Translated from English to Vietnamese - www.onlinedoctranslator.
com
Trong phòng thí nghiệm
Phân tích HPLC định lượng của axit Rosmarinic trong chiết xuất
củaMelissa officinalisvà Đo quang phổ của các hoạt động chống
oxy hóa của chúng
Vera Canelas và Cristina Teixeira da Costa *
Departamento de Química, Universidade de Évora, 7000-671 Évora, Bồ Đào Nha; *cmtc@uevora.pt
Melissa officinalis(tên thường gọi: húng chanh), a Họ hoa môi
, là một loại thảo mộc có nguồn gốc từ Nam Âu. Khi vò nát, lá tỏa
ra mùi chanh thơm đặc trưng và được dùng để pha trà và các dịch
truyền thảo dược. Lá tía tô đất được truyền thống sử dụng với tác
dụng an thần và chống co thắt, cũng như điều trị rối loạn tiêu hóa.
(1).Các chất chiết xuất từ nước nóng cũng có các hoạt động
kháng khuẩn và kháng vi rút (chống lạiHerpes simplexvi rút) và ức
chế sự phân chia của các tế bào khối u(2, 3).
Các nghiên cứu liên quan đến đặc tính dược liệu của
húng chanh với hoạt tính chống oxy hóa và hồ sơ phenolic
của nó đã được công bố(4–6).Có sự đồng thuận rằng các
đặc tính chống oxy hóa đáng kể và các đặc tính y học khác
của tía tô đất chủ yếu là do lượng lớn axit rosmarinic (Hình
1), một este của axit caffeic và axit 3,4-
dihydroxyphenyllactic, cũng có thể được tìm thấy trong
một số cây thuốc, thảo mộc và gia vị khác(5, 7).
Chất chống oxy hóa là chất trung hòa các gốc tự do có hại trong
cơ thể chúng ta. Gốc tự do là bất kỳ loài nào có khả năng tồn tại độc lập
chứa một hoặc nhiều electron chưa ghép đôi. Các gốc tự do được tạo ra
bởi quá trình trao đổi chất hiếu khí bình thường; tuy nhiên, lượng gốc
tự do dư thừa có hại vì chúng làm hỏng DNA, protein và lipid(8, 9).Sự
hình thành gốc tự do được kiểm soát một cách tự nhiên bởi các chất
chống oxy hóa và việc nghiên cứu các chất chống oxy hóa có trong thực
phẩm là một lĩnh vực nghiên cứu đang ngày càng phát triển. Các
phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa nói chung dựa trên sự
ức chế các phản ứng nhất định bởi sự hiện diện của chất chống oxy
hóa. Các phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất liên quan đến việc
tạo ra các hợp chất gốc, các hợp chất này sẽ bị dập tắt bởi các hợp chất
chống oxy hóa có trong chất chiết xuất từ thực vật(10).
Một số bài báo đã xuất hiện trong nàyTạp chíliên quan đến
việc áp dụng các kỹ thuật HPLC cho các sản phẩm tiêu dùng như
thực phẩm(11–15)và ma túy(16–19),nhưng chưa có loại trà nào tập
trung vào các loại trà thảo mộc. Các đặc tính y học liên quan đến
trà thảo mộc và các loại thực phẩm khác một phần liên quan đến
các đặc tính bảo vệ chúng chống lại tác hại của các gốc tự do.
Chúng tôi mô tả một thí nghiệm HPLC để kiểm tra định lượng axit
rosmarinic trong các loại trà được làm từ các mẫu khác nhau của
Melissa officinalis. Một phương pháp đo quang phổ sử dụng-
Hình 1. Cấu trúc hóa học của axit Rosmarinic.
1502Tạp chí Giáo dục Hóa học • Vol. 84 số ngày 9 tháng 9 năm 2007 • www.JCE.DivCHED.org
W
ing DPPH•(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) được sử dụng để xác định các
hoạt động chống oxy hóa của các loại trà khác nhau. Cuối cùng, một nỗ
lực được thực hiện để tương quan các đặc tính chống oxy hóa của các
loại trà khác nhau với lượng axit rosmarinic của chúng.
