Факултет за

Медицински
Науки

Практикум по Имунологија
СОДРЖИНА:

ВЕЖБА БР. 1, КЛЕТКИ ВО ИМУНИОТ СИСТЕМ ................................... 2

ВЕЖБА БР. 2, СЕПАРАЦИЈА НА ЛИМФОЦИТИ И МОНОЦИТИ

ОД ПЕРИФЕРНАТА КРВ............................................................................................... 12

ВЕЖБА БР. 3, АНТИГЕНИ ......................................................................................... 18

ВЕЖБА БР. 4, ОБРАБОТКА И ПРЕЗЕНТАЦИЈА НА АНТИГЕНИ

24
ВЕЖБА БР. 5, ЛИМФОИДНИ ОРГАНИ .........................................................30

ВЕЖБА.БР. 6, ИМУНОГЛОБУЛИНИ‐АНТИТЕЛА ............................. 41

ВЕЖБА.БР. 7, МЕТОДИ ЗА ДОБИВАЊЕ НА МОНОКЛОНСКИ

АНТИТЕЛА................................................................................................................................ 53

ВЕЖБА.БР. 8, ИМУНОХЕМИСКИ И ИМУН‐ФИЗИЧКИ‐

ХЕМИСКИ МЕТОДИ ......................................................................................................... 66

ВЕЖБА.БР. 9, ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЈА ..............................................69

ВЕЖБА.БР. 10, ЕЛИСА (ELISA‐ Еnzyme Linked

Immunosorbent Assay) ............................................................................................... 74

ВЕЖБА.БР. 11, ЕЛИСПОТ (Enzyme Linked Immunospot

Technique‐ELISPOT) ...................................................................................................... 80

ВЕЖБА.БР. 12, ВЕСТЕРН БЛОТ (Western blot) ............................... 85

ВЕЖБА.БР. 13, ФЛОЦИТОМЕТРИЈА (ПРОТОЧНА

ЦИТОМЕТРИЈА .................................................................................................................... 89

1
 ВЕЖБА БР.1

КЛЕТКИ ВО ИМУНИОТ СИСТЕМ

Клетките кои учевствуваат во имуната реакција настануваат од

плурипотентна хематопоетска клетка- матична во процес на хематопоезата
која започнува во ембрионалното жолчно кесе се до третиот месец од
гестацијата, потоа продолжува во црниот дроб и слезината до седмиот месец.
По седмиот месец коскената срж станува главен орган за диференцирање на
клетките. Рано во процесот на хематопоезата (Фиг. 1) плурипотентната клетка
се диференцира во една од двете можни насоки на диференцијација:

 лимфоидна клетка-лимфопоеза при што настануваат лимфоцитите.

 миелоидна клетка-миелопоеза при што настануваат фагоцитите и
медијаторските (акцесорни) клетки.
 презентирачките клетки- кои настануваат преку двете насоки на
диференцијација.

Лимфоидни клетки (lymphoid cells) е назив со кој се опфакаат сите развојни

стадиуми на лимфоцитите. Тие се носители на здобиениот специфичен
имунитет.

Лимфоцити:

 Т-лимфоцити
а) Тх1-помагачки лимфоцити (хелпер) кои ги потикнуваат останатите Б-
лимфоцити или Т-лимфоцити на реакција против противгенот.

б) Тх2-помагачки лимфоцити кои после препознаваwе на противгенот ги

активираат макрофагите.

в) Тс-цитотоксични лимфоцити кои се главни посредници во клеточниот

имунитет.

 Б-лимфоцити- носители на хуморален имунитет

Б-лимфоцит —> плазма клетка —> противтело

2
  О-нула лимфоцити- носители на вродениот имун систем

Миелоидна клетка- миелопоеза при што настануваат фагоцитите и

медијаторските (акцесорни) клетки.

Фагоцити- моноцити, макрофаги, неутрофили, еозинофили. (Фиг.2)

Фигура 1. Хематопоеза

3
Фигура 3. Лимфоцит, моноцит, моноцити неутрофил,
еозинофил, базофил

Б-Лимфоцити

Овие клетки името го добиле по местото на нивното созревање Бурза Фабриции

кај птиците, а кај човекот тоа е коскената срж. Зрелите Б-лимфоцити
се разликуваат од другите по нивната синтеза на мемрански имуноглобулински
молекули (антитело), кои имаат улога на рецептори за антигени. Интеракцијата
помегу антигенот и антителото врзани за зрелите Б-лимфицити доведува до
нивна диференцијација и делба која трае 4-5 дена создавајки плазма и мемори
клетки. Плазма клетките понатаму ги синтетизираат петте класи на
имуноглобулини (антитела) и се главни клетки на
специфичниот хуморален имунитет.

Т-Лимфоцити

Името на овие клетки доага од местото на нивното созревање во тимусот. И

овие клетки имаат рецептори на мембраната за антигените. Овој рецептор, Т
4
клеточен рецептор за разлика од имуноглобулинскиот на Б-лимфоцитот не го
препознава антигенот кога тој е слободен. Го препознава кога антигенот е
врзан за одредена класа на MHC молекулите кои ги има на антиген
презентирачките клетки, на клетките инфицирани со вирус и на туморски
клетки. Т-клеточниот имун систем се развил со цел да се елиминираат
сопствените променети клетки заразени од вирус или туморските кои
претставуваат опасност за нормалното функционирање на организмот. Овие
клетки ги има најмногу во тимусот, лимфните јазли, крвта и лимфата.

Т-лимфоцит кој има на својата мембрана ЦД 4 молекула го препознава антигенот

врзан со класа II MHC молекулите и овие Т-клетки се помошнички (Т-хелпер
клетки). Оние кои имаат ЦД 8 го препознаваат антигенот врзан со класа I MHC
молекулите и овие Т-клетки се цитотоксичните. Односот мегу овие два типа на
клетки кај здрави индивидуи во периферна крв е ЦД 4: ЦД8= 2:1.

Т-помошничките клетки секретираат материи -цитокини кои понатаму ги

активираат Б-клетките и им помагаат во создавањето на антителата, ги
помагаат и макрофагите и го појачуваат воспалението.

Т-цитотоксичните секретираат мала количина на цитокини, наместо тоа имаат

улога да ги препознаваат сопствените клетки инфицирани со вирус и
туморските клетки и да ги уни{тат и се главни клетки на специфичниот
клеточен имунитет.

Природни клетки убијци

За разлика од претходните две групи овие клетки немаат рецептори па со тоа ни

можност за специфично препознавање на антигенот. Се создаваат и созреваат
во коскената срж. Околу 70-95% од овие клетки имаат морфолошки изглед на
големи гранулирани лимфоцити. Главна функција им е убивање на клетките и
тоа го прават на два начини. Едниот се вика цитотоксичност зависна од
антитела што значи тие со помош на цитокини ја убиваат секоја клетка
обложена со антитела. Другиот начин е директно убивање на клетката -
природна активност на убивање (natural killer cell activity-НК
активност). Овие лимфоцити ги има најмногу во крвта и слезината.
5
Фагоцитни клетки

Мононуклеарниот фагоцитен систем го сочинуваат моноцити кои

циркулираат во крвта и макрофаги во ткивата. Фагоцитните клетки се првите
клетки кои доагаат во контакт со микроорганизмите и тугите материи кога ке
навлезат во организмот. Со процесот на фагоцитоза и ензимска разградба
успеваат да ги отстранат микроорганизмите а притоа да не биде активиран
специфичниот имунитет. Оваа активност на фагоцитите претставува главен
механизам кај неспецифичната имунолошка одбрана на организмот.
Макрофагите имаат различни функции во разни ткива, а името им потекнува
од ткивото во кое се лоцирани:

 алвеоларни макрофаги во бели дробови

 хистиоцити во сврзно ткиво
 Купферови клетки во црн дроб
 макроглиа клетки во мозок
 остеокласти во коски
Иако нормално се наогаат во состојба на мирување, во тек на имунолошкиот
одговор макрофагите се активираат со бројни стимулуси. Покрај овие клетки
во оваа група се и неутрофилните леукоцити и др. клетки
полиморфонуклеарниот фагоцитен систем. Сите фагоцити се создаваат во
коскената срж.

Фагоцитите се способни за ингестија (фагоцитоза) на егзогени антигени како што

се цели микроорганизми но и на ендогени делови од оштетени или мртви клетки
на домакинот. Нивната фагоцитна улога е овозможена со нивната способност на
движење. Исто така, oвие клетки имаат рецептори за Fc делот од
имуноглобулинот и за комплементот па тоа им овозможува препознавање и
фагоцитоза на антигенот кој е обложен со антитела. Оваа појава се нарекува
олеснета или имунолошка фагоцитоза. Фагоцитозата не е единствената улога на
овие клетки. Тие ослободуваат и хидролитички ензими, цитотоксични материи со
кои можат да ги убијат клетките и да го појачат процесот на воспаление. Овие
клетки се вклучени во неспецифичниот (вроден)
имунитет и во специфичниот (стекнат) имунитет. Нивната улога во
специфичниот имунитет e да делуваат како aнтиген-презентирачки клетки за Т-

6
лимфоцитите и во убивање на клетките обложени со антитела
цитотоксичност на клетки зависна од противтела. Kaj вродениот
имунитет, тие се потпомогнати од Т-помошничките лимфоцити кои лачат
лимфокини и со тоа им ја појачуваат фагоцитната способност да ги
уништуваат патогените.

Гранулоцитни клетки

Гранулоцитите се класифицирани како (сл.3):

 неутрофили: 40-75% од циркулирачките леукоцити

 еозинофили: 1-6%
 базофили:< 1%
Неутрофилни леукоцити-се фагоцитни клетки кои ги има најмногу во
крвта. Се создаваат во коскена срж и таму дозреваат, па влегуваат
потполно зрели во крвта и немаат понатаму способност да се делат. Во
крвта живеат кратко, помалку од еден ден, а во ткивата 4-5 дена. Главна
функција им е фагоцитозата, имаат и рецептори за Fc делот од
имуноглобулините и за комплементот така да учествуваат во олеснета
фагоцитоза. При инфекција и kако одговор на неа, коскената срж
продуцира поголем број на неутрофили од вообичаено и тие се првите
клетки што стигнуваат на местото на воспаление. Ова резултира со
транзиторно зголемување на бројот на неутрофили во крвта-леукоцитоза.
Појавата на леукоцитоза во медицината е индикација за инфекција.

Еозинофилни леукоцити-како и претходните клетки и тие се фагоцитни

клетки. Во крвта живеат неколку часа потоа преогаат во ткивата.
Способноста за фагоцитоза е послаба од неутрофилите. Особено важно е
тоа што ги фагоцитираат слободните комплекси од антиген-антитело со
што ги отстрануваат од организмот. Нивниот број се зголемува кај
алергиски болести, каде тие имаат улога да ја намалат воспалителната
реакција. За нив се смета дека играат улога во одбрана од паразити.

7
Базофилни леукоцити-се нефагоцитирачки клетки чија улога е
ослободување на фармаколошки активни материи кои играат улога во
алергиски реакции.

Фигура 3. Сликата прикажува типична морфологија на гранулоцит.

Забележете ги разликите во формата на јадрото и во бројот и формата на
цитолпазматските гранули.

8
Антиген-презентирачки клетки

Овие клетки имаат за задача на своите мембрани да го прикажат

антигенот заедно со MHC системот. При тоа овие клетки го впиваат
надворешниот (егзоген) антиген во клетката, го разградуваат на мали
пептиди, кои се врзуваат за молекулите од класа II на MHC и потоа се
пренесуваат на површината. Вирусните и сопствените протеини (ендоген)
ги разградуваат и ги прикажуваат на површината заедно со класа I
молекулите од MHC. Овие клетки се наогаат во кожата, лимфните јазли,
слезината, тимусот, а понекогаш крвта и лмфата и тоа на стратешките
места каде влегува антигенот. Постојат два типа на вакви клетки:

-дендритични клетки

-макрофаги

Дендритични клетки -се најспособни за прикажување на антигенот.

Потекнуваат од миелоидна клетка во коскената срж Го добиле името по
тоа што се покриени со долги мембрански продолжетоци (дендрит-гранка).
Според нивната локација се делат на:

- Лангерхансови во епидермот на кожата и мукозните мембрани

- Интердигитални дендритични клетки во Т-клеточните региони на
секундарните лимфоидни органи
- Интестициални дендритични клетки во срце, црн дроб, бели дробови,
бубрези
На површината имаат изразено високи нивоа на MHC молекули. Од овие
причини тие се помошни во прикажување на антигенот од макрофагите и
Б-лимфоцитите кои пак треба да бидат активирани пред да
функционираат како антиген презентирачки клетки. Дендритичните клетки
се важни во прикажување на вирусни и клеточни токсини кои во клетката
влегуваат без фагоцитоза се преработуваат и се прикажуваат на
површина со класа I MHC молекулите.

Посебна врста на дендрити~ните клетки се фоликуларните клетки кои

имаат различно потекло и функција од другите. Тие немаат класа II MHC

9
 молекули и се локализирани во лимфните јазли на места богати со Б-
лимфоцити. На својата мембрана имаат рецептори за антитела и
комплемент. Преку нив го врзуваат антиген-антитело комплексот и на тој
начин ги активираат Б-лимфоцитите.

Макрофаги- се нарекуваат уште и чистачи во организмот бидејки ги

отстрануваат мртвите и остарени клетки. Во најголем број на случаи овие
клетки ги фагоцитираат и убиваат микроорганизмите без да го активираат
специфичниот имунитет. Такви се Купферовите клетки во црниот дроб кои
ги немаат класа II MHC молекулите на мембраните. Но сепак постојат и
клетки кај кои после внес на антигенот се стимулира синтеза на овие MHC
молекули за прикажување на антигенот.

Дендритичните клетки и макрофагите се професионални антиген-

презентирачки клетки што значи дека презентацијата на антигени е нивна
главна улога. Освен нив, Б клетките имаат ограничена способност да
презентираат антигени.

Б-Лимфоцити-претходните две групи на антиген презентирачки клетки не

можат да ги прикажуваат растворливите антигени на своите мембрани. Се
верува дека таквите антигени на Т-лимфоцитите им ги прикажуваат токму
Б-лимфоцитите, кои го врзуваат антигенот за својот имуноглобулински
рецептор. Ваквиот антиген внатре во клетката се разградува и се
прикажува заедно со класа II MHC молекулите на површината на Б-
лимфоцитот. Така ке биде препознаен од Т-помошничките лимфоцити, а
тие пак од своја страна ги помагаат и потикнуваат Б-лимфоцитите да
создаваат антитела. Во растворливи антигени спагаат: токсините при убод
од инсекти, змијскиот отров, алергените и др.

