Điểm nổi bật

•
DART-MS, GC – MS và LC-MS đượ c sử dụ ng để phân tích các mẫ u hạ t
tiêu đen và kết quả củ a chúng đượ c so sánh;
•
Hóa họ c đã đượ c áp dụ ng để phân loạ i các mẫ u hạ t tiêu đen dự a trên
nguồ n gố c củ a chúng;
•
DART-MS đã đượ c chứ ng minh là mộ t phương pháp đơn giả n và hiệu
suấ t cao để nghiên cứ u phân biệt nguyên liệu thự c phẩ m.
trừu tượng
Nghiên cứ u hiện tạ i áp dụ ng sắ c ký khí-khố i phổ (GC-MS), sắ c ký lỏ ng-khố i
phổ (LC-MS) và phân tích trự c tiếp giả i hấ p nhiệt trong phương pháp khố i phổ
thờ i gian thự c (TD-DART-MS) để phân tích màu đen tiêu (Piper nigrumL.)
mẫ u từ các quố c gia khác nhau. Các mẫ u bộ t hạ t tiêu đen đượ c phân tích trự c
tiếp bằ ng TD-DART-MS mà không cầ n chiết xuấ t gì, nhưng đố i vớ i phương
pháp GC-MS và LC-MS, quy trình chiết xuấ t metanol đượ c sử dụ ng trướ c khi
phân tích. Các hợ p chấ t khác nhau, chẳ ng hạ n như piperamide và tecpen, đã
đượ c phát hiện. Phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhấ t từ ng phầ n (PLS-
DA) đượ c sử dụ ng để phân loạ i các mẫ u hạ t tiêu đen dự a trên nguồ n gố c củ a
chúng. Cấ u hình dữ liệu phổ khố i lượ ng ion tổ ng (TMS) từ các phương pháp
GC – MS, LC-MS và TD-DART-MS đã đượ c xây dự ng và đánh giá về hiệu suấ t
phân loạ i. Mộ t phép biến đổ i dữ liệu căn bậ c ba đã đượ c thử nghiệm trong quá
trình tiền xử lý dữ liệu và đượ c thấ y là có hiệu quả để cả i thiện tỷ lệ phân
loạ i. Tỷ lệ phân loạ i trung bình củ a các mô hình PLS-DA vớ i GC – MS-căn bậ c
ba-TMS, LC-MS-căn bậ c ba-TMS, và các biểu diễn dữ liệu DART-MS-khố i-
gố c-TMS lầ n lượ t là 94,1 ± 0,6%, 87,7 ± 0,6% và 97,0 ± 0,3% để xác thự c chéo
phân vùng Latinh khở i độ ng 100 lầ n. Nghiên cứ u này lầ n đầ u tiên trình bày
phân tích nguyên liệu thự c phẩ m có nguồ n gố c thự c vậ t bằ ng cách sử dụ ng
TD-DART-MS và nó đã đượ c chứ ng minh là mộ t phương pháp đơn giả n và
hiệu suấ t cao cho các nghiên cứ u phân loạ i.
Trừu tượng đồ họa
Từ khóa
Tiêu đen
DART-MS
Hóa họ c
GC – MS
LC-MS
Phân loạ i
Các từ viết tắt
CDF
định dạ ng tài liệu chung củ a mạ ng
CID
sự phân ly do va chạ m
DART-MS
phân tích trự c tiếp trong khố i phổ thờ i gian thự c
EIC
sắ c ký đồ ion chiết xuấ t / biểu đồ thờ i gian
ESI
sự ion hóa tia điện
FIMS
khố i phổ phun dòng chả y
FTIR
Quang phổ hồ ng ngoạ i biến đổ i Fourier
GC – MS
sắ c ký khí khố i phổ
LC-MS
sắ c ký lỏ ng khố i phổ
MDA
3,4-methylenedioxyamphetamine
MDMA
3,4-methylenedioxy-methamphetamine
PLS-DA
phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhấ t mộ t phầ n
RMSEE
sai số gố c-trung bình-bình phương củ a ướ c tính
SPME
vi văn bả n pha rắ n
TIC
tổ ng sắ c ký đồ hiện tạ i ion / biểu đồ thờ i gian
TMS
tổ ng khố i lượ ng ion phổ
CAO CẤ P
tầ m quan trọ ng thay đổ i đố i vớ i phép chiếu
được sản xuất và xuất khẩu bởi một số quốc gia lớn. Tính đến năm 2019, Việt
Nam, Indonesia, Ấn Độ và Brazil là bốn nhà sản xuất tiêu đen hàng đầu,
chiếm khoảng 72% sản lượng tiêu đen toàn cầu (Sawe, 2019).
