‫נסי זגורי‪ ,‬עידן ברזילי‬

‫דו"ח מעבדה מס' ‪ -2‬מיקרוסקופ אלקטרוני‪ ,‬קביעת ריכוז חלבון‪-‬שיטת‬

‫‪ Bradford‬והפרדת חלבונים בג'לים של פוליאקרילאמיד‬

‫תשובות לשאלות מנחות‪-‬סיכום תוצאות‪:‬‬

‫*קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד‪-‬‬

‫שאלה ‪ :1‬סדרו את תוצאות הניסוי בטבלה (ראה דוגמה בעמ' ‪ 14‬בחוברת)‪.‬‬

‫תשובה ‪ :1‬התקבלו התוצאות הנ"ל‪-‬‬
‫נתונים לעקום כיול‪-‬‬
‫צפיפות‬ ‫ריכוז חלבון‬ ‫כמות‬ ‫נפח ‪ BSA‬בריכוז‬ ‫נפח מים‬ ‫מס' מבחנה‬
‫אופטית (‪)OD‬‬ ‫(‪)mg/ml‬‬ ‫חלבון‬ ‫מזוקקים (‪)lµ‬‬
‫של ‪0.5mg/µl‬‬
‫(מיליגרם)‬
‫)‪(lµ‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.117‬‬ ‫‪0.025‬‬ ‫‪0.0025‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪95‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪0.269‬‬ ‫‪0.05‬‬ ‫‪0.005‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪90‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.353‬‬ ‫‪0.075‬‬ ‫‪0.0075‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪85‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.453‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪0.01‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪0.556‬‬ ‫‪0.125‬‬ ‫‪0.0125‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪75‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.468‬‬ ‫‪0.15‬‬ ‫‪0.015‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪70‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.645‬‬ ‫‪0.175‬‬ ‫‪0.0175‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪65‬‬ ‫‪8‬‬

‫דגימות ניסוי‪-‬‬
‫צפיפות‬ ‫ריכוז חלבון תוך‬ ‫ריכוז חלבון על סמך‬ ‫מקדם מיהול‬ ‫מס' דגימה‬
‫אופטית (‪)OD‬‬ ‫עקום כיול (‪ )mg/ml‬התחשבות במיהול (‬
‫‪)mg/ml‬‬
‫‪0.389‬‬ ‫‪0.84275‬‬ ‫‪0.084275‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.819‬‬ ‫לא ניתן לחישוב‪-‬לא לא ניתן לחישוב‪-‬לא‬ ‫‪20‬‬ ‫‪2‬‬
‫בתחום הלינארי‬ ‫בתחום הלינארי‬
‫‪0.615‬‬ ‫לא ניתן לחישוב‪-‬לא לא ניתן לחישוב‪-‬לא‬ ‫‪30‬‬
‫בתחום הלינארי‬ ‫בתחום הלינארי‬
‫‪0.359‬‬ ‫‪3.86064‬‬ ‫‪0.077213‬‬ ‫‪50‬‬
 ‫שאלה ‪ :2‬הכינו עקום כיול‪ ,‬וקבעו את המשוואה המתארת את הקטע הליניארי של העקום‪.‬‬
‫(הראו את כל השלבים‪ :‬חישובים ‪ +‬גרפים)‪.‬‬
‫תשובה ‪ :2‬עקום הכיול שהתקבל על סמך נתוני הטבלה הנ"ל‪-‬‬

‫עקום כיול‪-‬צפיפות אופטית כתלות בריכוז חלבון‬

‫‪7.0‬‬

‫‪130.0 + x842.4 = y‬‬ ‫‪6.0‬‬

‫צפיפות אופטית (‬
‫‪5.0‬‬
‫סידרה ‪1‬‬
‫‪4.0‬‬
‫סידרה ‪2‬‬
‫‪ 3.0‬ליניארי (סידרה )‪2‬‬
‫‪2.0‬‬
‫)‪DO‬‬