На крај , во одредени ситуации на јако воспаление и присуство на дадени

цитокини, сите клетки се здобиваат со моќ да презентираат антигени.

Акцесорни-медијаторски клетки

Овие клетки учествуваат во имуната реакција така што излачуваат хемиски

материи (медијатори). Со овие материи се појачува имуниот одговор но при
тоа често доага и до оштетување на ткивото. Овие медијатори доведуваат
10
до појачување на воспалението, односно при акутна воспалителна
реакција предизвикуваат промена на тонусот на мускулатурата
(бронхоспазам, вазодилатација) и зголемена пропустливост на крвните
садови, како и привлекуваат неутрофилни леукоцити на местото на
воспаление. Мегу медијаторските клетки спагаат:

-базофилните леукоцити

-мастоцитите

-тромбоцитите

За базофилите и мастоцитите се знае дека се клетки кои содржат

гранули со хистамин, простагландини и др. При анафилактична реакција
доага до дегранулација на овие клетки и ослободување на овие
медијатори кои што и доведуваат до оштетување на ткивото.
Дегранулацијата настанува на следниот начин;

Овие клетки имаат мембрански рецептори за Fc делот од Иг Е антителото.

На тој рецептор ке се врзат слободните ИгЕ антитела. Дегранулација ке
настане од како за нив ке се врзе и антигенот.

Тромбоцитите се создаваат во коскена срж од мегакариоцитите. Нивната

улога е во хемостазата, но играат улога и во имунолошката реакција преку
излачување на материи како што се хистамин и серотонин.

11
 ВЕЖБА БР.2

СЕПАРАЦИЈА НА ЛИМФОЦИТИ И МОНОЦИТИ ОД

ПЕРИФЕРНАТА КРВ

Со помош на центрифугирање или градиенти со различна густина, како и со

користење на својството на различна атхеренција, клетките од крвта
(лимфоцити, моноцити, тромбоцити) може да се издвојат едни од други.
Денес постојат сложени и современи методи еден од нив е сепарација на
клетки со моноклонални противтела.

Лимфоцитите се одделуваат од другите клетки од периферна крв со методот

на центрифугирање со помош на градиент фикол-триозил. Фиколот е
полисахарид, во него се додава натриум метриозат (триозил) за да се
зголеми неговта густина. Тој има густина од 1.077, а лимфоцитите имаат
помала густина и ке останат над него, додека другите клетки одат, патуваат
на дното. После изведување на целокупната постапка со пастерова пипета се
издвојуваат внимателно лимфоцитите. Така добиената суспензија од клетки
понатаму подлегнува на броење на клетките во посебна комора т.н
Нојбауерова комора за броеwе клетки. Треба да се напомене овде се работи
со живи клетки, тие остануваат живи ако се чуваат на О°С (во мраз и вода).
Општо земено лимфоцитите не издржуваат живи во ладилник оставени преку
ноќ, затоа треба бргу да се приготват и употребат.

Изолирање на мононуклеарни клетки од периферна крв

1. Се пипетира крв од епрувата и се става во туба од 50 милилитри

2. Пипетирај 10 мл од PBS (сол-фосфатен пуфер – содржи натриум
хлорид и натриум фосфат, изотоничен раствор кој се користи да ја
одржи константна PH вредноста) и додади го во истите 50 мл туби во
кои има крв
3. Сега имате добиено 1:1 раствор на крв со PBS.( сол-фосфатен пуфер)
4. Подложи го ова внимателно со 10 мл Lymphocyte Separation Media
(LSM), [лимфоцитен медиум стерилен, изоосмотски раствор, содржи
полисахарид и диатризоат со ниска вискозност, дизајниран за ин витро
изолација на лимфоцити од разредена крв]
5. Центрифугирај на 1800 вртежи во минута, за време од 25 минути, без
употреба на кочница.

12
 Фигура 4. Од лево е прикажана 50 мл туба со лимфоцитен медиум, во
средината туба на која е додадена крвта и од десно раздвоениот слој
на лимфоцити (бела стрелка)

6. Добиените слоеви од врвот спрема дното се: плазма – тромбоцити -

мононуклеарни клетки од периферна крв – лимфоцитен медиум -
еритроцити (со гранулоцити)

13
 Фигура 5. Шематски приказ на процесот на изолација на лимфоцити од
крвта

7. Со маркер означи го слојот од мононуклеарни клетки од периферна крв

8. Испипетирај и исфрли ја поголемата количина од плазмата (испипетирај
два сантиметри над слојот од мононуклеарни клетки) (1inch=2,54cm)
9. Внимателно аспирирај го слојот од тромбоцити и леукоцити (buffy coat –
слојот од леукоцити и тромбицити после центрифугирањето) заедно со
мононуклеарните клетки од периферната крв и префрли ги во ново
цевче од 50 мл. Аспириран мал дел од плазмата не претставува
проблем, но внимавај при аспирирањето да се аспирира колку може
помалку од лимфоцитниот медиум.
10. Додади PBS (солено – фосфатен пуфер) на мононуклеарните клетки од
периферната крв до 50 мл. Центрифугирај на 1200 вртежи во минута за
време од 10 минути.
11. Издекантирај го супернатантот и додади 5 мл лизирачки (агенс, пуфер)
12. После точно 5 минути (ако е можно во водена бања на 37C ) дополни
со PBS (солено – фосфатен пуфер) и центрифугирај
13. Декантирај го супернатантот, додави PBS (солено – фосфатен пуфер) и
измешај добро.
14. Повторно центрифугирај
15. Испери со PBS (солено – фосфатен пуфер) уште еднаш
16. Исфрли го PBS (солено – фосфатен пуфер)
17. Додади 1 мл PBS (солено – фосфатен пуфер) на седиментираните
клетки
14
 18. Земи 90 мл Трипанско синило (Trypan blue - органска боја, хемиски
диазо боја – која се користи за селективно боење на мртви ткива или
клетки. Мембраните на живите клетки при контакт со оваа боја не се
бојат, а мртвите клекти се прикажуваат со какрактеристична плава боја
под микроскоп) и стави ја во киветата
19. Додади 10 мл од клеточната суспензија
20. Измешај добро и изброј ги клетките на хемоцитометар (направа за
броење на клетки), клетките обоени темно сино се мртви и не треба да
се бројат

Фигура 6. Нубауеров хемоцитометар (броењето се врши под микроскоп)

Фигура 7. Боењето се врши во пет полиња и се зема средната вредност.

Се бројат само клетките кои се наогаат на горната и десната граница и во
средината на полето. На оваа фигура клетките кои треба да се бројат се
покажани со ‘yes’ а тие што не треба со ‘no’ .

15
Figura 8. Клетки обоени со трипанско синило на хемоцитометар. Сините
клетки (стрелка) не се бојат бидејки се мртви

Мембраната на живата клетка не дозволува навлегување на боја во

внатрешноста и според оваа особина може да се разликуваат мртвите од
живи клетки. За ова намена може да се користат и други бои како што е еозин
и др. Така кога ке се бројат во комората клетките, мртвите ке бидат обоени
црвено (ако користиме еозин), додека живите лимфоцити се сјајни.

Зошто ни се важни овие испитувања како и многу други кои служат за

одредување на бројот на крвните клетки? Затоа што овие крвни елементи се
носители на имунитетот.

На следната табела (Табела 1) се дадени нормалните вредности на белите

крвни клетки, на вкупните лимфоцити, на Т-лимфоцитите (ЦД4 и ЦД8), на Б-
лимфоцитите и тромбоцитите.

16
ТЕСТ ВОЗРАСТ Нормални вредности

Бели крвни клетки (БК) < 12 месеци 6,4 -11 х 109/ Л

(леукоцити) 1-6 години 6,8 -10 х 109/ Л

> 6 години 4,0 -11 х 109/ Л

Неутрофили 2,0 -7,5 х 109/ Л 40-75%

БК

Еозинофили 0,4 -0,44 х 109/ Л 1-6% БК

Базофили 00,1-0,10 х 109/ Л 0-1%БК

Моноцити 0,2-0,8 х 109/ Л 1-10% БК

Вкупни лимфоцити <12 месеци 2,7-5,4 х 109/ Л

1-17 години 2,0-4,1 х 109/ Л 20-45% БК

>17 години 1,6-3,5 х 109/ Л

Т лимфоцити 1-6 години 2,7-5,3 х 109/ Л

7-17 години 2,0-2,7 х 109/ Л

>17 години 1,6-2,4 х 109/ Л

ЦД4 < 12 месеци 1,7-2,8 х 109/ Л

1-6 години 1,0-1,8 х 109/ Л

> 6 години 0,7-1,1 х 109/ Л

ЦД8 0-6 години 0,8-1,5 х 109/ Л

>6 години 0,5-0,9 х 109/ Л

Б лимфоцити 0-6 години 0,6-1,4 х 109/ Л

>6 години 0,2-0,5 х 109/ Л

Тромбоцити 150-400 х 109/ Л

Табела 1 Нормалните вредности на белите крвни клетки

17
 ВЕЖБА БР. 3

АНТИГЕНИ

Антигените се сложени молекули кои имунолшкиот систем ги препознава како

туги. Но секоја таква молекула нема секогаш да потикне имунолошка
реакција, па затоа треба да се разликува имуногеност од антигеност.
Имуногеност претставува способност да се поттикне хуморален и/или
клеточен имун одговор:

Имуноген (антиген) + Б-Ли → ефекторни Б-Ли + памтечки Б-Ли

Имуноген (антиген) + Т-Ли → ефекторни Т-Ли + памтечки Т-Ли

Антигеност е способност на една субстанца да иде препознаена како туѓа.

Неможе со сигурност да се каже за некоја материја дали има својство на

антигеност или имуногеност, бидејки како ке се однесува таа во организмот ке
зависи од :

 количината на внесениот антиген

 патот (начинот) на внесување
Ако пнеумококниот полисахарид кај човек се внесе поткожно ке доведе до
стварање на антитела, додека ако се внесе на друг начин нема да доведе до
имун одговор.

Соработката на Б и Т лимфоцитите е важна за да дојде до стварање на

антитела. Но некои антигени ги потикнуваат Б-клетките на пролиферација и
стварање на антитела без соработка на Т-лимфоцитите. Таквите антигени
се нарекуваат антигени независни од тимусот. Сите останати се нарекуваат
антигени зависни од тимусот.

18
Антителата и лимфоцитите најчесто не ја препознаваат целата антигенска
молекула, туку одреден дел од молекулата наречен антигенска детерминанта
или епитоп. Б-лимфоцитите препознаваат растворливи антигени па затоа
епитопите мора да бидат на површината на молекулата, бидејки само така може
рецепторот на Б- лимфоцитите да ги препознаат. Додека пак Т-помошничките
лимфоцити го препознаваат епитопот заедно со класа II молекулата од МХЦ
системот на површината на АПК-клетка, тоа значи таа клетка мора претходно да
го преработи тој антиген. Т-цитотоксичните клетки го препознаваат епитопот
заедно со класа I молекула од МХЦ и тоа на површина на сопствени но
променети клетки како што се заразени со вирус или туморски клетки. Постојат
антигени кои за МХЦ молекулите и рецепторот од Т-клетките се врзува директно
без претходна обработка внатре во клетката. Таквите антигени се викаат
суперантигени а ги создаваат бактериите и вируси.

Хаптени се мали молекули кои имаат способност за антигеност, но немаат

способност за имуногеност (не предизвикуваат имун одговор) тоа значи
реагираат со антитела, но сами не можат да го потикнат нивното создавање.
Хаптените создаваат антитела само ако се врзани со протеински носач.

ФАКТОРИ ОД КОИ ЗАВИСИ ИМУНОГЕНОСТА

Веке спомнавме дека со сигурност неможе да се каже за некоја материја дали

има својство на антигеност или имуногеност, бидејки како ке се однесува таа
во организмот ке зависи и од единката во која се внесува антигенот и од
самата антигенска молекула.

Овде ке бидат разгледани четирите својства на антигенот кои влијаат врз

имуногеноста:

 својство на туѓо- за да предизвика имун одговор молекулата треба да

биде препознаена како туѓа. Кога антигенот се презентира на организмот,
степенот на неговата имуногеност зависи од степенот на неговата туѓост
(непознатост). Колку е поголем степенот на непознатост дотолку е
молекулата поимуногена па и имунолошката реакција кон таа молекула ке
биде посилна. Имунолошкиот систем во принцип разликува

19
 свое од туѓо, па не реагира на сопствените делови од организмот. Но
постојат исклучоци, кога во одредени околности и сопствените делови
стануваат имуногенични при што настануваат автоимуни болести.
 молекуларна маса- за да некоја молекула биде имуногена нејзината
релативна молекуларна маса треба да е поголема од 10000. Оние со
помала маса се слабо имуногенични, што значи колку молекуларната
маса е поголема, имуногеноста на молекулата е поголема. Веке
спомнавме дека малите молекули (хаптени) сами по себе не се
имуногени, но ке бидат ако се врзат за носач.
 хемиски состав и хетерогеност- молекули со посложена градба се
повеке имуногенични од оние со едноставна градба. На пр: синтетички
хомополимери (полимери составени од една аминокиселина) и покрај
нивната големина не покажуваат имуногеност.
 достапноста на антигенот за обработка и презентација- за
развој на хуморалниот и клеточниот имун одговор потребна е
интеракција на Т-лимфоцитите со антигенот кој претходно е обработен
и презентиран заедно со МХЦ молекулите. Макромолекулите кои
неможат да бидат разградени и презентирани на тој начин се слабо
имуногени.
Покрај овие својства на антигенот кои влијаат на имуногеноста, способноста
дa предизвика имун одговор зависи и од одредени особини на организмот:

 генотип- генетската конституција на човекот го определува

видот на имуниот одговор кој што тој ке го манифестира, како и
јачината на одговорот.
 количината на антигенот и начинот по кој влегува во
организмот- секој експериментален имуноген има своја дозно-
зависна крива која се определува со мерењето на имуниот
одговор кон различни дози и различни начини на негово
внесување во организмот. Доколку дозата на антигенот е многу
мала нема да стимулира имун одговор бидејки нема да доведе
до активација на доволно лимфоцити. Спротивно многу големи
дози исто може да не доведат до појава на имун одговор т.е да
доведат до имунотолеранција.