Tổng quan
Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm này được thiết kế cho
khóa học năm thứ ba về hóa học phân tích với trọng tâm là kỹ
thuật sắc ký, nhưng cũng được sử dụng cho khóa học năm thứ hai
về hóa học sản phẩm tự nhiên. Tất cả các sinh viên đã học các
khóa học hóa học đại cương và hóa học hữu cơ. Học sinh thực hiện
thí nghiệm này theo nhóm ba người và thí nghiệm này yêu cầu hai
tiết học (tổng cộng sáu giờ). Việc phân tích HPLC của các mẫu chè
và đường chuẩn được hoàn thành trong giai đoạn loại thứ nhất,
trong khi các hoạt động chống oxy hóa được đo trong giai đoạn
loại thứ hai.
Tóm tắt phòng thí nghiệm
Nguồn thương mại củaMelissa officinalisTrà có thể được tìm thấy
trong các siêu thị và cửa hàng thực phẩm tốt cho sức khỏe. Để chuẩn bị
chiết xuất, một mẫu đã cân (2,00 g đối với mẫu tươi, 0,60 g đối với trà
khô) được ngâm trong 20,0 mL nước gần sôi trong 5 phút, và chất rắn
được loại bỏ bằng cách lọc.
Người hướng dẫn cung cấp dung dịch chuẩn của
axit rosmarinic (0,200 mg-mL trong nước), và sinh viên
chuẩn bị các chất chuẩn bổ sung là 0,100, 0,050 và
0,025 mg-mL bằng cách pha loãng. Diện tích pic HPLC
(trung bình của ba phép đo) đối với bốn chất chuẩn và
chất chiết trà thu được bằng cách sử dụng 250 mm×Cột
4,6 mm chứa các hạt pha tĩnh C-18 5 mm và máy dò
mảng diode (DAD) được quét từ 200 đến 550 nm (hồ sơ
sắc ký được ghi ở bước sóng 254 nm). Pha động đẳng
cấp, bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch nước
của acetonitril (2,5% vv) và axit formic (0,5% vv), được
bơm ở 1,0 mL-phút.
Các chất chiết xuất từ trà được lưu trữ trong tủ lạnh cho đến
giai đoạn phòng thí nghiệm tiếp theo để nghiên cứu chất chống
oxy hóa. Người hướng dẫn cung cấp 100 mM DPPH•trong metanol.
Học sinh đặt 2,975 mL DPPH•vào hai ống nghiệm và thêm 25µL
phần của axit ascorbic 1 mM hoặc chiết xuất từ trà. Sau khi đợi 30
phút để màu phát triển (mẫu được giữ trong bóng tối), độ hấp thụ
được đọc ở bước sóng 515 nm so với DPPH không được xử lý•như
chỗ trống.
Mối nguy hiểm
Axit Rosmarinic, DPPH•, axit formic và acetonitril
có thể gây kích ứng da, mắt và đường hô hấp.
Acetonitril cũng rất dễ cháy. Cần thận trọng khi xử lý
các hợp chất này, và học sinh nên đeo kính bảo hộ
chống hóa chất và găng tay chống hóa chất tương
thích.
 Trong phòng thí nghiệm

Kết quả và thảo luận

Đo lường số lượng
Chúng tôi đã chọn cung cấp cho sinh viên các dung
dịch gốc nhưng họ có thể chuẩn bị tất cả các dung dịch và
pha động nếu có thêm 2 giờ thời gian trong phòng thí
nghiệm. Do hạn chế của thiết bị sắc ký, mỗi nhóm sinh
viên được chỉ định một nồng độ chất chuẩn và một đường
chuẩn duy nhất được thực hiện cho mỗi lớp, nhưng đây
cũng là vấn đề người hướng dẫn quyết định.
