Y Học TP.

Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC

TRONG ĐINH LĂNG LÁ XẺ [POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS.]
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Thị Phương Thảo*, Võ Thị Bạch Tuyết*, Nguyễn Minh Đức*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)
Phương pháp: Cao Đinh lăng lá xẻ sau khi chiết xuất và thủy phân sẽ được tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng
cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic.
Kết quả: Đã xây dựng hoàn chỉnh và thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ
Đinh lăng bằng HPLC.
Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC xây dựng đáng tin cậy. Hàm lượng acid oleanolic trong thân và
lá Đinh lăng lá xẻ khá cao (1,5%), trong khi hàm lượng trong rễ rất thấp (0,063%)
Từ khóa: Đinh lăng, saponin, acid oleanolic, HPLC.
ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OFOLEANOLIC ACID
IN POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS - ARALIACEAE) BY HPLC
Nguyen Thi Phuong Thao, Vo Thi Bach Tuyet, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 593 - 597

Objectives: Study on a HPLC method for quantitative determination of oleanolic acid in Polyscias fruticosa
(stems and leaves, and roots).
Methods: Extracts of Polyscias fruticosa were hydrolyzed, purifified prior to quantity determination of
oleanolic acid by HPLC.
Results:: A HPLC method to determine oleanolic acid in Polyscias fruticosa was established..
Conclusions: The analytical method was proven to be reliable. The content of oleanolic acid in stems and
leaves, and in roots were determined to be 1,5% and 0,063%, respectively.
Keywords: Polyscias fruticosa, saponin, oleanolic acid, HPLC.
ĐẶT VẤN ĐỀ phẩm đang lưu hành hiện nay còn rất đơn giản.
Vì vậy mục tiêu của đề tài này là nhằm
Đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms
nghiên cứu phương pháp định lượng acid
- Araliaceace), còn được gọi là cây Gỏi cá, là một
oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng
dược liệu được sử dụng khá rộng rãi với tác
hiệu năng cao (HPLC)(2) với chất chuẩn là acid
dụng bổ, tăng lực, chống mệt mỏi, giúp tăng
oleanolic, nhằm góp phần phục vụ cho việc
cường khả năng lao động và hoạt động trí
kiểm định Đinh lăng lá xẻ và các chế phẩm hơn
não…(1,3). Đinh lăng lá xẻ chứa saponin triterpen
hiệu quả.
với aglycon chính là acid oleanolic(4). Tuy nhiên,
các tiêu chí kiểm nghiệm Đinh lăng và các chế

*Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM

Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vn.vnn

Chuyên Đề Dược Khoa 593

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
- Rễ Đinh lăng thu hái ở Phú Yên, thân lá
Đinh lăng thu hái ở Tây Ninh vào tháng 4/2010.
- Acid oleanolic chuẩn (độ tinh khiết 99%) do
Ban Nghiên cứu Khoa học-Thư viện, Khoa
Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
cung cấp.
Phương pháp
Máy sắc ký
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu
LC-10AD, detector SPD-M10AVP. Cột HPLC
pha đảo Prontosil LC8 (150 x 4.6 mm, 3 μm).
Quy trình chiết xuất và định lượng acid
oleanolic
Rễ, thân và lá Đinh lăng, rửa sạch, phơi khô,
xay nhỏ, xác định độ ẩm. Cân chính xác khoảng
2 g (thân lá) hoặc 5 g (rễ). Chiết kiệt bằng 150 ml
methanol với dụng cụ Soxhlet trong 20 giờ. Cô
dịch chiết đến cắn, hòa với 30 ml dung dịch HCl
10% trong cồn. Thủy phân hồi lưu ở nhiệt độ sôi
trong 6 giờ. Lắc dịch thủy phân với 200 ml
Hình 1. Sắc đồ HPLC của acid oleanolic chuẩn (trái, Rt ~ 6,5) và sapogenin toàn phần cao thân lá Đinh lăng
(phải).
Thẩm định phương pháp HPLC
Xác định tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp.
594
dichloromethan (20 ml x 5 lần + 10 ml x 5 lần + 5
ml x 10 lần). Lắc dịch dichloromethan với 500 ml
nước cất (100 ml x 5 lần). Làm khan dịch
dichloromethan với muối Na2SO4 khan. Cô dịch
dichloromethan đến cắn và sấy chân không ở
nhiệt độ 50oC thu được sapogenin toàn phần
(chứa chủ yếu acid oleanolic). Cân chính xác
khoảng 3 mg sapogenin toàn phần (thân lá) hoặc
10 mg (rễ), hòa tan trong methanol HPLC trong
bình định mức 5 ml. Lọc qua giấy lọc đường
kính lỗ lọc 0.45 μm, tiến hành sắc ký HPLC, tính
hàm lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ.
Điều kiện tiến hành HPLC định lượng acid
oleanolic
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu
Pha động: CH3CN- H2O (72:28)
Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3
μm).
Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm.
Tốc độ dòng 0,768 ml/ phút
Thể tích bơm mẫu: 20 μl
Chuyên Đề Dược Khoa
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC
Bảng 1. Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC
Tên mẫu Độ ẩm dược liệu Lượng dược liệu Lượng dược liêu Lượng cắn Lượng cắn pha mẫu
ban đầu (g) khô (g) sapogenin (mg) định lượng (mg)
Thân lá 8,65% 2,0004 1,8274 136,9 3,49

