на ист волумен. Оваа техника се одвива по следниот редослед (Слика 1.11.):
1. Го притискаме копчето за пипетирање до вториот степен (С) и го задржуваме
тука.
копчето до почетната положба (А). Го извлекуваме продолжетокот од течноста
притоа допирајќи го со врвот ѕидот на садот од кој пипетираме за да се отстрани
вишокот на течност.
копчето до првиот степен (В). Извесно количество течност ќе остане во
продолжетокот, но тоа не треба да се пипетира.
4. Пипетирањето се продолжува со повторување на чекорите 2 и 3.
A 1 2 3 4
B
C
Слика 1.11. Повторлива техника на пипетирање

16
1.6.2. Исфрлање (вадење) на продолжетоците
За да се елиминира ризикот од контаминација, секој пипетор поседува систем за

исфрлање на продолжетоците. Системот за исфрлање на продолжетоците е копче кое
е осетливо на притисок. Со негово притискање со палецот, пипеторот го исфрла
продолжетокот (Слика 1.12.). Контаминираниот продолжеток се исфрла директно во
контејнер за медицински отпад.
Слика 1.12. Исфрлање на продолжеток од едноканален пипетор
1.7. Основни принципи на спектрофотометријата
Голем дел од клиничко-биохемиските методи се спектрофотометриски, односно

се засновани на мерење на интензитетот на светлината која проаѓа низ обоен раствор,
па токму од таа причина е неопходно да се потсетиме на основните принципи на
спектрофотометријата.
Познато е дека човековото око може да ја гледа светлината со бранови должини
помеѓу 400 и 750 nm, што се означува како видлив дел од спектарот. Светлината со
бранови должини под 400 nm се означува како ултравиолетова светлина, а онаа со
бранови должини над 750 nm се означува како инфрацрвена светлина. Иако невидливи
за човековото око, оптичките инструменти можат да ги регистрираат и
ултравиолетовата и инфрацрвената светлина.
Сончевата светлина, исто како и светлината од конвенционалните сијалици,
претставува спектар од различни бранови должини, па човековото око ја препознава
како бела светлина.
Ако еден раствор кој, кога го гледаме наспроти бела светлина, е обоен зелено
(на пример раствор на никел сулфат), тоа значи дека тој всушност ја пропушта само
светлината со бранова должина од 500-580 nm (зелената светлина), додека сите други
останати бранови должини ги апсорбира. Слично е и со цврстите тела: зелениот
предмет ја рефлектира светлината во горенаведениот опсег на бранови должини (500-
580 nm), а сите други бранови должини ги апсорбира. Во Табела 1.2. се прикажани
брановите должини за различните делови од спектарот, заедно со боите кои им
соодветствуваат.
17
Табела 1.2. Бранови должини за различните делови од спектарот и бои кои им
соодветствуваат
Бранова должина (nm) Дел од спектарот Боја

180-220 ултра кратки UV невидлива
220-320 кратки UV невидлива
320-400 долги UV невидлива
400-440 видливи виолетова
440-500 видливи сина
500-580 видливи зелена
580-600 видливи жолта
600-620 видливи портокалова
620-750 видливи црвена
750-2000 кратки IR невидлива
Ако еден раствор кој има пурпурна боја (на пример раствор на калиум
перманганат) го гледаме наспроти бела светлина, него всушност го гледаме како
пурпурен поради тоа што го пропушта синиот, виолетовиот и црвениот дел од спектарот,
а ја апсорбира светлината со сите други бранови должини.
Во спектрофотометријата, за определување на непознати концентрации на
обоените раствори, не се користи бела светлина, туку се користи светлина со точно
определена бранова должина, т.н. монохроматска светлина. Монохроматска
светлина се добива со пропуштање на бела светлина низ обоен филтер, кој ги
отстранува сите останати бои освен бојата која ја има самиот филтер. При тоа, за
фотометрирање се користи онаа боја на светлината која обоениот раствор најмногу ја
апсорбира, односно бојата која е комплементарна со бојата на растворот. Така за
црвено и пурпурно обоените течности (на пример растворот на калиум перманганат) се
користи зелено светло, односно зелен филтер, за зелено обоените раствори (на пример
растворот од никел сулфат) се користи црвен филтер, за модрите раствори се користи
портокалов филтер итн. При пропуштање на монохроматска светлина низ кивета со
обоен раствор еден дел од таа светлина ќе се апсорбира, а дел ќе се пропушти
(Слика 1.13.).
Слика 1.13. Шематски приказ на кивета во која се наоѓа обоен раствор и низ која
поминува монохроматска светлина
18
При тоа, логично е дека интензитетот на пропуштената светлина (I1) ќе биде
помал од интензитетот на влезната светлина (I0). Од тука се дефинира односот:
I1/I0 = T (T – transmittance)
Вредноста на Т е обратно пропорционална и логаритамски зависна од

концентрацијата, поточно од интензитетот на обојувањето на растворот. Поради
ваквата „незгодна“ зависност, од практични причини е дефиниран поимот апсорбанција
(А – absorbance) и тоа на следниот начин:
A = log I0/I1
A = log 1/T
За вредноста на апсорбанцијата е значајно тоа што таа е право

пропорционално и линеарно зависна од концентрацијата, поточно од
интензитетот на обојувањето на растворот (се разбира до определена граница,
односно интензитет на обојување).
Синоними за апсорбанција се: оптичка густина (optical density O.D.) и екстинција,
што е постар назив и поретко се користи. Врската помеѓу апсорбанцијата и %Т е
прикажана на Слика 1. 14.
Слика 1.14. Врска помеѓу апсорбанција и %Т
Од претходно кажаното произлегува Lambert-Beer-овиoт закон кој гласи:
A=εbc
A e апсорбанцијата, која е неименуван број

ε е моларен апсорпционен коефициент, кој е константен за секоја супстанција
(L mol-1cm-1) – на Сликата 1.13. е означен со α
b е дебелината на слојот на растворот низ кој минува монохроматската
светлина, a во пракса тоа е всушност дебелина на киветата (cm)
c е концентрацијата на растворот (mol L-1)
Поради тоа што ε и b имаат константни вредности, тие можат да се обединат во

една единствена константа која може да се користи како фактор за конкретната
метода што директно ќе ги поврзува вредностите на апсорбанцијата со
концентрацијата. Сепак, во клиничката пракса, за постигнување на највисока точност во
работењето, најдобро е наместо фактор да се користат еден или два стандарди со
позната концентрација во рамките на линеарноста на методата, со цел да се избегне
влијанието на низа фактори како што се варијациите во реагенсите, работните услови,
промените на самиот спектрофотометар и сл.
19
1.8. Центрифугирање
Центрифугирањето претставува базична лабораториска постапка каде со

користење на центрифугална сила се врши раздвојување на потешките од
полесните компоненти на некоја смеса.
Во клиничко-биохемиските лаборатории центрифугирањето најчесто се користи

за:
1. Отстранување на клеточните елементи од крвта со цел да се добие серум
или плазма за анализа.
2. Концентрација на клеточните и останатите елементи за микроскопски
испитувања, како на пример за анализа на уринарен седимент.
3. Отстранување на преципитатот и добивање на бистар супернатант за
анализа, како на пример за определување на HDL-холестерол со метода на
таложење.
Силата која е неопходна за да се изврши сепарација на двете фази се нарекува

релативна центрифугална сила (RCF – relative centrifugal force) и зависи од радиусот
на ротацијата и бројот на вртежи во минута:
RCF = 1,118 x 10-5 x r x rpm2
r e радиусот од центарот на ротацијата до дното на епруветата, изразен во cm

rpm e бројот на вртежи во минута (revolutions per minute)
1,118 х 10-5 е емпириски фактор
Релативната центрифугална сила се изразува преку гравитационата сила

(на пример: 2000 х g).
Доколку имаме потреба да ја промениме центрифугата, а при тоа сакаме да ја
примениме истата релативна центрифугална сила, бројот на вртежи во минута ќе го
пресметаме со користење на следната равенка:
RCF (оригинален ротор)

rpm (алтернативен ротор) = 1000 √
11,18 r (cm, алтернативен ротор)
Сепак треба да се нагласи дека при употреба на различни центрифуги не е

можно да се репродуцираат апсолутно идентични услови на центрифугирање од
причина што времето на забрзување и времето на застанување се различни за
различни центрифуги. Времето на забрзување е вклучено во времето на
центрифугирање, додека времето на застанување не е вклучено.
За непречена работа на секоја центрифуга неопходно е тежината на епруветите

да биде добро балансирана. Исто така, како што беше истакнато претходно,
центрифугите треба редовно да се чистат и дезинфицираат. Доколку случајно дојде до
кршење на некоја епрувета во центрифугата, во тој случај центрифугата треба веднаш
внимателно да се исчисти.
20
1.9. Значење на чистотата на водата во клиничко-биохемиската лабораторија
Квалитетот на резултатите кои се добиваат во една хемиска, биохемиска

или клиничко-биохемиска лабораторија е во директна зависност од чистотата на
хемикалиите и водата што се користат во таа лабораторија.
За подготовка на многу раствори, реагенси, калибратори и контролни примероци
во клиничко-биохемиските лаборатории е неопходна „чиста“ вода, односно вода со
степен на чистота на реагенс (reagent grade water, rgH2O).
Постојат три типа на вода со степен на чистота на реагенс и тоа:
1. Вода со степен на чистота на реагенс тип 1, која се користи при изработка
на анализи за кои е неопходна минимална интерференција и максимална точност.
Таков е случајот со анализите на елементи во траги, ензими и електролити. Овој тип
вода се користи и за подготовка на калибратори и контролни примероци. Оваа вода не
треба да се чува, туку се употребува веднаш.
2. Вода со степен на чистота на реагенс тип 2, која се користи во
лабораторијата секаде каде не е потребна вода со чистота на реагенс тип 1. Чувањето
на таа вода треба да биде ограничено на минимум, при што треба да се елиминира
можноста за хемиска и бактериска контаминација.
3. Вода со степен на чистота на реагенс тип 3, која се користи за миење на
стакларија. Меѓутоа, крајното плакнење на стакларијата треба да биде со вода со
степен на чистота кој одговара на аналитичката постапка при која ќе биде употребувана
таа стакларија.
1.10. Влијание на некои ендогени и егзогени фактори врз резултатите од

клиничко-биохемиските анализи
Идентификувани се поголем број фактори кои влијаат врз резултатите од

клиничко-биохемиските анализи. Во оваа прилика ќе презентирам само еден дел од
нив, во прв ред оние со кои релативно често се среќаваме во клиничката пракса, како и
некои поспецифични примери.
Овие фактори можат да бидат поделени во две групи и тоа:
1. Ендогени (биолошки) фактори и
2. Егзогени фактори.
1.10.1. Влијание на ендогените (биолошките) фактори врз концентрацијата на

клиничко-биохемиските параметри
Различни биолошки фактори можат да доведат до in vivo промени на

концентрацијата на некои аналити. Овие промени не зависат од користената
клиничко-биохемиска метода, ниту пак и од самата изработка на анализата. Во оваа
група фактори спаѓаат: полот, расата, возраста, менструалниот циклус, бременоста,
положбата на телото, физичката активност, надморската височина, циркадијалниот
ритам, исхраната, пушењето, консумирањето на алкохол, хируршките интервенции и сл.
Пол.– Помеѓу жените и мажите постојат извесни разлики во однос на
концентрацијата на определени аналити, што во прв ред се должи на разликите во
однос на мускулната маса, површината на телото и телесната маса, а што резултира со
постоење на различни референтни вредности кај двата пола. Меѓутоа, извесни атлетски
активности кои доведуваат до зголемување на мускулната маса кај жените можат да ги
маскираат овие разлики. Во принцип, мажите имаат повисоки вредности на креатинин,
креатин киназа, γ-глутамил трансфераза, мочна киселина, трансаминази и железо.
Мажите имаат и повисоки концентрации на хемоглобин и поголем број на еритроцити
во крвта во однос на жените. Разбирливо е исто така дека постојат и разлики во
концентрациите на половите хормони во циркулацијата помеѓу мажи и жени.
21
Раса.– Во литературата има податоци дека концентрациите на некои аналити се
во тесна зависност од расата. Така на пример, припадниците на црната раса имаат два
пати повисоки серумски концентрации на липопротеин (а) [Lp(a)] во однос на
припадниците на белата раса, додека 50% од Индијанците имаат покачена активност
на ензимот α-амилаза. Во нашата земја релативно ретко се среќаваме со примероци за
анализа кои потекнуваат од припадници на раси што се различни од белата раса, но
познавањето на овие феномени е од значење во земјите каде застапеноста на различни
раси во популацијата е значителна.
Возраст.– Со тек на годините кај возрасните лица се зголемуваат серумските
концентрации на глукозата, уреата и холестеролот, а се намалуваат концентрациите на
калциумот, фосфорот, албумините и вкупните протеини. Од друга страна пак, децата
имаат пониски концентрации на имуноглобулините и повисока активност на алкалната
фосфатаза во однос на возрасните.
Менструален циклус.– Хормонските промени кои се случуваат во тек на
месечниот циклус кај жените доведуваат до промени на концентрациите на некои
аналити. Така на пример, како резултат на максималното излачување на естрогени
хормони во средината на циклусот серумските концентрации на холестеролот се
најниски, а растат непосредно пред менструацијата и остануваат покачени во тек на
наредната недела.
Бременост.– Во текот на бременоста, особено во втората половина и кон крајот
на истата, се зголемуваат брзината на седиментација на еритроцитите, бројот на
леукоцитите, концентрациите на холестеролот и триглицеридите и активноста на
алкалната фосфатаза.
Положба на телото.– При промена на положбата на телото од лежечка во
стоечка, околу 8% вода од васкуларниот поминува во интерстициелниот простор, што
резултира со покачување на концентрацијата на некои аналити во плазмата и тоа:
аланин аминотрансфераза за 7%, албумин за 9%, алкална фосфатаза за 7%, α-амилаза
за 6%, аспартат аминотрансфераза за 5%, холестерол за 7%, триглицериди за 6% итн.
Овие промени се краткотрајни.
Физичка активност.– Привременото преминување на течност од васкуларниот
во интерстициелниот простор во тек на физичката активност, како и губењето на
течност преку потењето, предизвикуваат хемоконцентрација која доведува до пораст
на концентрацијата на протеините и бројот на клеточните елементи. Од друга страна,
неколку часа после зголемената физичка активност кај нетренирани лица, во
крвната плазма расте активноста на мускулните ензими (креатин киназа, аспартат
аминотрансфераза и лактат дехидрогеназа) поради оштетувањето на мускулните
клетки.
Надморска височина.– Како резултат на престојот на поголеми надморски
височини расте концентрацијата на хемоглобинот, поради намалениот парцијален
притисок на кислородот. Исто така се зголемува и бројот на еритроцитите, како и
вредноста на хематокритот.
Циркадијален ритам.– Веќе е спомнато дека постојат дневно-ноќни варијации
во концентрациите на определени аналити. Најкарактеристичен е примерот со
кортизолот и серумското железо, чии концентрации се највисоки наутро. Нашата
неодамнешна клиничка студија објавена во престижното научно списание PlosOne
докажа постоење на дневно-ноќни варијации во концентрациите на редица хормонски и
липидни биомаркери. Оваа статија го носи следниот број за идентификација:
doi.org/10.1371/journal.pone.0135652 и истата е слободно достапна за сите
заинтересирани читатели.
Исхрана.– При разгледување на влијанието на исхраната врз концентрацијата
на определени аналити треба да се направи разлика помеѓу краткотрајното
(моменталното) и долготрајното влијание.
Краткотрајно, доколку после земање на стандарден оброк процентот на промена
на испитуваниот аналит е помал од 5%, се смета дека храната значајно не влијае врз
истиот. Така, еден стандарден оброк значајно ќе влијае врз концентрациите на
22
глукозата, триглицеридите, билирубинот и неорганскиот фосфат, како и врз активноста
на аспартат аминотрансферазата.
Набљудувано долготрајно, високопротеинската исхрана доведува до
зголемување на серумските концентрации на уреата, а исхраната богата со
јаглехидрати предизвикува зголемување на активноста на алкалната фосфатаза и
лактат дехидрогеназата. Вегетаријанците имаат значајно пониски серумски
концентрации на холестерол и триглицериди во однос на лицата кои консумираат
стандардна, мешана храна. Како резултат на малнутриција се намалува
концентрацијата на вкупните протеини и албумините во серумот.
Пушење.– Пушењето ја зголемува концентрацијата на кортизолот, што се
манифестира еден час по консумирањето на 1-5 цигари. Хронично, пушењето ги
зголемува вредностите на Ц-реактивниот протеин и на туморскиот маркер CEA.
Алкохол.– Во период од околу 24 часа по консумирање на поголемо количество
алкохол доаѓа до намалување на концентрацијата на глукоза во крвта, a се зголемува
концентрацијата на лактатот и мочната киселина. Долготрајната злоупотреба на
алкохол доведува до зголемување на активноста на црнодробните ензими во серумот:
γ-глутамил трансфераза и аминотрансферазите AST и ALT.
Хируршки интервенции.– Во тек на првите 24 часа после хируршка
интервенција доаѓа до намалување на концентрацијата на хемоглобинот, зголемување
на брзината на седиментација на еритроцитите, а се зголемуваат и концентрациите на
Ц-реактивниот протеин, билирубинот, уреата, како и активноста на
аминотрансферазите.
1.10.2. Влијание на егзогените фактори врз резултатите од клиничко-

биохемиските анализи
Егзогените фактори влијаат врз вредностите на клиничко-биохемиските

параметри, но тоа не е последица на некој физиолошки процес во организмот. Во
оваа група фактори спаѓаат: хемолизата, липемијата и иктеричноста на примерокот за
анализа, присуството на антикоагуланси и конзерванси, контаминацијата на примерокот
со инфузиони раствори, присуството на лекови и нивните метаболити, егзогената
контаминација и сл.
Хемолиза, липемија и иктерус.– За влијанието на овие фактори врз
резултатите од клиничко-биохемиските испитувања беше кажано претходно.
Антикоагуланси и конзерванси.– Антикоагулансите и конзервансите кои се
неопходни за изработка на определени клиничко-биохемиски анализи можат да
интерферираат со некои други анализи. Така на пример, натриумовите и калиумовите
соли на антикоагулансите ќе интерферираат со методите за определување на
натриумот, односно калиумот во примерокот. Друг пример се хелатите што
антикоагулансите ги создаваат со калциумот, железото и магнезиумот, со што го
оневозможуваат нивното определување. Антикоагулансите исто така ја инхибираат
активноста на бројни ензими. Пример за интерференција е и конзервирањето на
урината со закиселување на рН под 3, што доведува до таложење на уратите.
Инфузиони раствори.– Несоодветното земање на примерок за анализа кај
пациенти кои примаат инфузија може да предизвика ефект на дилуција, а во исто време
и контаминација на примерокот со содржината од инфузиониот раствор.
Лекови и нивни метаболити.– Некои лекови и нивните метаболити исто така
интерферираат со определени методи. Така на пример, некои цефалоспорински
антибиотици лажно ја зголемуваат концентрацијата на креатининот во серумот, поради
тоа што реагираат со пикринската киселина слично како и самиот креатинин.
Аскорбинската киселина лажно ги снижува концентрациите на глукоза, холестерол,
триглицериди и мочна киселина, а позитивно интерферира со определувањето на
креатининот.
23
Егзогена контаминација.– Примерокот може да се контаминира со бактерии,
остатоци од детергент, фосфати, железо, при користење на лошо измиен
лабораториски прибор.
1.11. Концепт на контрола на квалитетот на резултатите во клиничко-

биохемиските лаборатории
Контролата на квалитетот на резултатите во една клиничко-биохемиска

лабораторија претставува суштински елемент во работењето на лабораторијата, што
ни дава потврда за точноста на изработените анализи и издадените резултати. Со
имплементација на акредитацијата на анализите според стандардот ISO:15189,
контролата на квалитетот на резултатите станува задолжителен елемент во контекст
на акредитацијата. Но и без тоа, лабораториите треба да се стремат кон спроведување
на контрола на квалитетот на резултатите, што претставува предуслов за успешно
работење на секоја лабораторија.
Контролата на квалитетот на резултатите од изработените анализи во една
клиничко-биохемиска лабораторија може да биде внатрешна и надворешна.
1. Внатрешната контрола на квалитетот се спроведува секојдневно. При тоа,
пред да се започне со рутинската дневна работа се врши анализа на контролниот
материјал. Контролниот материјал всушност претставува комерцијален контролен
примерок за кој производителот точно ја определил целната вредност на секој
испитуван параметар и дозволениот ранг на отстапување. Доколку во лабораторијата
се добиени вредности што не се во рамките на дозволениот ранг на отстапување, во тој
случај не се започнува со рутинската дневна работа сè додека не се реши проблемот
кој довел до таквите несакани отстапувања. Освен утринската анализа на контролниот
материјал, се препорачува и дополнителна анализа на контролен примерок, во тек на
изработката на голема серија примероци од пациенти, како потврда за точноста на
резултатите.
2. Надворешниот систем на контрола на квалитетот се состои во тоа што
обично еднаш месечно се изработуваат анализите кои се предмет на надворешна
контрола и тоа во комерцијален контролен примерок со непознати концентрации.
Добиените резултати се испраќаат на евалуација кај производителот на контролниот
материјал, после што следува извештај кој се испраќа назад во лабораторијата.
Контролните примероци можат да бидат лиофилизирани или во течна состојба.
За лиофилизираните контролни примероци е важно да се води сметка при отворањето
да не се расее дел од материјалот, затоа што тоа би имало негативно влијание врз
точноста на резултатите. Контролниот примерок, особено оној од надворешната
контрола не треба да има специјален третман во лабораторијата. Манипулацијата со
контролниот примерок треба да биде стандардна, односно иста како и онаа со
примероците од пациентите, со цел да се добие реална слика за квалитетот на работата
на лабораторијата.
Подготовката на контролните примероци, начинот на нивното чување и анализа,

како и толкувањето на резултатите од внатрешната и надворешната контрола на
резултатите, ќе бидат детално обработени во тек на практичната настава.
24
2. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ МЕТОДИ ЗА ДИЈАГНОСТИЦИРАЊЕ И СЛЕДЕЊЕ НА
НАРУШУВАЊАТА НА МЕТАБОЛИЗМОТ НА ЈАГЛЕХИДРАТИТЕ, СО ПОСЕБЕН
ОСВРТ НА ШЕЌЕРНАТА БОЛЕСТ
Јаглехидратите, заедно со протеините, липидите и нуклеинските киселини се

основните конституенти на живата материја. Не може да се каже дека некоја од овие
класи органски соединенија е поважна за одвивањето на животните процеси од другите,
поради тоа што нивните физиолошки улоги се испреплетуваат и взаемно се
надополнуваат. Шеќерната болест (Diabetes mellitus) претставува најчесто нарушување
на метаболизмот на јаглехидратите, а воедно и едно од најчестите заболувања во
современиот свет. Затоа, во ова поглавје ќе ги обработиме стандардните клиничко-
биохемиски параметри за дијагностицирање и следење на текот на ова заболување.
Освен шеќерната болест, опишани се и вродени грешки на метаболизмот на
јаглехидратите, како и нарушувања на складирањето на гликогенот. Но, тоа се ретки
заболувања, па поради тоа нема да бидат обработени во рамките на овој курс.
2.1. Јаглехидрати: општи карактеристики, поделба и основи на метаболизмот
Јаглехидратите се нарекуваат и шеќери, сахариди или глициди (глуциди). Тие се

органски соединенија кои во основа се изградени од три елементи: јаглерод, водород и
кислород, во сооднос 1:2:1. Овде треба да се нагласи дека во состав на некои
јаглехидрати се среќаваат исто така и азотот и сулфурот.
Општата формула на јаглехидратите е Cn(H2О)n, што всушност бил и основниот
мотив за нивното именување како јаглехидрати. Сепак, некои соединенија кои според
своите хемиски својства не се јаглехидрати ја имаат истата ваква емпириска формула
(на пример формалдехидот, оцетната киселина), а од друга страна пак некои
јаглехидрати (на пример дезоксирибозата) имаат емпириска формула различна од
горенаведената. Поради ова, а во согласност со нивната хемиска структура
јаглехидратите вообичаено се дефинираат како полихидроксилни алдехиди или
кетони и се означуваат како алдози или кетози.
Јаглехидратите се синтетизираат од страна на зелените растенија по пат на
фотосинтеза, процес за чие одвивање освен јаглерод диоксид и вода е потребно и
присуството на хлорофил и сончева светлина. Фотосинтезата е комплексен биохемиски
процес, кој сумарно може да се прикаже со следната хемиска равенка:
6CО2 + 6H2О C6H12О6 + 6О2
Синтетизираните јаглехидрати растенијата ги користат за изградба на нивните

ткива, за синтеза на разни други органски соединенија потребни за нивниот развој, а
дел се складира и како резервна храна.
Животните и човекот ги внесуваат јаглехидратите во својот организам преку
консумирање на храна од растително потекло. Кај нив се одвива процес обратен на
фотосинтезата, односно јаглехидратите се разложуваат до вода и јаглерод диоксид, при
што се ослободува енергија. Покрај тоа, животните и човекот имаат способност вишокот
на внесените јаглехидрати да го складираат во црниот дроб и во мускулите во облик на
полисахаридот гликоген, или пак од вишокот на јаглехидрати да синтетизираат масти,
поконкретно триглицериди, кои исто така служат како резервна енергија. Дел од
јаглехидратите влегуваат и во состав на сложени хетеромакромолекули.
Сите јаглехидрати, според можноста за нивно хидролизирање на попрости
шеќери можат да се поделат во три групи:
1. Моносахариди,
2. Олигосахариди и
3. Полисахариди.
25
2.1.1. Моносахариди
Моносахаридите се дефинираат како алдози или кетози кои со хидролиза не

можат да се разложат на попрости шеќери.
Според бројот на јаглеродните атоми во нивната молекула моносахаридите
се делат на: биози, триози, тетрози, пентози, хексози и хептози, со 2, 3, 4, 5, 6 и 7
јаглеродни атоми соодветно.
Според Fisher, структурните формули на моносахаридите се формираат на тој
начин што јаглеродната низа се пишува вертикално, алдехидната или кето групата е
горе, примарната алкохолна група е најдолу, додека броењето на јаглеродните атоми
се врши од горе кон долу.
На Слика 2.1. е прикажана структурната формула на глукозата, според Fisher.
2.1.1.1. Изомерија кај моносахаридите
Оптичка изомерија
За моносахаридите е карактеристично присуството на јаглеродни атоми кај кои
за сите четири валенции се врзани различни атоми или атомски групи. Тие се
означуваат како асиметрични (хирални) јаглеродни атоми. Кај глукозата асиметрични
се вториот, третиот, четвртиот и петтиот јаглероден атом.
Соединенијата кои во својата молекула поседуваат еден или повеќе
асиметрични јаглеродни атоми имаат својство да ја вртат рамнината на поларизираната
светлина за извесен агол, појава која се означува како оптичка активност. Секое
оптички активно соединение поседува две оптички активни модификации, односно
оптички изомери, чиј структурен распоред на атомите во молекулата е како кај предмет
и неговиот лик во огледало. Едната модификација ја врти рамнината на поларизираната
светлина десно (во насока на движење на стрелката на часовникот), се нарекува
декстрогира и се обележува со (+), а другата ја врти рамнината на поларизираната
светлина лево (спротивно од насоката на движење на стрелката на часовникот), се
нарекува левогира и се обележува со (-). Кога двата оптички изомери од една иста
супстанција ќе се најдат во еден раствор во еднакви концентрации, таквата смеса не е
оптички активна, се нарекува рацемска и се обележува со (±).
Слика 2.1. Структурна формула на D-глукоза, според Fisher
Стереоизомерија
Покрај оптичката, за моносахаридите е карактеристичен уште еден вид
изомерија, а тоа е стереоизомеријата.
Како пример за стереоизомерија се зема глицералдехидот кој има еден
асиметричен јаглероден атом и кој се јавува во две стереоизомерни форми: D и L.
Буквата D пред името на ова соединение означува дека во структурната формула на
глицералдехидот хидроксилната група на претпоследниот јаглероден атом се наоѓа од
26
десната страна, додека буквата L означува дека истата се наоѓа од левата страна
(Слика 2.2.).
D-глицералдехид L-глицералдехид
Слика 2.2. Стереоизомерија кај глицералдехидот
Овој принцип важи за сите моносахариди. Сите моносахариди кои имаат иста
конфигурација на претпоследниот јаглероден атом како кај D-глицералдехидот, односно
хидроксилната група е десно ориентирана се викаат десни или D-моносахариди. Сите
моносахариди кои имаат иста конфигурација на претпоследниот јаглероден атом како
кај L-глицералдехидот, односно хидроксилната група е лево ориентирана се викаат
леви или L-моносахариди. При тоа треба да се потенцира дека претпоследниот
јаглероден атом е хирален и прв до примарната алкохолна група, односно најоддалечен
од алдехидната или кето групата.
Најголемиот број на природни моносахариди се со десна конфигурација и
декстрогири истовремено.
α / β-изомерија
Постои уште еден вид изомерија што е карактеристичен за моносахаридите, а
тоа е α / β-изомеријата, која е резултат на постоењето на полуацеталните форми на
моносахаридите.
Кога моносахаридите со 4 или повеќе јаглеродни атоми ќе се растворат во вода,
доаѓа до интрамолекуларна реакција помеѓу карбонилната група од една страна и
хидроксилната група од γ или δ положба во истата молекула од друга страна, при што
молекулата циклизира, односно се формира полуацетална форма. Кај глукозата, со
формирањето на полуацетал, се создава нова хидроксилна група на првиот јаглероден
атом која се нарекува полуацетална или гликозидна група, а со тоа и првиот
јаглероден атом станува хирален. Кај фруктозата, полуацеталната хидроксилна група
се создава на вториот јаглероден атом. Ако полуацеталната хидроксилна група се наоѓа
ориентирана на десната страна, тогаш имаме α-изомерна форма, а ако е ориентирана
на левата страна, тогаш имаме β-изомерна форма.
Со создавањето на полуацеталните форми, моносахаридите добиваат
хетероциклична структура. Ако се формира шесточлен прстен кој потсетува на
структурата на соединението пиран, таквите форми се нарекуваат пиранози. Ако пак
се формира петочлен прстен кој потсетува на структурата на соединението фуран,
таквите форми се нарекуваат фуранози. Пиранозите се постабилни и поради тоа
почесто се создаваат. Во воден раствор на глукоза на пример, секогаш се воспоставува
рамнотежа помеѓу α- и β-глукопиранозата, α- и β-глукофуранозата и карбонилната
форма. Токму затоа некои реакции кои кај типичните алдехиди течат лесно, кај
глукозата се или бавни, или воопшто не се одвиваат.
Проучувајќи ја циклизацијата на моносахаридите во воден раствор, Hаwоrth ги
дизајнирал перспективните формули на моносахаридите на тој начин што замислил
дека хетероцикличното јадро на моносахаридот лежи врз хоризонтална површина.
При тоа, полуацеталната хидроксилна група која е во α-положба сега е прикажана со
27
ориентација надолу, а онаа која е во β-положба е ориентирана нагоре. На Слика 2.3. се
прикажани Hаwоrth-овите формули на α-D-глукопиранозата и β-D-глукопиранозата.
Слика 2.3. Hаwоrth-ови формули на α-D-глукопираноза и β-D-глукопираноза
2.1.1.2. Хемиски реакции на моносахаридите
За моносахаридите се карактеристични поголем број хемиски реакции кои

подетално се изучуваат во рамките на предметот Општа биохемија. Овде ќе наброиме
само дел од позначајните хемиски реакции на моносахаридите и тоа:
 Оксидација на алдехидната група до карбоксилна група. Оваа реакција ја
преставува основата на Фелинговата проба и другите редукциони проби.
 Редукција на алдехидната или кето групата, при што се добиваат
полихидроксилни алкохоли. Со редукција на глукозата се добива сорбитол.
 Оксидација на примарната алкохолна група, со што се добиваат уронски
киселини. Најзначајна е глукуронската киселина, која има улога во
отстранувањето на штетните супстанции од организмот преку урината.
Во оваа прилика подетално ќе се задржиме само на Фелинговата проба која е
една од најпознатите квалитативни проби за докажување на глукоза. Порано оваа
реакција се користела за докажување на присуството на глукоза во урината, но денеска
воопшто не се користи во клиничко-биохемиските лаборатории. Со овој пример сакаме
да ја потенцираме специфичноста на современите ензимски методи, а воедно и
напредокот на Клиничката биохемија.
Фелингова проба
Принцип
Глукозата во својата молекула поседува алдехидна група која лесно се оксидира до
карбоксилна група. Поради тоа глукозата дејствува како силно редукционо средство.
Од друга страна, во присуство на редукционо средство, двовалентниот бакар (Cu2+) од
Фелинговиот раствор се редуцира до едновалентен (Cu+). Притоа се забележува
промена на бојата на растворот од сина, преку зелена до црвено-керамидеста.
Реакцијата не е специфична само за глукозата, туку сите супстанции кои делуваат како
редукциони средства даваат позитивна Фелингова проба. Поради тоа нејзината
примена во клиничката пракса е напуштена и истата е заменета со специфични,
ензимски методи.
Реагенси и прибор
1. Глукоза 20 g/L
2. Фелингов реагенс (Fehling I и Fehling II)
3. Епрувети, пипети, шпиритусна ламба
Постапка
Во една епрувета се става по 1 mL раствор на Fehling I и Fehling II. Содржината се
промешува и се загрева до вриење.
Во друга епрувета се става 2 mL раствор на глукоза и исто се загрева до вриење.
28
Потоа, содржината од епруветата со Фелинговите раствори се префрла во епруветата
со раствор на глукоза.
Се забележува промена на бојата на растворот од сина, преку зелена до црвено-
керамидеста боја. Црвено-керамидестата боја потекнува од талогот од Cu2O и е знак за
позитивна проба, односно присуство на глукоза.
Ако наместо раствор на глукоза употребиме дестилирана вода и пробата ја изведеме
на ист начин, бојата на растворот нема да се промени, што значи дека пробата е
негативна.
2.1.1.3. Поважни моносахариди
Биозите, триозите и тетрозите во организмот се среќаваат само како

меѓупродукти во метаболните процеси.
Од пентозите најзначајни се рибозата и дезоксирибозата, кои всушност
претставуваат алдопентози.
Рибозата (Слика 2.4.) учествува во изградбата на рибонуклеинските киселини
(РНК), на ензимските кофактори никотинамид аденин динуклеотид (NАD) и никотинамид
аденин динуклеотид фосфат (NАDP) и на високоенергетското соединение аденозин
трифосфат (АТР).
Дезоксирибозата претставува алдопентоза кај која на вториот С-атом наместо
хидроксилна група се среќава водороден атом. Поради тоа, таа не се вклопува во
општата формула за јаглехидратите, Cn(H2О)n. Сепак, според своите хемиски својства,
дезоксирибозата спаѓа во класата јаглехидрати. Како значајна компонента на
дезоксирибонуклеинската киселина (ДНК), дезоксирибозата има незаменлива
биолошка функција.
Слика 2.4. Структура на D-рибоза
Хексозите се најзастапените моносахариди во природата. Се среќаваат и како

слободни, но најчесто се јавуваат како конституенти на различни олиго- и полисахариди.
За човековиот организам најзначајни се глукозата и галактозата, кои се алдози и
фруктозата, која е кетоза.
Глукозата често пати ја нарекуваат и гроздов шеќер, поради тоа што ја има во
грозјето или пак декстроза, поради тоа што е декстрогира. Во крвта на човекот и
животните се среќава во слободна состојба. Затоа го носи и името крвен шеќер.
Референтните вредности за концентрацијата на глукоза во крвта на човекот изнесуваат
од 3,5 – 6,1 mmol/L, мерено на гладно.
Галактозата, заедно со глукозата учествува во изградбата на млечниот шеќер
(лактоза). Во човековиот организам галактозата влегува во состав на јаглехидратните
детерминанти на крвните групи.
29
Фруктозата е најпознатата кетохексоза, која често пати ја нарекуваат и овошен
шеќер (се среќава во овошјето) или левулоза (таа е левогира). Заедно со глукозата,
како слободна фруктоза, се среќава во медот. Во сврзана состојба, заедно со глукозата,
фруктозата влегува во состав на најпознатиот дисахарид сахароза, кој е познат и под
името сукроза, а за кој во секојдневниот говор се користи називот шеќер.
Фосфорилирана фруктоза се среќава како меѓупродукт во метаболниот пат на
гликолиза. Освен тоа, фруктозата се секретира од страна на семиналните везикули во
семената течност и претставува главен енергетски извор за сперматозоидите. На Слика
2.5. се прикажани структурните формули на галактозата и фруктозата.
D-галактоза D-фруктоза
Слика 2.5. Структурни формули на D-галактоза и D-фруктоза
Хептозите (со еден исклучок: D-манохептулоза) во природата не се среќаваат

во слободна форма. Во човековиот организам една хептоза се среќава како меѓупродукт
во пентозо-фосфатниот циклус, а тоа е седохептулоза-7-фосфат која се добива од
рибоза-5-фосфат.
2.1.2. Олигосахариди
Олигосахаридите се органски соединенија кои се изградени од две до шест, а

според некои автори до десет моносахаридни единици. Зависно од бројот на
моносахаридните единици кои влегуваат во состав на олигосахаридната молекула тие
се делат на дисахариди, трисахариди, тетрасахариди итн.
Најдобро се проучени дисахаридите, кои всушност и најмногу се користат во
човековата исхрана. Најважните дисахариди се изградени од две хексози, со одземање
на една молекула на вода, и имаат емпириска формула C12H22О11.
Постојат два основни начини на поврзување на моносахаридните единици во
молекулата на дисахаридот и тоа:
1. Малтозен начин на поврзување и
2. Трехалозен начин на поврзување.
Малтозниот начин на поврзување настанува кога полуацеталната
хидроксилна група од едниот моносахарид ќе се поврзе со било која хидроксилна група
од другиот моносахарид, но не и со неговата полуацетална хидроксилна група. Така, на
добиениот дисахарид му останува една слободна полуацетална хидроксилна група,
што му овозможува да ги задржи сите физичко-хемиски својства кои произлегуваат од
постоењето на истата.
Во оваа група дисахариди спаѓаат:
а) Малтозата, која е изградена од две молекули α-D-глукоза и
б) Лактозата, која е изградена од β-D-галактоза и α-D-глукоза.
Малтозата се нарекува и сладен шеќер поради тоа што се среќава во пивскиот
слад. Од друга страна пак малтозата е главен продукт на разложувањето на скробот и
30
гликогенот во дигестивниот тракт. Под дејство на ензимот малтаза се хидролизира до
две молекули на глукоза.
Лактозата е позната под името млечен шеќер поради тоа што се среќава во
млекото. Во тенкото црево, под дејство на ензимот лактаза, лактозата хидролизира до
галактоза и глукоза. На Слика 2.6. се прикажани структурните формули на малтозата и
лактозата.
CH 2OH CH2OH
O O
H H H H
H H
OH H O OH H
HO OH
H OH H OH Малтоза
CH 2OH CH 2OH
O O
HO H H
H H
O
OH H OH H
H H OH
H OH H OH Лактоза
Слика 2.6. Структурни формули на малтоза и лактоза
Трехалозниот начин на поврзување настанува кога двете полуацетални

хидроксилни групи од моносахаридните единици меѓусебно ќе реагираат, така што
формираните дисахариди не поседуваат слободна полуацетална хидроксилна
група.
Во оваа група дисахариди спаѓаат:
а) Трехалозата, која е изградена од две молекули α-D-глукоза и
б) Сахарозата, која е изградена од α-D-глукоза и β-D-фруктоза.
На Слика 2.7. е прикажана структурната формула на сахарозата. Таа е
најпознатиот дисахарид кој секојдневно се користи во исхраната како обичен шеќер.
HO6CH 2
5 O
H H
4 1
OH H
HO
3 2
H OH
O O
HO6CH 2
5 2
H H OH
1 CH 2OH
4 3
OH H
Слика 2.7. Структурна формула на сахарозата
31
2.1.3. Полисахариди
Полисахаридите се јаглехидрати кои се составени од мошне голем број на

моносахаридни единици. Според својот хемиски состав полисахаридите можат да се
поделат на две групи:
а) Хомогликани, кои се изградени од истородни моносахаридни единици и
б) Хетерогликани, кои се изградени од два или повеќе различни вида на
моносахаридни единици.
2.1.3.1. Хомогликани
Позначајни претставници од групата на хомогликаните се: скробот, гликогенот и

целулозата.
Скробот е полисахарид од растително потекло кој претставува смеса од
амилоза и амилопектин. Молекулата на амилозата е спирално извиткана, но не е
разгранета и е изградена од голем број на глукозни единици поврзани со α-1,4
гликозидни врски. Амилопектинот пак има разгранета молекула изградена од глукозни
единици поврзани со α-1,4 и α-1,6 гликозидни врски. Растенијата го депонираат скробот
како резервна храна во плодовите, подземните стебла и корењата. Скробот
претставува значаен извор на глукоза за човекот.
Гликогенот претставува интрацелуларен резервен полисахарид кај човекот.
Неговата молекула е голема и разгранета и е изградена од голем број на глукозни
единици поврзани со α-1,4 и α-1,6 гликозидни врски. Гликогенот е најзастапен во црниот
дроб и мускулите. Резервите од гликоген во црниот дроб се доволни за 12-18 часа
гладување.
Целулозата, како најзначаен структурен полисахарид кај растенијата, воопшто
не е застапена кај човекот. Нејзината молекула е изградена од голем број на глукозни
единици поврзани со β-1,4 гликозидна врска. Во човековиот дигестивен систем нема
ензим кој може да ја разложи целулозата внесена со храната, па поради тоа таа е
значајна за регулирање на столицата, преку активирање на интестиналниот мотилитет.
2.1.3.2. Хетерогликани
Позначајни претставници од групата на хетерогликаните се:

1. Хијалуронската киселина, која влегува во состав на сврзните ткива,
2. Хондроитин сулфатот, кој влегува во состав на ’рскавиците, тетивите и
лигаментите и
3. Хепаринот, кој има антикоагулантно дејство.
2.1.4. Дигестија и апсорпција на јаглехидратите
Јаглехидратите претставуваат значаен извор на енергија за човекот. Нивната

калориска вредност изнесува 17,2 kJ/g (4,1 kcal/g). Јаглехидратите се внесуваат во
организмот преку храната, со консумирање на продукти од растително потекло (компир,
житарки, овошје...), но и во облик на шеќер (сахароза). Преку храната од животинско
потекло во организмот исто така се внесува извесно количество на јаглехидрати, но во
многу помала мерка во однос на продуктите од растително потекло.
Иако вообичаено јаглехидратите претставуваат квантитативно најзначаен извор
на енергија за организмот, неговите главни енергетски резерви се депонирани во облик
на триглицериди, чија енергетска вредност изнесува 38,9 kJ/g (9,3 kcal/g). И покрај тоа
што еден дел од депонираните резервни масти во организмот потекнува директно од
мастите кои се внесени со храната, најголемиот дел од нив потекнува од јаглехидратите
кои се внесуваат во организмот во количество кое е поголемо од неговите енергетските
потреби. Поради тоа луѓето кои консумираат прекумерни количини на јаглехидрати во
својата секојдневна исхрана стануваат прекумерно здебелени. Прекумерната тежина и
32
дебелината претставуваат фактори на ризик за појава на Diabetes mellitus тип 2,
заболување кое е следено со зголемен ризик за појава на атеросклероза, нефропатија,
ретинопатија, невропатија и други компликации.
Најважни јаглехидрати кои се внесуваат со храната се:
а) Полисахаридите скроб и гликоген,
б) Дисахаридите сахароза и лактоза и
в) Моносахаридите глукоза и фруктоза.
Покрај тоа, со храната се внесуваат и извесни количества на целулоза,
гликопротеиди и гликолипиди.
Дигестијата на јаглехидратите започнува уште во усната празнина со
хидролитичкото дејство на ензимот α-амилаза од плунката, која е специфична за α-1,4
гликозидните врски на скробот и гликогенот. Поради тоа што потекнува од плунката, овој
ензим се нарекува и птијалин. Поради краткотрајното задржување на храната во усната
празнина, дејството на α-амилазата од плунката е незначително за организмот.
Во желудникот, во кисела средина, плунковата α-амилаза бргу се инактивира,
денатурира и станува супстрат врз кого дејствуваат протеолитичките ензими.
Дигестијата на јаглехидратите продолжува во тенкото црево, под дејство на
ензимите од панкреасниот и тенкоцревниот сок.
Покрај останатите ензими, во панкреасниот сок е присутен и ензимот панкреасна
α-амилаза која, исто како и плунковата α-амилаза, е специфична за α-1,4 гликозидните
врски. Под дејство на панкреасната α-амилаза скробот и гликогенот се хидролизираат
главно до малтоза и во помали количества до малтотриоза и смеса на разгранети
олигосахариди (декстрини).
За дефинитивна дигестија на јаглехидратите неопходни се ензимите од
тенкоцревниот сок кои се означени како специфични дисахаридази, и тоа:
a) Малтаза, која ја хидролизира малтозата до две молекули на глукоза,
б) Сахараза, која ја хидролизира сахарозата до глукоза и фруктоза и
в) Лактаза, која ја хидролизира лактозата до галактоза и глукоза.
Апсорпцијата на јаглехидратите, поточно на моносахаридите, се врши главно во
средниот дел на тенкото црево. Нивната апсорпција се одвива со различна брзина.
Така, ако брзината на апсорпција на глукозата се означи со 100, тогаш брзината на
апсорпција на галактозата ќе изнесува 110, а на фруктозата 43.
Апсорпцијата на моносахаридите може да биде намалена доколку се присутни
промени на ниво на цревната слузокожа, на пример при нејзино воспаление. Од друга
страна, апсорпцијата на моносахаридите е стимулирана од страна на тироксинот, така
што кај лица со хипотиреоза истата може да биде забавена. Овие фактори треба да
бидат земени предвид при интерпретација на тестот на орално оптоварување со глукоза
(оГТТ – орален глукоза толеранс тест).
Нарушувања на дигестијата на јаглехидратите може да се јават како резултат на
вроден или стекнат дефицит на α-амилазата или пак на некоја од специфичните
дисахаридази, при што се манифестира интолеранција (неподносливост) кон
специфичниот јаглехидрат. Неподносливоста кон лактоза е релативно честа појава.
Поради дефицит на ензимот лактаза, лактозата не може да биде хидролизирана до
галактоза и глукоза и останува во тенкото црево каде задржува и вода, а како резултат
на ферментациското дејство на цревните бактерии врз неа се создаваат и низа продукти
кои дополнително ги надразнуваат цревата. Поради ова се јавуваат абдоминални
грчеви, проливи, надуеност на абдоменот и сл. Промената на начинот на исхраната,
односно исфрлањето на млекото (лактозата) од секојдневната исхрана доведува до
исчезнување на симптомите.
Најголем дел од апсорбираните моносахариди, преку порталниот крвоток се
транспортираат до црниот дроб, каде се одвива процес на конверзија на сите останати
хексози до глукоза.
33
2.1.5. Основи на метаболизмот на јаглехидратите
Метаболизмот на јаглехидратите e поделен на следните поединечни метаболни

патишта:
1. Гликогенеза (гликогенoгенеза),
2. Глуконеогенеза,
3. Гликогенолиза,
4. Пентозо-фосфатен циклус,
5. Гликолиза и
6. Оксидативна декарбоксилација на пируватот до ацетил КоА.
Сите овие метаболни патишта детално се обработени во рамките на предметот

Клеточна биохемија, така што овде само накратко ќе се потсетиме на нивните основни
карактеристики.
1. Гликогенезата, или како што уште се нарекува гликогеногенеза, е метаболен

пат за синтеза на гликоген од глукоза.
При нормална исхранетост, количеството на гликоген изнесува до 6% од масата
на црниот дроб и до 1% од мускулната маса. Но, поради тоа што вкупната мускулна
маса е значително поголема од масата на црниот дроб, вкупното количество на гликоген
во мускулите е околу два пати поголемо од она во црниот дроб.
Функцијата на гликогенот во мускулите и во црниот дроб е различна. Мускулниот
гликоген се користи како извор на енергија при зголемена мускулна активност.
Гликогенот од црниот дроб пак претставува резерва на глукоза за одржување на
нејзината концентрација во крвта.
2. Глуконеогенезата претставува процес на биосинтеза на нови молекули на
глукоза од соединенија кои се од нејаглехидратна природа. Овој метаболен пат е од
особена важност за организмот во услови на гладување или на интензивна мускулна
активност поради тоа што обезбедува континуирано снабдување на мозокот со глукоза.
Главни супстрати за процесот на глуконеогенеза се:
- Лактатот, кој се добива при гликолиза во анаеробни услови (во скелетните
мускули при интензивна мускулна активност, како и во еритроцитите),
- Аминокиселините, кои потекнуваат од протеините внесени со храната или
пак од протеинската разградба на мускулите при гладување и
- Глицеролот, кој е добиен со хидролиза на триглицеридите (масните
киселини кои се добиени главно со хидролиза на триглицеридите се
разградуваат до ацетил КоА и не можат да се употребат за синтеза на
јаглехидрати).
Глуконеогенезата главно се врши во црниот дроб и во помала мерка во
бубрезите. Определени мускулни влакна исто така имаат способност за глуконеогенеза,
но во ограничен обем. Глуконеогенезата во мускулите всушност се користи само за
пополнување на резервите од гликоген. Поради ова, во многу учебници стои дека
глуконеогенезата и не се врши во мускулното ткиво.
3. Гликогенолизата претставува метаболен пат на хидролиза на гликогенот до
глукоза. Повторно ќе нагласам дека глукозата која потекнува од мускулниот гликоген се
користи како извор на енергија при мускулната активност, додека глукозата која
потекнува од хепаталниот гликоген се користи за одржување на нејзината
концентрација во крвта.
4. Пентозо-фосфатниот циклус, кој се нарекува уште и фосфоглуконатен пат
или хексозо-монофосфатен шант, претставува алтернативен метаболен пат на
разградување на глукозата преку нејзина директна оксидација на ниво на хексоза, а не
на ниво на триоза.
Во тек на овој метаболен пат се создаваат пентози и екстрамитохондријални
(цитоплазматски) редукциски еквиваленти во форма на NADPH.
34
Основната разлика помеѓу NADH и NADPH е во тоа што NADH се реоксидира во
респираторниот синџир (во митохондриите) при што се синтетизира АТР, додека
NADPH служи како донор на протони и електрони за биосинтетските процеси кои се
вршат со редукција, во цитосолот. Така, NADPH е потребен во процесите на биосинтеза
на масните киселини и стероидите, но и за одржување на интегритетот на мембраната
на еритроцитите. Во согласност со неговата функција, пентозо-фосфатниот циклус се
одвива во кората на надбубрежните жлезди, во млечните жлезди, тестисите, црниот
дроб, масното ткиво и еритроцитите, но не и во мускулите, каде глукозата се разградува
само по пат на гликолиза.
Покрај тоа што пентозо-фосфатниот циклус го снабдува организмот со пентози,
истиот ја овозможува и интерконверзијата на моносахаридите со 3, 4, 5, 6 и 7 јаглеродни
атоми, при што некои од нив можат да се вклучат во процесот на гликолиза.
Интерконверзијата на моносахаридите е овозможена со активноста на ензимите
трансалдолаза и транскетолаза.
5. Гликолизата претставува метаболен пат при кој глукозата се разградува до
две молекули на пируват. Таа е речиси универзален метаболен пат во сите живи
организми.
Гликолизата се изведува потполно еднакво и во аеробни и во анаеробни услови,
единствено понатамошната судбина на пируватот зависи од условите (аеробни или
анаеробни).
Во анаеробни услови, под дејство на ензимот лактат дехидрогеназа, пируватот
се редуцира до лактат. Оваа реакција е особено карактеристична за скелетните мускули
при тешка физичка работа, кога натрупаниот лактат предизвикува чувство на замор.
6. Во аеробни услови пируватот претрпува процес на оксидативна
декарбоксилација до ацетил КоА. Оксидативната декарбоксилација на пируватот е
следена со голема промена на слободната енергија, па според тоа е иреверзибилна.
Токму од оваа причина масните киселини, чија разградба оди до ацетил КоА, не можат
да се искористат за синтеза на јаглехидрати.
Понатаму, ацетил КоА влегува во циклусот на лимонската киселина на кој се
надоврзуваат респираторниот синџир и оксидативната фосфорилација. Во тек на овие
процеси се создаваат крајните продукти на разградбата на глукозата: јаглерод
диоксид, вода и АТР.
За метаболните патишта на јаглехидратите, протеините и липидите е

карактеристична една особено тесна взаемна поврзаност.
Имено, преку процесите на трансаминација во кои се вклучени пируватот,
аланинот, α-кетоглутаратот, глутаматот, оксалацетатот и аспартатот, метаболизмот на
глукозата, односно на јаглехидратите, се поврзува со метаболизмот на
аминокиселините, односно на протеините.
Вишокот јаглехидрати може да се искористи за биосинтеза на масти.
Од друга страна, глицеролот ја обезбедува врската на метаболизмот на
јаглехидратите со метаболизмот на триглицеридите.
Единствено е затворена насоката на синтеза на јаглехидратите од масни
киселини.
2.2. Регулација на концентрацијата на глукоза во крвта
Регулацијата на концентрацијата на глукоза во крвта, односно на

гликемијата, е сложен процес. Во нормални услови гликемијата главно е регулирана
со дејството и со меѓусебните концентрациски односи на инсулинот, глукагонот и
соматотропниот хормон, додека при стрес и/или гладување влијаат и адреналинот,
кортизолот и тироксинот.
Од сите горенаведени хормони инсулинот е единствениот кој ја намалува
концентрацијата на глукоза во крвта, додека останатите имаат спротивно дејство.
35
Ваквиот регулаторен механизам се објаснува со фактот што организмот, а особено
мозокот, гледано во краток временски интервал, е многу почувствителен на
намалувањето на концентрацијата на глукоза во крвта отколку на нејзиното
зголемување.
Инсулинот е хормон кој се синтетизира во β-клетките на Лангерхансовите
островца во панкреасот, а неговото лачење е регулирано преку концентрацијата на
глукоза во крвта, со позитивен feed back механизам. Имено, зголемената концентрација
на глукоза во крвта го стимулира лачењето на инсулинот, а намалената дејствува
инхибиторно.
Важно е да се нагласи дека концентрацијата на инсулин во крвта која е
неопходна за адекватно снижување на гликемијата зависи од специфичните услови во
организмот. Така, кај прекумерно здебелените лица најчесто е потребно многу повеќе
инсулин за регулација на гликемијата во однос на лицата со нормална телесна маса,
што е резултат на резистенцијата на дебелите лица кон дејството на инсулинот.
Дејството на инсулинот е повеќекратно:
1. Ја зголемува пропустливоста на мускулните клетки и на адипоцитите за
глукозата.
2. Го стимулира процесот на гликогенеза (гликогеногенеза).
3. Го стимулира процесот на гликолиза.
4. Го инхибира процесот на глуконеогенеза.
5. Jа стимулира синтезата на протеините.
5. Ја инхибира липолизата, а ја стимулира липогенезата, со што ја намалува
концентрацијата на слободни масни киселини во циркулацијата.
Сумарно, инсулинот ја намалува концентрацијата на глукоза и слободни
масни киселини во крвта и ја спречува појавата на кетонски тела.
На површината на инсулин-сензитивните клетки постојат специфични рецептори
за овој хормон. Инсулинските рецептори имаат тетрамерна структура и се изградени од
две α- и две β-субединици.
α-субединиците се наоѓаат од надворешната страна на клеточната мембрана и
поседуваат места за врзување на инсулинот.
β-субединиците се протегаат низ самата клеточна мембрана сè до внатрешноста
на клетката.
Врзувањето на инсулинот за α-субединиците предизвикува автофосфорилација
на β-субединиците, што резултира со модулирање на активноста на низа
интрацелуларни протеини кои посредуваат при делувањето на инсулинот. Сите овие
биохемиски реакции во крајна линија резултираат со намалување на концентрацијата
на глукоза во крвта. Инсулинската сигнализација детално ја обработуваме во рамките
на предметот Клеточна биохемија. Во оваа прилика ќе истакнам дека во последниве
години се направени огромни напори да се расветли клеточниот механизам на дејство
на инсулинот. И покрај значајниот напредок, сепак сè уште остануваат отворени
прашања кои треба да се одговорат во иднина.
Во случај на:
а) Ниска концентрација на инсулин во плазмата (при неконтролиран Diabetes
mellitus), кога глукозата не може да се искористи од страна на клетките,
или
б) Гладување, кога нема прилив на егзогена глукоза во организмот,
се одвива процес на липолиза на ендогените триглицериди до глицерол и слободни
масни киселини.
Глицеролот се вклучува во метаболизмот на јаглехидратите, поточно во

процесот на глуконеогенеза.
Масните киселини се метаболизираат во процесот на β-оксидација до ацетил
КоА, кој понатаму може да се вклучи во циклусот на лимонска киселина. Меѓутоа, во
услови на интензивна липолиза доаѓа до создавање на големи количества ацетил КоА
36
кои го надминуваат капацитетот на циклусот на лимонска киселина во црниот дроб.
Поради тоа, во такви случаи во црниот дроб се активира еден друг метаболен пат
означен како кетогенеза, каде сумарно, од две молекули ацетил КоА се синтетизира
една молекула ацетоцетна киселина.
Ацетоцетната киселина во најголема мерка се редуцира до β-хидроксибутерна
киселина. Реакцијата на редукција на ацетоцетната киселина до β-хидроксибутерна
киселина е реверзибилна. Еден дел од ацетоцетната киселина спонтано се
декарбоксилира до ацетон кој, како краен метаболит, се исфрла од организмот главно
преку урината.
Ацетоцетната киселина, β-хидроксибутерната киселина и ацетонот се
познати под заедничкиот назив „кетонски тела“, и покрај тоа што од хемиски аспект
гледано β-хидроксибутерната киселина не е кетон.
Ацетоцетната и β-хидроксибутерната киселина од црниот дроб, преку крвта, се
пренесуваат до периферните органи и ткива, каде нивниот метаболизам продолжува.
Имено, од секоја молекула ацетоцетна киселина се добиваат по две молекули ацетил
КоА, кои сега можат да бидат вклучени во циклусот на лимонска киселина во
периферното ткиво. На тој начин, ацетоцетната киселина која се синтетизирала во
црниот дроб овозможува екстрахепаталните ткива да се снабдат со продукт од
метаболизмот на масните киселини кој е растворлив во вода и кој може да се искористи
за добивање на енергија. Ова е од особено значење за мозокот кој не е способен да ги
искористи масните киселини од крвта, па метаболниот пат за синтеза на кетонски тела
за него претставува значаен извор за енергија при недостиг на јаглехидрати.
Дејството на глукагонот врз концентрацијата на глукоза во крвта е резултат на

тоа што овој хормон, кој се синтетизира во α-клетките на Лангерхансовите островца на
панкреасот, ги стимулира процесите на гликогенолиза во црниот дроб и глуконеогенеза.
Глукагонот исто така го стимулира и лачењето на инсулинот.
Соматотропниот хормон ја зголемува концентрацијата на глукоза во крвта
преку спречување на влезот и искористувањето на глукозата во мускулните клетки.
Кортизолот влијае врз концентрацијата на глукоза во крвта на тој начин што ја
стимулира глуконеогенезата.
Адреналинот ја стимулира гликогенолизата и го инхибира лачењето на
инсулинот.
Тироксинот ја стимулира интестиналната апсорпција на глукозата, а исто така
ја стимулира и гликогенолизата.
Со помош на ваквата комплексна хормонска регулација, кај здрави лица

концентрацијата на глукоза во крвта се одржува во релативно тесни граници и тоа од
3,5 – 6,1 mmol/L, мерено на гладно.
Зголемената концентрација на глукоза во крвта се означува како
хипергликемија, а нејзината намалена концентрација се нарекува хипогликемија.
Најчеста причина за појава на хипергликемија е шеќерната болест. Меѓутоа,

хипергликемија може да се регистрира и кај сите заболувања и состојби каде има
зголемено лачење на адреналинот (на пример, феохромоцитом, шок, тешки изгореници
и сл.). Кај пациенти со акромегалија (зголемено лачење на соматотропниот хормон), со
Кушингова болест (зголемено лачење на кортизолот) и со хипертиреоза (зголемено
лачење на тироксинот) исто така може да се регистрира хипергликемија.
Хипогликемијата е многу поретка појава. Може да се јави како резултат на
хиперпродукција на инсулин од страна на панкреасот (при присуство на инсулином).
Хипогликемија може да се регистрира и кај пациенти со Адисонова болест (намалено
лачење на кортизолот) или кај тешки функционални оштетувања на црниот дроб.
37
2.3. Клиничко-биохемиски методи за дијагностицирање и следење на шеќерната
болест
Како што е кажано претходно, најчеста причина за појава на хипергликемија е

шеќерната болест.
Шеќерната болест (Diabetes mellitus) се дефинира како клинички синдром
кој е следен со состојба на хронично покачени концентрации на глукоза во крвта,
како на гладно, така и по внесување на јаглехидрати, при што може да се
регистрира и појава на глукоза во урината.
Шеќерната болест е последица на апсолутен или релативен недостиг на
инсулинот.
Експертите од Светската здравствена организација (WHO – World Health
Organization, 1999) го дефинираат Diabetes mellitus врз основа на лабораториските
наоди и тоа:
а) Ако концентрацијата на глукоза во венската плазма на гладно изнесува 7,0
mmol/L и повеќе и/или
б) Ако концентрацијата на глукоза во венската плазма изнесува 11,1 mmol/L и
повеќе два часа по оброк со јаглехидрати или орално оптоварување со 75 g
глукоза.
Според категоризацијата на WHO, клинички постојат три типа на Diabetes mellitus
и тоа:
1. Примарен дијабет,
2. Секундарен дијабет и
3. Гестациски дијабет.
1. Во примарен Diabetes mellitus спаѓаат:
а) Diabetes mellitus тип 1 и
б) Diabetes mellitus тип 2.
Diabetes mellitus тип 1 се нарекува и јувенилен дијабетес, а сè уште се среќава и
постариот назив – инсулин зависен diabetes mellitus (IDDM). Обично се јавува кај
младите, иако неговата појава не е исклучена на било која возраст. Кај најголемиот број
новооткриени случаи на Diabetes mellitus тип 1 (дури над 90%), во серумот на пациентот
се детектираат автоантитела насочени кон β-клетките на Лангерхансовите островца на
панкреасот, што говори за автоимуниот карактер на заболувањето. Кај повеќето
пациенти, по неколку години овие автоантитела исчезнуваат. Постојат податоци дека
Diabetes mellitus тип 1 може да се јави и после некоја вирусна инфекција (на пример
сипаници, заушки) која претставувала иницијален фактор за ова заболување.
Значи, за Diabetes mellitus тип 1 е карактеристичен апсолутен недостиг на
инсулин, тешка хипергликемија и кетоацидоза, кои, ако не се третираат на време, можат
да резултираат со смртен исход. Со примена на соодветна доза на инсулин кај овие
пациенти се постигнува задоволителна регулација на гликемијата, иако со тек на време
се развиваат микроваскуларни компликации.
Од сите случаи на Diabetes mellitus, на типот 1 отпаѓаат од 5-10%.
Diabetes mellitus тип 2 се нарекува и дијабетес на возрасните, а сè уште се
среќава и постариот назив – инсулин независен diabetes mellitus (NIDDM). Најчесто се
јавува кај лица на возраст над 40 години со вишок килограми и седентарен стил на
живот, но не е исклучена неговата појава и кај значително помлади лица. Кај овие
пациенти β-клетките на Лангерхансовите островца секретираат инсулин (инсулин се
мери и во крвните примероци од овие пациенти), меѓутоа, поради инсулинската
резистенција, тоа количество инсулин не е во состојба да ја одржува нормалната
концентрација на глукоза во крвта.
Значи, за Diabetes mellitus тип 2 е карактеристичен релативен недостиг на
инсулин. Кетоацидоза ретко се јавува. Третманот е со орални хипогликемици,
регулирање на телесната тежина и промена на стилот на живеење. Кај некои пациенти
во подоцнежниот стадиум на болеста се јавува потреба од третман со инсулин поради
38
намалувањето на капацитетот за негова биосинтеза, односно развојот на негов
апсолутен недостиг.
Од сите случаи на Diabetes mellitus, на типот 2 отпаѓаат од 80-90%.
2. За појава на секундарен Diabetes mellitus постојат низа потенцијални
причинители, меѓу кои позначајни се следните:
а) Оштетување на панкреасот или негово хируршко отстранување,
б) Некои ендокринолошки заболувања (на пример Кушингова болест и
акромегалија),
в) Терапија со кортикостероиди,
г) Употреба на лекови кои можат да индуцираат дисфункција на β-
клетките на панкреасот (на пример фенитоин и пентамидин),
д) Генетски условени дефекти на функцијата на β-клетките,
ѓ) Генетски условени дефекти на дејството на инсулинот,
е) Останати генетски заболувања, како што се Даунов синдром,
Клинефелтеров синдром и порфирија.
3. Гестацискиот Diabetes mellitus за прв пат се јавува или дијагностицира во
текот на бременоста. Во оваа категорија не спаѓаат случаите на трудници кај кои
Diabetes mellitus веќе бил дијагностициран пред бременоста. Жените со гестациски
дијабет имаат значително зголемен ризик за дијабет после бременоста, во прв ред
Diabetes mellitus тип 2. Гестацискиот дијабет е асоциран со зголемен морбидитет и
морталитет кај новороденчињата, кај кои многу често се регистрираат хипогликемија,
хипокалцемија и макросомија.
Прва и најосновна клиничко-биохемиска анализа за дијагностицирање на

Diabetes mellitus е определувањето на глукоза во крв.
2.3.1. Определување на концентрацијата на глукоза во крв
Определувањето на концентрацијата на глукоза во крв е една од најосновните

анализи во клиничко-биохемиските лаборатории.
Концентрацијата на глукозата може да се определува во полна крв или пак во
крвна плазма, односно во крвен серум. Исто така, како примерок може да се користи
капиларна или пак венска крв.
Поради можноста за користење на различни видови примероци при
определувањето на концентрацијата на глукоза, секогаш треба да се имаат предвид
следните факти:
1. Концентрацијата на глукозата е нешто пониска во полната крв во однос
на плазмата, односно серумот.
2. Концентрацијата на глукозата е нешто пониска во венската крв во однос
на капиларната.
Од оваа причина, а со цел да се овозможи споредливост на резултатите кои се
добиени за еден ист пациент во различно време, од суштинско значење е секоја
лабораторија да си воспостави свој стандарден начин на работа и изработка на оваа
особено значајна анализа.
Во повеќето клиничко-биохемиски лаборатории кои користат современи

биохемиски анализатори, концентрацијата на глукоза во крв се определува заедно со
другите биохемиски параметри, и за таа цел обично се користи серум добиен од венска
крв.
При користење на серум добиен од венска крв треба да се има предвид уште
еден многу значаен факт:
Кога крвта ќе се извади и ќе се остави необработена на собна температура
доаѓа до снижување на концентрацијата на глукозата, поради гликолизата
која се одвива во крвните клетки.
39
Поради тоа, и во однос на манипулацијата со епруветите после земањето на
крвта, секоја лабораторија, но и секоја здравствена установа, треба да си воспостави
своја стандардна постапка која ќе биде во склад со принципите на добра лабораториска
пракса, односно да воспостави систем на работа каде нема да се дозволи пролонгиран
контакт (со часови) на серумот со крвниот коагулум.
Во некои лаборатории за инхибирање на гликолизата, а со тоа за

стабилизирање на концентрацијата на глукозата, се користат епрувети со натриум
флуорид. Меѓутоа, од друга страна пак натриум флуоридот пречи при определувањето
на некои други параметри (уреа, ензими), така што генерално истиот нема широка
примена.
За определување на концентрацијата на глукоза во крв, во современите

клиничко-биохемиски лаборатории најчесто се користат следните две методи:
1. Методата со глукоза оксидаза и
2. Методата со хексокиназа.
Поретко се користи методата со глукоза дехидрогеназа.
Сите овие методи се ензимски и специфични за глукозата.
Согласно степенот на нивната примена во рутинските клиничко-биохемиски
лаборатории, во продолжение детално ќе ги обработиме методите за определување на
глукоза во серум или плазма со глукоза оксидаза и хексокиназа.