20
  Експериментално имуногените најчесто се даваат: субкутано (под
кожа) интрадермално (во кожа), интрамускулно,
интраперитонеално (во перитонеална празнина). Од патот на
внесување на имуногенот зависи кои органи и клетки ке бидат
ангажирани во одговорот.
 адјуванти- (од лат. адјуваре да помага) се супстанции кои
помешани со антигенот или ињектирани заедно со него ја
засилуваат имуногеноста на тој антиген. Тие се користат со цел
да се засили имуниот одговор кога антигенот има мала
имуногеност или има на располагање мали дози од него.

ЕПИТОПИ

Како што веке спомнавме клетките не стапуваат во интеракција, ниту пак ја

препознаваат целата молекула на антигенот, наместо тоа лимфоцитите
препознаваат одредени места на молекулите наречени епитопи. Епитопи се
имунолошки активни региони на антигенот кои се врзуваат за антиген-
специфичните мембрански рецептори на лимфоцитите или за секретираните
антитела.

Особености на Б-клеточените епитопи- овој епитоп на антигенот се

врзува со молекулата на антителото на површината на Б-клетката.
Имунодоминантни епитопи се оние делови од антигенот кои предизвикуваат
посилен имун одговор.

Особености на Т-клеточените епитопи- постои разлика во препознавањето

на антигенот од Т и Б-лимфоцитите. Т-лимфоцитите препознаваат само
претходно обработен антиген во пептиди кој се презентира во комбинација со
МХЦ молекули. Антигените препознаени од Т-клетките мора да имаат две
различни места за интеракција: епитоп кој се врзува за Т-рецепторот и епитоп кој
стапува во интеракција со МХЦ молекулите. Неопходно е антигенот да е
обработен до пептиди кои ке стапат во интеракција со МХЦ молекулите. Веке
спомнавме дека егзогените и ендогените антигени се обработуваат на различни
начини и се презентираат со МХЦ молекулите на

21
површината на АПК-клетките или на сопствените променети клетки и така се
препознаени од Т-лимфоцитите.

ПРИРОДНИ АНТИГЕНИ

Мегу природните молекули, протеините се најдобри антигени, без разлика дали

се сами или во склоп на други соединенија (гликопротеини, липопротеини). И
полисахаридите мо`ат да бидат имуногени. Мегу нив припагаат полисахариди
изолирани од разни микроорганизми. За разлика од нив чисти липидите не се
имуногени, но може да бидат ако се споени со др соединенија.

ВЕШТАЧКИ АНТИГЕНИ

Во оваа група на антигени спагаат природните антигени кај кои хемиската

градба е променета со замена, преместување или додавање на одредени
групи.

СИНТЕТИЧКИ АНТИГЕНИ

Тоа се антигени во целост произведени во лабораторија.

22
 ВЕЖБА БР.4

ОБРАБОТКА И ПРЕЗЕНТАЦИЈА НА АНТИГЕНИ

Со внесување на антигенот во организмот се покренуваат низа физиолошки

процеси кои го отстрануваат тој антиген. Тие процеси може да ги
разгледуваме на молекуларно ниво (преработка на антиген), на клеточно
(реакција на разни лимфоидни клетки), органско ниво (хистолошки промени) и
на ниво на цел организам (генерализација на имуната реакција). Имуната
реакција може да се подели на :

 аферентен дел- опфака фагоцитоза и преработка на антигенот

 средишен дел- мегусебна реакција на имуните клетки
 еферентен дел- завршни механизми на отстранување на антигенот
Овие механизми ги има во двe форми: хуморален и клеточен.
Судбина на антигенот во организмот- антигенот влегува во организмот
на два начина: природен пат и вештачки пат. По природен пат најчесто
влегува низ слузниците, но може да влезе и низ кожата, плацентата или
директно во крвта. Преку вештачки пат ако директно го ињектираме во вена,
мускул, под кожа или да влезе преку хируршки операции кога пресадуваме
органи или ткива. Понатаму во телото антигенот се шири низ крвта или
лимфата. Ако се внесе преку вена се шири низ крвта, ако пак е внесен
поткожно се шири низ лимфата т.е прво оди во регионалниот лимфен јазол, а
потоа преку крвта оди во слезината каде ке биде отстранет. Додека оние
внесени преку мускул се шират истовремено низ крв и лимфата. Некои од
антигените бавно се отстрануваат што значи дека се слабо имуногени и
предизвикуваат имун одговор само при големи количини. Други пак антигени
се доста имуногени па затоа брзо ке бидат отстранети.

 Преработка на антигенот се однесува на модификација на

антигенските молекули после фагоцитозата. Изразот презентација
значи дека антигенот после обработката се појавува на површината на
антиген-презентирачката клетка во комплекс со молекулите на MHC.

23
 Ваквиот комплекс потоа го препознава Т-лимфоцитот. При тоа класа I
молекулите од MHC ги врзуваат пептидите кои успеале да навлезат во
цитоплазмата на клетката при што претходно биле обработени во
клетките. Toa se случува кога се работи за инфекција со интрацелуларни
патогени како што се вирусите, некои бактерии и паразити како и при
промена на протеините на самата клетка со процесот на малигна
трансформација. Комплексот од класа I молекулите заедно со пептидот кој
тие ке го презентираат на површината на таргет клетките ке биде
препознаен од ЦД8-цитоксичните Т лимфоцити.
 Класа II молекулите од MHC ги врзуваат пептидите кои потекнуваат од
егзогени антигени (надворешни) кои се внесени со фагоцитоза и se
понатаму обработени до пептиди. Kлетките кои имаат способност за да го
врзат антигенот со молекулите на MHC се наречени антиген-прикажувачки
и на површина го прикажуваат комплексот класа II MHC со пептидот кој ке
биде препознаен од ЦД4 Т-помошничките лимфоцити.
 Значи, интрацелуларните (ендогени) и екстрацелуларните (егзогени)
антигени се обработуваат и презентираат на два различни начина.
Интрацелуларните (ендогени) антигени се обработуваат по цитоcолен
пат, се презентираат со класа I MHC молекулите и најефикасно се
елиминираат со ЦД8-цитокси~ните Т лимфоцити.
 Екстрацелуларните (егзогени) антигени се обработуваат по ендоцитен
пат, се презентираат со класа II MHC молекулите и најефикасно се
елиминираат со антитела чие што лачење се стимулира со посредство
на ЦД4 Т хелпер клетки.

ЕНДОГЕНИ АНТИГЕНИ: ЦИТОСОЛЕН ПАТ

Овие антигени се сместуваат и размножуваат во цитоплазмата на клетката.

Типични вакви антигени се вирусните кoи се разградуваат до пептиди во
цитоплазмата на инфицираната клетка. Разградбата до пептиди ја врши
протеазом. Класа I MHC молекулите се создаваат во ендоплазматичниот
ретикулум на клетката. Спојувањето на пептидите со овие молекули се одвива со
помош на преносни молекули (ТАП-1 и ТАП-2) и калнексин. Овие преносни
молекули ги носат aнтигените до ендоплазматичниот ретикулум каде се
24
врзуваат со класа I MHC молекулите. Вака створениот комплекс од
антигенски пептид и класа I MHC молекулите оди до клеточнaта мембрана и
се презентира на Т-цитотокси~ните лимфоцити. И кога клетката не е заразена
со вирус или бактерии нејзините класа I MHC молекулите се наогаат на
мембраната кои можат да ги врзат и пептидите од сопствените протеини.
Така што MHC молекулите не разликуваат што е туго од сопствено туку со
помош на преносните молекули ги бараат пептидите кои им се
комплементарни за да ги врзат.

ЕГЗОГЕНИ АНТИГЕНИ: ЕНДОЦИТЕН ПАТ

Овие надворешни патогени (антигени) се внесуваат во АПК-клетката по пат

на ендоцитоза или фагоцитоза. Многу од патогените бактерии и некои од
паразитите се внесуваат преку фагоцитоза. Б-лимфоцитите пак го внесуваат
антигенот преку користењето на мембранското антитело кое делува како
рецептор за антигенот. Така се внесуваат бактериските токсини или нивните
разградни продукти. Ова се случува обично кога Б-лимфоцитот делува како
АПК, каде егзогените антигени се врзуваат на имуноглобулинскиот рецептор
од Б-клетката и се биде вовлечени внатре во неа во нејзиниот везикуларен
дел т.е во ендозомите. Во нив киселоста се зголемува со што се активираат
нивните протеази кои ги разградуваат противгените до пептиди. Класа II MHC
молекулите се создаваат во ендоплазматскиот ретикулум, потоа тие се
врзуваат за друг протеин наречен инваријантен ланец. Инваријантниот ланец
е врзан на местото на пептидите и не дозволува сопствените ендогени
протеини да се врзат за класа II MHC молекулите. Од ЕР класа II MHC
молекулите се усмеруваат кон киселите ендозоми и и тука се ослободуваат
од инваријантниот ланец и се спојуваат со соодветниот пептид. Ваквиот
комплекс патува до клеточната мембрана со помош на Голџиевиот систем и
ке биде презентиран т.е препознаен од Т-помагачките лимфоцити.

25
Фигура 9. Патеки за интрацелуларно процесирање на протеинските антигени.
Класа 2 молекулите на MHC ги конвертираат протеинските антигени кои се
ендоцитирани во везикулите на антиген-презентирачките клетки во пептиди кои
се врзуваат за класата 2 на MHC молекулите за да бидат препознаени од ЦД4
Т клетките. Класата 1 MHC патека ги конвертира протеините во цитоплазмата
во пептиди кои се врзуваат за класа 1 MHC молекулите за да бидат
препознаени од страна на ЦД8 Т клетките.

МЕГУСЕБНА РЕАКЦИЈА НА ИМУНИТЕ КЛЕТКИ

Од моментот на влегување на антигенот до негово отстранување од организмот

се случуваат реакции во кои учествуваат неколку видови на лимфоцити и други
клетки. За да се создадат антитела или цитооксични Т-лимфоцити и активираат
макрофагите потребно се повеке клеточни интеракции. Многу од тие клетки
имаат високо специјализирани функции, мегутоа многу од тие функции се
испреплетуваат, надоврзуваат една на друга,

26
па поради тоа губење на еден вид на клетка ке оневозможи реагирање на
целиот имун систем. Во аферентниот дел веке рековме учествуваат АПК и
помагачките Т-лимфоцити. Макрофагите кои не се специфични за антигенот
го фагоцитираат го преработуваат и презентираат на помагачките Т-
лимфоцити. Истото го прават и Б-лимфоцитите кои се специфични за
антигенот, преку рецепторот го вовлекуваат антигенот, преработуваат и
презентираат на помагачките Т-лимфоцити. Следува средишната фаза во
која активираните помагачките Т-лимфоцити ги потикнуваат Б-лимфоцитите и
цитоксичните Т лимфоцити кои се специфични за тој антиген да го отстранат
противгенот-ефернтен дел.

Помагачките Т-лимфоцити не стапуваат во контакт со антигенот на местото

каде тој влегол во организмот, туку во лимфните органи кои содржат голем
број на АПК-клетки. Помагачките Т-лимфоцити постојано циркулираат од
крвта во лимфата и обратно и постојано се сретнуваат со АПК па така брзо
доагаат во контакт со антигенот. Макрофагите се наогаат во сите делови на
лимфниот јазол каде фагоцитираат микроорганизми и противгени во форма
на честички, додека дендритичните клетки се наогаат во деловите каде се
сместени и Т-лимфоцитите, а се важни за презентирање на вирусни антигени.
Б-лимфоцитите пак се наогаат во фолкулите на лимфниот јазол а ги
презентираат растворливите бактериски антигени кои ги врзуваат на своите
имуноглобулински рецептори. Веке спомнавме на мембраната на Т-
лимфоцитите има молекули ЦД4 и ЦД8 ~ија улога е во препознаваwето на
комплексот пептид-MHC молекула и се нарекуваат уште и корецептори. Т-
лимфоцитот кој има на мембраната ЦД8 молекула предодреден е да стане
цитотоксичен лимфоцит. Додека лимфоцитот со ЦД4 може да се
диференцира во Тх1-помагачка клетка има улога во клеточниот имунитет и
Тх2-помагачка клетка има улога во хуморалниот имунитет.

СОРАБОТКА ПОМЕГУ Т и Б ЛИМФОЦИТИТЕ

Б-лимфоцитот може да реагира на тугиот антиген само ако му помогне Тх2-

помагачка клетка кој ке го препознае истиот антиген. Оваа соработка започнува
со вовлекување на антигенот од страна на Б-лимфоцитот откако претходно се
27
врзал на имуноглобулинскот рецептор. Потоа го преработува до пептиди и во
комплекс со класа II MHC молекулите го презентира на Тх2-помагачкиот
лимфоцит. Тогаш Тх2-помага~киот лимфоцит го потикнува Б-лимфоцитот на
пролиферација и диференцијација во плазма клетка која има способност да
создава антитела кои го отстрануваат антигенoт.

СОРАБОТКА ПОМЕГУ ПОМАГАЧКИТЕ И ЦИТОТОКСИчНИТЕ ЛИМФОЦИТИ

Во одредени случаи при реакција на вирусно инфицирани клетки за да се

развијат Т-цитотоксичните лимфоцити им треба помош од помагачките
лимфоцити. Тогаш и двата вида на Т-лимфоцити треба истовремено и на
иста АПК-клетка да го препознаат тугиот антиген се разбира во склоп со
соодветната MHC молекула.

28
 ВЕЖБА БР.5

ЛИМФОИДНИ ОРГАНИ

Во лимфоидните органи имунолошките клетки се создаваат, созреваат и ја

обавуваат својата основна функција. Лимфоидните органи (сл.5) според
функцијата се делат на:

 примарни (централни): тимус и коскена срцевина

 секундарни (периферни):
инкапсулирани:слезина,лимфнијазли
неинкапсулирани: Лимфното ткиво на слузниците или т.н.
МАЛТ(Mucosa-Associated Lymphoid Tissue)се состои од
лимфоретикуларно ткиво на дигестивниот, респираторниот и
генитоуринарниот систем и коскена срцевина.

Лимфоидните клетки во примарните органи само дозреваат не ја

обавуваат својата функција на пр: создавање на антитела. Делбата на
лимфоцитите во овие органи не бара контакт со антигенот како што е
случајот со секундарните органи.

