LOGO

CHUYÊN ĐỀ. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC

HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Giảng Viên:
PGS.TS. Giang Thị Kim Liên
 Phân lập alkaloid

Bột nguyên liệu + dung dịch HCl 1% để chuyển

hóa thành muối clohiđrat dễ tan

Lọc lấy dung dịch muối, kiềm hóa để lấy alkaloid

hoàn toàn khỏi muối

Cất cuốn hơi nước hoặc chiết bằng dung môi hữu
cơ như chloroform, benzene…

Chạy sắc ký hoặc sắc ký bản mỏng điều chế...phân

lập riêng từng alkaloid

Xác định cấu trúc các ancaloit thử hoạt tính sinh
học, đem sản phẩm thử nghiệm, ứng dụng
 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Bột mật nhân
Chiết phân đoạn

Tinh chế, làm sạch Phân lập, xác định thành phần, cấu trúc hóa học

Định danh, xác định cấu trúc

Xây dựng quy trình chiết

Dịch chiết nước Dịch chiết ethanol 80 %

Thăm dò hoạt tính sinh học:

Kháng tế bào ung thư
Kháng viêm
Kháng oxy hóa
Kháng khuẩn, kháng sinh
Thử độc tính bất thường
Thử độc tính với tế bào người

Bột mật nhân

Trà thảo mộc mật nhân Cao chiết mật nhân Nước rau má mật nhân

Bổ sung cao mật nhân Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở Bổ sung bột mật nhân
Đánh giá cảm quan Đánh giá cảm quan
Đánh giá cảm quan
Đánh giá ATVSTP Đánh giá ATVSTP
Đánh giá ATVSTP
 CHUYÊN ĐỀ
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI SHEFFLERA,
ERIOBOTRYA VÀ LIVISTONA
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thăm dò Xử lý
hoạt tính nguyên
sinh học liệu

MỤC TIÊU
NGHIÊN CỨU

Xác định Chiết và

cấu trúc phân lập
hoá học chất
 NGUYÊN LIỆU

 Trong điều kiện cho phép nên dùng nguyên liệu tươi. Ổn
định nguyên liệu bằng cách nhúng vào cồn hay nước đun sôi
trong vài phút, sau đó để ráo nước hay làm khô tự nhiên
trong không khí, tránh dùng nhiệt độ cao để làm khô
nguyên liệu
 Xử lý nguyên liệu ban đầu như: vứt bỏ nguyên liệu có sâu
bệnh, hư hỏng
 Xác định đúng tên khoa học của loài thực vật, phải ghi địa
chỉ người và cơ quan giám định…, để người đọc có thể liên
hệ tham khảo khi cần thiết.
 TÍNH PHÂN CỰC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Trong cây, các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng hòa tan
trong nước, trong dầu béo hoặc tinh dầu
- Các hợp chất hòa tan trong nước (dịch tế bào) là các
hydratcacbon có phân tử lượng thấp (monosaccarit, một số
oligosacarit như pectin, gôm); các glycozit, muối ankaloit của
các axit hữu cơ; các aminoaxit, muối của aminoaxit; các hợp
chất phenol hòa tan dưới dạng glycozit.
 Nói chung các chất tan trong nước là các chất phân cực.
 Các hợp chất có nguyên tử H liên kết trực tiếp với nguyên tố
âm điện như O, N, F, Cl…là những nhóm phân cực, càng
nhiều nhóm phân cực trong phân tử thì tính phân cực càng
lớn
TÍNH PHÂN CỰC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

- Các hợp chất tan trong dầu béo hoặc tinh dầu: các
hidrocacbon, monotecpen, sesquitecpen, sterol,
carotenoit…
• Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các chất ít phân
cực. Tuy nhiên tính phân cực của chúng cũng khác nhau
tùy thuộc vào khối lượng nguyên tử và nhóm chức có
trong phân tử hợp chất.
• Thông thường các hợp chất có mạch cacbon dài thì kém
phân cực.
 DUNG MÔI