глукоза оксидаза (GOD-PAP метода)
Методата за определување на концентрацијата на глукоза со глукоза оксидаза е во

широка употреба во клиничко-биохемиските лаборатории.
Во продолжение е даден детален опис на оваа метода, согласно протоколот од
производителот на реагенсот HUMAN, број SU-GLLQ2 INF 1026002 GB 07-2008-19.
Овој детален опис на методата не претставува буквален превод на протоколот од
HUMAN, туку негово прилагодување за потребите на курсот по Клиничка биохемија.
Оригиналниот протокол е прикачен на платформата за е-учење.
Називот GOD-PAP метода потекнува од кратенките за ензимот и хромогенот кои
учествуваат во реакцијата, и тоа:
GOD – глукоза оксидаза и
PAP – пара-аминоантипирин (4-аминоантипирин, пара-аминофеназон;
4-аминофеназон).
Принцип на методата:
Според оваа метода концентрацијата на глукоза се определува после нејзината
ензимска оксидација до глуконска киселина под дејство на ензимот глукоза оксидаза.
Ослободениот водород пероксид од оваа реакција, под каталитичко дејство на ензимот
пероксидаза, во присуство на фенол и 4-аминофеназон, развива црвено обојување од
соединението кинонимин. Концентрацијата на глукоза е право пропорционалана со
интензитетот на обојување на растворот.
глукоза оксидаза
глукоза + О2 + H2O глуконска киселина + H2O2
пероксидаза
2H2O2 + 4-аминофеназон + фенол кинонимин + 4 H2O
40
Состав на реагенсот:
RGT:
Фосфатен пуфер (рН 7,5) 0,1 mol/L
4-аминофеназон 0,25 mmol/L
Фенол 0,75 mmol/L
Глукоза оксидаза > 15 KU/L
Пероксидаза > 1,5 KU/L
Мутаротаза > 2,0 KU/L
Стабилизатори
STD:
Глукоза 100 mg/dL односно 5,55 mmol/L
Подготовка и стабилност на реагенсите:

Реагенсот и стандардот ги добиваме во готова форма како комплет од реагенси -
кит.
Реагенсот е стабилен сè до истекот на рокот на траење, дури и после отворањето, ако
се чува на 2...8°C. На температура од 15...25°С реагенсот е стабилен до две недели.
При работа мораме да ја одбегнеме контаминацијата.
Примерок:
Серум, плазма.
Глукозата е стабилна до 24 часа кога примерокот се чува на 2...8°C, доколку серумот
или плазмата се одвоени до 30 минути по земањето на крвта.
Постапка:
Бранова должина: 500 nm
Должина на киветата: 1 cm
Температура: 20…25°C или 37°C
Шема за пипетирање, за мануелна изработка на анализата:
Слепа проба Стандард Примерок

Стандард (STD) / 10 µL /
Примерок / / 10 µL
Реагенс (RGT) 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Се промешува и се инкубира 10 минути на температура од 20-25°C, или 5 минути на

температура од 37°C. Се мери апсорбанцијата на примерокот (ΔAпримерок) и на
стандардот (ΔAстандард) наспроти слепата проба за време од најмногу 60 минути.
Пресметување на концентрацијата на глукоза:
ΔА примерок mmol
c = 5,55 × [ ]
ΔA стандард L
Концентрацијата на глукозата може да се изрази и во mg/dL, ако наместо 5,55 во

формулата се употреби вредноста 100, што ја претставува концентрацијата на
стандардот изразена во mg/dL. Важно е да се нагласи дека во нашата земја вообичаено
се користи единицата според SI системот – mmol/L. Но во некои земји се претпочита
единицата mg/dL.
41
Карактеристики на методата:
Тестот е линерен во граници до 400 mg/dL (22,2 mmol/L). Примероците со повисока
концентрација на глукоза се разредуваат 1 + 2 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се
повторува определувањето на концентарцијата. Резултатот се множи со 3.
Референтни вредности:
Во серум или плазма (на гладно): 75-115 mg/dL или 4,2-6,4 mmol/L
(Забелешка: Производителите на реагенсите во протоколите за изработка на анализите

даваат свои референтни вредности кои можат да се разликуваат од референтните
вредности кои се дадени во протоколите на други производители. Овде е дадена
референтната вредност од производителот Human, протокол број SU-GLLQ2 INF
1026002 GB 07-2008-19.)
Забелешка:
1. Иктеричните примероци интерферираат со тестот и затоа не треба да се
употребуваат за анализа.
2. Врз тестот не влијае концентрацијата на хемоглобин, дури и до 500 mg/dL,
концентрација на триглицериди до 2500 mg/dL, ниту вредностите од аскорбинска
киселина до 20 mg/dL.
Оваа метода со успех е аплицирана на автоматските биохемиски анализатори

од различни производители, но исто така може да се изработува и мануелно, со
употреба на спектрофотометар. Ова е впрочем еден генерален принцип кој се однесува
за сите спектрофотометриски методи кои ќе ги обработиме во рамките на овој курс. При
мануелната изработка на анализите, од особена важност е правилната техника на
пипетирање.
Техника на пипетирање при мануелна изработка на клиничко-биохемиски

анализи
Техниката на пипетирање има големо влијание врз точноста на резултатите од
клиничко-биохемиските анализи кои се изработуваат мануелно.
Пипетирањето на реагенсот се врши со некоја од техниките кои беа детално
обработени во претходното поглавје, зависно од големината на серијата и природата
на реагенсот.
За пипетирање на примерокот треба да се примени следната техника:
1. Најпрвин се користи основната техника на пипетирање.
2. Кога ќе се комплетираат сите чекори од основната техника, се врши
“проплакнување” на продолжетокот со реакционата смеса со користење на
техниката која шематски е прикажана на Слика 2.8.
3. За пипетирање на нов примерок задолжително се користи нов продолжеток.
A 1 2 3 4 5
B
C
Слика 2.8. Техника на “проплакнување” на продолжетокот со реакционата смеса

42
методата со хексокиназа
Методата за определување на глукоза во биолошки материјал со помош на ензимот

хексокиназа широко се користи во клиничко-биохемиските лаборатории. Во
продолжение е опишано определувањето на глукоза во серум (или плазма) со оваа
метода, согласно протоколот на производителот на реагенсот Human, број SU-GLUV3
INF 1078601 GB 10-2008-11.
Оригиналниот протокол е закачен на платформата за е-учење. Може да се забележи
дека со овој реагенс кит може да се определува глукоза не само во примероци од серум
(плазма), туку и во полна крв (после постапка за депротеинизација) и во
цереброспинална течност. Сите овие постапки ќе бидат детално обработени во рамките
на практичната настава. Во рамките на овој учебник ќе се задржиме само на
определувањето на концентрацијата на глукоза во серум или плазма.
Според оваа метода концентрацијата на глукоза се определува после нејзината

фосфорилација до глукоза-6-фосфат под дејство на ензимот хексокиназа, во присуство
на АТР како донор на фосфат. Понатаму, под каталитичкото дејство на ензимот глукоза-
6-фосфат дехидрогеназа и во присуство на коензимот NAD+, глукоза-6-фосфатот се
оксидира до глуконат-6-фосфат, при што коензимот NAD+ се редуцира до NADH + H+.
Порастот на апсорбанцијата како резултат на создавањето на NADH + H+ е право
пропорционален со концентрацијата на глукоза во примерокот.
Овде всушност е искористено својството на коензимот NAD да ја апсорбира светлината
на 340 nm кога е во својата редуцирана форма, а да не ја апсорбира светлината на
истата таа бранова должина кога е во својата оксидирана форма.
хексокиназа
глукоза + АТР глукоза-6-фосфат + ADP
глукоза-6-фосфат дехидрогеназа
глукоза-6-фосфат + NAD+ глуконат-6-фосфат + NADH + H+
RGT:
PIPES пуфер (рН 7,6) 100 mmol/L
ATP 4,7 mmol/L
NAD 3,1 mmol/L
Mg++ 4,9 mmol/L
Хексокиназа > 1,5 U/mL
Глукоза-6-фосфат дехидрогеназа > 1,5 U/mL
Натриум азид 0,05%
STD:
Глукоза 100 mg/dL односно 5,55 mmol/L

Реагенсот и стандардот ги добиваме во готова форма како комплет од реагенси -
кит.
Реагенсот е стабилен сè до истекот на рокот на траење, дури и после отворањето, ако
се чува на 2...8°C. На температура од 15...25°С реагенсот е стабилен до две недели.
Реагенсот треба да се чува заштитен од светлина. При работа мораме да ја одбегнеме
контаминацијата.
43
Примерок:
Серум, плазма.
Глукозата е стабилна до 24 часа кога примерокот се чува на 2...8°C, доколку серумот
или плазмата се одвоени до 30 минути по земањето на крвта.
Постапка:
Температура: 20…25C или 37°C


Пресметување на концентрацијата на глукоза:
ΔA примерок mmol
c = 5,55 × [ ]
Тестот е линерен во граници до 1000 mg/dL (55,5 mmol/L).
Во серум или плазма (на гладно): 75-115 mg/dL или 4,2-6,4 mmol/L
(Забелешка: Производителите на реагенсите во протоколите за изработка на анализите

даваат свои референтни вредности кои можат да се разликуваат од референтните
вредности кои се дадени во протоколите на други производители. Овде е дадена
референтната вредност од производителот Human, протокол број SU-GLUV3 INF
1078601 GB 10-2008-11.)
Забелешка:
1. Реагенсот содржи натриум азид како конзерванс. Да не се голта! Да се избегнува
контакт со кожа и мукозни мембрани!
2. Иктерични примероци, со билирубин над 10 mg/dL, може да интерферираат со
тестот и затоа не треба да се користат за изработка на оваа анализа.
3. Светло кафеав талог може да се јави на дното од реагенсот. Неговата појава не
пречи на активноста на реагенсот, но истиот не треба да се користи во
реакционата смеса.
44
2.3.1.3. Определување на концентрацијата на глукоза во полна крв со прирачен
глукометар
Во практиката, за определување на концентрацијата на глукоза во крв се

користат и прирачни глукометри, популарно наречени апаратчиња за шеќер.
Прирачните глукометри се во широка употреба во домашни услови,
овозможувајќи им на пациентите заболени од Diabetes mellitus редовно следење на
гликемијата. Прирачните глукометри се користат и во болнички установи, за брзо
определување на гликемијата во ургентни состојби, на самото одделение, практично
веднаш до болничкиот кревет, без при тоа да се губи време за транспорт на крвта до
лабораторијата, за обработка на примерокот и за изработка на анализата. Прирачни
глукометри се користат и во амбулантни услови, најчесто во ординации по општа и
интерна медицина.
Прирачните глукометри се дизајнирани за лесно и брзо определување на
гликемијата. Како примерок за анализа се користи капиларна полна крв. Анализата се
изведува на тој начин што капка полна крв се капнува на тест-лентата на која се
нанесени сите потребни реагенси во сува состојба, при што е искористена некоја од
погоре опишаните ензимски методи. Потоа тест-лентата се внесува во апаратчето и по
извесно време на дисплејот се отчитува резултатот. Принципот на мерење се заснова
или на рефлексивна фотометрија (каде се мери интензитетот на светлината која е
рефлектирана од тест-лентата) или на електрохемија (каде се мери протокот на
електрони кој резултира од ензимската реакција).
Денес, во аптеките во нашата земја, на пациентите им се достапни различни
модели на прирачни глукометри кои се разликуваат во однос на начинот и принципот
на работа, цената и квалитетот. Во оваа смисла, значајна е улогата на фармацевтот да
им помогне на пациентите во изборот на глукометар кој ќе ги задоволи нивните барања
и потреби. Важно е да се нагласи дека точноста на резултатите кај прирачните
глукометри во голема мерка зависи од правилното земање на крв и правилното
ракување со овие инструменти. Поради тоа, пациентите кои користат глукометар во
домашни услови треба да бидат запознаени со начинот на нивна правилна употреба.
Фармацевтите вклучени во продажбата на прирачни глукометри можат во голема мерка
да им помогнат на пациентите со информација за правилната употреба на конкретниот
модел.
Производителите на прирачни глукометри постојано работат на подобрување на
квалитетот и перформансите на овие инструменти. Така, пред неколку години на
пазарот се појави прирачниот глукометар HemoCue® Glucose 201 System кој се
одликува со особено висока точност и прецизност што се споредливи со точноста и
прецизноста на биохемиските анализатори. Спецификата на овој инструмент е тоа што
наместо тест-лента користи реакциона кивета за еднократна употреба која ги содржи
сите потребни реагенси за изведување на анализата, во сува состојба. Повеќе
информации за овој инструмент можат да се најдат на веб страната на производителот.
За среќа, овој прирачен глукометар е достапен и во нашата земја. Уште повеќе, имавме
можност во една мала пилот студија да ги провериме перформансите на овој
инструмент и да го споредиме со два различни биохемиски анализатори (необјавени
резултати). Нашата пилот студија ги потврди наводите на производителот дека
резултатите што ги генерира HemoCue® Glucose 201 System се споредливи со
резултатите добиени од биохемиските анализатори.
Со оглед на значењето на прирачните глукометри за пациентите кои се заболени
од Diabetes mellitus, во иднина може да се очекуваат повеќе иновации на ова поле.
45
2.3.2. Определување на глукоза и кетонски тела во урината
Во нормални услови речиси целокупната глукоза од гломеруларниот филтрат се

реапсорбира на ниво на проксималните тубули, така што кај здрави лица во конечната
урина глукоза речиси не се среќава.
Меѓутоа, кога концентрацијата на глукоза во крвта ќе ја надмине вредноста од
11,0 mmol/L, доаѓа до надминување на тубуларниот капацитет за реапсорпција на
глукозата, па во конечната урина се среќаваат зголемени концентрации на глукоза.
Оваа појава се нарекува глукозурија. Вредноста на концентрацијата на глукоза во
крвта над која се надминува тубуларниот капацитет за нејзина реапсорпција се нарекува
“бубрежен праг“ за глукозата. Во различни учебници се среќаваат различни вредности
за бубрежниот праг на глукозата кои се движат помеѓу 9,0 и 11,0 mmol/L.
Глукозурија може да се јави и при пониски концентрации на глукоза во крвта од
горенаведените, па дури и кај нормогликемични пациенти и во тој случај станува збор
за т.н. ренална глукозурија, која е резултат на намален тубуларен капацитет за
реапсорпција на глукозата.
За детектирање на глукоза во урината во современите клиничко-биохемиски
лаборатории се користат тест-ленти кои се дизајнирани по принципот на сува хемија.
Имено, тие се направени од пластична маса на која се нанесени квадратни парчиња
специјална хартија импрегнирана со реагенси во сува состојба. За секој аналит (глукоза,
кетонски тела, билирубин, уробилиноген, албумини...) се користи специфична
комбинација од реагенси. Конкретно, за определување на глукоза, најчесто се користи
методата со глукоза оксидаза, па реагенс-хартијата за глукоза е импрегнирана со:
глукоза оксидаза, пероксидаза и хромоген (хромогенот се разликува кај тест-лентите од
различни производители).
Техниката на изработка на хемиски преглед на урината со помош на тест-ленти
е идентична за сите параметри кои се опфатени на таа тест-лента. Имено, на тест-
лентата може да има различен број полиња, и сите овие анализи практично се
изработуваат истовремено.
Анализата се изведува со промешана, нецентрифугирана урина, на тој начин
што тест-лентата целосно се потопува во примерокот, приближно 2 секунди. Потоа
лентата се вади од примерокот, а вишокот урина се отстранува со провлекување на
страничниот раб од тест-лентата по работ на чашката за урина. Лентата се остава во
хоризонтална положба околу 1 минута, по што се врши споредување на интензитетот
на обојувањето на полињата реагенс-хартија со шаблонот што се наоѓа на
надворешниот дел од секое пакување на тест-лентите (Слика 2.9.). Според тоа,
методите за хемиски преглед на урината со тест-ленти се семиквантитативни.
Садот во кој се остава примерокот од урина треба да биде чист, сув и да нема
остатоци од детергенти (поради можни интерференции). Урината треба да се
анализира веднаш, а најдоцна за 2 часа. Полињата хартија со импрегнирани реагенси
не смеат да се допираат со раце.
На ист начин, со користење на тест-ленти, се детектираат и кетонските тела во
урината. Методата се заснова на принципот на реакција на ацетонот и ацетоцетната
киселина со натриум нитропрусид, при што се добива виолетово обојување. β-
хидроксибутерната киселина не реагира со натриум нитропрусидот.
Позитивен наод на глукоза и кетонски тела во урината кај пациенти со Diabetes
mellitus укажува на лоша регулација на дијабетот и потреба од поинтензивен третман.
Кетонски тела во урината можат да се јават и кај лица кои не се заболени од
Diabetes mellitus, во услови на гладување.
46
Слика 2.9. Пакување тест-ленти за урина со шаблон за визуелно отчитување на
резултатот
Иако визуелното отчитување на тест-лентите е вообичаена практика во

најголемиот број клиничко-биохемиски лаборатории, сепак овој пристап има еден
значаен недостаток, а тоа е одредениот степен на субјективизам (сепак мора да
признаеме дека човековото око не е непогрешиво). Поради тоа, во поново време на
пазарот се појавија инструменти за отчитување на тест-лентите, кои поседуваат
специфичен оптички систем за таа намена, со што се постигнува поголема прецизност
и репродуцибилност на резултатите. На Слика 2.10. е прикажан еден инструмент за
отчитување на тест-ленти за урина.
Слика 2.10. Инструмент за отчитување на тест-ленти за урина

(Извор – Analyticon, Германија)
47
2.3.3. Орален глукоза толеранс тест – оГТТ
За дијагностицирање на шеќерната болест од особено значење е оралниот

глукоза толеранс тест – оГТТ. Овој тест има незаменлива улога во поставувањето на
точна дијагноза кај пациенти кај кои концентрациите на глукоза во крвта на
гладно се околу или лесно над горната референтна вредност. Токму од таа
причина, мошне значајно е правилното изведување на ова испитување.
оГТТ се изведува под точно дефинирани услови и тоа:
1. Пред изведувањето на тестот пациентот може да има стандардна,

неограничена активност, меѓутоа не смее да се изложува на невообичаено
интензивно физичко напрегање.
2. Пред изведувањето на тестот пациентот треба да се придржува кон
нормален режим на исхрана кој, меѓу другото, мора да содржи и најмалку 150
g јаглехидрати дневно во период од три дена пред изведувањето на тестот.
3. Доколку е можно (со дозвола на лекарот) пред изведувањето на тестот
пациентот треба да престане со земањето на лековите кои влијаат на
толеранцијата кон глукоза, како што се кортикостероидите и диуретиците.
4. оГТТ не се изведува кај пациенти кои се под влијание на некоја траума,
инфекција или ако се во фаза на закрепнување од некоја тешка болест.
5. Пред изведувањето на тестот, како и во текот на самото испитување
пациентот не смее да пуши, да јаде или да пие било што друго освен
растворот на глукоза кој му се дава за изведување на тестот.
6. Во текот на изведувањето на тестот пациентот мора да мирува. Најдобро е
во текот на изведувањето на тестот пациентот да седи, а доколку лежи тоа
треба да биде на десната страна за да се обезбеди празнење на желудникот.
Пациентот не смее да лежи на левата страна!
7. Тестот се изведува после ноќно гладување од 12-14 часа, во кој временски
период пациентот може да пие само вода, ако за тоа има потреба.
8. Со изведување на тестот се почнува наутро, најдобро околу 8:00 часот.
Пред да му се даде раствор на глукоза, на пациентот најпрвин му се зема

венска крв за определување на концентрацијата на глукоза во серумот на гладно.
Потоа на пациентот му се дава да испие свежо подготвен раствор на глукоза кој

е подготвен на следниот начин:
75 g глукоза се раствораат со 250-300 mL вода. За подобро растворање,
растворот благо се загрева. Кога глукозата ќе се раствори, растворот се лади до
собна температура. Вака подготвениот раствор му се дава на пациентот да го
испие во рок од 1-2 минути.
За изведување на оГТТ кај деца се подготвува раствор во концентрација од 1,75
g глукоза на килограм телесна маса, сè до постигнување на количеството од 75
g.
При подготвувањето на растворот на глукоза особено треба да се внимава
на хигиената! Најдобро е растворот да се подготвува во посебна просторија која ќе
биде само за таа намена, со цел да се оневозможи и најмал контакт со хемикалии и
инфективен материјал. Денес на пазарот се достапни и комерцијални раствори на
глукоза за оГТТ.
Стандардно, крв повторно се зема 120 минути по оптоварувањето со глукоза, или

според протокол даден од страна на дијабетологот. Во времето на земање на крв може
да се остави и урина за детектирање на потенцијалната глукозурија.
48
Во случај на суспектна реактивна (постпрандијална) хипогликемија тестот може
да се продолжи и до 6 часа по оптоварувањето со глукоза, при што крв се зема на секои
60 минути. При суспектна реактивна хипогликемија добро е да се има подготвен раствор
на глукоза кој би се искористил доколку пациентот почувствува изразени симптоми на
хипогликемија. После тоа оГТТ се прекинува.
Критериумите на Светската здравствена организација (1999 год.) за

интерпретација на резултатите од оГТТ се прикажани во Табела 2.1.
Табела 2.1. Интерпретација на резултатите од оГТТ
нарушување на нарушување на
нормални
конц. на гликемијата на толеранцијата Diabetes mellitus
вредности
глукоза во гладно кон глукоза
венска на по 2 на по 2 на по 2 на по 2
плазма гладно часа гладно часа гладно часа гладно часа
(mmol/L) ≥ 6,1 и
< 6,1 < 7,8 < 7,8 < 7,0 ≥ 7,8 ≥ 7,0 ≥ 11,1
<7,0
За илустрација, на Слика 2.11. се прикажани резултати од оГТТ на тројца

пациенти, од кои еден е со нормален наод, еден е со нарушена толеранција кон глукоза
и еден е со дијабет тип 2. При изведување на оГТТ кај овие пациенти, концентрацијата
на глукоза во крв е мерена на секои 30 минути.
18
15
Глукоза во крв (mmol/L)
12
0
0 30 60 90 120
Време (минути)
Легенда:
- Пациент со нормален наод (зелена боја)
- Пациент со нарушена толеранција кон глукоза (жолта боја)
- Пациент со Diabetes mellitus тип 2 (црвена боја)
Слика 2.11. Графички приказ на резултати од оГТТ

(Извор – Built for Motion)
49
2.3.4. Дијагностичко значење на хемоглобин А1ц и негово определување
Пред да се запознаеме со дијагностичкото значење на хемоглобинот А1ц

(HbA1c) и неговото определување, најпрвин накратко да се потсетиме за хемоглобинот,
поточно за неговата хемиска структура и функцијата.
Хемоглобинот претставува главен функционален протеин на еритроцитите. Во
крвната плазма нормално нема хемоглобин. Според својата хемиска структура
хемоглобинот претставува хромопротеид, изграден од протеинска компонента – глобин
и непротеинска компонента – хем. Хемоглобинот всушност е тетрамер, при што секоја
од четирите субединици е изградена од еден полипептиден синџир и еден хем.
Хемиската структура на хемоглобинот детално ја изучуваме во рамките на предметот
Општа биохемија.
Во хуманите еритроцити нормално ги има следните видови хемоглобин:
1. Хемоглобин А (кој е познат и како хемоглобин А1), во кој се среќаваат 2α и 2β
полипептидни синџири и кој чини околу 95-98% од хемоглобинот во
еритроцитите кај возрасни здрави лица,
2. Хемоглобин А2, во кој се среќаваат 2α и 2δ полипептидни синџири и кој чини
околу 2,0 - 3,5% од хемоглобинот во еритроцитите кај возрасни здрави лица,
3. Феталниот хемоглобин (HbF), во кој се среќаваат 2α и 2γ полипептидни
синџири и кој е главен хемоглобин во крвта на фетусот, додека во адултните
еритроцити е застапен со помалку од 1% и
4. Примитивниот хемоглобин, кој се синтетизира во ембрионалниот период, од
7-12 недела, а потоа се заменува со феталниот хемоглобин.
Во состав на еритроцитите, хемоглобинот врши низа функции од кои најзначајни
се следните:
1. Го транспортира молекуларниот кислород од белите дробови до ткивата,
2. Учествува во преносот на СО2 од ткивата до белите дробови,
3. Учествува во регулација на рН на крвта.
Биохемиските основи на функциите на хемоглобинот исто така детално се
обработени во рамките на предметот Општа биохемија.
Покрај претходно споменатите видови хемоглобин, во еритроцитите се среќава
и извесно количество HbA1c кој се формира по пат на неензимско врзување на
глукозата (гликација) со протеинскиот дел од молекулата на хемоглобинот А1. HbA1c
го добил своето име при неговата изолација со хроматографска метода, согласно
фракцијата во која бил идентификуван.
HbA1c има две значајни карактеристики што го прават исклучително погоден
биомаркер за широка клиничка употреба, како индикатор за регулацијата на
гликемијата во претходните два до три месеци:
1. Концентрацијата на HbA1c е право пропорционална со концентрацијата
на глукозата во крвта и тоа гледано долгорочно. Тоа значи дека
пациентите кои подолго време имале повисоки концентрации на глукоза во
крвта и тоа не само на гладно туку и постпрандијално, ќе имаат и повисоки
вредности на HbA1c.
2. Реакцијата на гликација на хемоглобинот е иреверзибилна, па поради
тоа HbA1c не се разложува, туку останува присутен во крвта сè додека
во циркулацијата се присутни самите еритроцити што го содржат.
Знаејќи дека животот на еритроцитите изнесува околу 120 дена и дека тие
континуирано се обновуваат, разбирливо е дека во даден момент во
циркулацијата ќе има и стари и млади еритроцити. Постарите еритроцити ќе
имаат поголема содржина на HbA1c, а помладите многу помала. Поради тоа,
HbA1c во просек ни дава информација за регулацијата на гликемијата во
последните два до три месеци.
Определувањето на HbA1c има исклучително големо значење за
дијагностицирање и следење на третманот кај пациенти со Diabetes mellitus, под
претпоставка дека животниот век на еритроцитите е нормален. Добиените резултати
50
за HbA1c треба внимателно да се интерпретираат кај пациенти со хемолитичка
анемија и кај пациенти кои неодамна имале значајна загуба на крв, каде измерените
вредности за овој параметар ќе бидат пониски во однос на тоа што би се очекувало
за дадениот степен на регулација на гликемијата. Повисоки вредности за HbA1c се
мерат кај пациенти со анемија предизвикана од дефицит на железо, што се смета
дека е резултат на повисоката процентуална застапеност на постари
еритроцити.
За определување на HbA1c во литературата се опишани над 30 различни
методи. Во рутинските клиничко-биохемиски лаборатории во најширока употреба се
имунохемиските и хроматографските методи.
Во рамките на овој курс, најпрвин ќе се запознаеме со принципот на
имунохемиската имуноинхибиторна метода за определување на HbA1c што е
имплементирана на неколку биохемиски анализатори кои се достапни на пазарот. Оваа
метода најпрвин вклучува пред третман на примерокот, каде 25 μL полна крв (EDTA
или хепаринизирана), претходно добро промешана, се додаваат во 1 mL реагенс за
денатурирање. Овој реагенс врши лизирање на еритроцитите, но и истовремена
хидролиза на полипептидните вериги на хемоглобинот со посредство на протеазата што
ја содржи.
Потоа, пред третираниот примерок (сега хемолизат) се користи за определување
на концентрациите на:
(1) вкупниот хемоглобин и
(2) хемоглобинот А1ц.
(1) Вкупниот хемоглобин се определува преку негова конверзија во хематин
во алкален раствор на нејонски детергент, при што интензитетот на
зеленото обојување на растворот е право пропорционален со
концентрацијата на вкупниот хемоглобин во хемолизатот.
(2) Хемоглобинот А1ц се определува со претходно споменатата
имуноинхибиторна метода за чие изведување се користат два реагенси. Едниот
реагенс содржи антитела кон HbA1c што се нанесени на латекс партикули.
Другиот реагенс содржи имунореактивни делови од HbA1c нанесени на
специјални носачи - аглутинатори.
а) Во отсуство на HbA1c во примерокот за анализа, доаѓа до силна
аглутинација во реакционата смеса поради меѓусебната реакција на
активните компоненти од двата реагенси. Како резултат на таа
аглутинација се мери висока апсорбанција на реакционата смеса (слепа
проба).
б) Обратно, доколку во примерокот за анализа има висока концентрација
на HbA1c, во тој случај антителата кон HbA1c нема да реагираат само со
имунореактивните делови од HbA1c нанесени на аглутинаторите, туку и
со HbA1c од примерокот. Поради тоа, степенот на аглутинација ќе биде
низок, односно ќе се измери ниска апсорбанција на реакционата смеса.
На Слика 2.12. е даден шематски приказ на имунохемиската имуноинхибиторна
метода за определување на HbA1c, за примерок со многу ниска концентрација на HbA1c
каде се забележува висок степен на аглутинација.
51
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Слика 2.12. Шематски приказ на имунохемиската имуноинхибиторна метода за

определување на HbA1c
(Прилагодено според Olympus; сега Beckman-Coulter, Соединети Американски Држави)
На крај, со користење на вредностите на апсорбанциите што се измерени за

калибраторите, биохемискиот анализатор математички ќе го пресмета количеството на
HbA1c во однос на вкупниот хемоглобин во хемолизатот. Важно е да се истакне дека за
калибрирање на имунохемиската имуноинхибиторна метода се користат повеќе
калибратори со различна концентрација, како што е впрочем случај и со сите останати
турбидиметриски и нефелометриски методи со кои ќе се запознаеме подоцна. За
определување на вкупниот хемоглобин во хемолизатот се користи само еден
калибратор. Резултатот се изразува како процент на HbA1c во однос на вкупниот
хемоглобин во хемолизатот, или во поново време, како mmol/mol (mmol HbA1c на mol
хемоглобин).
Покрај имунохемиската имуноинхибиторна метода, за определување на HbA1c

во последно време сè повеќе се користи и методата која е заснована на принципот на
боронат-афинитетна хроматографија. Кај оваа аналитичка техника, за носачот во
хроматографската колона е врзана фенилборонска киселина. При минување на
примерокот низ колоната, HbA1c се врзува за боронатот, а останатиот хемоглобин
слободно поминува. Елуцијата на HbA1c се врши со помош на реагенс кој ќе ја раскине
неговата врска со боронатот.
Предноста на оваа аналитичка техника се состои во тоа што нема
интерференции како резултат на: а)присуство на различни варијанти на хемоглобинот,
б)присуство на модификации на хемоглобинот што не се резултат на неензимското
врзување на глукоза и в)присуство на модификации што се јавуваат во тек на чувањето
на примерокот (дозволено е чување до 7 дена на температура од 2-8°С). Друга значајна
предност е што не е потребен пред третман на примерокот.
Врз основа на принципот на боронат-афинитетна хроматографија, се
дизајнирани различни клинички анализатори за определување на HbA1c, вклучително
и мали инструменти за лесно и брзо изработување на оваа анализа (point-of-care
анализатори). Пример за таков инструмент е HemoCue® HbA1c 501 System, кој ја
изработува анализата за само неколку минути.
Референтните вредности за HbA1c изнесуваат од 4,0 – 6,0%. Кај пациенти со

лошо регулиран дијабет вредностите за HbA1c може да изнесуваат над два пати над
горната референтна вредност, но ретко над 15%. Доколку се измери вредност на HbA1c
над 15%, треба да се размислува и за потенцијална интерференција од страна на некој
од факторите кои беа споменати претходно.
52
Согласно препораките на Американската асоцијација за дијабет (2012),
вредноста на HbA1c ≥ 6,5% претставува критериум за дијагностицирање на дијабет. Кај
пациенти со дијагностициран дијабет, цел на третманот е да се постигне вредност на
HbA1c под 7,0%.
2.3.5. Фруктозамин
Фруктозаминот претставува продукт на неензимска гликација на ε-амино групите

од лизинските остатоци на албуминот. Поради тоа што албумините од крвната плазма
имаат време на полуживот од околу 20 дена, концентрацијата на фруктозаминот ја
рефлектира контролата на гликемијата во тек на претходните 2-3 недели. На тој начин
се обезбедува податок за ефектот на терапијата многу порано во однос на HbA1c, што
е од значење кај некои пациенти, на пример при гестациски Diabetes mellitus или при
промена на терапијата.
Иако методите за определување на концентрацијата на фруктозаминот се
евтини, брзи и лесно се автоматизираат, сепак не постои консензус за широка употреба
на оваа анализа во клиничката пракса.
2.3.6. Дијагностичко значење на микроалбуминуријата
Нефропатијата претставува една од најчестите компликации што се јавуваат кај

лица заболени од Diabetes mellitus. Појавата на зголемена екскреција на уринарен
албумин индицира постоење на зголемена транскапиларна пропустливост за
албуминот на ниво на бубрежните гломерули и претставува биомаркер за
микроваскуларните компликации кај овие пациенти.
Перзистентната протеинурија што се детектира со рутинските тест-ленти за
урина и која е еквивалентна на екскреција на уринарен албумин над 300 mg/24 h
претставува јасна индикација за постоење на нефропатија. Кога еднаш ќе се јави
дијабетска нефропатија, реналната функција брзо се нарушува и доаѓа до појава на
бубрежна инсуфициенција.
Пред да се достигне овој стадиум, карактеристичен е период на покачена
екскреција на уринарен албумин (од 30-300 mg/24 h) која, особено во пониските
концентрации, не се детектира со тест-лентите за рутински хемиски преглед на урината.
Ваквата екскреција на уринарен албумин се нарекува микроалбуминурија1. Кај
пациентите кај кои е присутна микроалбуминурија неопходна е строга контрола на
крвниот притисок и на гликемијата, со цел да се намали брзината на опаѓање на
бубрежната функција.
За детекција на микроалбуминуријата се користат имунохемиски методи. Со
една таква метода ќе се запознаеме подоцна, во поглавјето за анализа на специфични
протеини.
За определување на микроалбуминуријата можат да се користат различни
видови примероци:
1. 24-часовна урина,
2. Ноќна урина (8- или 12-часовна),
3. 1- или 2-часовна урина или
4. Прва утринска урина, кога се определува односот албумин/креатинин.
Најточни резултати се добиваат со 24-часовна или ноќна урина. Од друга страна,

определувањето на односот албумин/креатинин во првата утринска урина претставува
1Терминот микроалбуминурија, иако е општо прифатен, сепак не е сосема коректен. Имено,

истиот повеќе упатува на мали молекули на албумини (што не е коректно), отколку на екскреција
на количество на албумини со урината кое е повисоко од референтните вредности, но пониско
од она кое вообичаено се детектира со рутинските тест-ленти.
53
метода која се препорачува како најпрактична за пациентите, а сепак се одликува со
доволна точност.
Во продолжение се дадени референтните вредности, како и вредностите кои ги
дефинираат состојбите на микроалбуминурија и клиничка протеинурија.
<20 μg/мин
<30 mg/24 h
<30 mg/g креатинин во урина
Микроалбуминурија:
20-200 μg/мин
30-300 mg/24 h
30-300 mg/g креатинин во урина
Макроалбуминурија (клиничка протеинурија):
>200 μg/мин
>300 mg/24 h
>300 mg/g креатинин во урина
Поради високите интраиндивидуални разлики за овој параметар (CV од 30-50%),

се препорачува да бидат направени три мерења во три различни дена. Испитувањето
не треба да се прави после тежок физички напор, при постоење на инфекција на
уринарните патишта, во тек на некоја акутна состојба и веднаш после оперативен
зафат.
Доколку анализата се изработува во примерок од 24-часовна урина, урината
треба да се чува на 4°С, без конзерванс. Пред изработка на анализата примерокот
треба да се остави да ја достигне собната температура.
2.3.7. Дијагностичко значење на инсулинот и Ц-пептидот
Инсулинот се синтетизира во β-клетките на Лангерхансовите островца во

панкреасот, на ниво на рибозомите на рапавиот ендоплазматичен ретикулум. Најпрвин
се синтетизира препроинсулин кој е изграден од околу 100 аминокиселински остатоци.
Под дејството на специфични протеолитички ензими, препроинсулинот брзо се
трансформира во проинсулин кој се складира во секреторните гранули на Голџиевиот
систем на β-клетките. Тука, повторно под дејството на специфични протеолитички
ензими, доаѓа до разложување на проинсулинот до инсулин кој има 51
аминокиселински остаток и Ц-пептид. Овие два продукти се секретираат во крвта во
еквимоларни количества. Поради тоа, преку определување на концентрацијата на Ц-
пептидот може да се суди за нивото на продукција на инсулинот. При тоа,
определувањето на концентрацијата на Ц-пептидот дури има и предност во однос на
определувањето на концентрацијата на самиот инсулин поради тоа што полуживотот
на Ц-пептидот во циркулацијата е до 5 пати подолг отколку оној на инсулинот, но и
поради тоа што неговата серумска концентрација не е толку променлива како онаа на
инсулинот. Исто така, преку определување на концентрацијата на инсулинот не може
да се направи разлика помеѓу ендогениот и егзогениот инсулин кај пациентите кои се на
инсулинска терапија, што не е случај при определувањето на концентрацијата на Ц-
пептидот кој ја рефлектира само ендогената синтеза на инсулин.
Концентрацијата на Ц-пептидот може да се определува во серум, плазма или
урина. Меѓутоа, неговата концентрација во урината е прилично варијабилна и како таква
не претставува прецизна мерка за проценка на функцијата на β-клетките. Клиничките
индикации за определување на концентрацијата на Ц-пептидот се следните:
1. Пре- и пост-дијагностички испитувања кај Diabetes mellitus, како насока за
избор на третманот,
2. Дијагностицирање на инсулином,
3. Следење на пациентите после панкреатектомија,
54
4. Проценка на вијабилноста на трансплантирани β-клетки.
Основната клиничка апликација на определувањето на концентрацијата на
инсулинот во крвната плазма / серум е кај пациенти со хипогликемија. Во последно
време неговата концентрација се определува и кај жени со синдром на полицистични
јајници, за проценка на степенот на инсулинска резистенција. Некои автори
препорачуваат мерење на концентрацијата на инсулинот заедно со глукозата при
изработка на оГТТ, но ваквиот пристап не е широко прифатен.
За определување на концентрацијата на инсулинот и Ц-пептидот се користат
ензимско-имунохемиски методи, со кои ќе се запознаеме подоцна.
55
3. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ МЕТОДИ ЗА ПРОЦЕНКА НА ЛИПИДНИОТ СТАТУС
Прекумерната телесна тежина и дебелината, седентарниот стил на живеење и

неправилната исхрана, што се многу честа појава во современиот свет, секако во тесна
врска со генетската компонента, ја преставуваат основата на дислипидемиите,
зголемениот атероген ризик и кардиометаболните заболувања. Токму затоа, во ова
поглавје ќе се задржиме на липидите, липидниот метаболизам, дислипидемиите и
методите за определување на липидниот статус.
3.1. Липиди: општи карактеристики, поделба и основи на метаболизмот
Заедно со протеините, липидите го чинат главниот дел од органската материја

на живите клетки.
Липидите (мастите) претставуваат една голема група на мошне хетерогени
органски соединенија кои се широко распространети во живата материја. Нивна
заедничка особина е тоа што се релативно нерастворливи во вода, а се раствораат во
неполарни (органски) растворувачи како што се: етер, хлороформ, петролетер и сл.
Биолошките функции на липидите во организмот се многубројни и разновидни:
1. Триглицеридите претставуваат значаен извор на енергија во организмот (со
согорување на 1 g маст се ослободува енергија од 38,9 kJ);
2. Триглицеридите се и значајна енергетска резерва депонирана во масните
депоа;
3. Фосфолипидите и гликолипидите влегуваат во состав на биолошките
мембрани и нервното ткиво;
4. Холестеролот претставува прекурсор за биосинтеза на стероидните хормони
и жолчните киселини, кои и самите се класифицирани во групата на липиди;
5. Холестеролот исто така претставува значајна структурна компонента на
биолошките мембрани;
6. Го овозможуваат транспортот на витамините растворливи во масти;
7. Претставуваат механичка изолација на виталните органи во организмот.
Во литературата се среќаваат различни класификации на липидите, но многу

често тие се класифицираат на следниот начин:
1. Триглицериди (триацилглицероли, неутрални масти или

вистински масти),
2. Восоци,
3. Фосфолипиди,
4. Гликолипиди,
5. Стероиди и
6. Каротеноиди.
3.1.1. Триглицериди
Триглицеридите претставуваат естри на трихидроксилниот алкохол глицерол со

вишите масни киселини, при што сите три хидроксилни групи од глицеролот се
естерифицирани со по една молекула од масна киселина.
Реакцијата на естерификација се одвива на тој начин што во меѓусебна реакција
стапуваат:
a) Хидроксилната група од глицеролот и
б) Карбоксилната група од масната киселина,
при што се ослободува една молекула на вода.
56
Со естерификација на сите три хидроксилни групи на глицеролот, ќе се
ослободат три молекули на вода. Модел на една молекула на триглицерид е прикажан
на Слика 3.1.
Слика 3.1. Модел на триглицерид
Ретка е појавата триглицеридите да бидат хомогено изградени, односно сите три

хидроксилни групи на глицеролот да бидат естерифицирани со иста масна киселина.
Од друга страна можно е во молекулата на глицеролот естерски да биде врзана само
една масна киселина со што се добива моноглицерид или пак две масни киселини со
што се добива диглицерид.
Триглицеридите во најголема мерка се среќаваат во состав на масното ткиво,
како депонирани резервни масти во адипоцитите. Тие претставуваат енергетски
потенцијал кој по потреба може да се мобилизира, со што се обезбедува енергија за
непречено одвивање на метаболните процеси.
Триглицеридите се среќаваат и во крвната плазма, во состав на
липопротеинските партикули.
3.1.1.1. Масни киселини
Масните киселини се органски киселини што имаат долга неразгранета

алифатична јаглеводородна низа. Најчесто се среќаваат како конститутивен елемент на
комплексните липиди, а поретко и во мали концентрации како слободни масни киселини.
Според својата хемиска структура тие можат да бидат поделени на:
а) Заситени масни киселини и
б) Незаситени масни киселини.
а) Заситените масни киселини не поседуваат двојна врска во јаглеводородната
низа. Нивната општа формула е CnH2nO2 или CH3(CH2)nCOOH.
Од заситените масни киселини позначајни се:
1. Лауринската киселина (Lauric acid, со општа формула C12H24O2, која
поблиску се означува како 12:0);
2. Миристинската киселина (Myristic acid, со општа формула C14H28O2,
која поблиску се означува како 14:0);
3. Палмитинската киселина (Palmitic acid, со општа формула C16H32O2,
која поблиску се означува како 16:0);
4. Стеаринската киселина (Stearic acid, со општа формула C18H36O2, која
поблиску се означува како 18:0) и
5. Арахидинската киселина (Arachidic acid, со општа формула C20H40O2,
која поблиску се означува како 20:0).
Симболот 12:0 за лауринската киселина означува дека таа масна киселина има
вкупно 12 јаглеродни атоми и дека истата нема ниту една двојна врска во
јаглеводородната низа. Истата логика важи и за останатите заситени масни киселини:
палмитинската киселина (16:0) има 16 јаглеродни атоми и во јаглеводородната низа
57
нема ниту една двојна врска итн. Структурната формула на палмитинската киселина е
прикажана на Слика 3.2.
Слика 3.2. Структурна формула на палмитинска киселина
б) Незаситените масни киселини поседуваат една или повеќе двојни врски во

јаглеводородната низа. Нивната општа формула е:
а) CnH2n-2O2 → ако има една двојна врска,
б) CnH2n-4O2 → ако има две двојни врски,
в) CnH2n-6O2 → ако има три двојни врски итн.
Доколку во јаглеводородната низа на незаситената масна киселина има само
една двојна врска, таквата масна киселина се нарекува мононезаситена. Доколку
незаситената масна киселина содржи две или повеќе двојни врски во својата
јаглеводородна низа истата се означува како полинезаситена.
Од незаситените масни киселини позначајни се:
1. Олеинската киселина (со една двојна врска) (Oleic acid, со општа
формула C18H34O2, која поблиску се означува како 18:1;9);
2. Линолеинската киселина (со две двојни врски) (Linoleic acid, со општа
формула C18H32O2, која поблиску се означува како 18:2; 9,12);
3. α-Линоленската киселина (со три двојни врски) (Linolenic acid, со
општа формула C18H30O2, која поблиску се означува како 18:3; 9,12,15)
и
4. Арахидонската киселина (со четири двојни врски) (Arachidonic acid, со
општа формула C20H32O2, која поблиску се означува како 20:4;
5,8,11,14).
Структурната формула на α-линоленската киселина е дадена на Слика 3.3.
Слика 3.3. Структурна формула на α-линоленска киселина
Јаглеродниот атом кој влегува во состав на карбоксилната група е означен со

број 1. Првиот јаглероден атом после него е означен со α (алфа). Последниот
јаглероден атом е означен со ω (омега). Ваквиот принцип на означување на
јаглеродните атоми се применува кај сите масни киселини.
Во ознаката за α-линоленската киселина (18:3;9,12,15) бројот 18 означува дека
таа има вкупно 18 јаглеродни атоми и 3 двојни врски. Првата двојна врска започнува на
9-тиот јаглероден атом, втората на 12-тиот и третата на 15-тиот јаглероден атом.
Броено од назад, од последниот, ω-јаглероден атом, првата двојна врска почнува од
третиот јаглероден атом одзади и затоа се нарекува ω-3 двојна врска, а самата масна
киселина се класифицира во групата на ω-3 масни киселини. Тие имаат антиатерогено
и антиинфламаторно дејство. Во поголемо количество ги има во рибино масло и масло
од ленено семе. Масните киселини кај кои првата двојна врска, броено од назад,
почнува од 6-тиот односно од 9-тиот јаглероден атом се нарекуваат ω-6 односно ω-9
масни киселини, соодветно.
Постојат два вида конфигурација на двојните врски кај незаситените масни
киселини:
а) trans- конфигурација, каде водородните атоми што се врзани за двата
јаглеродни атоми меѓу кои се наоѓа двојната врска се од различна страна и
58
б) cis- конфигурација, каде водородните атоми што се врзани за двата
јаглеродни атоми меѓу кои се наоѓа двојната врска се од иста страна.
Според тоа, можни се две изомерни форми на една мононезаситена масна
киселина: trans- и cis- изомерна форма. Масните киселини кои имаат двојни врски со
trans- конфигурација на местото на тие двојни врски се сосема незначително извиткани
во просторот и по својата структура многу потсетуваат на заситените масни киселини.
За разлика од нив, масните киселини кои имаат двојни врски со cis- конфигурација на
местото на тие двојни врски се значително извиткани. Природните масти и масла
вообичаено содржат cis- масни киселини и сосема малку масни киселини со trans-
конфигурација на двојните врски, што ги има најмногу во месото и млекото.
Најголемиот дел од trans- масните киселини што се присутни во храната
настануваат во процесот на парцијално хидрогенизирање на маслата во прехранбената
индустрија и при изложување на маслата на високи температури. Поновите
истражувања го поврзуваат консумирањето на trans- масните киселини со значително
зголемен ризик за атеросклероза, па во развиените земји се спроведува кампања за
„нулта толеранција на trans- масни киселини“ во исхраната.
Значајна особина на масните киселини е што со зголемување на бројот на
јаглеродните атоми во нивната молекула им се зголемува и точката на топење. Така,
заситените масни киселини кои имаат помал број јаглеродни атоми во својата молекула
(од 4 до 8), на собна температура имаат течна конзистенција. Заситените масни
киселини со 8-12 јаглеродни атоми на собна температура имаат маслена конзистенција,
а оние со 14 и повеќе јаглеродни атоми на собна температура се во цврста состојба.
Присуството пак на двојни врски во јаглеводородната низа на масната киселина
придонесува за значително намалување на точката на топење во однос на соодветната
(онаа која има ист број на јаглеродни атоми) заситена масна киселина.
Од хемиските својства на масните киселини кои влегуваат во состав на
триглицеридите зависат и физичките својства на самите триглицериди, што може да се
илустрира со следниот пример:
а) Доколку трите хидроксилни групи на глицеролот се естерифицирани со
олеинска киселина (мононезаситена масна киселина со 18 јаглеродни атоми), се добива
триглицерид кој на собна температура има маслена конзистенција, односно е во течна
агрегатна состојба.
б) Доколку пак трите хидроксилни групи на глицеролот се естерифицирани со
стеаринска киселина (заситена масна киселина со 18 јаглеродни атоми), се добива
триглицерид кој на собна температура има масна конзистенција, односно е во цврста
агрегатна состојба.
Во состав на природните триглицериди скоро секогаш се среќаваат масни
киселини со парен број јаглеродни атоми. Најчесто се застапени палмитинската,
стеаринската и олеинската киселина. Најголем дел од масните киселини човековиот
организам има способност самиот да ги синтетизира, но дел од нив мора да ги прима
со храната (линолеинската, α-линоленската) и тие се означени како есенциелни масни
киселини (во постарата литература можат да се сретнат означени и како витамин F).
Најзначаен извор на овие масни киселини се: морската риба, растителните масла и
семиња и јаткастите плодови.
3.1.2. Восоци
Природните восоци се широко распространети. Попознати природни восоци се:

пчелиниот восок, растителните восоци, восоците од пердувите на пловните птици и
маста од главата на китовите. Природните восоци претставуваат смеса од различни
соединенија. Меѓутоа, нивна основна компонента е естер на долговерижен
еднохидроксилен алкохол со некоја виша масна киселина. Така, главната состојка на
пчелиниот восок е мирицинот кој претставува естер на алкохолот мирицил (C30H61OH)
со палмитинската киселина.
Восоците не се од значење за биохемијата на човекот.
59
3.1.3. Фосфолипиди
Фосфолипидите претставуваат една група соединенија со сложена хемиска

структура кои се одликуваат со тоа што во својата молекула, покрај масна киселина
естерски поврзана со алкохолна компонента, вклучуваат и фосфат.
Класификацијата на фосфолипидите е направена според алкохолната
компонента која влегува во состав на нивната молекула, па така фосфолипидите ги
делиме на:
1. Глицерофосфолипиди, кои се деривати на глицеролот и
2. Сфингофосфолипиди, кои се деривати на алкохолот сфингозин.
1. Глицерофосфолипидите според својата хемиска структура се доста слични со

триглицеридите, со таа разлика што третата хидроксилна група од глицеролот наместо
со масна киселина е естерифицирана со фосфорна киселина.
Кога првите две хидроксилни групи во молекулата на глицеролот се
естерифицирани со виши масни киселини, а третата со фосфорна киселина, се добива
основната структура на фосфолипид што се нарекува фосфатидна киселина. Од
причина што е можно естерско поврзување на различни виши масни киселини,
посоодветен е називот фосфатидни киселини.
За фосфатот од
фосфатидната киселина може
естерски да се поврзат: холин, CH3 O
серин, етанол амин, мио-инозитол. H C N CH CH O P O CH HC H2C
2
Доколку за фосфатот од
3 2 2
CH3 O
фосфатидната киселина се поврзе O O
амино алкохолот холин, тогаш се C O C O
добива фосфатидил холин кој е
попознат под називот лецитин. CH 2 CH 2
Поради тоа што во молекулата на CH 2 CH 2

фосфатидил холинот можат да се
сретнат различни масни киселини CH2 CH 2
од кои едната секогаш е незаситена, CH 2
CH 2
поправилно е да се користи називот:
фосфатидил холини, односно CH 2 CH 2
лецитини. Фосфатидил холинот за
CH 2
прв пат е изолиран во 1847 година CH
од жолчка од јајце, според што и го CH CH 2

добил своето име лецитин (λέκιθος –
жолчка, грчки). Го има и во сојата. CH 2 CH 2
Денес има широка употреба во CH 2 CH 2

прехранбената индустрија како
емулгатор. На Слика број 3.4. се CH 2 CH 2
прикажани симболот и структурната CH2 CH 2
формула на една молекула
фосфатидил холин. CH 2 CH 2
CH2 CH 2
CH2 CH 2
CH3 CH 3
Слика 3.4. Симбол и структурна формула

на една молекула фосфатидил холин
60
За молекулите на фосфатидил холин е карактеристично присуството на поларна,
силно хидрофилна „глава“ и неполарна хидрофобна „опашка“. Поларноста на „главата“
е резултат на постоењето на позитивен полнеж на атомот на азотот и негативен полнеж
на фосфатната група. Јаглеводородните вериги на масните киселини ја претставуваат
двојната хидрофобна „опашка“. Соединенијата од овој тип кои содржат и поларна и
неполарна компонента се означуваат како амфипатични соединенија.
Поради нивната специфична структура, глицерофосфолипидите претставуваат
значајна структурна компонента на клеточните мембрани и на сите останати
интрацелуларни мембрански системи кај живите организми. Тие се среќаваат и во
крвната плазма, во состав на липопротеинските партикули.
2. Сфингофосфолипидите се карактеризираат со тоа што наместо глицерол

содржат двовалентен (со две хидроксилни групи) незаситен амино алкохол кој има 18
јаглеродни атоми – сфингозин (Слика 3.5.).
Слика 3.5. Структурна формула на сфингозин
Кога за сфингозинот амидно (преку амино групата) ќе се врзе виша масна

киселина се добива церамид. Кога на основната церамидна структура преку примарната
хидроксилна група на сфингозинот естерски ќе се врзе холин фосфат (фосфохолин) се
добива сфингомиелин. Сфингомиелините се застапени во нервното ткиво, и тоа во прв
ред во миелинските обвивки, според што и го добиле своето име. Во состав на
природните сфингомиелини претежно се среќаваат долговерижни масни киселини, со
24 јаглеродни атоми.
3.1.4. Гликолипиди
Гликолипидите претставуваат сложено градени соединенија кои во својата

молекула покрај липидна компонента вклучуваат и јаглехидратен дел.
Слично како фосфолипидите, зависно од основната алкохолна компонента,
гликолипидите се делат на:
1. Глицеролгликолипиди, кои се деривати на глицеролот и
2. Гликосфинголипиди, кои се деривати на сфингозинот.
1. Глицеролгликолипидите имаат релативно едноставна структура. Кај нив, за

првиот и вториот јаглероден атом на глицеролот естерски се поврзани виши масни
киселини, додека на третата позиција гликозидно е поврзан некој моно- или
олигосахарид. Се среќаваат кај бактериите, а ги има и кај некои цицачи.
2. Гликосфинголипидите се соединенија кај кои на основната церамидна
структура преку примарната хидроксилна група на сфингозинот гликозидно е поврзана
јаглехидратна компонента.
Гликосфинголипидите се поделени на три подгрупи:
- цереброзиди, кои како јаглехидратна компонента содржат галактоза
или глукоза,
- сулфатиди, кои како јаглехидратна компонента содржат галактоза за
која е врзана –SO3 група и
- ганглиозиди, кај кои јаглехидратната компонента е некој олигосахарид.
Гликосфинголипидите се значајна компонента на нервното ткиво. Ги има и во
состав на клеточните мембрански системи.
61
3.1.5. Стероиди
Стероидите претставуваат една голема група природни соединенија со различни

физиолошки функции. Тие можат да бидат од животинско потекло, од растително
потекло или пак да потекнуваат од габички. Според својата хемиска структура
стероидите спаѓаат во една поголема група органски соединенија што се означени како
изопреноиди, каде основното соединение е изопренот. Прекурсор за синтеза на
изопреноидите е ацетил КоА, кој во овој случај образува разгранети молекули. Според
систематската хемиска номенклатура основното соединение од кое се изведуваат сите
стероиди е јаглеводородот циклопентаноперхидрофенантрен (стеран).
Структурата на скелетот на стеранот и на сите стероиди е прикажана на Слика
3.6.
Слика 3.6. Структура на скелетот на стероидите
Во молекулите на природните стероиди за различни јаглеродни атоми од

стеранот се врзани различни странични радикали.
За човековиот организам најзначајни стероиди се:
1. Стеролите,
2. Жолчните киселини и
3. Стероидните хормони.
1. Стероли.- Стеролите претставуваат алкохолни деривати на стеранот кои на

позиција 17 имаат странична верига, на позициите 10 и 13 имаат метил групи, а на
третата позиција се наоѓа хидроксилната група.
Попознати стероли се:
- Холестерол, кој го има кај ‘рбетниците,
- Ергостерол, кој го има во квасните габички и кој е провитамин на
витаминот D2 (ергокалциферол),
- 7-Дехидрохолестерол, кој го има во кожата на цицачите и кој е
провитамин на витаминот D3 (холекалциферол).
Холестеролот е застапен во сите клетки каде, заедно со фосфолипидите,

учествува во изградбата на мембраните. Во крвната плазма холестеролот влегува во
состав на липопротеинските партикули. Покрај тоа, холестеролот претставува појдовна
супстанца (прекурсор) за синтезата на жолчните киселини и стероидните хормони
(половите хормони и хормоните на кората на надбубрежната жлезда). Структурната
формула на холестеролот е прикажана на Слика 3.7.
62
Слика 3.7. Структурна формула на холестерол
Поради присуството на хидроксилна група на третиот јаглероден атом

холестеролот може да се естерифицира при што се добиваат различни естри, зависно
од масната киселина со која е извршена естерификацијата.
Холестеролот е продукт на животинскиот метаболизам и затоа се среќава само
во хранливи продукти од животинско потекло. Покрај тоа, постои и негова ендогена
синтеза. Имено, речиси сите клетки кои содржат јадро можат да синтетизираат
холестерол, но неговата синтеза е најинтензивна во црниот дроб (околу 1,5 g дневно),
а помала е во надбубрежните жлезди и половите жлезди (околу 0,5 g дневно).
2. Жолчни киселини.- Во црниот дроб најголем дел од холестеролот (околу

80%) се користи како прекурсор во процесот на биосинтеза на жолчните киселини.
Жолчните киселини се најзначајната компонента на жолчката и имаат незаменлива
улога во процесот на дигестија на храната. Тие, вршејќи емулгирање на мастите
примени со храната, го овозможуваат делувањето на липолитичките ензими од
панкреасниот и цревниот сок. Откако ќе ја извршат својата функција, најголем дел од
жолчните киселини (околу 90%) се реапсорбираат и преку порталната циркулација
доаѓаат во црниот дроб, од каде повторно се излачуваат во жолчната кеса. Ова е
познато како ентерохепатална циркулација. Другиот дел од жолчните киселини се
исфрла преку фецесот во надворешната средина, претходно претрпувајќи
модификации како резултат на делувањето на цревните бактерии.
Примарни жолчни киселини кои се присутни во жолчката кај човекот се:
- Холна киселина и
- Хенодезоксихолна киселина.
Пред да се секретираат во жолчните каналикули, двете примарни жолчни
киселини се конјугираат со глицин или таурин. Оваа конјугација ја засилува поларноста
и растворливоста во вода. Кај здрави лица глицинските конјугати доминираат во однос
3:1 до 4:1 додека пак неконјугираните (слободни) жолчни киселини не се присутни во
жолчката.
За време на транспортот низ цревото, на примарните жолчни киселини им
дејствуваат ензимите од бактериската флора, при што се формираат секундарните
жолчни киселини:
- Дезоксихолна и
- Литохолна киселина.
Секундарните жолчни киселини се приклучуваат кон примарните, како
компоненти на жолчката.
Поради алкалната реакција на жолчката, жолчните киселини најчесто се во
форма на натриумови соли, така што вообичаено се користи терминот: соли на
жолчните киселини.
Еден дел од холестеролот директно, без претходна хемиска трансформација,
доаѓа во жолчната кеса каде може да формира жолчни камчиња.
63
3. Стероидни хормони.- Холестеролот претставува прекурсор за биосинтеза на
стероидните хормони:
- Прогестеронот од жолтото тело и плацентата, со 21 С-атом,
- Кортизолот од кората на надбубрежната жлезда, со 21 С-атом,
- Алдостеронот од кората на надбубрежната жлезда, со 21 С-атом,
- Тестостеронот од тестисите, со 19 С-атоми и
- Естрадиолот од овариумите, со 18 С-атоми.
Нивната функција детално е објаснета во рамките на предметот Физиологија.
3.1.6. Каротеноиди
Каротеноидите, исто како и стероидите спаѓаат во групата на изопреноиди.

Изградени се од 8 изопренски остатоци. Каротеноидите се обоени масни супстанции,
широко распространети во животинскиот и растителниот свет. Иако се присутни и кај
растенијата и кај животните, тие секогаш се од растително потекло. На присуството на
каротеноидите во растенијата се должи нивната боја: каротенот и ликопенот се црвени,
а ксантофилите имаат жолта боја. Поради присуството на долга јаглеводородна низа
каротеноидите се растворливи во масти, па поради тоа го носат називот липохроми.
За човекот и цицачите најголемо значење има β-каротенот, кој е најважен
провитамин A. Многу го има во морковите. Ликопенот е силен природен антиоксиданс,
кој го има во доматите, црвените пиперки и други растителни плодови.
3.2. Дигестија и апсорпција на липидите
Липидите се значајна состојка на храната. Стандардната мешана храна, во

најголем процент споредено со сите останати липиди, ги содржи триглицеридите. За да
може организмот да ги искористи истите, најпрвин мора да ги хидролизира. Оваа
хидролиза се одвива во тенкото црево под дејство на панкреасни и цревни ензими кои
се означени како липази. Липазите го пројавуваат своето хидролитичко дејство само врз
мастите што се претходно емулгирани од страна на солите на жолчните киселини. Се
смета дека солите на жолчните киселини не само што ги емулгираат мастите, туку и ги
активираат самите липази.
Панкреасната липаза врши хидролиза на естерските врски на триглицеридите на
првиот и третиот јаглероден атом, при што како продукти на оваа хидролиза се
создаваат:
- 2-моноглицериди и
- слободни масни киселини.
Најголем дел од триглицеридите (околу 50-60%) се апсорбираат во форма на 2-
моноглицериди и слободни масни киселини. Остатокот целосно се хидролизира до
глицерол и слободни масни киселини под дејство на цревната 2-моноглицерид липаза.
Вака хидролизираните триглицериди, заедно со фосфолипидите, холестеролот и
солите на жолчните киселини формираат комплексни структури и навлегуваат во
ентероцитите.
Во ентероцитите повеќето од продуктите на хидролизата повторно се
преведуваат во триглицериди, процес кој се означува како ресинтеза на триглицериди.
Како супстрат за ресинтеза на триглицеридите служат: 2-моноглицериди, масни
киселини и глицерол фосфат. При тоа треба да се истакне дека 2-моноглицеридите
потекнуваат од хидролизираните и апсорбираните масти од храната, додека глицерол
фосфатот потекнува од метаболизмот на јаглехидратите. Масните киселини пак, за да
можат да се вклучат во процесот на ресинтеза на триглицеридите, најпрвин треба да се
активираат со нивно трансформирање во ацил КоА.
Ресинтетизираните триглицериди влегуваат во состав на хиломикроните, чиј
метаболизам ќе биде објаснет подоцна.
64
Стандардната мешана храна содржи и извесно количество холестерол и тоа во
форма на слободен и естерифициран холестерол. Меѓутоа, во тенкото црево практично
е присутен само слободен холестерол, затоа што естерифицираниот холестерол се
хидролизира под дејство на холестерол естеразите од панкреасниот и тенкоцревниот
сок. Холестеролот од тенкото црево се апсорбира заедно со фосфолипидите и
продуктите на хидролиза на триглицеридите, како што е објаснето погоре.
3.3. Основи на метаболизмот на липидите
Липидите претставуваат значајна енергетска резерва во организмот, што се

однесува во прв ред за триглицеридите. Така, во услови на зголемени енергетски
потреби или пак при гладување, доаѓа до мобилизација на триглицеридите складирани
во адипоцитите, процес означен како интрацелуларна хидролиза на масти. Липазата
што е одговорна за оваа хидролиза е под директна хормонска регулација и затоа овој
ензим се нарекува и хормон сензитивна липаза. Адреналинот и глукагонот ја активираат
оваа липаза и на тој начин делуваат липолитички.
Продуктите на интрацелуларната хидролиза на мастите ги напуштаат
адипоцитите и преминуваат во крвната плазма. Тука слободните масни киселини се
врзуваат за албумините и на тој начин се транспортираат до ткивата каде ќе бидат
искористени. Глицеролот се вклучува во метаболизмот на јаглехидратите.
Разградувањето на масните киселини се врши преку еден метаболен пат што е
познат како β-оксидација. Овој процес се одвива во матриксот на митохондриите.
Познато е дека масните киселини се хемиски релативно инертни соединенија. За да
можат да се вклучат во процесот на β-оксидација тие претходно треба да се активираат,
односно да се преведат во ацил КоА. Оваа реакција се одвива во цитоплазмата. За
активираните масни киселини со 14 или повеќе јаглеродни атоми е карактеристично тоа
што тие не можат директно да ја поминат митохондријалната мембрана, туку се
пренесуваат со помош на специфичен транспортен систем каде како носач се користи
карнитинот. Во митохондриите активираните масни киселини се вклучуваат во процесот
на β-оксидација.
β-оксидацијата на масните киселини претставува метаболен пат кој се одвива во
циклуси, а секој циклус се состои од 4 реакции. На крајот од секој циклус се откинува
еден молекул ацетил КоА и се добива еден молекул ацил КоА кој е пократок за 2
јаглеродни атоми почетниот за тој циклус. Циклусите се повторуваат сè додека масната
киселина целосно не се разгради до n молекули ацетил КоА. Овој метаболен пат
детално го обработуваме во рамките на предметот Клеточна биохемија.
Природните триглицериди вообичаено содржат масни киселини со парен број
јаглеродни атоми. Сепак, иако во многу мала мерка, можат да се сретнат и масни
киселини со непарен број јаглеродни атоми. Нивната β-оксидација се одвива на ист
начин како и на оние со парен број јаглеродни атоми, со тоа што во последниот циклус
наместо два мола ацетил КоА се добиваат еден мол ацетил КоА и еден мол пропионил
КоА (со три јаглеродни атоми). Пропионил КоА, преку низа реакции се преведува во
сукцинил КоА и како таков се вклучува во циклусот на лимонската киселина.
Оксидацијата на незаситените масни киселини се одвива на ист начин како и на
заситените, сè до местото на двојната врска. Тука доаѓа до ензимска трансформација
на двојната врска од cis- во trans- положба, после што процесот повторно се одвива
идентично како и кај заситените масни киселини.
Видовме дека главен продукт на β-оксидацијата на масните киселини е ацетил
КоА кој понатаму може да се вклучи во циклусот на лимонската киселина. Меѓутоа, во
услови на интензивна липолиза доаѓа до создавање на големи количества ацетил КоА
кои го надминуваат капацитетот на циклусот на лимонска киселина во црниот дроб.
Поради тоа, во такви случаи во црниот дроб се активира еден друг метаболен пат
означен како кетогенеза, кој беше обработен во поглавјето за јаглехидрати.
65
На крај, да се потсетиме и за метаболниот пат за биосинтеза на масни киселини
преку кој вишокот јаглехидрати кои не се искористуваат или пак не се депонираат во
форма на гликоген, се преведуваат во масни киселини. Овие масни киселини понатаму
се користат за биосинтеза на триглицериди кои се депонираат во масното ткиво.
Појдовна супстанца за биосинтезата на масните киселини е ацетил КоА кој
настанува при гликолизата и оксидативната декарбоксилација на пируватот.
Во биосинтезата на масните киселини учествуваат три различни ензимски
системи:
1. Систем за биосинтеза на палмитинска киселина,
2. Систем за елонгација на масните киселини и
3. Систем за десатурација на масните киселини.
Биосинтезата на палмитинската киселина се одвива во цитоплазмата со учество
на еден високо организиран мултиензимски комплекс кој е означен како синтетаза на
масни киселини. Процесот на биосинтеза на палмитинска киселина се одвива во 7
циклуси. На крајот од секој циклус се добива масна киселина со два јаглеродни атоми
повеќе од појдовната.
Системот за елонгација на масните киселини дејствува во митохондриите и
ендоплазматичниот ретикулум, а негова задача е да врши продолжување (елонгација)
на веригите на масните киселини.
Системот за десатурација на масните киселини е сместен на ниво на
ендоплазматичниот ретикулум. Тој се состои од ензими кои вршат преведување на
заситените масни киселини во незаситени.
3.4. Липопротеини во крвната плазма
Во крвната плазма се среќаваат следните видови липиди:

1. Холестерол, кој го има како естерифициран и како неестерифициран
(слободен) холестерол,
2. Триглицериди,
3. Фосфолипиди и
4. Слободни масни киселини.
Транспортирањето на липидите кои се нерастворливи во вода, во крвната
плазма која претставува една водена средина, е овозможено со постоењето на
комплексно градени партикули (честички), означени како липопротеински партикули или
плазматични липопротеини.
Структурата на плазматичните липопротеини е мошне сложена. Тие се
изградени од протеини и липиди со специфичен распоред. Имено, неполарните липиди
(триглицеридите и естрите на холестеролот) се наоѓаат во внатрешноста на
партикулата, а поларните липиди (слободниот холестерол и фосфолипидите), заедно
со протеините, се наоѓаат на површината (Слика 3.8.). Поврзувањето на липидите од
централниот дел на партикулата со фосфолипидите и протеините се остварува со
помош на водородни врски и Ван дер Валсови сили. Слабата врска помеѓу липидите и
протеините во рамките на липопротеинот овозможува измена на липиди и протеини
помеѓу различни липопротеински партикули во крвната плазма, како и измена на липиди
помеѓу клеточните мембрани и липопротеините. Од друга страна таа врска е доволно
силна за да ја овозможи сепарацијата на поодделните липопротеинските фракции со
употреба на различни аналитички техники.
Што се однесува пак до слободните масни киселини, тие се транспортираат
врзани за албумините од крвната плазма.
66
21 22 24 27
12 18 20 23 25
11 17 26
13
1 19 9 C D 16
14
2 8 15
A B
3
7
5
4 6
Слика 3.8. Структура на липопротеинска партикула
3.4.1. Поделба и номенклатура на липопротеините од крвната плазма
Поделбата на липопротеините од крвната плазма може да се направи врз основа

на 2 критериуми, и тоа:
1. Густина и
2. Електрофоретскa подвижност.
1. Со ултрацентрифугирање, липопротеините од крвната плазма можат да се

поделат врз основа на нивната густина, и тоа на следните фракции:
a. Хиломикрони, чија густина изнесува помалку од 0,95 g/mL,
b. VLDL (Very Low Density Lipoproteins), т.е. липопротеини со многу
мала густина, чија густина изнесува 0,95 – 1,006 g/mL,
c. IDL (Intermediate Density Lipoproteins), т.е. липопротеини со средна
густина, од 1,006 – 1,019 g/mL,
d. LDL (Low Density Lipoproteins), т.е. липопротеини со мала густина,
од 1,019 – 1,063 g/mL и
e. HDL (High Density Lipoproteins), т.е. липопротеини со голема
густина, од 1,063 – 1,210 g/mL.
2. Освен тоа, бидејќи содржат протеини, липопротеините од крвната плазма

подлежат на електрофоретско раздвојување. При тоа, врз основа на локализацијата
во однос на глобулините, липопротеините од крвната плазма се делат на:
a. -Липопротеини, а тоа се всушност HDL партикулите,
b. Пре--липопротеини [VLDL],
c. -Липопротеини [LDL],
d. Широка лента помеѓу - и пре--липопротеините [IDL] и
e. Хиломикрони кои, доколку се присутни во примерокот за анализа,
остануваат на стартот.
Во Табела 3.1. е прикажана просечната процентуална застапеност на составните

компоненти во рамките различните липопротеински фракции.
67
Табела 3.1. Просечна процентуална застапеност на составните компоненти во
рамките различните липопротеински фракции
Триглицериди Холестерол Фосфолипиди Протеини

(%) (%) (%) (%)
Хиломикрони 90 5 4 1
VLDL 65 13 13 10
LDL 10 45 23 20
HDL 2 18 30 50
Во Табела 3.2. е прикажана просечната големина на различните видови

липопротеински партикули.
Табела 3.2. Просечна големина на липопротеинските партикули
Хиломикрони VLDL IDL LDL HDL

Дијаметар
> 70 26 - 70 22-24 19 - 23 4 - 10
(nm)
Протеините кои влегуваат во состав на липопротеинските партикули се

означуваат како аполипопротеини (или апопротеини, или, скратено, апо). Тие имаат
тројна функција, и тоа:
1. Обезбедуваат транспорт на липидите во водената средина;
2. Некои од нив се јавуваат како модулатори на активноста на ензимите кои
учествуваат во метаболизмот на липопротеините;
3. Некои од нив се врзуваат за специфичните мембрански рецептори, со што се
овозможува навлегувањето на липопротеините во клетките, а со тоа и нивниот
понатамошен катаболизам.
Покрај досега наведените, во крвната плазма е опишан уште еден липопротеин

