ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP PPNCDL

1. Các tiêu chí lựa chọn dung môi chiết xuất trong nghiên cứu hóa học cây thuốc.
Nước, cồn: phân tích những thuận lợi và khó khăn của 2 dung môi này trong
chiết xuất hoạt chất từ dược liệu.
a) Tiêu chí lựa chọn dung môi chiết xuất trong nghiên cứu hóa học cây thuốc:

Việc lựa chọn dung môi chiết xuất tùy thuộc vào hoạt chất, tạp chất và phương pháp chiết
xuất. Đây là vấn đề quan trọng liên quan trực tiếp đến tất cả quy trình chiết xuất. Dưới đây
là một số tiêu chí lựa chọn dung môi chiết xuất trong nghiên cứu hóa học cây thuốc:

 Dung môi được chọn phải chiết được tối đa hoạt chất và ít tạp chất, phải có tính hòa tan
chọn lọc.
 Dễ thấm vào dược liệu (thường là dung các dung môi có độ nhớt thấp, linh động như
aceton,… hay có sức căng bề mặt nhỏ như diethyl ether,…).
 Trơ về mặt hóa học, không tạo ra các sản phẩm mới trong quá trình chiết xuất, không gây
khó khăn trong quá trình bảo quản, không bị phân hủy ở nhiệt độ cao.
 Có độc tính thấp: dựa vào độc tính có thể chia thành dung môi không độc như nước,…
dung môi độc như benzene,…
 Tính kinh tế: thường dung các dung môi có giá thành thấp, dễ kiếm như nước,… ngoài ra
còn có thể dung các dung môi đắt tiền.
 Không dễ gây cháy nổ, không gây ô nhiễm môi trường.
 Dựa vào nhiệt độ sôi có thể chia thành dung môi dễ bay hơi như ether, aceton,… và dung
môi khó bay hơi như nước,… Thường chọn các dung môi có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng
cô đặc dịch chiết và thu hồi,tiết kiệm dung môi.
 Nếu dược liệu đã được sử dụng trong YHCT thì nên dung dung môi và phương pháp chiết
xuất như cách mà người ta đã sử dụng để thu được các hoạt chất có hoạt tính mong muốn.
 Độ phân cực của dung môi là yếu tố quan trọng để xác định khả năng hòa tan hoạt chất:
dung môi phân cực mạnh (nước, methanol, etanol,…) dùng để hòa tan các hoạt chất phân
cực mạnh; dung môi phân cựu vừa và yếu (dicloromethan, aceton,…) hòa tan các chất
phân cực vừa và yếu; dung môi không phân cực (benzene, hexan, heptan,…) dùng để hòa
tan các chất không phân cực.
 Xác định rõ tính chất các hợp chất thứ cấp cần thiết, như khả năng hòa tan, khả năng phản
ứng, tính bền vững… thì cần lựa chọn dung môi và phương pháp chiết phù hợp nhằm
tránh tối đa hiện tượng phân hủy hoạt chất và tạo các tạp chất mới.

Tóm lại để có thể lựa chọn được một dung môi tốt cho quá trình chiết xuất thì phụ thuộc vào
rất nhiều yếu tố. Tùy từng trường hợp cụ thể mà người ta sẽ lựa chọn dung môi sao cho thích
hợp.

b) Những thuận lợi và khó khăn của 2 dung môi nước và cồn trong chiết xuất hoạt chất từ
dược liệu.
 Nước:
 Thuận lợi:
  Là dung môi thông dụng, rẽ tiền, dễ kiếm.
 Có pH trung tính, hạn chế được sự thủy phân hoạt chất trong môi
trường acid/base.
 Không độc hại, không gây cháy nổ.
 Dễ thấm vào dược liệu do có độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ.
 Có độ phân cực mạnh, có khả năng hòa tan được muối alkaloid, một số
glycoside, đường, chất nhầy, pectin, chất màu, các acid, ….
 Ở quy mô chiết xuất lớn hay chiết xuất ở quy mô công nghiệm, nước là
dung môi an toàn, rẻ tiền nên vẫn được lựa chọn
 Nếu chiết bằng dung môi nước hoặc hỗn hợp với nước thì có thể làm
khô bằng phương pháp đông khô.
 Khó khăn:
 Có khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất, tạo môi
trường cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển, dịch chiết khó bảo quản.
 Có thể gây thủy phân một số hoạt chất (glycoside , alkaloid).
 Có nhiệt độ sôi cao nên khi cô đặc dịch chiết có thể làm phân hủy hoạt
chất.
 Gây trương nở dược liệu vì thế không thích hợp cho một số phương
pháp như ngấm kiệt
 Chiết không chọn lọc
 Khó bay hơi dung môi
 Khả năng bảo quản (tránh vi khuẩn, nấm mốc) kém.
 Tùy theo mục đích và phương pháp chiết xuất có thể dùng nước cất, nước khử khoáng,
nước kiềm, nước acid, nước có chất bảo quản dùng làm dung môi chiết xuất.
 Cồn (Etanol)
 Thuận lợi:
 Có khả năng hòa tan chọn lọc các hoạt chất như alkaloid, một số
glycoside, các tinh dầu,…
 Có thể pha loãng với nước ở bất kỳ tỷ lệ nào để có độ cồn phù hợp
theo yêu cầu chiết xuất đối với từng loại hoạt chất và từng loại dược
liệu.
 Etanol có nồng độ > 20% có khả năng bảo quản, ngăn cản vi khuẩn và
nấm mốc phát triển.