Sắc ký đồ điển hình cho axit rosmarinic vàMelissa
officinalismẫu trà được thể hiện trong Hình 2 và Hình 3
tương ứng. Axit Rosmarinic cho thấy thời gian lưu,tR, trong
tổng số 7,04 phút. Mặc dù thực tế là một số pic xuất hiện
trên sắc ký đồ của trà, pic của axit rosmarinic luôn là pic
chính và xuất hiện cùng vớitR= 7,04 phút. Thiết bị có DAD
tạo ra phổ UV của chất chuẩn axit rosmarinic (Hình 2) trực
tuyến và sau đó cũng được sử dụng để đánh giá độ tinh
khiết của pic vớitR= 7,04 phút trong mẫu trà (dữ liệu không Hình 2. (trên) Sắc ký đồ và (dưới) phổ UV thu được từ dung dịch
được hiển thị). Các sinh viên thường gặp khó khăn khi hiểu chuẩn axit rosmarinic.
sự khác biệt và ưu điểm của DAD so với máy dò UV có bước
sóng thay đổi và công trình này đã giúp làm sáng tỏ những
khác biệt này.
Đồ thị điển hình của diện tích pic so với nồng độ
của axit rosmarinic được thể hiện trong Hình 4. Đường
chuẩn cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ
0,025 đến 0,200 mg-mL với hệ số tương quan là 0,996.
Sinh viên thường lấy hệ số tương quan lớn hơn 0,980.
Phần trăm axit rosmarinic trong các mẫu chè rất thay đổi.
Ví dụ, kết quả thu được của sinh viên trong học kỳ mùa thu
năm 2005 dao động từ 0,47 mg-mL đến 0,78 mg-mL đối với Hình 3. Sắc ký đồ thu được từMelissa officinalistruyền dịch.
nguồn thực vật khô và phi thương mại và 0,14 mg-mL đến 0,40
mg-mL đối với nguồn tươi (xem Tài liệu bổ sungW). Sự khác
biệt được quan sát thấy khi cùng một lượng thực vật được
phân tích ở dạng tươi hoặc khô, khi cùng một loại cây được
thu thập vào các thời điểm khác nhau trong năm hoặc khi các
mẫu trà thương mại khác nhau được phân tích. Sự thay đổi
cũng có thể xảy ra khi cùng một loại cây được sấy khô trong
các điều kiện khác nhau hoặc khi các thay đổi được thực hiện
đối với việc chuẩn bị trà.
Như đã biết, sự đa dạng hóa học và sinh học của cây
thơm và cây thuốc phụ thuộc vào các yếu tố như khu vực
trồng trọt, điều kiện khí hậu, giai đoạn thực vật và biến đổi
gen.(20).Khi sinh viên mang mẫu đến từ các nguồn gốc khác
nhau, dữ liệu thu thập được thường tạo ra một cuộc thảo luận
kích thích về nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt về hàm lượng
axit rosmarinic được đo. Hình 4. Đường chuẩn axit Rosmarinic.

Hoạt động đo lường

Các đặc tính chống oxy hóa của thực phẩm thường được báo tạo ra giá trị của AEAC (L-hoạt động chống oxy hóa tương
cáo trên các bản tin thời sự, và học sinh rất quan tâm đến môn học đương axitascorbic)(22),
này, điều này cũng đã được xem xét trong nàyTạp chí (21).Có một
số phương pháp để đo các đặc tính chống oxy hóa của chiết xuất ∆Một 100
thực vật(10),và chúng tôi đã chọn DPPH•vì tính đơn giản của nó. AEAC = CAA V
∆MộtAA W
Phương pháp này đo lường hoạt động chống oxy hóa tương đối
của các chất chiết xuất từ thực vật để loại bỏ DPPH gốc•so với số ở đâu∆Mộtlà sự thay đổi độ hấp thụ sau khi bổ sung chiết xuất
lượng tiêu chuẩn củaL-axitascorbic (AA), 1 mM. Khi DPPH•phản ứng thực vật,CAAlà nồng độ của dung dịch tiêu chuẩn AA, ∆MộtAAlà
với một hợp chất chống oxy hóa có thể hiến tặng hydro, nó bị khử. sự thay đổi độ hấp thụ khi thêm cùng một thể tích dung dịch
Sự thay đổi màu sắc (tia cực tím sâu sang màu vàng) được đo ở tiêu chuẩn AA với thể tích dịch chiết thực vật,Vlà thể tích của
bước sóng 515 nm trên máy quang phổ UV – vis. Sự thay đổi độ dịch lọc, vàWlà trọng lượng của thực vật được sử dụng để
hấp thụ này sau đó được sử dụng để chiết xuất.