што е означен како липопротеин (а) [Lp(a)]. Lp(a) наликува на LDL поради тоа што и
двата вида липопротеински партикули содржат по една молекула апо B-100, а имаат и
сличен состав на липидните компоненти. Разликата помеѓу овие два липопротеини се
состои во тоа што Lp(a) дополнително го содржи гликопротеинот апо (а), кој е
ковалентно поврзан со апо B-100. Апо (а) има висок степен на хомологија со
плазминогенот и интерферира со фибринолизата. Исто така, Lp(a) може да навлезе во
субендотелот каде е поподложен на оксидација во споредба со LDL. Поради тоа,
зголемената концентрација на Lp(a) во крвната плазма претставува значаен
дополнителен фактор на ризик за појава и прогресија на атеросклерозата. Меѓутоа,
методите за негово определување не се добро стандардизирани, што ја оневозможува
широката клиничка употреба на овој параметар.
68
3.4.2. Метаболизам на липопротеините од крвната плазма
3.4.2.1. Метаболизам на хиломикроните
а) Биосинтеза на хиломикроните
Процесот на создавање на хиломикроните започнува со биосинтеза на апо B-48
и на аполипопротеините од класата А во рапавиот ендоплазматичен ретикулум на
ентероцитите. Потоа, во мазниот ендоплазматичен ретикулум аполипопротеините се
поврзуваат со апсорбираните (егзогените) липиди. Вака оформените хиломикрони се
ослободуваат од ентероцитите по пат на егзоцитоза, доаѓаат во лимфниот систем кој ги
дренира цревата, а потоа и во крвта. Иако хиломикроните изолирани од крвта содржат
апо C и апо E, новосоздадените или т.н. насцентни хиломикрони не ги содржат овие
аполипопротеини. Се смета дека апо C и апо E се пренесуваат на хиломикроните од
HDL по нивното навлегување во циркулацијата.
б) Катаболизам на хиломикроните
Најзначајна улога во катаболизмот на хиломикроните има ензимот
липопротеинска липаза. Таа се наоѓа врзана за ѕидовите на крвните капилари. Во
нормални услови, крвта не содржи значителни количини од овој ензим. Но, по инјекција
од хепарин, липопротеинската липаза се ослободува од ѕидовите на крвните капилари
и доаѓа во циркулацијата, што доведува до намалување на липемијата in vivo. За
активноста на липопротеинската липаза е потребно присуството на апо C II, кој има
улога на нејзин активатор. Процесот на хидролиза се одвива додека хиломикроните се
врзани за ензимот на ендотелот. Триглицеридите се хидролизираат постепено, преку
диглицериди и моноглицериди до глицерол и слободни масни киселини.
По реакцијата со липопротеинската липаза, при што се хидролизираат и до 90%
од триглицеридите кои биле во состав на хиломикроните, апо C и апо A се пренесуваат
на HDL, а ново добиените липопротеини кои содржат апо E и апо B-48, се нарекуваат
хиломикрон ремнанти. Апо E од хиломикрон ремнантите го овозможуваат преземањето
на овие липопротеински партикули од страна на црниот дроб преку специфичните
клеточни рецептори кои ги поседуваат хепатоцитите. Во црниот дроб хиломикрон
ремнантите конечно се хидролизираат и метаболизираат.
Отстранувањето на хиломикроните од циркулацијата е мошне брзо, па токму
затоа нивното присуство во серумските примероци дури и 12 h по последниот оброк
(односно по вечерата), кога вообичаено се определува липидниот статус, претставува
патолошка појава.
69
3.4.2.2. Метаболизам на VLDL
а) Биосинтеза на VLDL
Метаболизмот на VLDL има многу сличности со тој на хиломикроните, со таа
разлика што VLDL претставуваат средство за транспорт на т.н. ендогени (синтетизирани
во црниот дроб) липиди, од црниот дроб до останатите ткива.
Масните киселини кои се користат за синтеза на триглицеридите во црниот дроб
потекнуваат од 2 можни извори:
1. Синтеза во црниот дроб од ацетил КоА, кој потекнува главно од
метаболизмот на јаглехидратите или
2. Преземање на слободните масни киселини од циркулацијата.
Првиот извор доминира во услови на добра снабденост на организмот со
јаглехидрати, додека пак вториот извор доминира при гладување, при нерегулиран
Diabetes mellitus или при исхрана со многу масти, состојби кога концентрацијата на
слободните масни киселини во плазмата е зголемена.
Создавањето на VLDL партикулите започнува со синтеза на апо B-100 во
рибозомите од рапавиот ендоплазматичен ретикулум на хепатоцитите. Потоа, во
мазниот ендоплазматичен ретикулум апо B-100 се врзуваат со липидите. На крај, VLDL
партикулите се ослободуваат од хепатоцитите по пат на егзоцитоза. Тие најпрво
доаѓаат во синусоидите на црниот дроб, а потоа и во циркулацијата. Штотуку
формираните VLDL партикули не поседуваат апо C и апо E, туку ги примаат од HDL
после навлегувањето во циркулацијата.
б) Катаболизам на VLDL
Централната улога во катаболизмот на VLDL партикулите ја има ензимот
липопротеинска липаза, а процесот се одвива на ист начин како кај хиломикроните. По
делувањето на липопротеинската липаза врз VLDL, аполипопротеините од класата C се
враќаат на HDL и во циркулацијата се појавуваат IDL партикулите. Тие всушност се
аналогни на хиломикрон ремнантите, а од аполипопротеините ги содржат апо E и апо
B-100. Во понатамошниот метаболен пат, IDL партикулите се трансформираат во LDL,
процес кој се одвива со посредство на ензимот хепатална липопротеинска липаза и на
апо E.
3.4.2.3. Метаболизам на LDL
На површината на клеточните мембрани клетките поседуваат специфични LDL

рецептори што имаат клучна улога во метаболизмот на липопротеините со ниска
густина. Имено, со поврзување на апо B-100 од LDL за LDL рецепторот е овозможено
навлегувањето на LDL партикулите во клетките. Тука, тие се хидролизираат со помош
на ензимите од лизозомите. При тоа аполипопротеините се разградуваат до
аминокиселини, триглицеридите се разградуваат до глицерол и слободни масни
киселини, а естрите на холестеролот до слободен холестерол и слободни масни
киселини.
Холестеролот кој навлегува во клетките преку специфичните рецептори,
активира два регулаторни механизми:
1. Дејствува инхибиторно врз синтезата на нови LDL рецептори и
2. Ја инхибира активноста на ензимот HMG - CoA редуктаза (3-хидрокси-3-
метилглутарил коензим А редуктаза), со што се оневозможува ендогената
синтеза на холестеролот.
Овие регулаторни механизми всушност ги заштитуваат клетките од натрупување
на енормно големо количество на липиди, што во крајна линија би станале токсични за
самите клетки.
Слободниот холестерол во клетките може да се искористи:
1. Во процесите на синтеза на мембрански системи на клетката и
70
2. За синтеза на стероидни хормони или други соединенија за кои е потребен
стероиден скелет.
Еден дел од слободниот холестерол, и тоа оној кој претставува вишок за
клетката, може да се естерифицира со помош на ензимот ацил-коензим А: холестерол
ацилтрансфераза (ACAT) и да се складира во клетката како резерва. По потреба, овој
резервен холестерол може повторно да се искористи, откако претходно ќе се
хидролизира до слободен холестерол и слободни масни киселини.
3.4.2.4. Метаболизам на HDL
Една од најзначајните особини на HDL партикулите е нивната способност да го

преземаат вишокот клеточен холестерол од периферните ткива и да го транспортираат
до црниот дроб. Освен тоа, HDL партикулите имаат и антиоксидантни,
антиинфламаторни и антикоагулантни својства, кои дополнително придонесуваат за
антиатерогениот потенцијал на HDL фракцијата.
HDL партикулите се синтетизираат во црниот дроб и во тенкото црево.
Насцентниот HDL, било да потекнува од црниот дроб или од тенкото црево, има
дискоиден облик и се состои од фосфолипиден двослој во кој се среќаваат
аполипопротеини и слободен холестерол. Слободниот холестерол активно се
испумпува од клетките со помош на транспортерот ABCA1 (ATP Binding Cassette
Subfamily A Member 1), како на ниво на хепатоцитите и ентероцитите при биогенезата
на HDL, така и на ниво на периферните ткива.
Значајна улога во понатамошниот метаболизам на HDL партикулите има
ензимот лецитин-холестерол ацилтрансфераза (LCAT) од крвната плазма. Негов
активатор е апо A I од HDL. Овој ензим се врзува за дискоидната HDL партикула и ја
катализира реакцијата на естерификација на холестеролот. Потоа, неполарните естри
на холестеролот се поместуваат кон внатрешноста на HDL партикулата, со што се
добива сферична HDL партикула. Црниот дроб селективно ги презема естрите на
холестеролот од сферичните HDL партикули, кои потоа повторно се враќаат во
циркулацијата за преземање нови количества холестерол од периферните клетки.
Метаболизмот на липопротеините од крвната плазма шематски е прикажан на
Слика 3.9.
71
HDL
IDL
VLDL VLDL
100
LDL
L
LCAT
Слика 3.9. Шематски приказ на метаболизмот на липопротеините од крвната

плазма
72
3.4.3. Нарушувања на метаболизмот на липопротеините од крвната плазма
Нарушувањата на метаболизмот на липопротеините од крвната плазма се

означуваат како дислипидемии. Тие најчесто се резултат на комбинирано влијание на
разновидни фактори како што се: начинот на исхрана, степенот на физичка активност,
прекумерната тежина и дебелината, како и присуството на полиморфизми на ниво на
некои од гените што кодираат ензими, структурни протеини и/или рецептори вклучени
во метаболизмот на липопротеините. Исто така постојат и секундарни дислипидемии,
што се јавуваат како последица од некое друго заболување или состојба, како на
пример: шеќерна болест, хипотиреоза, нарушена бубрежна функција, холестаза,
бременост и многу други.
Една од најпознатите класификации на дислипидемиите е воспоставена од
страна на познатиот научник, таткото на клиничката липидологија, Donald Sharp
Fredrickson (1924-2002). Fredrickson идентификувал 5 (односно 6) фенотипови на
дислипидемија, зависно од серумските концентрации на вкупниот холестерол и
триглицеридите и изгледот на серумот после 12-часовно стоење во фрижидер. Оваа
класификација не ги зема предвид вредностите на HDL-холестеролот. Поради својата
едноставност и практичност, Светската здравствена организација, во 1972 година, ја
прифатила оваа класификација како меѓународен стандард. Во Табела 3.3. се
прикажани карактеристиките на различните фенотипови на дислипидемија според
Fredrickson.
Табела 3.3. Класификација на дислипидемиите според Fredrickson
Фенотип Покачени Вредности Вредности на Изглед на Атерогеност

липопротеини на вкупниот триглицеридите серумот
холестерол после
стоење
(12 часа во
фрижидер)
Кремаст
Нормални
I Хиломикрони ↑↑↑↑ површински Нема
до ↑
слој
IIa LDL ↑↑ Нормални Бистар +++
Бистар или
IIb LDL и VLDL ↑↑ ↑↑ +++
турбиден
Турбиден
III IDL ↑↑ ↑↑↑ +++
до млечен
Нормални Турбиден
IV VLDL ↑↑ +
до ↑ до млечен
Млечен, со
VLDL и Нормални кремаст
V ↑↑↑↑ +
хиломикрони до ↑ површински
слој
Како резултат на брзиот напредок на молекуларната медицина, во последниве

години класификацијата според Fredrickson се заменува со класификација што е
заснована на генетската етиологија и патофизиологијата. Во продолжение, ќе наведеме
неколку вида дислипидемии што се генетски условени и што се добро проучени и
објаснети.
1. Дефицитна активност на липопротеинската липаза. –Се јавува како
резултат на мутации на генот што ја кодира липопротеинската липаза. Тоа е
ретко автозомно рецесивно заболување што се карактеризира со изразена
хиперхиломикронемија. Во литературата се наведуваат концентрации на
серумски триглицериди што достигнуваат до фантастични 113 mmol/L.
Заболувањето најчесто се дијагностицира во детството, а негови
73
најзначајни клинички манифестации се повторувачки епизоди на
абдоминална болка и напади на панкреатит. Лицата со ова заболување
немаат зголемен атероген ризик.
2. Дефицит или дефект на апо C II. –Со оглед на тоа што апо C II е
најзначајниот активатор на липопротеинската липаза, оваа генетски
условена дислипидемија исто така се карактеризира со
хиперхиломикронемија, што во овој случај е помалку изразена во однос на
хиперхиломикронемијата што се среќава кај лицата со дефицитна активност
на липопротеинската липаза.
3. Дисбеталипопротеинемија (Тип III хиперлипопротеинемија). –Овој тип
дислипидемија се јавува поради дефект во отстранувањето на хиломикрон
ремнантите и IDL. Како што беше објаснето претходно, апо Е што се наоѓа
на површината на ремнантите стапува во интеракција со специфичните
рецептори од хепатоцитите, со што е овозможено отстранување на
ремнантите од циркулацијата. За апо Е се опишани три варијанти, означени
како Е2, Е3 и Е4. Апо Е2 се карактеризира со тоа што неговото поврзување
со рецепторите од хепатоцитите е неефикасно, што резултира со
акумулација на ремнанти во циркулацијата. Важно да се нагласи дека
хомозиготноста за апо Е2 е почеста во однос на инциденцата на
дисбеталипопротеинемијата, што значи дека експресијата на ова
заболување е модулирана од страна на други внатрешни и надворешни
фактори.
4. Фамилијарна хиперхолестеролемија. –Овој тип дислипидемија се јавува
како резултат на дефекти во експресијата и/или функцијата на LDL
рецепторот. Кај хетерозиготните индивидуи серумските концентрации на
LDL-холестеролот се два до три пати повисоки во однос на референтните
вредности, додека кај хомозиготите се мерат четири до шест пати повисоки
вредности во однос на референтните. Атерогениот ризик кај овие
индивидуи е изразито висок.
5. Фамилијарен дефект на апо В-100. –Се јавува како резултат на мутации
на генот за апо В-100, што го намалува афинитетот на овој аполипопротеин
кон LDL рецепторот. LDL-холестеролот е покачен, што условува зголемен
атероген ризик.
6. Хипоалфалипопротеинемија (Низок HDL-холестерол). –Неколку генетски
дефекти доведуваат до појава на низок HDL-холестерол и зголемен
атероген ризик:
a) Мутации или делеции на ниво на генот што го кодира апо А I,
b) Дефицит на LCAT и
c) Мутации на генот што го кодира транспортерот ABCA1 (ја
условуваат појавата на Тангиеровата болест).
Освен овие, опишани се уште неколку видови дислипидемии што се исто така
генетски условени, но за кои точните генетски дефекти не се доволно добро проучени:
a) Фамилијарна комбинирана хиперлипидемија,
b) Хиперапобеталипопротеинемија,
c) Фамилијарна хипертриглицеридемија и
d) Тип V хиперлипопротеинемија.
3.4.4. Улога на липопротеините од крвната плазма во процесот на атерогенезата
Атеросклерозата е едно од најчестите заболувања во современиот свет.

Станува збор за мултифакторијално заболување при чие настанување значајна улога
имаат како генетските фактори, така и стилот на живеењето.
Атеросклерозата е најкарактеристична за коронарните артерии, но може да се
сретне и на ниво на каротидите и на феморалните артерии, како и воопшто кај речиси
74
сите артериски крвни садови чиј надворешен дијаметар е поголем од 3 mm. Сепак, со
највисок степен на ризик се токму коронарните артерии.
Атеросклерозата е заболување кое е резултат на акумулирањето на липиди во
ѕидот на артерискиот крвен сад. При тоа, во самиот почеток на нивното формирање,
атероматозните промени се забележуваат во субендотелниот простор во облик на
мошне тенки масни ленти. За масните ленти е карактеристично присуството на
многубројни т.н. пенести клетки, кои се преполни со липиди и кои потекнуваат од
циркулирачките моноцити. Понатаму, масните ленти еволуираат во фиброзни плаки кај
кои централниот дел, кој е богат со липиди, е прекриен со сврзно ткиво и кои помалку
или повеќе навлегуваат во луменот на крвниот сад. Во крајната фаза се среќаваат
нестабилни атероматозни плаки кои се подложни на руптура. Заради мошне бавната
прогресија, за атеросклерозата е карактеристична една долга пресимптоматска фаза.
Токму затоа неопходна е редовна анализа на липидниот статус, со цел да се
идентификуваат индивидуите со висок атероген ризик и да се следат ефектите од
спроведената терапија.
Првите сознанија за учеството на липидите во процесот на атерогенезата
потекнуваат од почетокот на минатиот век кога е утврдено дека атероматозните плаки,
покрај другите компоненти, содржат и значителен процент на холестерол. Теоретски,
овој холестерол би можел да биде создаден и локално, бидејќи сите клетки што се
среќаваат тука, со исклучок на еритроцитите, имаат способност да го синтетизираат
истиот. Но во текот на годините што следувале направени се бројни истражувања кои
овозможиле да се идентификуваат дел од липопротеинските фракции од крвната
плазма како одговорни за настанувањето и прогресијата на атероматозните плаки.
Со експериментални истражувања е докажано дека високите серумски
концентрации на вкупниот и на LDL-холестеролот во крвната плазма претставуваат
директна причина за појавата и напредувањето на атероматозните промени кај оние
експериментални животни кај кои хиперхолестеролемијата е предизвикана преку
исхраната богата со холестерол и заситени масни киселини.
Силен доказ за атерогеноста на LDL дале Brown и Goldstein (1986) кои го
проучувале механизмот на навлегување на LDL партикулите во клетките со посредство
на LDL рецепторот. При тоа, тие утврдиле дека генетски условените дефекти на ниво
на LDL рецепторот претставуваат директна причина за забавеното, или пак во крајна
линија за оневозможеното отстранување на LDL партикулите од циркулацијата. Ваквата
состојба резултира со изразита хиперхолестеролемија и прерана атеросклероза.
Епидемиолошките истражувања со кои биле опфатени различни популации исто
така ги посочиле како атерогени високите концентрации на вкупниот и на LDL-
холестеролот. Постојат податоци дека само кај оние популации кои одржуваат мошне
ниски концентрации на вкупниот (под 3,9 mmol/L) и на LDL-холестеролот (под 2,6
mmol/L) атеросклерозата скоро и да не е присутна, како и тоа дека секоја концентрација
на LDL-холестеролот над 2,6 mmol/L е всушност атерогена.
Особено атерогени се малите и густи LDL партикули кои се среќаваат во
циркулацијата кај пациенти со висока серумска концентрација на триглицериди и кои,
заедно со ниската концентрација на HDL-холестеролот претставуваат дел од т.н.
атерогена липидна тријада. За малите и густи LDL партикули е карактеристично тоа
што се многу поподложни на оксидативна модификација во субендотелниот простор во
однос на LDL партикулите со нормална големина и густина.
Докажана е и атерогеноста на липопротеинските ремнанти кои се сè уште
богати со триглицериди, но кои од аспект на атерогениот потенцијал се слични со LDL.
Од друга страна, податоците од епидемиолошките истражувања покажуваат
дека ниските серумски концентрации на HDL-холестеролот се мошне тесно
поврзани со зголемениот ризик за појава на атеросклероза, додека високиот HDL-
холестерол (над 1,55 mmol/L) е асоциран со намален атероген ризик.
Сумарно, атерогени липопротеини се LDL и ремнантите, а заштитно,
антиатерогено дејство има HDL.
75
Хиломикроните, поради своите димензии, не можат да навлезат во
субендотелниот простор, односно тие не се директно атерогени.
Интензитетот на инфлукс на атерогените липопротеини во интимата на
артерискиот крвен сад е право пропорционален со нивната концентрацијата во
циркулацијата. Многу важна особина на овој инфлукс е неговата двонасочност. Тоа
значи дека липопротеините кои еднаш навлегле во субендотелниот простор се
изменливи со липопротеините од крвната плазма, со што се објаснува делумната
регресија на атероматозните плаки поради намалувањето на концентрацијата на
циркулирачките атерогени липопротеини.
Во субендотелниот простор настанува оксидативна модификација на
липопротеинските партикули. Најдобро е прочуена оксидацијата на LDL. На самиот
почеток се формираат т.н. минимално оксидирани LDL партикули (moxLDL), за кои е
карактеристична сигнификантна оксидација на липидните компоненти и само
незначителна модификација на апо B-100. Тоа значи дека овие липопротеински
партикули сè уште можат да се метаболизираат со посредство на LDL рецепторите.
Доколку процесот на оксидација продолжи и понатаму, доаѓа до значителна оксидација
и на апо B-100. Тоа доведува до значајни промени во структурата и својствата на овие
аполипопротеини, односно истите повеќе не можат да бидат препознаени од страна на
специфичните клеточни рецептори и добиваат особини на антиген. Тоа претставува
стимул за позитивна хемотакса на циркулирачките моноцити и нивна диференцијација
во макрофаги кои, со помош на “scavenger” рецепторите (рецептори - чистачи) ги
интернализираат модифицираните LDL партикули, при што самите се трансформираат
во пенести клетки. Акумулацијата на мошне големи количини оксидирани LDL партикули
доведува до иреверзибилно оштетување на макрофагите и клеточна смрт. Во исто
време во циркулацијата се појавуваат автоантитела против оксидираните LDL
партикули (anti-oxLDL) чие присуство говори за автоимуниот карактер на
атеросклерозата (Слика 3.10.).
Молекуларните механизми на атерогенезата детално се изучуваат во рамките
на предметот Клеточна биохемија.
L
moxLDL
LDL
moxLDL
oxLDL
Слика 3.10. Шематски приказ на атерогенезата
76
3.5. Клиничко-биохемиски параметри за дијагностика на дислипидемиите
Од претходните поглавја станува јасно дека липидниот метаболизам воопшто,

како и метаболизмот на циркулирачките липопротеини се прилично комплексни. Од
тука, голем број молекули потенцијално би можеле да бидат искористени како
биомаркери за липидниот статус. Но, за рутинска клиничко-биохемиска анализа
вообичаено се одбираат параметри што можат да се определат релативно брзо и
едноставно, со методи што се широко достапни и не се многу скапи, а кои ќе ни дадат
клинички значајна информација за здравствената состојба на пациентот. Така, за
проценка на липидниот статус се утврдени четири основни клиничко-биохемиски
параметри, и тоа:
1. Определување на концентрацијата на вкупниот холестерол,
2. Определување на концентрацијата на триглицеридите,
3. Определување на концентрацијата на холестерол во HDL фракцијата и
4. Определување на концентрацијата на холестерол во LDL фракцијата.
Овие се едни од најчестите анализи што се изработуваат во клиничко-
биохемиските лаборатории и во прв ред се користат за проценка на степенот на ризик
за појава и напредување на атеросклерозата, како и за следење на терапијата кај
пациенти со дислипидемија.
Определувањето на серумските концентрации само на вкупниот холестерол
и триглицеридите, без притоа да се определат концентрациите на холестеролот
во HDL и LDL фракцијата, не дава комплетна слика за липидниот статус и за
степенот на атерогениот ризик кај пациентот.
Референтните вредности за четирите основни параметри кои го детерминираат
липидниот статус се:
1. 4,1-5,2 mmol/L за вкупниот холестерол,
2. <2,6 mmol/L за LDL-холестеролот,
3. 0,3-1,7 mmol/L за триглицеридите и
4. 1,00-2,00 mmol/L за HDL-холестеролот.
Овие референтни вредности не се воспоставени на вообичаениот начин, со
определување на концентрациите кај навидум здрави лица, туку врз основа на
епидемиолошките истражувања кои покажале дека овие концентрации се целни
(посакувани), за намалување на атерогениот ризик.
Крв за анализа на комплетен липиден статус задолжително се зема наутро, на
гладно, 12-14 часа по вечерата.
Се препорачува определување на комплетен липиден статус кај сите лица на
возраст над 20 години, најмалку еднаш на секои 5 години.
Во лабораториите на специјализирани здравствени институции, дијагностиката

на дислипидемиите вообичаено се проширува со:
1. Определување на концентрацијата на аполипопротеинот А I и
2. Определување на концентрацијата на аполипопротеинот B-100.
77
3.5.1. Определување на концентрацијата на вкупен холестерол
Стандардна метода за определување на концентрацијата на вкупен холестерол

во серум или плазма е методата со холестерол естераза, холестерол оксидаза и
пероксидаза. Определувањето стандардно се врши во серумски примероци. Оваа
метода е аплицирана на автоматските биохемиски анализатори од бројни
производители, но може да се користи и за мануелно определување.
Реагенс - китови за определување на вкупен холестерол се достапни на пазарот
од различни производители. За запознавање со принципот на методата и техниката на
изработка на анализата, во оваа прилика ќе го искористиме протоколот од
производителот Human, Германија, со ознака SU-CHOL INF 1001701 GB 07-2007-19. Во
продолжение, овој протокол не е буквално преведен, туку се дадени само клучните
информации неопходни за изучување на методата. Оригиналниот протокол е прикачен
на платформата за е-учење и детално го разработуваме во текот на теоретската и
практичната настава по овој предмет.
Холестеролот се определува после ензимска хидролиза и оксидација. Во оваа постапка
холестерол естрите од примерокот се хидролизираат со ензимот холестерол естераза
(СНЕ). Слободниот холестерол што се создава со оваа реакција заедно со слободниот
холестерол од серумскиот примерок, се оксидираат со ензимот холестерол оксидаза
(СНО) до холестен-3-он, при што се ослободува и водород пероксид (Н2О2). Н2О2
понатаму реагира со 4-аминофеназон (р-диметил аминоантипирин) и фенол во
присуство на ензимот пероксидаза (РОD) и се добива кинонимин со црвена боја.
Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата на
холестеролот и се мери спектрофотометриски на 500 nm.
RGT:
Фосфатен пуфер (рН 6,5) 100 mmol/L
Фенол 5 mmol/L
Пероксидаза >5 kU/L
Холестеролестераза >150 U/L
Холестеролоксидаза >100 U/L
Натриум азид 0,05 %
STD:
Холестерол 200 mg/dL односно 5,17 mmol/L

Реагенсот и стандардот ги добиваме во готова форма како комплет од реагенси - кит.
Реагенсите се стабилни сè до истекот на рокот на траење, дури и после отворањето,
кога се чуваат на 2...8°C. Отворениот реагенс е стабилен до две недели на 15...25°С.
При работа со нив мораме да ја одбегнеме контаминацијата.
Примерок:
Серум, хепаринизирана или EDTA-плазма.
Забелешка: Липемичните примероци условуваат турбидност на реакционата смеса што

може да даде лажно покачен резултат. Со употребата на овој реагенс се избегнуваат
такви лажно покачени резултати со помош на липид отстранувачкиот фактор (LCF – lipid
clearing factor) што го содржи истиот.
78
Постапка:

Реакционата смеса се промешува и се инкубира 10 минути на температура од 20-25°C,

или 5 минути на температура од 37°C. Се мери апсорбанцијата на примерокот
(ΔAпримерок) и на стандардот (ΔAстандард) наспроти слепата проба за време од најмногу 60
минути.
Пресметување на концентрацијата на вкупен холестерол:
c = 5,17 × [ ]
Концентрацијата на вкупниот холестерол може да се изрази и во mg/dL, ако наместо

5,17 во формулата се употреби вредноста 200, што ја претставува концентрацијата на
стандардот изразена во mg/dL.
Тестот за определување на концентрацијата на холестерол е линерен во граници до

19,3 mmol/L (750 mg/dL).
Примероците со повисока концентрација на холестерол се разредуваат 1 + 2 со
физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува определувањето на концентарцијата.
Резултатот се множи со 3.
Референтните вредности според АНА – American Heart Association се:

4,1 – 5,2 mmol/L
Забелешка:
1. Врз тестот не влијае на концентрацијата на хемоглобин, дури и до 200 mg/dL, ниту
вредностите од билирубин до 5 mg/dL.
2. Реагенсите содржат 0,05 % натриум азид како конзерванс. Да не се голта. Да се
избегнува контакт со кожа и слузокожа.
79
3.5.2. Определување на концентрацијата на триглицериди
Методата за определување на концентрацијата на триглицериди што ќе ја

изучиме во рамките на овој предмет е исто така стандардна и широко се користи. Истата
е аплицирана на автоматските биохемиски анализатори, но може да се користи и за
мануелно определување. Следува објаснување на основните карактеристики на
методата, а за таа цел како референца го користиме протоколот со ознака SU-TRIMR
INF 1072401 GB 02-2009-11 од производителот Human, Германија. Оригиналниот
протокол се наоѓа на платформата за е-учење.
Оваа постапка се базира на серија од неколку ензимски реакции.
Во првата реакција, триглицеридите од примерокот за анализа најпрвин се
хидролизираат со помош на липази до глицерол и слободни масни киселини.
Глицеролот потоа се фосфорилира со ATP (аденозин трифосфат) во присуство на
ензимот глицерол киназа (GK) при што се добива глицерол-3-фосфат и ADP.
Глицерол-3-фосфатот понатаму се оксидира со молекуларен кислород под дејство на
ензимот глицерол фосфат оксидаза (GPO) при што се ослободува Н2О2 и
дихидроксиацетон фосфат.
Во последната ензимска реакција Н2О2 врши оксидативно поврзување на 4-хлорофенол
и 4-аминоантипирин [односно пара-аминоантипирин (PAP)], во реакција што е
катализирана од ензимот пероксидаза (POD), при што се добива црвено обоен
кинонимин со максимална апсорпција на 500 nm.
Интензитетот на обојувањето се мери спектрофотометриски. Апсорбанцијата е право
пропорционална со концентрацијата на триглицериди во примерокот.
Забелешка: Согласно принципот на методата, концентрацијата на
триглицеридите во примерокот се определува преку концентрацијата на глицеролот
што се добива при нивна хидролиза. За да се изврши корекција за вредноста за
слободниот глицерол од примерокот, од измерената вредност за триглицеридите треба
да се одземе 0,11 mmol/L (10 mg/dL). Меѓутоа, вредноста од 0,11 mmol/L нема клиничко
значење. Слободниот глицерол може да претставува значајна интерференција кај
примероци од пациенти со интензивна липолиза.
RGT:
PIPES пуфер 50 mmol/L
4-хлорофенол 5 mmol/L
Mg-јони 4,5 mmol/L
ATP 2 mmol/L
Липази ≥1300 U/L
Пероксидаза ≥ 500 U/L
Глицеролкиназа ≥400 U/L
Глицерол-3-фосфат оксидаза ≥1500 U/L
STD:
Триглицериди 200 mg/dL или 2,28 mmol/L

Реагенсот и стандардот ги добиваме во готова форма како комплет од реагенси - кит.
кога се чуваат на 2...8°C. Отворениот реагенс е стабилен до 4 недели на 20...25°С. При
работа со нив мораме да ја одбегнеме контаминацијата.
Реагенсите мора да се чуваат заштитени од светлина.
80
Примерок:
Стабилност на примерокот за анализа: 3 дена доколку се чува на 2...8°C, или 4 месеци
чуван на -20°C.
Постапка:
Должина на патека: 1 cm


температура 37°C. Се мери апсорбанцијата на примерокот (ΔAпримерок) и на
стандардот(ΔAстандард) наспроти слепата проба за време од најмногу 60 минути.
Пресметување на концентрацијата на триглицериди:
c = 2,28 × [ ]
Концентрацијата на триглицеридите може да се изрази и во mg/dL, ако наместо 2,28 во

формулата се употреби вредноста 200, што ја претставува концентрацијата на
стандардот изразена во mg/dL.
Карактеристики на методaта:
Тестот за определување на концентрацијата на триглицериди е линерен во граници до
11,4 mmol/L (1000 mg/dL). Примероците со повисока концентрација се разредуваат 1 +
4 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува определувањето на
концентарцијата. Резултатот се множи со 5.

0,3 – 1,7 mmol/L
Забелешки:
1. Хемоглобинот во концентрација до 150 mg/dL и билирубинот во концентрација до 40
mg/dL не интерферираат со тестот. Аскорбинската киселина во концентрација над 4
mg/dL дава лажно пониски вредности на триглицеридите.
2. Реагенсите содржат натриум азид како конзерванс (0,05%). Да не се голта. Да се
избегнува контакт со кожа и слузокожа.
81
3.5.3. Определување на концентрацијата на HDL-холестерол со метода на
таложење
За проценка на степенот на атерогениот ризик, определувањето на

концентрацијата на холестеролот во HDL фракцијата е задолжително и е вклучено во
препораките на сите светски професионални здруженија чиј предмет на интерес се
атеросклерозата и/или метаболниот синдром. Концентрацијата на холестерол во HDL
фракцијата се означува и како HDL-холестерол, или популарно – „добар“ холестерол.
Името „добар“ холестерол потекнува од таму што HDL партикулите имаат функција за
транспорт на холестеролот од периферните ткива до хепатоцитите и поради тоа имаат
заштитно, антиатерогено дејство.
За определување на концентрацијата на HDL-холестерол се користат два вида

методи:
- Метода со таложење и
- Директна метода.
Во рамките на овој курс ќе се запознаеме со двата вида методи, нивните
предности и недостатоци.
Најпрвин ќе ја разгледаме методата со таложење што се одликува со висок

степен на прецизност и ниска цена на чинење. Единствен недостаток на оваа метода е
потребата од мануелен пред третман на примерокот, што во некои клиничко-
биохемиски лаборатории може да претставува значителна пречка. Со исклучок на
мануелната преципитација, понатамошниот тек на анализата може да се автоматизира
и како таква е аплицирана на голем број клиничко-биохемиски анализатори.
За изучување на принципот на оваа метода ќе го искористиме протоколот од
Human, број SU-HDL INF 1001801 GB 05-2007-15.
Хиломикроните, VLDL и LDL се преципитираат со фосфоволфрамова киселина и
магнезиум хлорид. По центрифугирањето, супернатантот ја содржи само HDL-
липопротеинската фракција во која концентрацијата на холестеролот се определува со
помош на реагенсот за определување на холестерол.
Состав на реагенс-китот за таложење:
PREC: Фосфоволфрамова киселина 0,55 mmol/L

Магнезиум хлорид 25,0 mmol/L
STD: Холестерол 50 mg/dL односно 1,29 mmol/L

За макро анализа се користи PRECа, кој всушност претставува неразреден реагенс
PREC (PREC – реагенс за преципитација).
За семи-микро анализа се користи PRECb, кој се подготвува на следниот начин:
- реагенсот PREC се разредува со 20 mL вода или
- се разредува 4 дела од реагенсот со 1 дел вода (4+1).
STD е готов за употреба и може директно да се вклучи во тестот. Не е неопходна
преципитација. Факторот во формулата за пресметка го вклучува степенот на
разредување.
PREC е стабилен дури и по отворањето, сè до рокот на траење доколку се чува на
температура од 2-25°С.
Притоа мора да се избегне контаминацијата.
Примерок:
Серум, хепаринизирана или EDTA-плазма
82
Шема на пипетирање:
1. Преципитација
Макро метода Семи-микро метода

Примерок 500 µL 200 µL
PRECа 1000 µL ---
PRECb --- 500 µL
Се промешува добро и се инкубира 10 минути на собна температура.

Се центрифугира најмалку 2 минути на 10 000 g, или 10 минути на 4 000 g.
По центрифугирањето се одвојува бистриот супернатант од преципитатот (најмногу
после еден час) и се определува концентрацијата на холестеролот во истиот,
употребувајќи го реагенсот за определување на холестерол.
2. Определување на холестерол во супернатантот (HDL-фракција)

Дестилирана вода 100 µL / /
HDL супернатант / / 100 µL
Се промешува и се инкубира 5 минути на температура од 37°С или 10 минути на

температура од 20-25°С. Се мери апсорбанцијата на примерокот (ΔAпримерок) и на
стандардот (ΔAстандард), наспроти слепата проба за време од 60 минути.
Пресметување на концентрацијата на HDL-холестерол:
Макро метода
c = 3,87 × [ ]
Концентрацијата на HDL-холестеролот може да се изрази и во mg/dL, ако наместо 3,87

во формулата се употреби вредноста 150.
Семи-микро метода
c = 4,52 × [ ]
Концентрацијата на HDL-холестеролот може да се изрази и во mg/dL, ако наместо 4,52

во формулата се употреби вредноста 175.

1,00 – 2,00 mmol/L
83
Забелешка:
1. Доколку супернатантот не е бистар (што се случува кога во примерокот има висока
концентрација на триглицериди), пред преципитацијата примерокот се разредува со
физиолошки раствор (0,9% NaCl) во сооднос 1 + 1, а пo извршената анализа добиениот
резултат се множи со 2.
2. Високи концентрации на витамин C (над 2,5 mg/dL), можат да дадат пониски
вредности за HDL-холестерол.
3. Висока концентрација на хемогобин во примерокот над 100 mg/dL и високи
концентрации на билирубин над 10 mg/dL во примерокот може да интерферираат со
тестот.
3.5.4. Определување на концентрацијата на HDL-холестерол со директна метода
Предноста на директната метода за определување на концентрацијата на HDL-

холестеролот е отсуството на мануелен пред третман на примерокот, што овозможува
нејзина комплетна автоматизација. Како таква, оваа метода е вклучена во менито на
голем број клиничко-биохемиски анализатори. Освен тоа, оваа метода може да се
изработува и мануелно. Недостаток на оваа метода е значително повисоката цена на
чинење во однос на методата со таложење.
Како пример за директна метода за определување на HDL-холестерол, во оваа
прилика ќе го разгледаме протоколот од Human, број SU-HDLDD INF 1008401 GB 07-
2008-14.
Определувањето на HDL-холестеролот со директна метода се одвива во два степени.
Во првиот степен, во специфични услови, на хиломикроните (доколку се присутни во
примерокот за анализа), VLDL и LDL партикулите им делуваат холестерол естеразата
и холестерол оксидазата, а добиениот водород пероксид се отстранува со помош на
ензимот каталаза.
Во вториот степен, концентрацијата на холестеролот од HDL фракцијата, се определува
со специфичната ензимска реакција за определување на холестерол, во присуство на
сурфактанти за HDL.
ENZ: Ензими
Пуфер, рН 6,6 (25°С) 100 mmol/L
Натриум хлорид 170 mmol/L
Холестерол естераза 1400 U/L
Холестерол оксидаза 800 U/L
Каталаза 600 kU/L
Аскорбат оксидаза 3000 U/L
N-(2-хидрокси-3-сулфопропил)-3,5-
диметоксианилин 0,56 mmol/L
Заштитен агенс 0,1% w/v
SUB: Супстрат
Пероксидаза 3500 U/L
4-аминоантипирин 4 mmol/L
Заштитен агенс 0,1 % w/v
Детергенти 1,4 % w/v
Натриум азид 0,05 % w/v
CAL: Холестерол концентрацијата е означена
на етикетата од шишенцето
84
ENZ и SUB:
ENZ и SUB ги добиваме во готова форма.
Отворените реагенси се стабилни до два месеци на 2...8°С.
Не смее да се замрзнуваат.
Да не се мешаат капачињата.
ENZ да се заштити од светлина.
CAL:
Содржината на калибраторот се раствора со 4 mL вода. Внимателно да се промеша, за
да не се создаде пена при растворањето на лиофилизатот. Треба да отстои 30 минути
пред да се употреби. Внимателно да се промеша пред употребата.
Стабилен е до 10 дена на 2...8°С. Може да биде распределен во порции и да се чува
замрзнат на -20°С, најмногу до 30 дена. Се замрзнува и одмрзнува само еднаш.
Внимателно да се промеша по одмрзнувањето.
Примерок:
Серум, плазма
Стабилност на примерокот: Се препорачува анализата да се изработи веднаш по
земањето на крв. Во спротивно серумот да се чува на -20°С до неколку недели, но при
тоа да биде избегнато повторено одмрзнување и замрзнување.
Во плазмата не смеат да се пречекорат следните концентрации на антикоагулансите:
EDTA-2Na < 1000 mg/L; Na-цитрат < 5000 mg/L; хепарин < 750 mg/L; Na-флуорид < 2000
mg/L, Na-оксалат < 3000 mg/L.
Постапка:
Бранова должина: 593 nm (570 – 610 nm)
Температура: 37°C
Шема за пипетрање, за мануелна изработка на анализата:
Слепа проба Калибратор Примерок

Вода 10 µL / /
Калибратор / 10 µL /
ENZ 750 µL 750 µL 750 µL
Се промешува и се инкубира точно 5 мин. на 37°С
SUB 250 µL 250 µL 250 µL
Се промешува внимателно и се инкубира на температура од 37°C. Температурата мора

да се одржува на  0,5°С во текот на тестот. Се мери апсорбанцијата на калибраторот
(ΔAкалибратор) и на примерокот (ΔAпримерок) наспроти слепата проба после 5 мин.
Пресметување на концентрацијата на HDL-холестерол:
Пресметувањето на концентрацијата се врши по следната формула:
ΔA примерок mg
c =c калибратор × [ ]
ΔA калибратор dL
Фактор на конверзија: С(mg/dL) x 0,02586 = C(mmol/L)
85

1,00 – 2,00 mmol/L
Линеарност: до 150 mg/dL HDL

Ако концентрацијата на HDL-холестеролот во серумот ја надминува границата на
линеарноста, примерокот се разредува 1 + 1 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се
повторува тестот. Резултатот се множи со 2.
Разредување треба да се направи и кај липемични примероци, каде вредноста на
триглицеридите е над 1200 mg/dL.
3.5.5. Определување на концентрацијата на LDL-холестерол со директна метода
Директната метода за определување на концентрацијата на LDL-холестеролот

широко се користи во современите клиничко-биохемиски лаборатории и е аплицирана
на биохемиските анализатори од бројни производители. Според принципот, методата е
многу слична со директната метода за определување на HDL-холестеролот, со таа
разлика што се користат различни детергенти и сурфактанти.
За запознавање со методата, ќе го искористиме протоколот од Human, број SU-
LDL INF 1009401 GB 07-2008-8.
Определувањето на LDL-холестеролот со директна метода се одвива во два степени.
Во првиот степен, во специфични услови, на хиломикроните, VLDL и HDL партикулите
им делуваат холестерол естеразата и холестерол оксидазата, а добиениот водород
пероксид се отстранува со помош на ензимот каталаза.
Во вториот степен, холестеролот од LDL фракцијата се определува со специфичната
ензимска реакција за определување холестерол, во присуство на сурфактанти за LDL.
ENZ: Ензими
Магнезиум хлорид 20 mmol/L
Холестерол естераза 600 U/L
Холестерол оксидаза 500 U/L
Каталаза 600 kU/L
N-етил-N-(2-хидрокси-3-сулфопропил)
-3-метиланилин 2,0 mmol/L
Детергент 0,3% w/v
Заштитен агенс <0,1% w/v
SUB: Супстрат
Пероксидаза 5000 U/L
4-аминоантипирин 4 mmol/L
Заштитен агенс <0,1% w/v
Детергент 1,0% w/v
86
CAL: 1 x 4 mL калибратор
Холестерол концентрацијата е означена
на етикетата од шишенцето

ENZ и SUB:
ENZ и SUB ги добиваме во готова форма.
Отворените реагенси се стабилни до два месеци на 2...8°С.
Не смее да се замрзнуваат.
Да не се мешаат капачињата.
ENZ да се заштити од светлина.
CAL:
Содржината на калибраторот се раствора со 4 mL вода. Внимателно да се промеша, за
да не се создаде пена при растворањето на лиофилизатот. Треба да отстои 30 минути
пред да се употреби. Внимателно да се промеша пред употребата.
Стабилен е до 10 дена на 2...8°С. Може да биде распределен во порции и да се чува
замрзнат на -20°С, најмногу до 30 дена. Се замрзнува и одмрзнува само еднаш.
Внимателно да се промеша по одмрзнувањето.
Примерок:
Серум, плазма
Стабилност: Се препорачува анализата да се изработи веднаш по земањето на крвта,
во спротивно серумот може да се чува на 2…8°С во рок од 5 дена.
Доколку тестот се изработува во плазма да се внимава да не се пречекори количеството
на антикоагулансот, и тоа: EDTA-2Na < 1000 mg/L; Na-цитрат < 5000 mg/L; хепарин <
750 mg/L; Na-флуорид < 2000 mg/L, Na-оксалат < 3000 mg/L.
Постапка:
Бранова должина: 555 nm (546 – 604 nm)
Слепа проба Калибратор Примерок

Вода 10 µL / /
Калибратор / 10 µL /
ENZ 750 µL 750 µL 750 µL
Се промешува и се инкубира точно 5 мин. на 37°С
SUB 250 µL 250 µL 250 µL
Се промешува внимателно и се инкубира на температура од 37°C. Температурата мора

да се одржува на  0,5°С во текот на тестот. Се мери апсорбанцијата на калибраторот
(ΔAкалибратор) и на примерокот (ΔAпримерок) наспроти слепата проба после 5 мин.
Пресметување на концентрацијата на LDL-холестерол:
Пресметувањето на концентрацијата се врши по следната формула:
c = c калибратор × [ ]
ΔA калибратор dL
87
Фактор на конверзија: С(mg/dL) x 0,02586 = C(mmol/L)
Линеарност: до 1000 mg/dL LDL.
Ако концентрацијата на LDL-холестеролот во серумот ја надминува границата на
линеарноста, примерокот се разредува 1 + 1 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се
повторува тестот. Резултатот се множи со 2.
Разредување треба да се направи и кај липемични примероци, каде вредноста на
триглицеридите е над 1000 mg/dL.
< 2,6 mmol/L
3.5.6. Определување на концентрацијата на LDL-холестерол со метода на

таложење
Концентрацијата на LDL-холестеролот може да се определи и со методата на

таложење. Меѓутоа, оваа метода нема широка употреба во клиничката пракса, па
поради тоа нејзиното значење е ограничено. Сепак, методата се користи во
истражувачки цели, па затоа накратко ќе се запознаеме со истата, поточно со нејзиниот
принцип.
LDL партикулите се преципитираат со помош на хепарин и натриум цитрат. По
центрифугирањето, во супернатантот остануваат HDL и VLDL. Концентрацијата на
холестерол во овие две фракции се определува со ензимската метода. Концентрацијата
на холестерол во LDL фракцијата се пресметува како разлика помеѓу концентрацијата
на вкупниот холестерол во нетретираниот примерок и концентрацијата на холестерол
во супернатантот.
3.5.7. Пресметување на концентрацијата на LDL-холестерол со Friedеwald-ова

формула
За проценка на степенот на атерогениот ризик кај еден пациент неопходно е да

се определат не само серумските концентрации на вкупниот холестерол и
триглицеридите, туку и HDL- и LDL-холестеролот. Меѓутоа, определувањето на HDL- и
LDL-холестеролот, особено со користење на директните методи, бара набавка на
реагенси со релативно висока цена, и не е секогаш достапно. Поради тоа добро е да се
знае дека концентрацијата на LDL-холестеролот може да се пресмета и со помош на
Friedеwald-овата формула, доколку претходно се измерени концентрациите на вкупниот
холестерол, триглицеридите и HDL-холестеролот:
триглицериди mmol
LDLхолестерол = вкупен холестерол - HDLхолестерол - [ ]
2,2 L
триглицериди mg
LDLхолестерол = вкупен холестерол - HDLхолестерол - [ ]
5 dL
Клиничките студии покажале дека постои висока корелација помеѓу вредностите

што се добиваат со Friedеwald-овата формула и вредностите што се добиваат со
88
метода на сепарација на LDL-фракцијата со ултрацентрифугирање, што претставува
референтна метода во анализата на липопротеините од крвната плазма.
Мора да се нагласи дека оваа формула може да се примени само доколку

концентрацијата на триглицеридите е помала од 4,0 mmol/L и доколку во
серумскиот примерок нема присуство на хиломикрони.
3.5.8. Дијагностичко значење на аполипопротеините А I И В-100
Аполипопротеинот А I е најзастапениот протеин во состав на HDL партикулите.

Го активира ензимот лецитин-холестерол-ацилтрансфераза и на тој начин го помага
отстранувањето на слободниот холестерол од екстрахепаталните ткива. Намалените
серумски концентрации на аполипопротеинот А I се индикатор за зголемен ризик од
појава и напредување на атеросклерозата. Ниски концентрации на овој аполипопротеин
се среќаваат и кај пациенти со хепатит и цироза.
Аполипопротеинот В-100 е најзастапениот протеин во состав на LDL, IDL и
VLDL партикулите. Покачените серумски концентрации на овој аполипопротеин
претставуваат индикатор за зголемен ризик од атеросклероза.
Серумските концентрации на аполипопротеините А I и В-100 се определуваат со
имунохемиски методи со кои ќе се запознаеме подоцна.
89
4. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИСКИ АНАЛИЗИ НА ПРОТЕИНИ
Протеините, кои уште се нарекуваат и белковини, претставуваат органски

соединенија кои во состав на човековиот организам (кај возрасен човек) се застапени
со околу 20% од вкупната телесна маса. Ако се земе предвид дека околу 60% од
вкупната телесна маса кај возрасен човек отпаѓа на водата, тогаш следува дека на
протеините отпаѓаат околу 50% од сувата маса на телото. Токму затоа оваа класа
органски соединенија со право го носи своето име: protos значи прв. Би можело
слободно да се каже дека животот претставува форма на постоење на протеините, чија
најзначајна одлика е размената на материите и енергијата со надворешната средина.
Освен тоа што претставуваат основна градбена компонента на живата материја,
протеините учествуваат и во сите биохемиски процеси во организмот и имаат особено
разновидна физиолошка функција. Имено, од протеинска природа се ензимите,
некои хормони, антителата, факторите на коагулација, хемоглобинот и многу
други соединенија.
Протеинските молекули имаат сложен хемиски состав, а нивните основни
градбени единици (мономери) се аминокиселините, меѓу себе поврзани со пептидни
врски.
4.1. Аминокиселини
4.1.1. Општи својства на аминокиселините
Аминокиселините се бели кристални супстанции со релативно висока точка на

топење, над 200°С. Добро се раствораат во вода, а не се раствораат во неполарни
растворувачи. Во природата постојат околу 300 аминокиселини.
Само 20 протеиногени аминокиселини (и селеноцистеинот како 21-ва
протеиногена аминокиселина) се вклучени во генетскиот код и како такви се среќаваат
во состав на протеините.
Од аспект на нивниот хемиски состав, за аминокиселините е значајно тоа што
тие поседуваат две функционални групи:
1) амино група (-NH2), која има базен карактер и
2) карбоксилна група (-COOH) која има кисел карактер,
како и странична R група. Поради присуството на функционалните групи со кисел и
базен карактер аминокиселините имаат особини и на киселини и на бази, т.е. тие се
амфотерни. Хемиската структура на една аминокиселина од општ вид е прикажана на
Слика 4.1.
Слика 4.1. Хемиска структура на аминокиселина
90
Природните аминокиселини се главно α-аминокиселини, односно амино групата
е поврзана за јаглеродниот атом кој се наоѓа веднаш до карбоксилната група, т.н. α-
јаглероден атом. Освен тоа, сите аминокиселини што ги градат природните протеини
имаат L-конфигурација, односно иста конфигурација како L-глицералдехидот, што во
случајот на аминокиселините се однесува на положбата на амино групата.
Функционалните групи на аминокиселините се услов за нивната дисоцијација во
воден раствор:
1. Карбоксилната група, како киселинска група, при дисоцијација во воден
раствор ослободува H+ јон, којшто базната -NH2 група може да го прифати и да премине
во амониум јон -NH3+. На тој начин аминокиселината станува диполарен јон или т.н.
цвитер јон (zwitterion).
Вредноста на pH на средината при која аминокиселината е во форма на цвитер
јон се нарекува изоелектрична точка. Во изоелектричната точка аминокиселините се
најмалку растворливи, најмалку стабилни и најлесно се таложат.
2. Кога во воден раствор на аминокиселина каде таа се наоѓа во форма на цвитер
јон се додаде киселина, тогаш во растворот има вишок на H+ јони и дисоцираната
карбоксилна група се неутрализира. Како резултат на тоа, аминокиселината како
целина поминува во катјон. Ваквата форма на аминокиселината се нарекува
протонирана форма.
3. Кога во воден раствор на аминокиселина каде таа се наоѓа во форма на цвитер
јон се додаде алкалија, тогаш во растворот се јавува вишок на -OH јони, амониум јонот
од аминокиселината ослободува H+ јон и се добива вода, а самата аминокиселина
поминува во форма на анјон. Ваквата форма на аминокиселината се нарекува протон
акцепторна форма.
4.1.2. Пептидна врска
Постојат поголем број хемиски реакции што се карактеристични за

аминокиселините. Тие се резултат на хемиските својства на карбоксилната група, на
амино групата или пак на определени специфични хемиски групи кои влегуваат во
состав на страничните R групи.
Сепак, може да се каже дека најзначајна хемиска реакција во која влегуваат
аминокиселините е реакцијата помеѓу амино групата од една аминокиселина и
карбоксилната група од друга аминокиселина, при што се ослободува една молекула
вода и се образува пептидна врска (Слика 4.2.). На тој начин се формираат дипептиди,
а понатаму и олигопептиди, полипептиди и протеини.
Рамнотежата на оваа реакција е во насока на хидролизата. За да потече
реакцијата формирање на пептидната врска потребна е претходна активација на
аминокиселините со аденозин трифосфат (ATP).
1 2
R H R
+
H3N CH C OH+H N CH COO
O
H2O H2O
1 2
R H R
+
H3N CH C N CH COO
O
Слика 4.2. Образување на пептидна врска
91
4.1.3. Поделба на аминокиселините
За полесно изучување, аминокиселините се систематизираат според некои

нивни заеднички карактеристики. Во литературата се среќаваат различни поделби на
аминокиселините. Во оваа прилика ќе ја изучиме поделбата што е направена врз основа
на градбата на целата молекула и присуството или отсуството на функционални кисели
или базни групи во страничната R група. Така, врз основа на овие критериуми
аминокиселините се поделени на:
1. Аминокиселини чија странична R група е јаглеводород,
2. Аминокиселини со поларни, нејонизирани групи во страничната R група,
3. Моноамино дикарбонски киселини и
4. Диамино монокарбонски киселини.
1. Кај сите аминокиселини чија странична R група е јаглеводород (освен кај
глицинот, каде страничната R група е всушност атом на водород) јаглеводородната низа
создава хидрофобни врски. Поради тоа, овие аминокиселини во состав на протеините
имаат својство да го спречуваат контактот со водата. Во оваа група на аминокиселини
спаѓаат: глицин (Gly, G), аланин (Ala, A), валин (Val, V), леуцин (Leu, L), изолеуцин (Ile,
I), фенилаланин (Phe, F) и пролин (Pro, P).
2. Аминокиселините со поларни, нејонизирани групи во страничната R група
можат да ги содржат следните функционални групи: -OH, -SH, -SCH3,-CONH2 или
хетероциклична група. Овие поларни групи учествуваат во создавањето на водородни
врски во пептидната верига и ја стабилизираат протеинската молекула. Во оваа група
на аминокиселини спаѓаат: серин (Ser, S), треонин (Thr, T), цистеин (Cys, C), метионин
(Met, M), тирозин (Tyr, Y), триптофан (Trp, W), аспарагин (Asn, N) и глутамин (Gln, Q).
3. Моноамино дикарбонските киселини содржат уште една дополнителна
карбоксилна група во рамките на страничната R група и поради тоа имаат кисел
карактер. Во оваа група спаѓаат глутаминската киселина (Glu, E) и аспарагинската
киселина (Asp, D).
4. Диамино монокарбонските киселини содржат уште една дополнителна базна
група во рамките на страничната R група и поради тоа имаат базен карактер. Во оваа
група спаѓаат аминокиселините: аргинин (Arg, R), лизин (Lys, K) и хистидин (His, H).
Од нутритивен и медицински аспект најзначајна е поделбата на
аминокиселините на:
- Есенциелни аминокиселини и
- Неесенциелни аминокиселини.
Есенциелни аминокиселини се оние кои се неопходни за одржување на
животните процеси во организмот, а истиот не може сам да ги синтетизира, туку мора
да се примаат преку храната. Неесенциелни аминокиселини се оние кои се неопходни
за одржување на животните процеси во организмот, но истиот има способност сам да
си ги синтетизира. Редовното внесување на аминокиселини во организмот преку
храната е од суштинско значење за нормално одвивање на биохемиските процеси и
одржување на здравјето. Хранливи продукти кои содржат висок процент на протеини се:
месото, рибата, јајцата и млекото. Протеините се застапени и во некои хранливи
продукти од растително потекло: соја, грав, грашок, леќа, пченица, пченка. Протеините
кои потекнуваат од месото, рибата, јајцата и млекото ги содржат сите есенциелни
аминокиселини и тоа во сооднос кој е соодветен со потребите на човековиот организам
и затоа тие имаат висока биолошка вредност. Од друга страна протеините од
растително потекло, со исклучок на оние кои потекнуваат од сојата, не ги содржат сите
есенциелни аминокиселини или барем не во сооднос кој е соодветен со потребите на
човековиот организам, па поради тоа нивната биолошка вредност е ниска.
На Слика 4.3. се прикажани структурните формули на 20-те протеиногени
аминокиселини.
92
Слика 4.3. Структурни формули на 20-те протеиногени аминокиселини
(Извор – Wikimedia)
93
4.2. Пептиди
Пептидите претставуваат соединенија кои се составени од два или повеќе, а

најмногу до 100 аминокиселински остатоци, поврзани со пептидни врски.
Пептид кој е составен од два аминокиселински остатоци се нарекува дипептид,
од три аминокиселински остатоци трипептид, од шест хексапептид и т.н. Пептидите кои
се изградени од два до десет аминокиселински остатоци се нарекуваат олигопептиди,
а над десет до сто аминокиселински остатоци се нарекуваат полипептиди.
При номенклатура на пептидите, аминокиселините кои ја вклучуваат
карбоксилната група во реакцијата добиваат наставка -ил, а последната аминокиселина
која ја има зачувано карбоксилната група останува со непроменето име (пр. аланил-
глицил-валин). За целосно детерминирање на пептидот важен е редоследот на
аминокиселинските остатоци во неговата молекула. Така, дипептидот глицил-валин е
сосема различно соединение од валил-глицин.
Во молекулата на секој пептид има една слободна амино група и една слободна
карбоксилна група. По договор, терминалната амино група во формулата на пептидот
секогаш се пишува на левата страна. Тој крај од молекулата се означува како N-
terminus. Според истиот договор, терминалната карбоксилна група во формулата на
пептидот секогаш се пишува на десната страна. Тој крај од молекулата се означува како
С-terminus.
4.2.1. Улога на пептидите во организмот
Постојат голем број природни пептиди од кои некои имаат мошне важни
физиолошки функции.
- Глутатионот е најпознатиот и најраспространетиот природен пептид. Тој е
всушност трипептид: γ-глутамил-цистеинил-глицин. Има значајна улога во оксидо-
редукционите реакции во организмот.
- Невропептидите се среќаваат во мозокот и имаат улога на невротрансмитери
и невромодулатори. Од посебно значење се ендорфините.
- Пептидна структура имаат и некои хормони, меѓу кои се:
а) Окситоцинот (оцитоцин) и вазопресинот (антидиуретичен
хормон) од задниот резен на хипофизата, кои имаат по 9
аминокиселински остатоци,
б) Адренокортикотропниот хормон од предниот резен на хипофизата
кој е изграден од 39 аминокиселински остатоци,
в) Инсулинот од панкреасот, кој се состои од 51 аминокиселински
остаток,
г) Глукагонот, исто така од панкреасот, кој е изграден од 29
д) Калцитонинот од тироидната жлезда изграден од 32
ѓ) Паратхормонот од паратироидната жлезда, со 84 аминокиселински
остатоци.
Градбата и функцијата на сите овие соединенија подетално се изучува во
рамките на предметите Биохемија (општа и клеточна) и Физиологија.
4.3. Протеини
Протеините можат да се дефинираат како високомолекуларни полимери на

аминокиселините. Нивните молекули содржат повеќе од 100 аминокиселински
остатоци.
Класификацијата на протеините може да биде направена според различни
критериуми: според нивната биолошка функција, според растворливоста, според
94
нивните хемиски и физички својства. Меѓутоа, секоја од овие класификации се одликува
со одредена недоследност, па затоа овде ќе биде претставена класичната
класификација според која протеините можат да се поделат во две групи:
а) Протеини или прости протеини и
б) Протеиди или сложени протеини.
Простите протеини се изградени само од аминокиселински остатоци, додека
сложените протеини се изградени од прост протеин за кој е врзана некоја непротеинска
молекула.
4.3.1. Прости протеини
Во групата на прости протеини спаѓаат:

Албумини.- Тие се широко застапени во живата природа. Ги има и во
растителниот и во животинскиот свет. Се одликуваат со тоа што се растворливи во вода
и во разредени раствори на соли, а не се раствораат во концентрирани раствори на
соли.
Глобулини.- Тие се исто така широко застапени во живата природа. Се
раствораат само во разредени раствори на соли, а се нерастворливи во вода и во
концентрирани раствори на соли.
Албумините и глобулините се застапени и во хуманата крвна плазма. Во
клиничко-биохемиските лаборатории нивната концентрација се определува рутински,
вообичаено во серумски примероци. Всушност, се определува концентрацијата на
вкупните протеини и на албумините, додека концентрацијата на глобулините се
определува како нивна разлика.
Хистони.- Тие се исклучиво животински протеини. Влегуваат во составот на
нуклеопротеидите.
Протеиноиди.- Тие по својата структура се фибриларни протеини и влегуваат
во состав на косата, епидермисот, коскеното ткиво и ‘рскавиците. Во оваа група спаѓаат
колагенот и α-кератинот.
Проламини.- Тие се наоѓаат исклучиво во семето од житата. Не ја содржат
есенциелната (за човековиот организам) аминокиселина лизин. Познати проламини се:
глијадин од пченицата, зеин од пченката и аванин од овесот.
Глутелини.- Тие се исто така растителни протеини. Познати глутелини се:
глутенин од пченицата, глутелин од пченката и оризенин од оризот.
Фосфопротеини.- Како и секоја друга класификација во биохемијата, така и

класификацијата на протеините на прости и сложени има свој недостаток што се
манифестира кај фосфопротеините. Имено, станува збор за една мала група на
протеини кои некои автори ги класифицираат како прости протеини, додека други
автори ги класифицираат како сложени протеини. За хемиската структура на
фосфопротеините е карактеристично тоа што за хидроксилната група на
аминокиселинскиот остаток на серинот или треонинот естерски е поврзана фосфорна
киселина. Фосфопротеините имаат важна улога во развојот на ембрионот и во растот
на младите организми. Позначајни фосфопротеини се: казеинот од млекото и вителинот
од жолчката од јајце.
4.3.2. Сложени протеини
Зависно од хемиската природа на непротеинската молекула, сложените

протеини можат да се поделат на:
Липопротеиди.- Тие се комплекси помеѓу протеини и липиди. Учествуваат во
транспортот на липидите во крвната плазма, но претставуваат и структурна компонента
на мембранските системи и на нервното ткиво.
95
Гликопротеиди.- Кај нив непротеинската молекула е некој јаглехидрат.
Влегуваат во состав на коскеното ткиво, ‘рскавиците, тетивите и слузавите секрети. Се
среќаваат и во состав на клеточните мембрански системи.
Хромопротеиди.- Тие како непротеинска молекула содржат некој пигмент. Во
оваа група на сложени протеини спаѓаат:
а) Порфиринските хромопротеиди, кои како непротеинска молекула
содржат порфирински прстен. Тука спаѓаат хемоглобинот, миоглобинот,
цитохромите, пероксидазата и каталазата.
б) Флавопротеидите, кои како непротеинска молекула содржат
рибофлавин (вит. B2). Тука спаѓаат оксидо-редукционите ензими флавин
дехидрогенази.
Нуклеопротеиди.- Тие претставуваат комплекси помеѓу протеини (хистони) и
нуклеински киселини. Имаат незаменлива улога во процесите на наследувањето и
биосинтезата на протеините.
Металопротеиди.- Тие во својата молекула содржат некој метал. На пример,
феритинот и трансферинот содржат железо, церулоплазминот содржи бакар, ензимот
алкохол дехидрогеназа содржи цинк итн.
4.3.3. Денатурација на протеините
Многу хемиски агенси (киселини, бази, алкохоли, соли на тешки метали) и

физички фактори (високи температури, јонизирачки зрачења) можат да предизвикаат
промена на физичките и физиолошките својства на протеините, односно можат да
предизвикаат нивна денатурација.
Со денатурацијата не се менува примарната структура на протеините (не се
менува нивниот хемиски состав, односно редоследот на аминокиселинските остатоци),
туку се менуваат само секундарната, терциерната и кватерната структура. Всушност
денатурацијата претставува премин од високо организирана структура во една
неорганизирана структура или т.н. состојба на „случајно клопче“. По денатурација
растворливоста на протеините се намалува.
Под точно определени услови денатурацијата може да биде реверзибилна и овој
процес се означува како ренатурација.
4.4. Дигестија и апсорпција на протеините
Протеините се внесуваат во организмот преку храната, но никогаш не влегуваат

во состав на ткивата без претходно да се разградат до аминокиселини. Поточно,
организмот за своите потреби не ги искористува протеините од храната, туку нивните
основни градбени блокови - аминокиселините, како и некои едноставни пептиди.
Всушност, за протеините е карактеристична строга видова специфичност. Туѓи
протеини внесени во организмот интравенски предизвикуваат имунолошка реакција.
Примените туѓи протеини преку храната се хидролизираат во дигестивниот тракт под
дејство на протеолитичките ензими, со што тие се лишуваат од нивната видова
специфичност.
Во дигестивниот систем на човекот постојат повеќе протеолитички ензими:
пепсин, трипсин, химотрипсин, еластаза, карбоксипептидази, аминопептидази,
трипептидази и дипептидази. Специфичноста на овие ензими не се однесува на точно
определени протеини, туку на определени структурни карактеристики на протеинскиот
синџир (делуваат само на точно определени места во протеинскиот синџир, пред или
после определена аминокиселина). Денатурираните протеини полесно се
хидролизираат во однос на нативните.
По делувањето на протеолитичките ензими, аминокиселините и некои мали
пептиди (до 8 аминокиселински остатоци) се апсорбираат од страна на цревната
слузокожа и преку порталниот крвоток доаѓаат до црниот дроб.
96
За организмот е карактеристично тоа што телесните протеини подлежат на
постојано разложување и синтеза. При тоа, брзината на обновувањето на различните
протеини е различна и се изразува преку времето на полуживот - време за кое
половината од даденото количество на протеинот ќе се обнови. Во литературата
постојат податоци дека времето на полуживот на протеините од црниот дроб изнесува
околу 6-10 дена, а кај оние кои влегуваат во состав на мускулното ткиво - околу 180
дена.
4.5. Основи на метаболизмот на протеините
Аминокиселините кои се апсорбирани во дигестивниот систем, како и оние кои

настанале со разградба на телесните протеини, можат да бидат метаболизирани на
следниот начин:
1. Можат да бидат искористени за биосинтеза на нови телесни протеини.
2. Можат да претрпат процес на декарбоксилација, при што карбоксилната
група на аминокиселината се откинува и се одделува во форма на молекул на
јаглерод диоксид. Процесот се одвива под каталитичко дејство на специфични ензими
од класата на лиазите. Во тек на овој процес, покрај СО2, се создаваат и специфични
амини. Овие амини, т.н. биогени амини, се од особена важност за организмот. На
пример, со декарбоксилација на аминокиселината хистидин под каталитичко дејство
на ензимот хистидин декарбоксилаза, се создава биогениот амин хистамин.
3. Можат да бидат вклучени во процес на трансаминација, каде под
каталитичко дејство на специфична аминотрансфераза (трансаминаза),
аминокиселината ја предава својата амино група на кетокиселина. Таков е примерот
на реакцијата на аланинот со α-кето глутарната киселина, под дејство на ензимот
аланин аминотрансфераза (ALT), при што како продукт на реакцијата се добиваат
пирогроздова киселина и глутаминска киселина. Оваа реакција на трансаминација е
реверзибилна и претставува врска помеѓу метаболизмот на протеините, поточно
метаболизмот на аминокиселините од една страна и метаболизмот на јаглехидратите
и липидите од друга страна.
4. Можат да претрпат оксидативна дезаминација која се одвива во два
чекори:
1. одземање на два атоми на водород и
2. адиција на една молекула на вода,
при што како продукт се добиваат соодветна кето киселина и амонијак.
Оксидативната дезаминација на глутаминската киселина се врши под
каталитичкото дејство на ензимот глутамат дехидрогеназа. Овој ензим е присутен во
митохондриите на сите клетки, а особено го има во митохондриите на хепатоцитите.
Амонијакот, како исклучително токсичен, особено за централниот нервен систем,
ефикасно се отстранува од организмот со помош на циклусот за синтеза на уреа која,
главно преку урината, се излачува надвор од организмот. Еден помал дел од амонијакот
се елиминира преку урината во форма на амониумови соли.
Еден дел од аминокиселините кои се присутни во организмот секојдневно
иреверзибилно се деградираат и мора да се надоместуваат преку внесување со
храната. Се смета дека на здрав возрасен човек нормално дневно му се потребни околу
0,8 g протеини на 1 kg телесна маса.
Една од карактеристиките на протеините е тоа што, покрај другите хемиски
елементи, во својот состав содржат азот, и тоа со прилично константна процентуална
застапеност – околу 16% од нивната маса.
Најголемиот дел од азотот што во организмот се внесува преку храната
потекнува од протеините. Исто така и најголемиот дел од излачениот азот од
организмот во форма на деградациони продукти потекнува токму од разложувањето на
протеините, односно аминокиселините. Како резултат на тоа, за изучување на
97
протеинскиот метаболизам е дефиниран поимот азотен биланс, како разлика помеѓу
внесениот и излачениот азот.
Позитивен азотен биланс има кога количеството на внесениот азот е поголемо
од количеството на излачениот азот и е карактеристичен за млади организми во
периодот на раст, во текот на бременоста и кај реконвалесценти.
Негативен азотен биланс се среќава при протеинско гладување, заболувања
на гастроинтестиналниот систем, инфекции, трауми, албуминурија и сл.
Врамнотежен азотен биланс има тогаш кога организмот излачува онолку азот
колку што е внесен, што е случај кај возрасни здрави лица.
Разложувањето на ткивните протеини во услови на протеинско гладување се
одвива со цел да се обезбедат аминокиселини за синтеза на неопходните протеини за
оние ткива што постојано се обновуваат или непрекинато растат: коса, нокти,
епидермис, цревна слузница, крвни клетки, како и за синтеза на ензими и хормони што
имаат протеинска хемиска природа.
За разлика од мастите и јаглехидратите кои можат да се депонираат во
организмот, за протеините е карактеристично тоа што тие не се чуваат како резерва,
туку вишокот аминокиселини влегува во енергетскиот метаболизам.
4.6. Протеини во крвната плазма – основен протеински статус
Крвната плазма претставува комплексен воден раствор во кој се растворени

бројни неоргански и органски соединенија. Околу 93% од крвната плазма отпаѓаат на
водата, а од останатите 7% во најголема мерка се застапени протеините. Протеините
што се среќаваат во крвната плазма имаат најразлични функции:
1. Некои од нив по својата функција се ензими, други се антитела, фактори на
коагулација или пак транспортни протеини.
2. Протеините од крвната плазма имаат и нутритивна функција. Кога
организмот за тоа има потреба, тие можат да бидат хидролизирани во црниот дроб до
аминокиселини, кои повторно можат да бидат искористени како градбени блокови за
синтеза на други протеини. Како алтернатива, овие аминокиселини можат да бидат
дезаминирани до соодветни кето киселини, кои можат да бидат вклучени во
метаболизмот на јаглехидратите или липидите.
3. Друга значајна функција на протеините во крвната плазма е одржувањето на
колоидно-осмотскиот (онкотскиот) притисок во крвта. Поради тоа што
протеинските молекули имаат голема молекулска маса, тие не можат да дифундираат
низ капиларните мембрани, туку се задржуваат во васкуларниот систем каде го
одржуваат колоидно-осмотскиот притисок. На тој начин се одржува нормалниот
волумен на крвта и нормалната содржина на водата во интерстициелната течност и во
ткивата. Всушност албумините, како една од фракциите на тоталните протеини во
крвната плазма, се тие кои имаат најзначајна улога при одржувањето на колоидно-
осмотскиот притисок во крвта. Поради тоа, при значително намалени концентрации на
албумините во крвната плазма водата од крвните садови поминува во
интерстициелната течност и во ткивата, предизвикувајќи отоци.
4. Протеините од крвната плазма учествуваат и во одржувањето на ацидо-
базната рамнотежа.
Познато е дека доколку се земе крв во епрувета без антикоагуланс крвта за