29
 Фигура 10.
Лимфоидни
органи.
Лимфоидните
органи по
функцијата се
поделени на
примарни
лимфоидни
органи (нацртани
во темно
кафеава боја) и
секундарни
лимфоидни
органи (нацртани
со жолта боја)

ТИМУС

Овој орган кај човекот се наога во горниот и преден медијастинум. Го

сочинуваат два резена (лобуси) поврзани со сврзно ткиво. Ова ткиво формира
капсула и го дели тимусот на многу мали резенчиња (Фиг.11). Секој од нив се
состои од периферија богата со Т-лимфоцити (кора) и средишен дел (медула)
сиромашна со лимфоцити, но богата со дендритични клетки. Околу 2-5% од
лимфоцитите го напуштаат тимусот а останатите изумираат во него. Тимусот
е со најголема маса во феталниот период се до 10 година од животот кога
после настанува инволуција при што масното ткиво ја заменува прво кората
па потоа и медулата. Важноста на тимусот во имуната функција се испитува
на глушец на кој по хируршки пат му е изваден тимусот (тимектомија).
Тимектомијата доведува до намалување на циркулирачките Т-лимфоцити и
до отсуство на Т-клеточниот имунитет. Друг доказ за важноста на тимусот се
студиите за конгенитални

30
дефекти на тимус кај луге (ДиГеоргеов синдром) кај кои овој орган не е
развиен. Овие луге немаат Т-клетки во циркулацијата и им недостасува
клеточниот имунитет што значи имаат зголемена склоност кон инфекции.

Фигура 12. Шематски приказ на пресек на тимусот кој ги покажува неколку

лобули одделени со сврзно ткиво (трабекули). Густо населениот надворешен
кортекс содржи многу тимоцити (модри клетки на сликата) кои овдека брзо се
делат но и масвно умираат. Исто така присутни во надворешниот кортекс се и
тимусните клетки-хранителки (сиви клетки на сликата) кои се специјализирани
епителни клеки со продолжетоци кои опкружуваат околу 50 тимоцити.
Медулата е поретко населена и се смета дека содржи позрели тимоцити. За
време на престојот во тимусот, тимоцитите контактираат со клетките на
стромата како што се кортикалните епителни клетки (светло црвени на
сликата), медуларните епителни клетки (беж на сликата), интердигитантни
дендритични клетки (лилјакови на сликата) и макрофагите (жолти). Овие
клетки лачат тимусни хормони и прикажуваат високо ниво на класа 1 и класа 2
MHC молекули. Хасаловите корпускули кои се наоѓаат во медулата содржат
концентрични слоеви на

31
дегенерирани епителни клетки. [Адаптирано од W. van Ewijk, 1991. Ann.
Rev. Immunol. 9:591]

КОСКЕНА СРЦЕВИНА

Во вистинска смисла на зборот коскената срцевина и не претставува

лимфоиден орган. Но таа е од голема важност за развој на лимфоидниот
систем бидејки е извор на матични клетки од кои настануваат лимфоидните
и фагоцитните клетки. Најголем дел од клетките во коскената срцевина се
незрели, но има и зрели како што се Б-лимфоцитите. Така во коскената срж

7
дневно се создаваат околу 5х10 Б-лимфоцити, додека созреваат само
10% од нив, останатите 90% умираат не напуштајки ја. Во коскената
срцевина има 15-30% од лимфоцитите кои се рековме воглавно незрели.
Додека во крвта лимфоцитите се застапени со 30% од кои 70% Т-
лимфоцити, 25% Б-лимфоцити и 5% КПУ.

ЛИМФНИ ЈАЗЛИ

Тоа се органи сместени поединечно или во групи по должината на лимфните

садови. (Фиг.13) Лимфата проага низ лимфните јазли, кои се филтри за туги
материи (антигени) кои доагаат со лимфата. Лимфните јазли се органи од
примарна важност во клеточниот имунитет. И кај нив разликуваме кора богата
со Б-лимфоцити, макрофаги и медула богата со плазма клетки кои лaчат
антитела . Во кората се разликуваат надворешен дел (субкапсуларен) и
внатре{ен (паракортикален) кој е богат претежно со Т-лимфоцити и
дендритични клетки-АПК. Во надворешниот дел се наогаат групи од
лимфоцити наречени лимфни чворчиња (фоликули) кои може да бидат
примарни и секундарни. Во секундарните во централниот дел (герминативен
центар) се наогаат Б-лимфоцитите кои интензивно се делат после контакт со
антигенот. После поголем број на делби од еден Б-лимфоцит настануваат и
до 1000 нови клетки кои најпосле се диференцираат во мемориски клетки и
во плазма клетки. Дел од плазма клетките одат во медулата, останатите
мигрираат во коскената срцевина.
32
Лимфоцитите кои циркулираат во лимфата доагаат во лимфните јазли
преку аферентните лимфни садови, а го напуштаат преку еферентните.
Лимфата која доага од ткивата бавно се цеди низ кортексот, паракортексот
и медулата и на тој начин овозможува на фагоцитите во лимфниот јазол
да ги заробат навлезените бактерии кои ги носи лимфата. После
инфекција лимфата која го напушта лимфниот јазол е збогатена со
антитела од плазма клетките во медулата како и со поголема
концентрација на лимфоцити. Ова се должи на лимфоцитната
пролиферација во јазолот како одговор на антигенот.

Фигура 13 . Шематски приказ на лимфен јазол.

СЛЕЗИНА

Тоа е најголем секундарен лимфоиден орган кој е сместен високо на левата

страна од абдоминалната празнина. За разлика од лимфните јазли нема
аферентни лимфни садови па реагира на антигени кои доагаат преку крвта т.е
филтрирање на крвта. Таа има и друга функција освен имунолошката како
што е депо на крвта, разградба на стари еритроцити. Дека слезината е

33
 важна во одбраната на организмот зборува фактот за појава на
генерализирани инфекции после нејзино хируршко отстранување. Тоа е
многу поизразено кај деца. Овој орган се состои од црвена и бела пулпа.
Белата пулпа (Малпигиеви телца) како и кората на лимфниот јазол се
состои од Б-лимфоцити групирани во фоликули. Црвената пулпа се состои
од групи од Т- лимфоцити сместени околу централна артерија.
(периартериска обвивка).

Крвта доага во белата пулпа преку артерија централис, од која преку гранки
дел оди во црвената пулпа а дел завршува во канал т.н маргинален синус.
Границата мегу овој синус и црвената пулпа се вика маргинална зона богата
со макрофаги и Б-лимфоцити. Антигенот кој доага со крвта веднаш ке биде
заробен во маргиналната зона и ке потикне продукција на антитела. Најпрво
пролиферираат клетките во белата пулпа, за 5 дена и во црвената, која е
богата со плазма клетки кои создаваат противтела. Црвената пулпа е место
каде старите еритроцити се уништуваат и отстрануваат. Макрофагите кои се
наогаат во овој дел од слезината содржат фагоцитирани еритроцити или
пигмент на железо од разградениот хемоглобин.

Фигура 14. Структура на слезената. А) Слезената која е околу 13 см долга кај

возрасните е најглоемиот лимфоиден орган кој специјализира во фаќање на

34
антигените со потекло од крвта. Б) Шематски пресек на слезената. Артеријата на
слезената (артериа централис) ја побива капсулата и се дели на се помали
артериоли кои завршуваат во везикуларни синусоиди кои се дренираат во вената на
слезенката . Црвената пулпа богата со еритроцити ги иопкружува синусоидите.
Белата пулпа формира ракав, параартериолен лимфоиден дел (Periarteriolar
lympgoid sheath-PALS) околу артериолите кој содржи многубројни Т клетки. Блиско
поврзана со PALS е маргиналната зона, зона богата со Б клетки и која што содржи
лимфоидни фоликули кои можат да се развијат во секундарни фоликули со
герминални центри. Ова е подетално прикажано во В).

МАЛТ-мукозно асоцирано лимфоидно ткиво

Со површина од над 400 метри квадратни мукозните мембрани на

дигестивниот, дишниот, урогениталниот се постојано изложени на
надворешни антигени вклушувајки ги тука и бактериите, вирусите и
паразитите. Поради тоа, овие мембрани се добро екипирани за борба
против патогени и содржат голем број на клетки кои учествуваат во
имуниот одговор. Овие мембрани се дефинирани како група на
организирани неинкапсулирани лимфни ткива заедно наречена –МАЛТ.
Така групирани во МАЛТ, тие го представуваат најголемиот лимфоиден
орган во човековото тело.

Дел од ова ткиво е во добро организирани структури како што се тонзилите

и Пејерови плочи кои ги има во субмукозата на цревата. Функционалната
важност на МАЛТ во одбраната на организмот се должи на големиот број
на плазма клетки кои создаваат антитела, чија бројка ја надминува онаа на
плазма клетките во слезината, лимфните јазли и коскената срцевина
заедно.

Тонзилите се наогаат на три локации:

 лингвална- на базата на јазикот

 непчана- на страните на задна страна од усната празнина
 назофарингеална- аденоиди на кровот од назофаринксот

35
Сите три групи (Фиг.15) се нодуларни структури изградени од мрежа на
ретукуларни клетки и влакна прошарани со лимфоцити, макрофаги. Б-клетките се
организирани во фоликули и герминативни центри. Околу фоликулите се наогаат
Т-лимфоцитите. Тонзилите учествуваат во одбрана кон антигени кои влегуваат
во организмот преку назалната и оралната слузница.

Фигура 15. Три типа на тонзили. а) Местоположба и внатрешна функција на

непчаните и лингвалните тонзили б) Местоположба на назофарингеалните
тонзили

Пејерови плочи- се групи од лимфоидни клетки во субмукозата на тенко

црево каде исто клетките се организирани во фоликули. (Фиг.16) Околу 50%
од Б-клетките овде создаваат имуноглобулин А (ИгА). Помегу фоликулите се
наогаат зони на Т-клетки. На површината на Пејеровите плочки и помегу
епителните клетки се наогаат специјанизирани клетки, т.н. М клетки. Слична
организирана структура од лимфоидно ткиво се наога и во субмукозата на
апендиксот.

36
Фигура 16. Шематски пресек на мукозата на тенкото црево. Сликата го
покажува нодулот кој што претставува Пејерова плочка во субмукозата.
Интестиналната ламина проприа содржи групи на лимфоидни клетки и
фоликули.

Покрај овие добро организирани структури постои и дифузно

лимфноретикуларно ткиво на дигестивниот и респираторниот систем- во
слузницата на овие системи воглавно во ламина проприа помегу епителните
клетки дифузно се распоредени Т-лимфоцитите, помалку има и Б-клетки, но
има и плазма клетки кои создаваат ИгА.

37
Лимфното ткиво во дигестивниот тракт започнува имун одговор при орално
внесен антиген, при што настануваат плазма клетки кои создават ИгА или се
предизвикува Т клеточен одговор. Aнтиген влегува во слузницата воглавно
преку специјални клетки наречени М-клетки кои се наогат на површината на
Пејеровие плочки (види Фигура ). М клетките имаат способност да
пропуштаат големи молекули преку нивната цитоплазма без да ги разградат.
М клеткире се единствени клетки со таква способност и затоа се лоцирани на
места каде што антигените кои навлегуваат на тој начин директно доагат во
контакт со Б лимфоцитите кои ги активираат (сл.11). Овие пак се
диференцираат во плазма клетки и создаваат антитела. Овие антитела во
прницип можат да бидат од било кој подтип но најбројни и најважни за
имуниот одговор во слузниците се оние од класа ИгА. ИгА на слузницие е
единствен имуноглобулин кој има спосбност за ‘имуно исклучување’ (immune
exclusion). Тоа значи дека ИгА ќе го врзе антигенот и ќе го екскретира во
луменот kako секреторен ИгА. На тој начин антигенот не останува во телото
дури ни врзан за антителото ако е антителото е од ИгА класата. Секреторен
ИгА се лачи во луменот и неврзан со антиген и е составен дел на слузта.

38
Фигура 17. Структура на М клетките и лачење на ИгА на местата на индукција. а) М
клетките, лоцирани во мукозните мембрани ги ендоцитираат антигените од луменот на
дигестивниот, респираторниот и урогениталниот тракт. Антигенот се транспортира низ
клетката и се ослободува во големиот базолатерален џеп. б) Транспорт на антиген низ
епителиумот од страна на М клетките ги активира Б клетките во Пејервата плочка или во
лимфоидниот фоликул кој се наога под М клетката. Активираните Б клетки се
диференцираат во плазма клетки кои лачат ИгА. Надворешниот епителен слој на
слузниците содржи и интраепителни лимфоцити кои се воглавно ЦД8+ Т клетки, се
наоќаат помегу епителните клетки и се прва линија на одбрана на клеточниот имунитет.

КОЖА

Таа претставува важна анатомска бариера кон надворешната средина, а

нејзината голема површина ја прави важен орган во неспецифичната (вродена )
одбрана во организмот. Епидермисот (надворешниот слој) има клетки
кератиноцити кои секретираат голем број на цитокини кои имаат функција да
индуцираат локална воспалителна реакција. Овие клетки може да играат улога и
на антиген-презетирачка клетка. Помегу овие клетки се наогаат Лангерхансовите
дендритични клетки кои го факаат антигенот по пат на фагоцитоза, кои потоа
мигрираат до регионалните лимфните јазли и се претвораат во мокни
презентирачки клетки на антигенот. Интраепидермалните

39
лимфоцити се претежно Т- цитотоксични клетки и се специјално прилагодени
да се борат против антигените кои влегуваат преку кожата.

40
 ВЕЖБА.БР. 6

ИМУНОГЛОБУЛИНИ‐АНТИТЕЛА

Таложни aнтитела- преципитација

Имунолошката преципитирачка реакција е откриена во 1897год.. Помасовно

се употребува во дијагностика после 1960год.

Преципитација значи појава на макроскопски видливи преципитати или

флокули како резултат на реакцијата антиген/антитело. Антигените во овие
реакции се нарекуваат преципитиногени а антителата-преципитини. За
разлика од аглутинација (за која ке зборуваме подолу) овде учествуваат
растворливи микробни антигени или егзотоксини. Оваа реакција се
користи кога сакаме да изолираме антиген со цел тој понатаму да се користи
за анализа и претставува сензитивна метода со која може да се детектира
присуство на одреден антиген во клетка или ткиво. За да се постигне
преципитација потребен е соодветен квантитативен сооднос помегу
антигенот и антителото, понатаму потребно е исполнување на одредени
физичко-хемиски услови како што се: pH, температура, јонски сили, соленост
на средината и др. Преципитацијата може да се изведува во течна и во гел
средина. Способноста на антителото да ги исталожи (преципитира)
антигените од растворот е една од нивните најпознати карактеристики. При
тоа се создава комплекс од вкрстена молекула антиген-антитело која е
преголема за да остане растворена во растворот. Треба да се спомене дека
таложење не настанува секогаш кога антителото ке дојде во контакт со
антигенот. Концентрацијата на антигенот и на антителото кога настанува
таложењето е во одредени граници и се нарекува зона на еквиваленција.
Надвор од овие граници било кој од антигенот или антителото да е во вишок,
се формира само мал дел од нивниот заеднички комплекс.