‫‪1.0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪50.0‬‬ ‫‪1.0‬‬ ‫‪51.0‬‬ ‫‪2.0‬‬
‫‪gm) lm‬‬
‫ריכוז חלבון ( ‪/‬‬

‫שאלה ‪ :3‬עבור דגימה ‪( 1‬חלבון בריכוז ידוע של ‪ ,)mg/ml 1‬חשב את הריכוז על סמך עקום‬
‫הכיול‪ .‬במידה ויש סטייה‪ ,‬הסבירו מה הגורמים האפשריים לכך‪.‬‬
‫תשובה ‪ :3‬עבור דגימה ‪ 1‬קיבלנו צפיפות אופטית של ‪ .0.389‬מאחר וצפיפות זו נופלת בתחום‬
‫הלינארי של עקום הכיול ניתן לחשב את ריכוז החלבון בהסתמך על משוואת העקום‪.‬‬
‫חישוב‪-x :‬ריכוז חלבון‬
‫‪x+0.031*4.248=0.389‬‬
‫‪4.248x=0.358‬‬
‫‪x=0.084275‬‬
‫מאחר ומהלנו את הדגימה ‪ 1‬במיהול של ‪ 1:10‬יש לכפול ערך זה שהתקבל פי ‪ 10‬כדי לקבל את‬
‫ריכוזה המקורי של הדגימה‪ .‬קיבלנו כי ריכוז החלבון בדגימה ‪ 1‬הוא ‪ .mg/ml 0.84275‬תוצאה‬
‫זו אומנם אינה רחוקה בהרבה מהריכוז הידוע של החלבון (‪ )mg/ml 1‬אך בכל זאת קיימת‬
‫סטייה מסוימת‪ .‬אחת הסיבות לסטייה זו עשויה לנבוע מחוסר דיוק במיהולים‪ ,‬שהשפיע על‬
‫קריאת הספקטרופוטומטר שרגיש מאד לשינויים קלים בריכוזים בתחום הלינארי‪ .‬סיבה‬
‫נוספת יכולה להיות חוסר הקפדה על ניקיון הקיווטה בצדדים דרכם עוברת קרן האור‪ .‬כמו כן‬
‫יתכן וההסבר לסטייה נעוץ בשגיאות קטנות של הספקטרופוטומטר עצמו‪.‬‬
‫שאלה ‪ :4‬עבור דגימה ‪( 2‬חלבון בריכוז לא ידוע) חשבו את ריכוז הדגימה‪ ,‬על סמך נתוני הבליעה‬
‫האופטית שהתקבלו‪ .‬יש לציין את מס' הדגימה והמיהול הנבחר (יש להראות את כל שלבי‬
‫החישוב)‪.‬‬
‫תשובה ‪ :4‬עבור דגימה מס' ‪ 5‬התקבלו הקריאות הבאות במיהולים הבאים‪-‬‬

‫צפיפות אופטית‬ ‫מקדם מיהול‬

‫(‪)OD‬‬
‫‪0.819‬‬ ‫‪20‬‬
‫‪0.615‬‬ ‫‪30‬‬
‫‪0.359‬‬ ‫‪50‬‬

‫מאחר וניתן להשתמש בעקום הכיול רק עבור מיהולים‪ ,‬שעבורם הקריאה נופלת בתחום‬
‫הלינארי‪ ,‬נוכל להשתמש בתוצאות הבליעה רק עבור מיהול של ‪.1:50‬‬
‫חישוב ריכוז החלבון‪-x :‬ריכוז חלבון‬
‫‪x+0.031*4.248=0.359‬‬
‫‪4.248x=0.328‬‬
‫‪x=0.0772123‬‬
‫מאחר ומהלנו את הדגימה מס' ‪ 5‬במיהול של ‪ 1:50‬יש לכפול ערך זה שהתקבל פי ‪ 50‬כדי לקבל‬
‫את ריכוזה המקורי של הדגימה‪ .‬קיבלנו כי ריכוז החלבון בדגימה מס' ‪ 5‬הוא ‪.mg/ml 3.86064‬‬
‫מאחר ואין אנו יודעים את ריכוז הדגימה לא ניתן לקבוע אם קיימת סטייה כלשהי‪ ,‬אך אם היא‬
‫קיימת ההסברים האפשריים לה מצוינים בתשובה לשאלה הקודמת‪.‬‬