 Nhiệt độ sôi thấp nên khi cô đặc dịch chiết, hoạt chất ít bị phân hủy.
 Etanol cao độ làm đông vón các chất nhầy, albumin, gôm, pectin,…
nên có thể dùng để loại tạp chất.
 Không làm trương nở dược liệu như nước.
 Xâm nhập vào màng tế bào tốt hơn nên chiết tốt các hợp chất nội bào.
 Khó khăn:
 Dễ cháy, có tác dụng dược lý riêng.
  Có độ nhớt cao, tính hút ẩm mạnh
 Tùy vào hoạt chất, dược liệu và phương pháp chiết xuất nên lựa chọn các độ cồn thích
hợp để làm dung môi chiết xuất. Ngoài ra có thể dùng Etanol được acid hóa bằng các
acid vô cơ hay hữu cơ để làm tăng hiệu suất chiết xuất.
 Hỗn hợp cồn – nước để tạo dịch chiết có độ phân cực thích hợp.
2. Phương pháp nhận biết và loại bỏ các tạp chất dễ tan trong nước trong quá trình
chiết xuất.
 Tanin
 Tanin đôi khi có hàm lượng rất cao trong một số dịch chiết
 Hợp chất này kết tủa với protein, ức chế một số enzyme nên có xu hướng
thay đổi (làm giảm) hoạt tính sinh học của dịch chiết.
 Tanin thực vật bản chất là các polyphenol nên thường có trong các dịch
chiết của dung môi phân cực
 Tannin : các cách loại tannin ra khỏi dịch chiết:
 Tủa với muối FeCl3.
 Loại bằng cách cho dịch chiết đi qua cột polyamid, Sephadex LH-20 hoặc cột
silica gel
 Loại tannin trong dung môi hữu cơ thì lắc với dung dịch muối cloride 1%,
loại bỏ pha phân cực. Sau đó làm khan pha dung môi hữu cơ bằng Na2SO4
trong vài giờ.
 Tanin bị tủa với gelatin, cafein, nylon hoặc protein.
 Tannin bị giữ lại bởi polyvinyl pyrolidone (PVP) hoặc polyamid resine bởi
các cầu nối giữa nhóm -OH phenol và các nhóm amin của tác nhân phản ứng.
Ngoài ra, diethyl amino ethyl cellulose cũng dùng để loại tannin nhưng
không giữ lại quá nhiều hợp chất phenol như PVP.
 Các hợp chất phenolic có thể loại đi bằng cách rửa với dung dịch NaOH 1%.
 Gôm
 Hòa tan dịch chiết trong ethanol 95% (có thể làm ấm trong trường hợp
cần thiết), cho chì acetat vào để tạo tủa với gom, sau đó lọc để loại bỏ.
 Nên lọc hút chân không qua phễu xốp vì gôm dễ gây tắc nghẽn trong quá
trình lọc.
3. Phương pháp nhận biết và loại bỏ các tạp chất ít tan trong nước trong quá trình
chiết xuất dược liệu.
 Lipid: Những dược liệu chứa các tạp chất là chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp,
nhựa: Nhận biết:
 Có trong dịch chiết khi chiết bằng dung môi không phân cực, dung môi
có độ phân cực tương đối như MeOH, EtOH
 Hợp chất này có thể được định tính bằng sắc ký lớp mỏng, thuốc thử là
hơi iod để trong lọ kín thì sẽ cho các vết màu nâu
 Trên phổ H-NMR là peak cao và rộng ở khoảng 1,2 đến 1,4ppm
 Dùng các alkan như n-hexan hoặc petroleum ether để loại chất béo, sáp
hoặc dầu mỡ.
 Chiết nguyên liệu với dung môi để loại chất béo rồi sau đó mới tiến hành
quy trình chiết xuất chính.
Hoặc chiết nguyên liệu với MeOH, EtOH, rồi sau đó lắc với các dung
môi ở trên để loại bỏ.
 Có thể sử dụng sắc ký cột silicagel pha thường (chất sẽ ra đầu trong quá
trình rửa giải) hoặc pha đảo (chất bị giữ lại ở trên cột).
 Có thể hòa tan dịch chiết trong hỗn hợp MeOH – nước, rồi sau đó lọc bỏ
kết tủa bởi nhóm hợp chất này khó tan trong hỗ hợp MeOH – nước.
 Chất màu: Những dược liệu có chứa tạp chất màu như chlorophyl, flavonoid,
anthranoid,… Chất màu
 Nhận biết: chất màu thường gặp là chlorophyl, glavônid, anthranoid
 Quá trình chiết xuất thực hiện với các bộ phận như lá, hoa, thân cành
 Chiết với nhiều loại dung môi
 Dùng than hoạt tính hoặc carbon hoạt tính (hấp phụ chọn lọc) tuy nhiên có
thể hấp thu cả các thành phần có hoạt tính (chất không màu) như
morphine, strychinin, quinine…
 Loại chlorophyll bằng lắc với các dung môi không phân cực, dùng ether,
cloroform để loại các tạp chất màu trong dịch chiết nước.
 Dùng cột silicagel pha thường thì hợp chất sẽ ra ở phân đoạn đầu và có
thể nhận ra bằng màu sắc trên cột.