 Tính phân cực của dung môi

 Cơ sở để lựa chọn dung môi để chiết là độ phân cực của các
hợp chất chứa trong nguyên liệu và độ phân cực của dung
môi.
 Người ta phân biệt các dung môi theo độ phân cực
+ Dung môi phân cực mạnh: nước, các ancol thấp (metanol,
etanol….).
+ Các dung môi phân cực yếu hoặc vừa: etyl axetat,
cloroform, axeton,…
+ Các dung môi không phân cực: ete, ete-dầu hỏa, benzen,
toluen, hexan…
 DUNG MÔI
 Chất tan trong nước và
dung môi phân cực
 Các chất điện ly như muối vô cơ
 Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hóa, nhưng nếu
chúng có những nhóm tạo được liên kết hydro với nước thì
tan được trong nước.
 Càng nhiều nhóm phân cực thì phân tử ấy càng dễ tan
trong nước, nếu mạch cacbon càng dài thì độ hòa tan càng
giảm. Các hợp chất tan được trong nước khi:
+ Nếu 1 nhóm phân cực trong phân tử có khả năng tạo
thành liên kết hidro với nước nếu phân tử của chất đó có
mạch cacbon không quá 5 hoặc không quá 6 nếu hợp chất
có mạch nhánh
+ Nếu phân tử có nhiều nhóm phân cực (từ 2 trở lên) thì tỉ lệ
này giảm xuống: một nhóm phân cực cho 3 hoặc 4 nguyên
tử cacbon trong mạch thì phân tử ấy tan được trong nước.
 DUNG MÔI
 Chất tan trong ete và
các dung môi không phân cực

 Nói chung các chất không phân cực đều tan trong ete và
các dung môi không phân cực,ngược lại không tan trong
nước và các dung môi phân cực khác.
 Các phân tử có một nhóm phân cực trong phân tử có thể
tan được trong ete.
 Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước thì không tan
trong ete.
 Nếu một chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete thì
chất đó phải là chất không ion hóa, có số cacbon không
quá 5, có một nhóm phân cực tạo liên kết hidro nhưng
không phải là phân cực mạnh.
 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT
 Phương pháp chung

 Phương pháp chiết tổng: Đối với nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết
rõ thành phần hóa học của nguyên liệu có thể sử dụng phương
pháp chiết tổng, dung dung môi phân cực để chiết kiệt nguyên
liệu (R/L), sau đó chiết phân đoạn (L/L) bằng các dung môi từ
không phân cực đến phân cực mạnh để thu được các phân đoạn
khác nhau.
 Phương pháp chiết phân đoạn (R/L): Dùng một dãy các dung môi
từ không phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân đoạn các
chất ra khỏi nguyên liệu, ví dụ dãy ete-dầu hỏa, ete, cloroform,
cồn và cuối cùng là nước. Cách chiết thông dụng nhất là chiết
nóng liên tục trên máy soxhlet hoặc chiết hồi lưu. Sau mỗi lần
chiết với một loại dung môi, cần làm khô nguyên liệu rồi mới tiếp
tục chiết với dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết, thu hồi
dung môi và tiến hành phân tích riêng.
Chiết nóng bằng soxhlet
và hồi lưu
 Dựa vào tính phân cực của dung môi và có thể dự đoán sự có
mặt của các chất có mặt trong các dịch chiết.
 Trong phân đoạn ete, ete dầu hỏa sẽ có hidrocacbon béo hoặc
thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất
không phân cực như các chất béo caroten, các sterol, các chất
màu thực vật, clorofyl.
 Trong dịch chiết cloroform có sesquitecpen, ditecpen,
coumarin, quinon các aglycon do các glycozit thủy phân tạo ra,
một số ankaloit bazo yếu
 Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ankaloit, flavonoit, các
hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin
 Trong dịch nước sẽ có sẽ có các hợp chất phân cực như các
glycozit, tanin, các đường, các hidratcacbon phân tử vừa như
pectin, các protein thực vật, các muối vô cơ…
 Phương pháp chiết tổng: lấy
toàn bộ thành phần trong nguyên liệu
 Dung môi thích hợp nhất là cồn (metanol hay etanol) 80%
trong nước. Cồn, đặc biệt là metanol được xem như dung
môi phổ biến, có thể hòa tan các chất không phân cực cũng
như các chất phân cực khác
 Cô đuổi dung môi, thu được cao toàn phần chứa hầu hết
các hợp chất trong nguyên liệu
 Tách phân đoạn các chất trong cao tổng bằng cách sử dụng
lần lượt các dung môi theo thứ tự có độ phân cực từ yếu
đến mạnh như: n-hexan, ete-dầu hỏa, ete, cloroform, etyl
axetat, butanol.
 Chiết phân đoạn: hòa tan cao tổng vào một lượng nước ,
cho vào bình chiết, lần lượt chiết với các dung môi trên.
Dịch chiết mỗi phân đoạn sau khi thu hồi dung môi thu
được các cao phân đoạn và được lựa chọn bằng SKBM để
tiếp tục phân lập và tinh chế các hợp chất.
  Cách chiết