‫*הפרדת חלבונים בג'ל פוליאקרילאמיד‪-‬‬

‫שאלה ‪ :1‬ציירו עקום כיול של הג'ל‪ :‬בעת עריכת התוצאות בטאו את המשקל המולקולרי של‬
‫הסמנים והדוגמא בסקלה לוגריתמית כתלות ב‪ .Rf -‬צרפו טבלה המרכזת את הערכים בהם‬
‫השתמשתם לשם בנית עקום הכיול‪.‬‬
‫תשובה ‪ :1‬התקבלה התמונה הנ"ל‪-‬‬
‫נסי ועידן‬ ‫ליאב ואלינער‬
‫בעצם בתמונה זו ניתן לראות‬
‫את שלושת הדגימות‬
‫שהועמסו על הג'ל‪-‬‬
‫א) סמני משקל‬
‫ב) תמצית של כבד‬
‫ג) ‪-BSA‬חלבון נקי‬

‫נתונים לעקום כיול‪-‬‬

 ‫לוגריתם של המשקל‬ ‫משקל מולקולרי (‪)Dalton‬‬ ‫‪Rf‬‬
‫המולקולרי‬
‫‪5.2916663‬‬ ‫‪195,734‬‬ ‫‪0.083333‬‬
‫‪5.0173715‬‬ ‫‪104,081‬‬ ‫‪0.183333‬‬
‫‪4.7722924‬‬ ‫‪59,196‬‬ ‫‪0.25‬‬
‫‪4.6149605‬‬ ‫‪41,206‬‬ ‫‪0.466666‬‬
‫‪4.3237676‬‬ ‫‪21,075‬‬ ‫‪0.65‬‬
‫‪4.1968115‬‬ ‫‪15,733‬‬ ‫‪0.775‬‬
‫‪3.8085486‬‬ ‫‪6,435‬‬ ‫‪0.983333‬‬

‫יש לציין כי ‪ Rf‬חושב על סמך מרחק הרצה נצפה של ‪ band‬של סמן ביחס לאורך הכללי של‬
‫שדה ההרצה (ע"פ תמונה של הרצת מרקרים ידועים)‪.‬‬
‫עקום הכיול שהתקבל על סמך נתוני הטבלה הנ"ל‪-‬‬

‫עקום כיול‪ -‬לוגריתם המשקל המולקולרי של סמן מולקולרי‬

‫כנגד מרחק הריצה היחסי שלו‬

‫‪6‬‬

‫‪5‬‬

‫‪4‬‬

‫‪3‬‬

‫‪2‬‬

‫‪1‬‬
‫‪)D ni thgiew(goL‬‬

‫סידרה ‪1‬‬
‫‪ 0‬ליניארי (סידרה )‪1‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪5.0‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪5.1‬‬
‫‪9103.5 + x2005.1- = y‬‬ ‫‪fR‬‬