đã được sử dụng để phân cụm năm mươi mốt giống tiêu đen (Mathew,
Mathew, & Kumar, 2001). Các kỹ thuật giải trình tự DNA như Simple
Sequence Repeat hoặc microsatellite đã được chứng minh là những công cụ
hữu ích để phân biệt ớt đen có nguồn gốc khác nhau dựa trên sự biến đổi di
truyền (Joy, Prasanth, & Soniya, 2011; Wu, Fan, Hu, Wu, & Hao , 2016). Các
phương pháp hình thái học đòi hỏi kiến thức và kinh nghiệm sâu rộng để xác
định chính xác và có thể do con người sai sót. Sự nhiễm bẩn hoặc suy thoái
DNA trước khi khuếch đại làm hạn chế các ứng dụng của các phương pháp
di truyền. Lập hồ sơ hóa học, cùng với phép đo hóa học, có thể là một giải
pháp thay thế tốt cho việc phân loại hạt tiêu đen. Các kỹ thuật phân tích
truyền thống, chẳng hạn như quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)
và sắc ký khí với đầu báo ion hóa ngọn lửa (GC-FID), đã được sử dụng trong
các nghiên cứu trước đây (Lafeuille, Fregiere-Salomon, Michelet, & Henry,
2020; Lima, Batista , Jesus, Silva, Araújo, & Santos, 2020; Mengliang Zhang
& de B. Harrington, & Chen, 2015). Tuy nhiên, phương pháp FTIR thường
được sử dụng để phát hiện các vật liệu bị tạp nhiễm như mùn cưa, vỏ quả óc
chó, hạt đu đủ trong hạt tiêu đen và sẽ không có đủ khả năng phân giải để
phân biệt ớt đen có nguồn gốc sinh trưởng khác nhau (Lafeuille et al., 2020;
Lima & Batista, Jesus, Silva, Araújo và Santos, 2020). Ngoài ra, các phương
pháp dựa trên GC tốn nhiều công sức và thường đòi hỏi thời gian chuẩn bị
mẫu và phân tích dụng cụ kéo dài. Phân tích trực tiếp trong khối phổ thời gian
thực (DART-MS) là một kỹ thuật mới nổi đã thu hút sự chú ý đáng kể đối với
phân tích hóa học trong các ma trận phức tạp vì tính đơn giản và hiệu quả
của nó (Barnett, Bailey, & Zhang, 2019; Dong et al., 2019 ; Liang, Frazier,
Benefield, Chong, & Zhang, 2020). Một số nghiên cứu đã báo cáo việc sử
dụng DART-MS để phân tích nguyên liệu thực phẩm như tỏi (Block, Dane,
Thomas, & Cody, 2010), nho (Jastrzembski, Bee, & Sacks, 2017) và lá rau
bina (Singh, 2016). Tuy nhiên, các mẫu phải được chiết xuất bằng dung môi
hữu cơ được chọn hoặc vi pha rắn (SPME) trong các nghiên cứu này, làm
giảm lợi thế của việc chuẩn bị mẫu tối thiểu trong phương pháp DART-MS.
Gần đây, một giai đoạn gia nhiệt giải hấp thụ nhiệt đã được giao tiếp với
DART-MS để mở rộng khả năng phân tích và cung cấp thêm thông tin về độ
bay hơi của hóa chất khi áp dụng một gradient nhiệt độ mong muốn (Maric,
Marano, Cody, & Bridge, 2018). DART-MS giải hấp nhiệt (TD- DART-MS) đã
được sử dụng trong một số ứng dụng pháp y (Bridge & Maric, 2019; Liang và
cộng sự, 2020), cho thấy một số ưu điểm so với DART-MS truyền thống,
chẳng hạn như giảm ion hiệu ứng triệt tiêu, khối phổ ít phức tạp hơn và thứ
nguyên nhiệt độ / thời gian bổ sung vào dữ liệu DART-MS. Tuy nhiên, kỹ
thuật này chưa bao giờ được áp dụng cho các vật liệu liên quan đến thực
phẩm. Mục tiêu của nghiên cứu này là khám phá tiềm năng của kỹ thuật TD-
DART-MS trong việc phân biệt tiêu đen được trồng ở các nước sản xuất hàng
đầu thế giới, bao gồm Việt Nam, Indonesia, Ấn Độ và Brazil. Các phương
pháp phân tích thông thường như GC-MS và LC-MS cũng được áp dụng, và
kết quả của chúng được so sánh. Dữ liệu tương ứng được tiếp tục xử lý bằng
các phương pháp đo hóa học, chẳng hạn như phân tích phân biệt bình
phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA), và các mẫu được phân loại dựa trên
nguồn gốc quốc gia của chúng. Việc chuyển đổi dữ liệu đã được đánh giá
trong bước tiền xử lý dữ liệu và được chứng minh để cải thiện tỷ lệ phân loại
PLS-DA bằng cách xác nhận chéo với các phân vùng Latin khởi động 100
lần. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu này trình bày báo cáo
đầu tiên về việc sử dụng TD-DART-MS để phân tích nguyên liệu thực phẩm.
TD-DART-MS đã được chứng minh là một công cụ đầy hứa hẹn cho các
nghiên cứu lập hồ sơ hóa học và nguồn gốc thực phẩm, vốn rất cần thiết để
đảm bảo chất lượng và tính xác thực của thực phẩm. 2. Vật liệu và phương
pháp 2.1. Vật liệu và thuốc thử 17 mẫu tiêu đen đích thực được lấy từ thư
viện của McCormick & Company, Inc. (Sparks, MD, USA). Nước, axetonitril,
metanol và axit formic là loại LC-MS (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA).