 Chiết ở nhiệt độ thường: có 2 cách là ngấm kiệt và

ngâm phân đoạn. Ngấm kiệt là phương pháp tốt hơn
vì nó chiết được nhiều hợp chất hơn, ít tốn dung môi,
nhất là khi áp dụng phương pháp ngấm kiệt ngược
dòng.
 Chiết nóng: Nếu dung môi dễ bay hơi phải dùng
phương pháp chiết liên tục (trong soxhlet) hoặc chiết
hồi lưu. Nếu chiết hồi lưu thì ít nhất phải chiết 2 lần.
  Cách chiết
 Chiết rắn – lỏng
 Chiết gián đoạn
 Chiết liên tục: dụng cụ soxhlet
 Chiết lỏng - lỏng
 Yêu cầu dung môi: dùng dung môi không trộn lẫn
với dung môi cũ và có khả năng tan tốt hợp chất
hữu cơ hơn dung môi cũ (thường là nước)
 Các dung môi thường dùng là ete etylic, ete dầu
hỏa, xăng, benzen, CHCl3...
  Cách thu hồi dung môi
Sử dụng phương pháp chưng cất ở áp suất thấp

khong khi

bom chan khong

 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

 Khái niệm về sắc ký

 Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách

riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng cách
phân bố chúng ra 2 pha: một pha có bề mặt rộng
gọi là pha cố định (pha tĩnh) và một pha kia là
một chất lỏng hay chất khí gọi là pha di động, di
chuyển qua pha tĩnh.
 Phân loại: Chia thành 2 loại: là sắc ký lỏng và sắc
ký khí
 Sắc ký lỏng : là sắc ký có pha động là chất
lỏng.
Trong sắc ký lỏng có các kỹ thuật:
 Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy
 Sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh là lớp mỏng chất hấp phụ được
trải bằng trên tấm thủy tinh hoặc kim loại
 Sắc ký cột: Pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột. Trong
sắc ký cột tùy thuộc vào bản chất của chất rắn nhồi cột mà
chia thành các loại
-Cột cổ điển: cột đơn giản với chất hấp phụ là vô cơ hay hữu
cơ
-Cột trao đổi ion: Cột là chất trao đổi ion âm hoặc dương
-Cột gel hay lọc gel: Pha tĩnh là một gel tổng hợp có lỗ xốp
xác định để lọc các chất có kích thước khác nhau
 Sắc ký lỏng cao áp: (sắc ký lỏng hiệu năng cao-HPLC)
 Sắc ký khí: là sắc ký có pha động là các chất
khí. Dựa vào pha cố định người ta còn chia ra:
 Sắc ký khí- rắn
 Sắc ký khí – lỏng
Trong thực tế người ta thường dùng SKK để phát
hiện số lượng các chất trong hỗn hợp, hàm lượng
của chúng dựa vào diện tích pic của phổ đồ sắc
ký
 Sắc ký giấy
A. Các bước tiến hành
Chuẩn bị mẫu thử
Chấm mẫu thử
Giấy
Dung môi
Cách khai triển
Phát hiện vết
a) Chuẩn bị mẫu thử
 Chất thử được pha trong lượng tối thiểu dung
môi. Dung môi thường dùng là các chất dễ bay
hơi như axeton, metanol, etanol
 Trừ trường hợp nghiên cứu toàn diện về cây,
thông thường người ta phải loại tạp và cô đặc