Định lượng acid oleanolic trong thân và lá Bảng 3. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid
Đinh lăng oleanolic
Số lần Thời Diện tích Hệ số Độ phân Số đĩa lý
Đường chuẩn HPLC định lượng acid oleanolic bơm gian lưu đỉnh bất đối giải thuyết
trong thân và lá Đinh lăng 1 6.507 2354748 0.88 1.6 1604
Tiến hành xác định diện tích đỉnh acid 2 6.461 2378642 0.86 1.55 1628
3 6.425 2315583 0.83 1.54 1611
oleanolic của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 24
4 6.44 2398933 0.86 1.62 1592
đến 300 μg/ml ta thu được kết quả sau:
5 6.471 2439432 0.86 1.58 1546
4500000
6 6.548 2433719 0.87 1.59 1562
Diện tích đỉnh

4000000 y = 13855x + 21100

3500000
2
R = 0.9998 TB 6.475333 2386843 0.86 1.58 1590.5
3000000 SD 0.045364 47506.76 0.016733 0.030332 30.99516
2500000 RSD% 0.700562 1.99036 1.945721 1.919715 1.948768
2000000
1500000 RSD% của thời gian lưu là 0.7% (<2%) và của
1000000
500000 diện tích đỉnh là 1.99% (<2%) nên hệ thống đạt
0
tính tương thích.
0 50 100 150 200 250 300 350
Nồng độ (mcg/ml)
Độ lặp lại
Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày
Hình 2. Đồ thị biểu diễn tính tương quan tuyến tính
trong Bảng 4. Nồng độ mẫu chuẩn 0,22 mg/ml,
giữa diện tích đỉnh và nồng độ acid oleanolic
diện tích đỉnh 3069709.
Nhận xét: R2 = 0,9998 > 0,995
Bảng 4. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid
Như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ
nồng độ acid oleanolic và diện tích đỉnh
Diện tích đỉnh mẫu Hàm lượng acid
Mẫu
Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân thử oleanolic (%)
và lá Đinh lăng 1 2404815 1.55
2 2713779 1.52
Bảng 2. Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân 3 2030165 1.43
và lá Đinh lăng 4 2680677 1.5
Tên Diện tích Nồng độ acid % acid oleanolic tính 5 2419096 1.49
mẫu đỉnh acid oleanolic trên dược liệu khô 6 2496939 1.49
oleanolic (mg/ml)
TB 1.5
Thân lá 2634708 0,1886 2,02%
SD 0.04
Thẩm định quy trình định lượng acid RSD% 2.66
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ Nhận xét: hàm lượng trung bình acid
Tính tương thích hệ thống oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ là
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống 1,5%. RSD = 2,66%. Hàm lượng chất phân tích <
khi xét hệ số phân tán của 6 lần bơm dung dịch 10% nên RSD < 2,8% là được chấp nhận. Như
mẫu thử thân và lá Đinh lăng lá xẻ (Bảng 3).
vậy phương pháp đạt độ chính xác.