 Dùng chì acetate 2-5% để tủa một số tạp chất trong đó có chlorophyll và
các tạp chất màu khác. Lọc để loại bỏ tạp
 Chất dẻo (plasticizers)
 Tạp chất dẻo có thể bị lẫn từ dung môi, giấy lọc, dụng cụ hoặc nhựa, chất
nhồi cột sắc ký chứa trong các thiết bị bằng nhựa
 Diotylphthalate ester là tạp chất thường gặp thuộc nhóm này:
 Có thể được phân lập ra ở dạng dầu tinh khiết, màu vàng và thường
nhầm lẫn là hợp chất được tách ra từ cây
 Hợp chất này có tác dụng gây độc ức chế tế bào ung thư như tế bào
ung thư bạch cầu
 Phát hiện trên sắc ký lớp mỏng dioctylphthalate ester cho vết màu
hồng tím khi đốt với H2SO4 hoặc hỗn hợp H2SO4/acid acetic (tỷ lệ
4:1) ở nhiệt độ 110C trong khoảng 5 phút. Rf ~0,4 khi triển khai với hệ
dung môi petroleum ether: ethyl acetat tỷ lệ 19:1.
 Chất nhựa
 Chất nhựa thường lẫn vào từ dung môi nen có thể bị loại bỏ bằng việc cất
dung môi trước khi dung
 Hoặc cho dịch chiết chạy sang cột silicagell pha đảo (nhựa sẽ được giữ
trên cột)
 Hoặc lọc dịch chiết qua phễu xốp nhôm oxide.
 Dầu bôi trơn
  Dầu bôi trơn silicon, paraffin thường được dung để bôi trơn trong các
dụng cụ chiết xuất có các khớp nối, van, khóa bằng thủy tinh.
 Các hợp chất này khi nhiễm vào dịch chiết hoặc các hợp chất phân lập
được thường được nhận ra ở phổ MS với các peak ion 429, 355, 281, 207
và 133.
4. Căn cứ để xây dựng phương pháp chiết xuất các hợp chất từ thiên nhiên; những
lưu ý khi lựa chọn phương pháp chiết xuất ứng dụng vào trong nghiên cứu và áp
dụng vào trong sản xuất.
a. Căn cứ để xây dựng phương pháp chiết xuất các hợp chất từ thiên nhiên dựa vào
các mục tiêu sau:
 Chiết càng kiệt hoạt chất càng tốt.
 Càng đơn giản, càng nhanh càng tốt.
 Càng tiết kiệm càng tốt.
 Càng bảo vệ được hoạt chất càng tốt.
b. Những lưu ý khi lựa chọn phương pháp chiết xuất:
 Lựa chọn phương pháp chiết xuất căn cứ vào:
 Việc lựa chọn quy trình chiết xuất phụ thuộc vào bản chất của nguồn nguyên
liệu đầu vào và các hợp chất dự kiến sẽ thu được. Trước khi lựa chọn
phương pháp cần phải thiết lập mục tiêu của quá trình chiết xuất.
 Tài liệu tham khảo: các quy trình chiết xuất có sẵn trong các tài liệu khoa
học,… nếu chiết xuất thực hiện với một dược liệu đã từng được nghiên cứu
trước đó thì cần tham khảo tài liệu để tìm quy trình tối ưu.
 Với dược liệu là mới, thì cần khảo sát quy mô nhỏ để lựa chọn dung môi và
các điều kiện chiết xuất thích hợp.
 Xác định kinh phí: nhằm xác định quy mô chiết xuất, điều kiện trang thiết bị,
dung môi,…
 Kinh nghiệm và khả năng thực hiện.
 Nguyên liệu, các phương pháp có thể áp dụng, thiết bị, dung môi…
- Khảo sát ở quy mô nhỏ
- Một loài nhưng điều kiện sống khác nhau, thời gian thu hái khác nhau thì
hàm lượng hoạt chất có thể khác nhau (chứ không phải do phương pháp
chiết mà đưa lại hiệu suất khác nhau)
- Các loài cùng một chi có thể khác nhau tương đối về thành phần hóa học.
- Việc xác định các chất chuyển hóa thứ cấp có ở trong nguyên liệu trước
khi chiết là quan trọng để xác định nhóm hoạt chất chuyển hóa thứ cấp có
thể được thực hiện bằng các phản ứng định tính, sklm hoặc kỹ thuật dấu
vân tay hóa học.
- Căn cứ vào hiệu suất để xác định nguồn nguyên liệu đầu vào, liệu sản
phẩm thu được có phù hợp cho các nghiên cứu xa hơn (thử nghiệm lâm
sàng, yêu cần về tính an toàn của dung môi, yêu cầu giữ được hương vị
với tinh dầu và chất thơm, yêu cần phân lập hoạt chất tinh khiết.
5. Trình bày khái niệm, phân loại các phương pháp sắc ký cột.
5.1. Khái niệm:
Sắc ký cột là một kỹ thuật sắc ký sử dụng để cắt các phân đoạn hoặc tách hỗn hợp
thành các chất hóa học thành những hợp chất riêng biệt, được tiến hành ở điều kiện
áp suất khí quyển. Với pha tĩnh là những hạt có kích thước xác định được nạp
trong một cột thủy tinh. Còn pha động là các dung môi ly giải thông thường được
đặt ở phía trên cao. Mẫu phân tích được đặt trên đầu cột phía trên pha tĩnh.
5.2. Phân loại:
 Sắc ký cột phân bố:
 Pha tĩnh là chất lỏng, được liên kết hóa học trên bề mặt của những hạt rắn,
nhuyễn mịn, có tính trơ.
 Sự tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp dựa vào việc mỗi hợp chất có hệ số
phân bố khác nhau giữa pha tĩnh (lớp chất lỏng trên bề mặt pha tĩnh) và pha
động (dung môi lỏng).