‫שאלה ‪ :2‬נתחו את תוצאות ההפרדה של כל דוגמא אותה הרצתם בג'ל‪ .‬חשבו את המשקל‬
‫המולקולרי של החלבון הנקי (‪.)BSA‬‬
‫תשובה ‪ :2‬כפי שצוין לעיל שלושת הדגימות שהועמסו על הג'ל הם‪ :‬סמני משקל‪ ,‬תמצית של‬
‫כבד ו‪-BSA-‬חלבון נקי‪ .‬תערובת סמני המשקל הינה תערובת חלבונים עם משקלים מולקולרים‬
‫שונים וידועים מראש ולכן עבורם התקבלו כצפוי בנדים נפרדים וברורים‪ .‬חלק מהבנדים עבים‬
‫יותר מאחרים‪ ,‬דבר המעיד על כמות חלבון גדולה יותר בעלת אותו משקל מולקולרי‪.‬‬
‫עבור הפרדת החלבונים של תמצית כבד ניתן למצוא כמות גדולה של חלבונים עם רצף משקלים‬
‫מולקולרים (הדגימה נמרחה על כל שדה ההרצה)‪ .‬גם כאן התקבלו בנדים מסוימים עבים יותר‬
‫מאחרים‪,‬לאורך שדה ההרצה‪ ,‬כנראה בגלל כמות מעט גדולה יותר של חלבונים בעלי אותו‬
‫משקל מולקולרי‪.‬‬
 ‫באלקטרופורזה של החלבון הנקי ‪ BSA‬ציפינו למצוא בנד אחיד ועבה של חלבון ‪ .‬אכן בפועל‬
‫קיבלנו בנד אחד עבה‪ ,‬המעיד על כמות חלבון גדולה מאד עם אותו משקל מולקולרי (החלבון‬
‫נקי)‪ .‬בהצבת המרחק היחסי אותו עבר החלבון הנקי במשוואת עקום הכיול נוכל לקבל את‬
‫משקלו של החלבון הנקי‪ ,‬מרחק זה‪.=0.341666Rf -‬‬
‫חישוב לוגריתם משקלו המולקולרי של החלבון‪y-Log(weight) :‬‬
‫‪y=-1.5002*0.341666+5.3019‬‬
‫‪y=4.789333‬‬
‫ומכאן שמשקלו המולקולרי של החלבון הנקי הוא ‪.Dalton 61,564.82748‬‬
‫מאחר ואין אנו יודעים את משקלו המולקולרי של החלבון לא ניתן לקבוע אם קיימת סטייה‬
‫כלשהי‪ ,‬אך אם היא קיימת היא יכולה לנבוע בין היתר מבעיה בהטענת הדגימה על גבי הג'ל‪.‬‬
‫בנוסף יש לזכור כי כל החישובים נעשו על סמך סרגל‪-‬שיטת מדידה שאינה מדויקת כל כך‪.‬‬