trước khi chấm. Cách loại tạp thường dùng là
tách bằng các dung môi khác nhau, bằng cách
tủa, ly tâm, đông lạnh…
b) Chấm mẫu thử:
 Dùng ống mao quản có đường kính từ 0,5-
1mm. Thông thường nồng độ chất chấm từ 0,1-
1%, lượng chất chấm từ 1-1000g tùy thuộc
vào độ nhạy để phát hiện chúng.
 Điều quan trọng trong kỹ thuật chấm vết là
chấm vết càng nhỏ càng tốt và các vết trên
cùng một lần sắc ký phải đồng đều nhau về
kích thước và độ đậm đặc
c) Bản sắc ký giấy
 Nếu dùng sắc ký giấy để phát hiện chất thì có
thể dùng loại giấy mỏng, nhưng nếu dùng tách
chất thì có thể dùng giấy dày.
 Khi sử dụng cần triển khai đúng chiều của giấy.
Thông thường ngoài bìa giấy có có mủi tên chỉ
chiều triển khai giấy.
d) Dung môi: Việc chọn dung môi thích hợp là yếu tố
chính quyết định kết quả thí nghiệm
+ Cách chọn dung môi:
 Thứ tự độ phân cực của dung môi (theo E. Berg,
1963)
Ete dầu hỏa < CCl4 < xyclohexan< cacbon disunfua
< dietylete < benzen < các este < Cloroform
< dicloetan < các ancol < nước < pyridin
< các axit hữu cơ < các axit vô cơ và bazo
 Cũng có thể dùng dung môi nguyên chất hoặc hỗn
hợp dung môi với tỉ lệ thích hợp.
 Để lựa chọn hệ dung môi ta có thể dùng chạy thử với
chiều cao 10 cm là đủ.
e) Cách triển khai:
 Triển khai trên xuống: Ưu điểm của phương pháp
này là tốc độ chảy tương đối ổn định và nhanh
nhờ tác dụng của trọng lực
 Triển khai dưới lên (triển khai ngược): Phương
pháp này có ưu điểm là triển khai đơn giản,
nhanh chóng nhưng có nhược điểm là khi dung
môi chảy được độ 25 mm thì dung môi sẽ chạy
chậm lại, do đó người ta thường sử dụng cách
này để thử tìm hệ dung môi thích hợp và thường
cho chạy đến 25cm thì ngừng lại.
 Triển khai ngang
 Triển khai vòng
 Triển khai nhiều lần và triển khai quá cở giấy
 Sắc ký hai chiều
g) Phát hiện vết
 Phương pháp hóa học: Dùng các chất hiện màu đặc
trưng cho từng loại hợp chất. Thuốc thử được pha có
nồng độ thích hợp cho tác dụng lên giấy . Có 2 cách:
- Nhúng giấy: Áp dụng cho các sắc đồ nhỏ,và thuốc thử
không hòa tan các vết
- Phun: Phương pháp này thường dụng hơn
 Phương pháp vật lý:
- Thường áp dụng với các hợp chất hấp thụ tia cực tím
trong khoảng từ 240-260 nm hình thành các vết tối
trên nền phát quang. Trong một số trường hợp có thể
phun lên giấy dung dịch Fluorescein (C20H18O2) với
mục đích làm tăng độ phát quang của nền để nhìn vết
rõ hơn.
- Một số chất có khả năng phát huỳnh quang khi chiếu
tia cực tím ở bước sóng khoảng 360nm
 B Các yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf

a) Giá trị Rf
 Trong sắc ký để biểu thị sự di chuyển của các
chất người ta dùng khái niệm Rf