2.2. Dụng cụ và điều kiện
Hệ thống GC – MS bao gồm khối phổ kế Shimadzu QP2010S với bộ lấy mẫu
tự động (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản). Kim phun GC được đặt ở 280 ◦C và
các chất phân tích được tách trên cột mao quản SHRCI-5MS, 30 m × 0,25
mm ID được liên kết hóa học với 5% diphenyl / 95% dimethyl polysiloxan ở độ
dày màng 0,1 µm (Shimadzu Scientific Instruments Inc Columbia, MD, Hoa
Kỳ). Dòng heli không đổi 1 mL / phút được sử dụng, trong đó độ phân chia cố
định khoảng 1:50 đi vào cột. Nhiệt độ cột được lập trình như sau: 50 ◦C, giữ
trong 2 phút, dốc ở 15 ◦C / phút đến 290 ◦C, giữ trong 10 phút. Nhiệt độ dòng
chuyển và nguồn ion được duy trì ở 290 C và 250 C. Chế độ quét toàn bộ đã
được chọn cho khối phổ kế và phạm vi quét từ m / z 33 đến 400. Các phép
phân tích LC-MS được thực hiện bằng cách sử dụng khối phổ kế Thermo
LTQ XL với hệ thống Dionex ™ UltiMate ™ 3000 UHPLC bao gồm Máy bơm
bậc bốn tiêu chuẩn Dionex ™ UltiMate ™ LPG-3400SD, Máy lấy mẫu tự động
tấm giếng tiêu chuẩn Dionex ™ UltiMate ™ và Dionex 3000 buồng cột
(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA). Việc phân tách được thực hiện trên
cột C18 pha đảo ngược (ZORBAX Eclipse XDB, 250 × 3.0 mm id, 5 µm) với
Bộ lọc trong dòng UltraLine UHPLC (RESTEK, Bellefonte, PA, USA) trong lò
cột ở nhiệt độ của 25 ℃. Pha động bao gồm sự kết hợp của A (0,5% axit
fomic trong nước, v / v) và B (axetonitril). Gradient nhị phân sử dụng chương
trình với tốc độ dòng 0,5 mL / phút như sau: 31% B, giữ trong 3 phút, tăng từ
31 đến 55% B ở 30 phút, từ 55 đến 90% B ở 40 phút, giữ 50 phút Khối phổ kế
được vận hành ở chế độ ion hóa dương. Các điều kiện được thiết lập như
sau: khí vỏ bọc ở 35 (đơn vị tùy ý), khí phụ và khí quét ở 15 (đơn vị tùy ý),
điện áp phun ở 3,5 kV, nhiệt độ mao quản ở 500 ◦C, điện áp mao quản ở 10
V, và ống thấu kính ở 55 V. Đối với các thí nghiệm quét toàn bộ, phạm vi khối
lượng là từ m / z 50 đến 1000. Đối với thí nghiệm quét phụ thuộc vào dữ liệu,
ion cường độ cao nhất đã được chọn để cung cấp các ion sản phẩm MS2 của
chúng với năng lượng va chạm chuẩn hóa ở 35 %. Đối với các thí nghiệm
DART-MS trong nghiên cứu này, một Thermo LTQ XL MS (Thermo Scientific,
Darmstadt, Đức) đã được kết hợp với một nguồn ion DART (IonSense inc.,
Saugus, MA, USA). Phạm vi khối lượng được đặt trong khoảng m / z từ 50–
1000 và hoạt động ở chế độ ion dương. Máy sưởi DART được đặt ở 500 ℃.
Hệ thống gradient nhiệt độ IonRocket (Biochromato, San Diego, CA, USA)
được sử dụng để phân tích DART-MS (TD-DART-MS) giải hấp nhiệt, và
chương trình nhiệt độ như sau: 30 ℃, giữ trong 1,0 phút, tăng lên nhiệt độ
đến 600 ℃ với tốc độ 100 ℃ / phút, và giữ trong 1,0 phút. Có thể tìm thấy sơ
đồ thiết lập TD-DART-MS trong Hình S1. 2.3. Chuẩn bị mẫu Hai mươi
miligam mỗi mẫu đất khô được trộn với 10 mL metanol trong các ống ly tâm
15 mL. Tất cả các mẫu được ngâm trong nồi cách thủy trong 1 giờ ở nhiệt độ
phòng. Nước trong máy hút âm được thay thế bằng nước mới khử ion từ hệ
thống lọc nước (PureLab Ultra, ULGA, Buckinghamshire, Anh Quốc) giữa các
mẻ khác nhau để duy trì cùng nhiệt độ ban đầu cho quá trình chiết xuất. Sau
đó, các mẫu được ly tâm ở 5000 g trong 15 phút, và phần nổi phía trên được
lọc qua bộ lọc ống tiêm nylon 0,22 µm (Celltreat Scientific Products,
Pepperell, MA, USA). Thể tích tiêm cho các thí nghiệm GC-MS và LC-MS
tương ứng là 1 µL và 20 µL. Tất cả các chiết xuất mẫu được phân tích ba lần
với thiết kế khối ngẫu nhiên. Đối với DART- MS, khoảng 2 mg bột hạt tiêu đen
(BPP) được nạp vào nồi đựng mẫu bằng đồng dùng một lần, sau đó được đặt
trên thiết bị giải hấp nhiệt. Một ống nối chữ T bằng thủy tinh được đặt trên