кратко време ќе коагулира, а после центрифугирањето над крвниот коагулум ќе се одвои
крвниот серум. Серумот се разликува од крвната плазма по тоа што тој не го содржи
протеинот фибриноген. Фибриногенот во процесот на коагулацијата се трансформирал
во нерастворлив фибрин, кој пак при центрифугирањето се одвоил од серумот заедно
со крвниот коагулум.
98
Имајќи предвид дека концентрацијата на фибриногенот во крвната плазма
нормално изнесува само околу 2-4 g/L, додека концентрацијата на вкупните протеини
изнесува од 66-87 g/L, сосема е разбирливо што за квантитативно определување на
вкупните протеини вообичаено се користат серумски примероци.
Зголемувањето на концентрацијата на вкупните протеини во крвната плазма над

горната граница на референтните вредности се означува како хиперпротеинемија.
Зголемени концентрации на протеините во крвната плазма, и тоа за 10-15%, се
регистрираат при дехидратација, а ова зголемување се рефлектира право
пропорционално на ниво на сите протеински фракции. При тоа апсолутното количество
на протеините во крвната плазма останува непроменето, но нивната концентрација е
зголемена поради намалениот волумен на растворувачот – водата. Оваа појава се
манифестира при дехидратација воопшто, без оглед на нејзината етиологија:
недоволно внесување на вода во организмот, дијареја и/или повраќање, ацидоза кај
пациенти со Diabetes mellitus.
Изразена хиперпротеинемија е карактеристична кај пациенти со мултипла
миелома2, каде можат да бидат измерени концентрации на вкупните протеини и над 100
g/L. Кај овие пациенти е зголемена концентрацијата само на моноклоналните
имуноглобулини (парапротеини), додека концентрациите на останатите фракции се
главно непроменети.
Хипопротеинемија или намалена концентрација на протеини во крвната

плазма, се среќава кај бројни заболувања и состојби.
Така хипопротеинемија се регистрира кај пациенти со нефротски синдром, каде
големи количества на албумини се исфрлаат преку урината како резултат на
оштетувањето на бубрезите.
Значајни загуби на протеини се карактеристични и при тешки изгореници,
отворени рани и крвавења, улцерозен колит.
Малапсорпцијата и малнутрицијата во подолг временски период исто така
резултираат со намалување на концентрацијата на серумските протеини.
Во клиничката пракса за определување на концентрацијата на вкупните

протеини во серум, односно во плазма, се користи биуретската метода, додека
албумините квантитативно се определуваат со методата со бромкрезол зелено.
Концентрацијата на серумските глобулини се определува како разлика помеѓу вкупните
протеини и албумините. Овие три параметри го дефинираат основниот протеински
статус.
За квантитативно определување на најразлични специфични протеини, се
користат имунотурбидиметриски и имунонефелометриски методи.
2 Мултиплата миелома претставува неопластична пролиферација на плазма клетки кои

продуцираат големо количество на моноклонални имуноглобулини (парапротеини). Овие
парапротеини формираат карактеристичен пик при електрофореза на серумските протеини.
Истовремено плазма клетките продуцираат и големо количество на слободни лесни синџири кои
се појавуваат во урината како Bence-Jones-ов протеин.
99
4.7. Квантитативно определување на вкупни протеини
За квантитативно определување на вкупни протеини во серум или плазма

вообичаено се користи биуретската метода. Оваа метода широко се користи во
биохемијата воопшто, а нам ни е позната од практичната настава по предметот Општа
биохемија каде ја користиме за докажување на присуството на протеини во биолошки
материјал. Се разбира, за клиничка употреба, реагенсите се стандардизирани и
конзервирани, со цел да се постигне неопходната точност и прецизност.
Определувањето на вкупни протеини во серум или плазма ќе го објасниме со обработка
на протоколот број SU-PROT INF 157001 GB 05-2007-16 од производителот Human,
Германија. Оригиналниот протокол се наоѓа закачен на платформата за е-учење. Во
оваа прилика ќе ја објасниме мануелната техника на изработка на анализата, но треба
да знаеме исто така дека оваа метода е автоматизирана и е дел од тест-менито кај
практично сите рутински клиничко-биохемиски анализатори.
Методата се базира на едноставна обоена хемиска реакција. Имено, во алкален
раствор, двовалентните бакарни јони од реагенсот реагираат со протеините од
примерокот за анализа, при што соединенијата кои содржат најмалку две пептидни
врски формираат виолетов комплекс. Апсорбанцијата на овој комплекс е право
пропорционална со концентрацијата на вкупните протеини во примерокот. Оваа метода
спаѓа во групата методи на завршна точка (end-point методи).
RGT:
Натриум хидроксид 200 mmol/L
Калиум натриум тартарат 32 mmol/L
Бакар сулфат 12 mmol/L
Калиум јодид 30 mmol/L
STD:
Протеин 8 g/dL односно 80 g/L

Реагенсот и стандардот ги добиваме во готова форма.
кога се чуваат на 2...25°C.
Примерок:
Протеините во серумот се стабилни до еден месец на температура 2...8°С или до една
недела на температура од 15...25°С.
Постапка:
Бранова должина: 520-580 nm
Температура: 20…25°C
100

Се промешува и се инкубира 10 минути на температура од 20…25C. Се мери

апсорбанцијата на примерокот (ΔAпримерок) и на стандардот (ΔAстандард) наспроти слепата
проба за време од најмногу 30 минути.
Пресметување на концентрацијата на вкупни протеини:
ΔA примерок g
c = 80 × [ ]
Тестот за концентрација на вкупни протеини е линерен во граници до 12 g/dL или 120
g/L. Примероците со повисока концентрација на протеини се разредуваат 1 + 1 со
физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува определувањето на концентарцијата.
Деца над 3 години и возрасни: 66 – 87 g/L
Забелешки:
1. Слепата проба за примерокот (sample blank) за бистри, безбојни примероци е
еквивалентна на 0,2 g/dL и може да се занемари.
Слепата проба за примерокот (sample blank) мора да се одреди доколку се работи со
хемолизиран, липемичен или иктеричен примерок, и тоа на следниот начин: се пипетира
20 µL од примерокот во 1000 µL физиолошки раствор и апсорбанцијата се мери
наспроти дестилирана вода. Апсорбанцијата од слепата проба за примерокот мора да
се одземе од апсорбанцијата на примерокот.
2. Обоениот реагенс (RGT) содржи натриум хидроксид кој е иритабилен и доколку дојде
во контакт со кожа или мукозни мембрани мора обилно да се исплакне со вода.
3. Стандардот (STD) содржи натриум азид како конзерванс (0,095%). Да не се голта. Да
се избегнува контакт со кожа и слузави мембрани.
4. Со стоење на реагенсот (RGT) во него може да се јави слабо таложење. При
изработка на анализата талогот треба да се избегнува.
101
4.8. Квантитативно определување на албумини
И оваа метода, исто како претходната, се базира на едноставна неензимска обоена
хемиска реакција и спаѓа во групата методи на завршна точка. За нејзино подетално
изучување го користиме протоколот број SU-ALBU INF 156001 GB 05-2008-16 од
производителот Human, Германија (закачен на е-учење).
Принципот на методата е следниот: бромкрезол зелено (BCG), во присуство на
цитратен пуфер (рН=4,2), реагира со албумините, при што се формира зелено обоено
комплексно соединение. Апсорбанцијата на комплексот е право пропорционална со
концентрацијата на албумините во примерокот.
RGT:
Цитратен пуфер (рН=4,2) 30 mmol/L
Бромкрезол зелено 260 µmol/L
STD:
Албумини 4 g/dL или 40 g/L

RGT и STD ги добиваме во готова форма.
Тие се стабилни до означениот рок на траење на температура од 2...25°С.
Примерок:
Албумините во серумот се стабилни до еден месец на температура 2...8°С или до една
недела на температура од 15...25°С.
Постапка:
Температура: 20...25°C

Се промешува внимателно и се инкубира 5 минути на температура од 20...25C. Се мери

апсорбанцијата на примерокот (ΔAпримерок) и на стандардот (ΔAстандард) наспроти слепата
проба за време од најмногу 30 мин.
Пресметување на концентрацијата на албумини:
ΔA примерок g
c = 40 × [ ]
102
Методата е линеарна до 7 g/dL или 70 g/L албумини.
Ако концентрацијата на албумини во серумот ја надминува границата на линеарноста,
примерокот се разредува 1 + 1 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува
тестот. Резултатот се множи со 2.
38-51 g/L
Забелешки:
1. Билирубинот во концентрација до 20 mg/dL не му влијае на тестот. Секои 100 mg/dL
хемоглобин условуваат лажно зголемување на концентрацијата на албумините за 0,1
g/dL, поради што хемолизата треба да се избегне.
2. Хемолизата и значителната липемија интерферираат со тестот. Поради тоа кај такви
примероци е неопходно да се направи слепа проба за примерокот (sample blank) и тоа
на следниот начин: се пипетира 10 µL од примерокот во 1000 µL физиолошки раствор и
се мери апсорбанцијата наспроти дестилирана вода. Апсорбанцијата од слепата проба
за примерокот мора да се одземе од апсорбанцијата на примерокот.
3. Стандардот содржи натриум азид. Да не се голта. Да се избегнува контакт со кожа и
мукозни мембрани.
103
4.9. Основни принципи на имунотурбидиметријата и имунонефелометријата
За квантитативно определување на различни специфични протеини, секој од нив

со различно дијагностичко значење, се користат имунотурбидиметриски и
имунонефелометриски методи. Поради тоа, пред да се запознаеме со дијагностичкото
значење на специфичните протеини што најчесто се определуваат во рутинските
клиничко-биохемиски лаборатории, најпрвин ќе се запознаеме со основните принципи
на имунотурбидиметријата и имунонефелометријата.
4.9.1. Реакција помеѓу антиген и антитело
Кога некој растворлив антиген ќе се помеша со соодветно антитело и тоа во

соодветен сооднос, ќе дојде до формирање на преципитат. Ваквиот тип на реакција бил
опишан уште во 1929 година од страна на Heilderberger и Kendall. Тие, во серија од
епрувети во кои имало константно количество на специфично антитело, додавале
постојано повисока концентрација од антигенот и го анализирале количеството на
добиениот преципитат. При тоа била добиена квантитативна имунопреципитациона
крива која е прикажана на Слика 4.4.
Слика 4.4. Квантитативна имунопреципитациона крива
Кај квантитативната имунопреципитациона крива јасно се разликуваат три зони:

1. Зона на вишок на антителото (Ab Excess zone), за која е карактеристично тоа
што нивото на преципитат се зголемува со додавање на сѐ поголемо количество
на антиген. Во оваа зона супернатантот сè уште содржи слободни антитела.
2. Зона на еквиваленција (Equivalence zone), каде има максимална
преципитација и каде супернатантот не содржи ниту слободен антиген, ниту
слободно антитело.
3. Зона на вишок на антигенот (Ag Excess zone), каде поради високата
концентрација на антиген се формираат мали растворливи имунокомплекси и
каде супернатантот содржи слободен антиген.
Оваа квантитативна имунопреципитациона крива ја претставува основата на
сите видови имунопреципитациони техники, вклучувајќи ги тука и
имунотурбидиметријата и имунонефелометријата и често пати се означува како dose-
response curve.
104
При определување на концентрацијата на некој специфичен протеин со
имунотурбидиметриска или имунонефелометриска метода мошне значајно е да се знае
во кој дел од квантитативната имунопреципитациона крива се работи, поради тоа што
едно исто отчитување може да одговара на две сосема различни концентрации на
антигенот, една од левата, а друга од десната страна на кривата. При тоа, важно е да
се нагласи дека неопходно е сите мерења да се вршат на левата страна од кривата,
односно во зоната на вишок на антителото.
4.9.2. Принципи на детекција
Како резултат на меѓусебната реакција помеѓу антигенот и антителото се

формираат нерастворливи имуни комплекси, чие присуство условува турбидност
(заматеност) на растворот.
Ако кон реакциона кивета во која се случила таква реакција се насочи
монохроматска светлина, тогаш еден дел од светлината ќе биде апсорбиран, еден дел
ќе се расее, а еден дел ќе биде пропуштен. Турбидиметријата е заснована на принципот
на мерење на интензитетот на пропуштената светлина. Нефелометријата е заснована
на принципот на мерење на интензитетот на расеаната светлина. На Слика 4.5. се
прикажани принципите на детекција кај турбидиметријата и нефелометријата.
Важно е да се разбере дека имунохемиската реакција во киветата е сосема
идентична и кај турбидиметријата и кај нефелометријата. Она по што се разликуваат
овие две техники е всушност принципот на детекција. И бидејќи единицата за детекција
на интензитетот на пропуштената светлина кај турбидиметријата се базира на обична
спектрофотометрија, всушност секој спектрофотометар со добри технички
карактеристики, автоматизиран или не, би можел да се користи и како турбидиметар.
Од друга страна, постојат специјализирани инструменти кои поседуваат оптичка
единица за нефелометрија, т.н. нефелометри. Како опција, инструментите кои имаат
оптичка единица за флуориметрија може да се користат и во нефелометријата.
d
e
d
c e c
a a
b d e
зголемување на концентрацијата на
нерастворливи имуни комплекси
Легенда:
а – монохроматска светлина која се насочува кон киветата
b – процеп низ кој поминува монохроматската светлина кон киветата
c – реакциона кивета
d – фотодетектори
e – делови за блокирање на светлината
Слика 4.5. Принципи на детекција кај турбидиметријата и нефелометријата
105
4.9.3. Стандардна крива
Стандардната крива претставува дел од левата страна на квантитативната

имунопреципитациона крива, а се добива како резултат на процесот на калибрација.
Калибрацијата се врши на тој начин што се подготвува серија од разредувања
(вообичаено 5 или 6) на калибратор со позната концентрација на испитуваниот аналит,
а потоа се забележува вредноста на сигналот кој е добиен за секое од разредувањата,
односно за секоја од различните концентрации. Се препорачува сите мерења да се
изведуваат во дупликат. Средните вредности од мерењата се користат за изработка на
стандардната крива, која во современите инструменти се конструира софтверски.
Валидноста на стандардната крива секојдневно треба да се проверува со два
контролни серуми: едниот со ниска, а другиот со висока концентрација на испитуваниот
аналит.
На Слика 4.6. е прикажан изгледот на стандардна крива за турбидиметрија и
нефелометрија.
Std.6
Std.5
Std.4
Std.3
Std.2
Std.1
Слика 4.6. Стандардна крива
4.9.4. Значајни елементи на квантитативната имунопреципитациона крива
Постојат неколку значајни карактеристики на квантитативната

имунопреципитациона крива, а тоа се:
 Лимит на детекција,
 Ранг на мерење,
 Критична точка и
 Зона на сигурност.
Тие се прикажани на Слика 4.7.
106
Слика 4.7. Значајни карактеристики на квантитативната имунопреципитациона
крива
Лимитот на детекција (detection limit) се дефинира како концентрација на

антигенот за која тројната вредност на стандардната девијација од добиениот сигнал е
сѐ уште помала од средната вредност на самиот сигнал.
Рангот на мерење (assay range или measuring range) е интервалот помеѓу
најнискиот и највисокиот стандард.
Концентрацијата на најнискиот стандард обично се избира нешто над лимитот
на детекција. Доколку сигналот кој е добиен со мерење на некој од примероците е
понизок од оној кој е добиен за најнискиот стандард, во тој случај инструментот дава
предупредување во облик на порака: “too low” или “below assay range”.
Концентрацијата на највисокиот стандард мора да биде избрана мошне
внимателно. Претходно беше објаснето дека еден ист сигнал може да одговара на две
различни концентрации на антигенот, едната во зоната на вишок на антителото, а
другата во зоната на вишок на антигенот. На тој начин, кај тестови кои не се добро
оптимизирани, лесно може да се јави проблемот означен како вишок на антиген, кој
неминовно води кон издавање на неточни (лажно ниски) резултати. За да се намали
веројатноста за појава на овој проблем неопходно е концентрацијата на највисокиот
стандард да се избере нешто под пикот на квантитативната имунопреципитациона
крива. Ако сигналот од анализираниот примерок е повисок од сигналот добиен за
највисокиот стандард, тогаш инструментот дава предупредување во вид на порака “too
high” или “above assay range”. Во таков случај операторот треба да го разреди
примерокот, да го анализира уште еднаш и добиениот резултат да го помножи со
факторот на дилуција.
Критична точка (critical point) претставува онаа концентрација на антигенот која
се наоѓа од десната страна на имунопреципитационата крива и која продуцира сигнал
кој е сѐ уште повисок од сигналот добиен за највисокиот стандард, но после која секоја
повисока концентрација ќе резултира со погрешна интерполација.
Зоната на сигурност (security range) ја сочинуваат сите концентрации на
антигенот кои се наоѓаат помеѓу вредноста на највисокиот стандард и критичната точка.
Зоната на сигурност може да се зголеми со користење на повисока концентрација на
антителото, што е прикажано на Слика 4.8.
Ризикот да се добие сигнал надвор од зоната на сигурност зависи и од
патофизиолошкиот ранг на концентрации на испитуваниот протеин во дадена телесна
течност. Така на пример, при мерење на концентрациите на специфични протеини од
крвната плазма ризикот е најголем за CRP и IgM, чии концентрации во одредени
патолошки состојби можат да бидат и до 100 пати повисоки во однос на референтните
вредности. Поради тоа производителот на реагенсите мора да обезбеди доволно
висока концентрација на антителото и добра оптимизација на тестот, така што
107
концентрациите на антигенот надвор од зоната на сигурност да не се компатибилни со
ниту една позната патофизиолошка состојба.
1. Ниска концентрација на антителото

2. Средна концентрација на антителото
3. Висока концентрација на антителото
Слика 4.8. Зголемување на зоната на сигурност со користење на повисока

концентрација на антителото
4.10. Приказ на ласерски нефелометар: MININEPHplus
Претходно беше кажано дека секој спектрофотометар со добри технички

карактеристики, автоматизиран или не, би можел да се искористи и како турбидиметар.
И навистина, во тест-менито на голем број автоматски биохемиски анализатори се
среќаваат апликации за определување различни специфични протеини со
имунотурбидиметриски методи.
Од друга страна, постојат специјализирани инструменти кои поседуваат оптичка
единица за нефелометрија, т.н. нефелометри. Некои од нив се комплетно
автоматизирани и имаат капацитет за изработка на голем број анализи во единица
време. Но, постојат и полуавтоматски нефелометри што претставуваат адекватен избор
за оние клиничко-биохемиски лаборатории каде овој тип на анализи не се застапени со
голема фреквенција. Таков е полуавтоматскиот ласерски нефелометар MININEPHplus,
со чии карактеристики подетално ќе се запознаеме.
Но пред тоа, кратко ќе се осврнам на дилемата: која техника да ја избереме во
лабораторијата – турбидиметрија или нефелометрија? Историски, нефелометријата се
карактеризира со повисок степен на сензитивност во однос на конвенционалната
турбидиметрија. Но, со развојот на технологијата на имунотурбидиметрија подобрена
со латекс партикули (latex-enhanced immunoturbidimetry) каде се користат инертни
микроскопски партикули што ги зголемуваат имуните комплекси и ја амплифицираат
реакцијата, оваа разлика во сензитивноста е надмината. Така, клиничко-биохемиските
лаборатории имаат бројни опции, а изборот ќе го направат во зависност од
организацијата на работата и расположливите ресурси.
Инструментот MININEPHplus, од производителот The Binding Site, Велика
Британија, претставува endpoint ласерски нефелометар кој служи за определување на
концентрацијата на различни специфични протеини. Како извор на светлина се користи
ласерска диода која емитува светлина со бранова должина од 670 nm. Оваа светлина
се фокусира кон киветата што ја содржи реакционата смеса, каде комплексите
108
антиген/антитело предизвикуваат нејзино расејување. Расејувањето на ласерската
светлина е право пропорционално со концентрацијата на создадените имунокомплекси,
а се детектира со помош на фотодетектор.
Изгледот на ласерскиот нефелометар MININEPHplus, заедно со вградениот
пипетор, е прикажан на Слика 4.9.
Слика 4.9. Ласерски нефелометар MININEPHplus

(Извор – The Binding Site, Велика Британија)
Методите што ги развил производителот The Binding Site се од комплетно

затворен тип, каде дури и калибрацијата е направена од страна на производителот на
реагенсите. Податоците за калибрацијата, кои се специфични за секоја серија реагенси,
се внесуваат во апаратот со помош на магнетна картичка што ја има во секое пакување.
4.10.1. Начин на изработка на анализи на ласерскиот нефелометар MININEPHplus
Детални инструкции за работа со ласерскиот нефелометар Minineph се дадени

на веб-страната на производителот. Овде накусо ќе ги презентираме најважните чекори:
1. Најпрвин се избира кодот на анализата која сакаме да ја изработиме. Се
провлекува магнетната картичка со податоци и се проверуваат реагенсите и
дилуцијата.
2. Во реакционата кивета се става магнетно стапче.
3. На дното на реакционата кивета внимателно се пипетира примерокот
(разреден или неразреден, зависно од анализата).
4. Реакционата кивета внимателно се става на мерното место во апаратот.
5. Со помош на вградениот пипетор се пипетира точно определен волумен од
антисерумот.
6. Се прави воздушен простор во продолжетокот.
7. Во истиот продолжеток се пипетира точно определен волумен од
реакциониот пуфер.
8. Содржината од продолжетокот (антисерум и реакционен пуфер) се пипетира
во реакционата кивета.
9. Пипеторот се враќа на своето место, а апаратот автоматски почнува со
работа – со магнетното стапче ја меша реакционата смеса.
10. На крајот од анализата на дисплејот се прикажува конечниот резултат, со
вкалкулиран фактор на дилуција.
109
4.11. Дијагностичко значење на некои специфични протеини
Современата лабораториска апаратура и реагенси нудат можности за рутинско

квантитативно определување на поголем број специфични протеини, при што секој од
нив има свое дијагностичко значење. Во рамките на овој курс ќе бидат обработени само
дел од нив, и тоа оние кои најчесто се определуваат во рутинските клиничко-биохемиски
лаборатории.
1. Ц-реактивниот протеин (CRP) е протеин на акутната фаза. Се синтетизира
во црниот дроб. Во нормални услови неговите серумски концентрации се многу ниски.
Референтните вредности изнесуваат до 10 mg/L. При инфламација неговата
концентрација расте многу бргу, па покачени вредности во серумот можат да се
детектираат само по 6 часа од започнувањето на процесот. Неговите серумски
концентрации растат и како одговор на траума и ткивна некроза. По надминување на
причината која довела до негово покачување, серумските концентрации на Ц-
реактивниот протеин бргу се намалуваат. Поради сево ова, Ц-реактивниот протеин се
смета за најзначаен и клинички најкорисен индикатор за инфекција, инфламација,
траума и ткивна некроза, и има особено широка и разновидна клиничка примена.
Благо покачени вредности на Ц-реактивниот протеин (од 10-40 mg/L) се
асоцирани со блага инфламација и вирусни инфекции. Значително повисоки
концентрации (од 40-200 mg/L) се асоцирани со акутна фаза на инфламација и
бактериски инфекции.
Во рамките на референтните вредности, кај пациенти кај кои нема клинички
знаци за инфекција и инфламација, Ц-реактивниот протеин се користи како
дополнителен, неконвенционален биомаркер за проценка на степенот на
кардиоваскуларниот ризик. За оваа цел се користи метода со висока сензитивност
(hsCRP).
2. Ревматскиот фактор (RF) претставува една хетерогена група на
автоантитела што се насочени кон сопствените имуноглобулини. Тие се создаваат од
страна на плазма клетките што се присутни на местото на оштетувањето на ткивото. Се
смета дека во улога на иницијален антиген се јавуваат вируси или вирусни антигени
присутни во зглобовите.
Високите концентрации на RF кај пациенти со ревматоиден артрит се индикатор
за полоша прогноза на заболувањето. Покачени вредности на RF, но во многу понизок
степен, се среќаваат и кај пациенти со лупус, хепатит, цироза, сифилис и др.
3. Трансферинот е протеин во крвната плазма чија главна функција е врзување
и транспорт на железото. Неговата концентрација е регулирана од достапноста на
железото во крвната плазма, при што ниски концентрации на железо условуваат пораст
на концентрацијата на трансферинот. Негови зголемени серумски концентрации се
регистрираат и при бременост и терапија со естрогени хормони. Намалените серумски
концентрации на овој протеин се асоцирани со хронични инфекции, малигни
заболувања и заболувања на црниот дроб и бубрезите.
4. Хаптоглобинот е гликопротеин кој има способност да го врзува слободниот
хемоглобин од крвната плазма. На тој начин хаптоглобинот ја спречува екскрецијата на
хемоглобинот преку бубрезите, а со тоа и бубрежното оштетување. Познато е дека
хемоглобинот претставува главен функционален протеин на еритроцитите и дека во
крвната плазма нормално нема хемоглобин. Но при хемолиза in vivo хемоглобинот
преминува во крвната плазма, се врзува за хаптоглобинот и како таков се транспортира
во црниот дроб за понатамошно метаболизирање.
Намалени серумски концентрации на хаптоглобин се среќаваат при хемолитичка
анемија, но исто така можат да индицираат деструкција на еритроцитите кај таласемија
или српеста анемија. При различни заболувања на црниот дроб можат да се
детектираат ниски серумски концентрации на хаптоглобин, поради неговата намалена
синтеза.
110
5. β2-микроглобулинот е протеин со мала релативна молекулска маса кој се
среќава на површината на клетките кои имаат јадро и претставува компонента на
хистокомпатибилниот комплекс.
Поради малата релативна молекулска маса β2-микроглобулинот го поминува
гломеруларниот филтер, но потоа речиси целосно се реапсорбира на ниво на
проксималните тубули. Поради тоа, во нормални услови, во урината го има само во
траги. Покачени концентрации на β2-микроглобулинот во урината се среќаваат при
тубуларна протеинурија.
Покачени серумски концентрации на овој протеин се асоцирани со бубрежни
заболувања и ревматоиден артрит. Покачени серумски концентрации се среќаваат и кај
пациенти со мултипла миелома, но и кај некои други малигни заболувања.
6. Дијагностичкото значење на аполипопротеините А I и B-100 е обработено во
поглавјето за липиди.
Освен претходно споменатите, специфични серумски протеини со дијагностичко
значење се и следните: α1-кисел гликопротеин, α1-антитрипсин, аполипопротеин Е,
церулоплазмин, комплемент Ц3, комплемент Ц4, цистатин Ц, имуноглобулините (IgA,
IgM и IgG) и др. Дијагностичкото значење на овие специфични протеини ќе го изучиме
преку обработка на дополнителна литература и изработка на семинарски работи.
4.11.1. Определување на CRP со метода на аглутинација – Квалитативна и

семиквантитативна метода
Слободно може да се каже дека од сите специфични протеини, CRP е протеинот

што најчесто се определува во рутинските клиничко-биохемиски лаборатории. Погоре
објаснивме дека неговите серумски концентрации можат да се определуваат со
имунотурбидиметриска или имунонефелометриска метода. Исто така кажавме дека
постојат и методи со висока сензитивност за определување на ниските концентрации
на CRP со висока точност.
Освен овие методи, за рутинско квалитативно или семиквантитативно
определување на CRP во серум многу често се користи и методата на аглутинација.
Принципот на методата и овде се базира на специфична реакција антиген-антитело, но
во овој случај антителата се нанесени на специјални латекс партикули. Со мешање на
еднакви количества од реагенсот (антитело) и примерокот за анализа, се набљудува
присуството или отсуството на аглутинација. Присуството на аглутинација е позитивен
наод (Слика 4.10).
1. Присуство на аглутинација (позитивен наод)

2. Отсуство на аглутинација (негативен наод)
Слика 4.10. Квалитативно определување на CRP со метода на аглутинација

(Извор – Arlington Scientific, Inc.®, Соединети Американски Држави)
Со подготовка на серија на разредувања од примерокот за анализа, можно е

семиквантитативно определување концентрацијата на CRP во примерокот. Протоколот
е закачен на платформата за е-учење.
111
Слично како за CRP, и за RF исто така постои метода со аглутинација. Техниката
на изработка на анализата е идентична.
4.12. Определување на концентрацијата на фибриноген во крвната плазма
Фибриногенот е протеин од крвната плазма кој учествува во процесот на

коагулација на крвта како прекурсор на фибринот. Каскадата реакции што се одвиваат
во процесот на коагулација на крвта детално се изучува во рамките на предметот
Физиологија.
Од друга страна, фибриногенот претставува и протеин на акутната фаза, па
поради тоа неговите концентрации растат како одговор на инфламација, инфекција и
траума. Покачени концентрации на фибриноген во крвната плазма се среќаваат и во
текот на бременоста. Освен тоа, концентрациите на фибриноген во крвната плазма
позитивно корелираат со ризикот за појава на коронарна артериска болест, инфаркт на
миокардот и мозочен удар.
Намалени плазматични концентрации на фибриноген се среќаваат кај пациенти
со дисеминирана интраваскуларна коагулација, системска фибринолиза и тешка
хепатална дисфункција.
Поради потенцијалот за широка клиничка употреба, од особена важност е
постоењето на точна, сигурна и прецизна метода за негово квантитативно
определување.
Постои метода за определување на концентрацијата на фибриноген во крвната
плазма која се базира на принципот на трансформирање на фибриногенот во фибрин
со помош на тромбин, издвојување и плакнење на создадениот фибрин, негово
растворање во раствор на натриум хидроксид и на крај мерење на концентрацијата на
растворениот фибрин со биуретска метода.
Меѓутоа, оваа метода веќе е напуштена и е заменета со методата заснована на
принципот на мерење на биолошката активност на фибриногенот, односно мерење
на брзината на конверзија на фибриногенот во фибрин во услови на вишок на
тромбин. Оваа метода е позната како метода на Clauss. При тоа, концентрацијата
фибриноген во испитуваниот примерок е обратно пропорционална со времето на
коагулација. За квантитативно определување на фибриногенот во испитуваните
примероци се подготвува калибрациона крива.
За определување на концентрацијата на фибриноген со методата на Clauss
неопходен е апарат кој се нарекува коагулометар. На Слика 4.11. е прикажан
едноставен коагулометар за мануелна изработка на анализите, модел Thrombotimer.
а) Надворешен изглед на инструментот

б) Шематски приказ на киветата во која се изработува анализата
Слика 4.11. Приказ на коагулометарот Thrombotimer

(Извор – Behnk Elektronik, Германија)
112
Коагулометарот Thrombotimer работи на следниот начин:
1. Во реакционата кивета се става челично топче кое се придвижува со помош
на ротирачкиот магнет кој е стациониран во апаратот, непосредно под
киветата.
2. Континуираното мешање на реакционата смеса со помош на челичното
топче овозможува формирање на хомоген фибрин во моментот кога
започнува коагулацијата.
3. Формираниот фибрин се детектира оптички со помош на диода која емитува
светлина и фотодиода како приемник на сигналот.
4. На дисплејот се отчитува времето на коагулацијата.
За анализа се користи цитратна плазма. При тоа, особено е важно да се

обезбеди правилно земање на крв и полнење на моноветата (вакуетата) до ознаката.
На тој начин се обезбедува адекватен сооднос помеѓу примерокот за анализа и
антикоагулансот.
4.13. Протеини во урина
Протеинуријата се дефинира како присуство на протеини во урината во

концентрации повисоки од референтните вредности.
Бубрежната гломеруларна базална мембрана претставува филтер за
протеините од крвната плазма. Степенот на преминување на одреден протеин од
крвната плазма низ гломеруларната базална мембрана е обратно пропорционален со
релативната молекулска маса на протеинот, а право пропорционален со неговата
концентрација во крвната плазма. Така, во нормални услови, плазматичните протеини
со голема релативна молекулска маса речиси не се присутни во гломеруларниот
филтрат, додека албумините, кои имаат помала релативна молекулска маса и кои се
присутни во плазмата во повисоки концентрации, можат во извесна мерка да го поминат
гломеруларниот филтер. Протеините со најмала релативна молекулска маса најлесно
се филтрираат, но поради нивната ниска концентрација во крвната плазма тие се
присутни во гломеруларниот филтрат во мало количество.
Количеството на плазматични протеини кое конечно ќе се екскретира преку
урината зависи од нивната реапсорпција на ниво на проксималните тубули, која исто
така е обратно пропорционална со големината на молекулите. Така, доколку
тубуларната функција е нормална, малите протеини, како што е β2-микроглобулинот,
се реапсорбираат речиси целосно.
Нормално, само мало количество плазматични протеини, и тоа главно албумини,
се екскретираат преку урината.
Во урината нормално се среќава и Tamm-Horsfall-овиот (глико)протеин кој не
потекнува од крвната плазма, туку се секретира на ниво на Henle-овата петелка.
Неговата функција не е целосно објаснета.
Референтните вредности за протеини во урината изнесуваат од 50-80 mg/24h во
мирување. Голем број клиничко-биохемиски лаборатории ја користат референтната
вредност: <100 mg/24h. Количеството на екскретирани протеини може да порасне и до
300 mg/24h во услови на физички напор.
Прв знак за зголемена пермеабилност на гломеруларната базална мембрана е
зголемената концентрација на албумини во урината.
Присуството пак на протеини со голема релативна молекулска маса во урината
е знак за губење на селективноста на гломеруларната базална мембрана.
Зголемената концентрација на протеини со мала релативна молекулска маса во
урината е знак за нарушена тубуларна реапсорпција.
113
Протеинуријата може да се класифицира на следниот начин:
1. Гломеруларна протеинурија,
2. Тубуларна протеинурија,
3. Протеинурија поради висока концентрација на одреден протеин со
мала релативна молекулска маса во плазмата (overload proteinuria) и
4. Постренална протеинурија.
Гломеруларната протеинурија се јавува како резултат на зголемената

пропустливост на гломеруларната базална мембрана. Поради тоа што најголем дел од
екскретираните протеини се албумини, таа често се означува и како албуминурија.
Функционалната протеинурија е бенигна форма на гломеруларна протеинурија
и се јавува како резултат на промените на протокот на крвта низ гломерулите. Таа се
среќава при интензивна физичка активност, висока телесна температура, изложеност
на студ, срцева слабост и хипертензија. Екскрецијата на протеини при функционална
протеинурија изнесува до 1 g/24h.
Ортостатската протеинурија претставува еден вид на функционална
протеинурија што е поврзана со исправената положба на телото. Екскрецијата на
протеини при овој вид протеинурија може да надмине 1 g/24h. Доколку ортостатската
протеинурија е краткотрајна тогаш таа најчесто е бенигна, но доколку перзистира и
доколку секогаш не е поврзана со положбата на телото, неопходно е да се контролира
екскрецијата на протеини секои 6 месеци, најдобро со квантитативна метода.
Во тек на бременоста екскрецијата на протеини нормално може да порасне и
до 200-300 mg/24h. Меѓутоа, при прееклампсија количеството на екскретирани протеини
расте и до 3 g/24h.
Со микроалбуминуријата се запознавме во поглавјето каде се обработени
клиничко-биохемиските методи за дијагностицирање и следење на шеќерната болест.
Тубуларната протеинурија се карактеризира со појава на протеини со мала

релативна молекулска маса во урината, што е резултат на намалената реапсорпција од
страна на проксималните тубули. Таа може да се јави самостојно или пак заедно со
гломеруларната протеинурија.
Акутна тубуларна протеинурија може да се јави при изгореници, акутен
панкреатит, примање на ренотоксични лекови и труење со тешки метали. Таа обично е
реверзибилна.
Хроничната тубуларна протеинурија обично е иреверзибилна. Таа може да
биде вродена или стекната. Во некои случаи лесната тубуларна протеинурија може да
биде единствен знак за прогресивно бубрежно заболување.
Најчесто користен маркер за тубуларна протеинурија е β2-микроглобулинот.
Протеинуријата поради висока концентрација на одреден протеин со мала

релативна молекулска маса во плазмата (overload proteinuria) може да се
манифестира како:
а) Хемоглобинурија (при силно изразена хемолиза),
б) Миоглобинурија (при рабдомиолиза) или
в) Bence-Jones протеинурија (при мултипла миелома).
Постреналната протеинурија вообичаено се јавува како резултат на

инфламација или карцином. Присуството на воспалителен процес се потврдува со
микроскопски преглед на уринарниот седимент.
114
4.13.1. Определување на албумини во урина со тест-ленти
Определувањето на албумини во урина со тест-ленти се базира на принципот на

протеинска грешка на индикаторот. Имено, при константна вредност на рН, промената
на бојата на индикаторот е резултат на неговата реакција со албумините што се
присутни во примерокот за анализа. Како индикатор обично се користи
тетрабромфенол сино. Бојата на полето се менува од жолта во зелена до зелено-
сина, а интензитетот на обојување е право пропорционален со концентрацијата на
албумини во примерокот.
Тестот главно ги детектира албумините.
Методата е семиквантитативна.
За анализа се користи свежа, нецентрифугирана, добро промешана урина.
Начинот на манипулација со тест-лентите и техниката на изведување на анализата се
објаснети во поглавјето каде се опишани методите за дијагностицирање и следење на
шеќерната болест.
Најниската концентрација на албумини што може да се измери со оваа метода
варира кај тест-лентите од различни производители, но обично изнесува околу 100-150
mg/L.
Доколку урината во која се определуваат албумини со оваа метода е алкална
(рН>9), тогаш се добива лажно позитивен резултат. Контаминацијата на примерокот со
остатоци од детергенти и дезинфициенси може исто така да даде лажно позитивен
резултат
4.13.2. Определување на протеини во урина со сулфосалицилна киселина
За изработка на оваа анализа како реагенс се користи раствор на

сулфосалицилна киселина (C7H6O6S x 2H2O) со концентрација од 0,79 mol/L.
Подготовка на реагенсот: Се мерат 20 g сулфосалицилна киселина и се
раствораат во околу 80 mL дестилирана вода во одмерна тиквичка од 100 mL, а потоа
тиквичката се надополнува со дестилирана вода до ознаката.
Изработка на анализата: Во епрувета се става околу 5 mL бистра урина (ако е
потребно претходно урината се центрифугира) и во неа се додаваат, капка по капка,
неколку капки, а најмногу 5, сулфосалицилна киселина. Заматувањето укажува на
присуство на протеини.
За да се види заматувањето појасно, епруветата се гледа наспроти светлина и
се споредува со друга епрувета во која е ставена само урината, без додаток на реагенс.
Интерпретација на тестот: Тестот со сулфосалицилна киселина е изразито
осетлив.
а) Присуството на протеини во урината во концентрација од 10 mg/L дава слаба
опалесценција.
б) Протеини во концентрација од 100 mg/L предизвикуваат заматување.
в) Протеини во концентрација од 500 mg/L даваат густо заматување.
г) Протеини во концентрација од 1000 mg/L даваат талог после кратко стоење.
Поради особено големата осетливост, доколку тестот со сулфосалицилна
киселина дава само сосема слаба и одвај видлива опалесценција, истиот не треба да
се смета за позитивен.
Овој тест е позитивен во присуство на албумини, глобулини и Bence-Jones-ов
протеин.
Интерференции: Присуството на урати може да предизвика лажно позитивна
реакција со сулфосалицилната киселина.
115
4.13.3. Определување на протеини во урина со пирогалол црвено – квантитативна
метода
За квантитативно определување на протеини во урина се користи 24-часовна урина, без

конзерванс. Начинот на собирање на урината и подготовката на примерокот за анализа
детално се опишани во воведното поглавје. Најдобро е анализата да се изврши веднаш,
во спротивно примерокот може да се чува до 48 часа на температура од 2...8°С.
Пирогалол црвено реагира со молибдат при што се создава црвен комплекс. Кога овој
комплекс ќе реагира со протеините што се присутни во примерокот за анализа се
формира нов комплекс со сино-виолетова боја, кој се фотометрира на 600 nm.
Вредноста на апсорбанцијата е право пропорционална со концентрацијата на протеини
во примерокот.
Ограничувања на методата:
За примероците што се контаминирани со хемоглобин можат да се добијат лажно
покачени вредности.
За примероците што содржат Bence-Jones-ов протеин можат да се добијат лажно
пониски вредности од реалните. Поради тоа, доколку постои сомнеж за присуство на
Bence-Jones-ов протеин во примерокот, истиот треба дополнително да се анализира со
погодна техника (електрофореза, имунохемиски методи).
50-80 mg/24h во мирување
до 300 mg/24h при физички напор
Забелешка:
1. Истата оваа метода се користи и за квантитативно определување на протеини во
цереброспинална течност.
4.14. Комплетен преглед на урина
Иако надвор од генералниот контекст за анализа на протеини, сметам дека

откако проговоривме за анализата на уринарните протеини, и претходно за
определување на глукоза и кетонски тела во урината, ова е добра прилика подетално
да се запознаеме со комплетниот преглед на урината и особено со анализата на
уринарниот седимент.
Како што беше кажано во воведното поглавје, комплетниот преглед на урина се
состои од два дела: хемиски преглед и преглед на уринарниот седимент. Хемискиот
преглед на урина во современите клиничко-биохемиски лаборатории се изведува со
помош на тест-ленти. Анализата на уринарниот седимент стандардно се врши со
микроскопирање.
Техниката на изработка на комплетен преглед на урина е следната:
1. Во центрифугална епрувета се става свежа промешана урина и се
изработува хемискиот преглед со тест-лента.
2. Урината се центрифугира.
3. Со брзо превртување на епруветата се отстранува супернатантот.
4. Уринарниот седимент се нанесува на предметно стакло и се анализира со
помош на светлосен микроскоп.
За изучување на сите параметри од хемискиот преглед на урината и елементите
од уринарниот седимент во рамките на овој курс ќе го користиме прирачникот со наслов
„Анализа на урината со тест ленти, уринарен седимент и интерпретација на
резултатите“ од проф. д-р Тодор Груев.
За жал, кај нас во последно време како да не ѝ се посветува доволно внимание
на анализата на уринарниот седимент. Од друга страна, на светскиот пазар веќе се
достапни автоматски анализатори за уринарен седимент, што говори за важноста на
оваа анализа. Некои од овие автоматски анализатори нудат комплетно решение за
анализа на урината, односно изработуваат и хемиски преглед и анализа на уринарен
116
седимент на една интегрирана платформа (на пример инструментот ARKRAY AUTION
HYBRID AU-4050), додека други се наменети само за анализа на уринарниот седимент
(на пример UriSed mini). Технолошките решенија кои се применети кај овие анализатори
се различни. Сигурно во иднина ќе бидеме сведоци и на нови, пософистицирани
технолошки решенија за изработка на комплетниот преглед на урината и особено на
уринарниот седимент.
Во продолжение, на Слика 4.12. е прикажан формулар за внесување на
параметрите од комплетниот преглед на урина, со нивните референтни вредности.
Слика 4.12. Формулар за комплетен преглед на урина
117
5. ДЕГРАДАЦИОНИ ПРОДУКТИ
Во клиничката биохемија деградационите продукти можеме да ги дефинираме

како крајни продукти на метаболизмот на некои органски соединенија кај човекот, кои
имаат точно дефинирано дијагностичко значење. Во групата на деградациони продукти
спаѓаат: билирубинот, уреата, креатининот и мочната киселина. За да можеме да го
разбереме дијагностичкото значење на секој од овие параметри неопходно е да го
познаваме нивниот метаболизам, поточно начинот на кој секој од нив се генерира и
елиминира од човековиот организам.
Така, во ова поглавје, за секој од четирите деградациони продукти најпрвин ќе се
запознаеме со основите на нивниот метаболизам, а потоа и со дијагностичкото значење
и со начинот на нивно квантитативно определување.
5.1. Билирубин
Билирубинот претставува краен продукт на метаболизмот на непротеинскиот

дел од молекулата на порфиринските хромопротеиди: хемоглобинот, миоглобинот,
цитохромите, пероксидазата и каталазата. Билирубинот во организмот се создава
континуирано, во количество од околу 400-500 μmol (240-300 mg) дневно. Во најголем
процент (85-90%) тој потекнува од катаболизмот на хемоглобинот што се одвива во
ретикулоендотелните клетки на слезената, коскената срцевина и црниот дроб.
По отстранувањето на протеинскиот дел од молекулата на хемоглобинот,
тетрапиролскиот прстен на хемот се оксидира со помош на ензимот хем оксигеназа и се
трансформира во тетрапиролски синџир. Тетрапиролскиот синџир, продукт на оваа
реакција е всушност пигментот биливердин кој има зелена боја. Во тек на оваа реакција
се ослободува и железото од хемот. Понатаму, под дејство на ензимот биливердин
редуктаза биливердинот се трансформира во жолто-портокалов билирубин.
Железото и протеинската компонента кои се добиваат со разградувањето на
хемоглобинот понатаму повторно можат да бидат искористени (рециклирани) од страна
на организмот.
Хемиската структура на хемоглобинот и на хемот како негова непротеинска
компонента детално ги изучивме во рамките на предметот Општа биохемија.
Метаболизмот на хемот и биосинтезата на билирубинот детално се изучуваат во
рамките на предметот Клеточна биохемија. Во оваа прилика ќе се потсетиме само на
хемиската структура на самиот билирубин (Слика 5.1).
Слика 5.1. Структурна формула на билирубинот
Од ретикулоендотелните клетки билирубинот постепено поминува во крвта.

Поради тоа што билирубинот практично е нерастворлив во вода истиот може да се
транспортира само доколку е врзан за албумините од крвната плазма. Билирубинот кој
е врзан за албумините се означува како неконјугиран билирубин (неговата конјугација
со глукуронска киселина се случува подоцна, во хепатоцитите). Друг, широко прифатен
назив за неконјугираниот билирубин е индиректен билирубин кој потекнува од таму што
118
неговата концентрација не може да се измери директно со диазо реакција, туку само
после реакцијата за отстранување на албумините со помош на акцелератор.
Неконјугираниот билирубин, врзан за албумините, брзо се транспортира во
црниот дроб каде се одвива хепаталната фаза на неговиот метаболизам.
Преземањето на билирубинот од страна на хепатоцитите се одвива на тој начин
што најпрвин врз надворешната мембрана на хепатоцитите се врши разложување на
билирубин-албумин комплексот. Албумините остануваат во крвта, а билирубинот се
поврзува со специфичните интрацелуларни носачи кои го транспортираат до
ендоплазматичниот ретикулум.
На ниво на ендоплазматичниот ретикулум на хепатоцитите, билирубинот се
конјугира со глукуронската киселина. Конјугираниот билирубин се одликува со тоа
што е растворлив во вода. Друг, широко прифатен назив за конјугираниот билирубин
е директен билирубин кој доаѓа од таму што неговата концентрација може да се
определи директно со диазо реакција.
По напуштањето на хепатоцитите сосема мал дел од конјугираниот билирубин
се враќа во крвта, додека најголемиот дел влегува во состав на жолчката и се излачува
во дуоденумот, каде започнува цревната фаза во метаболизмот на билирубинот.
Конјугираниот билирубин не се апсорбира од страна на интестиналната мукоза.
Во луменот на тенкото црево доаѓа до негова хидролиза при што глукуронската
киселина се ослободува, а самиот билирубин, под дејство на ензимите од
микроорганизмите кои ја чинат нормалната цревна флора, се редуцира до:
уробилиноген, мезобилиноген и стеркобилиноген.
Понатамошниот метаболен пат на уробилиногенот е следниот:
1. Мал дел од уробилиногенот влегува во ентерохепаталната циркулација, се
пренесува до црниот дроб, а од таму во жолчката и потоа повторно во цревата.
2. Сосема мал процент од уробилиногенот влегува во системската циркулација
и преку бубрезите се исфрла со урината.
3. Најголем дел од уробилиногенот, заедно со мезобилиногенот и
стеркобилиногенот, преминува во дебелото црево. Тука, повторно под дејство
на ензимите на цревната флора тие се оксидираат до уробилин, мезобилин и
стеркобилин, кои се исфрлаат со фецесот3.
Нормално во крвта се наоѓа извесно количество и на неконјугиран и на
конјугиран билирубин, кои заедно го чинат вкупниот билирубин. Уробилиногенот
во урината исто така нормално го има во мали концентрации. Кај здрави лица
билирубин во урината не е присутен.
Нарушувањата во метаболизмот на билирубинот се манифестираат со
зголемување на неговата концентрација во крвта над горната граница на референтните
вредности, состојба која се означува како хипербилирубинемија. Клиничка
манифестација на хипербилирубинемијата е жолтицата (icterus). При високи
концентрации на конјугираниот билирубин во крвта истиот се екскретира преку урината.
Постојат различни класификации на жолтицата. При тоа, многу често се среќава
поделбата на:
1. Прехепатална (хемолитичка),
2. Хепатална (хепатоцелуларна) и
3. Постхепатална (опструктивна) жолтица.
1. Хемолитичката жолтица е резултат на засилена хемолиза (на пример кај
хемолитичка анемија) поради која се генерира големо количество билирубин во
ретикулоендотелните клетки, што резултира со појава на хипербилирубинемија.
2. Кај хепатоцелуларната жолтица и покрај создавањето на нормално количество
билирубин во ретикулоендотелните клетки, функционално инсуфициентните
3
Стеркобилиногенот, мезобилиногенот и уробилиногенот и се безбојни за разлика од
стеркобилинот, мезобилинот и уробилинот кои се обоени супстанции и кои го даваат
обојувањето на фецесот.
119
хепатоцити не се во состојба комплетно да го метаболизираат истиот, што резултира
со покачување на неговата концентрација во крвта.
3. Кај опструктивната жолтица билирубинот во ретикулоендотелните клетки
нормално се создава, а нормална е и функцијата на хепатоцитите. Меѓутоа, поради
опструкција на жолчните патишта, билирубинот не се транспортира во тенкото црево
туку се враќа назад во крвта, каде концентрацијата му расте.
Покрај наведените видови жолтица постојат и вродени нарушувања на

метаболизмот на билирубинот кои исто така се манифестираат со
хипербилирубинемија. Во оваа група спаѓаат:
1. Gilbert синдром. –Претставува бенигна состојба што се манифестира со
блага неконјугирана хипербилирубинемија. Се среќава кај 3-5% од
популацијата. Серумските концентрации на вкупниот билирубин кај овие лица
се движат од 26-51 µmol/L. Тестовите за проценка на функцијата на црниот
дроб се во рамките на референтните вредности. Билирубин во урина не е
присутен. Не е потребен медицински третман за оваа состојба и овие
пациенти водат нормален живот.
2. Crigler-Najjar синдром, тип 1. –Претставува ретко заболување кое е
последица на комплетното отсуство на ензимот уридин дифосфат
глукуронилтрансфераза, ензим кој ја катализира реакцијата на конјугација на
билирубинот со глукуронската киселина. Ова заболување се манифестира со
екстремно високи серумски концентрации на неконјугиран билирубин.
Повеќето пациенти умираат во текот на првата година од животот како
последица од керниктерус (енцефалопатија што се јавува поради крајно
високите концентрации на билирубин кои доведуваат до трајно оштетување
на мозокот). Единствена ефикасна терапија е рана трансплантација на
црниот дроб.
3. Crigler-Najjar синдром, тип 2. –Претставува ретко заболување кое е
последица од парцијален дефицит на ензимот уридин дифосфат
глукуронилтрансфераза. Серумските концентрации на неконјугираниот
билирубин кај овие лица се движат од 85-340 µmol/L. Вообичаено, терапија
со фенобарбитал доведува до драматично подобрување на состојбата.
4. Lucey-Driscoll синдром. –Ова заболување е условено од присуството на
циркулирачки инхибитор на конјугацијата на билирубинот. Се манифестира
со блага хипербилирубинемија која е присутна само во првите 2-3 недели од
животот.
5. Dubin-Johnson и Rotor синдроми. –Се манифестираат со жолтица каде е
покачен конјугираниот билирубин, со само незначителен пораст на
неконјугираниот билирубин. Кај Dubin-Johnson синдромот дополнително се
јавува црна пигментација на хепарот. Двете состојби се бенигни.
Постојат исто така неколку видови жолтица кај новороденчињата кои можат да
се поделат во две групи:
а) Неконјугирана хипербилирубинемија и
б) Конјугирана хипербилирубинемија.
Неконјугираната хипербилирубинемија кај новороденчињата може да биде:
1. Физиолошка жолтица кај новороденчињата. –Се јавува во првите денови
од животот и трае помалку од 2 недели. Фактори кои го условуваат овој тип
жолтица се следните:
a. Краток живот на еритроцитите кај новороденчињата,
b. Релативен недостиг на ензимот уридин дифосфат
глукуронилтрансфераза во првите неколку денови од животот и
c. Влијание на инхибитори на конјугацијата на билирубинот од
мајчиното млеко.
120
Физиолошката жолтица кај новороденчињата се третира со фототерапија.
Светлината од околу 450 nm предизвикува промена на конфигурацијата на trans-
билирубинот во cis-билурубин кој е порастворлив во вода и така полесно се
отстранува од организмот.
2. Хемолитичка болест кај новороденчињата. –Се јавува како резултат на
некомпатибилност на Rh-факторите на мајката и новороденчето. Се
манифестира со неконјугирана хипербилирубинемија и постои опасност од
керниктерус.
3. Хипербилирубинемија која е резултат на доење. –Причината е непозната.
Ако перзистира, се прекинува доењето.
Конјугираната хипербилирубинемија кај новороденчињата може да се јави
како:
1. Идиопатски неонатален хепатит.
2. Билијарна атрезија. –Се јавува како резултат на аномалии во развојот на
жолчните канали. Поради тоа, жолчката се акумулира во хепарот, што во
крајна линија резултира со појава на мешана хипербилирубинемија.
Третманот е хируршки.
Определувањето на концентрацијата на вкупниот билирубин во серум е една од

најчестите анализи што се изработуваат во рутинските клиничко-биохемиски
лаборатории. Определувањето пак на концентрацијата на конјугираниот билирубин и
пресметувањето на концентрацијата на неконјугираниот билирубин како разлика помеѓу
вкупниот и конјугираниот билирубин има клиничко значење само во случаите каде
постои хипербилирубинемија која не е следена со патолошки вредности на останатите
тестови за проценка на функцијата на црниот дроб, како што се на пример хепаталните
ензими. Таков е случајот со вродените нарушувања на метаболизмот на билирубинот и
жолтицата кај новороденчиња.
За билирубинот е карактеристична изразита фотосензитивност, па поради тоа
примероците што се користат за определување на неговата концентрација треба да
бидат заштитени од светлина.
121
5.1.1. Определување на вкупен и директен билирубин во серум или плазма
(фотометриски тест – модифицирана Jendrassik/Gróf метода)
За квантитативно определување на билирубинот постојат повеќе методи, и тоа:

1. Методи базирани на диазо реакцијата,
2. Метода на директна спектрофотометрија,
3. HPLC-методи,
4. Ензимски методи и
5. Транскутано мерење на билирубинот.
Сепак, во клиничката пракса најчесто се користат методите базирани на диазо
реакцијата. Една од нив е токму модифициранaта Jendrassik/Gróf метода. Оваа метода
ќе ја изучиме преку обработка на протоколот број SU-BILDT INF 1074001 GB 11-2008-15
од производителот Human, Германија. Овој протокол е закачен на платформата за е-
учење. Во рамките на овој курс квантитативното определување на вкупниот и
директниот билирубин ќе го извршиме со мануелна метода.
Меѓутоа, треба да се нагласи исто така дека определувањето на вкупниот и директниот
билирубин со методи базирани на диазо реакцијата е автоматизирано и претставува
дел од тест-менито на сите автоматски биохемиски анализатори.
Билирубинот реагира со диазотираната сулфанилна киселина (DSA) при што се
формира црвено азо обојување. Апсорбанцијата на растворот е право пропорционална
со концентрацијата на билирубин во примерокот. Конјугираниот (директен) билирубин
директно реагира со диазотираната сулфанилна киселина. Неконјугираниот
(индиректен) билирубин ќе реагира со диазотираната сулфанилна киселина само во
присуство на акцелератор, во овој случај кофеин. Вкупниот (тотален) билирубин
претставува збир од директниот и индиректниот билирубин.
Сулфанилна киселина + Натриум нитрит DSA
Билирубин + DSA ДИРЕКТЕН Азобилирубин
Билирубин + DSA + акцелератор ВКУПЕН Азобилирубин
TBR: Реагенс за определување на тотален билирубин
Сулфанилна киселина 14 mmol/L
HCl 300 mmol/L
Кофеин (акцелератор) 200 mmol/L
Na-бензоат 420 mmol/L
TNR: Нитритен реагенс за определување на тотален билирубин
Na-нитрит 390 mmol/L
DBR: Реагенс за определување на директен билирубин
Сулфанилна киселина 14 mmol/L
HCl 300 mmol/L
DNR: Нитритен реагенс за определување на директен билирубин
Na-нитрит 25 mmol/L

Сите реагенси се готови за употреба.
Тие се стабилни дури и по отворањето, до истекот на рокот на употреба, доколку се
чуваат на температура од 15...25°C.
122
Примерок:
Серум или хепаринизирана плазма.
Да се избегнуваат хемолитични и липемични примероци! Примерокот мора да биде
заштитен од светлина.
Билирубинот е стабилен до 3 дена кога примерокот се чува заштитен од светлина, на
температура од 2...8°C.
Постапка:
Температура: 20-25°C
Мерења: Наспроти слепа проба за примерокот (sample blank)
Шема на пипетирање:
За определување на вкупен (тотален) билирубин
Слепа проба Примерок

TBR 1000 µL 1000 µL
TNR 1капка≈40 µL
Внимателно се промешува и се инкубира 5 минути.
Се промешува и се инкубира на собна температура 10-30 минути. Мерењата на
апсорбанцијата на примерокот се вршат наспроти слепата проба (sample blank).
За определување на директен билирубин
Слепа проба Примерок

DBR 1000 µL 1000 µL
DNR 1капка≈40 µl
Внимателно се промешува и се додава примерокот за време од 2 минути
Се промешува и се инкубира на собна температура, точно пет минути. Мерењата на
апсорбанцијата на примерокот се вршат наспроти слепата проба (sample blank).
Пресметување на концентрацијата на вкупен и директен билирубин:
Концентрацијата на вкупен и директен билирубин се пресметува со користење на

фактор 13,0.
Билирубин (mg/dL) = ΔA546 x 13,0
За изразување на концентрацијата во SI единицата μmol/L, резултатот се множи со 17,1.
[mg/dL] x 17,1 = [μmol/L]
Тестот за определување на концентрацијата на билирубин во серум или плазма е
линерен во граници до 25 mg/dL. Примероците со повисока концентрација на билирубин
се разредуваат 1 + 4 со физиолошки раствор (NaCl 0,9%) и се повторува
определувањето на концентрацијата. Резултатот се множи со 5.
123
Вкупен билирубин [mg/dL] [µmol/L]

При раѓање до: 5 85,5
5 дена по раѓањето до: 12 205,0
1 месец по раѓањето до: 1,5 25,6
Кај возрасни до: 1,1 18,8
Директен билирубин [mg/dL] [µmol/L]

Кај возрасни до: 0,25 4,3
Забелешки:
1. Пред да го додадеме примерокот многу е важно да се осигуриме дека реагенсот
за билирубин и нитритниот реагенс се добро и целосно измешани.
2. Концентрацијата на билирубин може да биде намалена доколку примерокот бил
изложен на сонце.
3. Хемолизата на примерокот исто така може да даде намалени вредности за
билирубин бидејќи хемоглобинот ја инхибира диазо реакцијата.
5.1.2. Определување на билирубин во урина
Определувањето на билирубин во урина е рутинска анализа во клиничко-

биохемиските лаборатории. Семиквантитативно тој се определува со употреба на тест-
ленти за урина. Меѓутоа сѐ уште во широка употреба е и квалитативната метода по
Rosin.
5.1.2.1. Определување на билирубин во урина со тест-ленти
Методата е заснована на реакцијата на билирубинот со диазотиран

дихлоранилин во силно кисела средина, што резултира со розово обојување на
полето. Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата на
билирубин во примерокот. Појавата на боја која е различна од боите прикажани на
шаблонот за семиквантитативно определување е индикација за неспецифична
реакција. Лажно позитивна реакција се јавува кога во урината се присутни високи
концентрации на хлорпромазин или рифампен. Присуството на аскорбинска киселина
во урината ја намалува осетливоста на тестот.
5.1.2.2. Докажување на присуството на билирубин во урина со јод-алкохол (тест

на Rosin)
За изработка на оваа анализа како реагенс се користи алкохолен раствор на јод

со концентрација од 39,4 mmol/L.
Подготовка на реагенсот: Се мери 1 g јод и се раствора во околу 80 mL етанол
во одмерна тиквичка од 100 mL, а потоа тиквичката се надополнува со етанол до
ознаката.
Изработка на анализата: Во епрувета се става околу 5 mL урина за анализа и
во неа внимателно, по ѕидовите на епруветата се додаваат 1-2 mL од алкохолниот
раствор на јод. Течностите не смеат да се мешаат! Доколку урината содржи
билирубин, на допирната површина помеѓу двата слоја ќе се појави зелен или зелено-
син прстен.
Всушност билирубинот, доколку е присутен во примерокот за анализа, се
оксидира со помош на јодот до биливердин, кој е зелено обоен или до билицијанин, кој
има сина боја.
124
Реакцијата е бавна, па поради тоа епруветата треба да се набљудува подолго
време, со евентуално само сосема благо протресување.
Урината која содржи билирубин се одликува со карактеристично жолто

обојување, но мора да се знае дека секое интензивно жолто обојување на урината не
е резултат на присуството на билирубин.
5.1.3. Определување на уробилиноген во урина
5.1.3.1. Определување на уробилиноген во урина со тест-ленти
Методата е заснована на реакцијата на уробилиногенот со

р-диетиламинобензалдехид во кисела средина, при што се добива розово обојување
на полето. Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата
на уробилиноген во примерокот.
Присуството на р-аминосалицилна киселина или на сулфонамиди во примерокот
може да даде лажно позитивен резултат.
5.1.3.2. Определување на уробилиноген во урината со тестот на ERLICH
За изработка на оваа анализа се користи Erlich-ов реагенс:

р-диметиламинобензалдехид во концентрација од 0,134 mol/L и
раствор на хлороводородна киселина во концентрација од 5,4 mol/L.
Подготовка на реагенсот: 2 g р-диметиламинобензалдехид се раствораат во 54
mL концентрирана хлороводородна киселина (HCl 37%) во одмерна тиквичка од 100 mL,
а потоа тиквичката се надополнува со дестилирана вода до ознаката.
Изработка на анализата: Во епрувета со 5 mL урина за анализа се додаваат 2-
4 капки од Erlich-овиот реагенс и се остава да стои до 5 минути.
Поради реакцијата на уреата со реагенсот веднаш се добива жолто обојување
на растворот.
Нешто подоцна се јавува светло портокалово обојување кое е резултат на
реакцијата на уробилиногенот со р-диметиламинобензалдехидот во кисела средина.
Ако во урината има висока концентрација на уробилиноген, во реакционата
смеса веднаш се добива портокалова до црвена боја.
Количеството на уробилиноген во урината може апроксимативно да се процени
на тој начин што ќе се направат разредувања на урината со дестилирана вода и тоа:
1:2; 1:4; 1:8 итн. Потоа во сите тие разредувања се изведува Erlich-овата реакција и се
забележува во кои разредувања ќе се добие позитивна реакција.
Во нормална урина позитивна реакција се добива само во разредувањата 1:2 до
1:4.
125
5.2. Уреа
Уреата (Слика 5.2.) претставува краен продукт на катаболизмот на протеините,

поточно на аминокиселините кај човекот. Над 75% од целокупниот непротеински азот
кој се елиминира од организмот на човекот всушност потекнува од уреата. Биосинтезата
на уреа се одвива во црниот дроб, во циклусот на конверзија на амонијакот во уреа.
Процесите на трансаминација и оксидативна дезаминација на аминокиселините, како и
циклусот на биосинтеза на уреа детално ги изучивме во рамките на предметот Клеточна
биохемија.
Во молекулата на уреата има два атоми азот, така што од 60 g/mol, колку што
изнесува релативната молекулска маса на уреата, на азотот отпаѓаат 28, што значи
дека односот уреа / уреа азот изнесува 2,14.
Врската помеѓу овие два параметри е следната:
C (уреа) = 2,14 х С (BUN) односно С (BUN) = 0,466 х C (уреа)
Уреа азотот во крвта се означува и како BUN (blood urea nitrogen).
Слика 5.2. Структурна формула на уреата
Околу 90% од уреата се екскретира преку бубрезите, а останатиот дел преку

гастроинтестиналниот тракт и кожата. Во бубрезите уреата слободно се филтрира на
ниво на гломерулите. На ниво на бубрежните тубули нема активна реапсорпција ниту
пак секреција на уреата. Меѓутоа, нормално околу 40-70% од уреата пасивно
дифундира од бубрежните тубули во интерстициелната течност и потоа во плазмата.
Степенот на оваа дифузија е обратно пропорционален со степенот на проток на
урината.
Покачувањето на серумските концентрации на уреата над горната граница
на референтните вредности се означува како уремија. Со оглед на тоа што околу
90% од уреата се екскретира преку бубрезите, зголемени серумски концентрации на
уреа се мерат кај пациенти со намалена функционална способност на бубрезите.
Меѓутоа, бројни екстраренални фактори исто така имаат значајно влијание за
покачување на серумските концентрации на уреата. Некои од нив се следните:
1. Постренално, опструкцијата на уринарниот тракт од најразлични причини

(присуство на камчиња, зголемена простата, тумори и др.) го намалува
протокот на урината и условува покачување на серумските концентрации на
уреата.
2. Серумските концентрации на уреата во голема мерка зависат и од начинот
на исхрана, така што кај лица кои консумираат храна богата со протеини се
мерат повисоки серумски концентрации на уреа.
3. При дехидратација исто така се регистрираат покачени концентрации на уреа
во серумот.
4. Зголемени серумски концентрации на уреата има и кај пациенти кај кои е
присутно интензивно разградување на протеините во организмот (на пример
при трауми и некроза на ткива).
126
5. Зголемени серумски концентрации на уреата се среќаваат и при намалена
перфузија на бубрезите (на пример кај пациенти со срцева слабост).
6. Третманот со кортизол или негови синтетски аналози исто така условува
зголемување на серумските концентрации на уреата.
Поради сево ова, иако определувањето на концентрацијата на уреа во серум
(плазма) и урина долги години се користело како индикатор за функцијата на
бубрезите, денеска генерално е прифатено дека креатининот дава подобри
информации во тој поглед.
Намалени серумски концентрации на уреата се среќаваат кај долготрајна
малнутриција. Од друга страна, намалената серумска концентрација на уреата кај
пациенти со тешки оштетувања на црниот дроб е знак за нејзина намалена синтеза, што
е неповолен прогностички параметар кај овие пациенти.
5.2.1. Определување на уреа во серум, плазма и урина (ензимско-колориметриски

тест)
Современите клиничко-биохемиски методи за определување на концентрацијата на

уреа во серум, плазма или урина се базирани на принципот на ензимско разложување
на уреата до амонијак и СО2, под дејство на каталитичката активност на уреазата.
Концентрацијата на создадениот амонијак е право пропорционална со концентрацијата
на уреа во испитуваниот примерок. Во следниот степен од реакцијата, концентрацијата
на амонијакот може да се определи со неколку различни методи:
1. Фотометриски методи на завршна точка,
2. Кинетички фотометриски методи,
3. Кондуктометриски методи и
4. Методи кои се дизајнирани на принципот на сува хемија.
Во рамките на автоматските биохемиски анализатори најчесто е застапена кинетичката
фотометриска метода на определување на амонијакот со глутамат дехидрогеназа.
Протокол за анализа е достапен на платформата за е-учење.
Во рамките пак на овој курс, ќе ја обработиме фотометриската метода на завршна точка
што е базирана на модифицираната Berthеlot-ова реакција.
Под дејство на ензимот уреаза, уреата се хидролизира до амонијак и СО 2. Потоа, во
модифицираната Berthеlot-ова реакција амониумовите јони реагираат со хипохлорит и
салицилат при што се формира зелено обојување. Апсорбанцијата на овој обоен
раствор, мерена на 578 nm е пропорционална со концентрацијата на уреа во
примерокот (Human, протокол број SU-URLQC INF 1050501 GB 06-2008-18).
RGT1:
Na-салицилат 60 mmol/L
Na-нитропрусид 5 mmol/L
EDTA 1 mmol/L
RGT2:
Фосфатен пуфер (рН<13) 120 mmol/L
Хипохлорит ≈0,6 g/L Cl
ENZ:
Уреаза >500 KU/L
STD:
Уреа 80 mg/dL или 13,3 mmol/L
Еквивалент на BUN 37,28 mg/dL или 6,2 mmol/L
Na-азид 0,095%
127
RGT2 и STD се готови за употреба.
Ензимскиот реагенс 1а се подготвува со мешање на 1 дел ENZ и 100 дела RGT1.
Реагенсите се стабилни до истекот на означениот рок на употреба, доколку не се
отворени и се чувани на температура од 2...8°C.
Отворените реагенси RGT1, RGT2 и ENZ се стабилни 6 недели после отворањето
доколку се чувани на температура од 2...8°C, или две недели на температура од
15...25°C.
STD е стабилен до истекот на рокот на траење, дури и после отворањето.
Ензимскиот реагенс 1а е стабилен 4 недели на 2...8°C или 2 недели на 15...25°C.
Примерок:
Серум, плазма (освен хепаринизирана со користење на амониум хепаринат) и урина.
Урината се дилуира во размер 1 + 100 со вода.
Не смее да се работи со липемичен примерок.
Серумот или плазмата може да се чуваат до 3 дена на 4°C, додека за чување во подолг
период тие треба да се замрзнат на -20°C.
Постапка:
Бранова должина: 570-600 nm
Температура: 20-25°C или 37°C
Шема за пипетирање за мануелна изработка на анализата:

Ензимски реагенс
1000 µL 1000 µL 1000 µL
1а (RGT1+ENZ)
STD 10 µL
Примерок 10 µL
Се промешува и се инкубира 5 минути на 20...25°C или 3 минути на 37°C
RGT2 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Внимателно се промешува и се инкубира 10 минути на 20...25°C или 5 минути на 37°C.