Giá trị Rf không phải là một hằng số đặc trưng cho

sự di chuyển của một chất ở mọi điều kiện, do đó
khi ghi giá trị Rf phải ghi đầy đủ những điều kiện
thí nghiệm kèm theo (loại giấy, nồng độ chất thử,
lượng chấm, hệ dung môi, lượng dung môi, chiều
triển khai, nhiệt độ tiến hành thí nghiệm)
 b) Phương pháp làm tăng độ lặp lại trong SKG
 Giữ nhiệt độ không đổi trong khoảng nhiệt độ cho phép 
50C
 Trộn đều dung môi và giử ở nhiệt độ thí nghiệm trong 1-
2 ngày.
 Kiểm tra lại dung môi bằng cách chạy thử với chất chuẩn
đối chiếu
 Giấy đã chấm chất thử được đưa vào trước 24 giờ để tạo
sự cân bằng giữa giấy và khí quyển trong bình
 Đậy bình kín trong suốt quá trình triển khai
 Đường di chuyển của dung môi phải từ 30-35 cm nếu
triển khai xuôi và 25 cm cho triển khai ngược
 Dùng một loại giấy, tiến hành trong cùng một điều kiện.
 Hiện tượng vết dị thường
 a. Vết lan rộng (Không tập trung)
 Để khắc phục cần phải
 Chấm vết càng nhỏ, tròn
 Thuốc hiện màu không quá đặc, pha vừa đủ để hiện màu
 Chọn hệ dung môi thích hợp, nhất là tốc độ chạy của hệ
dung môi.
 Ngoài ra nếu hình dạng và kích thước lỗ xốp của giấy không
đều vết cũng lan rộng
 b.Vết có đuôi
 Vết có đuôi có thể do
 Lượng chất chấm quá nhiều
 Dung môi chảy quá nhanh
 Sự biến đổi không thuận nghịch và từ các thành phần trong
chất tan trong quá trình di chuyển
 Sự hấp phụ quá mạnh của bề mặt chất hấp phụ
c. Hiện tượng hai đuôi
 Hiện tượng này thường xảy ra đối với các chất màu của dịch
chiết.
 Do các chất màu không có khả năng hấp phụ mạnh bằng
các chất không có màu có mặt trong dịch chiết nên các chất
không màu chiếm vị trí ngay ở giữa còn các chất màu di
chuyển ra rìa khi chấm.
Vì vậy khi triển khai thì có hai đuôi do các vết trên và dưới
chạy nhanh hơn ở 2 bên nên vết có 2 đuôi
d. Ngoài ra còn có các hiện tượng: vết bè ra hai bên , lan
rộng ra 2 bên, vết méo, vết không di chuyển, mất vết hoặc
một chất tạo nhiều vết
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

A. Nguyên lý:

B. Chất hấp phụ
D. Chất hấp phụ thông dụng
E. Dung môi
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

 Nguyên lý:
 Là phương pháp phân tích trong đó dung dịch
chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất
hấp phụ mịn vô cơ hay hữu cơ theo một chiều
nhất định.
 Trong quá trình di chuyển, mỗi chất chuyển dịch
với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của
chúng và dừng lại ở những vị trí khác nhau
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

 Chất hấp phụ

Thường dùng là các oxit không tan, các oxit hidrat hóa và
các muối
Lực hấp phụ của các chất hấp phụ theo trật tự tăng dần (theo
Strain)
 1- Sacaroz • 7- Magie cacbonat
 2- Magie xitrat • 8- Magie oxit
 3- Tale ( đá tan, hoạt thạch) • 9- Axit silixic hoạt hóa
 4- Silicagel •10- Nhôm oxit hoạt hóa
 5-Natri cacbonat •11- Than động vật hoạt
 6-Canxi cacbonat
Trong phân tích nguyên liệu, chất được dùng thông dụng nhất
là silicagel và oxit nhôm
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