 Nếu pha tĩnh tương đối phân cực, các hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ bị
nó giữ mạnh hơn so với các hợp chất kém phân cực, hệ quả là các hợp chất
kém phân cực sẽ di chuyển ngang pha tĩnh nhanh hơn và ra khỏi cột sớm hơn
so với các hợp chất phân cực.
 Pha tĩnh có bản chất là một lớp chất lỏng được bao phủ trên bề mặt của một
chất mang rắn.
 Hoạt động dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong mẫu phân tích
vào 2 chất lỏng không trộn lẫn nhau: dung môi pha động và lớp chất lỏng
trên bề mặt pha tĩnh.
 Sự phân tách các cấu tử trong mẫu phân tích phụ thuộc chủ yếu vào hệ số
phân bố, đặc trung cho khả năng hòa tan, phân bố giữa các cấu tử vào pha
tĩnh và pha động.
 Sắc ký cột hấp phụ:
 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt nhuyễn mịn, có tính hấp phụ.
 Sự tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về ái lực hấp
phụ của phân tử các hợp chất phân tích với bề mặt pha tĩnh.
 Độ hấp phụ được kiểm soát bới một số yếu tố như: liên kết hydro, lực Van
der Wall, tương tác lưỡng cực, khả năng tạo phức, tính acid-base.
 Sắc ký cột trao đổi ion: Đây là phương pháp phổ biến nhất để phân tách, tinh chế
protein và các phân tử tích điện.
 Pha tĩnh là các hạt hình cầu, có cấu tạo hóa học là các polymer, trên bề mặt
có mang các nhóm chức hóa học dạng ion, gọi là các hạt nhựa trao đổi ion
(ionit). Gồm có 2 loại:
 Nhựa trao đổi cation (cationit): Mang nhóm chức có điện tích âm nên
bắt giữ các ion dương của pha động và giải phóng ra H+
 Nhựa trao đỏi anion (anionit): mang nhóm chức có điện tích dương nên
bắt giữ các ion âm của pha động và giải phóng ra OH-
  Sự bắt giữ xảy ra nhờ lực hút tĩnh điện giữa 2 điện tích trái dấu
 Sự tách riêng các hợp chất của hỗn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỗn
hợp mang điện tích ngược dấu với điện tích của hạt nhựa, bị hạt nhựa giữ lại
trong cột.
 Lực liên kết của các phân tử trong mẫu phân tích với các hạt pha tĩnh phụ
thuộc vào tương tác ion giữa các nhóm chức ion trái dấu. Lực tương tác này
mạnh hay yếu được xác định bởi số lượng và vị trí của các nhóm ion trên
phân tử mẫu phân tích và trên các hạt pha tĩnh. Các phân tử trong mẫu phân
tích có lực tương tác ion yếu sẽ được rửa giải ra khỏi cột trước. Các phân tử
có lực tương tác ion mạnh hơn sẽ liên kết mạnh với pha tĩnh và được rửa giải
ra sau.
 Sắc ký cột loại cỡ:
 Pha tĩnh là các hạt nhỏ mà trên bề mặt của nó có các lỗ rỗng nhỏ, kích thước
bằng nhau.
 Những chất phân tích có kích thước lỡn sẽ không thâm nhập sâu được vào
mạng lưới pha tĩnh nên được rửa giải sớm. Những chất phân tích có kích
thước nhỏ thâm nhập sâu vào pha tĩnh nên quãng đường đi dài hơn do đó sẽ
rửa giải muộn hơn.
 Quá trình phân tách phụ thuộc vào kích thước phân tử và hình dạng của các
chất phân tích trong hỗn hợp
 Trong sắc ký này, chất phân tích ít tương tác với pha tĩnh nên khả năng thu
hồi mẫu là lớn nhất so với các phương pháp sắc ký cột khác.
6. Trình bày các bước cơ bản để triển khai sắc ký cột và căn cứ để lựa chọn pha tĩnh
và pha động.
6.1. Các bước cơ bản để triển khai sắc ký cột
 Lựa chọn pha tĩnh và pha động.
 Nhồi cột: nhồi cột khô hay nhồi cột ướt.
 Nạp mẫu chất dưới dạng dung dịch hay bột khô tơi.
 Cho dung môi pha động lên trên pha tĩnh và chảy qua cột. Tiến hành khai triển cột
bằng các cách:
 Rửa giải bằng gradient
 Rửa giải nhờ trọng lực
 Rửa giải nhờ lực đẩy
 Rửa giải nhờ áp lực chân không
 Rửa giải nhờ lực bơm
 Theo dõi quá trình rửa giải và thu lấy các mẫu phân tích bằng tay hoặc bằng máy
hứng tự động.
 Tổng kết quả trình sắc ký: rửa giải cột cuối cùng bằng methanol sau khi thu lấy
khoảng 70-80% lượng mẫu đã nạp vào cột và chọn ra phân đoạn nào để tiếp tục
khảo sát.
 Báo cáo kết quả sắc ký cột.
 6.2. Căn cứ để lựa chọn pha tĩnh và pha động:
a. Căn cứ để lựa chọn pha tĩnh:
 Việc lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực và khả năng tách của mẫu
phân tích.
 Đối với các chất phân cực mạnh thì sắc ký trao đổi ion và sắc ký loại cỡ là lựa
chọn ưu tiên.
 Đối với các chất phân tích thuộc lớp chất đã biết thì có thể bắt đầu quá trình
phân lập bằng cách sử dụng các protocol đã được công bố.