Мерењата на апсорбанцијата на примерокот и стандардот се вршат наспроти слепата
проба за време од најмногу 60 минути.
При тоа: ∆Апримерок = Апримерок - Аслепа проба
∆Астандард = Астандард - Аслепа проба
Пресметување на концентрацијата на уреа и BUN:
∆А примерок
C= x фактор
∆А стандард
Фактор C (уреа) C (BUN)

за серум / плазма mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L
80 13,3 37,28 6,2
за урина g/L mmol/L g/L mmol/L
80,8 1343 37,65 626,2
128
Тестот за концентрацијата на уреа во серум или плазма е линерен во граници до 400
mg/dL (66,6 mmol/L), додека во урина опсегот за линеарност е до 400 g/L (6600 mmol/L)
уреа. Примероците со повисока концентрација на уреа (серум, плазма или урина) се
разредуваат 1 + 1 со дестилирана вода и се повторува определувањето на
концентарцијата. Резултатот се множи со 2.
Серум (уреа): 10 - 50 mg/dL или 1,7 - 8,3 mmol/L
Урина (уреа): 20 - 35 g/24h или 333 - 583 mmol/24h
Забелешки:
1. STD содржи 0,095% Na-азид како конзерванс. Да на се голта. Да се избегнува
контакт со кожа и мукозни мембрани.
2. RGT2 содржи алкален раствор на Na-хипохлорит, поради што тој може да
предизвика иритација на очите, кожата и мукозните мембрани. Доколку дојде во
допир со очи, кожа или мукозни мембрани, местото треба обилно да се исплакне
со вода и да се консултира лекар.
129
5.3. Креатинин
Креатининот претставува краен продукт на катаболизмот на креатинот и креатин

фосфатот. Пред да се запознаеме со дијагностичкото значење на креатининот и
методите за негово квантитативно определување, најпрвин накратко ќе се осврнеме на
метаболизмот на креатинот и креатининот.
Биосинтезата на креатинот се одвива во бубрезите, црниот дроб и панкреасот.
Најпрвин, во бубрезите, од аргининот и глицинот се создаваат орнитин и
гванидинооцетна киселина. Гванидиноoцетната киселина потоа се транспортира до
црниот дроб и во помала мерка до панкреасот, каде, со помош на активираниот
метионин, се метилира и се добива креатин.
Потоа креатинот се транспортира преку крвта до останатите органи, во прв ред
до мускулите и мозокот, каде се фосфорилира, со што се добива енергетски богатото
соединение креатин фосфат.
креатин + ATP креатин фосфат + ADP

креатин киназа
При контракција на мускулите се случува обратната реакција, односно креатин

фосфатот ја предава фосфатната група на ADP. При тоа се формира
високоенергетското соединение ATP што се користи како извор на енергија за
мускулната контракција.
Околу 1-2% од мускулниот креатин дневно спонтано се распаѓа до креатинин, кој
всушност претставува негов анхидрид и цикличен дериват (Слика 5.3.). Поради тоа,
дневната продукција на креатининот е релативно константна и е во тесна зависност од
мускулната маса. Така, мажите, кои нормално имаат поголема мускулна маса во однос
на жените, имаат и повисоки серумски концентрации на креатинин. Ниски серумски
концентрации на креатининот се мерат кај лица со мошне мала мускулна маса.
а) Скелетна формула на креатинот

б) Скелетни формули на двата тавтомери на креатининот
Слика 5.3. Структурни формули на креатин и креатинин
Креатининот како деградационен продукт се отстранува од организмот преку

бубрезите. Тој слободно се филтрира на ниво на гломерулите. Само еден мал дел од
креатининот се реапсорбира на ниво на тубулите, а исто така постои, иако незначителна
во физиолошки услови, и негова тубуларна секреција. Тубуларната секреција на
креатининот се потенцира при негова зголемена серумска концентрација.
Согласно досега кажаното, можеме да резимираме дека серумските
концентрации на креатининот зависат од два фактори:
1. Мускулната маса и
2. Функцијата на бубрезите.
Поради тоа што мускулната маса кај една индивидуа е релативно константна во
подолг временски период, можеме да заклучиме дека креатининот е погоден
деградационен продукт за проценка на функцијата на бубрезите.
130
И навистина, серумскиот креатинин и вредноста на креатинин клиренсот4
претставуваат корисни клинички параметри за проценка на брзината на
гломеруларната филтрација (GFR – glomerular filtration rate), што претставува
индекс за бројот на функционалните нефрони. Намалувањето на брзината на
гломеруларната филтрација му претходи на бубрежното затајување кај сите форми на
прогресивно бубрежно заболување.
Во продолжение, ќе ги разгледаме лимитирачките фактори на овие две методи
– серумскиот креатинин и креатинин клиренсот.
За серумскиот креатинин значаен лимитирачки фактор е тоа што неговите
зголемени серумски концентрации се манифестираат дури во напредната фаза на
бубрежната болест.
Од друга страна, референтните вредности за креатинин во серум се добиени со
антиципирање на просечната мускулна маса во популацијата, со што е намалена
сензитивноста на методата.
Кај пациенти со хронична бубрежна болест постои екстраренален клиренс на
креатининот, што го маскира очекуваниот пораст на серумскиот креатинин поради
намалената брзината на гломеруларната филтрација. Така, серумскиот креатинин нема
да ги детектира пациентите со втор стадиум на хронична бубрежна болест (GFR од 60-
89 mL/min.), а исто така нема да идентификува и значителен број од пациентите со трет
стадиум на хронична бубрежна болест (GFR од 30-59 mL/min.).
Поради сево ова, иако зголемената концентрација на серумски креатинин
претставува показател за нарушена бубрежна функција, неговите нормални серумски
концентрации не исклучуваат нарушување на бубрежната функција. Следствено,
серумската концентрација на креатининот не може да се користи како единствен
биомаркер за проценка на бубрежната функција.
Креатинин клиренсот претставува посензитивен биомаркер за проценка на
брзината на гломеруларната филтрација во споредба со серумскиот креатинин.
Креатинин клиренсот се пресметува со користење на математичка формула во која се
внесуваат измерените концентрации на креатинин во серум и креатинин во 24-часовна
урина.
Еден од најзначајните недостатоци на оваа метода е потребата да се собира 24-
часовна урина, што е прилично непријатна постапка и за самиот пациент, но и за
медицинскиот персонал. За добивање на точни резултати, покрај запазувањето на сите
останати принципи на добрата лабораториска пракса, од особено значење е
правилното и комплетно собирање на 24-часовната урина и точното мерење на
волуменот на урината (диурезата). Исто така, во текот на изведувањето на тестот е
неопходно да се обезбеди соодветна хидратација на пациентот, односно брзината на
протокот на урина низ бубрезите (минутниот волумен) да изнесува околу 2 mL/минута.
За да може една супстанција да се искористи за мерење на бубрежниот клиренс,
истата треба да ги исполнува следните критериуми:
1. Брзо да се филтрира од плазмата на ниво на гломерулите.
2. Да не се реапсорбира ниту да се секретира на ниво на тубулите.
3. Нејзината концентрацијата во плазмата да биде константна во текот на
собирањето на урината.
4. Мерењето на нејзината концентрација во плазмата и во урината да биде
аналитички можно и реално.
Креатининот ги исполнува најголемиот дел од овие услови, со исклучок, како што
претходно беше кажано, што еден мал дел од креатининот се реапсорбира на ниво на
тубулите, а исто така постои, иако незначителна во физиолошки услови, и негова
тубуларна секреција. Тубуларната секреција на креатининот се потенцира при негова
зголемена серумска концентрација. Ова го девалвира значењето на креатинин
4
Бубрежниот клиренс на една супстанција е дефиниран со волуменот на плазмата од кој таа
супстанција комплетно ќе се отстрани преку бубрезите за единица време.
131
клиренсот, па во најдобар случај тој може и треба да се разгледува само како груб
показател на брзината на гломеруларната филтрација.
Математичка проценка на брзината на гломеруларната филтрација, со
користење само на измерената концентрација на серумскиот креатинин, коригирана со
поголем број фактори како што се: пол, возраст и раса, сѐ почесто се користи во
клиничката пракса. Денеска се достапни бесплатни софтвери за брзо и лесно
калкулирање на GFR со оваа метода.
Во последниве години се фаворизира употребата на еден нов, супериорен
биомаркер за проценка на брзината на гломеруларната филтрација, а тоа е цистатинот
Ц. Цистатинот Ц е протеин со мала релативна молекулска маса (12,8 kDa), кој се
синтетизира на ниво на сите клетки што содржат јадро. Неговата физиолошка функција
е инхибиција на цистеинските протеази. Поврзано со неговата улога како биомаркер за
проценка на брзината на гломеруларната филтрација, за цистатинот Ц е
карактеристично следното:
1. Слободно се филтрира на ниво на гломерулите.
2. Врз неговите серумски концентрации не влијаат полот, мускулната маса и
начинот на исхрана.
3. Не се познати екстраренални патишта за негова елиминација.
4. Неговите серумски концентрации зависат исклучиво од брзината на
гломеруларната филтрација.
Цистатинот Ц е особено корисен како биомаркер за благо и умерено нарушување
на бубрежната функција.
Неговите серумски концентрации се определуваат со имунотурбидиметриски и
имунонефелометриски методи.
5.3.1. Определување на креатинин во серум и урина со Jaffé-ова реакција и

пресметување на креатинин клиренс
(фотометриски колориметриски тест за кинетичко определување)
Квантитативното определување на креатинин во серум, плазма или урина се врши со

хемиски или ензимски методи.
Повеќето хемиски методи се базираат на неговата реакција со алкален пикрат, при што
се формира портокалово-црвен комплекс. Оваа реакција за прв пат е опишана од
страна на Jaffé во далечната 1886 год. Бројните интерференции и малата специфичност
на методата се надминати со воведување на кинетичко определување и внимателен
избор на концентрациите на реактантите.
Определувањето на креатинин со алкален пикрат е автоматизирано и е дел од тест-
менито на бројни клиничко-биохемиски анализатори. Во рамките на овој курс ние ќе ја
изработиме оваа анализа мануелно.
Во последно време се развиени и ензимски методи за квантитативно определување на
креатинин во биолошки примероци. Овие методи ќе ги разработиме преку користење на
дополнителна литература и изработка на семинарски работи.
Креатининот во алкален раствор реагира со пикринската киселина при што се формира
портокалово-црвено обоен комплекс. Апсорбанцијата на овој комплекс е право
пропорционална со концентрацијата на креатинин во примерокот. За изработка на оваа
анализа ќе го користиме реагенс-китот со каталошки број SU-ACREA INF 1005201 GB
07-2008-2 од производителот Human, Германија. Оригиналниот протокол е закачен на
платформата за е-учење.
132
NaOH: Натриум хидроксид 160 mmol/L
PIC: Пикринска киселина 13,9 mmol/L
STD: Креатинин 2 mg/dL или 176,8 µmol/L

NaOH и PIC: Натриум хидроксидот и пикринската киселина ги добиваме како готови
раствори.
Работниот реагенс се подготвува со мешање на натриум хидроксид и пикринска
киселина во однос 4 + 1.
STD е готов за употреба.
Реагенсите се стабилни до пропишаниот рок на траење, дури и по отворањето, ако се
чуваат на температура од 15...25°С.
Работниот реагенс треба да се чува заштитен од светлина. Стабилен е во текот на 4
недели кога се чува на температура од 15...25°С.
Примерок:
Серум, хепаринизирана плазма или урина.
Не смее да се работи со хемолизиран примерок.
Концентрацијата на креатинин во примерокот е стабилна 24 h на 2...8°C.
Урината треба да се разреди во однос 1 + 49 со вода.
Постапка:
Бранова должина: 490 - 510 nm
Мерење: растечка апсорбанција
Шема за пипетирање, за мануелна изработка на анализата, семи-микро метода:
Стандард Примерок
Стандард (STD) 100 µL /
Примерок / 100 µL
Работен реагенс 1000 µL 1000 µL
Анализите се работат една по една.

Добро се промешува и се вклучува штоперица.
За време од точно 30 секунди се отчитува вредноста за апсорбанцијата А1. Во
продолжение, точно после 2 минути се отчитува вредноста за апсорбанцијата А2.
А2 –А1 =∆А за примерокот или за стандардот.
Пресметување на концентрацијата на креатинин во серум / плазма:
ΔA примерок mg ΔA примерок µmol

C = 2,0 ( ) или C = 176,8 ( )
ΔА стандард dL ΔА стандард L
133
Пресметување на концентрацијата на креатинин во урина:
C = 100 ( )
ΔА стандард dL
Пресметување на концентрација на креатинин во 24-часовна урина:
C = mg/dL x mL урина/24h x 0,01 (mg/24h)

C = mg/24h x 0,00884 (mmol/24h)
Пресметување на креатинин клиренс:
mg креатинин/ dL урина x mL урина/ 24h mL

креатинин клиренс = ( )
mg креатинин/ dL серум x 1440 min
Претворањето на mg/dL во µmol/L и обратно се врши со следниве фактори:
[mg/dL] x 88,402 = [µmol/L]

[µmol/L] x 0,0113 = [mg/dL]
Тестот за концентрацијата на креатинин во серум е линерен во граници до 15 mg/dL
(1326 µmol/L), додека во урина опсегот за линеарност е до 500 mg/dL (44200 µmol/L).
Примероците со повисока концентрација на креатинин (серум, плазма или разредена
урина) се разредуваат 1 + 5 со физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува
определувањето на концентарцијата. Резултатот се множи со 6.
Серум: mg/dL µmol/L

Мажи 0,6 – 1,1 53 - 97
Жени 0,5 – 0,9 44 - 80
Урина 1000 – 1500 mg/24h
Креатинин клиренс:
Мажи 98 – 156 mL/min.
Жени 95 – 160 mL/min.
Забелешки:
1. Реакцијата е високо сензитивна на температурни промени, па поради тоа
температурата мора да се одржува константна.
2. Пикринската киселина е многу штетна доколку се вдише, се проголта или дојде во
допир со кожа.
Доколку дојде во допир со кожа или мукозни мембрани, местото треба обилно да се
исплакне со вода.
3. Со оваа анализа може да интерферираат редуцирачки компоненти, чија
интерференција може делумно да се избегне со краткотрајно провривање на урината.
4. Малиот талог кој ќе преципитира од растворот на натриум хидроксид нема значење.
134
5.4. Мочна киселина (Аcidum uricum)
Во човековиот организам мочната киселина (Слика 5.4.) претставува краен

продукт на катаболизмот на пуринските нуклеозиди – аденозин и гванозин. Еден дел од
нив се од ендогено потекло, односно потекнуваат од самиот организам, а дел се од
егзогено потекло, односно се внесуваат во организмот преку храната.
Најголемиот дел од мочната киселина која се елиминира од човековиот
организам потекнува од катаболизмот на ендогените нуклеински киселини.
Слика 5.4. Мочна киселина
Основните мономерни единици во градбата на нуклеинските киселини се

нуклеотидите. Секој нуклеотид е изграден од 3 компоненти:
1. Азотна хетероциклична база која е дериват на пуринот или
пиримидинот,
2. Пентозен шеќер (рибоза кај РНК или дезоксирибоза кај ДНК) и
3. Фосфорна киселина.
Во состав на нуклеотидите на ДНК од пуринските бази се среќаваат аденинот и
гванинот, а од пиримидинските бази се среќаваат цитозинот и тиминот. Во состав на
нуклеотидите на РНК од пуринските бази се среќаваат исто така аденинот и гванинот, а
од пиримидинските бази се среќаваат цитозинот и урацилот. Ако со хидролиза се
отстрани фосфатот од нуклеотидот, преостанатата структура се нарекува нуклеозид.
Човекот, цицачите и повеќето ‘рбетници имаат способност за de novo синтеза на
нуклеинските киселини, така што нивниот опстанок не зависи од внесувањето на овие
соединенија со храната. Сепак, со исхраната човекот секојдневно внесува значајни
количества на нуклеински киселини и тоа пред сè преку месото.
Нуклеинските киселини во организмот се внесуваат главно во облик на
нуклеопротеиди. Под дејство на протеолитичките ензими од дигестивниот систем
нуклеопротеидите се разложуваат до нуклеински киселини и аминокиселини.
Нуклеинските киселини понатаму се хидролизираат до нуклеотиди, кои потоа се
хидролизираат до нуклеозиди и фосфат.
Пуринските нуклеозиди понатаму се метаболизираат на следниот начин:
1. Аденозинот се преведува до хипоксантин;
2. Гванозинот се преведува до ксантин.
И хипоксантинот и ксантинот се оксидираат до мочна киселина под дејство на
ензимот ксантин оксидаза.
Мочната киселина потоа се апсорбира од страна на интестиналната мукоза и се
излачува со урината. Еден мал дел од мочната киселина се разложува под дејство на
цревната флора, процес означен како уриколиза.
Разложувањето пак на ендогените нуклеински киселини се одвива во
лизозомите, по ензимски пат, на сличен начин како разложувањето на егзогените
нуклеински киселини во дигестивниот систем. Значајно е дека по разложувањето на
ендогените нуклеотиди еден дел од пурините можат повторно да бидат искористени за
135
синтеза на нуклеотиди (тоа е т.н. purine salvage pathway), додека оние кои претставуваат
вишок се метаболизираат до мочна киселина.
Бубрежната екскреција на мочната киселина е комплексна и вклучува четири
чекори:
1. На ниво на гломерулите мочната киселина комплетно се филтрира од
плазмата.
2. На ниво на проксималните тубули, и тоа во нивниот почетен извиткан дел,
речиси целата филтрирана мочна киселина се реапсорбира.
3. На ниво на дисталниот дел на проксималните тубули се врши секреција на
мочна киселина.
4. На ниво на дисталните тубули мочната киселина повторно се реапсорбира.
Како резултат на сите овие процеси конечно се екскретира од 6 – 12% од
филтрираната мочна киселина на ниво на гломерулите.
Формата во која се среќава мочната киселина зависи од рН на средината:

1. При рН вредности под 5,75 таа се наоѓа во форма на мочна киселина, која е
крајно нерастворлива супстанца, што претставува причина за создавање на
нејзини кристали во мочните патишта.
2. При физиолошки вредности на рН, во крвната плазма, мочната киселина се
наоѓа во форма на натриум урат, кој е растворлив до концентрација од 416
μmol/L на 37°С. При концентрации над 416 μmol/L се создаваат кристали од
натриум урат кои се таложат во меките ткива или околу зглобовите, во прв
ред зглобовите од ножните палци. Како туѓи тела, овие кристали
предизвикуваат инфламаторна реакција. Ова заболување е познато како
гихт (подагра). Гихтот се карактеризира со повремени напади и долги
периоди на ремисија. Голем ризик за појава на гихт имаат пациентите кај кои
високи концентрации на мочна киселина (над 600 μmol/L) се задржуваат во
подолг временски период.
Намалените серумски концентрации на мочна киселина се означуваат со

терминот хипоурикемија и истите немаат особено клиничко значење.
Зголемените серумски концентрации на мочна киселина се означуваат со

терминот хиперурикемија.
Хиперурикемија се среќава кај пациенти со намалена ренална тубуларна
секреција на мочната киселина.
Се среќава и кај некои хематолошки заболувања, на пример кај хронични
леукемии и мултипла миелома, како резултат на интензивираниот метаболизам на
нуклеинските киселини.
Како доцен ефект при хронично труење со олово исто така се среќава
хиперурикемија, како резултат на оштетувањето на бубрезите и нарушената
елиминација на мочната киселина.
Состојбите на ацидоза и кетоза исто така се следени со хиперурикемија како
резултат на конкуренцијата на млечната и β-хидроксибутерната киселина со мочната
киселина за тубуларна секреција.
Хиперурикемија се регистрира и кај прееклампсија, каде концентрацијата на
мочна киселина во серумот се користи како индикатор за тежината на состојбата.
Врз серумските концентрации на мочната киселина влијаат и следните фактори:
1. Пол. -Мажите имаат повисоки серумски концентрации на мочна киселина во
однос на жените.
2. Телесна маса. -Кај дебелите лица серумските концентрации на мочната
киселина се исто така повисоки.
3. Социјална состојба. -Кај популациите со повисок социјален статус обично се
мерат повисоки концентрации на мочна киселина.
136
4. Начин на исхрана. -Лицата кои користат храна богата со нуклеински киселини,
во прв ред црвено месо, џигер, слезина, мозок и други ситнежи, имаат повисоки
серумски концентрации на мочна киселина.
5. Генетски фактори. - Некои вродени нарушувања на метаболизмот на пурините
значајно влијаат врз серумската концентрација на мочната киселина.
Наспроти метаболизмот на пурините, како резултат на метаболизмот на

пиримидините се создаваат метаболити кои се растворливи во вода и чија зголемена
продукција ретко доведува до клинички значајни манифестации.
Концентрацијата на мочна киселина се определува во серум (плазма) и урина.

Мочната киселина во урина се определува кај пациенти со гихт со цел да се избере
вистинскиот третман. Определувањето се врши во примерок од 24-часовна урина.
Примерокот треба претходно да се алкализира при што мочната киселина се
трансформира во растворлив натриум урат.
5.4.1. Определување на мочна киселина во серум, плазма и урина со PAP метода

(ензимско-колориметриски тест)
Постојат три групи методи за квантитативно определување на мочната киселина:

1. Методи со фосфоволфрамова киселина,
2. Методи со уриказа и
3. HPLC-методи.
Од нив, во широка клиничка употреба се методите со уриказа, поради високата
специфичност и можноста за апликација на автоматските биохемиски анализатори.
Една од нив ќе обработиме и во рамките на овој курс.
Квантитативното определување на мочната киселина се врши после реакцијата со
ензимот уриказа. Во оваа ензимска реакција мочната киселина се разложува до
алантоин, при што се ослободуваат јаглерод диоксид и водород пероксид (Н2О2).
Понатаму, водородниот пероксид реагира со N-етил-N-(2-хидрокси-3-сулфопропил)-3-
метиланилин натриумова сол (TOOS) и 4-аминофеназон (PAP) под каталитичкото
дејство на ензимот пероксидаза, давајќи црвено-виолетов кинонимин.
Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата на мочна
киселина во примерокот.
Потенцијалната интерференција од аскорбинската киселина е избегната со додавање
на аскорбат оксидаза во реагенсот.
За обработка на оваа метода и квантитативно определување на мочната киселина го
користиме протоколот број SU-URACP INF 1069401 GB 04-2007-7 од производителот
Human, Германија.
BUF:
TOOS 1 mmol/L
Аскорбат оксидаза ≥1 KU/L
ENZ:
Калиум хексацијано ферат (II) 10 µmol/L
Пероксидаза ≥1 KU/L
Уриказа ≥0,1 KU/L
137
STD:
Мочна киселина 8 mg/dL односно 476 µmol/L

Реагенсите ги добиваме во готова форма.
Работниот реагенс се подготвува со мешање на 4 дела од реагенсот BUF со 1 дел од
реагенсот ENZ (на пример: 80 mL BUF + 20 mL ENZ).
кога се чуваат на температура од 2...8°C.
Работниот реагенс е стабилен 3 недели на 15...25°C или 3 месеци на 2...8°C.
Сите реагенси треба да се чуваат заштитени од светлина.
Примерок:
Серум, хепаринизирана или EDTA-плазма, урина.
Урината се разредува со вода во однос 1+10.
Мочната киселина е стабилна во серумот од 3 до 5 дена на 2...8°C, или 6 месеци на -
20°C.
Во урина мочната киселина останува стабилна околу 3 дена на собна температура,
доколку урината е заштитена од бактериска контаминација.
Забелешка: Липемичните примероци обично создаваат турбидност на реакционата
смеса, што може да даде лажно покачен резултат. Овој тест ја елиминира појавата на
такви лажно покачени резултати, со помош на липид отстранувачкиот фактор (LCF).
Овој фактор ја избиструва вкупната турбидност во липемичниот примерок.
Постапка:
R1/R2 процедура
BUF 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Се промешува и се инкубира окoлу 1 мин.
ENZ 250 µL 250 µL 250 µL

Процедура со работен реагенс (WR)

WR 1000 µL 1000 µL 1000 µL

138
Пресметување на концентрацијата на мочна киселина:
Во серум или плазма:

ΔA примерок µmol
C = 476 ( )
ΔА стандард L
Во урина:
C = 5235 ( )
ΔА стандард L
Тестот е линерен во граници до 25 mg/dL (1488 µmol/L). Примероците со повисока
концентрација на мочна киселина се разредуваат 1 + 1 со физиолошки раствор (0,9%
NaCl) и се повторува определувањето на концентарцијата. Резултатот се множи со 2.
Мажи: 3,4 - 7,0 mg/dL или 200 - 420 µmol/L
Жени: 2,4 - 5,7 mg/dL или 140 - 340 µmol/L
Урина: 250 - 750 mg/24h или 1,5 - 4,5 mmol/24h
Забелешка:
1. Врз тестот не влијае концентрацијата на хемоглобин, дури и до 500 mg/dL,
вредностите на билирубин до 30 mg/dL, вредностите за триглицеридите до 2000 mg/dL
и витаминот C до 30 mg/dL.
2. Реагенсите содржат натриум азид како конзерванс (0,095%). Да не се голта. Да се
избегнува контакт со кожа и слузави мембрани.
139
6. КЛИНИЧКО-ЕНЗИМОЛОШКИ АНАЛИЗИ
Биокатализаторите претставуваат група органски соединенија, скоро исклучиво

од протеинска природа, чија функција се состои во забрзување на хемиските реакции
во организмот. Биокатализаторот овозможува алтернативен пат на одвивање на
хемиската реакција што ја катализира, при што значително се намалува енергијата на
активација. На тој начин во организмот се обезбедува одвивање на сложени хемиски
реакции во услови (температура, притисок, рН...) што се компатибилни со животот.
За илустрација на функцијата на биокатализаторите во литературата многу
често се користи еден едноставен пример, што е даден во продолжение. Имено, од
органската хемија ни е познато дека на собна температура глукозата има способност да
остане хемиски непроменета со години и дека за нејзино разложување до крајните
продукти јаглерод диоксид и вода надвор од организмот е потребно истата да се загрее
на температура од околу 300°C. Од друга страна, во живите организми глукозата
секојдневно се разложува до истите крајни продукти (јаглерод диоксид и вода), на
нормална телесна температура, без создавање на пламен и со ослободување на
енергија која организмот може да ја користи за одржување на животните процеси.
Ваквиот тек на хемиските реакции во живите организми е можен единствено поради
присуството и активноста на биокатализаторите, кои се уште нарекуваат ферменти или
ензими. Во човековиот организам постојат мошне голем број ензими што имаат
способност да катализираат најразлични хемиски реакции.
Од аспект на клиничката биохемија, дел од ензимите што нормално се присутни
во релативно високи концентрации во клетките од различни ткива и органи, можат да се
определуваат во серумски примероци давајќи ни клинички значајни информации за
здравјето на пациентите. Овие ензими се предмет на изучување на клиничката
ензимологија.
Поради сево ова, во воведниот дел од ова поглавје најпрвин накусо ќе се
потсетиме на хемиската структура, поделбата и функцијата на ензимите, а потоа
детално ќе се запознаеме со дијагностичкото значење и начинот на определување на
ензимите кои најчесто се користат во хуманата дијагностика.
Краток историски преглед

Првите ензимски процеси човекот ги запознал уште на самиот почеток на
развојот на цивилизацијата, но немал објаснување за истите. Имено, ензимски
процеси се: поткиселувањето на млекото, добивањето на алкохолни пијалаци со
ферментација на слатките овошни сокови, производството на пиво, киснењето на
лебот, добивањето на оцет од виното и сл. Ваквите хемиски процеси за кои е
карактеристично нагло развивање на гасови биле нарекувани „fermentatio“ -
ферментација, што значи бурно вриење.
Основите на науката за ензимите – ензимологијата ги поставил
познатиот научник Louis Pasteur. Тој докажал дека стерилен раствор на глукоза
оставен во затворен сад нема да претрпи хемиски промени, односно нема да започне
процес на ферментација. Но доколку во растворот на глукоза се додадат квасни
габички, тогаш ќе настане процес на вриење (ферментација):
C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2
Pasteur сметал дека микроорганизмите, кои тој ги нарекол ферменти, се

одговорни за овие промени.
Но, во 1903 год. научникот Buchner подготвил екстракт од квасни габички во
кој воопшто немало живи клетки. Тој утврдил дека со додавање на екстрактот во
раствор од глукоза започнува процесот на ферментација. Заклучокот од овој
експеримент бил дека во екстрактот од квасните габички има компоненти што
довеле до ферментација, кои биле наречени ензими („во квасец“ – грчки).
140
6.1. Дефиниција и хемиска структура на ензимите
Катализаторите во општ случај се дефинираат како супстанции кои учествуваат

во хемиските реакции и ги забрзуваат истите. Биокатализаторите пак претставуваат
катализатори од биолошко потекло. Тие се една посебна класа на биомолекули, главно
со протеинска структура, кои ги катализираат хемиските реакции во живите организми.
За неорганските катализатори е карактеристично тоа што тие не поседуваат својство на
специфичност. Таков е примерот со платината која е универзален катализатор во
неорганската катализа. За разлика од нив, биокатализаторите поседуваат својство на
специфичност, но во различен степен. Имено, има ензими кои се строго специфични и
дејствуваат само врз еден супстрат. Таков е случајот со ензимот аргиназа кој го
разградува само аргининот. Други ензими покажуваат помал степен на специфичност,
како што е случајот со химотрипсинот кој ги хидролизира пептидните врски помеѓу
ароматична и било која друга аминокиселина. Некои ензими пак се само групно
специфични, како што е алкалната фосфатаза која врши хидролиза на најразлични
моноестри на фосфорната киселина.
Супстанцијата која се менува под каталитичкото дејство на ензимот се нарекува
супстрат(и), а на крајот од реакцијата се добива продукт(и).
Улогата на ензимот во ензимската реакција е да ја забрзува реакцијата (за 1000
па и повеќе пати), при што тој е само посредник и забрзувач на реакцијата, но не и нејзин
задвижувач.
Со мали исклучоци, сите досега познати ензими според својата хемиска
структура се или прости или сложени протеини. Ензимите кои според својата хемиска
структура се прости протеини се составени само од протеинска компонента. Ензимите
пак кои според својата хемиска структура се сложени протеини се составени од
протеинска компонента – апоензим и непротеинска компонента – кофактор или
коензим. Протеинската и непротеинската компонента заедно ја сочинуваат
комплексната ензимска молекула – холоензим.
Според местото каде го пројавуваат своето дејство, ензимите можат да се
поделат во две групи:
1. Ендоензими, кои дејствуваат во самите клетки каде што се
синтетизирани и
2. Ектоензими, кои се синтетизираат во клетките, најчесто секреторните, а
потоа со секретите се излачуваат надвор од клетките и таму го
пројавуваат своето дејство. Таков е примерот со дигестивните ензими.
Постојат исто така и изоензими. Тоа се ензими кои катализираат иста реакција,
но имаат различни хемиски или физичко-хемиски својства, а се наоѓаат кај еден
животински вид или кај човекот. Нивната синтеза ја кодираат различни гени.
До неодамна се сметало дека сите биохемиски каталитички реакции се
катализирани од протеини. Меѓутоа, најновите истражувања покажале дека и некои
молекули на рибонуклеинска киселина (РНК) можат да дејствуваат како
биокатализатори. Тие се означени како рибозими. Во понатамошниот текст ќе бидат
обработени само биокатализаторите кои по својата хемиска структура се прости или
сложени протеини.
6.2. Номенклатура и класификација на ензимите
Имињата на некои ензими се добиени според името на супстратот врз кој

дејствува ензимот и тоа на тој начин што на името на супстратот се додава наставката
-аза [уреа – уреаза; сахароза – сахараза; амилум (скроб) – амилаза; аргинин – аргиназа
итн.].
Ензимите можат да бидат именувани и според видот на реакциите кои ги
катализираат и тоа:
1. Ензимите кои вршат хидролиза се нарекуваат хидролази;
141
2. Ензимите кои пренесуваат кисели групи се нарекуваат трансацилази;
3. Ензимите кои пренесуваат амино групи се трансаминази итн.
Некои ензими се именувани и според името на супстратот и според типот на
реакцијата која ја катализираат: лактат дехидрогеназа, глукоза оксидаза и сл.
Постојат и ензими кои имаат и свои емпириски имиња, како што е случајот со
плунковата α-амилаза која се нарекува и птијалин (ензим кој се среќава во плунката).
Такви се и имињата на ензимите трипсин, пепсин, дијастаза.
За да се надминат проблемите на класифицирањето на ензимите кои произлегле
од нивната бројност и разнообразната функција, во 1961 година Меѓународната унија
за биохемија препорачала класификација според која сите ензими се поделени во шест
големи класи:
1. Оксидоредуктази, кои ги катализираат оксидо-редукционите реакции;
2. Трансферази, кои ги катализираат реакциите на пренесување на
различни функционални групи, а кое пренесување може да биде
внатремолекулско или меѓумолекулско;
3. Хидролази, кои ги катализираат реакциите на хидролиза;
4. Лиази, кои ги катализираат реакциите на откинување на одделни групи
од некои соединенија како слободни молекули (на пример јаглерод
диоксид) без учество на вода;
5. Изомерази, кои ги катализираат реакциите на изомеризација и
6. Лигази, кои ги катализираат реакциите на биосинтеза.
Според оваа класификација секоја класа се дели на повеќе групи. Секоја група
понатаму се дели на повеќе подгрупи. На крај, секој ензим во подгрупата си има свој
реден број. Со оваа класификација секој ензим си добил свој единствен
класификационен број кој еднозначно го определува и кој се користи кога е потребна
точна идентификација на ензимот. На пример, класификациониот број на ензимот
алкохол дехидрогеназа е E.C.1.1.1.1. Првата единица означува дека овој ензим ѝ
припаѓа на првата класа ензими, а тоа се оксидоредуктазите. Втората единица означува
дека овој ензим ѝ припаѓа на првата група оксидоредуктази, а тоа се оние кои
дејствуваат врз алкохолната група. Третата единица означува дека алкохол
дехидрогеназата ѝ припаѓа на првата подгрупа од првата група оксидоредуктази, каде
како акцептор на водородот се јавува коензимот никотинамид аденин динуклеотид.
Четвртата единица означува дека алкохол дехидрогеназата е првиот ензим од оваа
подгрупа.
6.3. Активен центар
Во хемиската структура на ензимот централно место има активниот центар кој

всушност е местото во протеинскиот дел на ензимот каде се врзува супстратот.
Наспроти класичното гледиште дека активниот центар на ензимот и соодветниот
супстрат се структурно комплементарни, односно дека си одговараат како „клуч и
клучалка“, во поново време е прифатена хипотезата на индуцирано прилагодување,
според која супстратот е тој кој при врзувањето со ензимот ги индуцира
конформационите промени во активниот центар на ензимот.
Аминокиселините кои го градат активниот центар, според својата функција
можат да се поделат во три групи:
1. Контактни аминокиселини, кои го врзуваат супстратот со ензимот и
обезбедуваат погодна положба за дејствување на каталитичките
аминокиселини,
2. Каталитички аминокиселини, кои хемиски делуваат врз супстратот за
време на катализата и
3. Аминокиселини кои ја одржуваат карактеристичната
тродимензионална структура на активниот центар.
142
6.4. Механизам на ензимските реакции
Постојат неколку теории што го објаснуваат механизмот на ензимските реакции,

но денес општо прифатена е теоријата за интермедиерно соединение на Michaelis-
Menten. Според оваа теорија во првата фаза од ензимската реакција ензимот се
соединува со супстратот при што се формира ензим-супстрат комплекс. Потоа
настануваат хемиски промени со што ензим-супстрат комплексот се активира, односно
станува нестабилен. Во втората фаза нестабилниот ензим-супстрат комплекс се
распаѓа при што се ослободуваат продукт(и) на реакцијата и самиот ензим. После ова,
ензимот има способност да стапува во реакција со други молекули на супстрат. Од тука
произлегува дека мало количество на ензим може да катализира трансформација на
големо количество на супстрат. Меѓутоа, живите организми поседуваат регулаторни
механизми кои овозможуваат да се произведе само онолку продукт колку што му е
потребен на организмот.
Во живиот организам, доколку ензимот не би бил присутен, би требало предолго
време за да се изврши реакцијата, односно таа практично не би се вршела. Надвор од
живиот организам, без присуство на ензим, за да се забрза реакцијата, на реакциониот
систем треба да му се додаде енергија од надвор, најчесто со загревање. Со тоа се
зголемува кинетичката енергија на молекулите што реагираат, односно се зголемува
бројот на нивните меѓусебни судири, а со тоа и брзината на реакцијата. Меѓутоа,
зголемувањето на температурата како начин за зголемување на кинетичката енергија и
забрзување на реакцијата е некомпатибилно со животот. Всушност ензимите се тие кои
ја снижуваат енергијата на активација преку создавање на интермедиерно соединение
со супстратот, со што се овозможува одвивање на биохемиските реакции на релативно
ниски (телесни) температури (Слика 6.1.). Токму во ова се согледува значењето на
ензимите за одржувањето на животните процеси во целокупниот жив свет.
Ea
Ea
Легенда:
Ea – Енергија на активација
ΔG – промена на слободната енергија
Слика 6.1. Тек на една ензимска реакција – намалување на енергијата на

активација
143
6.5. Брзина на ензимските реакции
Брзината на ензимските реакции зависи од повеќе фактори како што се:

температура, рН на средината, концентрација на ензимот, концентрација на супстратот
и присуство на активатори и инхибитори. Сите овие фактори имаат значајна улога in
vivo, но исто така имаат големо значење и во клиничката ензимологија, за дизајнирање
и разбирање на методите за определување на ензимите во дијагностички цели.
6.5.1. Влијание на температурата
Во рамките на ограничен температурен интервал брзината на ензимските

реакции расте со порастот на температурата.
Промената на брзината на реакцијата при пораст на температурата за 10°C се
нарекува температурен коефициент и се бележи со Q10. Брзината на голем број
биохемиски реакции се удвојува при пораст на температурата за 10°C, односно Q10=2.
За секоја ензимска реакција постои оптимална температура на која реакцијата
е најбрза. Над таа температура брзината на реакцијата нагло опаѓа, главно поради
денатурацијата на ензимот.
За повеќето хумани и анимални ензими оптималната температура е околу 40°C,
а за растителните од 60 - 70°C.
6.5.2. Влијание на концентрацијата на водородните јони
За секој ензим постои таква концентрација на водородните јони во средината во

која се одвива реакцијата при која брзината на ензимската реакција е најголема. Таквата
концентрација на водородните јони се нарекува оптимална pH.
Оптималната pH за еден ист ензим може да се разликува зависно од реакцијата
што ја катализира. Таков е примерот со ензимот лактат дехидрогеназа.
LDH
Пируват + NADH + H+ → Лактат + NAD+ (оптимална pH e 7,5)
LDH
Лактат + NAD+ → Пируват + NADH + H+ (оптимална pH e 9,2)
Во изразито кисела или алкална средина речиси сите ензими иреверзибилно

се денатурираат.
6.5.3. Влијание на концентрацијата на ензимот
При доволно количество на супстрат, почетната брзина на реакцијата што

ја катализира ензимот е право пропорционална со концентрацијата на ензимот.
Овој факт ни овозможува преку мерење на почетната брзина на ензимските
реакции, при одржување на константност на сите други услови, да судиме за
количеството на ензимите, што има значајна практична примена во клиничката
ензимологија. За ова детално ќе говориме подоцна во рамките на ова поглавје.
6.5.4. Влијание на концентрацијата на супстратот
При константни вредности за температурата, pH и концентрацијата на ензимот,

брзината на ензимската реакција е пропорционална со концентрацијата на супстратот
само во услови кога концентрацијата на супстратот е ниска.
Со понатамошно зголемување на концентрацијата на супстратот брзината на
реакцијата се зголемува и понатаму, но сега во помала мерка, односно
непропорционално со покачувањето на концентрацијата на супстратот.
144
Доколку концентрацијата на супстратот уште се зголемува, се постигнува
максималната брзина на ензимската реакција (Vmax), после што концентрацијата на
супстратот повеќе не влијае врз брзината на ензимската реакција (Слика 6.2.).
Концентрацијата на супстратот при која се постигнува половината од
максималната брзина на реакцијата се нарекува Michaelis-Menten-ова константа (Кm).
Michaelis-Menten-овата константа ја претставува состојбата кога ензимот е полузаситен,
односно кога половината од количеството ензим е врзан во ES комплексот, а
половината е во слободна форма. Кm има карактеристична вредност за секоја ензимска
реакција. Така, кај ензимите кои имаат повеќе супстрати, секој супстрат си има своја
карактеристична вредност за Кm.
0.35
0.30 Vmax
0.25 1
2 Vmax
0.20
0.15
0.10
Km
0.05
0.00
0 1000 2000 3000 4000
Легенда:
Vmax – Максимална брзина
Кm – Michaelis-Menten-ова константа
Слика 6.2. Влијание на концентрацијата на супстратот врз брзината на

ензимската реакција
6.5.5. Влијание на ефекторите
Одделни хемиски фактори можат:

1. Да го стимулираат дејството на ензимите - се нарекуваат активатори, или
2. Да го спречуваат дејството на ензимите - се нарекуваат инхибитори.
Активаторите и инхибиторите со заедничко име се означени како ефектори.
1. Освен ензимот и супстратот, за одвивање на ензимските реакции често пати е

потребен и некој трет фактор, односно активатор на ензимот, без чие присуство
ензимската реакција би била невозможна. Многу често како активатори на ензимите се
среќаваат металните јони: Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+ и др. Важно е да се нагласи дека
некои метални јони врз некои ензими дејствуваат како активатори, а врз други ензими
дејствуваат како инхибитори.
2. Инхибицијата на ензимската активност може да биде:

а) Реверзибилна и
б) Иреверзибилна.
145
а) Реверзибилната инхибиција се карактеризира со тоа што инхибиторот се
поврзува за ензимот со слаба врска, па создадениот комплекс ензим-инхибитор може
да дисоцира. Постојат неколку вида на реверзибилна инхибиција:
- Компетитивна,
- Некомпетитивна,
- Акомпетитивна и
- Алостерична инхибиција.
- Компетитивна инхибиција се јавува тогаш кога инхибиторот има многу слична
хемиска структура со супстратот, па му конкурира на истиот при неговото поврзување
за активниот центар на ензимот (англиски, compete – се натпреварува). При тоа, покрај
ензим-супстрат комплекс се создава и ензим-инхибитор комплекс кој е непродуктивен,
односно не може да се распадне на продукт/и и ензим.
- Некомпетитивна инхибиција се јавува тогаш кога инхибиторот нема слична
хемиска структура со супстратот и не му конкурира при неговото поврзување за
активниот центар, туку инхибиторот реверзибилно се поврзува за некое друго место на
ензимската молекула кое е надвор од активниот центар. При ваквото поврзување на
инхибиторот со ензимот доаѓа до конформациони промени на ниво на ензимската
молекула кои резултираат:
- или со оневозможување на поврзувањето на ензимот со супстратот,
- или пак со забавување на реакцијата доколку сепак поврзувањето на
ензимот со супстратот се оствари.
- Акомпетитивна инхибиција се јавува тогаш кога инхибиторот не се поврзува
за слободниот ензим, туку за веќе создадениот ензим-супстрат комплекс и ја
оневозможува неговата конечна трансформација до продукт/и и ензим.
- Алостеричната инхибиција е значајна за регулација на клеточниот
метаболизам. Така на пример, доколку во една низа од ензимски реакции што водат до
биосинтеза на определен продукт, концентрацијата на продуктот се зголеми над
определеното ниво, тогаш тој продукт се поврзува за алостеричниот центар на првиот
од ензимите кои учествуваат во неговата биосинтеза, со што ја намалува неговата
активност. На тој начин самиот продукт со feed back механизам ја регулира својата
биосинтеза.
б) Иреверзибилна инхибиција настанува тогаш кога инхибиторот цврсто и
иреверзибилно се поврзува за ензимот и при тоа ја блокира неговата активност. Поради
тоа иреверзибилните инхибитори уште се нарекуваат и „отрови на ензимите“. Речиси
сите иреверзибилни ензимски инхибитори се токсични супстанции. Така на пример
живата и бакарот иреверзибилно ја инхибираат активноста на ензимите кои содржат -
ЅН групи. Иреверзибилни инхибитори се и многу пестициди и нервни гасови кои се на
база на органофосфати. Тие иреверзибилно ја инхибираат активноста на
холинестеразата на тој начин што вршат фосфорилација на серинот во активниот
центар на овој ензим.
146
6.6. Основи на клиничката ензимологија
Во воведниот дел беше кажано дека основите на ензимологијата ги поставил

Louis Pasteur. Подоцна, со развојот на оваа наука, во втората половина на 20. век, во
рамките на ензимологијата се развила клиничката ензимологија како една посебна
гранка. Клиничката ензимологија може да се дефинира како наука која ги користи
податоците за активноста на ензимите во дијагностички цели. Определувањето на
каталитичката активност на ензимите во голема мерка ја унапредило дијагностиката на
многу заболувања.
6.6.1. Физиолошки основи на дијагностичкото значење на ензимите
Според својот хемиски состав ензимите се главно протеини кои, со оглед на тоа
што се макромолекули, во физиолошки услови не ја преминуваат клеточната мембрана.
Сепак, во крвната плазма се детектира извесно мало количество на интрацелуларни
ензими кои потекнуваат од клетките што нормално изумреле во организмот. Во живите
клетки застапеноста на истите овие ензими е многукратно повисока во однос на нивната
застапеност во крвната плазма. Така на пример, во миокардот има 10 000 пати повеќе
аспартат аминотрансфераза отколку во плазмата.
Во определени случаи, во крвната плазма може да се регистрира зголемено
количество на интрацелуларни ензими. Ова може да биде резултат на различни
процеси и тоа:
1. Зголемена синтеза на ензимите.- Кај децата на пример, во периодот на
раст на коските, интензивирана е функцијата на остеобластите каде е
засилена синтезата на алкалната фосфатаза. Поради тоа, активноста на
алкалната фосфатаза во серумот кај деца е повисока во однос на таа кај
возрасните.
2. Нарушување на пермеабилноста на клеточната мембрана.- При
воспалителни процеси што доведуваат до нарушување на
пермеабилноста на клеточната мембрана, големо количество на ензими
што се локализирани во цитоплазмата поминуваат во крвната плазма.
Така, уште во раниот стадиум на вирусен хепатит се регистрира
покачена серумска активност на аминотрансферазите. Исто така, дури и
при лесни форми на панкреатит расте активноста на α-амилазата и
липазата во серумот.
3. Некроза на клетките.- При некроза, која претставува процес на целосна
дезинтеграција на клетките, клеточната содржина се излева во
екстрацелуларната течност. Поради тоа, некрозата е следена со изразен
пораст на активноста на клеточните ензими во серумот. И додека при
нарушувањето на пермеабилноста на клеточната мембрана расте само
активноста на цитоплазматските ензими, при некроза расте активноста и
на ензимите кои потекнуваат од клеточните органели, пред сè од
митохондриите.
4. Пречки во секрецијата.- Секретите од различни жлезди (панкреас,
плунковни жлезди, простата) содржат ензими. Во физиолошки услови
само еден мал дел од тие ензими нормално поминува во циркулацијата.
Меѓутоа, во случај на пречки во секрецијата, во циркулацијата поминува
значително поголемо количество од овие ензими.
5. Пречки во елиминацијата на ензимите од циркулацијата.- По
навлегувањето во циркулацијата, интрацелуларните ензими релативно
бргу се отстрануваат од крвта. Се смета дека тие не се елиминираат
преку жолчката, туку веројатно биваат подложени на интраваскуларна
деградација.
Освен тоа, еден мал број ензими, и тоа оние кои имаат мала релативна
молекулска маса, можат да го поминат гломеруларниот филтер и да се
147
екскретираат преку урината. Во случај на олигурија или анурија нивната
активност во серумот расте. Таков е случајот со α-амилазата која има
релативно мала молекула.
Времето што е потребно активноста на ензимот во циркулацијата да опадне за

половина од почетната активност се нарекува време на полуживот. Ова време е
различно за различни ензими и се движи од неколку часа до неколку дена. Овие
податоци се прикажани во Табела 6.1.
Табела 6.1. Време на полуживот на ензимите што се од значење за хуманата in

vitro дијагностика
ЕНЗИМ Време на полуживот

Аспартат аминотрансфераза 12-22 часа
Аланин аминотрансфераза 37-57 часа
Креатин киназа околу 15 часа
α-Амилаза 3-6 часа
γ-Глутамил трансфераза 3-4 дена
Лактат дехидрогеназа, изоензим 1 53-173 часа
Лактат дехидрогеназа, изоензим 5 8-12 часа
Алкална фосфатаза 3-7 дена
Како резултат на високата диференцијација на клетките во човековиот

организам, постојат значајни разлики во однос на застапеноста на ензимите во
различни ткива и органи. Некои ензими се карактеристични за определен орган, како
што е на пример случајот со липазата во панкреасот. Други пак се застапени во речиси
сите ткива и органи, како што се аспартат аминотрансферазата и аланин
аминотрансферазата.
Иако има малку ензими што се строго специфични за определен орган, сепак
распределбата на ензимите во поодделни органи е различна, односно можеме да
кажеме дека различните органи си имаат своја карактеристична ензимска слика. Така
на пример, срцевиот мускул содржи креатин киназа, лактат дехидрогеназа, аспартат
аминотрансфераза и аланин аминотрансфераза. Од друга страна, црниот дроб содржи
лактат дехидрогеназа, аланин аминотрансфераза и аспартат аминотрансфераза, а
речиси не содржи креатин киназа (Табела 6.2.).
Сите овие факти се земаат предвид при толкувањето на резултатите од
клиничко-ензимолошките анализи.
Од друга страна, различна е и локализацијата на ензимите во рамките на

самите клетки, што исто така е од значење при толкувањето на резултатите.
Некои ензими, како што се аланин аминотрансферазата и лактат
дехидрогеназата се наоѓаат во цитоплазмата и нивната активност во серумот се
покачува дури и при благи оштетувања на клетките, кога се менува само пропустливоста
на клеточната мембрана.
Други ензими пак се наоѓаат во митохондриите, како што е случајот со глутамат
дехидрогеназата. Овие ензими се ослободуваат од клетките тогаш кога се распаѓаат
митохондриите, а тоа се случува при некроза.
Ензимот аспартат аминотрансфераза се наоѓа и во цитоплазмата и во
митохондриите.
148
Табела 6.2. Застапеност на ензимите што се од значење за хуманата in vitro
дијагностика
ОРГАН ЕНЗИМ Специфичност

Панкреас Липаза ***
α-Амилаза **
Аспартат аминотрансфераза *
Плунковни жлезди α-Амилаза **
Коски Алкална фосфатаза **
Простата Кисела простатична фосфатаза ***
Миокард Креатин киназа **
Лактат дехидрогеназа, изоензим 1 **
Аланин аминотрансфераза *
Скелетни мускули Креатин киназа **
Лактат дехидрогеназа, изоензим 5 **
Црн дроб Лактат дехидрогеназа, изоензим 5 **
Аланин аминотрансфераза **
Жолчни патишта Алкална фосфатаза **
Еритроцити Лактат дехидрогеназа, изоензим 1 **
Легенда:
*** Висока специфичност
** Умерена специфичност
* Ниска специфичност
Во клиничката биохемија, во рутинската лабораториска практика, за дијагностицирање

на различни заболувања и следење на текот на болеста најчесто се користат следните
ензими:
1. Аспартат аминотрансфераза (AST; ASАT; sGOT; GOT),
2. Аланин аминотрансфераза (ALT; ALАT; sGPT; GPT),
3. Креатин киназа (CK, CPK) и нејзиниот изоензим CK-MB,
4. α-Амилаза (AMY),
5. γ-Глутамил трансфераза (γGT; γ-GT; GGT),
6. Лактат дехидрогеназа (LDH) и
7. Алкална фосфатаза (ALP; AP).
Сите овие ензими ќе ги изучиме во рамките на овој курс.
149
6.6.2. Општи принципи на методите за определување на каталитичката активност
на ензимите
Современите рутински методи за определување на каталитичката

активност на ензимите се засноваат на еден единствен принцип:
Ензимот дејствува врз специфичен супстрат, при што се мери:
 или зголемувањето на концентрацијата на продуктот кој
се создава во текот на реакцијата (што е почест случај)
 или намалувањето на концентрацијата на супстратот.
Овој принцип за определување на ензимската активност е воспоставен од
причина што ензимите во биолошкиот материјал се наоѓаат во мошне ниски
концентрации, така што е многу поедноставно (и поевтино) да се определат релативно
поголемите концентрации на продуктот на реакцијата.
При изведувањето на анализите може се работи на тој начин што примерокот во
кој се определува активноста на одреден ензим ќе се помеша со пуферираниот
работен реагенс кој ги содржи сите потребни компоненти за одвивање на ензимската
реакција, освен ензимот, кој пак е присутен во самиот примерок. Со тоа започнува
ензимската реакција. Оваа постапка се нарекува sample start процедура.
Анализите може да се изработуваат и на тој начин што најпрвин примерокот во
кој се определува активноста на ензимот ќе се помеша со пуферираниот реагенс (R1)
кој ги содржи сите потребни компоненти за одвивање на ензимската реакција, освен
супстратот и ензимот. Сега следува период на кратка инкубација, после што во
реакционата смеса се додава супстратот (R2). Со тоа започнува ензимската реакција.
Оваа постапка се нарекува substrate start процедура.
Во основата на принципот за определување на каталитичката активност на

ензимите е теоријата на урамнотежена состојба (steady state) на Briggs и Haldane,
која претставува еден вид надополнување и проширување на теоријата на Michaelis-
Menten. Според оваа теорија во текот на една ензимска реакција можат да се
разликуваат три фази.
1. Непосредно после мешањето на ензимот со супстратот најпрвин мора да се
создаде ензим-супстрат комплекс. Во тој почетен период - иницијална фаза,
создавањето на ензим-супстрат комплексот е многу брзо и не е следено со
пропорционално создавање на продуктот на реакцијата. Поради тоа, во оваа фаза
мерењето на брзината на настанување на продуктот не ни ја дава вистинската слика за
активноста на ензимот. Оваа фаза трае кратко време.
2. Со завршувањето на иницијалната фаза се воспоставува урамнотежена
состојба, кога брзината на создавање на ензим-супстрат комплексот е еднаква со
брзината на неговото распаѓање. Брзината на создавање на продуктот на
реакцијата во фазата на урамнотежена состојба се нарекува почетна (иницијална)
брзина. Во услови на доволно количество на супстрат, иницијалната брзина
зависи само од концентрацијата на ензимот. Поради тоа, фазата на урамнотежена
состојба е најпогодна за мерење на брзината на ензимската реакција, односно за
мерење на каталитичката активност на ензимот.
3. После фазата на урамнотежена состојба брзината на реакцијата опаѓа
поради значително намалување на концентрацијата на супстратот, натрупување на
продукт(и) од реакцијата или евентуално натрупување на продукт/и со инхибиторно
дејство. На крај, реакцијата ќе запре кога ќе се воспостави рамнотежа или кога ќе се
истроши супстратот.
Со современите методи за определување на ензимската активност всушност се

мери почетната (иницијалната) брзина на ензимската реакција. Тоа се всушност методи
на континуирано мерење, каде мерењето се врши континуирано во тек на првите
неколку минути од реакцијата. Имено, откако во реакционата смеса ќе се најдат сите
потребни компоненти за отпочнување на ензимската реакција, реакционата смеса
150
најпрвин кратко се инкубира. Потоа, во фазата на урамнотежена состојба, се врши
отчитување на апсорбанцијата на секоја минута, обично во тек на три минути. Од
отчитаните вредности се пресметува средната вредност на промената на
апсорбанцијата за една минута. Оваа вредност се множи со соодветен фактор, со што
се добива резултатот за активноста на ензимот.
Првите методи на континуирано мерење биле засновани на т.н. оптички тест,
кој се применува и денес. Оптичкиот тест се заснова на принципот што редуцираните
коензими NADH+Н+ и NADРH+Н+ ја апсорбираат светлината помеѓу 300 и 390 nm
(максималната апсорпција е на 339 nm), додека нивните оксидирани форми NAD+ и
NADР+ во тоа подрачје не апсорбираат (Слика 6.3.).
16
+
16 NAD
+
12
NAD
12 NADH
8 NADH
8
4
4
0
0
240 280 320 360
240 280 320 360
Слика 6.3. Теоретски основи на оптичкиот тест
Со практична примена на овие разлики во апсорпцијата на оксидираните и

редуцираните форми на коензимите NAD и NADР, можно е континуирано следење на
оксидо-редукционите реакции преку следење на промената на апсорбанцијата на 339
nm (340 nm).
Така, со оксидација на NADH+Н+ или NADРH+Н+ апсорбанцијата се намалува
пропорционално со трансформирањето на редуцираниот коензим во неговата
оксидирана форма. Обратно, со редукција на NAD+ или NADР+ апсорбанцијата расте.
Наједноставен пример за примена на оптичкиот тест е определувањето на
активноста на лактат дехидрогеназата:
Лактат дехидрогеназа
Пируват + NADH+H +
Лактат + NAD+ (опаѓачка апсорбанција)
Со помош на оптичкиот тест може да се определува и активноста на ензими кои

не спаѓаат во класата на оксидоредуктази, доколку на реакцијата која тие ја
катализираат е можно да се надоврзе реакција со некоја оксидоредуктаза. Таков е
примерот со определувањето на активноста на креатин киназата. Со принципот на оваа
метода ќе се запознаеме понатаму во рамките на ова поглавје.
151
Подоцна биле синтетизирани и бројни нови, иновативни супстрати, најчесто
деривати на р-нитроанилин и р-нитрофенол, кои во тек на ензимската реакција
продуцираат обоени продукти што се определуваат спектрофотометриски.
Со развојот на клиничката ензимологија се развиваат и т.н. оптимизирани
методи со кои се настојува да се обезбедат in vitro услови за одвивање на ензимската
реакција што е можно поблиски до оптималните in vivo услови за определуваниот ензим.
Покрај определувањето на серумската ензимската активност, постои можност за
определување и на серумската концентрација на самиот ензимски протеин, со
ензимско-имунохемиски методи. Таков е примерот со определувањето на
простатичната кисела фосфатаза и на изоензимот на креатин киназата – CK-MB. Сепак,
овие методи немаат широка клиничка примена.
6.6.3. Единици за изразување на ензимската активност
На почетокот од развојот на ензимологијата резултатите од анализите за

определување на активноста на ензимите се изразувале во различни единици кои
најчесто биле именувани според авторот на методата. Со цел да се спречи
хетерогеноста во изразувањето на резултатите, но и за да се овозможи нивна споредба,
Комисијата за ензими при Интернационалната унија за биохемија во 1964 год.
препорачала ензимската активност да се изразува со интернационална единица (IU
или U).
Една интернационална единица одговара на активност на ензимот кој во
една минута катализира промена на еден микромол супстрат.
Во серумот ензимската активност се изразува на еден литар (U/L).
Со воведувањето на SI системот за мери и единици, предложена е употребата
на единицата катал (kat).
Еден катал одговара на активност на ензимот кој во една секунда
катализира промена на еден мол супстрат.
Поради тоа што во клиничката ензимологија при изразувањето на активноста на
ензимите во катали би се добивале многу мали броеви, прифатено е да се користат
единиците микрокатал (μkat), нанокатал (nkat) или пикокатал (pkat).
Врската помеѓу интернационалната единица и каталот е следната:
1 IU = 16,67 nkat
1 kat = 6 x 107 IU
И покрај тоа што каталот е единица што е во согласност со SI системот, сепак тој
не е во широка клиничка употреба, туку во практиката се преферира резултатите од
клиничко-ензимолошките анализи да се изразуваат во U/L.
152
6.7. Аспартат аминотрансфераза
Аспартат аминотрансферазата (позната и како аспартат трансаминаза) (ASAT,

АЅТ) е ензим што ја катализира реверзибилната реакција на трансаминација помеѓу
аспарагинската и α-кетоглутарната киселина, реакција со која всушност се врши
поврзување метаболизмот на јаглехидратите со метаболизмот на протеините (Слика
6.4.).
COO COO
COO CH2 COO CH2
CH2 CH2 CH2 CH2
HC NH3+ + C O C O + HC NH3+
COO COO COO COO

аспартат α-кетоглутарат оксалацетат глутамат
Слика 6.4. Реакција на трансаминација катализирана од AST
Аспартат аминотрансферазата е застапена во бројни органи, ткива и клетки, како

на пример во црниот дроб, миокардот, скелетните мускули, мозокот, бубрезите,
панкреасот, белите дробови, еритроцитите, леукоцитите и др. Највисока застапеност на
AST има во црниот дроб, срцето и скелетните мускули (Табела 6.3.). Не се среќава во
коските и забите.
Табела 6.3. Застапеност на AST во човековиот организам
Орган / клетки Застапеност на АЅТ (U/g)
Црн дроб 59
Срце 52
Скелетни мускули 36
Мозок 15
Бубрези 10
Панкреас 3
Бели дробови 1
Еритроцити 0,8
Постојат два изоензими на аспартат аминотрансферазата:

а) Цитоплазматска АЅТ, застапена со околу 40% од вкупната клеточна
АЅТ и
б) Митохондријална АЅТ, застапена со 60%.
Овие два изоензими ја катализираат истата реакција, но се разликуваат помеѓу
себе според своите својства (афинитет спрема супстратот, електрофоретска
подвижност, термостабилност и сл.).
153
Во согласност со податоците за највисоката застапеност на AST во црниот дроб,
срцето и скелетните мускули, определувањето на активноста на овој ензим во серум е
индицирано при поставувањето на дијагноза и следењето на текот на болеста кај:
а) Хепатобилијарни заболувања,
б) Инфаркт на миокардот и
в) Заболувања на скелетните мускули.
Покрај тоа, серумската активност на АЅТ, заедно со ALT, се определува и како
дел од редовните систематски прегледи.
Кај заболувања на црниот дроб, паралелно со активноста на АЅТ се

определува и активноста на ALT во серумот, а потоа се проценува и вредноста на
количникот на De Ritis: AST/ALT, кој претставува индикатор за степенот на оштетување
на црниот дроб. Имено, количник кој има вредност помала од 1,0 индицира поблаго
оштетување на црниот дроб, главно од инфламаторна природа, додека количник кој е
поголем од 1,0 индицира потешко заболување на црниот дроб кое обично е следено со
некроза.
Кај пациенти со акутен вирусен хепатит активноста на серумската АЅТ може да
биде покачена и до 50 - 70 пати над горната граница на референтните вредности, што
е следено со уште поизразен пораст на активноста на ALT.
При акутен токсичен хепатит активноста на серумската АЅТ исто така бележи
голем пораст, но во овој случај најчесто за АЅТ се мерат повисоки вредности во однос
на ALT.
Кај перзистирачки хроничен хепатит вредноста за АЅТ е нормална или само
благо покачена.
Покачена активност на АЅТ во серум се регистрира и кај опструктивен иктерус и
цироза.
Кај пациенти со инфаркт на миокардот активноста на АЅТ во серум може да
порасне и до 10 пати над горната граница на референтните вредности, при што
порастот е право пропорционален со масата на миокардот која е зафатена со
инфарктот. Активноста на АЅТ почнува да расте 6 часа по инфарктот, ја достигнува
максималната вредност по 24 - 48 часа, после што опаѓа и се враќа во рамките на
референтните вредности во рок од 3 - 5 дена. Секој реинфаркт доведува до појава на
повторен раст на активноста на АЅТ.
Понекогаш после инфаркт на миокардот може да се јави инсуфициенција на
десното срце со стаза во црниот дроб. Во тој случај повторно може да се покачи
активноста на серумската АЅТ, но сега таа потекнува од црниот дроб и е следена со
уште позначително покачување на активноста на ALT.
При стенокардија активноста на серумската AST не расте.
Кај заболувањата на скелетните мускули исто така е индицирано
определување на активноста на овој ензим во серум. Изразито висока серумска
активност на АЅТ се среќава кај пациенти со мускулна дистрофија. Благо покачување
на активноста на АЅТ има кај миозитис, додека кај миастенија гравис активноста на овој
ензим е нормална.
Со оглед на застапеноста на AST во бројни ткива и органи, логично е што
зголемена активност на АЅТ во серум е присутна и при најразлични други заболувања:
акутен панкреатит, хемолитичка анемија, пулмонална емболија, гангрена и др. Благо
покачување на активноста на АЅТ може да се јави и при користење на лекови
(антибиотици, опијати, салицилати и др.), како и при злоупотреба на алкохол.
Кинетичката метода што e во согласност со препораките на IFCC претставува
стандардна метода за определување на активноста на AST, со широка употреба во
клиничко-биохемиските лаборатории и можност за апликација на сите автоматски
биохемиски анализатори.
154
Во рамките на овој курс, определувањето на AST со оваа метода ќе го извршиме
мануелно. За детално изучување и објаснување на принципот на методата ќе го
искористиме протоколот број EN-GOTLI INF1221101 GB 03-2009-17 од производителот
Human, Германија, каде е опишана методата без активација со пиридоксал фосфат.
Оригиналниот протокол е закачен на платформата за е-учење.
Определувањето на AST се врши на тој начин што во првиот чекор од реакцијата

аспартат аминотрансферазата ја катализира реакцијата на трансаминација помеѓу
аспартатот и α-кетоглутаратот, при што се добиваат оксалацетат и глутамат. Во
следниот чекор од реакцијата, оксалацетатот, под дејство на ензимот малат
+
дехидрогеназа (MDH) и во присуство на редуцираниот коензим NADH+H , поминува во
+
малат, при што се ослободува оксидиран NAD . Падот на апсорбанцијата поради
+
трошењето на NADH+H во текот на реакцијата е мерка за активноста на аспартат
аминотрансферазата.
BUF:
TRIS пуфер (рН=7,8) 100 mmol/L
L-аспартат 300 mmol/L
LDH ≥ 0,9 kU/L
MDH ≥ 0,6 kU/L
SUB:
α-кетоглутарат 60 mmol/L
NADH 0,9 mmol/L

За процедурата 1 каде се работи по принципот на substrate start, реагенсите се готови
за употреба.
Реагенсите се стабилни, дури и по отворањето сè до истекот на означениот рок на
употреба, доколку се чуваат заштитени од светлина на 2…8°C.
За процедурата 2 каде се работи по принципот sample start, треба да се подготви
работен реагенс, кој е стабилен 4 недели на 2...8°C, или 5 дена на 15...25°C.
Работниот реагенс се добива со мешање на 1 дел од реагенсот SUB + 4 дела од
реагенсот BUF, во количество кое зависи од бројот на анализите кои треба да бидат
изработени.
Примерок:
Да не се користат хемолитични примероци.
Во рок од 3 дена можна е загуба на активноста на ензимот од ≈8% доколку примерокот
се чува на 4°С и ≈10% доколку примерокот се чува на температура од 20...25°С.
Постапка:
Бранова должина: Hg 365 nm, 340 nm или Hg 334 nm
Температура: 25°C, 30°C или 37°C
Мерење: Опаѓачка апсорбанција
155
Шема за пипетирање, за мануелна изработка на анализите:
Реагенсите и киветите во кои се работи најпрво треба да се загреат на избраната
температура, која мора да биде константна (±0,5°C) во текот на изведувањето на тестот.
Процедура 1:
25°C, 30°C 37°C
BUF (пуфер) 1000 µL 1000 µL
Се промешува и се инкубира 5 минути на избраната температура.
SUB (супстрат) 250 µL 250 µL
Епруветата внимателно се промешува. Се отчитува апсорбанцијата после 1 минута.
Во овој момент се стартува повторно штоперицата при што се мерат апсорбанциите
после точно 1, 2 и 3 минути.
25°C, 30°C 37°C
Епруветата внимателно се промешува. Се отчитува апсорбанцијата после 1 минута. Во
овој момент се стартува повторно штоперицата при што пак се мерат апсорбанциите
Пресметување на активноста на AST:

За пресметување на активноста на AST потребно е најпрвин да се определи ∆А/min,
како средна вредност од трите добиени вредности. Потоа, ∆А/min се множи со
соодветниот фактор, како што е дадено во табелата:
U/L=∆A/min x Sample start Reagent (substrate) start
Бранова должина 25°C, 30°C 37°C 25°C, 30°C 37°C
Hg 334nm 971 1780 1173 2184
340nm 952 1745 1151 2143
Hg 365nm 1765 3235 2132 3971
За ∆А/min која се движи во границите од 0,06-0,08 за Hg 365 nm, односно за ∆А/min во
граници од 0,12-0,16 за Hg 334 nm и 340 nm (за процедурите 1 и 2), за пресметки треба
да се користат само мерењата од првите две минути (1 минута инкубација, 2 минути
мерење).
Доколку промената на апсорбанцијата во минута, односно вредностите за активност на
AST ги надминат вредностите дадени следната табела:
Бранова должина (nm) ∆А/min 25°C, 30°C (U/L) 37°C (U/L)

Hg 365 0.080 170 320
Hg 334 / 340 0.160 190 350
во тој случај се врши разредување на примерокот: 0,1 mL од примерокот се разредува
со 0,9 mL физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува мерењето. Резултатот се
множи со 10.
156
МНОГУ ВАЖНО!!! Во примероци со многу високи активности на ензимот,
иницијалната апсорбанција може да биде многу ниска бидејќи поголемиот дел од
+
NADH+H може да се потроши пред првото отчитување на апсорбанцијата. Во тој
случај примерокот треба да се изработи повторно, со претходно разредување
како што е опишано претходно.
Температура 25°C 30°C 37°C IFCC*

Кај мажи до: 18 U/L 25 U/L 37 U/L 35 U/L
Кај жени до: 15 U/L 21 U/L 31 U/L 31 U/L
* со активација со пиридоксал фосфат
Контрола на квалитет:
Можат да бидат употребени сите контролни серуми кои имаат вредности за AST
определени со оваа метода.
Сепак се препорачува употреба на контролните серуми на Human и тоа: HumaTrol кој е
изработен од анимален серум и Serodos кој е изработен од хуман серум.
Автоматизација на методата:
На барање на корисникот достапни се препораки за апликација на овие реагенси на
различни анализатори.
Секоја лабораторија самата е одговорна за валидација на апликацијата.
Забелешки:
BUF и SUB содржат Na-азид (0,095%) и не смеат да се проголтаат.
Да се избегнува контакт со кожа и мукозни мембрани.
157
6.8. Аланин аминотрансфераза
Аланин аминотрансферазата (позната и како аланин трансаминаза) (ALAT, ALT)

e ензим што ја катализира реверзибилната реакција на трансаминација помеѓу
аланинот и α-кетоглутарната киселина (Слика 6.5.) и како таков има значајна улога во
поврзувањето на метаболизмот на протеините и јаглехидратите.
COO COO
CH2 CH2
CH3 CH2 CH3 CH2
HC NH3+ + C O C O + HC NH3+
COO COO COO COO

аланин α-кетоглутарат пируват глутамат
Слика 6.5. Реакција на трансаминација катализирана од ALT
Овој ензим е локализиран во цитоплазмата, па поради тоа, дури и при благи

воспалителни процеси и оштетувања на ткивата, кога доаѓа само до зголемување на
пропустливоста на клеточните мембрани, ALT излегува од клетките и поминува во
циркулацијата.
ALT се среќава во речиси сите органи и ткива, освен во коските и забите. Во
најголема мерка овој ензим е присутен во црниот дроб, а потоа следуваат скелетните
мускули, срцето, бубрезите, панкреасот, еритроцитите и др. (Табела 6.4).
Табела 6.4. Застапеност на ALT во човековиот организам
Орган / клетки Застапеност на ALT (U/g)
Црн дроб 35,0

Скелетни мускули 3,4
Срце 2,9
Бубрези 1,3
Панкреас 0,7
Еритроцити 0,1
Ако се направи споредба помеѓу AST и ALT во однос на нивната застапеност во