mẫu để hướng các hợp chất được khử hấp thụ khỏi mẫu để phân tích trực
tiếp bằng DART-MS. 2.4. Phân tích dữ liệu Dữ liệu GC – MS (tệp QGD) đã
được chuyển đổi sang định dạng tài liệu chung của mạng (CDF) bằng phần
mềm nguồn mở OpenChrom Ấn bản cộng đồng. Đối với dữ liệu được thu
thập từ LC-MS và DART-MS, các tệp RAW thu được đã được chuyển đổi
thành tệp CDF bằng phần mềm Xcalibur “Công cụ chuyển đổi tệp”. Các tệp
CDF được đọc trực tiếp vào MATLAB 2018b (MathWorks Inc., Natick, MA)
bằng cách sử dụng chức năng netcdf. MATLAB được sử dụng để xử lý trước
dữ liệu và SIMCA 14.1 (MKS Umetrics, Umea, Thụy Điển) được sử dụng cho
mô hình PLS-DA. Dữ liệu gốc từ các phân tích GC – MS, LC-MS và giải hấp
nhiệt DART-MS là ma trận ba chiều: thời gian × tỷ lệ khối lượng trên điện tích
(m / z) × cường độ. Đối với quá trình xử lý dữ liệu trong tương lai, các tập dữ
liệu được phân nhóm theo thời gian lưu giữ với gia số 0,01 phút và phân
nhóm theo m / z với gia số 1. Dữ liệu tổng khối lượng phổ một chiều (TMS)
được xây dựng bằng cách tính tổng theo chiều thời gian của ma trận dữ liệu
ba chiều được phân loại. Việc chuyển đổi dữ liệu với các hàm gốc thứ n đã
được chứng minh là làm tăng hiệu quả các tính năng hóa học đặc trưng với
cường độ nhỏ hơn (Dong et al., 2019). Hàm bậc ba đã được thử nghiệm và
áp dụng cho các tập dữ liệu TMS trong quá trình tiền xử lý dữ liệu trong
nghiên cứu này. Chuẩn hóa được sử dụng để giảm thiểu ảnh hưởng của các
biến thể từ nồng độ mẫu và độ nhạy của thiết bị, và tất cả dữ liệu đã được
chuẩn hóa theo độ dài vectơ đơn vị (Barnett & Zhang, 2018; Wang, Chen, Yu,
& Harrington, 2013). PLS-DA là một kỹ thuật nhận dạng mẫu có giám sát cổ
điển để liên hệ ma trận X với vectơ Y hoặc với ma trận Y (Zhang &
Harrington, 2014). Trong nghiên cứu của chúng tôi, ma trận dữ liệu độc lập X,
chẳng hạn như dữ liệu GC-MS, LC-MS hoặc DART-MS, có thể được chuyển
đổi thành các biến tiềm ẩn để hồi quy với ma trận biến nhị phân phụ thuộc Y,
đại diện cho nguồn gốc quốc gia. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. So sánh dữ liệu
GC – MS, LC-MS và DART-MS Các kỹ thuật sắc ký kết hợp với khối phổ,
chẳng hạn như GC – MS và LC-MS, được sử dụng rộng rãi trong phân tích
thực phẩm. Hai nhóm chất chuyển hóa thứ cấp trong hạt tiêu đen có xu
hướng được các nhà nghiên cứu quan tâm nhất: piperamides và terpen.
Terpenes là những hợp chất dễ bay hơi mang lại mùi thơm độc đáo cho hạt
tiêu đen và chúng được phân tích chủ yếu bằng các phương pháp dựa trên
GC (Jirovetz, Buchbauer, Ngassoum, & Geissler, 2002; Kapoor et al., 2009;
Mengliang Zhang & de B. Harrington, & Chen, 2015). Piperamide chịu trách
nhiệm về độ cay, hương vị và hoạt tính sinh học của hạt tiêu đen, và LC-MS
thường được sử dụng để xác định piperamide (Chandra Bose. Kotte, Dubey,
& Murali, 2014; Friedman và cộng sự, 2008). Trong nghiên cứu này, các chiết
xuất metanol của các mẫu hạt tiêu đen được phân tích bằng cả hai phương
pháp GC – MS và LC-MS. Ngoài ra, các mẫu BPP được phân tích trực tiếp
bằng cách sử dụng TD-DART-MS. Sắc ký đồ / biểu đồ thời gian dòng ion tổng
đại diện (TIC) được xây dựng bằng cách tính tổng theo chiều m / z như các ví
dụ được trình bày trong Hình S2. Đối với phân tích GC-MS, các thành phần
hóa học được xác định một cách dự kiến dựa trên sự so sánh các chỉ số lưu
giữ và phổ khối của chúng từ các tài liệu hiện có và các thư viện phổ khối từ
Viện Công nghệ Tiêu chuẩn Quốc gia. Trong các nghiên cứu trước đây được
thực hiện bằng các phương pháp liên quan đến GC, tecpen là hợp chất tạo
mùi thơm chính gây ra mùi của các mẫu hạt tiêu đen và các sản phẩm tinh
dầu của chúng (Jirovetz và cộng sự, 2002; Kapoor và cộng sự, 2009).