41
Фигура 18. Неталожни антитела-аглутинација

Аглутинација претставува специфично фиксирање на специфичните антитела

за определени антигенски епитопи кои се наогаат на површината на многу
хумани клетки, бактерии или вируси, при што доага до нивно мегусебно
групирање и слепување. При тоа добиваме макроскопски видливи формации-
аглутинати, кои претставуваат знак за реакција на антиген-антитело.
Антигените во овие реакции се нарекуваат аглутиногени, а антителата-
аглутинини. Во оваа реакција како антигени учествуваат цели клетки
(бактерии, вируси, еритроцити).

Аглутинацијата најчесто се користи во крвногрупната имунохематологија.

Овде антигените се наогаат на клеточната мембрана и се основен фактор во
реакцијата, предизвикуваат создавање на антитела и претставуваат

42
специфични рецептори во процесот на фиксација на антителата. При тоа
важна е нивната густина на клеточната мембрана како и положбата. Пр:
антигенот А од крвногрупниот АБО систем, има 10.000 места на
еритроцитната мембрана и за да настане реакција потребна е само 2%
еритроцитна суспензија. Додека за Д антигенот од Рх системот потребна е
40%, бидејки тој е присутен со 10-30.000 места на мембраната. Положбата на
антигенот А е таква да тој проминира над мембраната, па антителата лесно
се фиксираат за него, додека Д е поставен длабоко во мембраната.

анти-А анти-АБ анти-Б О А Б крвна група

+ + - - - + А

- + + - + - Б

+ + + - - - АБ

- - - - + + О

Овие реакции се слични со оние на преципитација. И овде вишокот на

антитела нема да доведе до аглутинација. И овде се потребни одредени
услови да бидат исполнети: температура, ПХ, јонски сили, инкубација,
мешање и центрифугитање.

Пр; постојат оптимални температурни граници во кои најдобро се фиксираат

антителата за антигените. Така некои реакции најдобро се одвиваат на собна
температура 18-22°С или на 4, тие антитела се студени ( такви се од АБО
системот) или на 37°С т.н топли антитела (од Рх системот).

Треба да се напомене дека аглутинацијата е реверзибилен процес, при

промена на условите се добива процес на елуација т.н состојба иста како
пред почетокот на реакцијата.

ДИРЕКТНА АГЛУТИНАЦИЈА

Аглутинацијата може да биде директна кога со познати антитела (познат серум)

се откриваат непознати антигени. Пример за тоа е определување на АБО

43
крвните групи. Овој директен метод може да се изведува на плочка и во
епрувети.

Метод на плочка: Потребно ни е: периферна крв без антикоагуланс, познати

тест серуми со антитела-против А, антитела-против Б, антитела-против АБ. На
чиста пло~ка од лево кон десно капнуваме на три места по неколку капки од
крвта.Потоа пак од лево кон десно на првото место капнуваме против А серум, на
второто против АБ, на третото против Б. Потоа секое место го промешуваме
внимателно. За многу кусо време, доколку на Ер се наогаат соодветни антигени
за познатите антитела од серумот, ке настапи аглутинација.

читање на тестот: Ако има аглутинација на првото и второто место, имаме

присуство на А антиген и тие Ер се на лице од крвна група А. Ако имаме
аглутинација на второто и третото место, имаме присуство на антиген Б,
станува збор за Б крвна група. Ако има аглутинација на сите три места имаме
присуство на А и на Б антигени, станува збор за АБ крвна група. Ако нема
аглутинација на ниедно место имаме тогаш на Ер не се откриени антигени и
тие припагаат на О крвна група.

Метод во епрувети: Потребно е: шест епрувети, против серуми за АБО грвни

групи, тест еритроцити А, Б,О, епрувета со примерок крв ( без антикоагуланс) од
испитаникот. Шест епрувети обележани од 1-6 со иницијали на испитаникот се
редат на сталакт. Во првите три се капнува по 1 капка физиолошки р-р и по
2 капки од тест серумите и тоа: во првата анти-А, во втората анти-АБ, во
третата анти-Б. Во ~етвртата една капка од суспензија од тест еритроцити О,
во петтата: тест еритроцити А, во шестата тест еритроцити Б. Потоа
епруветата со крвта од испитаникот се центрифугира на 2000-3000 вртења во
1 минута за да се одели серумот и со чиста пипета се внесува во 4,5,6
епрувета по три капки од серумот на испитаникот, а потоа во 1,2,3 епрувета
по една капка од неговата еритроцитна суспензија. Се промешуваат и се
центрифугираат на 1000-1500 вртења во 1 минута. Потоа се вадат од
центрифуга и со протресување се чита резултатот т.е се гледа каде
настапила аглутинација која означува позитивен резултат.

44
 А)

Б)

Фигура 19.Одредување на крвни групи. А) Шематски приказ, Б) резултати од

тестирање

45
Фигура 20. Одредување на крвни групи во склоп на проценка на
компатибилност на орган донор

БАКТЕРИСКА АГЛУТИНАЦИЈА

Бактериската инфекција честопати иницира продукција на серумски антитела

кои се специфични за површинските антигени на бактериските клетки.
Присуството на таквите антитела може да се открие со бактериски реакции на
аглутинација. Серумот на пациентот за кој се мисли дека е инфициран со
дадена бактерија сериски се разредува во серија епрувети во кои е додадена
бактеријата. Последната епрувета која покажува видлива аглутинација го
одразува серумскиот титар на антителата на пациентот. Титарот се дефинира
како реципрочна вредност на најголемото серумско разредување кое
доведува до појава на позитивна реакција на аглитинација. Овој титар може
да се употреби за дијагноза на бактериска инфекции (Фигура 21).

46
Фигура 21. Одредување на бактеријата причинител на инфекција со методот
на бактериска аглутинација.

ИНХИБИЦИЈА НА АГЛУТИНАЦИЈА

Оваа реакција се употребува за да се открие дали некое лице користи

одредени видови на илегална дрога. Урина или примерок од крв прво се
инкубира со антитело специфично за одредена дрога. Потоа се додаваат
еритроцитите кои се обложени со дрогата. Ако еритроцитите не се
аглутинираат со антителото, тоа е доказ дека примерокот содржи антиген кој
е препознаен од антителото, односно дека лицето користело дрога.

АНТИГЛОБУЛИНСКИ ТЕСТ

Понекогаш антителата се фиксираат за специфичниот антиген, но не се

појавува аглутинација. Тогаш со додавање антиглобулински серум може да се
поврзат Fc деловите од антителата што се фиксирани за антигенот и на таков
начин реакцијата ке биде видлива. Овој тест е поставен од Кумбс (Coombs)

47
1945г. кој под формите на директен и индиректен тест има најширока
употреба во имунохематологијата, имуногенетика и имунологијата воопшто.
Во чест на авторот антиглобулинскиот серум се именува како Кумбсов серум.
Во оваа реакција основна реактивна супстанција претставува
антиглобулинскиот серум. тој се добива со имунизација односно внесување
човечки антитела-глобулини, во циркулацијата на некои животни (најчесто
зајак, коза, овен), кои ке доведат до создавање на антитела против внесените
глобулини. Од вака имунизираните животни се зема крв и од неа се издвојува
серумот, кој понатаму може да се стабилизира или замрзне и чува како
реагенс-антивглобулински серум. Овој серум може да е полиспецифичен да
содржи антитела против ИгГ, ИгМ, ИгА или моноспецифичен пр: само против
ИгГ ако имунизација е извршена со една класа на имуноглобулини.

Целта на овој тест е да се прикаже присуство или отсуство на слободни

антитела во испитуваниот серум или присуство или отсуство на антитела
врзани за еритроцитите што се испитуваат. Изведување на овој тест може да
помогне во дијагноза на суспектна хемолитичка анемија, хемолитички
пострансфузиски реакции, хемолитичка болест на новородено. Исто така овој
тест се користи за откривање на антитела кога се изведува тест за
компатибилност на крвта, потоа се откриваат антитела кај трудници,
трансплантирани, политрансфундирани пациенти и кај пациенти со малигни и
автоимуни заболувања.

Директен антиглобулински тест: служи за детекција на антитела кои се веке

фиксирани за антигенот. Може да се изврши во епрувета или на предметно
стакленце. Врз капка испрани еритроцити се додава капка антиглобулински
серум,потоа се инкубира 15мин. на собна температура. По инкубација
епруветата се центрифугира 30сек. на 1000 вртежи во минута. Се вади
епруветата, лесно се протресува и наспроти извор на светлина се чита
резултатот т.е се гледа појава на аглутинација. и доколку постојат антитела
фиксирани за антигените од Ер мембрана. Ако тестот е негативен се зема
една капка од епруветата и се набљудува под микроскоп. Овој тест се
употребува за:

1. дијагноза на ХБН-Хемолитичка болест на новородено.

48
 2. дијагноза на АИХА-автоимуна хемолитичка анемија и др. автоимуни
заболувања.
3. хемолитички реакции предизвикани од лекови.
4. акутна и доцна хемолитичка постранфузиска реакција

Фигура 22. Директен Кумбсов тест.

Индиректен антиглобулински тест: служи за детекција на слободни антитела, кои

слободно циркулираат во плазма. Може да се изврши во епрувета или на
предметно стакленце. Во епрувета се капнуваат три капки измиени Ер од крвна
група О се додаваат три капки од серумот што се испитува дали има антитела.
Потоа се инкубира епруветата 45 мин. на 37 за кое време ке се фиксираат
антителата (доколку ги има) за антигените од еритроцитната мембрана. По
инкубација содржината на епруветата се плакне со физиолошки р-р, три пати со
центрифугирање на 1500-2000 вртежи во 1 минута. По последното плакнење на
талогот се додава две капки антиглобулински серум. По секое центрифугирање
супернатантот комплетно се отстранува со пипета со аспирирање. По
последното плакнење на талогот се додава две капки антиглобулински серум.
Пак се центрифугира на 1000 вртежи во 1 минута. Потоа се чита резултатот
макроскопски наспроти извор на светлина. Ако тестот

49
е негативен се зема една капка од епруветата и се набљудува под микроскоп.
Присуство на аглутинација значи позитивен тест. Овој тест се користи за:

1. вкрстена проба-интеракција
2. детекција на еритроцитни антигени кои не можат да се откријат со
други техники

Фигура 23. Индиректен Кумбсов тест

НОРМАЛНИ ВРЕДНОСТИ НА ИМУНОГЛОБУЛИНСКИТЕ КЛАСИ

Нормалните вредности варираат во првите месеци и години. Најголеми

промени во првите месеци од животот на децата имаат ИгМ и ИгГ. Што се
однесува до вредностите кај возрасни мажи и жени тие се приближно еднакви
освен за ИгМ.

50
Вид на анализа кратенка нормални вредности

Имуноглобулин М ИгМ 0,49-1,82 г/Л `ени

0,42-1,6 г/Л ма`и

Имуноглобулин А ИгА 0,25-1,67 г/Л

Имуноглобулин Г ИгГ 5,1-12,85 г/Л

Клиничко значење на имуноглобулинските класи и поткласи

Промените во концентрацијата на имуноглобулините обично се

класифицираат како:

1. Хипогамаглобулинемии-намалена концентрација поради намалена

синтеза, зголемен губиток, зголемено разградување.
2. Поликлонски и олигоклонски гамопатии- зголемување на повеке или
една имуноглобулинска класа.
3. Моноклонски гамопатии-масовна пролиферација на Б клетките кои
синтетизираат имуноглобулини од една класа.
Хипогамаглобулинемии

Имунонедостатоците може да ги поделеме на четири категории:

 физиолошки (кај новородени и во старост)

 примарни специфични
 секундарни специфични
 јатрогени
Примарните се ретки и се одликуваат со зголемена осетливост кон појава на
инфекции. Се јавуваат во неонатална возраст, во тек на адолесценција.
Заедничка карактеристика е зголемена осетливост или невообичаено тешки
инфекции некарактеристични за возраста на пациентот. на имунонедостаток
треба да се помисли доколку:

 постојат повторувачки или невообичаени теш{ки инфекции кои зафакаат

повеке органски системи, а се предизвикани од различни патогени;

51
  се јават несакани компликации при вакцинирање или доколку
вакцинирањето е без успех.
Дијагностицирање на имуните пореметувања кои се јавуваат во текот на
детството обично почнува со вообичаени клинички иследувања:

 комплетна крвна слика, вклучувајки ја тука и крвната размаска

 одредување на концентрација на имуноглобулинските класи и поткласи
 одредување на концентрација на феритин за да се исклучи постоење
на недостаток на железо
 детекција на антитела кон вообичаени патогени
 микробилошко докажување на патоген во тек на акутна фаза на
инфекција

Поликлонски и олигоклонски гамопатии

Овде имаме зголемување на серумските имуноглобулини од една или повеке

класи. Изолирано зголемување на ИгМ се смета како знак за примарна
инфекција. Зголемување само на ИгГ и лесно зголемување на ИгМ е знак за
секундарен имун одговр кон веке познат патоген. Хроничните активни
инфекции ја зголемуваат концентрацијата на ИгГ, но во исто време се
зголемени и ИгМ и ИгА.

Моноклонски гамопатии

Кај овие овие пореметувања имаме зголемување само на концентрацијата на

еден тип лесни вериги(или само капа или само ламбда). Пример: мултипниот
миелом. Лесните вериги може да се филтрираат и повторно да се
реабсорбираат во тубулите на бубрегот. така ако има зголемено создавање
на имуноглобулински лесни вериги тие може да се појават во урината. Така
откривање на слободните лесни вериги во урина - Бенс Xонсонови протеини
е важен показател за оваа болест и може да се користи како за дијагностика
така и за следење текот на болеста.

52
 ВЕЖБА.БР. 7

МЕТОДИ ЗА ДОБИВАЊЕ НА МОНОКЛОНСКИ АНТИТЕЛА

Техниката e за прв пат опишана во 1975г. од Kohler и Milstein. Добитници

на Нобелова награда за ова во 1984г.
Поликлонални антитела

Продуцирани од страна на различни клонови на Б лимфоцити. Смеса од

имуноглобулински молекули од кои секоја молекула препознава ист
антиген, но реагира со различни антигенски детерминанти од тој антиген.
(Фигура 24).