различни органи и ткива, ќе се увиди дека црниот дроб всушност содржи нешто повеќе
AST отколку ALT. Сепак, поради тоа што содржината на ALT во останатите органи е
релативно ниска, ALT се смета за ензим кој е доста специфичен за црниот дроб.
Следствено, активноста на ALT во серум е покачена при најразлични
заболувања на хепатобилијарниот тракт.
Најголем пораст се регистрира при акутен вирусен хепатит кога активноста на
ALT може да порасне и до 70 - 100 пати над горната граница на референтните
вредности, а потоа опаѓа паралелно со падот на концентрацијата на билирубинот.
Значајно е исто така што при акутен вирусен хепатит активноста на обете
аминотрансферази (трансаминази) - AST и ALT започнува да расте дури до три недели
пред појавата на останатите клинички знаци на болеста.
158
Кај токсичен хепатит исто така се регистрираат високи серумски вредности за
ALT. Но, како што беше претходно истакнато, во овој случај најчесто за АЅТ се мерат
повисоки вредности во однос на ALT.
Кај перзистирачки хроничен хепатит серумската активност на овој ензим е
обично во референтните граници или е само малку покачена.
Покачена активност на серумската ALT се среќава и кај цироза и опструктивен
иктерус.
При заболувањата на панкреасот (акутен или хроничен панкреатит или пак
карцином на панкреасот) исто така може да биде регистрирано зголемување на
активноста на ALT во серумот. Тоа може да е резултат на оштетувањето на самиот
панкреас, но може да биде и резултат на секундарното оштетување на црниот дроб.
Кај инфаркт на миокардот серумската активност на ALT се зголемува на сличен
начин како и онаа на AST, односно ги достигнува максималните вредности по 24 - 48
часа после инфарктот. Но, поради релативно малата содржина на ALT во миокардот
најчесто ниту таа максимална вредност не ја преминува горната граница на
референтните вредности. Меѓутоа, ако со инфарктот е зафатена релативно голема
маса на срцевиот мускул, тогаш активноста на ALT може да ја премине горната
референтна вредност. Поради тоа ALT се користи како показател за проценка на
тежината на инфарктот.
Како што беше кажано претходно, понекогаш после инфаркт на миокардот може
да се јави инсуфициенција на десното срце со стаза во црниот дроб. Во тој случај
порастот на ALT во серумот потекнува од црниот дроб и има повисока вредност од онаа
на AST.
Благо покачување на активноста на АLТ се јавува при користење на лекови
(антибиотици, опијати, салицилати и др.) или при злоупотреба на алкохол.
Кинетичката метода што e во согласност со препораките на IFCC претставува
стандардна метода за определување на активноста на ALT. Оваа метода има широка
примена во клиничко-биохемиските лаборатории, особено поради можноста за нејзина
апликација на сите автоматски биохемиски анализатори.
Во рамките на овој курс, определувањето на ALT ќе го извршиме мануелно. За детално
изучување и објаснување на принципот на методата ќе го искористиме протоколот број
EN-GPTLI INF1221201 GB 03-2009-17 од производителот Human, Германија, каде е
опишана методата без активација со пиридоксал фосфат. Оригиналниот протокол е
закачен на платформата за е-учење.
Определувањето се врши на тој начин што во првиот чекор од реакцијата аланин

аминотрансферазата ја катализира реакцијата на трансаминација помеѓу аланинот и α-
кетоглутаратот, при што се добиваат пируват и глутамат. Во следниот чекор, пируватот,
под дејство на ензимот лактат дехидрогеназа (LDH) и во присуство на редуцираниот
+
коензим NADH+H , се трансформира во лактат, при што се ослободува оксидиран
+ +
NAD . Падот на апсорбанцијата поради трошењето на NADH+H во текот на реакцијата
е мерка за активноста за ALT.
BUF:
L-аланин 750 mmol/L
LDH ≥ 1,2 kU/L
159
SUB:
α-кетоглутарат 90 mmol/L
NADH 0,9 mmol/L

За процедурата 1 во која се работи по принципот на substrate start, реагенсите се
готови за употреба.
употреба, доколку се чуваат заштитени од светлина на 2...8°C.
За процедурата 2 во која се работи по принципот sample start, треба да се подготви
работен реагенс, кој е стабилен 4 недели на 2...8°C, или 5 дена на 15...25°C.
Примерок:
Во период од 3 дена можна е загуба на активноста на ензимот од ≈10% доколку
примерокот се чува на 4°С и дури до ≈17% ако се чува на температура од 20...25°С.
Постапка:

25°C, 30°C 37°C
Се промешува и се инкубира 5 минути на избраната температура.
25°C, 30°C 37°C
160
Пресметување на активноста на ALT:
За пресметување на активноста на ALT потребно е најпрвин да се определи ∆А/min,
како средна вредност од трите добиени вредности. Потоа, ∆А/min се множи со
соодветниот фактор, како што е дадено во табелата:
U/l=∆A/min x Sample start Reagent (substrate) start
Бранова должина 25°C, 30°C 37°C 25°C, 30°C 37°C
Hg 334nm 971 1780 1173 2184
340nm 952 1745 1151 2143
Hg 365nm 1765 3235 2132 3971
За ∆А/min која се движи во границите од 0,06-0,08 за Hg 365 nm, односно за ∆А/min во
граници од 0,12-0,16 за Hg 334 nm и 340 nm (за процедурите 1 и 2), за пресметки треба
да се користат само мерењата од првите две минути (1 минута инкубација, 2 минути
мерење).
Доколку промената на апсорбанцијата во минута, односно вредностите за активност на
ALT ги надминат вредностите дадени во табелата:
Бранова должина (nm) ∆А/min 25°C, 30°C (U/L) 37°C (U/L)
Hg 365 0,080 170 320
Hg 334 / 340 0,160 190 350
со 0,9 mL физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува мерењето. Резултатот се
множи со 10.
МНОГУ ВАЖНО!!! Во примероци со многу високи активности на ензимот,

иницијалната апсорбанција може да биде многу ниска бидејќи поголемиот дел од
+
NADH+H може да се потроши пред првото отчитување на апсорбанцијата. Во тој
случај примерокот треба да се изработи повторно, со претходно разредување
како што е опишано претходно.
Температура 25°C 30°C 37°C IFCC*

Кај мажи до: 22 U/L 30 U/L 42 U/L 45 U/L
Кај жени до: 17 U/L 23 U/L 32 U/L 34 U/L
* со активација со пиридоксал фосфат
Параграфите за контрола на квалитет, автоматизација на методата и забелешките се

идентични како кај протоколот за AST.
161
6.9. Креатин киназа
Креатин киназата (CK) [се нарекува уште и креатин фосфокиназа (CPK)] е ензим
што ја катализира реверзибилната реакција на пренесување на фосфат помеѓу креатин
фосфатот и ADP, односно помеѓу креатинот и АТР (Слика 6.6). При контракција на
мускулите, ATP се троши и се преведува во ADP. Во такви услови, креатин киназата ја
катализира реакцијата на рефосфорилација на ADP до ATP, користејќи го креатин
фосфатот како извор на енергија.
NH 2 NH 2
N N
N N
N N N N
OH OH OH OH OH
HO O O O HO O O O O
P P P P P
O O O O O
HO OH 2+ HO OH
Mg
ADP ATP
EC 2.7.3.2
NH NH
OH
HO + HO
N N P O + H N NH
O CH3 H OH O CH3 H
Слика 6.6. Ензимска активност на креатин киназата
Молекулата на CK претставува димер кој се состои од еднакви или различни

мономери. Мономерот M (од англискиот збор muscle, мускул) и мономерот B (од
англискиот збор brain, мозок) се спојуваат во димери: MM, MB или BB и на тој начин се
создаваат три изоензими.
- Изоензимот MM е најмногу застапен во скелетните мускули.
- Изоензимот BB е најмногу застапен во мозокот.
- Изоензимот MB е најмногу застапен во миокардот.
Овие три изоензими се среќаваат во цитоплазмата.
Покрај овие три, постои уште еден изоензим (CK-Mt) кој е лоциран помеѓу
внатрешната и надворешната митохондријална мембрана.
За CK е карактеристично тоа што има 2 активни центри.
Креатин киназата понекогаш може да се јави во макромолекуларна форма.
Познати се две макромолекуларни форми на CK.
1. Макромолекуларната форма тип 1 вообичаено претставува
комплекс од CK-BB и IgG, иако се опишани и други комплекси, како
на пример комплексот од CK-MM и IgA.
Комплексот од CK-BB и IgG интерферира со имуноинхибиторната
метода за определување на активноста на CK-MB.
Поради тоа, подобри резултати се добиваат со ензимско-
имунохемиските методи за определување на масата на CK-MB.
2. Макромолекуларната форма тип 2 претставува олигомер на CK-Mt.
Друга значајна карактеристика на креатин киназата е нејзината релативна
нестабилност, поради оксидација на –SH групата во активниот центар. Поради тоа, при
определување на активноста на CK во серумски примероци, во реагенсот се додаваат
162
компоненти што поседуваат –SH групи (најчесто N-ацетилцистеин – NAC), со што
оксидираниот ензим се реактивира.
CK најмногу е застапена во скелетните мускули, во мозокот и во срцевиот мускул,
а сосема незначително ја има во мазните мускули, бубрезите и црниот дроб. Поради
тоа, во клиничката практика активноста на CK во серум се определува кај болести
на скелетните мускули и при инфаркт на миокардот.
Многу високи вредности на CK во серумот се карактеристични за пациенти со
мускулна дистрофија и акутна рабдомиолиза. Активноста на серумската CK е доста
висока кај миозитис. Кај миастенија гравис пак активноста на серумската CK е во
границите на референтните вредности. Активноста на CK во серумот се зголемува и
после тежок физички напор. Исто така, интересен е феноменот на зголемување на
содржината на CK-MB во скелетните мускули кај тренирани маратонци, поради што
доаѓа до зголемување и на серумската CK-MB.
Кај инфаркт на миокардот веќе после 3 часа, а најдоцна после 6 часа,
активноста на CK во серумот на пациентот започнува да расте. Максималното ниво се
достигнува обично после 24 часа (12 - 36 часа), при што во серумот можат да се измерат
вредности на CK и до 5 пати повисоки од референтните. По 3 - 5 дена активноста на CK
се нормализира. Отстапки од ваквиот тек, во смисла на пораст на активноста на CK и
по 36 часа од настанувањето на инфарктот или пак отсуство на нејзино нормализирање
после петтиот ден, се јавуваат при комплициран миокарден инфаркт.
Кај стенокардија или белодробен инфаркт активноста на CK во серумот на
пациентот останува во рамките на референтните вредности.
Со оглед на тоа што зголемената серумска активност на CK може да потекнува
од скелетните мускули (силни удари, повреди, тежок физички напор, интрамускулни
инјекции и сл.), специфичноста овој ензим за дијагностицирање на инфаркт на
миокардот не е голема. Поради тоа, во одредени недоволно јасни случаи, неопходно е
покрај определувањето на активноста на вкупната серумска CK да се определи и
активноста на изоензимот CK-MB. За таа цел вообичаено се користи имуноинхибиторна
метода, каде специфичен антисерум ги инхибира сите М субединици што се присутни
во примерокот, а потоа се определува само активноста на B субединиците. При тоа,
основна претпоставка е дека во примерокот не е присутен изоензимот CK-BB, ниту
комплекси од CK-BB и IgG. Нивното присуство во примерокот за анализа значајно
интерферира со определувањето, па во такви случаи неопходно е да се определи
масата на CK-MB протеинот со ензимско-имунохемиска метода. Сепак, овде треба да
се потенцира дека во последно време приматот на најсензитивни и најспецифични
биомаркери за инфаркт на миокардот го преземаат срцевите тропонини, кои патем
речено не се ензими, па нивното дијагностичко значење и методите за нивно
определување ќе ги разработиме преку изработка на семинарски работи.
Бројни лекови во фармаколошки дози можат да влијаат врз вредноста на
серумската CK. Зголемена активност на серумската CK е регистрирана и кај околу 60%
од пациентите со хипотиреоза.
Постојат неколку методи за определување на активноста на креатин киназата, но во
оваа прилика ние ќе ја обработиме оптимизираната стандардна метода според
препораките на Германското здружение за клиничка хемија, со користење на протоколот
EN-CK-M INF1200501 GB 03-2009-15, од производителот Human, Германија.
Креатин киназата го катализира трансферот на фосфатна група од креатин фосфат на
аденозин дифосфатот (ADP), при што како продукти се добиваат креатин и аденозин
трифосфат (АТР). Формираниот АТР се искористува за преведување на глукозата во
глукоза-6-фосфат, при што се ослободува ADP. Оваа реакција е катализирана од страна
на ензимот хексокиназа (HK) чија максимална активност е изразена во присуство на
магнезиумови јони. Глукоза-6-фосфатот понатаму се оксидира под дејство на ензимот
163
глукоза-6-фосфат дехидрогеназа (G6P-DH) при што се добива 6-фосфоглуконолактон,
а коензимот NADP+ се редуцира до NADPH+H+.
Зголемувањето на апсорбанцијата на 340 nm, што се должи на формирањето на
NADPH+H+, е пропорционално со активноста на CK во примерокот.
BUF:
Имидазолен пуфер (рН 6,7) 0,1 mol/L
Глукоза 20 mmol/L
Mg-ацетат 10 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
ENZ:
ADP 2,0 mmol/L
AMP 5,0 mmol/L
Диаденозин пентафосфат 10 µmol/L
NADP 2,0 mmol/L
Креатин фосфат 30 mmol/L
HK (хексокиназа) >2,5 U/mL
G6P-DH >1,5 U/mL
N-ацетил цистеин 20 mmol/L

Содржината од реагенсот ENZ се раствора со 3 mL од реагенсот BUF.
Реагенсите се стабилни сè до истекот на рокот на траење доколку се чуваат на
температура од 2...8°С.
Работниот реагенс по неговата подготовка е стабилен 10 дена на температура од 2...8°С
или 32 часа на 15...25°С.
Примерок:
Можна е загуба на активноста на ензимот од 2% доколку примерокот се чува 7 дена на
4°С или 24 часа на 25°С.
Хемоглобинот во концентрации до 200 mg/dL не интерферира со тестот.
Постапка:
Мерење: Растечка апсорбанција
Шема за пипетирање:
Реагенсите и киветите треба да бидат загреани до избраната температура која треба
да се одржува константна за време на анализата во интервал од ± 0,5°C.
Семи-микро метода
Температура 25°C / 30°C 37°C
Да се пипетира во киветите
Се промешува. Се отчитува апсорбанцијата после 3 минути на 25°C, после 2 минути на
30°C, односно после една минута на 37°C. Во овој момент повторно се стартува
штоперицата при што пак се мерат апсорбанциите после точно 1, 2 и 3 минути.
164
Пресметување на активноста на креатин киназа:
Од отчитаните вредности за апсорбанциите А0, А1, А2 и А3 се пресметува средната
промена на апсорбанцијата во минута (∆А/min).
Активноста на ензимот во примерокот се пресметува во U/L, со користење на следните
фактори:
25°C / 30°C 37°C
∆А/min (Hg 334 nm) x 4207 8252
∆А/min (340 nm) x 4127 8095
∆А/min (Hg 365 nm) x 7429 14542
Методата е линеарна до активност од 1000 U/L.
Доколку активноста на ензимот во примерокот го надминува опсегот на линеарноста
на методата, тогаш 0,1 mL од примерокот се разредува со 1,0 mL физиолошки раствор
(0,9% NaCl) и се повторува мерењето. Резултатот се множи со 11.
Референтни вредности (U/L):
Температура 25°C 30°C 37°C

Мажи 10 - 80 15 - 125 24 - 190
Жени 10 - 70 15 - 110 24 - 170
Можат да бидат употребени сите контролни серуми кои имаат вредности за CK
Овој кит е наменет за мануелна употреба. За употреба на автоматски биохемиски
анализатори се препорачува китот со каталошки број 12015. За тој кит постојат
апликации за различни анализатори кои се достапни на барање на корисниците.
Забелешки:
BUF содржи Na-азид (0,095%). Не смее да се проголта.
165
6.10. α-Амилаза
α-Амилазата е ензим со хидролитичко дејство врз α-1,4 гликозидните врски на

скробот и гликогенот, при што овие супстрати се хидролизираат главно до малтоза и во
помали количества до малтотриоза и смеса од разгранети олигосахариди (декстрини).
Најмногу е застапена во плунковните жлезди и во панкреасот, а ја има и во
тестисите, овариумите, скелетните мускули, белите дробови и масното ткиво, но во
значително помали количества.
Молекулата на α-амилазата е мала, па поради тоа таа лесно го поминува
гломеруларниот филтер и се екскретира со урината.
Во крвната плазма α-амилазата понекогаш се појавува во комплекс со
имуноглобулините, како макроамилаза.
Со електрофореза α-амилазата од серумот или урината може да се раздвои на
неколку изоензими, од кои најзначајни се саливарниот и панкреасниот.
Определувањето на активноста на α-амилазата во серум и урина има
најголемо дијагностичко значење кај болестите на плунковните жлезди и
панкреасот.
Покачени вредности на α-амилазата во серум и урина се среќаваат кај различни
заболувања на плунковните жлезди: инфекции, опструкција на одводните каналчиња,
тумори.
Вредноста на α-амилазата расте и по хируршки интервенции врз плунковните
жлезди.
Кај акутен панкреатит активноста на α-амилазата во серумот започнува да расте
3 - 12 часа по започнувањето на болеста, го достигнува максимумот по 24 -36 часа, а
потоа почнува да опаѓа и може да се нормализира по 2 - 4 дена. Во урината активноста
на овој ензим почнува да расте 6 - 10 часа по започнувањето на болеста, а се
нормализира по 3 - 4 дена.
Кај хроничен панкреатит порастот на активноста на α-амилазата во серумот е
помалку изразен, а понекогаш таа може да биде и во рамките на референтните
вредности.
Кај карцином на панкреасот активноста на α-амилазата во серумот може да
варира, а во урината е најчесто покачена.
Кај тешка некроза на панкреасот може да биде регистрирано намалување на
активноста на α-амилазата.
Зголемена активност на α-амилазата има и кај болести на билијарниот тракт,
перфорација на чир на желудник, перитонитис, акутен апендицитис, интестинална
опструкција, илеус, постоперативни состојби, бубрежна инсуфициенција и сл.
Зголемена активност на α-амилазата може да се регистрира и како резултат на
ектопичното создавање на овој ензим од страна на малигни тумори на овариумите и
белите дробови.
Поради тоа што α-амилазата се екскретира со урината, многу често, покрај
определувањето на нејзината активност во серумот, таа се определува и во урината.
Има примери кога активноста на овој ензим во серумот е во рамките на
референтните вредности, додека во урината е зголемена, на пример кај хроничен
панкреатит и кај карцином на панкреасот.
Висока активност пак во серумот, без соодветно покачување во урината се
регистрира во два случаи:
а) Ако се работи за бубрежна инсуфициенција, кога α-амилазата не може да се
екскретира со урината поради оштетувањето на бубрезите.
б) Кај макроамилаземија, кога макромолекулите на комплексите на α-амилазата
со имуноглобулините не можат да поминат низ гломеруларниот филтер.
166
За определување на активноста на α-амилазата во серум или урина се опишани повеќе
различни методи. Во рамките на овој курс ние нема детално да ги изучуваме
карактеристиките и лимитирачките фактори кај секоја од нив. Овде ќе ја изучиме само
методата каде за определување на активноста на α-амилазата се користи еден
иновативен синтетички супстрат, 2-хлоро-4-нитрофенил-малтотриозид (CNPG3). Овој
супстрат директно реагира со α-амилазата и не бара присуство на други дополнителни
ензими. Како резултат на ензимската реакција се формира обоен продукт 2-хлоро-4-
нитрофенол (CNP). Генерирањето на CNP условува зголемување на апсорбанцијата,
што е право пропорционално со содржината на α-амилазата во примерокот.
Ние детално ќе ја изучиме оваа метода преку обработка на протоколот број EN-AMYLI
INF1201801 GB 01-2009-13, од производителот Human, Германија.
Метода е калибрирана според новата IFCC метода на Lorentz и сор.5 со цел да се
добијат идентични референтни вредности.
RGT:
MES пуфер (рН=6,0) 36 mmol/L
CNPG3 1,6 mmol/L
Ca-ацетат 3,6 mmol/L
Na-хлорид 37 mmol/L
K-тиоцијанат 253 mmol/L
Na-азид 0,095%

RGT е готов за употреба.
Неотворениот реагенс RGT е стабилен сè до означениот рок на употреба доколку се
чува на 2...8°C.
После отворањето реагенсот е стабилен до 12 недели ако се чува заштитен од светлина
на температура од 2...8°C или 4 недели на 15...25°C.
При работа со него мораме да ја одбегнеме контаминацијата.
Примерок:
Серум, хепаринизирана плазма или урина.
Доколку примерокот се чува 5 дена на температура од 4...25°C, нема да настане
промена на активноста на ензимот.
Постапка:
Бранова должина: Hg 405 nm, (400 – 410 nm)
Температура: 25°C, 37°C

температура која мора да биде константна (±0,5°C) во текот на изведувањето на тестот.
Температура 25°C 37°C

Реагенс (RGT) 1000 µL 1000 µL
5
Lorentz, K., (1998): Clin Chem Lab Med 36, 185-203.
167
Епруветата внимателно се промешува и се инкубира 1 минута. Се отчитува
апсорбанцијата и во исто време се вклучува штоперицата. Апсорбанцијата се отчитува
повторно после точно 1, 2 и 3 минути.
Пресметување на активноста на α-амилаза:

За пресметување на активноста на α-амилазата, потребно е најпрвин да се определи
∆А/min, како средна вредност од трите добиени вредности.
Потоа, ∆А/min се множи со еден од следниве фактори за да се добие активноста на α-
амилазата:
U/L (25°C) = ∆А/min x 9864
U/L (37°C) = ∆А/min x 24820
IFCC: U/L (37°C) = ∆А/min x 10183
Доколку промената на апсорбанцијата во минута ја надмине вредноста ∆А/min=0,300,
со 0,5 mL физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува мерењето.
Температура 25°C 37°C IFCC

Серум / плазма: 120 U/L 220 U/L 28-100 U/L
Урина (случаен примерок) 600 U/L 1000 U/L ≤460 U/L
24h урина** 450 U/24h 900 U/24h ≤410 U/24h
** пресметани вредности
Можат да бидат употребени сите контролни серуми кои имаат вредности за α-амилазата
На барање на корисникот достапни се препораки за апликација на реагенсот на
Забелешки:
1. Плунката и потта содржат α-амилаза и поради ова треба да бидеме особено
внимателни да не го контаминираме примерокот за испитување. Не смее да се
пипетира со уста и мора да се избегне контакт на продолжетоците на
микропипеторот со кожата.
2. Реагенсот RGT може да пожолти со стоење, но тоа нема да влијае на тестот се
додека апсорбанцијата на слепата проба е <0,200. Во спротивно RGT повеќе не
смее да се користи.
3. Реагенсот содржи Na-азид (0,095%) и не смее да се проголта.
168
6.11. γ-Глутамил трансфераза
γ-Глутамил трансферазата (γ-GT) е ензим кој катализира три типа реакции во

организмот:
1. Реакција на хидролитичко отцепување на глутаминската киселина која е
врзана со некој пептид, аминокиселина или амин.
2. Реакција на екстерна транспептидација, кога отцепениот остаток на
глутаминска киселина се пренесува врз аминокиселина или пептид кои
имаат функција на акцептор.
3. Реакција на интерна транспептидација, кога отцепените остатоци на
глутаминска киселина се врзуваат меѓу себе и создаваат γ-
глутамилглутамински пептиди.
γ-Глутамил трансферазата најмногу е застапена во бубрезите и тоа на ниво на
проксималните тубули и Хенлеовата петелка. Ја има и во црниот дроб, панкреасот и
тенкото црево. Претежно е врзана за клеточните мембрани, но ја има и во
цитоплазмата, во микрозомите.
Иако овој ензим е најзастапен во бубрежното ткиво, γ-глутамил трансферазата
што се среќава во крвната плазма главно потекнува од хепатобилијарниот систем.
Поради тоа, во клиничката пракса, γ-глутамил трансферазата се користи како
показател токму за оштетувањата на хепатобилијарниот систем.
При акутен вирусен хепатит активноста на γ-глутамил трансферазата во серумот
расте од 2 - 5 пати над горната граница на референтните вредности.
Кај перзистирачки хроничен хепатит активноста на γ-GT може благо да порасне.
Кај агресивен хроничен хепатит и кај цироза активноста на γ-GT во серумот е
висока, особено ако овие состојби се последица од злоупотреба на алкохол.
При опструктивна жолтица активноста на γ-GT во серумот значително расте
и тоа од 5 - 30 пати над горната граница на референтните вредности.
Високи вредности на серумската γ-GT се регистрираат и при карцином на црниот
дроб.
За γ-GT е карактеристично тоа што нејзината активност е индуцирана од страна
на некои лекови (барбитурати, антиепилептици, контрацептиви и др.) и особено од
алкохолот. Индуктивниот ефект на алкохолот врз активноста на γ-GT е особено силно
изразен, па поради тоа определувањето на активноста на овој ензим во серумот се
користи како screening-тест за алкохоличари. И додека кај алкохоличарите активноста
на γ-GT во серумот е изразито зголемена, под дејство на погоре споменатите лекови
нејзината активност само благо се покачува.
Преку обработка на протоколот број EN-GT-LQ INF1221301 GB 03-2009-16 од
производителот Human, Германија, ќе ја изучиме кинетичката колориметриска метода
за определување на активноста на γ-глутамил трансферазата според Persijn & van der
Slik.
Активноста на γ-глутамил трансферазата се определува со помош на:
L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид и глицилглицин.
Продукти на оваа реакција се:
L-γ-глутамил-глицилглицин и 5-амино-2-нитробензоат.
Создавањето на 5-амино-2-нитробензоатот условува пораст на апсорбанцијата кој е
право пропорционален со активноста на ензимот.
Оваа метода е стандардизирана според методата препорачана од IFCC.
169
BUF:
Глицилглицин 150 mmol/L
SUB:
L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид 20 mmol/L

За процедурата 1 во која се работи по принципот на reagent start, реагенсите се готови
употреба, доколку се чуваат на 2…8°C.
работен реагенс, кој е стабилен 6 недели на 2...8°C или 5 дена на 15...25°C. Работниот
реагенс се подготвува со мешање на 1 дел од реагенсот SUB + 4 дела од реагенсот
BUF, во количество кое зависи од бројот на анализите кои треба да бидат изработени.
Примерок:
Серум, EDTA-плазма. Да не се користат хемолитични примероци.
Доколку примерокот се чува 7 дена на температура од 4...25°C, нема да настане
промена на активноста на ензимот.
Постапка:
Бранова должина: Hg 405 nm, (400 – 420 nm)
Температура: 25°C, 30°C, 37°C
Температура 25°C, 30°C, 37°C
BUF (пуфер) 1000 µL
Се промешува и се инкубира 1 минута на избраната температура.
SUB (супстрат) 250 µL
Температура 25°C, 30°C, 37°C
Работен реагенс 1000 µL
170
Пресметување на активноста на ензимот γ-глутамил трансфераза:
За пресметување на активноста на γ-глутамил трансферазата, потребно е најпрвин да
се определи вредноста на ∆А/min, како средна вредност од трите измерени вредности.
∆А/min се множи со еден од следниве фактори за да се добие активноста на ензимот:
U/L=∆A/min x Scasz метода (405 nm) IFCC метода (405 nm)

Reagent start 1421 1606
Sample start 1158 1309
Доколку промената на апсорбанцијата во минута ја надмине вредноста од 0,200 во тој
случај се врши разредување на примерокот: 0,1 mL од примерокот се разредува со 0,5
mL физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува мерењето.
Температура 25°C 30°C 37°C IFCC

Кај мажи: 6-28 U/L 8-46 U/L 11-61 U/L < 55 U/L
Кај жени: 4-18 U/L 7-29 U/L 9-39 U/L < 38 U/L
Можат да бидат употребени сите контролни серуми кои имаат вредности за γ-глутамил
трансферазата определени со оваа метода.
Забелешки:
1. BUF и SUB содржат Na-азид (0,095%) и не смеат да се проголтаат.
2. За време на реакцијата се ослободува 5-амино-2-нитробензоат како продукт, кој
е отровен доколку се вдише, проголта или се апсорбира преку кожата. Ако
реакционата смеса дојде во контакт со кожа или мукозни мембрани, местото
треба обилно да се измие со вода.
3. Отпадниот материјал да се отстрани во согласност со локалните законски
прописи за отпаден материјал опасен за околината.
171
6.12. Лактат дехидрогеназа
Лактат дехидрогеназата (LDH) е ензим кој ја катализира реверзибилната

реакција на трансформирање на лактат во пируват.
LDH ја има во сите клетки и ткива, а најмногу во црниот дроб, скелетните
мускули, миокардот и еритроцитите.
LDH во клетките е локализирана исклучиво во цитоплазмата и поради тоа е
доволно само малку да се промени пермеабилноста на клеточната мембрана, па
ензимот да помине во циркулацијата.
LDH е тетрамер во чиј состав влегуваат два вида мономери: Н (heart, срце) и М
(muscle, мускул) кои се комбинирани на следниот начин: 4Н, 3Н1М, 2Н2М, 1Н3М и 4М.
На тој начин се формираат 5 различни изоензими кои се означени како LDH1, LDH2,
LDH3, LDH4 и LDH5. Изоензимите LDH1 и LDH2 кои се составени од 4Н, односно од
3Н1М мономери соодветно, се најзастапени во миокардот и еритроцитите. Изоензимите
LDH4 и LDH5 кои се составени од 1Н3М, односно од 4М мономери соодветно, се
најзастапени во црниот дроб и скелетните мускули.
Согласно застапеноста во различните органи и ткива, определувањето на LDH
во серум има значење кај инфаркт на миокардот, болести на црниот дроб,
хематолошки заболувања и карциноми.
Кај инфаркт на миокардот активноста на LDH во серумот започнува да расте 8

- 10 часа по инфарктот, ја достигнува максималната вредност по 3 - 5 дена кога, кај
некомплициран инфаркт, започнува да се намалува. Се нормализира во рок од 8 - 14
дена по инфарктот. При инфаркт на миокардот, максималната вредност на LDH
достигнува и до 5 пати повисоки вредности во однос на референтните. Поради ваквото
специфично движење на серумската активност на LDН, нејзиното определување е
значајно кај пациенти со миокарден инфаркт кои доцна стигнале во болница, кога
активноста на CK и AST веќе се нормализирала. Слично како кај CK и AST, и за LDH е
карактеристично тоа што нејзината активност не расте при стенокардија.
Кај болестите на црниот дроб и жолчните патишта е карактеристично умерено

зголемување на активноста на LDH во серумот.
Кај акутен вирусен хепатит активноста на овој ензим расте само 2 - 3 пати над
горната референтна вредност.
Кај токсичен хепатит порастот на активноста на LDH е поголем и изнесува до 10
пати над горната референтна вредност.
Кај перзистирачки хроничен хепатит активноста на LDH во серумот е обично во
рамките на референтните вредности.
Кај агресивен хроничен хепатит и цироза активноста на LDH во серумот е
зголемена, но не во толкава мерка како активноста на AST и ALT.
Кај опструктивна жолтица активноста на LDH во серумот е обично нормална или
слабо покачена.
Еритроцитите содржат значително количество на LDH, па поради тоа кај

пациенти со хемолитичка анемија се мерат високи вредности за активноста на овој
ензим во серумот.
Од истата причина примероците кои хемолизарале во текот на земањето на
крвта или после тоа, не треба да се користат за определување на активноста на LDH,
поради тоа што кај нив ќе се измери висока серумска активност која потекнува од
хемолизата што се случила во преаналитичката фаза.
При мегалобластна анемија, каде постои неефективна еритропоеза (најчесто, но
не и исклучиво поради недостиг на витамин В12 и/или фолна киселина), клетките
прекурсори на еритроцитите интензивно се распаѓаат во коскената срцевина и
ослободуваат големо количество на LDH1 и LDH2. Од таа причина кај овие пациенти
можат да се измерат екстремно високи вредности за серумска LDH, и до 50 пати над
172
горната референтна вредност. Овие вредности се нормализираат после соодветен
третман на пациентот.
И леукоцитите содржат значително количество на LDH, па поради тоа
активноста на овој ензим е зголемена во серумот кај пациенти заболени од акутна
миелоична леукемија и инфективна мононуклеоза.
Покачување на активноста на LDH во серумот се регистрира и кај малигни
заболувања.
За in vitro определување на активноста на лактат дехидрогеназата е искористена
нејзината физиолошка функција за катализирање на реверзибилната реакција на
трансформација на лактатот во пируват. При тоа, in vitro може да се искористи било која
насока од реверзибилната реакција: пируват→лактат или лактат→пируват. Меѓутоа,
треба да се нагласи дека IFCC има развиено референтна метода лактат→пируват,
оптимизирана за LDH1, на 37°C.
Во рамките на овој курс ние ќе ја изучиме методата што е препорачана од SCE
(Scandinavian Committee of Enzymes), согласно протоколот број EN-LDHUV INF1221401
GB 03-2009-16 од Human, Германија.
Според оваа метода, лактат дехидрогеназата ја катализира редукцијата на пируватот
во лактат, во присуство на редуцираниот коензим NADH+H+, при што се добива
оксидиран NAD+. Падот на апсорбанцијата поради трошењето на NADH+H+ во текот на
реакцијата е мерка за активноста на лактат дехидрогеназата.
BUF:
Пируват 1,5 mmol/L
SUB:
NADH 0,8 mmol/L

употреба, доколку се чуваат на 2…8°C.
Пуферот BUF мора да биде заштитен од светлина.
работен реагенс, кој е стабилен 3 недели на 2...8°C или 3 дена на 15...25°C.
Работниот реагенс мора да биде заштитен од светлина.
Примерок:
Во период од 3 дена можна е загуба на активноста на ензимот од 8% доколку
примерокот се чува на 4°С или 2% ако се чува на температура од 15...25°C.
173
Постапка:
Бранова должина: Hg 334 nm, 340 nm, Hg 365 nm
Температура: 25°C, 30°C, 37°C
Температура 25°C, 30°C 37°C
Се промешува и се инкубира од 1-5 минути на избраната температура.
тој момент се стартува повторно штоперицата при што пак се мерат апсорбанциите
Температура 25°C, 30°C 37°C
Пресметување на активноста на LDH:

За пресметување на активноста на LDH потребно е најпрвин да се определи вредноста
на ∆А/min, како средна вредност од трите добиени вредности.
∆А/min се множи со еден од следниве фактори за да се добие активноста на LDH:
U/L=∆A/min x Reagent start Sample start
25°C, 30°C 37°C 25°C, 30°C 37°C
Hg 334 nm 10275 20390 8250 16345
340 nm 10080 20000 8095 16030
Hg 365 nm 18675 37060 15000 29705
Факторот на конверзија за претворање на резултатот добиен со SCE методата во

вредност според методата препорачана од IFCC е следниот:
U/L (LDH SCE) x 0,4796= U/L (LDH IFCC)
Доколку промената на апсорбанцијата во минута ја надмине вредноста од 0,150 при
мерења на Hg 334 nm и 340 nm, односно од 0,070 при мерења на Hg 365 nm, во тој
случај се врши разредување на примерокот: 0,1 mL од примерокот се разредува со 0,9
mL физиолошки раствор (0,9% NaCl) и се повторува мерењето.
174
Температура 25°C 30°C 37°C IFCC
Кај возрасни: 120-240 U/L 160-320 U/L 225-450 U/L
Кај мажи до: < 243 U/L
Кај жени до: < 244 U/L
Деца до 12 до 500 U/L
месеци
Забелешки:
BUF и SUB содржат Na-азид (0,095%) и не смеат да се проголтаат.
6.13. Алкална фосфатаза
Со називот алкална фосфатаза е опфатена група ензими кои во алкална средина

дејствуваат хидролитички врз естерската врска на фосфатните моноестри. Освен тоа,
во присуство на акцептор, овие ензими дејствуваат и трансфосфорилирачки.
Опишани се поголем број изоензими на алкалната фосфатаза од кои позначајни
се: цревната, бубрежната, коскената, хепаталната и плаценталната.
Определувањето на активноста на алкалната фосфатаза во серум има

значење кај болестите на коските кои се асоцирани со зголемена активност на
остеобластите и кај болестите на црниот дроб и жолчните патишта.
Активноста на алкалната фосфатаза во серум физиолошки е покачена кај децата
во периодот на раст на коските, што е резултат на активноста на остеобластите.
При зараснување на коскените фрактури и создавање на калус исто така се
бележи зголемување на активноста на алкалната фосфатаза во серумот. Отсуството на
ваквиот пораст е знак за намалено создавање на калус.
Зголемена серумска активност на алкалната фосфатаза се регистрира при
различни заболувања на коските: Пагетова болест, остеомалација, рахитис, малигни
тумори на коските. За диференцијална дијагноза на коскените болести освен активноста
на алкалната фосфатаза потребно е да се определат и концентрациите на калциум и
фосфор во серум и урина.
Определувањето на активноста на алкалната фосфатаза во серум има големо
значење за диференцијалната дијагностика на болестите на хепатобилијарниот такт, во
прв ред за разликување на опструктивната од хепатоцелуларната жолтица.
Така, кај опструктивната жолтица активноста на алкалната фосфатаза во
серумот е најчесто над три пати повисока од нормалната, а може да порасне и до 12
пати над горната референтна вредност.
Кај хепатоцелуларната жолтица пак активноста на алкалната фосфатаза во
серумот е само благо покачена, а понекогаш дури е и нормална.
Висока активност на алкалната фосфатаза во серум се регистрира и кај
карцином на црниот дроб.
Зголемена активност на серумската алкална фосфатаза се среќава и кај

заболувањата на бубрезите: гломерулонефритис, пиелонефритис, хронична бубрежна
инсуфициенција.
Во серумот на бремени жени, во третиот триместар од бременоста, има
зголемена активност на алкалната фосфатаза која потекнува од плацентата.
175
Методата за определување на активноста на алкалната фосфатаза се заснова врз
препораките на експертите од IFCC (International Federation of Clinical Chemistry).
Алкалната фосфатаза ја катализира реакцијата на конверзија на 4-нитрофенил
фосфатот до 4-нитрофенол, во присуство на 2-амино-2-метил-1-пропанол и
магнезиумови јони.
Порастот на апсорбанцијата поради создавањето на 4-нитрофенолот е директно
пропорционален со активноста на алкалната фосфатаза.
Human, протокол број: EN-APAM1 INF1211701 GB 03-2009-13.
BUF:
2-амино-2-метил-1-пропанол, (рН=10,4) 435 mmol/L
Магнезиум ацетат 2,5 mmol/L
Цинк сулфат 1,2 mmol/L
Na-азид 0,095 %
SUB:
p-нитрофенил фосфат 60 mmol/L
Na-азид 0,095 %

По отворањето реагенсите се стабилни до 28 дена, доколку се чуваат на температура
од 2…8°C.
SUB мора да биде заштитен од светлина.
За процедурата 2 во која се работи по принципот на sample start, треба да се подготви
работен реагенс, кој е стабилен 2 недели на 2...8°C или 5 дена на 15...25°C.
Работниот реагенс мора да биде заштитен од светлина.
Примерок:
Доколку примерокот се чува 7 дена на 20...25°С можна е загуба на активноста на
ензимот од ≈10%. На 4°С нема загуба на активноста на ензимот во период до 7 дена.
Постапка:
Бранова должина: Hg 405 nm, 400 - 420 nm
Температура: 30°C, 37°C
176
Се промешува и се инкубира 1 минута на избраната температура.
Пресметување на активноста на алкална фосфатаза:

За пресметување на активноста на алкалната фосфатаза, потребно е најпрвин да се
определи вредноста на ∆А/min, како средна вредност од трите добиени вредности.
∆А/min се множи со еден од следниве фактори за да се добие активноста на ALP:
U/L=∆A/min x 405 nm
Reagent start 3433
Sample start 2757
Доколку промената на апсорбанцијата во минута ја надмине вредноста од 0,250 или
активноста на ензимот е над 700 U/L, во тој случај се врши разредување на примерокот
на следниот начин: 0,1 mL од примерокот се разредува со 0,5 mL физиолошки раствор
(0,9% NaCl) и мерењето се повторува.
Во серум U/L IFCC
Температура 30°C 37°C 37°C
Кај мажи: 38-94 53-128 40-129
Кај жени: 28-78 42-98 35-104
Можат да бидат употребени сите контролни серуми кои имаат вредности за алкалната
фосфатаза определени со оваа метода.
177
Забелешки:
2. Како производ од реакцијата се ослободува 4-нитрофенол кој е отровен доколку
се инхалира, проголта или се апсорбира преку кожата. Ако некој од реагенсите
дојде во контакт со кожа или мукозни мембрани, местото мора обилно да се
исплакне со вода.
3. Триглицеридите до 2000 mg/dL, хемоглобинот до 250 mg/dL и билирубинот до 40
mg/dL не интерферираат со тестот.
6.14. Некои други позначајни ензими за хуманата in vitro дијагностика
6.14.1. Липаза
Липазата (LIP) е ензим кој ја катализира реакцијата на хидролиза на естрите на
глицеролот со вишите масни киселини. Најголем дел од липазната активност во крвната
плазма потекнува од панкреасната липаза.
Молекулата на липазата е мала и лесно го минува гломеруларниот филтер, но
потоа целосно се реапсорбира и катаболизира од страна на бубрежните проксимални
тубуларни клетки. Поради тоа во урината нормално липаза не е присутна.
Определувањето на активноста на липазата во серум е од особено значење
за дијагностицирање на акутен панкреатит.
Кај акутен панкреатит активноста на липазата во серумот почнува да расте по 4
- 8 часа од појавата на првите симптоми, највисоката вредност ја достигнува по 24 часа,
а потоа опаѓа во тек на 8 - 14 дена. Максималната вредност на липазата при акутен
панкреатит може да биде од 2 - 50 пати повисока од горната референтна вредност.
Порастот на липазата не мора да е пропорционален со тежината на нападот.
Кај акутен панкреатит покачените вредности на липазата во серумот се
задржуваат подолго време во однос на оние на α-амилазата.
Покачување на активноста на серумската липаза може да се регистрира и при
акутен холецистит или при опструкција на одводните каналчиња на панкреасот.
Поради фактот што липазата се филтрира на ниво на гломерулите, кај
пациентите со намалена брзина на гломеруларната филтрација се регистрира покачена
активност на липазата во серумот. Поради тоа посебно треба да се внимава при
интерпретација на лабораториските резултати за активноста на серумската липазата
кај пациенти со бубрежна инсуфициенција.
6.14.2. α-Хидроксибутират дехидрогеназа

α-Хидроксибутират дехидрогеназата (α-HBDH, HBDH) не претставува посебен
ензим туку ги обединува изоензимите LDH1 и LDH2. Овие два изоензими на LDH можат
да реагираат со α-хидроксибутиратот како супстрат, од каде и потекнува името α-HBDH.
Останатите изоензими на LDH со овој супстрат реагираат сосема незначително. На тој
начин брзо и едноставно, без примена на техниката на електрофореза, може да се
определи активноста на LDH1 и LDH2 во серумски примерок, што порано имало особено
значење во дијагностиката на инфаркт на миокардот. Во денешно време, срцевите
тропонини се метода на избор во дијагностиката на акутен инфаркт на миокардот.
6.14.3. Глутамат дехидрогеназа

Глутамат дехидрогеназата (GLDH) е ензим кој ја катализира реакцијата на
отстранување на водород од глутаминската киселина. При тоа се создава соодветна
имино киселина, која спонтано хидролизира до α-кетоглутарна киселина. Како продукт
од оваа реакција се создава и амонијак кој, како исклучително токсичен, веднаш се
отстранува од организмот.
178
Глутамат дехидрогеназата е исклучиво митохондријален ензим. Најмногу ја има
во црниот дроб, миокардот и бубрезите, а во помала мерка и во мозокот, скелетните
мускули и леукоцитите.
Определувањето на активноста на глутамат дехидрогеназата во серум се
користи, заедно со останатите хепатални ензими, за диференцијална дијагностика на
болестите на црниот дроб. Поради тоа што станува збор за исклучиво
митохондријален ензим, неговите покачени вредности индицираат присуство на
некротичен процес во црниот дроб.
6.14.4. Кисела фосфатаза

Терминот кисела фосфатаза ги опфаќа сите ензими кои вршат хидролиза на
фосфатни моноестри, а имаат оптимална активност во кисела средина. Киселата
фосфатаза најмногу е застапена во простатата, коските, поточно во остеокластите,
слезената, тромбоцитите и еритроцитите.
Простатичната кисела фосфатаза силно се инхибира со тартарат.
Така, доколку се определат:
- активноста на вкупната кисела фосфатаза (без тартарат) и
- активноста на непростатичната кисела фосфатаза (со тартарат),
а потоа се пресмета нивната разлика, ќе се добие активноста на простатичната кисела
фосфатаза. Простатичната кисела фосфатаза порано многу се користела при
дијагностицирање и следење на третманот кај заболувањата на простатата. Денеска,
со откривањето и широката употреба на PSA (простата специфичен антиген),
употребата на простатичната кисела фосфатаза е речиси напуштена.
Активноста на непростатичната кисела фосфатаза во плазмата е зголемена при
висока активност на остеокластите, и тоа:
- физиолошки, кај децата во период на раст и
- патолошки, кај заболувања на коските како што се: Пагетовата
болест и карциноми кои го зафатиле коскеното ткиво.
Активноста на непростатичната кисела фосфатаза во плазмата е зголемена и
при Gaucher-овата болест, кога таа потекнува од абнормалните макрофаги од
слезената и останатите ткива.
Киселата фосфатаза in vitro е мошне нестабилна, па поради тоа е неопходно,
веднаш по центрифугирањето на крвта, серумот да се одвои и да се закисели. Заради
високата застапеност на киселата фосфатаза во еритроцитите, хемолизирани
примероци не се погодни за изработка на оваа анализа.
6.14.5. Холинестераза
Холинестеразата е ензим кој ги хидролизира естрите на холинот и тиохолинот.
Терминот холинестераза обединува два ензима:
1. Едниот ензим се означува како вистинска холинестераза. Таа се среќава во
еритроцитите, белите дробови, слезената, нервните завршетоци и сивата
мозочна маса. Одговорна е за моменталната хидролиза на ацетилхолинот кој
се ослободува на нервните завршетоци.
2. Другиот ензим се означува како псевдохолинестераза или серумска
холинестераза. Таа се среќава во црниот дроб, панкреасот, срцето, белата
мозочна маса и серумот. Нејзината биолошка функција е недоволно
истражена.
Холинестеразната активност во плазмата во најголема мерка потекнува од
псевдохолинестеразата.
Определувањето на активноста на холинестеразата во серум го има следното
дијагностичко значење:
- Како тест за функцијата на црниот дроб,
- Како индикатор за можно труење со пестициди,
179
- За детекција на пациенти со генетски условени атипични форми на
овој ензим кај кои постои ризик од пролонгиран одговор кон некои
миорелаксанти кои се користат при хируршките интервенции.
- Поради тоа што холинестеразата се синтетизира во црниот дроб, таа може да
се искористи како показател за неговата функција. Имено, ако се исклучи труење со
пестициди и постоење на атипични форми на ензимот, намалената активност на
холинестеразата во серумот индицира нејзина намалена синтеза, односно нарушување
на функцијата на црниот дроб.
- Пестицидите на база на органофосфати имаат својство да ја инхибираат
активноста на холинестеразата што, при високи дози, може да резултира со смртен
исход. При изложување на такви препарати активноста на холинестеразата во серумот
може да опадне и до 40% пред да се појават првите симптоми на труење. Поради тоа
потребно е да се контролира нејзината активност во плазмата кај работници кои работат
со пестициди на база на органофосфати.
- Сукцинилхолинот кој се користи како миорелаксант при хируршките
интервенции се хидролизира од страна на холинестеразата. При нормална активност
на ензимот фармаколошкиот ефект на миорелаксантот трае онолку колку што е
потребно за извршување на хируршката интервенција.
Меѓутоа, кај пациенти кај кои се присутни генетски условени атипични форми на
холинестеразата, активноста на ензимот е ниска. Поради тоа разградувањето на
миорелаксантот е бавно, па пациентот може да влезе во пролонгирана состојба на
апнеа кога ќе биде потребна механичка вентилација.
Покрај тоа што имаат ниска активност, атипичните форми на холинестеразата се

карактеризираат и со тоа што во мала мерка се инхибираат со дибукаин.
Поради тоа, покрај вкупната активност на холинестеразата неопходно е да се определи
и т.н. дибукаински број кој означува колкав процент од ензимската активност е
инхибиран со дибукаинот.
На пример:
А) Вкупната активност на ензимот (без дибукаин) изнесува 10 000 U/L
Б) Активноста на неинхибираниот ензим (со дибукаин) изнесува 2 000 U/L
Се пресметува дибукаинскиот број:
2 000
Дибукаински број (%) = 100 - (100 x ) =100 - 20=80%
10 000
Кај нормални хомозиготи дибукаинскиот број изнесува > 75%

Кај хетерозиготи дибукаинскиот број изнесува од 45 – 72%
Кај атипични хомозиготи дибукаинскиот број изнесува <30%
180
7. МАКРОЕЛЕМЕНТИ И ЖЕЛЕЗО
Со испитување на хемискиот состав на човековиот организам констатирано

е дека во него се среќаваат голем број хемиски елементи кои процентуално различно
се застапени.
Според нивната процентуална застапеност во организмот, хемиските елементи

се поделени во две групи:
1. Макроелементи, чија концентрација во организмот изнесува 0,04% и повеќе и
2. Микроелементи, чија концентрација во организмот изнесува под 0,04%.
Процентуалната застапеност, како и вкупната маса на макроелементите и дел од
микроелементите кај човек тежок 70 kg, се прикажани во Табела 7.1.
Првите шест макроелементи од табелата (кислород, јаглерод, водород, азот,

калциум и фосфор) заедно се застапени со вкупно 98% од телесната маса на човекот.
Од друга страна сите микроелементи заедно се застапени со помалку од 0,1%.
Определувањето на дел од макроелементите во телесните течности има
особено клиничко значење. Тука во прв ред се натриумот (Na+), калиумот (К+) и хлоридот
(Cl-), кои заедно со бикарбонатниот анјон (HCO3-), го дефинираат основниот
електролитен статус. Концентрацијата на бикарбонатниот анјон се определува
пресметковно, со користење на вредностите на pH на крвта и парцијалниот притисок на
CO2. Инструментите со кои се вршат овие мерења скоро задолжително поседуваат и
електрода за определување на парцијалниот притисок на кислородот што е исто така
параметар од витално значење. Дијагностичко значење има и определувањето на
калциум, фосфат и магнезиум. Со сите овие параметри и со методите за нивно
определување ќе се запознаеме во рамките на ова поглавје.
Денес се смета дека најмалку 13 микроелементи имаат есенциелно значење за
нормално функционирање на човековиот организам и тоа: железо, бакар, цинк, хром,
манган, флуор, јод, стронциум, молибден, кобалт, селен, никел и ванадиум. Во рамките
на овој курс ќе биде обработено само железото, како микроелемент кој најчесто се
определува во клиничката пракса.
181
Табела 7.1. Елементарен состав на човековиот организам
Просечно кај човек од 70

Елемент % од телесна маса
kg
Макроелементи
Кислород 63 44,1 kg
Јаглерод 20 17
Водород 10 7
Азот 3 2,1
Калциум 1 700 g
Фосфор 1 700
Калиум 0,25 175
Сулфур 0,2 140
Хлор 0,14 100
Натриум 0,14 100
Магнезиум 0,04 28
Микроелементи
Железо 0,005 4g
Цинк 0,00125 1
Бакар 0,0002 150 mg
Јод 0,000036 25
Манган 0,00003 20
Молибден 0,00003 20
Кобалт 0,000015 10
182
7.1. Електролити
Електролитите претставуваат наелектризирани честички со мала маса кои се

присутни во интрацелуларната и екстрацелуларната течност.
Според видот на електричниот полнеж електролитите се класифицирани во две
групи:
- Катјони, кои се позитивно наелектризирани и во електрично поле се движат
кон катодата и
- Анјони, кои се негативно наелектризирани и во електрично поле се движат кон
анодата.
Физиолошки најзначајни електролити се: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, H2PO4-,
HPO42-, SO42-, како и некои органски анјони како што е лактатот.
Аминокиселините и протеините во воден раствор исто така носат електричен
полнеж, но поради нивната специфична хемиска природа која е различна од хемиската
природа на погоре наведените јони, тие вообичаено се разгледуваат одделно.
Одржувањето на водената хомеостаза претставува императив за секој жив
организам. Кај човекот и цицачите одржувањето на осмотскиот притисок и
дистрибуцијата на водата во организмот се условени главно од четирите најзначајни
електролити: натриум (Na+), калиум (К+), хлорид (Cl-) и бикарбонат (HCO3-).
Освен улогата што ја имаат во одржување на водената хомеостаза, овие четири
електролити ги имаат и следните важни функции:
- Учествуваат во одржување на рН во организмот,
- Обезбедуваат правилна функција на срцето и мускулите,
- Учествуваат во оксидо-редукциони реакции,
- Се јавуваат како кофактори на некои ензими.
Всушност речиси и да не постои метаболен процес кој не е на некој начин
поврзан со овие четири електролити. Нивните патолошки вредности во телесните
течности можат да бидат или причина или последица од бројни заболувања. Поради
тоа, определувањето на електролитниот статус, што всушност опфаќа определување
на натриум, калиум, хлорид и бикарбонат, е една од најзначајните активности на секоја
клиничко-биохемиска лабораторија.
Четирите основни електролити (натриум, калиум, хлорид и бикарбонат) во
телесните течности се јавуваат претежно како слободни јони. За разлика од нив, висок
процент од калциумот, магнезиумот и микроелементите се врзани за различни
протеини, за што подетално ќе се познаеме подоцна во рамките на ова поглавје.
7.1.1. Натриум
Натриумот претставува главен катјон на екстрацелуларната течност. Тој е

одговорен за речиси половината од осмотската сила на крвната плазма. Поради тоа,
натриумот има централна улога во одржувањето на осмотскиот притисок во
екстрацелуларната течност и нормалната дистрибуција на водата во организмот.
Неговите серумски концентрации се движат во рамките од 135 – 145 mmol/L и не зависат
од возраста.
Храната генерално е сиромашна со натриум и затоа истиот се внесува како
нејзин додаток во форма на NaCl (готварска сол). Се препорачува дневното внесување
на готварска сол да биде под 5,8 g (Dietary Guidelines for Americans, 2015). Меѓутоа, со
стандардна исхрана во организмот се внесува значително поголемо количество NaCl
(дури и до 15 g дневно), кој речиси целосно се апсорбира во гастроинтестиналниот
тракт. Вишокот се екскретира преку бубрезите кои се најзначајни регулатори на
количеството на Na+, a со тоа и на количеството на вода во организмот.
Натриумот слободно се филтрира во гломерулите. Во проксималните тубули 60
– 70% од филтрираниот натриум активно се реапсорбира. При тоа водата и хлоридот
пасивно го следат, со што се одржуваат осмотската еквивалентност и
електронеутралноста. Во слегувачкиот дел на Henle-овата петелка пасивно се
183
реапсорбира само водата но не и електролитите, поради високата осмотска сила на
интерстициелната течност во овој регион. Во качувачкиот дел на Henle-овата петелка
активно се реапсорбира хлоридот, а натриумот го следи. На ниво на дисталните тубули,
под дејство на хормонот алдостерон од кората на надбубрежните жлезди натриумот се
реапсорбира во замена за калиум и во помала мерка H+ кои се секретираат за да се
одржи електронеутралноста, a водата го следи натриумот пасивно. Тоа се случува при
низок притисок во артериолите кој претставува стимулус за бубрежните
југстагломеруларни клетки да лачат ренин. Тој, преку ангиотензинот ја стимулира
секрецијата на алдостерон. На ниво на дисталните тубули дејствува и
антидиуретичниот хормон (вазопресин) од задниот резен на хипофизата кој се лачи при
намален волумен на плазмата или нејзина зголемена осмолалност и условува
реапсорпција на водата. Вишокот натриум се екскретира. Освен преку урината,
натриумот се екскретира и преку потта.
Хипонатремијата претставува состојба кога концентрацијата на Na+ во
плазмата ќе падне под долната граница на референтните вредности. Се манифестира
со наузеа и општа слабост, со ментална конфузија кога вредноста ќе достигне под 120
mmol/L и тешка ментална состојба при вредности од 90 - 105 mmol/L. Невролошките
симптоми карактеристични за хипонатремијата се резултат на навлегувањето на вода
(со цел да се одржи осмотската рамнотежа) во клетките на централниот нервен систем.
Доколку хипонатремијата се развива брзо, клинички симптоми можат да се јават и при
концентрации на Na+ од приближно 125 mmol/L.
Хипонатремијата може да се јави во услови на хипоосмотска, хиперосмотска или
изоосмотска плазма. Поради тоа, определувањето на осмолалноста на плазмата
претставува значаен иницијален чекор при проценка на хипонатремијата. Со оглед на
тоа што натриумот е примарна детерминанта на осмолалноста на плазмата,
хипоосмотската хипонатремија е најчеста.
Хипернатремијата претставува состојба кога концентрацијата на Na+ во
плазмата ќе се покачи над горната граница на референтните вредности.
Хипернатремијата е секогаш хиперосмотска. Симптомите и овде се примарно
невролошки, но овој пат поради загубата на вода од клетките на централниот нервен
систем. Симптомите на хипернатремија вклучуваат: тремор, иритабилност, атаксија,
конфузија и кома. Слично како кај хипонатремијата, и овде од брзината на развој на
хипернатремијата ќе зависи при која плазматична концентрација на натриум ќе се јават
симптомите.
7.1.2. Калиум
Калиумот претставува главен интрацелуларен катјон. Во клетките на различни

ткива неговата просечна концентрација е околу 150 mmol/L, додека во еритроцитите таа
изнесува 105 mmol/L. Референтните вредности за калиум во серум кај возрасни се од
3,5 – 5,0 mmol/L, a за новороденчиња од 3,7 – 5,9 mmol/L.
Високите интрацелуларни концентрации на калиумот се одржуваат со помош на
активноста на Na+,K+-ATP-азната пумпа која, трошејќи енергија во форма на ATP,
континуирано го транспортира калиумот во клетките наспроти градиентот на
концентрацијата. Физиолошки, оваа пумпа е од клучно значење за одржување на
јонскиот градиент неопходен за пренесување на нервните импулси и за мускулната
контракција. Освен тоа, разбирањето на активноста на оваа пумпа е значајно со цел да
се избегнат определени грешки во рамките на преаналитичката фаза при
определувањето на концентрацијата на калиумот, што подетално ќе биде објаснето
подолу во текстот.
Калиумот е доволно застапен во храната, па при рационална исхрана не се
очекува негов дефицит. Се апсорбира во гастроинтестиналниот тракт, дел се користи
од страна на клетките, а вишокот се екскретира преку бубрезите.
184
Во бубрезите калиумот се филтрира во гломерулите, а потоа скоро целосно се
реапсорбира на ниво на проксималните тубули. На ниво на дисталните тубули се
секретира во замена за натриумот, под дејство на алдостеронот.
Нарушувањата на хомеостазата на калиумот се јавуваат во контекст на
сериозни и животозагрозувачки состојби. Поради тоа, на квантитативното
определување на калиумот треба да му се обрне големо внимание и да се направи
напор да се избегнат сите потенцијални грешки во преаналитичката и аналитичката
фаза.
Хипокалемијата се дефинира како намалена концентрација на калиум во
крвната плазма, под долната граница на референтните вредности. Клинички се
манифестира со мускулна слабост, иритабилност и парализа. Плазматични
концентрации пониски од 3,0 mmol/L се асоцирани со сериозни невро-мускулни
нарушувања и индицираат критично ниво на намалување на интрацелуларната
содржина на калиумот. Со понатамошно намалување на плазматичните концентрации
на калиумот доаѓа до појава на тахикардија и сериозни нарушувања на срцевата
спроводливост (промени на EKG), што може да доведат до кардијален арест.
Хиперкалемијата, која претставува состојба на покачена концентрација на
калиум во крвната плазма, над горната граница на референтните вредности, се
манифестира со ментална конфузија, слабост, трпнење и парализа на екстремитетите,
како и слабост на респираторната мускулатура. Кардијалните ефекти на
хиперкалемијата вклучуваат брадикардија и промени на срцевата спроводливост што
се манифестираат со патолошко EKG. Пролонгирана тешка хиперкалемија (над 7,0
mmol/L) може да доведе до периферен васкуларен колапс и кардијален арест. Постои
извесна интер-индивидуална варијабилност во однос на концентрацијата на
плазматичен калиум кога започнуваат да се манифестираат симптомите на
хиперкалемија, но генерално симптомите се секогаш присутни при плазматични
концентрации над 6,5 mmol/L. Концентрации над 10,0 mmol/L се обично фатални.
7.1.3. Определување на натриум и калиум
Определувањето на концентрациите на натриум и калиум се едни од најчестите

анализи во клиничко-биохемиските лаборатории, особено во болнички услови. За
определување на натриум и калиум во биолошки примероци се развиени различни
видови методи и тоа:
1. Електрохемиски,
2. Методи со атомска апсорпциона спектрофотометрија,
3. Методи со пламена емисиона спектрофотометрија и
4. Спектрофотометриски методи.
И покрај бројноста и разновидноста на методите, сепак во современите
клиничко-биохемиски лаборатории најзастапени се електрохемиските методи каде се
користат јон-селективни електроди (ISE – ion-selective electrode). Овие методи обично
се означуваат како ISE методи.
Јон-селективните електроди претставуваат потенциометриски електроди кои
поседуваат специфична мембрана што е селективно пропустлива за еден единствен
јонски вид. Јон-селективната мембрана го претставува „срцето“ на јон-селективната
електрода, поради тоа што од неа зависи селективноста (специфичноста) на самата
електрода. Јон-селективните мембрани обично се изработени од стаклени, кристални
или полимерни материјали. Потенцијалот што се создава како резултат на
интеракцијата помеѓу мембраната и примерокот за анализа е пропорционален со
логаритамот од јонската активност, односно концентрацијата на испитуваниот јон. За
калибрација на методите се користат стандарди со позната концентрација. Вообичаено,
калибрацијата е честа и автоматизирана.
Постојат два типа ISE методи: индиректни и директни, кои се разликуваат во
однос на принципот на определувањето.
185
1. Индиректнитите ISE методи се карактеризираат со тоа што пред да се
пристапи кон мерење, примерокот се дилуира со релативно голем волумен
на соодветен дилуент. На тој начин се врши прекривање на целата површина
на електродата која е релативно голема, а од друга страна се намалува
концентрацијата на протеини на површината на самата електрода. Индиректните
ISE методи вообичаено се застапени во рамките на автоматските биохемиски
анализатори со голем капацитет.
2. Директните ISE методи се карактеризираат со тоа што примерокот се носи
до мерната електрода без претходна дилуција. Директните ISE методи обично
се застапени во состав на апаратите што се користат во единиците за интензивна
нега и ургентните центри, т.н. point-of-care инструменти.
Овде е многу важно да се нагласи дека силно липемични примероци, како и
примероци со особено висока концентрација на вкупни протеини не треба да се
употребуваат за анализа на натриум и калиум со индиректни ISE методи. Имено, кај
такви примероци се добиваат лажно пониски вредности, што е резултат на дилуцијата
на примерокот. Оваа интерференција е избегната кај директните ISE методи. Поради
тоа, денес директните ISE методи се сметаат како методи на избор за определување
на електролитите.
За определување на натриум и калиум во рутинските клиничко-биохемиски
лаборатории многу често се користи серум кој е добиен од примерок од венска крв, а
анализите обично се изработуваат на автоматски биохемиски анализатори кои имаат
вградени јон-селективни електроди. Во единиците за интензивна нега и ургентните
центри вообичаено е концентрацијата на натриум и калиум да се определува во
хепаринизирана полна крв (капиларна, венска или артериска), на посебни анализатори
прилагодени за таа намена. Концентрацијата на натриум и калиум може да се
определува и во хепаринизирана плазма. При употребата на хепарин како
антикоагуланс, треба да се користат само негови литиумови или амониумови соли.
Со оглед на тоа што за определување на натриум и калиум можат да се користат
различни видови примероци, логично е да се очекува разлика во однос на
референтните вредности. И навистина, постои таква разлика, но само разликата
помеѓу серум и плазма кај калиумот е клинички сигнификантна. Имено, зависно од
бројот на тромбоцитите во примерокот, во серум се мерат нешто повисоки
концентрации на калиум во однос на плазмата, поради тоа што дополнително
количество калиум се ослободува во серумот како резултат на руптурата на
тромбоцитите во процесот на коагулација на примерокот. За да се избегне оваа
интерференција, најдобро е како примерок за анализа да се користи хепаринизирана
плазма или полна крв.
Особено треба да се внимава за определување на концентрацијата на калиум
да не се користи хемолизиран примерок поради тоа што при хемолиза калиумот
излегува од еритроцитите, што е причина за добивање на погрешен, лажно повисок
резултат. Доколку визуелно се регистрира и најблаг степен на хемолиза, истото мора
да се нотира во самиот лабораториски наод, со назнака дека хемолизата влијае врз
вредноста на калиумот. Проблем секако претставува идентификувањето на
хемолизирани примероци кога се работи со полна крв. Во таков случај, доколку постои
и најмал сомнеж за хемолиза, се постапува на тој начин што мал дел од примерокот се
центрифугира и визуелно се верифицира присуството или отсуството на хемолиза.
Хемолизата не претставува значаен проблем при определувањето на натриумот
поради тоа што интрацелуларната содржина на натриум во еритроцитите е ниска и
изнесува само околу 1/10 од онаа во плазмата.
Клинички значајна преаналитичка грешка при определувањето на калиумот
претставува ладењето на примерокот пред изработка на анализата. Како што беше
кажано претходно, одржувањето на високата интрацелуларна концентрација на
калиумот е резултат на активноста на Na+,K+-ATP-азната пумпа, која користи енергија
од гликолизата. При ладење на примерокот, интензитетот на гликолизата, а со тоа и
активноста на Na+,K+-ATP-азната пумпа се намалува, поради што калиумот дифундира
186
од крвните клетки во плазмата. Дифундирање на калиумот надвор од крвните клетки се
случува исто така и при долготрајно стоење на примерокот на собна температура,
но овој пат поради истрошувањето на самата глукоза. И двете ситуации резултираат со
добивање на погрешен, лажно покачен резултат.
Така, за добивање на најточни резултати за калиумот, се препорачува следната
постапка:
1. Земање на крв во епрувета со хепарин.
2. Манипулација со епруветата на собна температура.
3. Одвојување на плазмата во тек на неколку минути по земањето на крвта, со
центрифугирање без ладење.
(Во праксата, одвојување на плазмата во рок од 1 час на собна температура се
смета дека нема да придонесе за значајни грешки.)
Пумпање со дланката пред венепункцијата и неослободување на езмархот кога
ќе почне да тече крвта во епруветата, условува зголемување на калиумот кој во овој
случај потекнува од мускулните клетки.
Иако поретко, концентрациите на натриум и калиум рутински се определуваат и
во урина.
7.1.4. Хлорид
Хлоридот претставува најзастапен екстрацелуларен анјон. Неговите серумски

концентрации кај здрави лица се движат од 100 – 108 mmol/L. Заедно со натриумот,
хлоридот е најзначајната детерминанта на осмотската сила на крвната плазма.
Хлоридот има значајна улога во регулацијата на водената хомеостаза, осмотскиот
притисок и ацидо-базната рамнотежа. Во одржување на ацидо-базната рамнотежа во
организмот хлоридот учествува преку замена за бикарбонатот со цел да се одржи
електронеутралноста.
Хлоридните анјони примени со храната речиси целосно се апсорбираат во
гастроинтестиналниот тракт.
Во бубрезите хлоридот се филтрира во гломерулите, а потоа, на ниво на
проксималните тубули, пасивно се реапсорбира следејќи го натриумот. Во качувачкиот
дел на Henle-овата петелка хлоридот активно се реапсорбира како резултат на
функцијата на хлоридната пумпа, а натриумот го следи. Вишокот хлорид се екскретира
преку урината. Хлорид се губи и преку потта. Определувањето на хлорид во потта се
користи како дијагностички параметар за цистична фиброза.
Во нормални услови концентрацијата на хлорид во плазмата главно ја следи
концентрацијата на натриумот. Меѓутоа во услови на нарушена ацидо-базна рамнотежа
определувањето на концентрацијата на хлоридот е значајно за поставување на
диференцијална дијагноза на нарушувањето.
Со оглед на тоа што концентрацијата на хлоридот во еритроцитите изнесува
приближно половина од онаа во крвната плазма, хемолизата на примерокот значајно не
му пречи на определувањето. Концентрацијата на хлоридот се определува и во
цереброспинална течност, каде таа е приближно 15% повисока од серумската.
Во современите клиничко-биохемиски лаборатории, определувањето на хлорид
се врши со јон-селективни електроди.
7.1.5. Определување на осмолалност на крвната плазма и урината
Осмозата претставува процес на движење на растворувачот (водата) низ

полупропустлива мембрана, како резултат на разликата во осмотскиот притисок од
двете страни на мембраната. Всушност, водата мигрира низ мембраната кон онаа
страна што содржи поконцентриран раствор. Осмометријата претставува техника за
мерење на концентрацијата на растворените честички кои придонесуваат за осмотскиот
притисок на растворот. Пример за биолошки значајни селективни мембрани се
гломеруларната базална мембрана и крвните капилари. Тие се пропустливи за водата
187
и за речиси сите мали молекули и јони, но се непропустливи за големите протеински
молекули. Разликата во концентрацијата на осмотски активните молекули што не ја
поминуваат мембраната, условува движење на малите молекули и јони, со цел да се
воспостави осмотска рамнотежа.
Определувањето на осмолалноста на крвната плазма и на урината се користи за
проценка на нарушувањата на електролитниот и ацидо-базниот статус.
За пресметување на осмолалноста на крвната плазма се користи следната
формула:
mOsm/kg = 1,86 (Na+ [mmol/L]) + глукоза [mmol/L] + уреа [mmol/L] + 9
Константата 1,86 го претставува придонесот и на натриумот и на хлоридот.