 Chất hấp phụ thông dụng

a. Silica gel: Dùng trong bản mỏng là loại bột mịn, vô định
hình có đường kính cở hạt từ 10- 40 m, nếu dùng trong
sắc ký cột thông thường thì đường kính cở hạt 63-200 m
(63-200 mesh)
 Về mặt hóa học silica gel vô định hình là loại có các nhóm
siloxan O-Si-O và các nhóm silinol O-Si-OH
 Vị trí hấp phụ trên bề mặt là các nhóm silinol, nó có khả
năng tạo liên kết cộng hóa trị với các hợp chất phân tích.
 Để tăng khả năng hấp phụ của silicagel người ta sấy ở nhiệt
độ 110-1200C để loại nước, nhưng không sấy cao hơn
150oC vì khi đó các nhóm OH trong silica gel bị mất nước
và giảm khả năng hấp phụ và không hút nước
 Ngoài ra để tăng thêm khả năng hấp phụ, tùy theo bản
chất của chất cần tách người ta có thể thêm axit hay bazo
để sự hấp phụ có thể được tăng lên hay giảm xuống.
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

b. Alumina Thành phần hóa học, chứa chủ yếu là -Al2O3.

có 3 loại: trung tính, baz và axit
 Alumin baz có chứa khoảng 0,1-0,5 % NaOH bám trên mặt
alumin ở dạng natri aluminat, có pH 10.Nó là chất trao đổi
ion trong nước
 Alumin trung tính, có pH từ 6,5-7. Đây là loại dùng tốt cho
sắc ký cột vì không gây phản ứng với chất thử
 Alumin axit được điều chế từ alumin với HCl loãng, pH  4,
có tác dụng như chất trao đổi ion
 Các chất thử có tính axit như các phenol, axit cacboxylic sẽ
bị giữ lại trên alumin baz hơn loại trung tính và axit, ngược
lại các chất có tính baz (amin, ankaloit...) sẽ bị giữ lại trên
alumin axit hơn loại trung tính và baz
 Khác với silicagel, các alumin nếu sấy trên 2000C sẽ hấp
phụ lựa chọn đối với các chất phân cực và có thể làm tăng
độ hấp phụ khi đun nóng đến dưới 7000C
 Nếu trên 7000C thì khả năng hấp phụ giảm.
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

 Dung môi
a)Tốc độ di chuyển của chất phụ thuộc vào
dung môi
 Trật tự tăng dần lực phản hấp phụ dung môi như
sau (Theo Trappe)
 Ete dầu hỏa < xyclohexan < CCl4 < tricloetylen
< toluen < benzen < metylclorua < clorofoc <
ete etylic < etyl axetat < pyridin < axeton <
n-propanol < etanol < metanol < nước
 Trong thực tế người ta thường dùng hỗn hợp
dung môi có độ phân cực với tỉ lệ phù hợp để
tạo hệ các dung môi mới
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

b) Phương pháp chọn dung môi

 Nguyên tắc chung: Nếu chất thử có ái lực yếu đối với chất
hấp phụ thì chọn chất hấp phụ mạnh với hệ dung môi có
lực phản hấp phụ yếu. Ngược lại nếu chất thử ái lực mạnh
với chất hấp phụ thì chọn chất hấp phụ yếu và chọn dung
môi có lực phản hấp phụ mạnh.
manh phan cuc manh
(phan hap phu yeu)

CHAT HAP PHU DUNG MOI

yeu phan cuc yeu

(phan hap phu manh)

ai luc yeu ai luc manh

CHAT THU
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

c) Cấu tạo hóa học và ái lực hấp phụ của chất

thử
 Các hidrocacbon no hầu như không hấp phụ
 Sự có mặt của liên kết đôi tăng thêm lực hấp phụ, càng
nhiều nối đôi, lực hấp phụ càng tăng
 Có thêm các nhóm chức càng làm tăng lực hấp phụ. Bằng
thực nghiệm, người ta thấy lực hấp phụ giảm dần theo dãy
sau:
+ Đối với hidrocacbon thơm:
- COOH > -CO-NH2 > -OH > -NH-CONH2 > -NH2 >
-OCO- CH3 > -CO-CH3> - COCH3 > -N(CH3)3 > -NO2 >
-OCH3 > -H > Cl
+ Đối với hidrocacbon mạch thẳng :
- COOH > -OH > -NH2 > -COOR(ankyl) > -CH3
+ Các hợp chất cacbonyl hấp phụ yếu hơn hợp chất có OH và
amin tương ứng
 SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM/SKBM)