‫תשובות לשאלות מסכמות‪:‬‬

‫שאלה ‪ :1‬האם ניתן להסתכל על רקמה‪/‬תאים חיים במיקרוסקופ אלקטרוני? הסבר‪.‬‬

‫תשובה ‪ :1‬באופן כללי‪ ,‬לא ניתן לצפות בתאים חיים ורקמת חיות‪ ,‬באמצעות מיקרוסקופ‬
‫אלקטרוני‪.‬‬
‫הבעיה העיקרית בצפייה בתאים חיים על ידי מיקרו' אלקטרוני היא שלב ההכנה של הדגימה‪.‬‬
‫ההכנה כוללת בדרך כלל ייבוש של הדגימה(עקב היותו של החלל בתוך מיקרו'‬
‫האלקטרונים‪-‬וואקום)‪ ,‬הקפאה(לצורך החיתוך של הדגימה לפיסות מאוד קטנות על ידי סכין‬
‫זכוכית)‪ ,‬והוספה של יוני מתכות כבדים(לצורך הגברת החדות) ו‪/‬או מולקלות סמן‬
‫אימונולוגיות(לצורך זיהוי ספציפי של מולקלות ספציפיות) ו‪/‬או חומרי צבע שונים‪.‬‬
‫בתקופה האחרונה‪ ,‬הופיע פיתוח מחודש של המיקרוסקופ‪-‬‬
‫)‪ , Environmental scanning electron microscopy (ESEM‬אשר מסוגל‪ ,‬לצפות בדגימות‬
‫"רטובות"‪ .‬מיקרוסקופ זה משתמש בקיטור כמקור "לחות"‪ ,‬לאחר שלב הייבוש והקירור כפי‬
‫שהוסבר לעיל‪ ,‬וממזער עד כמה שניתן את הנזק שנגרם על ידי הקיטור לתנועת האלקטרונים‪.‬‬
‫המכשיר אף משתמש במול' המים‪ ,‬ליצירת אלקטרונים שניוניים‪ ,‬שמסוגלים לסייע בהפקת‬
‫תמונת פני השטח של הדגימה בחדות ראוייה‪.‬‬
‫על פי מה שידוע עד כה‪ ,‬ניתן היה לצפות באמצעות מיקרוסקופ ה‪ ESEM‬בתאי תירס‪ ,‬בשלב‬
‫גדילה‪.‬‬
‫סכימת התהליך מוצגת בעמוד הבא‪-‬‬
 ‫שאלה ‪ :2‬האם ניתן לצפות ברקמה‪/‬תאים שלא נצבעו במיקרוסקופ אלקטרוני? אם כן הסבר‬
‫כיצד‪.‬‬
‫תשובה ‪ :2‬לא ניתן לצפות בתאים ורקמות שלא נצבעו במיקרוסקופ אלקטרונים‪.‬‬
‫האלקטרונים‪ ,‬שמשוגרים אל הדגימה‪ ,‬חוזרים אחורה בכיוון שנמצא ביחס ישר למספר‬
‫האטומי של היסודות המרכיבים את המולקלות בתאים וברקמות‪ .‬לפיכך‪ ,‬ככל שהמספר‬
‫האטומי של היסודות יהיה גדול יותר‪ ,‬כך החדות של התמונה‪ ,‬תהיה גדולה יותר‪.‬‬
‫יסודות המרכיבים את התאים‪-‬פחמן‪ ,‬מימן‪ ,‬חמצן וחנקן‪ ,‬בעלי מספר אטומי נמוך יחסית‪ .‬לכן‪,‬‬
‫תתקבל חדות נמוכה‪ ,‬שלא תייצג נכוחה את המצב בתאים‪ .‬לכן‪ ,‬יש להוסיף לתאים‪ ,‬תמיסת‬
‫מלח המכילה מתכות כבדות(כמו זהב ואורניום)‪ .‬ניתן להוסיף את יוני המתכות הכבודות‬
‫באמצעות שיטה אימונולוגית‪-‬מוסיפים לדגימה נוגדנים הנקשרים למולקולות ואיזורים‬
‫מבוקשים(לדוגמא‪-‬כרומוזום)‪ ,‬אשר אליהם נקשרים לאחר מכן‪ ,‬נוגדנים שניוניים‪ ,‬שמחוברים‬
‫למתכת כבדה כלשהיא‪.‬‬
‫עוצמות שונות של חדות מכוונת על ידי משך שהיית הדגימה עם המלחים‪ ,‬ככל שהיא תהיה‬
‫יותר ארוכה‪ ,‬החדות תהיה גדולה יותר‪.‬‬

‫שאלה ‪ :3‬ציינו לפחות ‪ 3‬יתרונות לשיטת ברדפורד‪.‬‬

‫תשובה ‪ :3‬יתרונות השימוש בשיטת ברדפורד‪:‬‬
‫א) פשטות השיטה‪ -‬שיטה זו דורשת שימוש בריאגנט אחד בלבד‪ ,‬זאת לעומת שיטה מקובלת‬
‫אחרת בשם שיטת ‪ Lowry‬הכוללת מספר ריאגנטים‪ .‬אומנם נחשבת מסורבלת יותר משיטת‬
‫הכימות בעזרת ‪ UV‬שהשיטה ברדפורד מצריכה עקום כיול‪ ,‬אך כשמדובר בדגימות רבות היא‬
‫דווקא פשוטה יותר‪.‬‬
 ‫ב) מהירות‪ -‬שיטה זו מהירה‪ ,‬דבר המתבטא בכך שתוך ‪ 5‬דקות מתקבלת התוצאה‪ .‬לעומת זאת‬
‫בשיטת ‪ Lawory‬משך הריאקציה היא כ‪ 50 -‬דקות‪.‬‬
‫ג) יציבות הקשר‪ -‬הצבע שמתקבל לאחר ‪ 5‬דקות נשאר יציב במשך שעה‪.‬‬
‫ד) רגישות לחומרים‪ -‬ריאקצית הצבע כמעט ואינה מושפעת מרוב החומרים הנמצאים בתמיסה‪.‬‬
‫זאת לעומת שיטות אחרות כגון‪ Lowry :‬שאחד מחסרונותיה הבולטים הוא רגישה להפרעה של‬
‫חומרים כמו אמוניום סולפט ו‪Buiret -‬שגם חסרונה מתבטא בכך שישנם מספר חומרים‬
‫המפריעים לקביעת חלבון (לדוגמה בופר טריס)‪.‬‬