Germacrene D, limonene, β-pinene, α-phellandrene, và β-caryophyllene đã
được xác định trong nghiên cứu của chúng tôi (Hình S2A và Bảng S1). Một
số piperamide, chẳng hạn như piperine và các đồng phân của nó, cũng được
quan sát thấy trong kết quả GC-MS. Trong các nghiên cứu trước đây, dung
môi chiết không phân cực như n-hexan hoặc vi pha rắn (SPME) với lớp phủ
sợi polyme không phân cực đã được sử dụng (Jirovetz và cộng sự, 2002;
Orav, Stulova, Kailas, & Muurisepp, 2004). Các dung môi chiết xuất này có
hiệu quả hơn một cách chọn lọc để chiết xuất các thành phần không phân
cực và / hoặc dễ bay hơi như tecpen. Do đó, người ta không phát hiện thấy
các piperamit như một nhóm các hợp chất tương đối phân cực và ít bay hơi.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, metanol được sử dụng làm dung môi chiết
để cả hai phương pháp GC-MS và LC-MS đều có thể phân tích các chất
chiết. Kết quả là, piperin dường như là đỉnh cao nhất trong các cấu hình GC –
MS TIC (ví dụ, RT 22,6 phút) của các chiết xuất BPP của chúng tôi.

Hơn 20 piperamide và các dẫn xuất đã được quan sát từ phân tích LC-MS
của các chất chiết xuất từ BPP (Hình. S2B). Các hợp chất này đã chứng minh
một số mẫu đặc trưng trong phổ khối lượng quét toàn phần ESI-MS và phổ
ion sản phẩm MS2. Các ion dimer proton hóa ([2 M + H] +) thường được phát
hiện trong phổ MS quét toàn bộ với các ion phân tử proton hóa ([M + H] +)
(Bảng S1), và các kết quả tương tự có thể được tìm thấy trong tài liệu khi
thiết bị LC-ESI-Q-TOF-MS đã được sử dụng (Chandra Bose. Kotte, et al.,
2014). Ngoài ra, các mảnh khối phổ cơ bản của piperamit đã được báo cáo
trong các nghiên cứu trước đây: m / z 201 (C12H9O3 +), 171 (C11H7O2 +)
và 143 (C10H7O +) được hình thành do sự phân cắt của gốc cacboxamit
(Chandra Bose. Kotte, và cộng sự, 2014; Friedman và cộng sự, 2008; Liu và
cộng sự, 2015). Mặc dù m / z 171 và 143 cũng được quan sát thấy trong một
số phổ ion sản phẩm MS2 trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng có mặt ở
cường độ tương đối thấp. Ion sản phẩm ở m / z 135 được phát hiện là một
ion chính, phù hợp với hầu hết các phổ ion sản phẩm của piperamit (Chandra
Bose. Kotte, et al., 2014; Liu et al., 2015); tuy nhiên, sự làm sáng tỏ cấu trúc
và con đường phân mảnh của nó không rõ ràng. Người ta nhận thấy rằng cấu
trúc cốt lõi của piperamides tương tự như một nhóm thuốc thiết kế riêng. Ví
dụ: việc đưa một gốc methylenedioxy vào amphetamine hoặc
methamphetamine dẫn đến ma túy bất hợp pháp, chẳng hạn như 3,4-
methylenedioxyamphetamine (MDA) hoặc 3,4-methylenedioxy-
methamphetamine (MDMA). Hơn nữa, các phân mảnh CID cho các hợp chất
bất hợp pháp này đã được nghiên cứu rộng rãi và m / z 135 được báo cáo là
một trong những ion phân mảnh đặc trưng để sàng lọc các dẫn xuất của MDA
và MDMA (Apollonio, Whittall, Pianca, Kyd, & Maher, 2006; Awad, DeRuiter,
& Clark, 2007; Bijlsma, Sancho, Hernandez, ´ & Niessen, 2011; Montesano và
cộng sự, 2013). Dựa trên các tài liệu hiện có, một con đường phân mảnh
chung được đề xuất trong Hình S3 mà từ đó m / z 135 tương ứng với cation
3,4-methylenedioxybenzyl (C8H7O2 +). Điều đáng chú ý là cấu trúc đồng
phân lập thể của piperamide tồn tại rộng rãi trong các chất chiết xuất từ hạt
tiêu đen. Ví dụ, có tám đồng phân cis – trans của piperettine về mặt lý thuyết
(Friedman và cộng sự, 2008), nhưng dữ liệu được sử dụng trong nghiên cứu
này không cho phép chỉ định cấu trúc cụ thể cho từng đồng phân. Tất cả các
pic sắc ký quan trọng được xác định là piperamide và các dẫn xuất của nó, và
các tecpen không được quan sát thấy. Hầu hết các tecpen trong các chất
chiết xuất là các hợp chất không phân cực, vì vậy chúng không thể được ion
hóa một cách hiệu quả bởi ESI. Hơn nữa, hàm lượng tecpen trong chiết xuất
BPP thấp cũng dẫn đến khó phát hiện. Chronogram từ phân tích TD-DART-
MS của BPP được hiển thị trong Hình S2C. Không có kỹ thuật sắc ký nào
tham gia vào quá trình này. Các hợp chất được khử hấp thụ khỏi các mẫu bột
bằng chương trình nhiệt độ nhanh (tức là 100 ◦C / phút từ 30 đến 600 ◦C) dựa
trên tính dễ bay hơi của chúng và đạt được sự phân tách nhẹ. Như được thể
hiện trong Hình 1A, thời gian giải hấp đối với các đồng phân pellitorine và
piperettine (ví dụ, m / z 224 và 312, tương ứng) từ các mẫu BPP được phân
tích bởi TD-DART-MS khác nhau khoảng 1 phút. Tuy nhiên, hai đỉnh trong
biểu đồ thời gian ion chiết xuất (EIC) trùng nhau. Các pic sắc ký của hai đồng
phân piperettine được phân giải tốt trên EIC từ phép phân tích LC-MS, và
chúng cũng được tách khỏi pic pellitorine,
giải hấp nhiệt DART-MS (A) và từ các chất chiết xuất từ hạt tiêu đen được
phân tích bằng LC-MS (B). Lưu ý: EIC là viết tắt của “chương trình thời gian
ion chiết xuất” cho dữ liệu DART-MS và “sắc ký đồ ion chiết xuất” cho dữ liệu
LC-MS hoặc GC-MS. được trình bày trong Hình 1B. Thứ tự thời gian của các
đỉnh đồng phân pellitorine và piperettine bị đảo ngược giữa EIC từ TD-DART-
MS và LC-MS vì cơ chế phân tách khác nhau của chúng: tính bay hơi và
phân cực hóa học. Hình 2 cho thấy sự so sánh của phổ MS đối với piperine
được thu thập bằng các phương pháp MS khác nhau. Đối với LC-MS, cả ion
phân tử proton hóa (m / z 286) và ion dimer proton hóa (m / z 571) đều được
tìm thấy trong phổ khối lượng quét đầy đủ (Hình 2A). Các ion đặc trưng, bao
gồm m / z 201 và 135, được quan sát thấy trong phổ ion sản phẩm (Hình 2B).