 Kỹ thuật sắc ký
 Tráng kính, hoạt hóa kính: hoạt hóa ở 1100C – 1
giờ
 Bảo quản kính trong bình hút ẩm
 Chấm mẫu phân tích
 Triển khai bằng dung môi
 Hiện vết
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

 Khái niệm
 Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký
giấy hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng ở đây pha
tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển
khai một cách liên tục với nhiều hệ dung môi
khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh
 Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột
(nhồi cột) mà sự tách có thể xãy ra chủ yếu
theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) ví dụ như
silicagel, oxit nhôm hoặc cơ chế phân bố (cột
phân bố) ví dụ xenlulo.
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)
 Dụng cụ - hóa chất
a) Cột
 Kích thước cột và lượng chất hấp phụ: Thông thường lượng
chất hấp phụ gấp 25-50 lần lượng chất cần tách và độ cao
của phần cột chất hấp phụ và của phần mẩu thử lớn hơn
8:1.
 Tuy nhiên với những chất khó tách thì cần cột to và lượng
chất hấp phụ phải lớn hơn

Mẫu sắc ký Khối lượng Đường kính Chiều cao

(g) chất hấp phụ cột (mm) cột
(gam) (mm)
0,001 0,3 3,5 30
0,1 3 7,5 60
1,0 30 16 130
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

b) Hóa chất làm cột

 Cột phân bố: xenlulo, kieselguhr (Cellite), gel của axit
silixic
 Cột hấp phụ: oxit nhôm, silicagel, poliamit, CaCO3, MgO,
than hoạt
 Một số hóa chất dùng cho sắc ký cột đã được tiêu chuẩn
hóa
+ Oxit nhôm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-
230 mesh)
+ Oxit nhôm bazo, cỡ hạt 0,063-0,200 mm ( 70- 230 mesh)
+ Silicagel 60 Merck, cỡ hạt 0,063-0,200 mm
+ Poliamit: cở hạt < 0,07 mm
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

 Khi cho chất hấp phụ vào dung dịch chứa chất hữu cơ, thì
các chất hữu cơ sẽ bám vào chất hấp phụ do nhiều loại liên
kết khác nhau. Trật tự các loại lực này thay đổi như sau:
 Sự tạo muối > liên kết phối trí >
liên kết hidro > tương tác lưỡng cực >
lực Van-der-Valls
 Dung môi: Các dung môi thường dùng cho sắc ký cột là
hexan, benzen, CHCl3, axeton, etanol, metanol, butanol,
nước.
Thứ tự độ phân cực tăng dần của dung môi:
Ete dầu < hexan < xiclohexan < CCl4,< benzen <
toluen < diclometan < CHCl3 < ete etylic < etyl axetat <
axeton < pyridin < propanol < etanol < nước < axit axetic
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

 Hứng các phân đoạn vào dụng cụ hứng và

thu hồi dung môi:
 Thông thường các chất không phân cực ra trước
sau đó mới đến các chất phân cực yếu và cuối
cùng là các chất phân cực mạnh
 Với dung môi không phân cực: Giải ly ra sớm
Ankan→ Anken, ankin; → Xicloankan,
xicloanken; → Aren; → Xeton; → Andehit
 Với dung môi phân cực : Giải ly ra chậm
Este; → Ancol, thiol; → Amin; → Phenol,axit
cacboxylic
SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