 Đối với mẫu phân tích chưa dự đoán được độ phân cực của các hợp chất thì
thường dùng SKLM để lựa chọn pha tĩnh vì một số pha tĩnh trong SKLM cũng
được dùng trong sắc ký cột như silica gel, alumin.
b. Căn cứ để lựa chọn dung môi pha động:
 Dựa vào cách triển khai SKLM, có thể thu được các thông tin hữu ích cho việc
lựa chọn điều kiện sắc ký cũng như lựa chọn dung môi pha động để rửa giải được
càng nhiều chất càng tốt.
 Chuẩn bị dích chiết thô hoặc mẫu phân tích trong dung môi hữu cơ có nhiệt độ
sôi thấp, nồng độ tối thiểu là 10mg/mL
 Triển khai mẫu này (2-5L) với các loại SKLM khác nhau.
 Triển khai SKLM với các dung môi pha động khác nhau
 Quan sát các bản mỏng sắc ký dưới đèn UV hay phun thuốc thử đặc hiệu.
 Phân tích bản mỏng:
 Lựa chọn hệ dung môi có khả năng lưu giữ các hợp chất trong mẫu phân
tích với hệ số Rf = 0,2-0,3.
 Đối với dịch chiết thô, chọn dung môi rửa giải khởi đầu là dung môi có
thể đẩy vết chất lên vị trí cao nhất của cao chiết trên bản mỏng có Rf =
0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết
chất thấp nhất của cao chiết lên vị trí ở bản mỏng có Rf = 0,2.
7. Ưu nhược điểm và ứng dụng của sắc ký lớp mỏng.
7.1. Ưu nhược điểm.
 Ưa điểm:
 Rẻ tiền,tốn ít dung môi pha động, việc chuẩn bị mẫu đơn giản, dễ quan sát
trực quan.
 Chỉ cần một lượng mẫu rất ít để phân tích
 Có thê phân tích đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn đối chứng trong cùng
điều kiện phân tích.
 Thời gian thực hiện nhanh chóng.
 Để phát hiện vết sau khi triển khai sắc ký có thể sử dụng được các thuốc
thử mạnh như acid sulfuric, acid nitric.
 Trong trường hợp mẫu phân tích không có quá nhiều hợp chất, các hợp
chất này có thể được định vị trên bản mỏng sắc ký. Ứng dụng trong
SKLM điều chế.
  Có nhiều loại thuốc thử hiện màu.
 Có thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu một lần.
 Xử lý kết quả đơn giản, không bị nhiễm chéo hay ảnh hưởng bởi các mẫu
thử trước đó vì dung môi pha động thường chỉ dùng một lần.
 Nhược điểm:
 Đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp, SKLM có thể sẽ không cho
ra kết quả đúng vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao dẫn.
 Do chiều dài pha tĩnh ngắn nên khả năng phân tách còn hạn chế.
 Không thể tự động hóa hoàn toàn.
 Khó lặp lại được giá trị Rf dó bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau.
7.2. Ứng dụng của SKLM
 Định tính và thử tinh khiết
 Công bố đặc điểm của hợp chất vừa mới phân lập:
 Một hợp chất mới sau khi phân lập cần công bố các đặc điểm của hợp
chất này như phổ NMR, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực ,…
cũng như giá trị Rf của nó.
 Một chất tinh khiết sẽ có một vết với SKLM, có giá trị Rf không đổi
khi khai triển với một hệ dung môi xác định.
 Kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không bằng cách so sánh giá
trị Rf của 2 chất trên 3 bản mỏng sắc ký trong 3 hệ dung môi khai triển có độ
phân cực khác nhau và màu sắc khi cùng phun một loại thuốc thử. Chỉ cần
có 1 bản mỏng có sự sai khác về giá trị Rf của 2 chất này hoặc có cùng giá
trị Rf nhưng màu sắc 2 vết khác nhau thì 2 chất đó là khác nhau.
 Tìm hiểu sơ bộ tính chất của mẫu chất phân tích:
 Biết được số hợp chất có trong hỗn hợp mẫu phân tích. Căn cứ vào số
lượng vết trên sắc ký đồ để dự đoán sơ bộ số lượng các hợp chất có
mặt trong mẫu phân tích. Tuy nhiên do bản mỏng có độ phân giải thấp
nên có trường hợp một vết nhưng của hỗn hợp nhiều chất chưa tách.
Có thể căn cứ vào độ đậm của vết chất khi đốt với H2SO4 10% để sơ
bộ đánh giá sự tương quan hàm lượng của các vết chất có trong hỗn
hợp
 Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất: thử trên 3 bản mỏng sắc ký với 3
hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Nếu hợp chất tinh khiết, cả 3
bản mỏng sẽ cho ra vết tròn đều, màu sắc đồng nhất, chỉ cho một vết
duy nhất không có bất kì vết bẩn hay vết chất khác.
 Biết được độ phân cực của các hợp chất trong mẫu phân tích.
Đối với SKLM pha thuận, các chất kém phân cực cho Rf lớn còn chất
phân cực cao cho Rf bé. Đối với SKLM pha đão, các chất càng phân
cực cho Rf lớn còn chất kém phân cực cho Rf bé.
 Định hướng phân lập bằng sắc ký cột: lựa chọn dung môi khai triển sắc ký
cột bằng cách khảo sát với SKLM. Chọn dung môi nào có thể kéo vết chất
lên vị trí ở bản mỏng có giá trị Rf thường trong khoảng 0,2-0,3.