‫שאלה ‪ :4‬ציינו את חשיבות הכנת עקומת כיול בשיטת ברדפורד‪.‬‬

‫תשובה ‪ :4‬שיטת ברדפורד משמשת כשיטה לקביעת ריכוז חלבון‪ .‬שיטה זו מתבססת על‬
‫קשירת הצבע ‪ Coomasie Brilliant Blue‬לחלבון‪ ,‬קשירה אשר גורמת לשינוי צבע התמיסה‬
‫ובעצם לשינוי פיק הבליעה המקסימלי של הצבע מאורך גל של ‪ nm 465‬ל‪ .nm 595 -‬את‬
‫הבליעה המתקבלת ניתן למדוד בספקטרופוטומטר באורך גל של ‪ ,nm 595‬בליעה זו נמצאת‬
‫ביחס ישר לכמות החלבון‪ .‬החיסרון בשיטה זו הוא ברגישותה הגבוהה למגיבים חנקניים‬
‫ולדטרגנטים המשמשים להפרדת חלבונים במערכות המכילות ליפידים‪ .‬בנוסף לכך קיימת‬
‫חפיפה בבליעת האור בין תמיסת ברדפורד קשורה לבלתי קשורה‪ .‬כל הנ"ל מהווים רעשי רקע‪,‬‬
‫שכדי להתגבר עליהם בונים עקום כיול‪ .‬עקום הכיול בעצם מאפשר התחשבות בהפרעות הללו‬
‫במהלך הבדיקה ללא פגיעה משמעותית באמינות הניסוי‪.‬‬
‫מעבר לכך יש לזכור ששיטת ברדפורד היא שיטה המתבססת על ריאקציה קולומטרית ועקום‬
‫כיול‪ ,‬ומכאן חשיבותו הגדולה של עקום הכיול שכן ללא עקום הכיול לא היינו יכולים למצוא את‬
‫הריכוז של התמיסה הנבדקת‪.‬‬

‫שאלה ‪ :5‬ציינו לפחות ‪ 3‬יתרונות בהפרדת חלבונים בג'ל פוליאקרילאמיד על‪-‬פני שיטות הפרדה‬
‫אחרות‪.‬‬
‫תשובה ‪ :5‬בצורה כללית ניתן לחלק את שיטות ההפרדה של חלבונים ל‪:4-‬‬
‫א) הפרדה לפי מטען‪ :‬מחליפי אניונים קטיונים ואלקטרופורזה‪.‬‬
‫ב) הפרדה לפי גודל‪ :‬אלקטרופורזה דנטורטיבית ((‪ ,SDS-PAGE‬דיאליזה ו‪.Gel filtration-‬‬
‫ג) הפרדה לפי קשירה ספציפית (אפיניות)‪.Affinity Chromatography :‬‬
‫ד) הפרדה על סמך מסיסות‪.‬‬
‫להפרדת חלבונים על ג'ל פוליאקרילאמיד היתרונות הבאים‪:‬‬
‫* בחלק מן השיטות ההפרדה‪ ,‬לדוג' ‪ ,Gel filtration‬יש השפעה למבנה המרחבי של החלבון‬
‫דבר המשבש את אמינות השיטה במקרים מסוימים‪ .‬בהפרדה על ג'ל פוליאקרילאמיד יש‬
‫שימוש ב‪ SDS-‬אשר מפרק את מבנה החלבון ובכך מעניק לכל החלבונים צורה אחידה ומבטל‬
‫את גורם הצורה בנדידה של החלבון לכיוון אלקטרודה מסוימת‪.‬‬
‫* בהפרדת חלבונים על ג'ל פוליאקרילאמיד ניתן לנתח תמיסה המכילה חלבונים שונים‪ .‬שיטה‬
‫זו משמשת למשל למציאת מספר סוגי החלבונים הנמצאים בתמיסה מסוימת או לקבלת‬
 ‫הערכה של כמות חלבון לפי עוצמת הצביעה‪ .‬אפשרות זו של ניתוח התמיסה אינה מתאפשרת‬
‫ברבות מן השיטות האחרות האפשרות הפרדת חלבון גרידא‪.‬‬
‫* הרבה מהשיטות הנן ספציפיות להפרדת חלבון אחד בודד בכל הפעלה של השיטה ניתן לבודד‬
‫חלבון אחד בלבד מתערובת החלבונים‪ .‬לעומת זאת בהפרדה על ג'ל פוליאקרילאמיד ניתן‬
‫בהעמסה אחת‬
‫* תכונה רציפה‬
‫* בהפרדה לפי קשירה ספציפית יש לדעת על החלבון‬
‫לודיש‬