Chuyên Đề Dược Khoa 595

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Độ đúng Diện tích đỉnh mẫu Hàm lượng acid oleanolic

Mẫu
thử (%)
Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày 5 1488948 0,065
trong Bảng 5. 6 1430635 0,064
Bảng 5. Độ đúng của phương pháp định lượng acid TB 0.063
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ SD 0,002
RSD% 3,59
Mức Lượng acid Lượng acid Tỷ lệ
Mẫu hàm oleanolic thêm oleanolic tìm phục Nhận xét: hàm lượng trung bình acid
lượng vào (mg) thấy (mg) hồi (%)
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ là 0,063%.
1 17,99 17,48 97,17
2 80% 18,24 18,11 99,29 RSD = 3,59%. Hàm lượng chất phân tích <
3 18,14 17,96 99,01 0,1% nên RSD < 3,7% là được chấp nhận. Như
4 22,49 22,41 99,64 vậy phương pháp đạt độ chính xác.
5 100% 22,49 23,07 102,58
Độ đúng
6 22,45 22,36 99,6
7 27,03 26,61 98,45 Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày
8 120% 27,31 26,78 98,06 trong Bảng 7.
9 26,75 26,41 98,73
Bảng 7. Độ đúng của phương pháp định lượng acid
TB 99,17
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ
SD 1,5
Mức Lượng acid Lượng acid Tỷ lệ
RSD% 1,51
Mẫu hàm oleanolic thêm oleanolic tìm phục
Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 99,17%. Hàm lượng vào (mg) thấy (mg) hồi (%)
1 2,3 2,21 96,09
lượng chất phân tích ≥ 1% nên tỉ lệ phục hồi nằm
2 80% 2,28 2.2 96,49
trong khoảng 97-103% là được chấp nhận. Như 3 2.25 2.2 97,78
vậy phương pháp đạt độ đúng. 4 3,35 3,27 97,61
5 100% 3,34 3,27 97,9
Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy 6 3.3 3.23 98,48
trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với 7 3.75 3.62 96,53
8 120% 3.72 3.59 96,51
quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình
9 3.8 3.71 97,63
bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần TB 97,22
thiết để định lượng acid oleanolic trong dược SD 0,83
RSD% 0,85
liệu thân và lá Đinh lăng lá xẻ.
Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 97,22%. RSD =
Thẩm định quy trình định lượng acid
0,85%. Hàm lượng chất phân tích
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ
< 0,1% nên tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng
Độ lặp lại
95-105% là được chấp nhận. Như vậy phương
Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày pháp đạt độ đúng.
trong Bảng 6. Nồng độ mẫu chuẩn 0,235 mg/ml, Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy
diện tích đỉnh 3279022. trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với
Bảng 6. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần
Diện tích đỉnh mẫu Hàm lượng acid oleanolic thiết để định lượng acid oleanolic trong dược
Mẫu
thử (%) liệu rễ Đinh lăng lá xẻ.
1 1465489 0,063
2 1476281 0,064
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
3 1251069 0,061 Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã xây
4 1175139 0,059 dựng được hoàn chỉnh và thẩm định quy trình

596 Chuyên Đề Dược Khoa

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ
Đinh lăng lá xẻ. Qua kết quả định lượng thấy
được thân lá Đinh lăng lá xẻ chứa hàm lượng
acid oleanolic khá cao (1,5%) trong khi rễ chứa
rất ít (0,063%).
Phương pháp chiết xuất, loại tạp và định
lượng acid oleanolic trong thân là và rễ Định
lăng đã được chứng minh là đáng tin cậy và ổn
định, có thể dùng để kiểm định acid oleanolic
trong Đinh lăng và các chế phẩm, cũng như mở
rộng ứng dụng cho các dược liệu chứa acid
oleanolic khác.
Chuyên Đề Dược Khoa
Nghiên cứu Y học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà
xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 828-830.
2. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số
ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và
hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Y Học, Thành phố Hồ Chí
Minh.
3. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.793-
796.
4. Vo Duy Huan, Satoshi Yamamura, Kazuhiro Otani, Ryoji
Kasai, Kazuo Yamasaki, Nguyen Thoi Nham, Hoang Minh
Chau (1998), “Oleannolic saponins from Polyscias fruticosa”,
Phytochemmistry, Vol. 47, No. 3, pp. 451-457.
597