www.JCE.DivCHED.org • Tập. 84 Số ngày 9 tháng 9 năm 2007 • Tạp chí Giáo dục Hóa học1503
 Trong phòng thí nghiệm
Giá trị AEAC là thước đo hoạt tính chống oxy hóa của mẫu
trà và được biểu thị bằng mgL-ascorbic acid (AA) trên 100 g
thực vật. Các giá trị thu được có thể thay đổi và nằm trong
khoảng từ 0,81 mg AA-100 g thực vật đến 10,93 mg AA-100 g
thực vật (xem Tài liệu bổ sungW). Như đã nêu trước đây, có
những báo cáo trong tài liệu liên quan đến các đặc tính chống
oxy hóa củaMellisa officinallistrà với hàm lượng của chúng
trong axit rosmarinic(23),và, đối với các mẫu chè khô được
nghiên cứu, mối tương quan tốt (0,956) đã được quan sát
(Hình 5). Dữ liệu về cây tươi không được vẽ biểu đồ vì chỉ có
hai mẫu được nghiên cứu.
Một kết quả thú vị của thí nghiệm trong phòng thí nghiệm
này là các cuộc thảo luận trong lớp học đầy hứng khởi sau khi kết
quả từ các lớp khác nhau được tổng hợp. Học sinh nhận thức được
rằng cần đặc biệt chú ý đến việc bào chế và thương mại hóa các
cây thuốc để tối đa hóa các đặc tính thuốc của chúng và cũng phải
đặt câu hỏi về tính hợp lệ của các tuyên bố về lợi ích sức khỏe liên
quan đến một số chất bổ sung thảo dược.
Các sửa đổi
Một số sửa đổi có thể được thực hiện đối với thử nghiệm.
Thí nghiệm có thể giảm xuống một chu kỳ nếu chỉ thực hiện
định lượng axit rosmarinic. Đối với lớp định hướng hóa sinh
hoặc hóa thực phẩm hơn, các phương pháp khác để đo chất
chống oxy hóa cũng có thể được thực hiện, cụ thể là ABTS, 2,2
´azinobis (axit 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic), xét nghiệm
cation gốc(24),và sự ra đời của EC50
(lượng chất chống oxy hóa cần thiết để giảm DPPH ban
đầu•hoặc ABTS•+nồng độ 50%) cho mỗi mẫu trà
(25).Khi có đủ các bản sao được nghiên cứu, các loại trà làm từ các loại
cây khác nhau cũng có thể được so sánh bằng phân tích thống kê (ví
dụ: ANOVA).
WVật liệu bổ sung
Hướng dẫn cho sinh viên và ghi chú cho người
hướng dẫn, bao gồm thêm thông tin liên quan đến các
gốc, phép đo các đặc tính chống oxy hóa bằng DPPH•
phương pháp, suy ra công thức AEAC, và các ví dụ về kết quả
mong đợi và các phép tính bắt buộc, có sẵn trong số báo này
củaJCE trực tuyến.