Nhiều mảnh vỡ hơn xuất hiện trong phổ khối lượng EI (Hình 2C) từ phân tích
GC – MS do các điện tử có năng lượng cao (70 eV) được sử dụng trong EI.
Các ion phân tử (M +, m / z 285) của piperin được xác định trong phổ khối
lượng EI. Phổ DART-MS cho piperine tương tự như phổ LC-MS nhưng có
mức độ phong phú tương đối thấp hơn của các ion dimer proton hóa (m / z
571) (Hình 2D). Heli metastable (He *) từ DART có năng lượng 19,8 eV và ion
hóa nước trong khí quyển trước tiên, sau đó chuyển proton đến các phân tử
trong dòng khí để tạo ra chủ yếu [M + H] + cation (Cody, Laramee, & Durst,
2005). Các cơ chế ion hóa khác nhau dẫn đến các phổ MS khác biệt trong
Hình 2. Nhìn chung, so với EI, phổ DART-MS có ít mảnh hơn. So với ESI, các
ion phụ như gắn cation kim loại kiềm cũng hiếm khi được quan sát thấy. 3.2.
Hiệu suất tổng thể của các phương pháp khác nhau để phân tích BPP Cả hai
kỹ thuật GC-MS và LC-MS đều hiệu quả và mạnh mẽ để phân tích các chất
chuyển hóa thứ cấp đã chọn trong dịch chiết mẫu BPP. TD-DART-MS không
thể mang lại hiệu quả phân tách tương đương cho hỗn hợp các hợp chất
trong nền phức so với các phương pháp sắc ký truyền thống khác, nhưng nó
cung cấp các cơ hội mới cho việc lập hồ sơ hóa thực vật có năng suất cao và
phân biệt giữa các nguyên liệu thực vật khi kết hợp với phép đo hóa học.
Không giống như các phương pháp GC-MS và LC-MS yêu cầu chuẩn bị mẫu
tốn nhiều thời gian và công sức, các mẫu BPP được phân tích trực tiếp bằng
TD-DART-MS mà không cần đến các quy trình chiết xuất, lọc và cô đặc. Thời
gian chạy phân tích đối với phương pháp DART-MS đã giảm xuống còn 8
phút so với 50 phút đối với phương pháp LC-MS và 30 phút đối với phương
pháp GC-MS. Phương pháp DART-MS cũng sạch và thân thiện với môi
trường vì không có dung môi hữu cơ nào được sử dụng để chuẩn bị mẫu và
phân tích thiết bị. Các phương pháp lấy dấu vân tay phổ không sắc ký khác
như khối phổ phun dòng (FIMS) đã được sử dụng để phân biệt thực phẩm và
thực vật (Chen, Sun, & Ford, 2014; Sun & Chen, 2011; Jianghao Sun et al.,
2018 ); tuy nhiên, phương pháp FIMS có thể gặp phải vấn đề ức chế ion hạn
chế khả năng bộc lộ sự khác biệt nhỏ giữa các mẫu (Geng, Zhang, Harnly,
Luthria, & Chen, 2015).
Như đã mô tả trước đây, một số lượng nhỏ các ion phụ và ion phân mảnh
được hình thành trong phổ DART-MS, vì vậy DART-MS đơn giản hóa việc
giải thích khối phổ và cung cấp độ nhạy tốt cho chất phân tích bằng cách
không lan truyền dòng ion qua nhiều kênh dữ liệu hơn (Cody và cộng sự,
2005). Sự hình thành các dimer liên kết không hóa trị trong ESI và các kỹ
thuật ion hóa khác được cho là phụ thuộc vào sự tập trung (Ding & Anderegg,
1995; Forbes & Verkouteren, 2019; Stefansson, Sjoberg, ¨ & Markides, 1996).