  Theo dõi tiến trình xảy ra phản ứng: triển khai 3 vết chất gồm chất tham gia
phản ứng, hỗn hợp trong quá trình phản ứng và sản phẩm tạo thành trên
cùng một bản sắc ký lớp mỏng. Trên sắc ký đồ tại vế hỗn hợp trong quá
trình phản ứng, lúc phản ứng bắt đầu xảy ra thì xuất hiện vế chất tham gia,
không xuất hiện vết chất sản phẩm. Trái lại khi phản ứng đã kết thúc thì
không xuất hiện vết chất tham gia phản ứng vì khi đó chất tham gia phản
ứng đã tiêu thụ hết trong quá trình hình thành sản phẩm.
 Kiểm tra độ bền của một hợp chất: thực hiện ly giải 2 chiều với cùng một hệ
dung môi cho 2 quá trình sắc ký. Hợp chất nào có tính chất không bị thay
đổi bới bất cứ yếu tố nào (ánh sang, không khí, dung môi) thì phải có vết
trên đường chéo của bản mỏng.
 Bán định lượng: dùng trong các máy tự động hóa chuyên dùng.
8. Các yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf
 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
Khi tiến hành sắc ký cùng một dung môi pha động, với các chất hấp phụ khác
nhau cho các giá trị Rf khác nhau. Các bản mỏng tráng sắn silica gel cần được
cất trong bình hút ẩm và cần được hoạt hóa trước khi dùng.
 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
 Chiều dày tiêu chuẩn là 250 m., nếu < 200 m thì cho giá trị Rf sai khác
đáng kể.
 Quảng đường chạy sắc ký dài thì khả năng phân tách càng tốt.
 Lượng chất chấm: nồng độ mẫu lớn thì chấm ít, còn mẫu loãng thì chấm
nhiều.
 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng
 Thành phần và độ phân cực của pha động: mỗi hệ dung môi khác nhau sẽ cho
các giá trị Rf khác nhau. Độ phân cực của pha động quyết định đến khả năng hòa
tan chất phân tích trong pha động. Dung môi pha động có độ phân cực tương tự
độ phân cực của chất phân tích sẽ dễ dàng hòa tan chất phân tích và mang chất
phân tích đi nhanh hơn khi pha động di chuyển trên bản mỏng. Trong sắc ký pha
thường, dung môi càng phân cực cho giá trị Rf càng cao.
 Phương pháp khai triển sắc ký: sắc ký ngang, sắc ký dọc, hay sắc ký 2 chiều.
 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký. Trước khi triển khai sắc ký thì cần
bão hòa dung môi trong bình bằng cách đặt giấy lọc quanh bình và để ổn định
trong vòng 20 phút trước khi khai triển. Bình sắc ký phải được đậy kín nắp.
 Ảnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành phần hỗn hợp cần tách
 Độ ẩm, nhiệt độ, và pH…
Nhiệt độ cao làm dung môi pha động bay hơi nhanh chóng, tốc độ di chuyển của
pha động nhanh hơn do đó Rf tăng đáng kể, khả năng phân tách không còn chính
xác. Vì vậy, khi tiến hành sắc ký cần tránh xa nguồn nhiệt và ánh sáng mặt trời
chiếu trực tiếp.
9. Sắc ký lớp mỏng: khái niệm, nguyên tắc, dụng cụ, cách tiến hành.
9.1. Khái niệm:
SKLM là phương pháp phân tách các thành phần riêng lẻ trong hỗn hợp mẫu chủ
yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ, trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp của
dung môi, di chuyển ngang pha tĩnh là một chất tương đối trơ về mặt hóa học như
silica gel, alumin oxyd, được tráng thành lớp mỏng đều phủ trên nền phẳng như tấm
nhôm, tấm kính,…
9.2. Nguyên tắc:
Khi pha động di chuyển trên bản mỏng, đầu tiên dung môi sẽ hòa tan mẫu phân tích.
Các chất di chuyển nhanh hay chậm (Rf cao hay thấp) phụ thuộc vào hai yếu tố: khả
năng hòa tan chất phân tích của dung môi và mức độ liên kết của chất phân tích với
pha tĩnh.
Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển
các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau do sự hấp phụ, phân bố … tạo
thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau.
9.3. Dụng cụ:
 Bình sắc ký: chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh hình trụ hoặc hình chữ nhật có nắp đậy.
 Pha tĩnh: thường là các chất hấp phụ như silica gel, alumin oxyd,… được tráng thành
lớp mỏng có bề dày 250 m, đều, phủ trên bề mặt phẳng của tấm kính, tấm nhôm,…
Trước khi dùng, các bản mỏng cần được hoạt hóa.
 Pha động là dung môi hay hỗn hợp nhiều dung môi, di chuyển chậm chậm dọc theo
tấm lớp mỏng và lôi kéo các hợp phần của mẫu phân tích đi theo nó. Trước khi khai
triển sắc ký cần được bão hòa dung môi.
 Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng
1L dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng khoảng 2-5%.
 Thuốc thử hiện màu: đặc hiệu cho từng loại hoạt chất hoặc là các thuốc thử dùng để
phát hiện vết như H2SO4,.... hay hiện màu bằng soi UV ở bước sóng 245nm hay 365
nm tùy theo bản chất của hoạt chất có trong mẫu phân tích hay là bản chất của bản
mỏng.