Вредноста 9 го претставува придонесот на останатите осмотски активни
супстанции во плазмата, како што се калиумот, калциумот и протеините.
Референтните вредности изнесуваат од 275 – 300 mOsm/kg.
Забелешка: Осмолалноста се изразува на kg растворувач. За разлика од неа,
осмоларноста се изразува на L раствор.
Во овој случај ние говориме за осмолалност.
Постојат исто така и инструменти за директно мерење на осмолалноста, што се
нарекуваат осмометри. Споредбата помеѓу калкулираната и измерената осмолалност
на крвната плазма помага за идентификација на осмолалниот јаз, кој може да укажува
на присуство на егзогени осмотски активни супстанци.
Концентрацијата на урината може да се определи на два начини:

1. Со определување на специфичната тежина, со употреба на тест-ленти или
2. Со мерење на осмолалноста, со помош на осмометар.
Најчесто, во клиничката пракса, определувањето на специфичната тежина е
сосема доволно.
Кај здрави лица, осмолалноста на урината варира во широки граници, зависно
од степенот на хидратација на организмот, од 50 mOsm/kg H2O при значително
консумирање на течности, па сѐ до 1400 mOsm/kg H2O при значителна рестрикција на
течности. Во нормални услови, осмолалноста на урината се движи од 300 – 900
mOsm/kg H2O.
Осмолалноста на урината се користи како мерка за реналната способност за
концентрација, што е намалена кај пациенти со прогресивно бубрежно заболување.
7.1.6. Бикарбонат
Бикарбонатот е екстрацелуларен анјон од ендогено потекло. Се синтетизира од

CO2 кој е еден од крајните продукти на метаболизмот. Имено, CO2 и водата, во реакција
катализирана од ензимот карбон анхидраза, реагираат помеѓу себе при што се добива
јаглеродна киселина, која понатаму дисоцира до водород и бикарбонатен анјон:
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-
Бикарбонатниот анјон има исклучително значајна улога во одржувањето на

ацидо-базната рамнотежа, како компонента на бикарбонатниот пуфер.
Во рамките на клеточниот метаболизам непрекинато се синтетизира релативно
големо количество на соединенија со кисела реакција (јаглеродна, сулфурна, фосфорна
и други киселини), така што организмот непрестано е изложен на опасност од
закиселување. Меѓутоа, од друга страна, организмот поседува единствена способност
да ја одржува својата ацидо-базна рамнотежа. Така, во нормални услови, вредноста на
рН на артериската крв се движи во тесни граници од 7,35 – 7,45, а во венската крв се
разликува само за малку и изнесува од 7,32 – 7,38. Вредностите на рН на крвта над 7,8
и под 7,0 значат директна животна опасност за човекот за само неколку минути.
188
За регулација на ацидо-базната рамнотежа во организмот клучна улога имаат:
1. Пуферите,
2. Респираторниот систем и
3. Бубрезите.
Најголемо учество во одржување на ацидо-базната рамнотежа имаат пуферите,
со капацитет од околу 80% и моментно дејство. Потоа, за 1-3 минути се вклучува
респираторниот систем со капацитет од околу 10%. Бубрезите се вклучуваат последни,
по 1-2 часа, со вкупно учество од околу 10%.
Во регулацијата на ацидо-базната рамнотежа на крвта учествуваат четири
пуфери:
1. Бикарбонатен,
2. Фосфатен,
3. Протеински и
4. Хемоглобински.
Првите три се пуфери на плазмата. Во еритроцитите е особено важен
хемоглобинскиот пуфер, иако во помала мерка се застапени и останатите.
Од сите пуфери во организмот бикарбонатниот пуфер е квантитативно
најзначаен. Негова важна карактеристика е тоа што тој не зависи од внесената храна
или течности, туку само од правилната работа на респираторниот систем, бубрезите и
од нормалното одвивање на метаболните процеси во организмот. Како и сите останати
пуфери, така и бикарбонатниот пуфер се состои од базна компонента која има функција
на акцептор на протони и кисела компонента која има функција на донор на протони. Кај
бикарбонатниот пуфер алкалната компонента е претставена со бикарбонатниот анјон,
а киселата компонента е претставена со јаглеродната киселина. Но, комплексноста, а
во крајна линија и ефикасноста на овој пуфер, се состои во тоа што јаглеродната
киселина се генерира од растворениот CO2, кој пак е во рамнотежа со CO2 што се наоѓа
во гасовита состојба.
Сумарно, pH на бикарбонатниот пуфер зависи од концентрациите на
јаглеродната киселина и бикарбонатниот анјон. Концентрацијата на јаглеродната
киселина зависи од концентрацијата на растворениот CO2, кој пак е условен од нивото
на CO2 што се наоѓа во гасовита состојба, односно од парцијалниот притисок на CO 2.
При вишок на кисели компоненти, водородните јони ќе реагираат со бикарбонатниот
анјон и ќе се формира јаглеродна киселина, која е слаба киселина, и која потоа ќе се
разложи до јаглерод диоксид и вода. На тој начин опаѓањето на рН ќе биде минимално,
а нарушената рамнотежа на пуферот повторно ќе се воспостави на тој начин што
вишокот јаглерод диоксид ќе се отстрани преку белите дробови.
Сето ова што досега го објаснивме, може да се изрази и математички, преку
равенката на Henderson-Hasselbalch. Имено, за концентрациите на водородниот јон
(cН+), бикарбонатот (cHCO3-) и растворениот СО2 (cdСО2) важи следната равенка:
cHCO3 -
К' = cH+
cdCO2
каде: К’ e константа чија вредност изнесува 4,68 х 10-7.
Треба да се нагласи дека концентрацијата на растворениот CO2 (cdСО2) го

вклучува во себе и малото количество недисоцирана (растворена) јаглеродна киселина.
Поради тоа важи следната равенка:
cdCO2 = α х PCO2
каде: PCO2 e парцијалниот притисок на јаглерод диоксидот

α е коефициент на растворливост за CO2
189
Со обединување на двете равенки се добива:
PCO2
cH+ = К' α -
cHCO3
Значи, доколку се определи концентрацијата на водородните јони и

парцијалниот притисок на јаглерод диоксидот, може да се пресмета
концентрацијата на бикарбонатот.
Во нормални услови просечната концентрација на бикарбонатот (cHCO3-) во

плазмата изнесува 25 mmol/L, a на растворениот СО2 (cdCO2) е 1,25 mmol/L. Од тука
произлегува дека нивниот сооднос (база/киселина) изнесува 20/1.
Во серум или плазма може да се определи и концентрацијата на вкупниот CO 2,
кој во себе ги содржи и бикарбонатот и растворениот СО2. За таа цел се користат
ензимски или електрохемиски методи. Референтните вредности за концентрацијата на
вкупниот CO2, изнесуваат од 21 – 32 mmol/L.
Бубрезите ја претставуваат последната одбранбена линија против промените на

рН во организмот. Во услови кога има вишок на кисели компоненти бубрезите нив ги
екскретираат, а ги конзервираат базите. Овие процеси главно се случуваат преку
следните механизми:
(1) Секреција на водород во замена за натриум,
(2) Синтеза на амонијак и екскреција на NH4+ и
(3) Реапсорпција на бикарбонатот.
Во услови кога има вишок на базни компоненти бубрезите нив ги екскретираат, а
ги конзервираат киселините.
Клиничките состојби кои се означени како метаболни нарушувања на ацидо-
базната рамнотежа се примарно нарушувања на cHCO3- (ренална компонента).
Од друга страна, клиничките состојби кои се означени како респираторни
нарушувања на ацидо-базната рамнотежа се примарно нарушувања на cdCO2
(респираторна компонента).
Ацидемија претставува состојба кога вредноста на рН на артериската крв е
помала од 7,35. Алкалемија е состојба кога вредноста на рН на артериската крв е
поголема од 7,45. Со термините ацидоза и алкалоза се означуваат патолошките
состојби кои доведуваат до ацидемија и алкалемија.
7.1.7. Изработка на гасни анализи
Како што објаснивме претходно, доколку се определи pH на крвта и парцијалниот

притисок на CO2, може да се пресмета концентрацијата на бикарбонатниот анјон.
Мерењето на pH и PCO2 се врши со електрохемиски методи. Инструментите со кои се
вршат овие мерења скоро задолжително поседуваат и електрода за определување на
парцијалниот притисок на кислородот (PO2). Поради тоа, овие инструменти се
нарекуваат гасни анализатори. Тие имаат клучна улога за нормалното функционирање
на единиците за интензивна нега. Кај голем дел од овие инструменти се застапени и
електроди за изработка на натриум, калиум, јонизиран калциум и хематокрит, а кај некои
и глукоза, лактат и други параметри.
За определување на pH, PCO2 и PO2, како примерок за анализа се препорачува
хепаринизирана артериска крв. Се препорачува хепаринот да биде во лиофилизирана
форма. Предност и олеснување е тоа што во рамките на палетата производи што ги
нудат производителите на различни затворени системи за земање на крв, вообичаено
се нудат и епрувети или шприцови што се наменети за земање на крв за гасни анализи.
Во однос на препораката за користење на артериска крв за анализа, истата е
дадена поради тоа што постои значителна разлика во однос на парцијалниот притисок
190
на кислородот помеѓу артериската и венската крв. Разликите за парцијалниот притисок
на јаглерод диоксидот и pH на крвта се помали.
Во однос на самата постапка за земање на артериска крв, треба да се знае дека
истата е следена со извесен ризик за пациентот, па задолжително мора да се
спроведува исклучиво од персонал што завршил адекватна обука за оваа процедура.
При земањето на крв и изработката на гасните анализи, особено е значајно
одржувањето на анаеробни услови, поради тоа што контактот на примерокот со
атмосферскиот воздух условува промени на PCO2 и PO2. Веднаш после земањето на
крв, анализата треба да се изработи за колку што е можно покусо време, најдобро во
рамките на 15 минути. Примероците каде бројот на леукоцити е значително покачен
треба да се анализираат веднаш, во рамките на само неколку минути, од причина што
леукоцитите кога се присутни во голем број имаат драматично влијание врз pH, PCO2 и
PO2.
Наместо артериска крв, во определени случаи како примерок за анализа може
да се употреби артеризирана капиларна крв, што според својот состав е многу слична
со артериската. За земање на ваков примерок се препорачува претходно благо
загревање на местото на убодот, околу 10 минути на 45°C. Овој примерок се зема во
хепаринизирана капилара и мора да се анализира веднаш. Во капиларата не смее да
има меурчиња воздух, затоа што истите значително ќе интерферираат со
определувањето.
Употреба на артеризирана капиларна крв за гасни анализи не се препорачува во
следните случаи:
1. Кога систолниот крвен притисок е под 95 mm Hg,
2. Во случај на вазоконстрикција,
3. Кај пациенти на терапија со кислород,
4. Кај новороденчиња.
Референтните вредности за артериската крв изнесуваат:

pH 7,35 – 7,45
PCO2 35 – 45 mm Hg
PO2 80 – 100 mm Hg
За детално изучување на принципите за изработка на гасните анализи, поблиску

ќе се запознаеме со инструментот GEM Premier 3000 од производителот Instrumentation
Laboratory (Слика 7.1.). Овој инструмент се карактеризира со висок степен на
автоматизација. Дизајнирани се специјални кертриџи во рамките на кои се сместени
електродите, реагенсите, калибраторите, цревата, семплерот и делот за складирање
на отпадот. Системот автоматски се калибрира на однапред определени временски
интервали, а по потреба можна е и дополнителна калибрација на барање на
операторот.
За контрола на квалитетот системот е снабден со ампули контролен материјал
кои се анализираат веднаш по отворањето.
Кога ќе се истрошат реагенсите во кертриџот и/или кога рокот на траење на
самиот кертриџ ќе истече, истиот се заменува со нов. На тој начин е постигната
максимална точност на работа на инструментот и максимална сигурност во однос на
изработените анализи и издадените резултати.
Со сите детали за работата на овој инструмент и начинот на изработка на
гасните анализи ќе се запознаеме во рамките на практичната настава.
191
Слика 7.1. GEM Premier 3000
(Извор – Instrumentation Laboratory, Соединети Американски Држави)
192
7.2. Калциум, фосфор и магнезиум
7.2.1. Калциум
Калциумот е елемент чиј метаболизам е еден од најстрого регулираните процеси

во организмот. Во однос на неговата процентуална застапеност во телото на човекот,
тој се наоѓа на петтото место од сите елементи, и е процентуално најзастапен катјон.
Од целокупната содржина на калциумот во организмот дури 99% влегува во
состав на скелетот, главно во форма на екстрацелуларни кристали чија структура е
блиска со таа на хидроксиапатитот: [Ca10(PO4)5(OH)2].
Останатиот 1% од калциумот влегува во состав на:
 Клетките - интрацелуларен калциум и
 Екстрацелуларната течност - екстрацелуларен калциум.
Интрацелуларниот калциум има клучна улога во бројни важни физиолошки
процеси во организмот како што се: контракција на мускулите, секреција на хормони,
метаболизам на гликогенот, делба на клетките и др. Концентрацијата на
интрацелуларен калциум е значително пониска во однос на концентрацијата на калциум
во екстрацелуларната течност.
Во крвта речиси целокупната содржина на калциум се наоѓа во крвната плазма,
каде неговата концентрација се движи во границите од 2,25 до 2,75 mmol/L (B. Štraus,
1988). Калциумот во крвната плазма се наоѓа во два облици:
 Дифузибилен калциум и
 Недифузибилен калциум.
Дифузибилниот калциум поминува низ полупропустливите мембрани, додека
недифузибилниот калциум главно е врзан со серумските албумини (во многу мало
количество се среќава врзан и со глобулините) и не може да поминува низ
полупропустливите мембрани.
Дифузибилниот калциум претставува 50-60% од вкупниот калциум во плазмата
и се состои од две фракции:
 Јонизиран (слободен) калциум и
 Комплексно врзан калциум со цитрати, бикарбонати, сулфати или
фосфати.
Комплексно врзаниот калциум сочинува само мал дел од дифузибилниот
калциум (0,050-0,125 mmol/L). Поголемиот дел од дифузибилниот калциум претставува
јонизиран калциум и неговата концентрација изнесува од 1,05-1,40 mmol/L (B. Štraus,
1988). Физиолошки е активен само јонизираниот (слободен) калциум.
Екстрацелуларниот калциум има значајна улога во минерализацијата на коските,
во процесот на коагулација на крвта, а ја регулира и пермеабилноста и ексцитабилноста
на клеточните мембрани.
Намалувањето на концентрацијата на јонизиран (слободен) калциум во
плазмата резултира со зголемена невро-мускулна ексцитабилност и појава на
тетании. Обратно, зголемувањето на концентрацијата на јонизиран калциум во
плазмата доведува до појава на редуцирана невро-мускулна ексцитабилност.
Калциумот се внесува во организмот со храната и се апсорбира во дуоденумот.
Дневните потреби за калциум зависат од возраста и физиолошката состојба. За
возрасни е доволно околу 0,5 g дневно, за деца во периодот на раст околу 1 g, а за
бремени жени и доилки од 1 – 2 g дневно. Млекото и млечните производи се извонредно
богати со калциум.
Паратироидниот хормон и 1,25-дихидрокси витаминот D се најзначајните
хормони кои ја регулираат концентрацијата на калциум во плазмата и неговиот
метаболизам воопшто.
193
Паратироидниот хормон ја покачува концентрацијата на калциум во плазмата
преку:
а) Брза мобилизација на калциумот од коските,
б) Стимулирање на синтезата на 1,25-дихидрокси витаминот D и
в) Зголемување на реапсорпцијата на калциумот на ниво на бубрежните
тубули.
1,25-дихидрокси витаминот D ја покачува концентрацијата на калциум во
плазмата првенствено на тој начин што ја стимулира неговата апсорпција во
дуоденумот.
Намалената концентрација на вкупниот калциум во серум се нарекува
хипокалцемија. Таа може да се јави: а)поради намалување на концентрацијата на
калциумот што е врзан за албумините, б)поради намалување на концентрацијата на
слободниот калциум или в)како резултат на двете состојби заедно.
Како што кажавме претходно, плазматичните протеини, и тоа пред сè
албумините, врзуваат значителен дел од калциумот во крвната плазма. Поради тоа,
намалувањето на концентрацијата на албумините во крвната плазма доведува до
намалување на концентрацијата на вкупниот калциум. Ова намалување се однесува
само на недифузибилната фракција и ретко е причина за појава на тетании. Оваа
состојба се нарекува псевдохипокалцемија. Ниски серумски концентрации на
албумините се среќаваат кај хронични болести на црниот дроб, нефротски синдром,
срцева слабост, малнутриција и др.
Хроничната бубрежна слабост е следена со хипопротеинемија,
хиперфосфатемија, ниски серумски концентрации на 1,25-дихидрокси витаминот D
(поради намалена синтеза) и резистенција на коските кон паратироидниот хормон, што
сето заедно придонесува кон развој на хипокалцемија.
Хипопаратиреоидизмот и дефицитот на 1,25-дихидрокси витаминот D исто така
условуваат хипокалцемија.
Зголемената концентрација на вкупен калциум во серум се нарекува
хиперкалцемија. Таа се јавува кај следните заболувања: примарен
хиперпаратиреоидизам, малигни заболувања и хипервитаминоза D. Примарниот
хиперпаратиреоидизам и малигните заболувања претставуваат причина за 90 – 95% од
сите случаи на хиперкалцемија.
Хиперкалцемија се јавува кај 10 – 20% од сите пациенти со канцер.
Хиперкалцемијата кај малигните заболувања е условена од следните фактори:
1. Продукција на протеин сличен на паратхормонот од страна на малигното
ткиво. Тој протеин се ослободува во циркулацијата и предизвикува коскена
ресорпција.
2. Развој на метастатски тумор на коските што продуцира фактори кои
условуваат коскена ресорпција.
Хронична хиперкалцемија со хиперкалциурија може да доведе до формирање на
бубрежни камчиња.
Во клиничката пракса е неопходно да се определува концентрацијата и на

вкупниот и на јонизираниот (слободниот) калциум. Се смета дека слободниот калциум
е најдобар индикатор за статусот на калциумот во организмот поради тоа што истиот е
биолошки активен и е строго регулиран од страна на паратхормонот и 1,25-дихидрокси
витаминот D. За определување на слободниот калциум се користат специфични јон-
селективни електроди. Тие многу често се вградени во инструментите со кои се
изработуваат гасните анализи.
За определување на вкупниот калциум, во рутинските клиничко-биохемиски
лаборатории вообичаено се користат две спектрофотометриски методи:
- Методата со арсеназо III и
- Методата со о-крезолфталеин-комплексон.
194
Во рамките на овој курс ние ќе ја определиме концентрацијата на вкупниот калциум со
методата со о-крезолфталеин-комплексон, согласно протоколот број EY-CA INF 101101
GB 06-2008-16, од производителот Human, Германија.
Калциумовите јони реагираат со о-крезолфталеин-комплексон во алкална средина, при
што се формира виолетово обоено комплексно соединение.
Апсорбанцијата на овој комплекс е право пропорционалана со концентрацијата на
вкупниот калциум во примерокот.
BUF:
Лизински пуфер (рН=11,1) 0,2 mol/L
Na-азид 0,095 %
RGT:
8-Хидроксикинолин 14 mmol/L
о-Крезолфталеин-комплексон 0,1 mmol/L
HCl 40 mmol/L
STD:
Ca2+ 8 mg/dL или 2 mmol/L
Na-азид 0,095 %

За оваа метода се користи работен реагенс кој се подготвува со мешање на RGT и BUF.
Се земаат еднакви волумени од двата реагенси и внимателно се промешуваат. Вака
подготвениот работен реагенс се остава да стои 30 минути на собна температура пред
да почнеме да го користиме.
Реагенсите (RGT, BUF) и стандардот се стабилни дури и по отворањето сè до
означениот рок на употреба, доколку се чуваат на 2...25°C.
Работниот реагенс е стабилен 7 дена доколку се чува на 2...8°C или 3 дена на 15...25°C.
Примерок:
Стабилност калциумот во серумот: 10 дена на 2...25°C.
Постапка:
Бранова должина: 570 nm, Hg 578 nm

Стандард (STD) 20 µL
Работен реагенс 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Епруветите внимателно се промешуваат и се инкубираат 5 мин. Потоа се мерат

апсорбанциите на примерокот ∆Апримерок и на стандардот ∆Астандард наспроти слепата
проба, во рок од 30 минути.
195
Пресметување на концентрацијата на калциум:
c=2× [ ]
Тестот за концентрацијата на калциум во серум или плазма е линерен во граници до 15
mg/dL (3,75 mmol/L). Примероците со повисока концентрација се разредуваат 1 + 1 со
вода и се повторува определувањето на концентрaцијата.
Во серум или плазма: 8,1 – 10,4 mg/dL или 2,02 – 2,60 mmol/L
Забелешки:
1. Контаминираниот стаклен лабораториски прибор е еден од најзначајните извори
за грешка при определувањето на калциумот, па затоа се препорачува
користење на пластични садови за еднократна употреба.
2. Концентрациите на хемоглобин до 200 mg/dL или на билирубин до 20 mg/dL не
влијаат врз резултатите од тестот.
3. Доколку имаме липемичен или хемолитичен примерок потребно е да се изработи
слепа проба за примерокот (sample blank). За изработка на слепата проба за
примерокот се користи истата шема за пипетирање, односно се пипетираат 20
µL од примерокот во 1000 µL вода и се мери апсорбанцијата (∆Аслепа проба за
примерокот) наспроти апсорбанцијата на водата. Оваа ∆Аслепа проба за примерокот мора да
се одземе од ∆Апримерокот.
7.2.2. Фосфор
Фосфорот е елемент кој, слично како калциумот, во највисок процент, 80 – 90%

од вкупната содржина во организмот, влегува во состав на коските.
Од фосфорот пак што влегува во состав на меките ткива, најголем процент е
органски фосфор. Тој претставува составна компонента на нуклеинските киселини,
фосфолипидите, фосфопротеините, високоенергетските соединенија (како што е на
пример АТР), цикличните нуклеотиди (како што е на пример cAMP), NADP и др.
Неорганскиот фосфор е онаа фракција од фосфорот чиј метаболизам е тесно
поврзан со метаболизмот на калциумот, со одржувањето на ацидо-базната рамнотежа,
осмотскиот притисок и водената хомеостаза во организмот.
Фосфорот во крвта се наоѓа во форма на неоргански и органски фосфор.
Органскиот фосфор примарно е лоциран во крвните клетки. Во крвната плазма
фосфорот првенствено се среќава во форма на едновалентни (H2PO4-) и двовалентни
(HPO42-) фосфатни јони. Обично кога се говори за фосфор во крвта и кога од клиничко-
биохемиските лаборатории се бара да се определи концентрацијата на фосфорот се
мисли на определување на концентрацијата на фосфатите во крвната плазма,
односно во серумот.
Метаболизмот на фосфорот во организмот е регулиран од страна на
паратироидниот хормон и 1,25-дихидрокси витаминот D.
Паратироидниот хормон ја намалува концентрацијата на фосфат во крвната
плазма на тој начин што ја инхибира неговата реапсорпција во бубрежните тубули.
Спротивно дејствува 1,25-дихидрокси витаминот D кој ја стимулира
апсорпцијата на фосфор во јејунумот и илеумот.
196
Во крвниот серум кај здрав возрасен човек концентрацијата на фосфат се движи
во граници од 0,81 - 1,62 mmol/L. Кај доенчиња и мали деца референтните вредности
се повисоки и се движат од 1,30 – 2,26 mmol/L.
Намалената концентрација на фосфат во серум се нарекува хипофосфатемија.
Таа може да биде условена од бројни заболувања и состојби, кои генерално се
поделени во три групи:
- Состојби каде има пренос на фосфат од екстрацелуларниот во
интрацелуларниот простор,
- Состојби следени со ренална загуба на фосфат и
- Состојби на намалена интестинална апсорпција.
Клиничките манифестации зависат од должината и степенот на дефицит и можат
да се движат од блага мускулна слабост, па сè до рабдомиолиза, хемолиза и кома.
Зголемената концентрација на фосфат во серум се нарекува
хиперфосфатемија. Таа може да се јави при хипопаратиреоидизам и хипервитаминоза
D.
Хиперфосфатемија се среќава и кај пациенти со бубрежна слабост, поради
неможноста фосфатот да се екскретира преку бубрезите.
Рапидно покачување на плазматичната концентрација на фосфатот може да
предизвика хипокалцемија и тетанија.
За квантитативно определување на фосфатот вообичаено се користи методата

со амониум молибдат, што детално ќе ја изучиме преку обработка на протоколот број
SU-PHOS INF 102701 GB 05-2007-14, од Human, Германија.
Фосфатот од примерокот реагира со молибдат анјонот во силно кисела средина, при
што се формира комплексно соединение. Апсорбанцијата на овој комплекс е право
пропорционална со концентрацијата на фосфатниот анјон.
RGT:
Амониумхептамолибдат 0,3 mmol/L
Сулфурна киселина (рН<1,0) 160 mmol/L
Детергент 1%
Активатори и стабилизатори
STD:
Фосфор 10 mg/dL или 3,2 mmol/L

Реагенсот (RGT) и стандардот (STD) се готови за употреба.
Тие се стабилни дури и по отворањето, сѐ до означениот рок на употреба доколку се
чуваат на 2...25°C.
Примерок:
За овој тест како примерок може да се употребува само серум.
Плазма не смее да се користи бидејќи антикоагулансите може да доведат до лажно
ниски резултати.
Во серум фосфорот е стабилен до 7 дена ако примерокот се чува на +4°C или 2 дена
на 20...25°C.
Постапка:
Температура: 20…25°C
197

RGT 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Епруветите внимателно се промешуваат и се инкубираат 1 минута на собна

температура. Потоа се мерат апсорбанциите на примерокот ∆Апримерок и на стандардот
∆Астандард наспроти слепата проба, во рок од 60 минути.
Пресметување на концентрацијата на фосфор:
c = 3,2 × [ ]
Тестот за определување на концентрацијата на фосфор во серум е линерен во граници
до 20 mg/dL (6,4 mmol/L). Примероците со повисока концентрација се разредуваат со
вода во однос 1 + 1 и се повторува определувањето на концентрaцијата.
Возрасни: 2,5-5,0 mg/dL или 0,81-1,62 mmol/L
Деца: 4,0-7,0 mg/dL или 1,30-2,26 mmol/L
Забелешки:
1. Доколку имаме иктеричен или слабо липемичен примерок потребно е да се
изработи слепа проба за примерокот (sample blank). За изработка на слепата
проба за примерокот се користи истата шема за пипетирање, односно се пипетираат
10 µL од примерокот во 1000 µL вода и се мери апсорбанцијата (∆Аслепа проба за примерокот)
наспроти апсорбанцијата на водата. Оваа ∆Аслепа проба за примерокот мора да се одземе
од ∆Апримерок.
2. Силно липемични и хемолитични примероци не смеат да се употребуваат.
за грешка при определувањето на фосфорот, па затоа се препорачува користење
на пластични садови за еднократна употреба.
4. RGT содржи сулфурна киселина. Доколку овој реагенс дојде во контакт со кожа
или мукозни мембрани местото треба обилно да се измие со вода.
Иако во презентираните протоколи тоа не е опишано, треба да се знае дека

концентрациите на калциум и фосфат може да се определуваат и во 24-часовна урина.
198
7.2.3. Магнезиум
Магнезиумот е макроелемент од исклучителна важност за организмот. Околу

55% од вкупниот магнезиум што е застапен во телото на човекот влегува во состав на
коските. Околу 95% од останатиот магнезиум се наоѓа внатре во клетките. Така, после
калиумот, магнезиумот е најзастапен интрацелуларен катјон.
Значајни функции на магнезиумот се следните:
- Тој е кофактор на повеќе од 300 различни ензими,
- Во многу случаи е неопходен за формирање на ензим-супстрат
комплексот,
- Се јавува во улога на алостерички активатор кај многу ензимски
системи.
Магнезиумот исто така има значајна улога во регулацијата на невро-мускулната
надразливост. Имено, намалувањето на серумските концентрации на магнезиумот
резултира со зголемена невро-мускулна надразливост.
Најголем дел од магнезиумот примен со храната се апсорбира во тенкото црево.
Количеството на магнезиум во организмот е контролирано од страна на бубрезите.
Така, при недостиг на магнезиум во организмот се врши негова реапсорпција на ниво
на бубрежните тубули, додека при вишок истиот се екскретира.
Концентрацијата на магнезиум во крвниот серум изнесува од 0,80-1,00 mmol/L.
Заради високата концентрација на магнезиум во еритроцитите, хемолитични примероци
не смеат да се користат за анализа.
Намалената концентрација на магнезиум во серум се нарекува
хипомагнеземија. Овде треба да се потенцира дека дефицитот на магнезиум во
организмот бавно се одразува во серумот. Во таков случај најпрвин се регистрира
намалена екскреција на магнезиум преку бубрезите. Поради тоа, се смета дека
концентрацијата на магнезиум во урина е добар индикатор за дефицитот на магнезиум
во организмот. Од друга страна, треба да се потенцира исто така дека
хипомагнеземијата може да биде резултат на преносот на магнезиум од
екстрацелуларниот во интрацелуларниот простор, а не резултат на дефицит на
магнезиум. Сите овие факти треба да се имаат предвид при толкувањето на
резултатите од клиничко-биохемиските анализи.
Дефицит на магнезиум може да се јави при малнутриција, малапсорпција,
повраќање и дијареја. Дефицитот на магнезиум може да биде условен и од негова
прекумерна загуба преку бубрезите, како што е случај при долготрајно земање на
диуретици. Прекумерна загуба на магнезиум преку бубрезите се регистрира и кај тешки
алкохоличари, но и кај дијабетичари.
Дефицитот на магнезиум во организмот е асоциран со срцеви аритмии. При
значителен недостиг на магнезиум може да се манифестира невро-мускулна
хиперексцитабилност со тетанија.
Зголемената концентрација на магнезиум во серум се нарекува
хипермагнеземија. Симптоматска хипермагнеземија може да се јави кај пациенти со
хронична бубрежна инсуфициенција кои примаат лекови што содржат магнезиум како
помошна состојка. Поради бубрежната инсуфициенција, нивниот организам не е во
состојба да го елиминира вишокот магнезиум. При интоксикација со магнезиум се јавува
депресија на невро-мускулниот систем. Третманот е со интравенска администрација на
калциум.
За квантитативно определување на магнезиум во клиничката пракса се користат

неколку спектрофотометриски методи. Ние подетално ќе се запознаеме со методата со
ксилидил сино.
199
Магнезиумовите јони со ксилидил сино во алкална средина формираат обоен комплекс.
Порастот на апсорбанцијата е право пропорционален со концентрацијата на
магнезиумови јони во примерокот.
При оваа постапка се користи и дополнителен реагенс, гликолетердиамин-N,N,N’,N’-
тетраоцетна киселина (GEDTA), кој служи за маскирање на калциумовите јони (Human,
протокол број ЕY-MG INF 1001001 GB 05-2008-14).
Состав на реагенсите:
RGT:
CAPS 49 mmol/L
GEDTA 0,13 mmol/L
Ксилидил сино 0,09 mmol/L
Na-азид 0,095 %
Активатори
STD:
Mg2+ 2,5 mg/dL или 1,03 mmol/L
Na-азид 0,095 %

Примерок:
Серум, ликвор или урина.
Не смее да се користи EDTA-плазма. Цитрат и оксалат исто така не треба да се
користат како антикоагуланси. Сите тие формираат комплекси со магнезиумот.
Магнезиумот во примерокот е стабилен 7 дена доколку истиот се чува на 2...8°C.
Доколку како примерок се користи урина истата треба да се закисели до рН од 3-4 со

додавање на неколку капки концентрирана HCl.
Урината понатаму се разредува со вода во однос 1+4 и како таква се користи во тестот.

смеса што може да резултира со лажно повисок резултат од реалниот. Овој тест
избегнува такви лажно покачени резултати со помош на липид отстранувачкиот фактор
(LCF). Овој фактор ја избиструва турбидноста во липемичниот примерок со
концентрација на триглицериди до 2000 mg/dL.
Постапка:

Вода 10 µL
RGT 1000 µL 1000 µL 1000 µL
200
Епруветите внимателно се промешуваат и се инкубираат 10 минути на температура од
20-25°C. Потоа се мерат апсорбанциите на примерокот ∆Апримерок и на стандардот
Пресметување на концентрацијата на магнезиум:
c = 1,03 × [ ]
Тестот за концентрацијата на магнезиум во серум или плазма е линерен во граници до
5 mg/dL (2,05 mmol/L). Примероците со повисока концентрација се разредуваат 1 + 1 со
вода и се повторува определувањето на концентрaцијата.
Серум / плазма 1,9-2,5 mg/dL 0,8-1,0 mmol/L
Ликвор 2,5-3,5 mg/dL 1,0-1,5 mmol/L
Урина 1,0-10,0 mg/dL 0,4-4,1 mmol/L
24h урина 50-150 mg/24h 2.0-6.2 mmol/24h
Забелешки:
1. Хемолитични примероци не смеe да се употребуваат поради високата
концентрација на магнезиум во еритроцитите.
2. Липемијата, како и концентрациите на билирубин до 20 mg/dL не влијаат врз
резултатите од овој тест.
за грешка при определувањето на магнезиумот, па затоа се препорачува
користење на пластични садови за еднократна употреба.
4. RGT и STD содржат Na-азид (0,095%) и не смеат да се проголтаат.
201
7.3. Железо
Железото е најзастапениот микроелемент во организмот на човекот. Во

поновата литература стои дека телото на здрав возрасен човек (маж со телесна маса
од околу 70 kg) содржи просечно околу 3,2 g железо. Најголем дел од железото во
човековиот организам, околу 65-70%, се наоѓа во состав на еритроцитите врзано во
хемоглобинот, 3-5% е врзано во миоглобинот, помалку од 1% влегува во состав на
различни ензими, додека 20-30% е депонирано, во најголема мерка во црниот дроб,
слезената и коскената срцевина.
Метаболизмот на железото во човековиот организам е предмет на проучување
на бројни истражувачки групи ширум светот. Иако дел од протеините што се вклучени
во метаболизмот на железото, како што се трансферинот и феритинот, се познати со
децении, најголем дел од сознанијата за молекуларните основи на метаболизмот на
железото потекнуваат од последните дваесетина години. Особено значаен е периодот
од 1996 до 2001 година, кога се откриени клучните молекули за метаболизмот на
железото и тоа: транспортерот на двовалентни метални јони 1 (DMT1 – divalent metal
transporter 1), феропортинот, како и главниот регулатор на метаболизмот на железото
– хепцидинот.
За полесно изучување на метаболизмот на железото и разбирање на
дијагностичкото значење на клиничко-биохемиските параметри што го дефинираат
статусот на железо во организмот, најпрвин подетално ќе ја разгледаме неговата
дистрибуција. Имено, железото во организмот е распределено на следниот начин:
1. Железо што влегува во состав на хемоглобинот,
2. Складирано железо, во форма на феритин и хемосидерин,
3. Ткивно железо,
4. Железо што влегува во состав на миоглобинот,
5. Пул на лабилно железо и
6. Транспортно железо.
1. Хемоглобинот е протеин што се среќава во еритроцитите. Неговата основна
функција е врзување и транспорт на кислородот. Железото влегува во состав на хемот
и го врзува молекуларниот кислород. Кај човекот, 1 mL еритроцити просечно содржи 1
mg железо. Кај возрасен маж со телесна маса од околу 70 kg масата на еритроцити
изнесува околу 2 L, што значи дека во неговиот организам има околу 2 g железо што
влегува во состав на хемоглобинот.
2. Железото претставува есенциелен микроелемент, без кој не може да се
замисли нормалното функционирање на организмот на човекот. Поради тоа, постојат
механизми за негово складирање и максимално конзервирање. Железото во
организмот се складира во форма на феритин и хемосидерин.
Феритинот претставува сложен протеин што се состои од две компоненти:
апоферитин и складирано железо. Апоферитинот претставува еден вид протеинска
обвивка (школка) која е изградена од 24 субединици. Во внатрешноста на обвивката е
сместено јадро што е изградено од голем број молекули на фери оксихидроксид
(FeOOH)n. Значи, железото се складира во состав на протеинот феритин како Fe+3n-
феритин. Ваквата специфична градба на феритинот оневозможува директен контакт на
железните јони со околните молекули. На тој начин е спречена појавата на токсични
ефекти на слободното железо и оксидативен стрес. Феритинот се среќава во речиси
сите клетки во организмот, но најзастапен е во црниот дроб, слезената и коскената
срцевина.
Доколку количеството на депонирано железо во организмот прекумерно се
зголемува, тогаш истото се складира и во форма на гранули од хемосидерин.
Хемосидеринот се формира кога феритинот ќе се разложи во секундарните лизозоми.
Всушност, хемосидеринот претставува агрегиран, делумно депротеинизиран феритин.
Како таков, хемосидеринот претставува крајна точка на биохемискиот пат за
интрацелуларно складирање на железото. За разлика од феритинот, хемосидеринот е
нерастворлив во вода. Најзастапен е во црниот дроб, слезената и коскената срцевина.
202
3. Ткивното железо го сочинува оној дел од железото во организмот што влегува
во состав на најразлични ензими или коензими. Така на пример, цитохромите и
пероксидазите содржат хем. Други ензими, како што е на пример аконитазата, содржат
железо-сулфур кластер. Процентуалната застапеност на ткивното железо е многу мала,
но истото има незаменлива улога во клеточниот метаболизам.
4. Миоглобинот е протеин што се среќава во мускулите. Според својата
структура многу наликува на една субединица хемоглобин. Поседува хем што има
способност да го врзува кислородот. Миоглобинот има висок афинитет за кислородот,
што е поврзано со неговата функција за складирање на кислород.
5. Пулот на лабилно железо нема јасна анатомска локација, туку е дефинирано
преку кинетичките студии со радиоактивно обележено железо. Кај возрасен маж со
телесна маса од околу 70 kg на пулот на лабилно железо отпаѓаат околу 2,2 % од
вкупното железо во организмот.
6. Транспортното железо е претставено со плазматичниот протеин
трансферин. Всушност, со поврзување на тривалентно железо со апотрансферинот,
се формира протеинот трансферин. (Но, во литературата ретко се користи терминот
апотрансферин за попрецизно означување на молекулите што не врзале железо.)
Улогата на трансферинот е да го транспортира железото од еден орган до друг, преку
крвната плазма. Во крвната плазма кај возрасен маж со телесна маса од околу 70 kg
има вкупно само околу 2,5 mg железо.
Железото во организмот нормално се внесува преку храната, каде се среќава во

две форми:
 Хемско железо (железо што влегува во состав на хемот) и
 Нехемско железо (железо што не влегува во состав на хемот).
Хемското железо главно се внесува преку продукти од животинско потекло, како
составна компонента на миоглобинот и хемоглобинот.
Нехемското железо се среќава како во продукти од растително, така и во
продукти од животинско потекло и ги вклучува следните форми на железо:
- Растворливо железо,
- Железо што влегува во состав на нискомолекуларни комплекси,
- Складирано железо, во форма на феритин и хемосидерин и
- Железо што влегува во состав на каталитичките центри на некои ензими.
Апсорпцијата на железото главно се одвива во дуоденумот и во почетниот дел
на јејунумот.
Познато е дека апсорпцијата на хемското железо е поефикасна од онаа на
нехемското, но сепак нејзините молекуларни механизми сѐ уште не се целосно
разјаснети. Се смета дека хемот содржан во храната се прима од страна на
ентероцитите со посредство на специфичен апикален рецептор, а потоа, во самите
ентероцити, железото се ослободува од хемот како резултат на ензимската активност
на хем оксигеназата. Понатамошната метаболна судбина на ова железо е иста како и
на нехемското железо.
Нехемското железо се прима од страна на ентероцитите со посредство на
апикалниот транспортер DMT1. Овој транспортен протеин има способност да
транспортира само двовалентни железни јони. Поради тоа, за да може да биде примено
од страна на ентероцитите, тривалентното железо содржано во храната најпрвин треба
да се редуцира до двовалентно. Оваа улога ја имаат витаминот C од храната и
дуоденалниот цитохром Б, а веројатно и други молекули. Доколку применото железо
веднаш не му е неопходно на организмот, истото се складира во форма на феритин во
самите ентероцити, и се елиминира со отстранување („лупење“) на ентероцитите на
крајот од нивниот неколкудневен животен век. Доколку пак на организмот му е
неопходно ова железо, истото се транспортира надвор од ентероцитите, во
циркулацијата, преку нивната базолатерална мембрана, со посредство на протеинот
феропортин. Ефикасноста на базолатералниот транспорт на железото е помогната со
активноста на ензимот хефестин, кој претставува оксидаза на железото што е зависна
203
од бакар, и кој го преведува штотуку транспортираното двовалентно железо во
тривалентна форма, погодна за сврзување со трансферинот.
Апсорпцијата на железото зависи од следните фактори:
 Заситеноста на резервите на железо – доколку резервите на железо се
заситени, тогаш апсорпцијата ќе биде намалена.
 Еритропоетската активност на коскената срцевина – апсорпцијата на
железото е зголемена при поинтензивна еритропоетска активност.
 Парцијалниот притисок на кислородот – апсорпцијата на железото е
зголемена при понизок парцијален притисок на кислородот.
Човековиот организам не поседува механизам за исфрлање на непотребниот
вишок на железо. Напротив, организмот поседува механизми за негово максимално
конзервирање, а депонирањето на токсични количества железо е спречено преку
ефикасна регулација на апсорпцијата (Слика 7.2.).
а.
б.
Слика 7.2. Регулација на апсорпцијата на железото

Прилагодено според: https://courses.washington.edu/conj/bess/iron/iron.htm
204
Во услови кога организмот има потреба од железо (Слика 7.2.а.), железото од
ентероцитите, со посредство на протеинот феропортин, ќе помине во крвната плазма,
каде ќе се врзе со трансферинот и ќе се транспортира до периферните ткива. Еден дел
од железото што е примено во ентероцитите може да се складира во состав на
протеинот феритин и ќе остане во самите ентероцити.
Во услови кога во организмот има доволно железо (Слика 7.2.б.), во црниот дроб
се синтетизира пептидот хепцидин. (Инфламацијата исто така ја стимулира
биосинтезата на хепцидин.) Хепцидинот се поврзува со феропортинот и ја условува
неговата деградација. На тој начин е оневозможен транспортот на железото од
ентероцитите во циркулацијата. Апсорбираното железо ќе остане во состав на
феритинот во ентероцитите, и ќе се елиминира преку фецесот, со отстранување
(„лупење“) на ентероцитите на крајот од нивниот животен век. Се смета дека просечната
дневна загуба на железото е помала од 1 mg.
Штотуку апсорбираното железо, исто како и железото што се ослободува од

клетките каде што било складирано (на пример хепатоцити, макрофаги), се поврзува со
трансферинот и се дистрибуира низ организмот, таму каде е неопходно. Секоја
молекула трансферин може да врзе најмногу два атоми на тривалентно железо. Во
нормални услови, приближно само околу 30% од врзувачките места на плазматичниот
пул на трансферинот се зафатени со железо. На тој начин е обезбеден значителен
пуферирачки капацитет за заштита од токсичните ефекти на слободното железо.
Сатурацијата на трансферинот е параметар што ни дава информација за
снабдувањето на коскената срцевина со железо. Во нормални услови (кога приближно
30% од врзувачките места на плазматичниот пул на трансферинот се зафатени со
железо), логично, сатурацијата на трансферинот изнесува околу 30%. Вредности под
16% условуваат намалена продукција на нови еритроцити во коскената срцевина.
Од концентрацијата на трансферин во крвната плазма зависи колкав ќе биде
вкупниот капацитет за врзување на железо во серумот (TIBC - total iron binding capacity).
Незаситениот дел од трансферинот, кој може да врзе уште железо, претставува мерка
за незаситениот капацитет за врзување на железо (UIBC - unsaturated iron binding
capacity).
Кога ќе дојде до целните клетки, трансферинот се поврзува со неговиот
специфичен рецептор. Потоа комплексот трансферин/трансферин рецептор се
интернализира во клетката, во форма на ендозом. Тука доаѓа до ацидификација на
ендозомот и ослободување на железото во неговата редуцирана форма, како феро јон
(Fe2+). Fe2+ понатаму се транспортира надвор од ендозомот, во цитосолот, со
посредство на транспортерот на двовалентни метални јони 1 (DMT1). Апотрансферинот
се враќа назад, надвор од клетката, подготвен да транспортира нови јони на железо.
Оваа серија од реакции се означува како циклус на трансферинот.
Метаболната судбина на интрацелуларното железо зависи од специфичните
потреби на клетките:
1. Доколку железото е неопходно во клеточниот метаболизам, истото веднаш се
транспортира до местото на утилизација.
2. Ако железото не е неопходно веднаш, тогаш се складира во форма на
феритин.
3. Клетките исто така можат да се ослободат од железото преку негов транспорт
(поточно експорт) со посредство на феропортинот.
За разлика од ентероцитите, кај другите видови клетки оваа функција е
потпомогната од страна на циркулирачкиот хомолог на хефестинот, а тоа е
церулоплазминот.
Клетки со највисок капацитет за експорт на железото се:
- Макрофагите, кои помагаат во рециклирањето на железото што потекнува
од старите еритроцити,
- Хепатоцитите, кои се најзначајни за складирање на железото и
- Ентероцитите.
205
На Слика 7.3. е прикажано кружењето на железото во организмот.
Fe
Слика 7.3. Кружење на железото во организмот

(Прилагодено според Anderson GJ и Frazer DM, 2017)
Со изучување на метаболизмот на железото, станува јасно дека тука се

инволвирани поголем број протеини. Мутации на ниво на овие протеини може да
резултираат со:
1. Дефицит на железо или
2. Преоптоварување на организмот со железо.
Меѓутоа, сите овие процеси и точната улога на сите релевантни протеини сѐ
уште не се целосно проучени.
Од друга страна, дефицит на железо во организмот може да се јави и како
резултат на негово неадекватно внесување преку исхраната.
1. Дефицитот на железо е едно од најчестите нарушувања кај луѓето. Може да
се јави на секоја возраст, но сепак најпогодени се децата, младите жени и старите лица.
Кај децата дефицит на железо вообичаено се јавува поради неадекватно внесување
преку исхраната, бидејќи млекото содржи малку железо. Дефицитот на железо кај
возрасните вообичаено е условен од хронична загуба на крв или пак бременост и
породување кај жените.
За дијагностицирање на дефицитот на железото се користат поголем број
параметри. Иницијално, акцентот бил ставен на хематолошките параметри. Имено, во
првата половина на 20. век, хипохромната анемија се сметала за синоним за дефицит
на железо. Понатаму, користени се, и сѐ уште се користат, и поголем број други
параметри како што се:
206
- Боење на примерок од коскена срцевина,
- Определување на серумско железо,
- Определување на трансферин во серум
- Определување на TIBC, UIBC и сатурацијата на трансферинот,
- Определување на серумски феритин,
- Определување на протопорфирин во еритроцитите,
- Определување на циркулирачкиот рецептор на трансферинот,
- Определување на хемоглобин во ретикулоцитите.
Сите овие методи се одлични за дијагностицирање на тежок некомплициран
дефицит на железо, но ниту една од нив сама за себе не е доволна за дијагностицирање
на благ и/или клинички комплексен дефицит.
2. Долготрајното преоптоварување на организмот со железо предизвикува
појава на две карактеристични состојби:
 Хемосидероза или
 Хемохроматоза.
Хемосидерозата претставува состојба на преоптовареност на организмот со
железо при што не е присутно оштетување на ткивата. Обично се јавува кај лица на кои
им е давано железо во прекумерни количини, било во форма на препарати на железо,
или пак преку трансфузии на крв.
Хемохроматозата пак претставува состојба на преоптовареност на организмот
со железо при што акумулираниот вишок предизвикува оштетување на ткивата.
Симптомите на хемохроматоза се претставени со класичната тријада:
- Бронзена боја на кожата,
- Цироза и
- Дијабет.
Останати симптоми се: кардиомиопатија, аритмија, нарушувања на ендокринот
систем, артропатија.
Хемохроматозата може да биде:
- Примарна или
- Секундарна.
Примарната хемохроматоза е генетски условена и се јавува како резултат на
специфични мутации кај некои од протеините што учествуваат во метаболизмот на
железото. Овие мутации доведуваат до нарушување на регулацијата на апсорпцијата
на железото. Поради тоа кај овие лица доаѓа до депонирање на големо количество на
железо, пред сè во црниот дроб, срцето и панкреасот, што доведува до трајни
оштетувања на овие органи.
Секундарната хемохроматоза обично е последица од прекумерна парентерална
администрација на железо или бројни трансфузии на крв.
При еднократно внесување на големо количество на железо во организмот
можат да се јават симптоми на интоксикација. Оваа состојба е типична кај деца кои
случајно ќе земат преголема доза на препарати на железо.
Како што беше кажано претходно, во клиничката пракса се познати поголем број
параметри за определување на статусот на железо во организмот. Сепак, во рутинските
клиничко-биохемиски лаборатории најчесто се определуваат следните:
- Серумско железо,
- Трансферин во серум,
- TIBC и UIBC,
- Сатурација на трансферинот и
- Серумски феритин.
За принципот на методата за определување на серумскиот трансферин и
неговото дијагностичко значење беше кажано во поглавјето за протеини. Во
продолжение, подетално ќе ги разгледаме сите останати параметри.
207
7.3.1. Серумско железо
Серумското железо е параметар што вообичаено првично се определува за

проценка на статусот на железо во организмот.
Кај возрасни здрави мажи во крвниот серум има 14,0-27,0 µmol/L железо, додека
кај жените вредностите се вообичаено пониски и се движат од 12,5-25,0 µmol/L (B.
Štraus, 1988). Оваа тенденција жените да имаат пониски вредности на серумско железо
во однос на мажите дополнително е потенцирана за време на менструалниот циклус и
бременоста.
Кај лица постари од 70 години серумското железото е доста снижено и изнесува
од 7,0-14,0 µmol/L (B. Štraus, 1988).
Кај новороденчиња вредностите на серумското железо се повисоки и се движат
во границите од 25,0-34,0 µmol/L (B. Štraus, 1988). Ова се должи на забрзаното
распаѓање на еритроцитите веднаш по раѓањето. Концентрацијата на железо се
нормализира после првиот месец и достигнува вредности слични како кај возрасните.
Намалена концентрација на серумското железото може да се јави при следните
заболувања / состојби:
 Малнутриција,
 Малапсорпција на железото,
 Тешки крвавења,
 Инфекции, акутни или хронични,
 Автоимуни заболувања,
 Карциноми.
Зголемена концентрација на серумското железото може да се јави при следните
заболувања / состојби:
 Преоптовареност на организмот со железо (хемосидероза или
хемохроматоза),
 Намалена еритропоеза, која може да биде резултат од труење со олово или
пак од недостиг на витамин B12, B6 или фолна киселина,
 Хепатит и цироза, при што се јавува зголемено ослободување на
складираното железо од црниот дроб,
 Примање на орални контрацептивни средства.
Определувањето на концентрацијата на серумското железо генерално се базира

на принципот на ослободување на тривалентното железо од трансферинот во кисела
средина и негова редукција до двовалентно железо. Во услови на ниска pH не доаѓа до
ослободување на железото од хемоглобинот, доколку истиот е присутен во примерокот.
Меѓутоа, кај силно хемолитични примероци може да се ослободи мало количество
железо од хемоглобинот и да интерферира со определувањето. Понатаму,
двовалентното железо реагира со хромоген при што се добива обоен продукт на
реакцијата. Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата
на серумското железо. Едни од најчесто користените хромогени за определување на
серумското железо се батофенантролинот и ферозинот.
Во рамките на овој курс ние ќе се запознаеме со една малку поразлична метода,
а тоа е методата со хромазурол Б и цетилтриметиламониум бромид, преку разработка
на протоколот број SU-FE INF 1022901 GB 07-2008-23 од Human, Германија.
Fe3+ јоните реагираат со хромазурол Б (CAB) и цетилтриметиламониум бромид (CTMA)
при што формираат обоено комплексно соединение со максимална апсорбанција на 623
nm. Интензитетот на обојувањето на растворот е право пропорционален со
концентрацијата на железо во примерокот.
Овој реагенс се употребува и при определување на вкупниот капацитет за врзување на
железото со TIBC-китот од истиот производител.
208
Состав на реагенсите:
RGT:
CAB 0,18 mmol/L
CTMA 2,2 mmol/L
Гванидин хлорид 2,6 mol/L
Na-ацетатен пуфер (рН=4,7) 45 mmol/L
STD:
Fe3+ јони 100 µg/dL или 17,9 µmol/L

При работа со нив мораме апсолутно да ја одбегнеме контаминацијата.
Примерок:
Серум, хепаринизирана плазма.
Не смее да се употреби EDTA-плазма, цитратна плазма или хемолитичен примерок.
смеса, што може да резултира со лажно покачен резултат.
Овој тест избегнува такви лажно покачени резултати со помош на липид
отстранувачкиот фактор (LCF). Овој фактор ја избиструва вкупната турбидност во
липемичниот примерок за време на инкубацијата на реакционата смеса.
Постапка:

Вода 50 µL
Епруветите внимателно се промешуваат и се инкубираат 15 минути на температура од

20-25°C. Потоа се мерат апсорбанциите на примерокот ∆Апримерок и на стандардот
Пресметување на концентрацијата на железо:
а) со фактор
Бранова должина железо (µg/dL) железо (µmol/L)
Hg 623 nm !!! 830 x ∆Апримерок 149 x ∆Апримерок
209
б) со стандард (620 – 640 nm)
c = 17,9 × [ ]
Тестот за концентрацијата на железо во серум или плазма е линерен во граници до 500
µg/dL (89,5 µmol/L).
Кај мажи: 59-148 µg/dL или 10,6-28,3 µmol/L
Кај жени: 37-145 µg/dL или 6,6-26,0 µmol/L
Забелешки:
1. Тестот за определување на концентрацијата на железо е многу чувствителен. За
да се избегне контаминација стакларијата не смее да содржи железо. За овој
тест строго се препорачува употреба на лабораториски материјали за
еднократна употреба.
2. Водата не смее да содржи железо.
3. Да не се употребува заматен или хемолитичен серум или плазма.
4. Билирубинот со концентрација до 15 mg/dL или бакар со концентрација до 500
µg/dL нема да влијаат врз резултатите од тестот.
7.3.2. TIBC (Total Iron Binding Capacity) и UIBC (Unsaturated Iron Binding Capacity)
Определени фактори доведуваат до значајни промени на концентрацијата на

серумското железо, како што се:
 Исхраната и примањето на витаминско-минерални препарати кои содржат
железо,
 Акутните инфекции,
 Менструалниот месечен циклус кај жените,
 Циркадијалниот ритам на организмот што доведува до значителни дневно -
ноќни варијации кои се движат и до 70% (наутро се мерат нормални
концентрации на серумско железо, а потоа истите значително опаѓаат).
Поради тоа, определувањето само на концентрацијата на серумското железо
има ограничено дијагностичко значење. Затоа, за проценка на статусот на железото во
организмот треба да се определи најмалку уште и вредноста на TIBC, параметар кој
покажува помали физиолошки варијации во однос на серумското железо.
Пораст на вредноста на TIBC се јавува кога концентрацијата на железото во
плазмата е ниска и притоа како одговор се засилува биосинтезата на трансферин.
Вредностите на TIBC можат да бидат намалени при нефротски синдром, поради
загуба на трансферинот. TIBC може да се намали и при хронични инфекции и малигни
заболувања, како и при хемохроматоза.
Во рамките на овој курс ќе ја обработиме методата за определување на TIBC
согласно протоколот број SU-TIBC INF 1067001 GB 05-2007-13 од производителот
Human, Германија.
Серумот го третираме со слободни Fe3+-јони во вишок, при што трансферинот ќе се
засити со максималното количество железо што може да го врзе. Потоа, неврзаните
Fe3+-јони се адсорбираат на површината на алуминиум оксидот и се преципитираат. На
тој начин, на крајот се определува само железото што е врзано за трансферинот, кое се
наоѓа во супернатантот и кое претставува мерка за TIBC.
210
Fe: FeCl3 0,09 mol/L
ALOX: Al2O3
Стабилност на реагенсите:
Реагенсите се стабилни дури и по отворањето, сѐ до означениот рок на употреба
доколку се чуваат на 15...25°C.
Примерок:
Серум, хепаринизирана плазма.
Не смее да се употреби EDTA-плазма, цитратна плазма или хемолитичен примерок.
Примерокот е стабилен 7 дена доколку се чува на 4°C или 4 дена на 15...25°C.
Реагенс Fe 1,0 mL
Примерок 0,5 mL
Добро се промешува. После 3-5 минути во епруветата се додава една мерна лажичка
од алуминиум оксидот (околу 0,25-0,35 mg). Епруветата се затвора и се става на
ротациона мешалка да се меша околу 10 минути. По мешањето епруветата се остава
да стои исправено околу 3 минути или подобро, се центрифугира 1 минута на 5000
завртувања во минута (пред центрифугирањето епруветата се отвора).
Во понатамошната постапка бистриот супернатант се користи како примерок во
кој се определува концентрацијата на железо.
Концентрацијата на железо се определува според веќе обработената претходна
постапка.
Определување на TIBC (total iron binding capacity):

За да се определи TIBC вредноста добиена за концентрацијата на железото во
супернатантот се множи со факторот на дилуција, односно со 3.
TIBC = c (железо) x 3
Определување на UIBC (unsaturated iron binding capacity):

За да се определи UIBC од вредноста на TIBC се одзема вредноста за серумската
концентрација на железо.
UIBC = TIBC - серумско железо
За TIBC: 274-385 µg/dL или 49-69 µmol/L
За UIBC: 180-260 µg/dL или 32-46 µmol/L
Забелешки:
1. Адхеренцијата на прашокот врз ѕидовите на епруветата нема да му смета на
тестот.
2. Билирубин со концентрација до 15 mg/dL или бакар со концентрација до 500
µg/dL нема да влијаат врз резултатите од тестот.
3. За овој тест се препорачани пластични епрувети со капачиња (2-5 mL).
4. Центрифугирањето ја зголемува репродуцибилноста на тестот.
Треба да се знае дека се развиени и методи за директно определување на TIBC/UIBC

кои не вклучуваат мануелен пред третман на примерокот и се дел од тест-менито на
автоматските биохемиски анализатори.
211
7.3.3. Пресметување на сатурацијата на трансферинот
Сатурацијата на трансферинот е параметар што се определува пресметковно,

доколку претходно се определат вредностите за серумското железо и TIBC, со
користење на следната формула:
Серумско железо
Сатурација на трансферинот (%) = 100 ×
TIBC
7.3.4. Феритин
Количеството на железо во крвната плазма е многу мало во однос на вкупното

количество на железо во организмот и не ни дава целосна слика за резервите на
железо. За проценка на резервите на железо во организмот неопходно е да се определи
концентрацијата на серумскиот феритин.
Како што беше објаснето во претходниот текст, феритинот претставува
најзначаен интрацелуларен протеин за складирање на железото. Се среќава речиси во
сите клетки и ткива, но најзастапен е во црниот дроб, слезената и коскената срцевина.
Освен тоа, иако во мали количества, феритинот се среќава и во крвната плазма.
(Всушност, во циркулацијата во најголема мерка е присутен апоферитинот, кој е
сиромашен со железо.)
Докажано е дека концентрацијата на феритинот во плазмата, односно во
серумскиот примерок, е во директна корелација со количеството на железо кое се наоѓа
во организмот како резерва. Уште повеќе, концентрацијата на феритин во плазмата се
намалува уште на самиот почеток на развој на дефицитот на железо, долго пред да се
забележат промени на ниво на серумското железо, крвниот хемоглобин или големината
на еритроцитите. Поради тоа, серумскиот феритин се смета за прилично осетлив
индикатор за дефицит на железо кај пациенти кај кои не се присутни некои други
заболувања.
Меѓутоа, кај заболувања на црниот дроб, карциноми и некои други заболувања,
каде феритинот се ослободува од заболените ткива, не постои корелација помеѓу
концентрацијата на феритинот во плазмата и количеството на железо кое се наоѓа во
организмот како резерва. Исто така, при интерпретацијата на резултатите треба да се
има предвид дека феритинот е протеин на акутната фаза, па неговите серумски
концентрации се покачени кај акутна и хронична инфламација.
Определувањето на серумскиот феритин се врши со примена на различни

имунохемиски методи, вклучително и ензимско-имунохемиските.
212
8. ЕНЗИМСКО-ИМУНОХЕМИСКИ МЕТОДИ ВО КЛИНИЧКАТА БИОХЕМИЈА
Имунохемиските методи имаат широка примена во хуманата in vitro дијагностика.

Овие методи генерално се базираат на принципот што соодветно антитело се користи
како реагенс за детектирање на аналитот (антиген) од интерес. Имунохемиските методи
се карактеризираат со висока специфичност, која е резултат на самата специфичност
на поврзувањето помеѓу антигенот и антителото.
Во клиничката биохемија своја примена наоѓаат разновидни имунохемиски
методи. Принципите на имунотурбидиметриските и имунонефелометриските методи,
како и на методите со аглутинација веќе ги изучивме. Освен нив, клиничко значење
имаат и следните имунохемиски методи, кои се поделени во две групи:
1. Квалитативни имунохемиски методи
- Пасивна гел дифузија
- Имуноелектрофореза
- Western blotting
2. Квантитативни имунохемиски методи
- Радијална имунодифузија
- „Ракета“ метода
- Имунохемиски методи со обележување (labeled immunochemical assays)
Од сите нив, имунохемиските методи со обележување се најчесто користени во

клиничката пракса. Зависно од природата на обележувачот, овие имунохемиски методи
понатаму се делат на неколку групи, од кои најпознати се:
o Радио-имунохемиски методи, - како обележувач се користи
радиоактивен изотоп
o Ензимско-имунохемиски методи, - како обележувач се користи
ензим
o Флуоро-имунохемиски методи, - како обележувач се користи
флуоресцентна молекула
o Хемилуминисцентни имунохемиски методи, - како обележувач се
користи хемилуминисцентна молекула
o Електрохемилуминисцентни имунохемиски методи, - како
обележувач се користи електрохемилуминисцентна молекула
Во рамките на овој курс подетално ќе се запознаеме со ензимско-
имунохемиските методи. Тие имаат значајна примена во клиничката биохемија, но и
пошироко.
8.1. Основни принципи на ензимско-имунохемиските методи
Една од најзначајните карактеристики, а воедно и предности на ензимско-

имунохемиските методи е тоа што обележувањето со ензим обезбедува висок степен
на амплификација на сигналот кој резултира од интеракцијата антиген-антитело. На тој
начин значително се подобрува лимитот на детекција. Амплификацијата на сигналот со
посредство на ензимот-обележувач произлегува од самата природа на ензимите и
механизмот на ензимските реакции. Имено, познато е дека една молекула на ензим
може да катализира трансформација на голем број молекули на супстрат.
Натамошно подобрување на лимитот на детекција се постигнува со замена на
конвенционалната фотометриска детекција со хемилуминисцентна.
Ваквата комбинација,
a) Амплификација на сигналот со ензим и
b) Ултрасензитивна хемилуминисцентна детекција
резултира со постигнување на особено висока сензитивност кај
некомпетитивните хемилуминисцентни ензимско-имунохемиски методи.
213
Во ова поглавје најпрвин ќе се запознаеме со општите принципи на ензимско-
имунохемиските методи со фотометриска детекција, а потоа и со принципот на
хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски методи и нивната автоматизација.
Ензимско-имунохемиските методи, впрочем како и сите останати методи со
обележување, во основа можат да бидат поделени во две големи групи:
1. Компетитивни ензимско-имунохемиски методи и
2. Сендвич ензимско-имунохемиски методи.
Во продолжение, најпрвин ќе го изучиме принципот на компетитивните и сендвич
ензимско-имунохемиските методи со фотометриска детекција.
8.1.1. Компетитивни ензимско-имунохемиски методи со фотометриска детекција
Компетитивните ензимско-имунохемиски методи се означуваат и како EIA

(enzyme immunoassay). Истите имаат широка примена во хуманата in vitro дијагностика,
но исто така особено големо значење и примена имаат и во рамките на
биомедицинските истражувања и природните науки воопшто. Во продолжение, преку
еден општ пример, ќе се запознаеме со принципот на компетитивните ензимско-
имунохемиски методи со фотометриска детекција.
Кај компетитивните ензимско-имунохемиски методи двете компоненти:
обележениот и необележениот аналит (од примерокот) си „конкурираат“ еден со
друг за врзување за ограничениот број на врзувачки места (Слика 8.1).
Имено, во реакционото бунарче од микроплочата на чие дно претходно е
нанесено (имобилизирано) врзувачкото антитело (capture antibody), се додава:
а) Точно определена, ограничена концентрација од примарното антитело
(primary antibody),
б) Определуваниот аналит конјугиран (обележен) со ензим и
в) Примерокот за анализа.
Во конкретниов пример, во улога на ензим-обележувач се јавува алкалната
фосфатаза.
Овде треба да се нагласи дека кај голем број компетитивни ензимско-
имунохемиски методи функцијата на врзувачкото и примарното антитело е интегрирана
во едно единствено антитело.
AP AP
AP
AP
(AP)
AP AP
Слика 8.1. Шематски приказ на компетитивна ензимско-имунохемиска метода со

фотометриска детекција
214
Во текот на инкубациониот период, аналитот конјугиран со ензим и аналитот од
испитуваниот примерок си конкурираат за ограничениот број на врзувачки места на
примарното антитело, кое е врзано за имобилизираното врзувачко антитело.
Доколку концентрацијата на испитуваниот аналит во примерокот за анализа е
ниска, во тој случај процентуално повеќе молекули на обележен аналит ќе се врзат за
примарното антитело.
Обратно, при висока концентрацијата на испитуваниот аналит во примерокот за
анализа, процентуално помалку молекули на обележен аналит ќе се врзат за
примарното антитело.
После процедурата на перење, во реакционите бунарчиња се додава соодветен
супстрат кој бива хидролизиран од страна на ензимот, при што се создава обоен продукт
на реакцијата кој може да се фотометрира. Согласно принципот на методата,
концентрацијата на обележениот аналит кој останал во реакционото бунарче после
перењето е обратно пропорционална со концентрацијата на необележениот аналит кој
е присутен во примерокот, односно апсорбанцијата опаѓа со растењето на
концентрацијата на испитуваниот аналит во примерокот за анализа.
8.1.1.1. Определување на концентрацијата на кортизол со компетитивна ензимско-

имунохемиска метода со фотометриска детекција
За полесно разбирање на принципот на компетитивните ензимско-имунохемиски

методи со фотометриска детекција и за запознавање со техниката на изработка на овие
анализи, во оваа прилика детално ќе ја обработиме методата за определување на
кортизол во серум, согласно протоколот број RE 520 61 од производителот IBL
International Gmbh, Германија (од 2014 година во состав на компанијата Tecan,
Швајцарија). Оригиналниот протокол е закачен на платформата за е-учење.
Кортизолот е стероиден хормон кој се синтетизира во кората на надбубрежните

жлезди. Неговата структурна формула е прикажана на Слика 8.2. Во нормални услови,
само околу 10% од кортизолот што е присутен во крвната плазма циркулира во
слободна форма, додека остатокот е поврзан со протеинот транскортин и со
албумините. Секрецијата на кортизолот е регулирана од страна на
адренокортикотропниот хормон (ACTH) од хипофизата, преку механизмот на негативна
повратна спрега. Имено, со зголемување на концентрацијата на слободен кортизол во
циркулацијата, ослободувањето на ACTH се инхибира. Обратно, при ниски
концентрации на кортизол во циркулацијата, ACTH расте и кората на надбубрежната
жлезда секретира кортизол сѐ додека не се достигнат нормалните вредности во крвната
плазма.
Ослободувањето на ACTH од своја страна е под контрола на кортикотропниот
ослободувачки (рилизинг) хормон (CRH) од хипоталамусот. Негативната повратна
спрега што ја регулира концентрацијата на кортизол во циркулацијата постои и на ниво
на ACTH и на ниво на CRH.
Постои циркадијален ритам во лачењето на кортизолот, со највисоки
концентрации рано наутро. Поради тоа, кога се зема крв за определување на
концентрацијата на кортизолот, тоа треба да се направи во точно определено време, а
вообичаено околу 8:00 часот наутро.
Кортизолот има значајна улога во регулацијата на метаболните процеси во
организмот, а има и антиинфламаторно дејство.
215
Слика 8.2. Кортизол
Серумските концентрации на кортизол се определуваат со цел да се направи

проценка на суспектните нарушувања на неговата продукција:
- Кушингова болест,
- Адисонова болест или
- Секундарна адренална инсуфициенција.
Често пати, за локализација на нарушувањето (кора на надбубрежните жлезди,
хипофиза или хипоталамус) се прават динамички тестови на стимулација или супресија.
Принцип на методата: Овој реагенс-кит овозможува квантитативно

определување на кортизолот во хуман серум или плазма. Методата е базирана на
принципот на компетитивна ензимско-имунохемиска реакција и сепарација на
микроплоча. На Слика 8.3. е прикажан изгледот на една микроплоча.
А)Кортизолот што е присутен во примерокот за анализа во непозната
концентрација и Б)точно определената концентрација на кортизол обележен со ензим
од реагенсот означен како конјугат, си конкурираат меѓу себе за врзувачките места на
антителото со кое се обложени бунарчињата на микроплочата. После инкубацијата,
бунарчињата се перат и се додава супстрат TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine). По
кратка инкубација реакцијата се стопира со раствор на хлороводородна киселина.
Веднаш потоа се отчитува апсорбанцијата која е обратно пропорционална со
концентрацијата на кортизол во примерокот.
Слика 8.3. Изглед на микроплоча
Компоненти на реагенс-китот:
- Микроплоча, каде бунарчињата се обложени со зајачки анти-кортизол
антитела
o Овие антитела ја имаат функцијата и на врзувачко и на примарно
антитело.
o Реакционите бунарчиња на микроплочата ја претставуваат
цврстата фаза на реагенсот.
- Стандард А, со нулта концентрација
- Сет од стандарди B-G, со различна концентрација на кортизол
216
- Ензимски конјугат – кортизол конјугиран со пероксидаза
- TMB супстрат раствор – раствор од 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine со
водород пероксид
- TMB стоп раствор – раствор од 0,5М HCl
- Пуфер за перење, концентрат (40x) – пред употреба треба да се разреди
со вода
Начин на чување и стабилност на компонентите од китот: Детални

информации за секоја од компонентите од китот има во самиот протокол. Неправилното
чување на китот има влијание врз точноста на резултатите.
Примерок за анализа: Како примерок за анализа се користат серум или EDTA-

плазма. Стабилноста на кортизолот во примерокот изнесува 24 часа на температура од
2-8°С. За подолго чување, примерокот треба да се замрзне најмалку на -20°С или на
пониска температура.
За изработка на оваа анализа да не се користат силно хемолитични, иктерични
или силно липемични примероци.
Не е потребен пред третман на примерокот. Доколку концентрацијата на
кортизол во примерокот е повисока од 800 ng/mL, тогаш истиот треба да се разреди со
нултиот стандард (стандард А) и да се повтори определувањето. Добиениот резултат
треба да се помножи со факторот на дилуција.
Општи забелешки за начинот на изработка на анализата: Пред да се започне

со изработката на анализата, сите реагенси и примероци треба да достигнат собна
температура. Сите реагенси треба внимателно да се промешаат, без создавање на
пена. Кога еднаш ќе се започне со анализата, истата треба да се заврши до крај, без
прекинување. За секој реагенс, стандард или примерок да се употреби нов
продолжеток, со цел да се спречи вкрстената контаминација.
Начин на работа: Во секое реакционо бунарче се пипетира:

- Примерок од пациент (или стандард, или контролен примерок), 20 μL и
- Реагенс: кортизол конјугиран со пероксидаза (ензимски конјугат), 200 μL.
Примероците (стандардите, контролите) се пипетираат со стандарден,
едноканален пипетор, а реагенсот со мултиканален пипетор. На Слика 8.4. е прикажан
начинот на работа со мултиканален пипетор.
Слика 8.4. Начин на пипетирање со мултиканален пипетор
217
Плочата се промешува 10 секунди.
Следува период на инкубација од 60 минути на собна температура, во тек на кој
кортизолот од примерокот и кортизолот конјугиран со пероксидаза (од реагенсот) си
конкурираат меѓу себе за ограничениот број на врзувачки места на микроплочата.
Следува перење на бунарчињата со помош на перач на микроплочи (microplate
washer), 3х со по 300 μL претходно разреден пуфер за перење, со што се отстранува
целиот неврзан материјал. На Слика 8.5.а. е прикажан модел на перач на микроплочи.
Доколку во лабораторијата не поседуваме таков инструмент, како далеку поевтина а
исто толку ефикасна алтернатива може да се искористи мултиканален диспензер,
прикажан на Слика 8.5.б.
a. б.
а) Перач на микроплочи (Извор – BOECO, Германија)

б) Мултиканален диспензер (Извор – Merck, Германија)
Слика 8.5. Перач на микроплочи и мултиканален диспензер
После последното перење микроплочата треба да се преврти врз апсорбирачка

хартија (лигнин) и отсечно да се истапка, со цел да се отстранат сите резидуи од
течност.
Во реакционите бунарчиња веднаш се додава 100 μL супстрат TMB.
Микроплочата се инкубира 15 минути на собна температура, при што се создава
обоено комплексно соединение. Интензитетот на обојување е право пропорционален
со количеството на ензимот.
Реакцијата се стопира со 100 μL раствор на HCl со концентрација од 0,5 mol/L.
Нежно се промешува, при што треба да се внимава содржината да не излезе надвор од
бунарчињата. Микроплочата се фотометрира со помош на читач на микроплочи на 450
± 10 nm во рок од 1 час после стопирањето на реакцијата.
Паралелно со изработката на примероците од пациенти, при секое
определување треба да се изработат и стандардите (калибраторите) кои се содржани
во китот, со чија помош ќе се изработи калибрационата крива. Поради тоа што ова е
имунохемиска реакција од типот на competitive immunoassay, вредностите на
апсорбанциите ќе бидат обратно пропорционални со концентрациите на кортизол во
примероците.
При секое определување треба да се изработат и контролни примероци со ниска
и висока концентрација, со цел да се изврши контрола на квалитетот на резултатите.
8:00 – 10:00 часот наутро 50 – 230 ng/mL
16:00 часот 30 – 150 ng/mL
Фактор на конверзија: 1 ng/mL = 2,76 nmol/L

Лимит на детекција: 2,5 ng/mL (6,9 nmol/L)
218
8.1.2. Сендвич ензимско-имунохемиски методи со фотометриска детекција
Сендвич ензимско-имунохемиските методи се означуваат и како ELISA (enzyme

linked-immunosorbent assay). И овие методи, исто како и компетитивните, имаат широка
примена во хуманата in vitro дијагностика, но исто така се применуваат и во
биомедицинските истражувања. Во продолжение, преку еден општ пример, ќе се
запознаеме со принципот на сендвич ензимско-имунохемиските методи со
фотометриска детекција (Слика 8.6.).
Кај сендвич ензимско-имунохемиските методи аналитот чија концентрација ја
определуваме се наоѓа во еден вид на сендвич помеѓу врзувачкото (capture antibody) и
детекционото (detection antibody) антитело. За оваа техника е карактеристично тоа што
и врзувачкото и детекционото антитело вообичаено се во значителен вишок
споредено со концентрацијата на испитуваниот аналит во примерокот.
HRP HRP HRP

HRP
HRP
HRP HRP HRP (
Слика 8.6. Шематски приказ на сендвич ензимско-имунохемиска метода со

фотометриска детекција
Врзувачкото антитело кое е специфично за испитуваниот аналит е претходно

нанесено (имобилизирано) на дното на реакционото бунарче од микроплочата. Со
додавање на примерокот за анализа, аналитот кој е присутен во него се сврзува за
врзувачкото антитело.
После периодот на инкубација и перењето, во реакционото бунарче се додава
детекционо антитело кое е специфично за определуваниот аналит и кое е конјугирано
со ензим (enzyme-linked analyte-specific detection antibody). Во конкретниов пример, во
улога на ензим-обележувач се јавува пероксидазата. Детекционото антитело се врзува
за аналитот.
После вториот период на инкубација и перењето, во реакционото бунарче се
додава соодветен супстрат кој бива хидролизиран од страна на ензимот, при што се
создава обоен продукт на реакцијата кој може да се фотометрира.
Кај овој тип реакции интензитетот на обојувањето, а со тоа и вредноста на
апсорбанцијата се право пропорционални со концентрацијата на аналитот.
219
8.1.2.1. Определување на концентрацијата на Ц-пептид со сендвич ензимско-
имунохемиска метода со фотометриска детекција
Како и претходно, за полесно разбирање на принципот на методата и начинот на

изработка на овие анализи, ќе се послужиме со конкретен пример. Овој пат тоа ќе биде
квантитативно определување на Ц-пептид согласно протоколот број 10-1136-01 од
производителот Mercodia, Шведска.
Ц-пептидот претставува нуспродукт во процесот на биосинтеза на инсулинот.