Tuy nhiên, các ion dimer piperine từ các mẫu hạt tiêu đen bằng phương pháp
giải hấp nhiệt DART-MS được phát hiện chủ yếu bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ
giải hấp và điều này được thể hiện rõ ràng từ dữ liệu được trình bày trong
Hình S4. Cường độ cao nhất của các ion dimer được quan sát ở khoảng 400
◦C, trong khi các ion đơn phân piperine cho thấy mức độ phong phú cao nhất
ở khoảng 300 ◦C. Hiện tượng phụ thuộc nhiệt độ này đối với sự hình thành
dimer cũng đã được quan sát thấy trong một nghiên cứu khác, trong đó gốc
nitrat pha khí được sử dụng để oxy hóa và ion hóa limonene, mặc dù cơ chế
chưa rõ ràng (Faxon, Hammes, Le Breton, Pathak, & Hallquist, 2018). Kết
luận, TD-DART-MS đã cho thấy lợi thế của nó về thông lượng mẫu cao, dễ
sử dụng, nhu cầu chuẩn bị mẫu tối thiểu và tính bền vững về môi trường cho
phân tích BPP trong nghiên cứu của chúng tôi. Nó có thể là một công cụ có
giá trị để kiểm soát chất lượng và nghiên cứu xác thực hạt tiêu đen cũng như
các nguyên liệu thực phẩm khác.

Fig. 2. Piperine mass spectra under different instrument conditions: (A) ESI-MS full scan mass spectrum;(B) ESI-MS2 product ion spectrum of the [M+ H] + molecular

3.3. Phân loại hạt tiêu đen dựa trên xuất xứ Cấu hình phổ khối lượng ion tổng
(TMS) được xây dựng bằng cách tổng hợp theo chiều thời gian của dữ liệu
GC-MS, LC-MS và TD-DART-MS ba chiều ban đầu. Biểu diễn dữ liệu TMS
kết hợp với đo hóa học đã được sử dụng cho các nghiên cứu phân loại và
phân biệt khác nhau, khai thác lợi thế của kích thước dữ liệu nhỏ hơn, khả
năng chống ảnh hưởng của sự thay đổi thời gian lưu và tăng cường khả năng
tái tạo trong và giữa phòng thí nghiệm (Barnett và cộng sự, 2019; Sigman,
Williams, Castelbuono, Colca và Clark, 2008). Với bản chất phức tạp của các
thành phần hóa học trong các mẫu BPP, người ta đã quan sát thấy sự thay
đổi lớn của sự phân bố cường độ và ion. Điều này dẫn đến khó khăn trong
việc phân loại. Mô hình phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất từng phần
(PLS-DA) được xây dựng bằng cách sử dụng dữ liệu TMS từ GC-MS, LC-MS
và TD-DART-MS cho việc phân loại các mẫu BPP dựa trên nguồn gốc xuất
xứ của chúng.

Hình 3 hiển thị TMS đại diện của dữ liệu GC-MS, LC-MS và DART-MS và
các biểu đồ điểm số cho hai thành phần tiềm ẩn đầu tiên bắt nguồn từ các mô
hình PLS-DA tương ứng. Như đã chứng minh, biểu đồ điểm từ dữ liệu GC-
MS TMS cung cấp một phân loại hạn chế của các mẫu tiêu đen có nguồn gốc
khác nhau. Mặc dù các mô hình PLS-DA thu được từ dữ liệu LC-MS TMS và
DART-MS TMS đã chứng minh sự phân loại tốt hơn cho các mẫu được điều
tra ở đây, nhưng các mẫu từ các quốc gia khác nhau không hoàn toàn tách
biệt với nhau. Ví dụ, các mẫu hạt tiêu đen từ Ấn Độ được chồng lên các mẫu
từ Indonesia từ các dự báo của hai thành phần đầu tiên của mô hình PLS-DA
bằng dữ liệu DART-MS TMS (Hình 3F). Phép biến đổi dữ liệu căn bậc ba
được áp dụng cho dữ liệu TMS và các cấu hình phổ khối lượng được biến đổi
được thể hiện trong Hình 4. Nhiều phương pháp đo hóa học, bao gồm PLS-
DA, tối ưu hóa các mô hình dựa trên sự giảm thiểu bình phương nhỏ nhất
của sai số, cho kết quả cao hơn trọng lượng đối với tín hiệu lớn hơn
(Massart, Vandeginste, Michotte, & Kaufman, 1988). Tuy nhiên, các đỉnh nhỏ
có thể chứa nhiều thông tin phân biệt hơn để phân loại. Với việc chuyển đổi
dữ liệu căn bậc ba trong tiền xử lý dữ liệu, nó có thể mang lại tầm quan trọng
lớn hơn cho các đỉnh nhỏ hơn trong khi xây dựng mô hình PLS-DA. Đối với
các mẫu BPP từ các quốc gia khác nhau, cấu hình hóa học của chúng dự
kiến sẽ giống nhau và việc xác định những khác biệt nhỏ có thể tương đối dễ
dàng hơn với việc chuyển đổi dữ liệu. So với các cấu hình TMS trong Hình 3,
cường độ tương đối của các cực đại nhỏ xuất hiện đáng kể hơn sau khi biến
đổi. Các thành phần hóa học chính như tecpen và piperamit có mặt khắp nơi
trong các mẫu BPP mặc dù nguồn gốc của chúng. Với dữ liệu được chuyển
đổi, việc phân tách các lớp khác nhau được xây dựng trên hai thành phần
tiềm ẩn đầu tiên của mô hình PLS-DA đã được cải thiện nhiều (Hình 4B, D và
F).