Фигура 24. Добивање на поликлонални антитела

Моноспецифични антитела

Препознаваат само една антигенска детерминанта од Аг. Б –

лимфоцитите (клонови) кои ги продуцираат водат потекло од една
единствена мајка – клетка. (Фигура 25)

53
Фигура 25. Добивање на моноклонално антитела

Фигура 26. Моноклонално антитело

54
Постапки за добивање на моноклонални антитела

Со хибридизација на лимфоцити од имунизирани глувци со клетки кои

континуирано се реплицираат (миеломски клетки). Хибридомите најлесно се
добиваат на следниот начин:
1. имунизација на експериментално животно со саканиот антиген. (слика 1)

2. изолирање на Б лимфоцити од слезенката или лимфниот чвор на животното

3. фузија на овие Б клетки со туморски клетки кои имаат способност за

континуирано реплицирање ( клетки на миелом).
 Ваквата суспензија од клетки ќе се спои по нивниот краткотраен престој
во полиетилен глукол. Во културата од клетки ќе има три популации на
клетки: лимфоцити, миеломски клетки и хибриди. Хибридите ќе имаат
комбинација на геномите од соматската (Б лимфоцит) и миеломската
клетка.
4. Селекција на хибридомите in vitro во ХАТ медиум (хипоксантин,
аминоптерин и тимидин).
 Миеломските клетки изумираат во овој медиум бидејки се HGPRT -
(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) неможат да користат
егзоген хипоксантин за производство на пурин и клетките умираат.
 Б лимфоцитите со природна смрт.

 Така во овие услови остануваат само хибридомите, по 24-48 часа се

удвојуваат и се формираат нови колонии.
 Хибридомските клетки се клонираат со постапки на гранично
разблажување. Ова реклонирање се користи за да се обезбеди
моноклоност и голем број на клетки кои ќе создаваат исти Ат.
 Додека за специфичност на Ат се спроведуваат серолошки испитувања.

1. Имунизација на животно

Едноставноста во добивање на овие антитела ќе зависи од:

1. Начин на имунизација

 Субкутано

 Интравенозно

55
  Интраперитонеално

 Интрамускулно

2. Времето помеѓу имунизациите

3. Видот на животно

 Стаорец

 Зајак

 Овца

 кокошка

4. Видот на Аг

 Клетка

 Дел од клетка

 Протеин прочистен

 Смеса од протеини

Пример: Интраперитонеална имунизација на стаорци

 Старост 7- 8 недели

 Се повторува три пати

 Прв пат мешавина на Аг со комплетен Freund – ов адјуванс

 Втор пат (по 3 недели) Аг со некомплетен Freund – ов адјуванс

 Трет пат ( по 3 недели од вториот) а 3 дена пред фузијата, само

со Аг
Првите две имунизации се интраперитонеално со 200 μl од смесата, третата
е интравенска со 50 μl Аг.

Freund-ов адјувант

 Минерално масло со дадоток на мртви микобактерии во него-

комплетен

56
  Без микобактерии- некомплетен

Неговата улога е :

1. Делува како депо на Аг, од кој се ослободува Аг во

рамномерни временски интервали
2. Стимулира фагоцитоза

3. Митогени за лимфоцити

 КОМПЛЕТЕН: минерално масло (Bayole), емулзиско средство (Aquafor)

и мртви микобактерии

 НЕКОМПЛЕТЕН: минерално масло (Bayole), емулзиско средство

(Aquafor)

2. Хранлива култура од клетки

 После фузија клетките се доста нестабилни и чуствителни, мора да

им се обезбедат најдобри услови за раст и размножување (
соодветен медиум)
 Потребни се ЦИТОКИНИ, кои ги излачуваат макрофагите

 Затоа се изолираат макрофаги од кои ќе се добие големо количество

на цитокини
 Макрофагите се потребни и за фагоцитоза на умрените клетки со што
се обезбедува експанзија на хибридомите.
 Денес се користи комерцијално приготвен медиум од цитокини

3. Изолирање на клетки од имунизираното животно

Се одбираат тие животни кои имале најдобар имун одговор

1. Највисок титар на саканите Ат

2. Највисок афинитет на Ат за дадениот Аг

3. Најтесна специфичност на Ат

Изолирање на слезинката на имунизираното животното и припрема

на клетките од неа за фузија со милеомските кл.

57
1. Жтрвување на животното

2. Изолирање на слезенката

3. Манипулација со слезенката во стерилни услови

4. Резултат: суспензија на клетки од слезенка

5. Броење на лимфоцити од слезенка

6. Броење на миеломски кл

7. Разредување= кл.слезенка: миеломски кл. 7:1

4. Култура од клетки кои имаат својство на континуиран раст

 Култура од миеломски кл- потекло од тумор на коскена срж. (Фигура 27)

 Добро примпремени за постојан раст во ин витро култура

 Основно својство на овие кл-можност за нивно

неограничено размножување ( безсмртност)

Фигура 27. Миеломска клетка

5. Фузија

 Фузија- соединување на две клетки во хибридна клетка (Фигура 28, 29)

 Значајни се само хибридоми кои се формирани од

1. Една бесмртна клетка

58
 2. Една клетка која создава Ат

 Само тие после СЕЛЕКЦИЈА ке се одржуваат во културата

 СЕЛЕКЦИЈА- одбирање само на хибридом кој е способен да

продуцира Ат

Фигура 28. Фузија на клетки

Процес на фузија се изведува со :

 полиетилен гликол кој помага во фузија на мембраните на

двете клетки
 Фузијата се одвива сосем случајно помеѓу присутните клетки

 Пример: сите клетки од слезенка (Б лимфоцити стимулирани со саканиот

Аг, покрај нив и други Б-Лимфоцити, Т-Лимфоцити, Еритроцити)

 Можни се голем број на комбинации меѓу клетките.

 Но со селекција се одбираат само оние кои настанале со фузија на

миеломски и Б-Ли кои продуцираат Ат од наш интерес.

59
Фигура 29. Процес на фузија – формирање на хибридоми

6. СЕЛЕКЦИЈА

 Таа зависи од особините на клетките кои се фузираат:

1. Миеломски кл.имаат особина за неограничен раст во ин витро култура

и го немаат ензимот хипоксантин фосфорибозил трансфераза (ХПРТ -
). (Слика 5)
2. Б-Ли од слезенка немаат можност за неограничен раст, но го
имаат ензимот (ХПРТ+).

Фигура 30. Фузија на Б –лимфоцити (ХПРТ+).и миеломси клетки (ХПРТ -).

во полиетилен гликол

60
Хипоксантин фосфорибозил трансфераза (ХПРТ)

 Во услови на тимидин и хипоксантин овозможува алтернативен пат

на синтеза на ДНК
 И кога под дејство на аминоптерин основниот пат на синтеза на ДНК
е прекинат
 Ако во хранливиот медиум има тимидин, аминоптерин ,
хипоксантин (ХАТ)
 Аминоптерин ја прекинува основната синтеза на ДНК

 А во присуство на тимидин и хипоксантин преживуват само клетки кои

го имаат ХПРТ
 Со оваква селекција се овозможува опстанок само на хибридни кл.
Кои настанале од клетки на слезенка (имаат ХПРТ) и миеломски кл.
(имаат способност за неограничен раст). (Фигура 31)

Фигура 31. Процес на селекција на клетки со ХПРТ-

хипоксантин фосфорибозил трансфераза

61
 7. КЛОНИРАЊЕ

 По 10 дена од растот во селекциониот медиум се запазуваат клонови

од хибридни клетки. (Фигура 32)
 Само некои од нив излачуваат Ат специфични за дадениот Аг ( со
фузија на адекватниот клон на Б-Ли и миеломски кл)
 Клоновите од интерес мора да се издвојат од останатите

 Цел: да се развие еден клон на Б-Ли кој продуцира антитела од интерес

 Хибридоми клетките кои покажуваат својство на продукција квалитетни

Ат ( висока специфичност и висок афинитет за врзување со дадениот
Аг) понатаму може да се одгледуваат во ин витро култура.
 Така се формираат ФАБРИКИ НА КЛЕТКИ кои го продуцираат
саканото Ат во големи количини.

Фигура 32. Клонална експанзија на една клетка која продуцира

моноклонални антитела

62
 8. Пречистување

 Овие Ат за да се користат комерцијално мора да се пречистат

од останатите компоненти кои ги има во медиумот: фактори на
раст, цитокини, хормони.
 Филтрација на медиумот во кој хибридомите растат

 Хроматографија (Фигура 33)

Фигура 33. Метод на пречистување со хроматографија

63
Фигура 34. Постапки за добивање на моноклони антитела

Фигура 35. Постапки за добивање на моноклони антитела

Добро прочистените Ат се користат во дијагноза и терапија на оделни

заболувања. Во табелата 1 се дадени дел од моноклоните антитела кои се
одобрени за употреба во терапија на оделни заболувања.

64
Табела 2. Моноклони антитела во терапија на заболувања

65
 ВЕЖБА.БР. 8

ИМУНОХЕМИСКИ И ИМУН‐ФИЗИЧКИ‐ХЕМИСКИ МЕТОДИ

За детално испитување на серумските составните делови се користат методи

кои се базираат на имунохемиски и имунофизичкохемиски особини на
серумските протеини.

1. ХРОМАТОГРАФИЈА НА КОЛОНА

Хроматографските техники се со широка примена пред се за фракционирање

на протеини и изолирање на имуноглобулини Иг од протеинска смеса. За
оваа цел колоната која претставува стаклена цевка со различен дијаметар и
должина најмалку 2/3 од својата должина се полни со со синтетички гел
(смола). На нејзиниот горен дел на површината на смолата се аплицира
испитуваниот материјал и кој е смеса на материи кои треба да се
фракционираат. Врз база на физичките и хемиските особини на протеинските
молекули во смесата истите со одреден степен ќе се задржуваат односно
пропуштаат низ матриксот на смолата и последователно ќе се елуираат во
различни садови под колоната во кои ќе се собираат за да потоа се
анализираат уште на пониско ниво. Во однос на принципите на елуирање и
фракционирање постојат повеќе типови на хроматографија низ колона и тоа:

1. јоноизменувачка хроматографија
Раздвојувањето на протеините се базира на разлики во електричниот полнеж
на истите. Функционалната единица на гелот претставува наелектризирана
група прикачена на нерастворлив носач (целулоза, агароза или
полимеризиран декстран).
Принципот на јоноизменувачка хроматографија е:

1. во коланата се формира столб на носачот на матриксот со позитивно

наелектризирани зрнца од целулоза
2. негативно наелектризираните молекули во смесата од протеини се
врзуваат за матриксот и остануваат во колоната
3. неутралните молекули на протеини поминуваат помеѓу
наелектризираните честици и се елуираат.
Промена на pH и моларитетот на пуферот кој протекува низ колоната влијае на
полнежот на протеинските молекули како и во зголемување на бројот на јоните

66
кои ке конкурираат да бидат врзани за истото место каде ќе се врзат
протеинските молекули за гелот од колоната. Така со постепено зголемување
на моларноста и намалување на pH на пуферот протеините ќе се елуираат од
смолата.
Примери на смоли во јоноизменувачката хроматографија Катјонски

(кисели): карбокси метил целулоза, полисулфонска к-на

Анјонски, базни: диетил аминоетиол целулоза ( DEAE). Хроматографија на

DEAE целулоза е многу добар метод за изолирање на ИгГ кои можат да се
добијат потполно ослободени од сите останати серумски протеини.

2. Гелфилтрација
Со оваа техника протеинските молекули (како и др.молекули) се раздвојуваат
врз база на молекулската маса. Гелот е составен од зрнца на декстран со
пори со различна големина кај различни видови на гел. Протеините со
поголема молекулска маса од порите на зрнцата од гелот неможат да влезат
во самите зрнца па заедно со течната фаза која минува низ столбот на гелот
се елуираат најнапред. Помалите молекули во различна мера продираат во
зрнцата. Овие молекули во зрнцата се наоѓаат во рамнотежна концентрација
со молекулите во течна фаза надвор од зрнцата па на тој начин одредени
молекули тргнуваат низ колоната во вид на зони. Така протеинските фракции
во елуатот се појавуваат т.е. се распоредени во однос на тоа како им се
намалува молекулската маса. Големите протеински молекули се елуираат
додека малите се задржуваат во колоната.
Со оваа метода лесно се издвојуваат ИгМ од другите серумски
имуноглобулини. Се применува и во раздвојување на тешките од лесните
ланци на имуноглобулините, како и за изолирање на Бенс-Јонесови протеини
во урина на пациенти со мултипл миелом.

3. Афинитетна хроматографија
Принцип на афинитетната хроматографија е специфичноста и реверзибилната
реакција помеѓу гелот и супстанциите кои треба да се изолираат. Специфичноста
на поврзување се постигнува со ковалентно поврзување на соодветниот врзувач
и нерастворливиот носач (агароза или декстран). Така добиениот гел може да
абсорбира некоја супстанција од смесата која на тој начин ќе се изолира од
истата. Неповрзаните материи ке се исперат од колоната, компонентата која е
сама и врзана за колоната може да се елуира понатаму со промена на pH,
промена на јонска јачина на растворот и сл.

67
Способноста за врзување на антителата за антигените е една од реакциите
која може да се примени во афинитетната хроматографија. Одредени Ат во
серумот може да се изолираат ако специфични Аг за нив се поврзат за гелот
или обратно.
Пример: протеин А (изолиран од сој на Stafilococcus aureus ) кој специфично
реагира со молекулите на ИгГ од поткласа 1,2 и 4 може да се користи како
лиганд за изолирање на ИгГ од поткласа 3.
Со оваа техника може да се изолираат посебни видови на клетки.
Субпопулации на Т и Б клетките се разликуваат врз база на површински
рецептори кои се способни да се поврзуваат за посебни лиганди, на тој начин
и се раздвојуваат. Пример: Б лимфоцитите на својата површина имаат
рецептори за Иг, па ако има вградено на гелот антиимуноглобулини овие
клетки лесно ќе се одвојат од Т лимфоцитите.

68
 ВЕЖБА.БР. 9

ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЈА

Имунофлуоресценцијата е метода со помош на која се детектира присуството

на даден антиген на клеточно ниво преку реакција антитело- антиген при што
антителата се обележани со флуоресцентни материи. Оваа метода
овозможува да се види каде во ткивото ( или во клетката) се наога даден
антиген и се користи најмногу за таа цел. Освен тоа, степенот на
флуоресценција може да се измери со флуорометар- флуоресцентен
микроскоп (Фигура 36).

Во природата постојат многу материи кои флуоресцираат: ароматски

јалехидрати, деривати на ксантени (еозин, флуоресцеин), деривати на
акридин (трипафлавин) и др. Овие флуоресцентни материи имаат својство да
се спојат со протеините во стабилни соединенија.