 Kỹ thuật
a) Chuẩn bị cột: Yêu cầu là chất rắn làm pha tĩnh (ví
dụ silica gel) phải phân tán đồng đều ở mọi điểm
trong cột thành một khối đồng nhất.
Cột hấp phụ: Có 2 cách nhồi cột
+ Nhồi khô: cho pha tĩnh trực tiếp vào cột, sau đó rót
dung môi vào cột,chạy qua pha tĩnh nhiều lần cho đến
khi ổn định.
+ Nhồi ướt: Trộn pha tĩnh vào dung môi, tạo thành thể
đồng nhất và rót vào cột. Tiếp tục cho dung môi vào
cột cho chảy tiếp tục một thời gian (từ 5-10 giờ) để
cho cột ổn định hoàn toàn. Chú ý là không được khô
dung môi trong cột.
Cột phân bố: Cũng như sắc ký giấy, tách bằng cột
phân bố là thực hiện sự tách giữa 2 pha là pha cố định
và pha di động, thường là hệ lỏng – lỏng.
 SẮC KÝ CỘT –SKC - (CC)

b. Đưa mẫu thử vào cột:

Yêu cầu là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng
đồng đều trên một mặt phẳng. Có nhiều cách đưa chất
thử vào cột:
 Nạp mẫu ướt - cho thẳng dung dịch thử lên cột
 Nạp mẫu khô - trộn đều chất hấp phụ với mẫu chất thử,
cô đuổi cho khô dung môi và nạp vào cột.
c. Rửa cột
Dùng hệ dung môi chạy sắc ký ban đầu để rửa cột cho
sạch trước khi nạp mẫu chính thức.
 Kỹ thuật sắc ký cột nhanh

a. Đặc điểm
 Kỹ thuật sắc ký cột nhanh là kỹ thuật mà các thông
số tối ưu đã được xây dựng từ thực nghiệm với mục
đích làm cho việc ứng dụng được đơn giản, tiết kiệm,
nhanh
 Để nghiên cứu kỹ thuật này, tác giả cố định một số
yếu tố và chỉ thay đổi một số yếu tố cần thiết.
 Các yếu tố cố định là:
- Chất hấp phụ dùng cho mọi trường hợp là silicagel 60,
cở hạt 40-60m
- Chiều cao cột hấp phụ 15 cm
- Tốc độ chảy: Mỗi phút chảy được 5 cm chiều cao dung
môi trong cột cho mọi cở cột với mọi chất thử
b. Các bước tiến hành
 b1) Chọn dung môi:
 b2) Dựa vào Rf và Rf và lượng chất thử để chọn cột, thể
tích dung môi và ấn định số phân đoạn tập hợp theo bảng
trên
 b3) Chuẩn bị cột:
 b4) Vào dung dịch thử: Chủ yếu bằng phương pháp cho
thẳng dung dịch thử vào cột. Sau khi cho mẫu thử vào cột
xong cần phải điều chỉnh áp suất sao cho mỗi phút chảy
được 5cm chiều cao của cột
c) Ưu điểm của kỹ thuật sắc ký nhanh
 Tiết kiệm chất hấp phụ và dung môi, thời gian nhanh nhanh
hơn nhiều
 Nếu các chất có Rf từ 0,1-0,2 đều có thể tách được bằng
phương pháp này, nếu chọn được hệ dung môi thích hợp
 Đơn giản, dễ áp dụng nhờ các thông số đã được xây dựng
sẵn.
 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH
1.Phương pháp sắc ký
 Sắc ký giấy
 Sắc ký lớp mỏng
 Sắc ký khí
2. Các phương pháp phổ( IR, UV, NMR, MS...)
3. Các phương pháp vật lý khác
 Nhiệt độ nóng chảy
 Nhiệt độ sôi
 Chỉ số khúc xạ, góc quay cực

 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG

 1. Phân tích khối lượng
 2. Phân tích thể tích
PHỄU CHIẾT
CHROMATO-GRAPHY

Sắc ký giấy
QUÁ TRÌNH DIỄN RA TRONG CỘT SẮC KÝ
(COLUMN CHROMATO-GRAPHY)
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
SẮC KÝ ĐỒ HPLC/UPLC
SẮC KÝ ĐỒ LC-MS
SẮC KÝ CỘT TRUNG ÁP