‫שאלה ‪ :6‬סטודנט הריץ חלבון בעל ‪ 4‬תת‪-‬יחידות בגדלים שונים (‪25kDa, 37kDa, 50kDa,‬‬
‫‪ )75kDa‬בג'ל פוליאקרילאמיד ‪ .10%‬בקבלת תמונת החלבונים‪-‬במה טעה הסטודנט?‬
‫תשובה ‪ :6‬הסטודנט הריץ את החלבון עם ‪ sample buffer‬החסר ‪mercaptoethanol β.‬‬
‫‪ mercaptoethanol β‬הינו חומר מחזר הגורם לפתיחת קשרי ‪ s-s‬ובכך מסייע לפתיחת המבנה‬
‫הרביעוני של החלבון‪ .‬אילו היה הסטודנט מריץ את החלבון עם ‪ sample buffer‬שאינו חסר‬
‫היה מקבל תמונת חלבונים ובה מס' בנדים‪ 4 ,‬במספר‪ ,‬עבור כל תת יחידה בהתאם לגודלה‪-‬‬
‫‪ . 25kDa, 37kDa, 50kDa, 75kDa‬אומנם מאחר וה‪ sample buffer -‬אותו הריץ הסטודנט‬
‫חסר ‪ mercaptoethanol β‬לא התרחשה פתיחת המבנה הרביעוני של החלבון והפרדתו לתת‬
‫יחידותיו ולכן התמונה שהתקבלה היא של החלבון השלם‪.kDa187 -‬‬

‫בביוגרפיה‪:‬‬
‫"פרקים בביוכימיה" ‪ /‬ע‪ .‬פרימן‪ ,‬ס‪ .‬אברמוב‪ ,‬מרכז הפרסומים ה"ח‪.1994 ,‬‬
‫‪http://www.bgu.ac.il/biomedeng/coursim/gimel/36712011‬‬
‫‪http://www.telhai.info/up/$1140657222_.doc‬‬
‫‪http://hl2.bgu.ac.il/users/www/19266/%D7%91%D7%99%D7%95%D7%9B‬‬
‫‪%D7%99%D7%9E%D7%99%D7%94/%D7%97%D7%9C‬‬
‫‪%D7%91%D7%95%D7%A0%D7%99%D7%9D.doc‬‬
‫?‪http://demo.ort.org.il/ortforums/scripts/forum_msg_show.asp‬‬
‫‪pc=874656456&msgID=308230721‬‬
‫‪,http://www.bgu.ac.il/biomedeng/coursim/gimel/36712011/BME3.ppt#297,23‬‬
‫שקופית ‪23‬‬
‫‪http://clickit.ort.org.il/files/upl/177340477/150849694.doc‬‬
‫ויקיפדיה‬