Фигура 36. Флуоресцентен микроскоп

Така со спојување на овие материи со антитела се добиваат обележани,

маркирани антитела или флуоресцентни антитела.

69
За да се користи за оваа цел флуоресцентната материја треба да ги
задоволува следниве услови:

• Јачината на флуоресценција не смее да биде намалена после

врзување со антителото
• Не треба има таква хемиска структура која ќе влијае на реакцијата
антиген антитело
• После спојување со антителото не смее да влијае врз имунохемиската
специфичност и активноста на антителото
• Да е стабилна и ефтина

Следните материи ги задоволуват овие својства и се едни од најчесто

користените флуоресцентни бои:

• FITC- fluoresceinizotiocijanat (флуоресцира зелено). (Фигура 37)

Фигура 37. Клетките на сликата се одбележани со антитело кои е конјугирано

со FITC

• Rodamin B- izocijanat (флуресцира црвено). (Фигура 38)

Фигура 38. Позитивна реакција на имунофлуоресценција со Izocijanat како

обележувач на антителото

70
Постојат два типа на имунофлуореценција и тоа:

• Директна имунофлуоресценција (детекција на антигени)

• Индиректна имунофлуоресценција (детекција на антитела)

Се користат наразлични примероци од пациентите (крв, спутум, ткиво ,

култура од клетки). Притоа потребно е да се направат препарати и тоа на
еден од следниве начини:

• Во вид на размаска (крв, гној..)

• Во вид на отисок (ткиво, колонија на агар)
• Исечок од ткиво во дебелина од 3-4μ

Препаратите обично се фиксираат во 3% формалин или параформалдехид а

ако се работи за длабоко замрзнато ткиво во ацетон.

Директна имунофлуоресценција (ДИФ)

При изведување на ДИФ антигенот од препаратот (примерокот) на пациентот
го детектираме преку додавање на конјугат, составен од ФИТЦ врзан за
антителата специфични за бараниот антиген. После следи инкубација на
препаратот на температура од 37° околу 60 минути. Потоа вршиме испирање
на вишокот неврзани маркирани антитела со помош на пуферски раствор. Го
сушиме препаратот и го гледаме под флуоресцентен микроскоп.
Формираниот комплекс антиген-антитело-ФИТЦ ќе флуоресцира со јаболко
зелена боја (+ реакција). (Фигура 37). На овој начин може да докажеме само
постоење на антиген. (Фигура 39)

71
Фигура 39. Постапки при изведување на ДИФ

Индиректна имунофлуоресценција (ИИФ)

При изведување на ИИФ антителата во серумот на пациентот се докажува
така што капка од серумот се нанесува на предметно стакленце на кое се
наоѓа фиксиран и инактивиран антиген.Потоа се додава конјугатот составен
од антихумани имуноглобулини врзани за ФИТЦ. (Слика 5)
Комплексот антиген –антитело ќе флуоресцентира со зелена боја. Со оваа
метода може да се детектираат антитела од различни класи и да се одредува
нивниот титар, преку претходно диулирање на серумите.

72
Фигура 40. Постапки при изведување на ИИФ

73
 ВЕЖБА.БР. 10

ЕЛИСА (ELISA‐ Еnzyme Linked Immunosorbent Assay)

ЕЛИСА е квантитативен метод за детекција на дадена субстанца во

течности базирана на ензимски имунопроби (enzyme immunoassay –EIA).
Неопходна е во многу научни области: имунологија, ендокринологија и
неуроендокринологија, молекуларна биологија, вирусологија, фармакологија
и др. Се користи за одредување на голем број супстанции во промероци од
различни компоненти (серум, млеко, плазма,ткиво...): пептидни хормони,
непептидни хормони, циклични нуклеотиди, имуноглобулини,лекови, вирусни
протеини, ензими.
Пред да се открие ЕЛИСА, единствен начин за да се прават имунопроби бил
со радиоактивни имунопроби (RIA-radioimmunoassay). Заради својата
прецизност РИА нашла широка примена во повќе земји, меѓутоа оваа метода
бара посложeни услови и тоа посебно опремени лабаратории со скапа
опрема и користење на радиоактивнини изотопи. Со откивањето на ЕЛИСА за
одредување на концентрацијата на супстанции како што се хормони,
имуноглобулини,лекови РИА била заменета со ЕЛИСА. (Слика 1). ЕЛИСА
работи по истиот принцип како и РИА меѓутоа разликата е во тоа што
антигенот кај РИА е обележан со радиоизотопи а кај ЕЛИСА со ензими.

van Weemen, BK Clinical Chemistry, 51, 12, 2005.

Фигура 41. Споредба на употребата на РИА и ЕЛИСА во период 1960г.-2005г.

74
ЕЛИСА- Принцип на работа
Основна карактеристика на методата е обележување на една од
компонентите со ензим:
1. Антигенот или
2. Антителото т.н примарно 1st Ab или секундарно 2nd Ab
Активноста на ензимот во комплексот се одредува врз основа на
индикаторската реакција на овај ензим со соодветниот супстрат кој под
дејство на ензимот се трансформира во обоен бродукт (односно ја менува
бојата). Количината на супстанца која ја испитуваме се одредува со читање
на обоените полиња на спектрофотометар при што се мери трансмисијата на
светлина низ дадено поле (полињата на ЕЛИСА плочките се направени од
прозирна пластика). За ова се користат посебни инструменти, т.н читачи на
ЕЛИСА.
Разликуваме директна компетитивна индиректна некомпетитивна и сендвич
ЕЛИСА која најчесто се користи при одредување на концентрација на
протеински хормони.
КОМПЕТИТИВЕН ТИП НА ЕЛИСА

Кај овој метод неодбележаното антитело се инкубира прво со антигенот во

примерокот кој што сакаме да го испитаме. Потоа комплексите на антиген-
антитело кои на ваков начин се создале се додаваат на полињата во ЕЛИСА
плочката кои претходно се обложени со саканиот антиген. По периодот на
инкубација плочката се мие за да се одстрани антителото кое не се врзало.
Колку повеке антиген постои во примерокот помалку антитело ке остане
слободно за да се врзе за антигеннот на плочката (оттаму доага зборот
компетитивна). Се додава секундарно антитело кое е специфично и се врзува
за примарното антитело.Ова секундарно антитело е врзано за ензим и кога ке
се додаде субстратот кој се врзува за ензимот се создава боја. Јачината на
бојата ке зависи од концентрацијата на антителото.

Понекогаш при компетитивната ЕЛИСА антигенот е одбележан а не

антителото.

A
g

75
КОМПЕТИТИВЕН ТИП-обележан антиген Ag

✓ 1st Ab - фиксиран за подлогата (Фигура 42)

✓ Се додава Аg (стандардот или примерокот) и Аg обележан со

ензимот (се јавува помеѓу нив компетиција)
✓ + супстрат = боја.

Фигура 42. Фиксирано примарно антитело (1st Ab) на плочка

Фигура 43. Постапки при изведување на компетитивен тип на ЕЛИСА

76
 Количината на обоениот продукт е обратно пропорционална со количината
на антигенот во стандардот односно во примероркот (види график на
стандарна крива на Фигура 43).

Фигура 44. Постапки при изведување на компетитивен тип на ЕЛИСА

НЕКОМПЕТИТИВЕН сендвич ТИП – обележано антитело Аb

• 1st Ab фиксиран за подлогата

• се додава Аg – aнтигенот (примерокот или стадардот)

• повторно се додава 1st Ab

77
 • на крај се додава 2nd Ab-обележано со ензим

Фигура 45. Постапки при изведување на сендвич тип на ЕЛИСА

Количината на обоениот продукт е пропорционална со количината на

антигенот во стандардот односно во примероркот (види график на стандарна
крива на Фигура 45).

ЕЛИСА е високо специфична метода:

• Поради можноста за примена на високо специфични антитела

• Примена на пречистени стабилни ензими со едноставна
конетика (алкална фосфатаза, -D-галактозидаза)
• Користење на јасно дефинирани сусптрати и хромогени(
супстанци кои ја даваат бојата на крајниот продукт)
• Количината на крајниот продукт се мери со фотометар
т.е флуорометар или луминометар
• Методата има и висока сензитивна, лесно се изведува и има
можности за мерење на мали концентрации на Аг во
биолошки материјал

78
 ВЕЖБА.БР. 11

ЕЛИСПОТ

ЕЛИСПОТ (Enzyme Linked Immunospot Technique‐ELISPOT)

• Методот го разви Сесил Черкински во 1983 год. и се користи за
детекција на протеини кои ги лачат клетките. Најчесто се користи за
детекција на цитокини при што, со овој метод можат да се избројат
бројот на клетки кои го лачат тој цитокин но не може да се види колку
лачат количински ниту пак која е клтката која го лачи цитокинот.

• За ЕЛИСПОТ се користат плочки со 96 полиња (Фигура 46).

Фигура 46. Плочки за ЕЛИСПОТ

• Во полињата се наога нитроцелулозна мембрана или мембрана

обложена со високо квалитетен поливинилден дифлуорид. Ваквите
мембрани имаат висок капацитет за врзување на протеини. Прво се
додава примарно антитело кое е специфично за цитокинот кој се
испитува, Потоа се додава суспензија на клетки за која сакаме да
дознаеме дали го лачи дадениот цитокин. Клетките обично се
стимулираат за да почнат да лачат цитокини. Откако ке отстојат
извесно време за да им се дозволи да го излачат цитокинот,
мембраната се мие со што се отстрануват клетките. Потоа се додава
секундарно антитело кое е конјугирано за боја и има способност да се
врзе за примарното антитело. На тој начин се одбелезува цитокинот кој
се врзал за примарното антитело на мембраната. Местата каде што се
излачил изгледаат како точки (‘spot’ е точка). На шемата подоле е
прикажана постапката за ЕЛИСПОТ за ИФН гама (Фигура
47).

79
 Мембраната е Клетките се ИФН кој се Клетките и
обложена со додаваат лачи се врзува стимулантот
примарно заедно со за се мијат
анти‐ИФН стимулант примарното

Биотинилира Се додава Се
но анти ИФН Стрептавидин додава
антитело се АП боја и таа се сустрат
додава и тоа врзува за кој се
се врзува за биотинот на врзува за
ИФН анти ИФН АП
секундарно (алкална

Фигура 47. Како работи ЕЛИСПОТ

• Изгледот на мембраната на ЕЛИСПОТ е прикажана во слика 48 а и

б. Точките се бројат или на микроскоп или во специјален ЕЛИСПОТ
бројач.

80
А)

Б)

• Слика 48. Краен резултат на ЕЛИСПОТ процедурата. а) едно поле

со ЕЛИСПОТ; б) изгледот на плочката со позитивни и негативни
ЕЛИСПОТ полиња

• Во поново време резултатите од ЕЛИСПОТ се читаат на

ЕЛИСПОТ ЧИТАЧ. Има различни видови на ЕЛИСПОТ ЧИТАЧИ.
Пример за тоа како еден вид на ЕЛИСПОТ ЧИТАЧ функционира е
прикажан во Фигура 49.

81
82
Фигура 49. Читање на ЕЛИСПОТ со ЕЛИСПОТ ЧИТАЧ

• Во клиничката медицина ЕЛИСПОТ се корист како техника за

одредување на имуногеноста на дадена кандидат вакцина.
Цитокинот кој се испитува е обично ИФН гама макар да може да се
испитуват и други имуногени цитокини како што е ИЛ-2 итн.

83
 ВЕЖБА.БР. 12

ВЕСТЕРН БЛОТ (Western blot)

Вестерн блот е метода која овозможува да се одреди молекуларната тежина

на даден протеин како и количината присутна во дадениот примерок.
Накратко, методата се состои во тоа што прво дадениот протеин се издвојува
од примерокот со гел електрофореза, се пренесува на блотна хартија
(нитроцелулоза ) и се детектира со антитело врзано за ензинм кој потоа се
визуелизира со додавање на субстрат.
Методата се одвива врз база на трансфер на биолошкиот примерок од гел
врз мембрана, како и негова детекција на површината на таа мембрана. Се
нарекува уште и имуноблотинг метода, поради тоа што за детекција на
специфични протеини на мембраната се користат антитела. Специфичноста
на реакцијата антиген-антитело овозможува во смеса од различни протеини
да се детектира саканиот протеин.
Трансферот на протеинот од гелот врз мембраната се врши поради тоа што е
полесно да се манипулира со неа и на неа може прецизно да се детектира и
поголем број на протеини. Покрај ова протеините кои се наоѓаат адсорбирани
на мембраната се многу подостапни при реакцијата со антителата
(имунодетекција), за разлика од тие кои се наоѓаат во гелот.
Прв чекор при Western blot процедурата е раздвојувањето на
макромолекулите од смесата, преку процесот на гел-електофореза (Фигура
50). Сите макромолекули се издвојуваат при овој процес вклучувајки го и
протеинот кој ни е од интерес.

Фигура 50. Одделување на макромолекулите од протеинска смеса со гел

електофореза

84
Вака раздвоените молекули се пренесуваат на секундарен матрикс
(нитроцелулозна мембрана). (Фигура 51)

Фигура 51. Трансфер на протеините од гелот врз нитоцелулознатамембрана

Следниот чекор е т.н. блокирање на мембраната со цел да се оневозможи

неспецифично врзување на антителата за површината на мембраната. После
ова протеините се инкубираат со антителото специфично за протеинот за кој сме
заинтересирани т.н. примарно антитело (Ат) кое треба специфично да се врзе за
саканиот антиген (протеин чија експресија ја испитуваме). Потоа следи
инкубација со т.н. секундарно антитело кое не го препознава протеинот, туку се
врзува за примарното антитело. Секундарното антитело е врзано во комплекс со
ензим кој овозможува детекција со додавање на субстрат и појава на обојување.
После додавање на овој комлекс, ензимот овозможува формирање на обоен
преципитат кој се детектира колориметриски. (Фигура 52)

Фигура 52. Процес на блокирање и испирање на мембраната, како и

додавање на примарно и секундарно Ат

85
Покрај овој начин на детекција на протеинот, може со употреба на
хемилуминисцентен супстрат кој во реакција со ензимот наместо обоен
продукт дава светлосен сигнал, кој се детектира со помош на фотографски
рентген филм. Без разлика кој тип на супстрат се користи интензитетот на
сигналот е секогаш во корелација со количеството на испитуваниот протеин
кој е присутен на мембраната.
Во зависнот од принципот на детекција на саканиот протеин разликуваме два
основни типа:
1. Директна детекција- каде примарното Ат кое се користи за детекција на
протеинот е обележано со ензим или флуоресцентна боја. Оваа метода
ретко се користи.
2. Индиректна метода- најпрво се додава примарното Ат, тоа ќе се врзе
за протеинот, а потоа додаваме секундарно Ат кое ке се врзе за
примарното. За обележување на секундарното Ат во употреба се :
биотин, флуоресцентни проби( флуоресцин и родамин), како и ензими
(алкална фосфатаза и пероксидаза).