Hiệu suất của mô hình PLS-DA được đánh giá bằng sai số trung bình gốc của
giá trị ước tính (RMSEE) và xác nhận chéo với các phân vùng Latin khởi
động 100 lần. Kết quả được trình bày trong Bảng 1. Sai số (giá trị RMSEE)
của các mô hình PLS-DA đã giảm đáng kể sau khi chuyển đổi căn bậc hai so
với dữ liệu TMS ban đầu từ các kỹ thuật công cụ khác nhau. Tương tự, tỷ lệ
phân loại trung bình của các mô hình PLS-DA theo Phân vùng Latinh khởi
động đã được cải thiện ít nhất 20% sau khi chuyển đổi dữ liệu căn bậc ba
được áp dụng cho các cấu hình TMS. Trong số sáu biểu diễn dữ liệu được
thử nghiệm ở đây, TMS căn bậc ba DART-MS là hiệu quả nhất trong việc
phân loại các mẫu BPP theo phương pháp PLS-DA, cung cấp RMSEE tối
thiểu là 0,075 và tỷ lệ phân loại trung bình tốt nhất là 97,0 ± 0,3%. Kết quả chỉ
ra rằng bộ phân loại PLS-DA đã phân loại thành công các mẫu BPP dựa trên
nguồn gốc quốc gia của chúng khi sử dụng TMS căn bậc ba DART-MS. Tầm
quan trọng của biến đối với biểu đồ dự báo (VIP) phản ánh tầm quan trọng
của các biến để giải thích X (phép chiếu) và tương quan với Y (các lớp) trong
mô hình PLS-DA.
 Các biến có giá trị VIP lớn hơn 1
được coi là quan trọng (Kirdar, Green, & Rathore, 2008). Khoảng giá trị VIP
từ 1 đến 1,5 cũng được coi là vùng xám, nơi mức độ quan trọng phụ thuộc
vào kích thước của tập dữ liệu. Do đó, giá trị VIP là 1,5 đã được sử dụng làm
giá trị quan trọng trong nghiên cứu của chúng tôi để đánh giá mức ý nghĩa.
Tổng cộng, 57 biến có ý nghĩa đã được tìm thấy. 10 biến hàng đầu được sắp
xếp từ cao đến thấp dựa trên các giá trị VIP và được thể hiện trong Hình 5
cho mô hình PLS-DA được xây dựng bởi dữ liệu DART-MS-square-root-TMS.
Đúng như dự đoán, các biến quan trọng nhất từ biểu đồ này không phải là
các tecpen hoặc piperamide phổ biến. Các ion này hiện diện trong phổ DART-
MS ở cường độ thấp nhưng với trọng số cao hơn cho phân loại. Các cấu hình
EIC trung bình của 2 ion hàng đầu từ ô VIP, m / z 264 và 363, từ dữ liệu TD-
DART-MS cho các mẫu BPP của các quốc gia khác nhau, được hiển thị trong
Hình S5. Nói chung, hai cực đại được quan sát thấy cho cả hai ion tại thời
điểm giải hấp 3,2 và 4,8 phút. Tuy nhiên, cường độ tương đối của các cấu
hình EIC đã cho thấy sự khác biệt đáng kể đối với các mẫu từ các quốc gia
khác nhau. Ví dụ, các cường độ tương tự đối với EIC là m / z 264 và 363 tại
3,2 phút đã được quan sát đối với các mẫu có nguồn gốc từ Ấn Độ. EIC của
m / z 264 cũng cho thấy cường độ cao hơn nhiều so với EIC của m / z 363 ở
mức 3,2 phút đối với các mẫu tiêu đen Indonesia. Việc xác định các biến
không được cố gắng trong nghiên cứu này. Mối tương quan và tương tác
giữa các biến được tính đến trong các mô hình PLS-DA, vì vậy hồ sơ toàn
diện của tất cả các biến quan trọng thay vì các biến chọn lọc sẽ rất quan trọng
cho sự thành công của việc phân loại.

4. Kết luận
Các mẫu hạt tiêu đen được phân tích và phân loại bằng GC-MS, LC-MS và
TD-DART-MS bằng phương pháp đo hóa học. TD-DART-MS đã được giới
thiệu- nghiên cứu và đánh giá để phân tích trực tiếp các nguyên liệu thực
phẩm lần đầu tiên. Nó nhanh hơn và dễ sử dụng hơn vì không cần chiết xuất
dung môi và tách sắc ký. Sự phân biệt đáng tin cậy giữa các mẫu hạt tiêu đen
từ các nguồn gốc địa chất khác nhau đã đạt được khi kết hợp với các chiến
lược hóa học như PLS-DA và chuyển đổi dữ liệu căn bậc hai. Ví dụ, tỷ lệ
phân loại trung bình là 97,0 ± 0,3% đối với dữ liệu TMS gốc khối DART-MS từ
xác nhận chéo với các phân vùng Latin khởi động 100 lần. Nghiên cứu này
đã chứng minh một phương pháp thông lượng cao và mạnh mẽ để phân loại
các mẫu BPP mà không cần sử dụng một chương trình sắc ký dài để tách
hoàn toàn các thành phần hóa học chính hoặc chiết xuất dung môi trước khi
phân tích bằng thiết bị.