9.4. Cách tiến hành:
 Chuẩn bị mẫu:
Mẫu được xử lý qua một số bước như xử lý cơ học, lọc, tách, cô đặc,… để làm sạch
và loại bỏ các tạp chất không mong muốn.
 Lựa chọn bản mỏng sắc ký:
Hiệu quả tách của SKLM phụ thuộc nhiều vào pha tĩnh. Trong SKLM (TLC) thường
sử dụng các hạt silica gel có kích thước 12m. Có hai loại silica gel hay dùng: silica
gel pha thuận (pha thường, pha tĩnh phân cực) và silica gel pha đão (pha tĩnh không
phân cực). Trước khi dùng các cần được hoạt hóa bằng cách sấy bản mỏng ở nhiệt
độ 105-110oC trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm.
 Lựa chọn dung môi pha động:
 Việc lựa chọn dung môi pha động chủ yếu dựa vào các thí nghiệm, chưa có
quy tắc cụ thể nảo cho việc này.
  Có thể dùng hỗn hợp dung môi, thêm nước, thêm acid hoặc base để tối ưu hóa
độ hòa tan của mẫu phân tích trong hệ dung môi đó:
 Thêm các chất phân cực hoặc ion hóa mẫu phân tích để tách tối trong
dung dịch là nước.
 Thêm acid để tăng độ hòa tan của các thành phần có tính base trong hỗn
hợp
 Thêm base để tăng độ hòa tan của các thành phần có tính acid trong hỗn
hợp
 Đối với SKLM pha thường: thường dùng các dung môi kém phân cực như n-
hexan, aceton, ethyl acetat,… Các chất kém phân cực sẽ được rửa giải ra sớm
hơn các chất phân cực. ngược lại, nếu dùng dung môi phân cực thì các hợp
phần phân cực sẽ được kéo xa hơn trên bản sắc ký.
 Tương tự đối với SKLM pha đão: thường dùng các dung môi phân cực như
nước, ethanol, acetonitril, acid acetic,…
 Hệ dung môi thích hợp là những hệ dung môi làm cho các thành phần của
mẫu phân tích di chuyển khỏi vị trí xuất phát và có giá trị Rf vào khoảng 0,15-
0,8 (lý tưởng nhất là từ 0,2-0,4).
 Một số yếu tố lưu ý khi lựa chọn dung môi:
 Bản chất của chất phân tích
 Bàn chất của pha tĩnh
 Giá cả: nếu 2 hệ dung môi cho khả năng tách như nhau thì chọn hệ
dung môi có giá rẽ hơn.
 Độc tính: nếu 2 hệ dung môi cho khả năng tách như nhau thì chọn hệ
dung môi có độc tín thấp, an toàn hơn cho người sử dụng cũng như môi
trường xung quanh.
 Chấm mẫu sắc ký:
 Mẫu đưa lên bảng sắc ký là dạng dung dịch. Dùng ống mao quản để chấm
dung dịch mẫu với thể tích từ 0,1-1L lên điểm xuất phát.
 Lượng mẫu nhỏ quá sẽ khó quan sát, lượng mẫu lớn quá sẽ gây quá tải và sai
khác kết quả.
 Chấm thành vết tròn hay vạch ngắn đều nhau.
 Lưu ý khi chấm mẫu sắc ký:
 Dùng bút chì gỗ mũi tù để đánh dấu vị trí xuất phát và điểm kết thúc,
không dùng bút mực.
 Không để điểm chấm mẫu ngập chìm trong dung môi.
 Sau khí chấm nên sấy nhẹ làm khô dung môi.
 Khai triển sắc ký:
 Dung môi trong bình sắc ký cần được làm bão hòa trước khi khai triển bằng
cách bỏ giấy lọc vào bên trong bình và để ổn định một thời gian.
 Các cách khai triển: khai triển đi lên, khai triển đi xuống, khai triển hai chiều.
 Lưu ý khí khai triển bản mỏng:
  Đặt bản mỏng thẳng đứng trong bình khai triển đã chứa dung môi.
 Kiểm tra thường xuyên trong quá trình khai triển sắc ký. Không làm
dịch chuyển hay thay đổi vị trí của bản mỏng cũng như là vị trí bình sắc
ký để hạn chế sự dao động dung môi trong bình, gây ảnh hưởng đến
quá trính phân tách.
 Lấy bản mỏng ra ngoài khí dung môi chạy cách mép trên từ 0,5-1 cm
hay đến điểm kết thúc đã đánh dấu.
 Làm khô bản mỏng và phát hiện chất phân tích:
 Làm khô bản mỏng trước khi soi UV hay phun thuốc thử.
 Phát hiện vết bằng soi UV hay phun thuốc thử
 Dùng bút chì đánh dấu lại các vị trí có vết dưới đèn UV
 Tính giá trị Rf
10.Trình bày các phương pháp nhồi cột sắc ký:
10.1. Phương pháp nhồi cột ướt:
 Là phương pháp duy nhất để nhồi cột đối với các loại pha tĩnh trương nở trong
dung môi pha động như Sephadex G-10. Dễ thực hiện, hay được sử dụng để nạp
cột.
 B1: Mở khóa cột sắc ký đã nhồi sẳn bông và cho cốc thủy tinh hứng vòi cột.
 B2 : Chuẩn bị hệ dung môi pha động.
 B3 Cho từ từ hệ dung môi pha động vào cốc chứa silica gel dự định nhồi cột,
dùng đũa thủy tinh khuấy đều để silica gel thấm và đuổi bọt khí ra khỏi hổn
hợp. Còn đối với các loại pha tĩnh trương nỡ thì để ổn định cho pha tĩnh
trương nở hoàn toàn.