ИСПИРАЊЕ НА МЕМБРАНАТА

Мора да биде адекватно прилагодено на реагенсите што се користат при

оваа метода. Доколку испирањето е недоволно ќе има остатоци од
примарното и секундарното Ат врз мембраната каде не се наога
специфичниот протеин, со што ке се оневозможи јасна детекција на
саканиот протеин. Прекумерното испирање може пак да донесе да од
мембраната се исперат и Ат кои се врзани за саканиот протеинот, што
исто води кон слабеење на сканиот сигнал. За испирање се користат
различни пуфериски раствори: TBS (Tris Buffered Saline) и PBS (Phosphate
Buffered Saline) во комбинација со детергенти.
БЛОКИРАЊЕ НА МЕМБРАНАТА

Мембраната која се користи при оваа метода има висок афинитет за

врзување протеини. Како и антителата по своја природа се протеини, ќе
доведе и тие да се врзат за неа, на места каде го нема специфичниот
протеин, со што се ремети состојбата за детекција на протеинот кој е од
наш интерес. За да се избегне ова мембраната треба да се блокира т.е да
се блокират сите неспецифични места со употреба на протеини кои ќе се
врзат за неа а нема да стапат во интеракција со примарното и секундарно
Ат. Такви протеински материи за блокирање се: серумски протеини,
протеини од млеко па се до високо прочистени протеини.

86
ПРИМАРНИ И СЕКУНДАРНИ АНТИТЕЛА

Изборот за примарно Ат ке зависи од антигенот т.е. од бараниот протеин

кој сакаме да го детектитраме. Денес овие антитела комерцијално се
произведуваат. Се употребуваат и поликлонални и моноклонални
анатитела. Изборот за секундарно Ат зависи пре се од тоа кој вид на
животно ни послужило како домаќин за продукција на примарното Ат.
Пример: ако примарното Ат е глувчешко моноклонално Ат, секундарното
мора да биде анти-глувечешко антитело (кое специфично ги препознава
глувчешките Ат), произведено во било која животинска врста освен во
глувците.
Изборот на секундарно Ат зависи и од начинот на кој сакаме да биде тоа
обележано , а тоа пак зависи од апаратурата со која располагаме. Многу
различни молекули кои овозможуваат детекција може да бидат конјугирани со
секундарното Ат. Во минатото биле користени радиоизотопи, но денес ретко
поради високата цена и посебниот начин на ракување со нив. Денес во
употреба се: биотин, флуоресцентни бои (родомин и флуоресцеин), ензими(
пероксидаза (horseradish peroksidase -HRP) и алкална фосфатаза).
Флуресцентните бои овозможуваат детекција на сигнали те т.е мерење на
ниво на флуоресценција и , па има потреба посебни апаратури. Затоа денес
се користат за обележување на секундарно Ат најчесто ензими.

СУПСТРАТ

Супстрат за ензимот со кој се обележува секундарното Ат, може да дава

обоен продукт или емисија на светлосен сигнал (хемилуминисценција) ,
која е пропорционална на количината на испитуваниот протеин од
мембраната.
Луминол e еден од најчесто користените хемилуминисценти реагенси, кои
во тек на реакција на оксидација и присуство на водороден пероксид
доведува до создавање на 3-аминофталат, профикт кј се наоѓа во
екситирана состојба. Со преоѓање во пониска енергетска состојба овој
продукт емитира свтлосни фотони, кои може да се детектираат со помош
на фотографски филм.

87
Фигура 53. Хемилуминисцентна детекција на протеин

Фигура 54. Финален резултат при Western blot метода со користење на –

HRP обележано антитело (via chemiluminesce). За да можеме да ја
одредиме молекуларната тежина секогаш при гел електрофорезата се
додава една линија со маркер за молекуларна тежина (предпоследен на
сликата) при што молекуларната тежина на протените кои се наогаат на
маркерот ни е позната и ни овозможува преку споредување да одредиме
која е молекулрната тежина на испитуваниот протеин.

88
 ВЕЖБА.БР. 13

ФЛОЦИТОМЕТРИЈА (ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЈА)

FLOWCYTOMETRY (други имиња се FLOW; FACS)

Flow-тек, проток

Cyto-клетка

Metry-мери

Мерење на својствата на клетките во проточен систем.

Првиот инструмент за флоцитометрија е откриен во 1968 година од
Wolfgang Göhde на Универзитетот во Минхен, Германија. Оригиналното име
на методот била пулсна цитофотометрија (pulse cytophotometry; German:
Impulszytophotometrie). Ова име е сменето во флоцитометрија во 1978 на
Конференцата на Америчката Фондација за Инжењеринг во Флорида. Името
ФАКС за првпат е употребено во 1974 и потекнува од името на инструментот
произведен од компанијата Бектон Дикинсон (FACS, Becton Dickinson Inc).
Упростено, овој метод се состои од протерување на клеточна суспензија низ
ласерски светлосен зрак.

Флоцитометарот се состои од неколку дела:

Проточен дел (Fluidics)

Оптички дел

Детектори

ПРОТОЧЕН ДЕЛ

Проточниот дел се состои од систем на цевки каде што клетките се

протеруват низ доволно тесна цевка за да поминат поединечно а во околната
(поголема) цевка се наога специјална обвивна течност (sheath fluid)која не го менува
поминувањето на светлосниот (ласерски) зрак (Фигура 55).

89
 Клеточна
суспензија

Обвивна течност
(sheath fluid)

Проток на единечни
клетки

Фигура 55. Проточниот дел од флоцитометарот. Пренасочување на голем волумен

на течност во мал волумен на тој начин што станува фокусиран се нарекува
хидродинамично фокусирање.

ОПТИЧКИ ДЕЛ

По хидродинамичкото фокусирање секоја клетка поминува низ еден

или повеке светлосни зраци. Расејувањето на светлината кое што настанува
притоа или емитирањето на флуоресценција (ако клетката е одбележана со
флуоресцентна боја) дава информација за особините на клетката. Како извор
на светлосен зрак се користат ласери. Ласерскиот зрак мора да биде
фокусиран на истото место каде што се фокусирани клетките.

ПРЕДЕН СКАТЕР; ПРЕДНО РАСЕЈУВАЊЕ (FORWARD SCATTER-FCS)

Светлосниот зрак кој се расејува кон напред во линија на светлосниот зрак се

нарекува преден скатер (FORWARD SCATTER, FCS). Големината на
предниот скатер зависи од големината на клетката така да со преден скатер
се одредува големината на испитуваната клетка (Фигура 56а). Светлината
која поминала тогаш се детектира преку детектори (Фигура 56б).
Информацијата добиена на ваков начин се детектира преку детектори и се
преработува во хистограм (Фигура 57) или во

90
 ДЕТЕКТ

Преден
скатер

А Б

Фигура 56. Преден скатер (FCS)

Мала Средна Голема

Фигура 57. Изгледот на хистограмот на преден скатер (FCS) во зависност

од големината на клетката.

91
СТРАНИЧЕН СКАТЕР (SIDE SCATTER, SSC)

Кај страничниот скатер светлината се распрскува под агол од 90⁰

од ласерскиот зрак (Фигура 58).

Фигура 58. Страничен скатер

Страничниот скатер ја покажува структурата на клетката (слика 5).

Страничниот скатер е
предизвикан од
грануларноста и
структурната
комплексност на
клетката

Фигура 59. Начин на распрскување на светлината на страничниот скатер

во зависност од структурата на клетката.

92
 ОДРЕДУВАЊЕ НА ГОЛЕМИНАТА И ГРАНУЛАРНОСТА НА КЛЕТКИТЕ

Големината и грануларност на клетките се одредуват со предниот и

страничниот скатер . Клетката поминува ни ласерскиот зрак при што предниот
и страничниот скатер се детектираат од два различни детектори (слика 6).

ХИДРОДИНАМИЧКО
ФОКУСИРАЊЕ

ПРЕДЕН
СТРАНИЧЕН
СКАТЕР
СКАТЕР

ЛАСЕР

Фигура 60. Одредување на големината и грануларноста на клетките со

преден и страничен скатер.
Информацијата потоа се преработува и се прикажува како хистограм (Фигура
62а) или како флодиаграм (flowchart) (Фигура 62б). Само со преден скатер не
може да се одреди дали се работи за една или повеке групи на клетки. На
пример во Фигура 61 е прикажан преден скатер на популација на клетки.

Фигура 61.
Преден скатер на
популација на
клетки

93
 Популацијата прикажана во предниот скатер во сл.7 изгледа како хомогена
популација на клетки. Мегутоа, доколку се направи комбинација на преден и
страничен скатер се гледа дека се работи за три различни популации на
клетки (слика 8).

Страничен Преден скатер

Страничен

Б
Преден скатер

Фигура 62. А. Хистограми на преден и страничен скатер на клетките од сл. 7.

Б. Флодијаграм на истите клетки со преден и страничен скатер
Во Фигура 63 е прикажан флодијаграм на клетките во крвта.

Страничен скатер =
грануларност и комплексност

Преден скатер =

Фигура 63. Флодијаграм на клетките на крвта. Бидејки неутрофилите се полни со

гранули тие се наогаат највисоко на сиде скатерот. Под нив се моноцитите а
лимфоцитите се многу помали и затоа се најниско на предниот скатер. Исто

94
така бидејки немаат никакви гранули, лимфоцитите се наогаат ниско и
на страничниот скатер.

КОРИСТЕЊЕ НА ФЛУОРЕСЦЕНТНИ БОИ ВО ФЛОЦИТОМЕТРИЈАТА

Принципот врз кој почива користењето на флуоресцентните бои е

следниот: Под дејство на светлосниот ( ласерски) зрак настанува ексцитација
на честичките на флуорофорот (флуоресцентната боја) бидејки тие ја
абсорбираат енергијата од светлосниот зрак. Потоа честичките се вракаат во
нормална состојба при што емитираат (зрачат) светлина. Светлината која ја
зрачат се детектира со детектори. Флуоресцентните бои се врзани за
антитела кои се специфични за молекулите на клетката кои сакаме да ги
испитаме (пр. ЦД4, ЦД8, маркери за мемори клетки итн) (Фигура 64а).
Флуоресцентните антитела претходно се додаваат на клеточната суспензија
при што тие се врзуваат за структурите на клетките за кои се специфични
(Фигура 64б). Кога клетката поминува низ ласерскиот зрак настанува
ексцитација на флуоресцентната боја која почнува да зрачи светлина која се
детектира со детекторот.

А Б

Фигура 64. Користење на флуоросцентните бои за одбележување на клетките

Информацијата за флуоресценцијата се бележи на следниот начин. Кога

клетката поминува низ ласерскиот зрак, флуоресцентната светлост која се
емитира патува низ истата патека како страничниот скатер и поминува низ
серија на филтери и огледала така да различните бранови должини се
донесуват до детекторите специфични за нив (Фигура 65).

95
 Фигура 66. Детекција на флуоресценцијата

Вака детектираната флуоресценција ке се покаже на хистограм на

следниот начин (Фигура 67):

Популација на
позитивни клетки

Популација на негативни
клетки

Фигура 67. Хистограм при користење на една флуоресцентна боја

Со овој метод може точно да се утврди за кои клетки станува збор, дали се
мемори или наивни како и кои цитокини ги лачат. Исто така, може да се
измери и интензитетот на флуоресценцијата (Фигура 68).

96
 посјајни

Фигура 68. Интензитетот на флуоресценцијата ке е различен во зависност

од тоа колку молекули има кои ке бидат одбележени.
За да може клетките во потполно да се карактеризираат се користи боење со
повеке флуоресцентни антитела. Притоа, при изборот на флуоресцентните
бои кои ке се користат заедно особено треба да се внимава брановата
должина на светлоста на емисија на различните флуоресцентни бои да биде
доволно оддалечена една од друга за да може јасно да се разграничат
клетките позитивни за секоја од флуоресцентните бои. Денеска се користат
до 16 флуоресцентни бои симултано. Ова е можно само доколку се користи
флоцитометар со четири ласера.
За анализа на резултатите се користат посебни софтвери. Најпопуларен во
последно време е ФлоЏо.

97
Пример. Анализа на лачење на ИФН гама, ТНФ алфа, ЦД107а (маркер
за цитотоксични лимфоцити) и ИЛ-10 од ЦД4 и ЦД8 Т лимфоцитите

Преден скатер (хоризонтална

оска) и страничен скатер
(вертикална оска)

Страничен скатер (вертикална

оска) и ЦД3 (маркер за сите Т
клетки). Портата (gate) се
оцртува околу ЦД3+ клетки и
понатака само тие клетки се
анализираат

Порта (gate)‐оваа клеточна

суспензија содржи 28.1% Т
клетки

98
 Страничен скатер (вертикална
оска) и ЦД4 (хоризонтална
оска). Овдека е прикажана само
популацијата на ЦД3+ Т клетки
анализирана низ претходната
порта. Втората порта е ставена
на ЦД4+ клетки кои се 19.6% од
вкупните Т клетки.
Понатамошната анализа се
врши преку двете порти ЦД3 и
ЦД4 што значи се однесува само
на ЦД4+ Т клетки

Процент на ЦД4+ Т клетки кои прикажуват ЦД107а (лево‐маркер за перфорин

на цитотоксичните клетки, 3.49%) и ТНФ алфа (десно, 1.45%)

99
Процент на ЦД4+ Т клетки кои лачат ИЛ‐10 (лево, 1.86%) и ИФН гама (десно, 1.68%)

100
 Страничен скатер (вертикална
оска) и ЦД8 (хоризонтална
оска). Овдека е прикажана само
популацијата на ЦД3+ Т клетки
анализирана низ претходната
порта. Втората порта е ставена
на ЦД8+ клетки кои се 66.7% од
вкупните Т клетки.
Понатамошната анализа се
врши преку двете порти ЦД3 и
ЦД8 што значи се однесува само
на ЦД8+ Т клетки

Процент на ЦД8+ Т клетки кои прикажуват ЦД107а (лево‐маркер за перфорин

на цитотоксичните клетки, 2.05%) и ТНФ алфа (десно, 0.75%)

101
 Процент на ЦД8+ Т клетки кои
лачат ИФН гама (0.77%)

Ова е само еден начин на анализа. Анализата може да се направи на

неколку различни начини на истата популација во зависност од потребите.

102