Иако беа наведени во поглавјето каде ги обработивме клиничко-биохемиските методи
за дијагностицирање и следење на шеќерната болест, овде сепак ќе ги повториме
најзначајните клинички индикации за определување на концентрацијата на Ц-пептидот,
а тоа се:
1. Пре- и пост-дијагностички испитувања кај Diabetes mellitus, како насока за
избор на третманот,
2. Дијагностицирање на инсулином,
3. Следење на пациентите после панкреатектомија,
4. Проценка на вијабилноста на трансплантирани β-клетки.
Принцип на методата: Ц-пептидот што се наоѓа во примерокот за анализа (или

во калибраторот, или во контролниот примерок) реагира со глувчешките анти-Ц-пептид
антитела (capture antibody) со кои се обложени реакционите бунарчиња на
микроплочата. После инкубацијата и перењето се додава конјугатот: глувчешки анти-Ц-
пептид антитела конјугирани со пероксидаза (enzyme-linked analyte-specific detection
antibody). Овде е важно да се нагласи дека овие две антитела препознаваат различни
антигенски детерминанти на ниво на молекулата на Ц-пептидот. После периодот на
инкубација следува повторно перење со кое се отстранува вишокот (неврзаниот)
конјугат. Нивото на врзаниот конјугат (поточно нивото на пероксидазата) се детектира
со додавање на безбојниот супстрат TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), кој во ензимска
реакција катализирана од пероксидазата се трансформира во обоено комплексно
соединение. Реакцијата се стопира со додавање на раствор на сулфурна киселина.
Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со концентрацијата на Ц-
пептидот во примерокот. Се фотометрира на бранова должина од 450 nm во рок од
најмногу 30 минути.
Реагенси: Китот за определување на концентрацијата на Ц-пептидот ги содржи

сите потребни реагенси за изработка на 42 примероци и калибрациона крива, во
дупликат:
1. Микроплоча со 96 реакциони бунарчиња обложени со глувчешки анти-Ц-
пептид антитела;
2. 5 калибратори;
3. Нулти калибратор;
4. Ензимски конјугат (глувчешки анти-Ц-пептид антитела конјугирани со
пероксидаза);
5. Пуфер за разредување на ензимскиот конјугат;
6. Реакционен пуфер;
7. Пуфер за перење, концентрат (21х);
8. Супстрат TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine);
9. Раствор за стопирање на реакцијата (0,5 М H2SO4).
Примероци: Серум, хепаринизирана или EDTA-плазма или урина.

Во примероци од серум или плазма Ц-пептидот е стабилен до 3 дена на
температура од 2-8°C, а за подолго чување се препорачува температура од -20°C. Не
се препорачува повеќекратно одмрзнување и замрзнување.
220
За определување на концентрацијата на Ц-пептидот во урина се користи 24-
часовна урина, без конзерванс. Во текот на собирањето на урината истата треба да се
чува на температура од 2-8°C. По собирањето на урината анализата треба да се
изработи што е можно побрзо (најмногу во рок од 24 часа), а за подолго чување се
препорачува замрзнување на порција од урината на температура од -70°C. Не се
препорачува повеќекратно одмрзнување и замрзнување. Сепак, треба да се нагласи
дека определувањето на Ц-пептид нема некоја значајна клиничка примена.
Постапка: Пред да се започне со изведувањето на анализата реагенсите и

примероците треба да бидат на собна температура. За секоја серија примероци треба
да се изработи калибрациона крива.
Во секое реакционо бунарче треба да се испипетира по 25 μL калибратор,
односно примерок (од пациент или контролен примерок).
Во сите реакциони бунарчиња треба да се додаде по 50 μL реакционен пуфер.
За таа цел се користи мултиканален пипетор.
Микроплочата се покрива со фолија (parafilm), се става на мешалка и се инкубира
60 минути на собна температура.
По инкубацијата, микроплочата се пере 6 пати со разредениот пуфер за перење
(wash buffer) со помош на перач на микроплочи (microplate washer) или мултиканален
диспензер. После последното перење плочата треба да се преврти врз апсорбирачка
хартија (лигнин) и отсечно да се истапка. (Врзувачкото антитело и врзаниот Ц-пептид
остануваат врзани за дното на реакционите бунарчиња од микроплочата.)
Понатаму, со мултиканален пипетор, во сите реакциони бунарчиња се додаваат
по 100 μL ензимски конјугат.
Микроплочата повторно се покрива со фолија (parafilm), се става на мешалка и
се инкубира 60 минути на собна температура.
Следува повторно перење, 6 пати со разредениот пуфер за перење со помош на
microplate washer или мултиканален диспензер. После последното перење плочата
треба да се преврти врз апсорбирачка хартија (лигнин) и отсечно да се истапка.
Со мултиканален пипетор во сите реакциони бунарчиња се додава по 200 μL
супстрат TMB.
Се инкубира 15 минути на собна температура, на темно.
Со мултиканален пипетор во сите реакциони бунарчиња се додава по 50 μL
раствор за стопирање на реакцијата и кратко се промешува.
Се фотометрира со помош на читач на микроплочи (microplate reader) на 450 nm,
во рок од најмногу 30 минути. Интензитетот на обојувањето е право пропорционален со
концентрацијата на Ц-пептидот во калибраторот, односно примерокот.
Од резултатите кои се добиени за калибраторите се генерира калибрациона
крива, која се користи за определување на концентрацијата на Ц-пептидот во
испитуваните примероци.
Референтни вредности: 1,0 – 5,4 μg/L (343 – 1803 pmol/L)

Фактор на конверзија: 1 μg/L = 331 pmol/L
Лимит на детекција: 0,045 μg/L (15 pmol/L)
221
8.1.3. Основни принципи на хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски
методи
Како што беше кажано во воведниот дел, со замена на конвенционалната

фотометриска детекција со хемилуминисцентна детекција, која самата по себе се
одликува со висока сензитивност, се постигнува значително подобрување на лимитот
на детекција на ензимско-имунохемиските методи.
Од таа причина, хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски методи
добиваат значајно место во клиничката биохемија. Од особено значење е можноста за
нивна автоматизација, што овозможува релативно брзо и особено прецизно
квантитативно определување на повеќе десетици параметри што имаат клиничко
значење. Таков е примерот со автоматскиот имунохемиски анализатор Immulite 2000 од
производителот Siemens, Германија (Слика 8.7.), со чиј принцип на работа подетално
ќе се запознаеме во рамките на ова поглавје.
Слика 8.7. Immulite 2000, автоматски имунохемиски анализатор

(Извор – Siemens, Германија)
За хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски методи е карактеристично тоа

што сè до последната фаза на определувањето се засновани врз истите генерални
принципи како и ензимско-имунохемиските методи со фотометриска детекција.
Спецификата на последната фаза кај хемилуминисцентните ензимско-имунохемиски
методи се состои во тоа што тука се додава хемилуминисцентен супстрат. Тој претрпува
хемиска трансформација од страна на ензимот, при што се емитира светлина.
Кај линијата автоматски имунохемиски анализатори Immulite се употребува
хемилуминисцентниот супстрат 4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)-spiro-(1,2-dioxetane-
3,2’-adamantane). Тој бива дефосфорилиран од страна на алкалната фосфатаза, која
кај Immulite секогаш е составна компонента на конјугатот, при што се формира еден
нестабилен интермедиер. Овој нестабилен интермедиер понатаму спонтано се
разложува, при што се генерира светлина (Слика 8.8.). Интензитетот на емитираната
светлина е право пропорционален со количеството на алкалната фосфатаза.
222
O O
OCH3
OPO3
O O
OCH3
OCH3
O
O
Слика 8.8. Принцип на ензимска хемилуминисцентната детекција кај Immulite
Понатаму, овие методи го следат општиот принцип на компетитивните и сендвич

ензимско-имунохемиските методи:
- Кога се работи за ензимско-имунохемиски реакции од типот на competitive
immunoassay количеството на врзаната алкална фосфатаза е обратно
пропорционално со концентрацијата на испитуваниот аналит во
примерокот на пациентот.
- Кога се работи пак за ензимско-имунохемиски реакции од типот на
sandwich immunoassay количеството на врзаната алкална фосфатаза е
право пропорционално со концентрацијата на испитуваниот аналит во
примерокот на пациентот.
8.1.3.1. Определување на концентрацијата на кортизол во серум со

автоматизирана хемилуминисцентна ензимско-имунохемиска метода
Технолошките решенија што се применети кај Immulite 2000, најлесно ќе ги

објасниме преку еден конкретен пример, а тоа е определувањето на концентрацијата
на кортизол во серум. Ова определување е засновано на принципот на competitive
immunoassay или поконкретно, competitive chemiluminescent enzyme immunoassay.
Цврстата фаза на реагенсот, што е аналогна на реакционите бунарчиња од
микроплочите, е претставена со сфера која е обложена со зајачки анти-кортизол
антитела.
Течната фаза на реагенсот ја претставува кортизол конјугиран со алкална
фосфатаза, растворен во соодветен пуфер.
Анализата се изработува автоматски, на тој начин што сферата се вметнува во
реакционата кивета, а потоа се пипетираат примерокот, течната фаза од реагенсот и
вода (Слика 8.9.а.).
223
Слика 8.9. Шематски приказ на реакциона кивета кај Immulite 2000, во различни
фази од изработката на анализата
После тоа следува инкубација и автоматско мешање на реакционата кивета, во

самиот апарат, на 37°C. Во текот на инкубациониот период, кортизолот од примерокот
за анализа и конјугираниот кортизол од течната фаза на реагенсот си конкурираат меѓу
себе за врзувачките места на сферата. Така, ако во примерокот за анализа има висока
концентрација на кортизол, во тој случај пропорционално помалку конјугиран кортизол
ќе се врзе за сферата, количеството на врзана алкална фосфатаза исто така ќе биде
помало, а тоа ќе резултира и со помал интензитет на емитирана светлина.
По инкубацијата, во самиот апарат, реакционата кивета автоматски се
центрифугира со голема брзина околу нејзината замислена вертикална оска. На тој
начин целата реакциона течност се истиснува од киветата (Слика 8.9.б.).
Потоа следува серија од четири перења и центрифугирања, за на крај во
реакционата кивета да се додаде хемилуминисцентниот супстрат, со што настанува
карактеристичната ензимски амплифицирана хемилуминисцентна реакција (Слика
8.9.в.). Интензитетот на емитираната светлина се чита со помош на високо сензитивен
луминометар кој е интегрален дел на самиот апарат.
Калибрацијата на оваа метода, како впрочем и на останатите методи кај линијата

автоматски имунохемиски анализатори Immulite, се врши со комбинација на два
методолошки пристапи и тоа:
1. Калибрациона крива (master curve) која е изработена во лабораторијата на
производителот на реагенсите и на апаратот (станува збор за комплетно
затворен систем). Оваа калибрациона крива се внесува во апаратот на крајниот
корисник преку бар-кодовите кои ги има на секое пакување (кутија) од реагенсот.
Калибрационата крива е специфична за секоја серија реагенси. За изработка на
калибрационата крива производителот користи поголем број на калибратори кои
го опфаќаат целиот ранг на мерење на методата, а нивниот број варира од 6 до
15, зависно од анализата.
2. Користење на два адјустори (low и high) во рутинската лабораторија со чија
помош се врши корекција на калибрационата крива за спецификите на
конкретниот анализатор.
Тест-менито на линијата автоматски имунохемиски анализатори Immulite опфаќа

над 100 различни аналити. Меѓу другите, со Immulite се определуваат:
1. Параметри од значење за репродуктивната ендокринологија
- Дехидроепианростерон сулфат
- Естрадиол
- Фоликулостимулирачки хормон
- Лутеинизирачки хормон
- Прогестерон
224
- Пролактин
- Тестостерон
2. Параметри што ја детерминираат функцијата на тироидната жлезда
- Вкупен тироксин
- Вкупен тријодтиронин
- Слободен тироксин
- Слободен тријодтиронин
- Тиреостимулирачки хормон
- Тироксин-бајндинг глобулин
- Тироглобулин
- Автоантитела насочени кон тироглобулинот
- Автоантитела насочени кон тироидната пероксидаза
3. Параметри за дијагностика и следење на третманот кај пациенти со
шеќерна болест
- Ц-пептид
- Инсулин
- Микроалбуминурија
4. Параметри од значење за метаболизмот
- Адренокортикотропен хормон
- Кортизол
- Хомоцистеин
5. Туморски маркери
- Алфа-фетопротеин (AFP)
- Карциноембрионски антиген (CEA)
- Ca 15-3
- Ca 19-9
- Ca 125
- Простата специфичен антиген (PSA)
- Слободен простата специфичен антиген
6. Параметри од значење за дијагностиката на анемиите
- Еритропоетин
- Феритин
- Фолна киселина
- Фолат во еритроцити
- Витамин B12
7. Параметри што го детерминираат коскениот метаболизам
- Калцитонин
- Остеокалцин
- Дезоксипиридинолин (D-Pyrilinks)
- Витамин D
Освен Immulite, на пазарот се достапни и автоматски имунохемиски анализатори

од други производители, кои исто така нудат комплетни решенија за изработка на овие
и други слични параметри. Разбирливо е дека тест-менијата на автоматските
имунохемиски анализатори од различни производители се разликуваат. Меѓутоа, сите
компании генерално се трудат да ги опфатат параметрите што најчесто се
определуваат во рутинската клиничка пракса. Исто така компаниите се трудат да ги
следат новините во клиничко-биохемиската дијагностика, па периодично воведуваат
нови анализи.
Во однос на принципот на методите, постојат разлики кај автоматските
имунохемиски анализатори од различни производители, кои развиле специфични
технолошки решенија, различни од хемилуминисцентната ензимско-имунохемиска
анализа кај Immulite. Така на пример, кај автоматските имунохемиски анализатори од
линијата ARCHITECT, од производителот Abbott од Соединетите Американски Држави,
е применета малку поразлична хемилуминисцентна технологија. Имено, станува збор
225
за технологијата на хемилуминисцентна имуноанализа со микропартикули (CMIA –
chemiluminescent microparticle immunoassay), што се означува и како Chemiflex-
технологија.
Од друга страна кај автоматските имунохемиски анализатори од линијата Vidas,
од производителот BioMérieux од Франција, е применета технологијата на ензимски
поврзана флуоресцентна анализа (ELFA – enzyme linked fluorescent assay).
Со оглед на дијагностичкото значење на овие параметри и нивната широка
клиничка примена, реално е да се очекува дека и во иднина ќе бидеме сведоци на бројни
иновативни технолошки решенија на ова поле.
226
ЛИСТА НА КРАТЕНКИ
Кратенка Објаснување на кратенката Објаснување на кратенката на

на англиски јазик македонски јазик
Ab Antibody Антитело
ABCA1 ATP Binding Cassette Subfamily
A Member 1
ACAT Acyl-Coenzyme A: Cholesterol Ацил-коензим А: холестерол
Acyltransferase ацилтрансфераза
ACTH Adrenocorticotropic hormone Адренокортикотропен хормон
ADP Adenosine diphosphate Аденозин дифосфат
AFP Alpha-fetoprotein Алфа-фетопротеин
Ag Antigen Антиген
AHA American Heart Association Американска асоцијација за срце
ALOX Aluminum(III) oxide Алуминиум(III) оксид
ALP Alkaline phosphatase Алкална фосфатаза
ALT Alanine transaminase Аланин трансаминаза
ALАT Alanine aminotransferase Аланин аминотрансфераза
AMP Adenosine monophosphate Аденозин монофосфат
AMY Amylase Амилаза
anti-oxLDL Autoantibodies against oxidized Автоантитела против оксидираните
LDL LDL
AP Alkaline phosphatase Алкална фосфатаза
AST Aspartate transaminase Аспартат трансаминаза
ASАT Aspartate aminotransferase Аспартат аминотрансфераза
ATP Adenosine triphosphate Аденозин трифосфат
BCG Bromocresol green Бромкрезол зелено
BUF Buffer Пуфер
BUN Blood urea nitrogen Уреа азот во крвта
Ca 125 Carcinoma antigen 125 Карциномски антиген 125
Ca 15-3 Carcinoma antigen 15-3 Карциномски антиген 15-3
Ca 19-9 Carcinoma antigen 19-9 Карциномски антиген 19-9
CAB Chromazurol B Хромазурол Б
CAL Calibrator Калибратор
cAMP Cyclic adenosine monophosphate Цикличен аденозин монофосфат
CAPS N-cyclohexyl-3- N-циклохексил-3-
aminopropanesulfonic acid аминопропансулфонска киселина
CEA Carcinoembryonic antigen Карциноембрионски антиген
CHE Cholesterol esterase Холестерол естераза
CHO Cholesterol oxidase Холестерол оксидаза
CK Creatine kinase Креатин киназа
CK-BB Creatine kinase, brain Креатин киназа, мозочна
CK-MB Creatine kinase, heart Креатин киназа, срцева
CK-MM Creatine kinase, muscle Креатин киназа, мускулна
CK-Mt Creatine kinase, mitochondrial Креатин киназа, митохондријална
CMIA Chemiluminescent microparticle Хемилуминисцентна имуноанализа
immunoassay со микропартикули
227
CNP 2-Chloro-4-nitrophenol 2-Хлоро-4-нитрофенол
CNPG3 2-Chloro-4-nitrophenyl- 2-Хлоро-4-нитрофенил-
maltotrioside малтотриозид
CPK Creatine phosphokinase Креатин фосфокиназа
CRH Corticotropin-releasing hormone Кортикотропен ослободувачки
(рилизинг) хормон
CRP C-reactive protein Ц-реактивен протеин
CTMA Cetyltrimethylammonium bromide Цетилтриметиламониум бромид
CV Coefficient of variation Коефициент на варијација
DBR Direct bilirubin reagent Реагенс за определување на
директен билирубин
DMT1 Divalent metal transporter 1 Транспортер на двовалентни
метални јони 1
DNR D-Nitrite reagent, for Нитритен реагенс за определување
determination of direct bilirubin на директен билирубин
DSA Diazotized sulphanilic acid Диазотирана сулфанилна киселина
E.C. Enzyme Commission Комисија за ензими
Ea Activation energy Енергија на активација
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Етилендиаминтетраоцетна киселина
EIA Enzyme immunoassay Ензимска имуноанализа
EKG Electrocardiogram Електрокардиограм
ELFA Enzyme linked fluorescent assay Ензимски поврзана флуоресцентна
анализа
ELISA Enzyme linked-immunosorbent Ензимски поврзана имуносорбентна
assay анализа
ENZ Enzyme Ензим
ES Enzyme-substrate complex Ензим-супстрат комплекс
комплекс
G6P-DH Glucose-6-phosphate Глукоза-6-фосфат дехидрогеназа
dehydrogenase
GEDTA Glycoletherdiamine-N,N,N’,N’- Гликолетердиамин-N,N,N’,N’-
tetraacetic acid тетраоцетна киселина
GFR Glomerular filtration rate Брзина на гломеруларната
филтрација
GGT Gamma glutamyl transferase γ-Глутамил трансфераза
GK Glycerol kinase Глицерол киназа
GLDH Glutamate dehydrogenase Глутамат дехидрогеназа
GOD Glucose oxidase Глукоза оксидаза
GOT Glutamate-oxaloacetate Глутамат-оксалацетат трансаминаза
transaminase
GPO Glycerol phosphate oxidase Глицерол фосфат оксидаза
GPT Glutamate-pyruvate Глутамат-пируват трансаминаза
transaminase
HbA1c Hemoglobin A1c Хемоглобин А1ц
HBDH α-Hydroxybutyrate α-Хидроксибутират дехидрогеназа
dehydrogenase
HbF Fetal hemoglobin Фетален хемоглобин
HDL High Density Lipoproteins Липопротеини со голема густина
228
HK Hexokinase Хексокиназа
HMG - CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA 3-Хидрокси-3-метилглутарил
коензим А
HPLC High-performance liquid Течна хроматографија со високи
chromatography перформанси
HRP Horseradish peroxidase Пероксидаза од рен
IDDM Insulin-Dependent Diabetes Инсулин зависен дијабетес мелитус
Mellitus
IDL Intermediate Density Lipoproteins Липопротеини со средна густина
IFCC International Federation of Меѓународна федерација за
Clinical Chemistry клиничка хемија
IgA Immunoglobulin A Имуноглобулин А
IgG Immunoglobulin G Имуноглобулин Г
IgM Immunoglobulin M Имуноглобулин М
IR Infrared Инфрацрвена (светлина)
ISE Ion-selective electrode Јон-селективна електрода
ISO International Organization for Меѓународна организација за
Standardization стандардизација
Km Michaelis-Menten constant Michaelis-Menten-ова константа
LCAT Lecithin-Cholesterol Лецитин-холестерол
Acyltransferase ацилтрансфераза
LCF Lipid clearing factor Липид отстранувачки фактор
LDH Lactate dehydrogenase Лактат дехидрогеназа
LDL Low Density Lipoproteins Липопротеини со мала густина
LIP Lipase Липаза
Lp(a) Lipoprotein(a) Липопротеин (а)
MDH Malate dehydrogenase Малат дехидрогеназа
MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic 2-(N-морфолино)етансулфонска
acid киселина
moxLDL Minimally oxidized LDL Минимално оксидирани LDL
NAC N-acetylcysteine N-Ацетилцистеин
NAD Nicotinamide adenine Никотинамид аденин динуклеотид
dinucleotide
NADP Nicotinamide adenine Никотинамид аденин динуклеотид
dinucleotide phosphate фосфат
NIDDM Non-Insulin-Dependent Diabetes Инсулин независен дијабетес
Mellitus мелитус
O.D. Optical density Оптичка густина
oxLDL Oxidized LDL Оксидирани LDL
PAP p-Aminoantipyrine; пара-Аминоантипирин;
p-Aminophenazone пара-Аминофеназон
PIC Picric acid Пикринска киселина
PIPES Piperazine-N,N′-bis(2- Пиперазин-N',N'-бис(2-
ethanesulfonic acid) етансулфонска киселина)
POD Peroxidase Пероксидаза
PREC Precipitant Реагенс за преципитација
PSA Prostate specific antigen Простата специфичен антиген
229
R1 Reagent 1 Реагенс 1
R2 Reagent 2 Реагенс 2
RCF Relative centrifugal force Релативна центрифугална сила
RF Rheumatoid factor Ревматски фактор
rgH2O Reagent grade water Вода со степен на чистота на
реагенс
RGT Reagent Реагенс
rpm Revolutions per minute Број на вртежи во минута
SCE Scandinavian Committee of Скандинавски комитет за ензими
Enzymes
sGOT Serum glutamate-oxaloacetate Серумска глутамат-оксалацетат
transaminase трансаминаза
sGPT Serum glutamate-pyruvate Серумска глутамат-пируват
transaminase трансаминаза
SI (d'unités) Système international (d'unités) -- Интернационален систем на
Француски единици
STD Standard Стандард
SUB Substrate Супстрат
TBR Total bilirubin reagent Реагенс за определување на
тотален билирубин
TIBC Total iron binding capacity Вкупен капацитет за врзување на
железо
TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин
TNR T-Nitrite reagent, for Нитритен реагенс за определување
determination of total bilirubin на тотален билирубин
TOOS N-ethyl-N-(2-hydroxy-3- N-етил-N-(2-хидрокси-3-
sulfopropyl)-3-methylaniline сулфопропил)-3-метиланилин
sodium salt натриумова сол
TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethane Трис(хидроксиметил)аминометан
UIBC Unsaturated iron binding capacity Незаситен капацитет за врзување на
железо
UV Ultraviolet Ултравиолетова (светлина)
VLDL Very Low Density Lipoproteins Липопротеини со многу мала густина
Vmax Maximal rate of the reaction Максимална брзина на реакцијата
WHO World Health Organization Светска здравствена организација
WR Working reagent Работен реагенс
α-HBDH α-Hydroxybutyrate α-Хидроксибутират дехидрогеназа
dehydrogenase
γGT (или Gamma glutamyl transferase γ-Глутамил трансфераза
γ-GT)
ДНК / Дезоксирибонуклеинска киселина
КоА / Коензим А
оГТТ / Орален глукоза толеранс тест
РНК / Рибонуклеинска киселина
230
ЛИТЕРАТУРА
Учебници
1. Burtis, CA, Ashwood ER, Bruns DE. TIETZ, Fundamentals of CLINICAL CHEMISTRY.
6th edition, Saunders, Elsevier, 2008.
2. Karlson P. BIOKEMIJA – za studentе kemije i medicine. Превод на хрватски јазик,
Školska knjiga, Zagreb, 1993.
3. Koolman J, Roehm KH. Color Atlas of Biochemistry. Second edition. Thieme, Stuttgart,
New York, 2005.
4. Majkić-Singh N. MEDICINSKA BIOHEMIJA. Drugo dopunjeno izdanje. Društvo
medicinskih biohemičara Srbije, Beograd, 2006.
5. Štraus B. MEDICINSKA BIOKEMIJA. Jugoslavenska medicinska naklada, Zagreb,
1988.
6. Нелсон ДЛ, Кокс ММ. ЛЕНИНЏЕР, ПРИНЦИПИ НА БИОХЕМИЈАТА. Петто
издание. Превод на македонски јазик, НИД МИКЕНА – Битола, 2011.
7. Џекова-Стојкова С, и соработници. БИОХЕМИЈА. Катедра по биохемија при
Медицинскиот факултет - Скопје, НИП „Форум“, Скопје, 1999.
Прирачници
1. Just Svendsen P, Blirup-Jensen S. Determination of Human Plasma Proteins by
Turbidimetry and Nephelometry. Basic Principles and the DAKO Test System for
Quantitative Protein Determinations on Automated Instruments. DAKO A/S,
Copenhagen, Denmark, 1997.
2. Груев Т. Анализа на урината со тест ленти, уринарен седимент и интерпретација
на резултатите. Институт за Клиничка биохемија, Клинички центар, Скопје.
Мартин – Комерц, Скопје, 2006.
Докторска дисертација
1. Рушковска Т. Влијание на ловастатинот врз оксидативниот стрес и врз IgG
автоантителата против MDA модифицираните LDL честички кај пациенти со
дислипидемија. Докторска дисертација, Универзитет „Кирил и Методиј“, Скопје,
2002.
Статии од научни списанија

1. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus.
Diabetes Care. 2012 Jan;35 Suppl 1:S64-71. doi: 10.2337/dc12-s064.
2. Anderson GJ, Frazer DM. Current understanding of iron homeostasis. Am J Clin Nutr.
2017 Dec;106(Suppl 6):1559S-1566S. doi: 10.3945/ajcn.117.155804.
3. van Kerkhof LW, Van Dycke KC, Jansen EH, Beekhof PK, van Oostrom CT,
Ruskovska T, Velickova N, Kamcev N, Pennings JL, van Steeg H, Rodenburg W.
Diurnal Variation of Hormonal and Lipid Biomarkers in a Molecular Epidemiology-Like
Setting. PLoS One. 2015 Aug 18;10(8):e0135652. doi: 10.1371/journal.pone.0135652.
eCollection 2015.
4. Yeshurun D, Gotto AM Jr. Hyperlipidemia: perspectives in diagnosis and treatment.
South Med J. 1995 Apr;88(4):379-91.
231
Интернет страници
1. 77 Elektronika Kft, URISED mini
http://en.e77.hu/products/urine-analyzers/urised-mini
Пристапено на 10.12.2018
2. Abbott, ARCHITECT i2000SR
https://www.corelaboratory.abbott/int/en/offerings/brands/architect/architect-i2000SR
3. Analyticon, Urilyzer® 100 Pro
https://www.analyticon-
diagnostics.com/en/products_and_solutions/urine_diagnostic/analyzer/urilyzer_100.h
tml
4. ARKRAY USA Clinical Diagnostics, AUTION HYBRID AU-4050
http://www.arkrayusa.com/clinical-diagnostics/products/aution-hybrid-au4050
5. Arlington Scientific, Inc.®, CRP Procedures and Interpretation
http://www.arlingtonscientific.com/crp-procedures.html
6. Beckman Coulter, HbA1c
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=/cis/BAOSR6x92/%
%/EN_HbA1c_
7. Behnk Elektronik, Thrombotimer
http://www.behnk.de/en/halbautomaten/thrombotimer.php
8. BioMérieux, mini Vidas
https://www.biomerieux-diagnostics.com/mini-vidasr
9. Bio-Rad, Monitoring for Hemolysis, Icterus and Lipemia (HIL)
http://www.qcnet.com/serumindices/
10. BOECO, microplate washer
https://boeco.com/artikelShow.php?ID=425
11. Built for Motion, Oral Glucose Tolerance Test
http://www.builtformotion.co.nz/reversing-type-2-diabetes-blog/very-low-calorie-diets-
type-2-diabetes-reversal-part-4-glucose-tolerance
12. Dietary Guidelines for Americans
https://health.gov/dietaryguidelines/2015/
13. Greiner Bio-One, Preanalytics
https://www.gbo.com/en_US/applications-products.html
14. HemoCue, Glucose 201 DM System
https://www.hemocue.com/en/solutions/diabetes/hemocue-glucose-201-dm-system
15. HemoCue, HbA1c 501 System
https://www.hemocue.com/en/solutions/diabetes/hemocue-hba1c-501-system
232
16. Human
https://www.human.de/
17. Instrumentation Laboratory, GEM Premier 3000
https://www.instrumentationlaboratory.com/en/gem-premier-3000
18. Merck, Stat-Matic II Plate Washer
http://www.merckmillipore.com/INTL/en/product/Stat-Matic-II-Plate-Washer-with-
bottle,MM_NF-2402
19. Mercodia
https://www.mercodia.se/
20. Sarstedt, Blood collection systems
https://www.sarstedt.com/en/products/diagnostic/blood-sedimentation/blood-
collection-systems/
21. Sarstedt, Capillary blood collection
https://www.sarstedt.com/en/products/new-products/tip-of-the-month-capillary-blood-
collection/
22. Sarstedt, Universal rocking mixer
https://www.sarstedt.com/en/products/laboratory/mixers/devices/product/90.180.200/
23. Siemens, Immulite 2000
https://www.healthcare.siemens.com/immunoassay/systems/immulite-2000-
immunoassay-ystem
24. Tecan
https://www.tecan.com/history
25. The Binding Site, MININEPHplus
https://www.bindingsite.com/en/discover/clinical-chemistry/mininephplus/technical-
specification
26. Thermo Scientific, Finnpipette
http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/D00181.pdf
27. University of Washington, Courses
https://courses.washington.edu/conj/bess/iron/iron.htm
28. VITLAB, Efficiency in variable pipetting
https://www.vitlab.com/en/products/knowledge/pipetting/
29. Wikimedia, Tablica aminokiselina
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tablica_aminokiselina.jpg
233
ПРЕДМЕТЕН АЗБУЧЕН ИНДЕКС
24-часовна урина, 5, 53-54, 116, 131, CRH (corticotropin-releasing hormone),

134, 137,198, 221 215
2-моноглицерид, 64 Crigler-Najjar синдром, 120
2-хлоро-4-нитрофенил-малтотриозид, CRP (C-reactive protein), 23, 107, 110-
167 111
4-аминофеназон (4-аминоантипирин,
PAP), 40-41, 78, 80, 84, 86, 137
D
4-нитрофенил фосфат, 176
Diabetes mellitus, види шеќерна болест
5-амино-2-нитробензоат, 169, 171
Dubin-Johnson синдром, 120
6-фосфоглуконолактон, 164
7-дехидрохолестерол, 62
E
EIA (enzyme immunoassay), 214
A
ELFA (enzyme linked fluorescent assay),
ABCA1 (ATP Binding Cassette Subfamily 226
A Member 1), 71, 74
ELISA (enzyme linked-immunosorbent
anti-oxLDL (autoantibodies against assay), 219
oxidized LDL), 76
Erlich-ова реакција, 125
B
F
Bence-Jones протеинурија, 114
Fredrickson-ова класификација на
Bence-Jones-ов протеин, 99, 115-116 дислипидемиите, 73
Berthеlot-ова реакција, 127 Friedеwald-ова формула, 88
BUN (blood urea nitrogen), 126-128
G
C Gaucher-ова болест, 179
Ca 125, 225 Gilbert синдром, 120
Ca 15-3, 225
Ca 19-9, 225 H
cis-изомерија HbA1c (hemoglobin A1c), 3, 50-53
кај билирубинот, 121 HDL (high density lipoproteins), 20, 67-71,
73-75, 77, 82-86, 88-89
кај масните киселини, 59, 65
Henderson-Hasselbalch-ова равенка,
CMIA (chemiluminescent microparticle 189
immunoassay), 226
Henle-ова петелка, 113,183-184, 187
234
HMG - CoA редуктаза, 70 R
HPLC (high-performance liquid Rosin метода, 124
chromatography), 122,137
Rotor синдром, 120
I
T
IDL (intermediate density lipoproteins), 67-
68, 70, 73-74, 89 Tamm-Horsfall-ов протеин, 113
ISE (ion-selective electrode), 185-187, TIBC (total iron binding capacity), 205,
194 207-208, 210-212
TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), 216-
218, 220-221
J
trans-изомерија
Jaffé-ова реакција, 6, 132
кај билирубинот, 121
Jendrassik/Gróf метода, 122
кај масните киселини, 58-59, 65
L
U
LDL (low density lipoproteins), 67-68, 70,
73-77, 82, 84, 86-89 UIBC (unsaturated iron binding capacity),
205, 207, 210-211
Lp(a) [lipoprotein(a)], 22, 68
Lucey-Driscoll синдром, 120
V
VLDL (very low density lipoproteins), 67-
M 68, 70,73, 82, 84, 86, 88-89
Michaelis-Menten-ова
константа, 145 α
теорија за интермедиерно α-1,4 гликозидна врска, 32-33, 166
соединение, 143, 150
α1-антитрипсин, 111
α1-кисел гликопротеин, 111
N
α-амилаза, 6, 22, 33, 141-142, 147-149,
Na+,K+-ATP-азна пумпа, 184,186 166-168, 178
N-ацетилцистеин, 163 макроамилаза,166
α-кератин, 95
P α-клетки на Лангерхансовите островца
на панкреасот, 37
p-нитроанилин, 152
α-линоленска киселина, 58-59
p-нитрофенол, 152
α-хидроксибутират дехидрогеназа, 178
point-of-care, 52, 186
purine salvage pathway, 136
235
β аланин аминотрансфераза (ALAT, ALT),
3, 21, 22-23, 97, 148-149, 154, 158-159,
β2-микроглобулин, 111, 113-114 161, 172
β-каротен, 64 алдози, 25-26, 29
β-клетки на Лангерхансовите островца алдостерон, 64, 184-185
во панкреасот, 36, 38-39, 54-55, 220
алкална фосфатаза, 22-23, 141, 147-
β-оксидација на масните киселини, 36, 149, 175-177
65
алкална фосфатаза како компонента
β-хидроксибутерна киселина, 37, 46, на конјугат, 214, 222-224
136
алкохол (консумирање, злоупотреба),
21, 23, 154, 159, 169, 199
γ алфа-фетопротеин, 225
γ-глутамил трансфераза, 21, 23, 148- амилоза, 32
149, 169, 171
амилопектин, 32
аминопептидази, 96
ω
амплификација на реакцијата
ω-3 масни киселини, 58
со ензим, 213, 224
со латекс партикули, 108
A
ангиотензин, 184
автоантитела, 38, 76, 110, 225
антиатерогено дејство, 58, 71, 75, 82
аглутинација, 51, 111-112, 213
антибиотици, 23, 154, 159
адипоцити, 36, 57, 65
антигенски детерминанти, 220
Адисонова болест, 37, 216
антидиуретичен хормон, 94, 184
адреналин, 35, 37, 65
антиепилептици, 169
aдренокортикотропен хормон, 94, 215,
225 антиинфламаторно дејство, 58, 71, 215
аеросоли, 3, 9 антиоксиданс, 64, 71
азотен биланс, 98 антисерум, 109, 163
аконитаза, 203 аполипопротеин, 68-71, 74, 76-77, 89,
111
акромегалија, 37, 39
апотрансферин, 203, 205
активатор на коагулација, 3, 10
апоферитин, 202, 212
активен центар, 142, 146, 162
арахидинска киселина, 57
акутен апендицитис, 166
арахидонска киселина, 58
акутна миелоична леукемија, 173
аргиназа, 141
акутна фаза (протеин на...), 110, 112,
212 аргинин, 92, 130, 141
акцелератор, 119, 122 арсеназо III, 194
236
артериоли, 184 белодробен инфаркт, 163
артропатија, 207 бикарбонат, 181, 183, 187-190, 193
аскорбинска киселина, види витамини биливердин, 118, 124
аспартат аминотрансфераза (ASAT, биливердин редуктаза, 118
AST), 3, 21-23, 147-149, 153-159, 161,
172 билијарна атрезија, 121
атаксија, 184 билицијанин, 124
атероген ризик (aтерогеност), 56, 73-77, биогени амини, 97

82, 88 биосинтеза на масни киселини, 66
атеросклероза, 33, 59, 68, 74-77, 82, 89 биуретска метода, 99-100, 112
атероматозни плаки, 75-76 брадикардија, 185
ацетилхолин, 179 бременост, 21-22, 39, 73, 98, 110, 112,
ацетон, 37, 46 114, 175, 206, 208
ацетоцетна киселина, 37, 46 брзина на гломеруларната филтрација,

131-132, 178
ацидо-базна рамнотежа, 98, 187-190,
196 бромкрезол зелено, 99, 102
ацидоза, 38, 99, 136, 190

ацил КоА, 64-65 В
ацил-коензим А: холестерол вазоконстрикција, 191

ацилтрансфераза, 71 вазопресин, види антидиуретичен
хормон
Б Ван дер Валсови сили, 66
бакар ванадиум, 181
во состав на Фелинговиот вирусна инфекција, 38, 110

раствор, 28 висока телесна температура, 114
во состав на церулоплазминот, витамини, 56
96
витамин B12, 172, 208, 225
интерференција, 210-211
витамин B6 (пиридоксал
кај биуретската метода, 100 фосфат), 155, 157, 159, 161, 208
како иреверзибилен инхибитор, витамин C (аскорбинска
146 киселина), 23, 42, 81, 84, 124,
како микроелемент, 181-182 137, 139, 203
улога во оксидација на витамин D, 62, 193-194, 196-197,

железото, 203-204 225
барбитурати, 120, 169 витамин F, 59
батофенантролин, 208 фолна киселина, 172, 208, 225
бели дробови, 50, 153, 166, 179, 189 вителин, 95
237
водена хомеостаза, 183, 187, 196 глукоза
водородни врски, 66, 92 аналитички аспекти, 39-46, 48-
49, 190
воспаление, 33, 110, 112, 114, 136, 147,
158 влијание на различни фактори,
22-23
време на полуживот, 53-54, 97, 148
во состав на реагенс, 163-164
за пресметување на
Г осмолалност, 188
галактоза, 29-31, 33, 61 преаналитички аспекти, 2, 4, 39-
ганглиозиди, 61 40
гангрена, 154 хемиска структура и

метаболизам, 25-38, 50, 52, 61,
гванидинооцетна киселина, 130 140, 187
гихт, 136-137 глукоза оксидаза, 40-41, 46, 142
гликолиза, 4, 30, 34-36, 39-40, 66, 186 глукоза-6-фосфат дехидрогеназа, 43,
164
гликозидна група, види полуацетална
хидроксилна група глукозурија, 46, 48
глицералдехид, 26-27, 91 глуконска киселина, 40
глицерол глукуронска киселина, 28, 118-120
во методата за определување глутамат дехидрогеназа, 97, 127, 148,
на триглицериди, 80 178-179
во состав на органски глутатион, 94
соединенија и метаболизам, 34-
36, 56-57, 59-61, 64-65, 69-70, глутелини, 95
178
заштита при работа во Д
лабораторија, 7
Даунов синдром, 39
глицерол киназа, 80
дебело црево, 119
глицерол фосфат оксидаза, 80
дезинфекција, 2, 7, 9, 12-13, 20, 115
глицин, 92
дезоксипиридинолин, 4, 225
во биосинтеза на креатинот, 130
дезоксирибоза, 25, 29, 135
во состав на пептиди, 94
дезоксихолна киселина, 63
за конјугација со жолчните
киселини, 63 декарбоксилација
гломеруларна базална мембрана, 113- декарбоксилација на
114, 187 аминокиселините, 97
гломерулонефритис, 175 оксидативна декарбоксилација
на пируватот, 34-35, 66
глукагон, 35, 37, 65, 94
декстрини, 33, 166
денатурација, 33, 51, 96, 144
238
депротеинизација, 43 ентерохепатална циркулација, 63, 119
десатурација на масните киселини, 66 ентероцити, 64, 69, 71, 203, 205
дехидратација, 99, 126 енцефалопатија, 120
дехидроепианростерон сулфат, 224 ергостерол, 62
диазо реакција, 119, 122, 124 еритропоетин, 225
диазотиран дихлоранилин, 124 естрадиол, 64, 224
диазотирана сулфанилна киселина, 122 етанол амин, 60
дибукаински број, 180
дијабет, види шеќерна болест Ж
дијареја, 99, 199 железо, 2, 21-24, 51, 96, 110, 118, 181-
182, 202-212
дијастаза, 142
жива, 146
дипептидази, 96
жолтица (иктерус), 119-121, 154, 159,
директен билирубин, види конјугиран 169, 172, 175
билирубин
жолчни киселини, 56, 62-64
дисбеталипопротеинемија, 74
жолчни патишта, 120-121, 149, 172, 175
дисеминирана интраваскуларна
коагулација, 112
дислипидемија, 56, 73-74, 77 З
диуреза, 5, 131 зона на сигурност, 106-108
диуретици, 48, 199
дуоденум, 119, 193-194, 203 И
изгореници, 7, 13, 37, 99, 114
Е изоелектрична точка, 91
егзоцитоза, 69-70 изоензими, 141, 148-149, 152-153, 162-
163, 166, 172, 175, 178
еластаза, 96
изопреноиди, 62, 64
електролити (електролитен статус), 21,
181, 183-184, 186, 188 иктерус, види жолтица
електронеутралност, 183-184, 187 илеум, 196
електрофореза, 67, 99, 116, 153, 166, илеус, 166
178, 213
имуноглобулини (Ig), 22, 99, 107, 110-
електрохемиски методи, 45, 185, 190 111, 162-163, 166
елонгација на масните киселини, 66 имуноинхибиторна метода, 51-52, 162-
163
ендозом, 205
индиректен билирубин, види
ендоплазматичен ретикулум, 54, 66, 69- неконјугиран билирубин
70, 119
индуцирано прилагодување, 142
енергија на активација, 140, 143
239
иницијална брзина на ензимската преаналитички аспекти, 2-3, 12,
реакција, 150 186-187
инсулином, 37, 54, 220 придонес кон осмолалноста, 188
инсулинска резистенција, 36, 38, 55 калцитонин, 94, 225
интермедиерно соединение, 143 калциум
интернационална единица, 152 влијание на возраста, 22
интестинална опструкција, 166 како макроелемент, 181-183,
193-194, 196, 199
интолеранција кон лактоза, 33
како таргет на антикоагуланси, 4,
интрамускулни инјекции, 163 23
интрацелуларна хидролиза на масти, определување, 175, 190, 194-
65 196, 198
инфаркт на миокардот, 112, 154, 159, придонес кон осмолалноста, 188
163, 172, 178
карбоксипептидази, 96
инфективна мононуклеоза, 173
карбон анхидраза, 188
инфекција, 3, 8, 38, 48, 54, 98, 110, 112,
166, 208, 210 кардијален арест, 185
инфламација, види воспаление кардиомиопатија, 207
инфузија, 9, 12, 23 карнитин, 65
иритабилност, 184-185 каротиди, 74
карциноембрионски антиген (CEA), 23,
225
Ј
катал, 152
јаглеродна киселина, 188-189
каталаза, 84, 86, 96, 118
јејунум, 196, 203
квантитативна имунопреципитациона
јонизиран (слободен) калциум, 190, крива, 104-107
193-194
керниктерус, 120-121
јон-селективни електроди, види ISE
кетогенеза, 37, 65
југстагломеруларни клетки, 184
кетонски тела, 36-37, 46, 116
кинонимин, 40, 78, 80, 137
К
кисела простатична фосфатаза, 149,
казеин, 95 152, 179
калиум Клинефелтеров синдром, 39
во состав на антикоагуланси, 4, клиренс, 131-132, 134
23
кобалт, 181-182
како електролит, 181-185
колаген, 95
определување, 185-187, 190
количник на De Ritis, 154
240
колоидно-осмотски притисок, 98 ксилидил сино, 199-200
кома, 184, 197 Кушингова болест, 37, 39, 216
комплемент (Ц3, Ц4), 111 лактаза, 31, 33
комплетен преглед на урина, 5, 116-117 лактат дехидрогеназа, 3, 22-23, 35, 142,
144, 148-149, 151, 159, 172-174, 178
конјугиран билирубин, 119-122
лактоза, 29-31, 33
контрацептиви, 169, 208
латекс партикули, 51, 108, 111
конфузија, 184-185
лауринска киселина, 57
коронарни артерии, 74-75
леукемија, 136, 173
кортизол
лецитин, 60-61
биолошка активност, 35, 37, 64,
127, 215 лецитин-холестерол ацилтрансфераза,
71, 89
влијание на пушењето, 23
лигази, 142
дневно-ноќни варијации, 2, 22,
215 лизозоми, 70, 135, 202
определување, 215-218, 223-224 лимит на детекција, 106-107, 213, 218,
221-222
кортикостероиди, 39, 48
линолеинска киселина, 58-59
коскена ресорпција, 194
лиофилизат, 24, 85, 87, 190
коскена срцевина, 118, 172, 202, 204-
205, 207, 212 липаза, 64-65, 69-70, 73-74, 80, 147-149,
178
кофеин (како акцелератор), 122
липопротеини, види HDL, IDL, LDL,
крвавења (загуба на крв), 51, 99, 206, Lp(a), VLDL, хиломикрони
208
литохолна киселина, 63
креатин, 130, 162
лупус, 110
креатин киназа (CK, CPK), 21-22, 130,
148-149, 151-152, 162-165, 172 лутеинизирачки хормон, 224
креатинин магнезиум
албумин/креатинин, 53-54 преаналитички аспекти, 3, 23
влијание на различни фактори, во состав на реагенси, 82, 86,
21, 23 163-164, 176
како деградационен продукт, како макроелемент, 181-183, 199
118, 127, 130-132
определување, 199-201
макромолекуларни форми на CK, 162
преаналитички аспекти, 6
макросомија, 39
критична точка, 106-107
макрофаги, 76, 179, 205
ксантин, 135
малапсорпција, 99, 199, 208
ксантин оксидаза, 135
малат дехидрогеназа, 155
241
малнутриција, 23, 99, 127, 194, 199, 208 Н
малтоза, 30-31, 33, 166 надбубрежни жлезди, 35, 62-64, 184,
215-216
масни ленти, 75
надморска височина, 21-22
масно ткиво, 35, 57, 66, 166
натриум
мегалобластна анемија, 172
во состав на антикоагуланси, 4,
мезобилин, 119 23
мезобилиноген, 119 за пресметување на
менструален циклус, 21-22, 208, 210 осмолалноста, 188
металопротеиди, 96 како електролит, 181-185, 187,

190
метода на Clauss, 112
определување, 185-187, 190
методи на континуирано мерење, 150-
151 преаналитички аспекти, 186
механичка вентилација, 180 натриум нитропрусид, 46
миастенија гравис, 154, 163 наузеа, 184
микроалбуминурија, 53-54, 225 невропептиди, 94
микроваскуларни компликации, 38, 53 неконјугиран билирубин, 118-122
микрозоми, 169 некроза, 110, 126, 147-148, 154, 166
миоглобин, 96, 118, 202-203 непротеински азот, 126
миоглобинурија, 114 нервни гасови, 146
миозитис, 154, 163 нефротски синдром, 99, 194, 210
мио-инозитол, 60 нитритен реагенс, 122, 124
миорелаксант, 180 нуклеозид, 135
миристинска киселина, 57 нуклеопротеиди, 95-96, 135
мозочен удар, 112 нуклеотиди, 135-136, 196
моноклонални имуноглобулини
(парапротеини), 99 О
мочна киселина овариуми, 64, 166
влијание на различни фактори, оГТТ, 33, 48-49, 55
21, 23
о-крезолфталеин-комплексон, 194-195
како деградационен продукт,
118, 135-137 оксидативен стрес, 202
определување, 137-139 оксидативна дезаминација, 97, 126
мултипла миелома, 99, 111, 114, 136 оксидоредуктази, 142, 151
мускулна дистрофија, 154, 163 окситоцин, 94
мускулна слабост, 185, 197 олеинска киселина, 58-59
242
олигосахариди, 25, 30, 33, 61, 166 парцијален притисок
олово (труење), 136, 208 на јаглерод диоксидот, 181, 189-
191
онкотски притисок, види колоидно-
осмотски притисок на кислородот, 22, 181, 190-191,
204
опијати, 154, 159
пенести клетки, 75-76
оптимизирани методи, 152
пентозо-фосфатен циклус, 30, 34-35
оптичка интерференција, 6
пепсин, 96, 142
оптички тест, 151
перитонитис, 166
орален глукоза толеранс тест, види
оГТТ периферен васкуларен колапс, 185
органофосфати, 146, 180 пероксидаза
орнитин, 130 во состав на реагенси, 40-41, 46,
78, 80, 84, 86, 137, 217-220
осмоза, 187
структура и функција, 96, 118,
осмолалност, 184, 187-188 225
осмометрија, 187 перфорација на чир на желудник, 166
осмотска сила на крвната плазма, 183, пестициди, 146, 179-180
187
пиелонефритис, 175
осмотски притисок, 183, 187, 196
пикринска киселина, 23, 132-134
остеобласти, 147, 175
пиранози, 27-28
остеокалцин, 225
пирогалол црвено, 116
остеокласти, 179
плацента, 64, 175
остеомалација, 175
плунка, 5, 33, 142, 166, 168
плунковни жлезди, 147, 149, 166
П
повраќање, 99, 199
Пагетова болест, 175, 179
подагра, види гихт
палмитинска киселина, 57-59, 66
полуацетална хидроксилна група, 27,
панкреатектомија, 54, 220 30-31
панкреатит, 74, 114, 147, 154, 159, 166, портална циркулација (портален
178 крвоток), 33, 63, 96
парализа, 185 порфирија, 39
парапротеини, види моноклонални порфирински хромопротеиди, 96, 118
имуноглобулини
прва утринска урина, 4-5, 53
паратхормон (паратироиден хормон),
94, 193-194, 196 прееклампсија, 114, 136
прекумерна телесна тежина, 32, 56, 73
прогестерон, 64, 224
243
пролактин, 225 рибозоми, 54, 70
проламини, 95 рифампен, 124
пропионил КоА, 65
простата специфичен антиген (PSA), С
179, 225
салива, види плунка
протеиноиди, 95
салицилат, 127, 154, 159
протеинска грешка на индикаторот, 115
сахароза, 30-33, 141
протеинурија, 53-54, 98, 111, 113-114
седимент, уринарен, 5, 20, 114, 116-117
протеолитички ензими, 33, 54, 96, 135
седиментација на еритроцитите, 3-4,
протопорфирин, 207 10, 22-23
псевдохипокалцемија, 194 секреција во бубрежните тубули, 126,
130-131, 136, 190
птијалин, види α-амилаза
секундарна адренална
пулмонална емболија, 154 инсуфициенција, 216
пушење, 9, 21, 23, 48 синдром на полицистични јајници, 55
сипаници, 38
Р сифилис, 110
рабдомиолиза, 114, 163, 197 слепа проба за примерокот (sample
ранг на мерење, 106-107, 224 blank), 101, 103, 123, 196, 198
раса, 21-22, 132 слободни лесни синџири, 99
рахитис, 175 соматотропен хормон, 35, 37
реапсорпција во бубрежните тубули, 46, социјална состојба, 136

113-114, 126, 184, 190, 194, 196 специфична тежина на урината, 188
ревматоиден артрит, 110-111 српеста анемија, 110
ревматски фактор, 110 срцева слабост, 114, 127, 194
реконвалесценти, 98 срцева спроводливост, 185
релативна центрифугална сила, 3, 20 срцеви аритмии, 199, 207
ремнанти, 69-70, 74-75 стандардна крива, 106
ренатурација, 96 стеаринска киселина, 57, 59
ренин, 184 стенокардија, 154, 163, 172
ретикулоендотелни клетки, 118-120 степен на чистота на водата, 5, 21
ретикулоцити, 207 стеран, 62
рефлексивна фотометрија, 45 стеркобилин, 119
рибоза, 29-30, 135 стеркобилиноген, 119
рибозими, 141 стероиди, 35, 39, 48, 56, 62-64, 71, 215
244
студ, 114 транскетолаза, 35
субендотелен простор, 68, 75-76 транскортин, 215
сукцинилхолин, 180 транспортер на двовалентни метални
јони 1, 202, 205
сулфатиди, 61
трансферин, 96, 110, 202-208, 210, 212
сулфонамиди, 125
трансфузија, 207
сулфосалицилна киселина, 115
траума, 2, 48, 98, 110, 112, 126
сфингозин, 60-61
тремор, 184
сфингомиелин, 61
триглицериди (триацилглицероли)
влијание на различни фактори,
Т 22, 23
таласемија, 110 за пресметување на LDL-
Тангиерова болест, 74 холестерол, 88-89
тартарат, 100, 179 определување, 77, 80-81
таурин, 63 преаналитички аспекти, 2, 6
тахикардија, 185 хемиска структура и

метаболизам, 25, 32, 34-36, 56-
температурен коефициент, 144 57, 59, 64-70, 73, 75
теорија на урамнотежена состојба, 150 тријодтиронин, 225
терапија со кислород, 191 трипептидази, 96
тестостерон, 64, 225 трипсин, 96, 142
тетании, 193-194, 197, 199 тропонини, 163, 178
тетрабромфенол сино, 115 трпнење, 185
тетрапиролски синџир, 118
тетрапиролски прстен, 118 У
тиохолин, 179 ултрацентрифугирање, 67, 89
тип III хиперлипопротеинемија, види улцерозен колит, 99
дисбеталипопротеинемија
урати, види мочна киселина
тип V хиперлипопротеинемија, 74
уреа
тиреостимулирачки хормон, 225
тироглобулин, 225 22, 23
тироксин, 33, 35, 37, 225 за пресметување на
осмолалност, 188
тироксин-бајндинг глобулин, 225
како деградационен продукт, 97,
трансалдолаза, 35
118, 126-127
трансаминази, види аланин
аминотрансфераза и аспартат
аминотрансфераза преаналитички аспекти, 40
245
уреаза, 127, 141 фосфор
уремија, 126 влијание на различни фактори,
22-24
уридин дифосфат
глукуронилтрансфераза, 120 како макроелемент, 181-182,
196-197
уриказа, 137
определување, 175, 197-198
уриколиза, 135
преаналитички аспекти, 12
уробилин, 119
фрактура, 175
уробилиноген, 46, 119, 125
фруктоза, 27, 29-31, 33
фруктозамин, 53
Ф
фуранози, 27
фамилијарен дефект на апо В-100, 74
фамилијарна комбинирана
хиперлипидемија, 74 Х
фамилијарна хипертриглицеридемија, хаптоглобин, 110
74
хексокиназа, 40, 43-44, 163-164
фамилијарна хиперхолестеролемија, 74
хем оксигеназа, 118, 203
Фелингова проба, 28
хематин, 51
феморални артерии, 74
хематолошки заболувања, 136, 172
фенобарбитал, види барбитурати
хемилуминисцентен супстрат, 222-224
феохромоцитом, 37
хемиски преглед на урина, 5, 46-47, 53,
фери оксихидроксид, 202 116-117
феритин, 96, 202-207, 212, 225 хемоглобин А1ц, види HbA1c
ферозин, 208 хемоглобин (интерференции не се
вклучени), 21-23, 50-52, 90, 96, 110, 118,
феропортин, 202-203, 205 189, 202-203, 207-208, 212
фибриноген, 3, 98-99, 112-113 хемоглобинурија, 114
фибринолиза, 68, 112 хемоконцентрација, 22
флавин дехидрогенази, 96 хемолизат, 5, 51-52
флавопротеиди, 96 хемолитичка анемија, 51, 110, 119, 154,
флеботомија, 11-12 172
фоликулостимулирачки хормон, 224 хемолитичка болест кај

новороденчињата, 121
фолна киселина, види витамини
хемосидерин, 202-203
фосфатидил холин, види лецитин
хемосидероза, 207-208
фосфатидна киселина, 60
хемохроматоза, 207-208, 210
фосфоволфрамова киселина, 82, 137
хенодезоксихолна киселина, 63
фосфопротеини, 95, 196
246
хепатит, 89, 110, 208 хипонатремија, 184
агресивен хроничен, 169, 172 хипопротеинемија, 99, 194
акутен вирусен, 147, 154, 158, хипотиреоза, 33, 73, 163
169, 172
хипоурикемија, 136
идиопатски неонатален, 121
хипофосфатемија, 197
перзистирачки хроничен, 154,
159, 169, 172 хипохлорит, 127, 129
токсичен, 154, 159, 172 хипохромна анемија, 206
хепцидин, 202, 205 хистамин, 97
хефестин, 203, 205 хистидин, 92, 97
хидроксиапатит, 193 хистидин декарбоксилаза, 97
хидролази, 141-142 хистокомпатибилен комплекс, 111
хиломикрони, 6, 64, 67-69, 73, 74, 76, хистони, 95-96

82, 84, 86, 89 хлорпромазин, 124
химотрипсин, 96, 141 холестаза, 73
хиперапобеталипопротеинемија, 74 холестерол
хипербилирубинемија, 119-121 HDL-холестерол, 20, 71, 74-75,
хипергликемија, 37-38 77, 82-86
хиперкалемија, 185 LDL-холестерол, 70, 74-75, 77,

86-89
хиперкалцемија, 194
вкупен холестерол, 73, 75, 77-79
хиперкалциурија, 194
хипермагнеземија, 199 22-23
хипернатремија, 184 естерифициран, 66
хиперпротеинемија, 99 метаболизам и функции во
организмот, 56, 62-65, 68
хипертензија, 114
холестерол естераза, 78, 84, 86
хипертиреоза, 37
холестерол оксидаза, 78, 84, 86
хиперурикемија, 136
холецистит, 178
хиперфосфатемија, 194, 197
холинестераза, 146, 179-180
хиперхиломикронемија, 73, 74
холна киселина, 63
хипоалфалипопротеинемија, 74
хомоцистеин, 225
хипогликемија, 37, 39, 49, 55
хромазурол Б, 208
хипокалемија, 185
хроматографски методи, 50-52, 122,
хипокалцемија, 39, 194, 197 137
хипоксантин, 135 хромопротеиди, 50, 96, 118
хипомагнеземија, 199
247
хронична бубрежна болест, 131, 175, циркадијален ритам, 2, 21-22, 210, 215
194, 199
цироза, 89, 110, 154, 159, 169, 172, 207-
208
Ц цистатин Ц, 111, 132
цвитер јон, 91 цистична фиброза, 187
целулоза, 32-33 цитохром Б, 203
церамид, 61 цитохроми, 96, 118, 203
цереброзиди, 61 Ц-пептид, 54-55, 220-221, 225
цереброспинална течност, 5, 43, 116, Ц-реактивен протеин, види CRP
187
церулоплазмин, 96, 111, 205
Ш
цетилтриметиламониум бромид, 208
шеќерна болест, 25, 33, 36-39, 45-46,
циклопентаноперхидрофенантрен, види 48-50, 52-54, 70, 73, 99, 199, 207, 220,
стеран 225
циклус на лимонска киселина, 35-37, 65 шок, 37
248
БИОГРАФСКИ ПОДАТОЦИ
Татјана Рушковска е родена во 1967 год. во Штип. Основното

и средното образование ги завршува во Берово. Во 1990 год.
дипломира на Природно-математичкиот факултет при
Универзитетот „Св. Кирил и Методиј“ во Скопје, група
биологија, биохемиско-физиолошка насока, како студент со
највисок среден успех во генерацијата.
Од 1994 до 2010 година работи во Централната клиничка
лабораторија во Воената болница во Скопје, најпрвин како
биохемичар, а потоа и како Началник на лабораторијата (2003-
2010 год.). Во меѓувреме ги завршува магистерските (1997
год.) и докторските (2002 год.) студии на Природно-
математичкиот факултет при Универзитетот „Св. Кирил и
Методиј“ во Скопје.
Во 2009 год. Татјана Рушковска е избрана за насловен доцент на Факултетот за
медицински науки при Универзитетот „Гоце Делчев“ во Штип. Од 2010 год. е редовно
вработена на Факултетот за медицински науки при Универзитетот „Гоце Делчев“ во
Штип, најпрвин како доцент, а потоа и како професор. Во периодот 2011-2014 год. ја
извршува функцијата Продекан на Факултетот за медицински науки. Во учебната
2014/15 год. работи како визитинг професор на Одделот за биохемија, молекуларна
биологија и биофизика на Универзитетот на Минесота, САД, како Фулбрајт стипендист.
Во моментов ја извршува функцијата Претседател на Наставно-научниот совет на
Школата за докторски студии на Факултетот за медицински науки при Универзитетот
„Гоце Делчев“ во Штип.
Татјана Рушковска учествува во бројни меѓународни и универзитетски научно-
истражувачки проекти. Автор е на поголем број научни публикации од областа на
биохемијата и клиничката биохемија, објавени во реномирани меѓународни научни
списанија, од кои најголемиот дел се слободно достапни на базата PubMed.
Рецензирала поголем број научни трудови за едни од најреномираните научни
списанија од областа на биохемијата и клиничката биохемија, како што се: Frontiers,
PlosOne, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Antioxidants and Redox Signaling,
Free Radical Research и др.
Активно учествува во работата на Универзитетските тела и континуирано се залага за
унапредување на образовниот процес и научно-истражувачките капацитети на
Универзитетот.
ISBN (xxx – xxx)

Клиничка биохемија

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Клиничка биохемија

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ТАТЈАНА РУШКОВСКА

Лектор: проф. д-р Толе Белчев

Оригинални фотографии: Коста Замановски

Илустрации и дизајн на корици: Вебмастер, Охрид

Техничко уредување: Татјана Рушковска

Издавач: Универзитет „Гоце Делчев” - Штип

Објавено во е-библиотека: https://e-lib.ugd.edu.mk

CIP - Каталогизација во публикација

Начин на пристап (URL): https://e-lib.ugd.edu.mk/804. - Текст во PDF

а) Клиничка биохемија - Високошколски учебници

проф. д-р Татјана Рушковска

Учебникот „Клиничка биохемија“ почнав да го создавам во сега веќе далечната 2009

1. ВОВЕД ВО КЛИНИЧКАТА БИОХЕМИЈА................................................................................................ 1

1.1. Дефиниција на клиничката биохемија

Биохемијата e природна наука што го проучува хемискиот состав на живите

Биохемијата може да се подели во две главни области:

Според дефиницијата која е дадена од страна на Интернационалната федерација за

1.2. Фази во работниот процес во клиничко-биохемиската лабораторија

Со цел да се добијат точни лабораториски резултати, во поранешните години

Како што е кажано погоре, преаналитичката фаза ги опфаќа процесите на

Клиничко-биохемиските параметри најчесто се определуваат во примероци од

По земањето на крв следува обработка на примероците, која зависи од типот

Епруветите со антикоагуланс веднаш по земањето на крв благо се

Во широка употреба се следните антикоагуланси: етилендиаминтетраоцетна

За клиничко-биохемиски анализи можат да се користат и различни видови

Освен крв и урина, во клиничко-биохемиските лаборатории може да се

1.2.2. Аналитичка фаза

Аналитичката фаза ги опфаќа самите лабораториски испитувања, односно

1.2.3. Постаналитичка фаза

Во постаналитичката фаза се врши проверка и издавање на резултатите.

Хемолизата е значаен фактор кој влијае врз точноста на резултатите. За неа

Липемична плазма или серум – се среќава кај пациенти со висока концентрација

Иктерична плазма или серум – се среќава кај пациенти со висока концентрација

На крај, особено важен сегмент од работата во клиничко-биохемиската лабораторија е

1.3. Основни мерки за заштита при работа во хемиска лабораторија и во

Постојат низа опасности кои се присутни при работа во хемиските лаборатории и во

Основни правила за работа во лабораторија:

При дефинирањето на улогата и значењето на клиничката биохемија беше

Доколку се практикуваат сите препорачани мерки на претпазливост,

Медицинскиот отпад се дефинира како единствена форма на течен и цврст отпад

Слика 1.3. Симбол за инфективен материјал

Точноста на резултатите од лабораториските испитувања зависи не само

Табела 1.1. Најчесто користени епрувети за земање на крв во рутинските

Европски код за Американски код за

Освен тоа постојат и епрувети за специјална намена, како што се епрувети за

Слика 1.4. Затворен систем за земање на крв со вакуум

Слика 1.5. Затворен систем со двојна можност: вакуум и рачна аспирација

Процесот на земање на крв за анализа се означува како флеботомија, а

Над местото на венепункција се врзува подврска (езмарх). Кога крвта ќе почне

Техниката на венепункција се совладува преку практична обука која секогаш

Капиларна крв се зема од:

На Слика 1.6. е прикажано во кој дел треба да се направи убодот.

Местото на убодот најпрвин треба да се дезинфицира. Откако дезинфициенсот

При слаба периферна циркулација местото на убодот не треба да се масира,

Пипеторите се употребуваат за пренесување на точно одмерен волумен на

Слика 1.7. Приказ на микропипетори, мултиканален и едноканален

Пипеторите работат на принцип на истиснување на воздух. За работа со

а) Дисплеј на пипетор б) Подесување на волумен

Слика 1.8. Приказ на дисплеј на пипетор и подесување на волумен за пипетирање

1.6.1. Техники на пипетирање

Копчето за пипетирање секогаш се притиска и отпушта бавно, а особено кога

Основната техника на пипетирање се одвива по следниот редослед:

Основната техника на пипетирање е прикажана на Слика 1.9.

Слика 1.9. Основна техника на пипетирање