 B4 Cho hổn hợp lên cột, chú ý dùng đủa thủy tinh để hổn hợp chảy nhẹ lên
thành cột tránh tạo bọt khí.
 B5 Dùng dung môi rửa giải để tráng phần silica gel còn dính trên thành cột,
tiếp tục cho dung môi tránh khô bề mặt cột.
 B6: Dùng búa cao su gỏ đều đặn nhẹ nhàng sung quanh cột để silica gel phân
bố đều trong lòng cột và tạo bề mặt tương đối phẳng, khi chiều cao cột ổn
định tiếp tục cho pha động chảy qua để cột ổn định trong vòng 15 phút. Đợi
mức dung môi cách cột 1cm thì khóa vòi cột.
10.2. Phương pháp nhồi cột khô:
 Thường áp dụng với pha tĩnh là silica gel hoặc silica gel liên kết, hữu ích với
phương pháp sắc ký lỏng chân không.
 B1: Cho phểu thủy thinh lên cột đã nhồi sẳn bông ở đáy cột, mở khóa cột.
 B2: Cho từ từ Silicagel qua phễu cho đến hết lượng dự định dùng.
 B3: Dùng búa cao su hoặc thanh cứng có đầu cao su, gõ nhẹ và đều đặn
quanh cột để sicagel được nén chặt và phan bố đều trong lòng sắc ký. Đến
khi chiều cao cột ổn định và bề mặt tương đối phẳng thì dừng lại.
 B4 : Mở khóa cột, rót dung môi khai triển vào nhẹ nhàng, đợi dung môi thấm
đều mới được rót tiếp phần còn lại. Cho dung môi chảy ổn định khoảng 15
 phút. Gõ nhẹ nếu bề mặt phẳng bị sáo trộn. Đợi mức dung môi cách bề mặt
silicagel khoảng 1 cm thì dừng lại.
11.Trình bày các phương pháp rửa giải cột sắc ký. Phân tích ưu nhước điểm của mỗi
phương pháp.
11.1. Rửa giải bằng gradient:
 Thay đổi thành phần dung môi pha động theo tính phân cực giúp quá
trình phân tách tốt hơn. Bước nhảy gradien nồng độ tạo ra bằng thay
đổi tĩ lệ dung môi pha động phân cực và kém phân cực chảy qua cột.
 Ưu: Đơn giản kết qủa phân tách tốt.
 Nhược:Thay đổi độ phân cực đột ngột dể gảy cột sắc ký.
11.2. Rửa giải nhờ vào trọng lực:
 Phân tách nhờ tác dụng của trọng lực kéo dung môi pha động đi xuống. Phân
tách tốt khi kích thước tiểu phân lớn hơn 60 m.
 Ưu: Đơn giản.
 Nhược: kích thước pha tĩnh phải lớn hơn 60 m, thời gian sắc ký lâu.
11.3. Rửa giải nhờ vào lực đẩy: còn gọi là sắc ký nhanh hay sắc ký chớp nhoáng.
 Tác dụng một áp lực lên cột từ trên xuống để tăng tốc độ rửa giả lên sắc ký,
thường sử dụng các hạt pha tĩnh 40 – 60 m . Cột phải chịu được lực.
 Ưu: Thời gian nhanh phân
 Nhược: Dễ bị doãng pic do sự di chuyển không đều, không an toàn cột dễ bị vở
nếu áp suất lớn.
11.4. Rửa giải nhờ vào lực hút chân không:
 Đặt một áp lực phía đầu ra của cột. Tạo một lực hút giúp pha động đi chuyển
nhanh hơn do đó quá trình sác ký nhanh hơn. Thường dùng để tinh chế mẫu
phân tích hoặc phân tách dịch chiết thô thành các phân đoạn nhỏ.
 Ưu:An toàn
 Nhược: khó kiểm soát tốc độ chảy pha động.
11.5. Rửa giải nhờ vào lực bơm:
 Sử dụng bơm để kiểm soát tốc độ dòng chảy pha động.
 Chia làm 3 loại:
 Sắc ký cột áp suất thấp (LPLC) kích thước hạt pha tĩnh 40-200m, áp suất
nhỏ hơn áp suất khí quyển.
 Sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC) kích thước hạt pha tĩnh 25-40m,
áp suất từ 75-600 psi.
 Sắc ký cột áp suất cao (HPLC) kích thước hạt pha tĩnh 4-12, áp suất từ
500-3000 psi.
 Độ phân giải giảm dần theo thứ tự: HPLC > MPLC > LPLC.
 Thời gian khai triển tăng theo thứ tự: HPLC < MPLC < LPLC.
 Ưu: Kiểm soát được tốc độ dòng chảy.

12.Bài tập về sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, HPLC.

 Cần chú ý đến dạng câu hỏi thứ tự rửa giải các hợp chất phân đoạn trong dung môi. Ta
có các dung môi được sắp xếp theo thứ tự tăng dần độ phân cực như sau:
Hexan, heptan, pen tan < cyclohexan < CCl4 < toluen < benzen < diethyl ether <
dicloromethan < 1,2-dicloroethane < n buthanol < cloroform < ethyl acetat < aceton,
methanol < ethanol <acetonitrile < acid acetic < dimethyl sulfoxide < nước.
(có thể tham khảo thêm ở trang 73 trong phụ lục sách thực tập PPNCDL).
 Cần chú ý đến dạng thay đổi hệ dung môi để làm tăng hay giảm Rf