Văn học được trích dẫn
1. Heinrich, M.; Barnes, J .; Vượn, S.; Williamson, EMCác nguyên
tắc cơ bản của Dược lý học và Phytotherapy;Churchill
Livingstone: Edinburgh, 2004; trang 236–237, trang 247–248.
2. Allahaverdiyev, A.; Duran, N.; Ozguven, M.; Koltas, S.;
Phytomedicine2004,11,657–661.
3. de Sousa AC; Alviano, DS; Trống, AF; Alves, PB; Alviano,
CS; Gattass, CRJ. Pharm. Parmacol.2004,56, 677–681.
4. Ziaková, A.; Brandsteterová, E.; Blahová, E.J. Chromatogr.,
A2003,983,271–275.
Các cấu trúc của axit rosmarinic và DPPH có sẵn trong Jmol và Chime hoàn toàn có thể điều khiển được
định dạng nhưJCECác phân tử nổi bật trongJCE trực tuyến(xem trang 1496).
JCECác phân tử nổi bật
một tính năng tạo mô hình tương tác, Only @ JCE Online
http://www.JCE.DivCHED.org/JCEWWW/Features/MonthlyMolecules
1504Tạp chí Giáo dục Hóa học • Vol. 84 số ngày 9 tháng 9 năm 2007 • www.JCE.DivCHED.org
Hình 5. Tương quan giữa AEAC và nồng độ của axit rosmarinic.
5. Pereira, P.; Tysca, D.; Oliveira, P.; da Silva Brum, LF; Nascimento
Picada, J .; Ardenghi, P.Pharmacol. Nghiên cứu,2005,
52,199–203.
6. Ivanova, D.; Genova, D.; Chervenkov, T.; Yankova, T.J.
Ethnopharmacol.2005,96,145–150.
7. Peterson, M.; Simmonds, MSJHóa thực vật2003,62,
121–125.
8. Shui, G.; Peng, L.J. Chromatogr., A2004, 1048, 17–24.
9. Atoni, AK; Mansouri, A. .; Boskou, G.; Kefalas, P.Thực phẩm Chem.
2005,89,27–36.
10. Arnao, MB; Cano, A.; Acosta, M.Rad miễn phí. Res.1999,31, 89–
96
11. Orth, DLJ. Chèm. Giáo dục.2001,78,791.
12. da Queija, C.; Queiros, MA; Rodrigues, LMJ. Chèm. Giáo
dục.2001,78,236.
13. Huang, J. .; Mabury, SA; Sagebiel, JCJ. Chèm. Giáo dục.2000,
77,1630.
14. Bergen, Nhân sự; Benson, LM; Naylor, S.J. Chèm. Giáo dục.2000,
77,1325.
15. Duxbury, M.J. Chèm. Giáo dục.2000,77,1319.
16. Batc started, JD; Jones, BTJ. Chèm. Giáo dục.2000,77,266.
17. Cược, TAJ. Chèm. Giáo dục.1999,76,240.
18. Charles, MJ; Martin, NW; Msimanga, HZJ. Chèm. Giáo
dục.1997,74,1114.
19. Ferguson, GKJ. Chèm. Giáo dục.1998,75,1615.
20. Heinrich, M.; Barnes, J .; Vượn, S.; Williamson, EMCác nguyên
tắc cơ bản của Dược lý học và Phytotherapy;Churchill
Livingstone: Edinburgh, 2004; trang 48–57.
21. Hải ly, B.J. Chèm. Giáo dục.1999,76,1108–1112.
22. Leong, LP; Shui, G.Món ăn Chem chép.2002,76,69–75.
23. Lamaison, JL; Petitjean-Freytetc .; Carnat, A.Dược phẩm. Acta
Helv.1991,66(7), 185–188.
24. Sellappan, S.; Akoh, CCJ. Agric. Thực phẩm Chem.2002,50,
5338–5342.
25. Atoui AK; Mansouri, A. .; Boskou, G.; Kefalas, P.Thực phẩm Chem.
2005,89,27–36.