PODSTAWY BIOCHEMII DLA TOWAROZNAWCÓW

Podręcznik
pod redakcją Mariana Filipiaka
Pamięci docenta Jerzego Krauze,
naszego Nauczyciela i Przyjaciela

autorzy

II
Autorzy:
BIAŁKA – Daniela Gwiazdowska
WĘGLOWODANY – Alina Piotraszewska-Pająk
LIPIDY – Daniela Gwiazdowska
KWASY NUKLEINOWE – Marta Ligaj
WITAMINY – Marta Ligaj
ENZYMY – Marian Filipiak
WYBRANE METODY STOSOWANE W ANALIZIE BIOCHEMICZNEJ
– Daniela Gwiazdowska, Marta Ligaj

III
Od autorów

Biochemia i nauki pokrewne takie jak biotechnologia czy biologia molekularna są w

trakcie dynamicznego rozwoju wpływającego na wzrost gospodarczy, a jednocześnie na
jakość naszego życia. Wiedza z zakresu biochemii stanowi fundament nauk
przyrodniczych będących jednym z trzech filarów towaroznawstwa. Dlatego też
studenci kierunku Towaroznawstwo powinni opanować tę naukę przynajmniej w
podstawowym zakresie. Intencją autorów niniejszego podręcznika nie było opracowanie
i przedstawienie wszystkich zagadnień wchodzących w zakres biochemii, wybrane
zostały te, które w naszej opinii są najbardziej przydatne towaroznawcom.

Biochemia jest nauką eksperymentalną, gdzie wszelkie kanony powstają na drodze

doświadczalnej, a teorie stają się obowiązującymi, jeżeli zostaną potwierdzone przez
eksperyment. Poznawanie biochemii musi się więc ściśle łączyć z
eksperymentowaniem. Dlatego podręcznik zawiera procedury kilkunastu doświadczeń,
które studenci powinni przeprowadzić równolegle z przyswajaniem materiału
wykładowego. Ponadto ostatni rozdział podręcznika prezentuje najpopularniejsze w
analityce biochemicznej metody badawcze.

Podręcznik przeznaczony jest przede wszystkim dla studentów kierunku

Towaroznawstwo, ale także i innych pokrewnych kierunków studiów wyższych, na
których program przewiduje nauczanie biochemii w zbliżonym zakresie.

Podręcznik dedykujemy naszym studentom, którzy ciągle przekonują nas o tym, że

najlepszym sposobem poznawania przedmiotu jest jego nauczanie.

IV
SPIS TREŚCI
BIAŁKA
1. Wprowadzenie
2. Aminokwasy – jednostki strukturalne białek
2.1. Klasyfikacja aminokwasów
2.1.1. Aminokwasy białkowe i niebiałkowe
2.1.2. Zdolność organizmu do syntezy aminokwasów
2.1.3. Budowa łańcucha bocznego
2.1.4. Powinowactwo aminokwasów do wody
2.2. Właściwości aminokwasów
2.2.1. Właściwości amfoteryczne aminokwasów
2.2.2. Reakcje charakterystyczne aminokwasów
2.3. Metody rozdziału i identyfikacji aminokwasów
2.3.1. Chromatografia jonowymienna
2.3.2. Chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa
3. Struktura i właściwości białek
3.1. Struktura białek
3.1.1. Wiązania odpowiedzialne za strukturę białek
3.1.2. Struktura pierwszorzędowa i wtórna białek
3.2. Klasyfikacja białek
3.2.1. Budowa białek
3.2.2. Kształt cząsteczki
3.2.3. Wartość odżywcza białek
3.3. Właściwości białek
3.3.1. Właściwości amfoteryczne białek
3.3.2. Rozpuszczalność białek
3.3.3. Koagulacja
3.3.4. Denaturacja
3.3.5. Oddziaływania pomiędzy białkami
3.4. Izolacja i oczyszczanie białek
3.4.1. Dializa
3.4.2. Ultrawirowanie
3.4.3. Chromatografia
3.4.4. Elektroforeza

1
 3.5. Ilościowe oznaczanie białek
3.5.1. Bezpośrednia metoda pomiaru absorbancji w nadfiolecie
3.5.2. Pośrednie metody kolorymetryczne
3.6. Test immunoenzymatyczny ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) –
wykrywanie i ilościowe oznaczanie białek
4. Zagadnienia
5. Część eksperymentalna
5.1. Reakcje barwne aminokwasów i białek
5.1.1. Reakcja z ninhydryną
5.1.2. Reakcja Adamkiewicza – Hopkinsa (wykrywanie tryptofanu)
5.1.3. Reakcja Sakaguchi (wykrywanie argininy)
5.1.4. Reakcja Pauliego (wykrywanie histydyny)
5.1.5. Reakcje aminokwasów siarkowych
5.1.6. Reakcja biuretowa – wykrywanie wiązań peptydowych
5.2. Metody wytrącania białek z roztworu
5.2.1. Wysalanie białek siarczanem amonowym
5.2.2. Wytrącanie białka etanolem
5.2.3. Wytrącanie białka za pomocą kationów
5.2.4. Wytrącanie białka za pomocą anionów
5.2.5. Denaturacja białka przez ogrzewanie
5.3. Chromatografia aminokwasów i białek
5.3.1. Rozdział aminokwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej
5.3.2. Odsalanie białka metodą chromatografii żelowej na kolumnie z
żelem Sephadex G-25
5.4. Ilościowe oznaczanie białek
5.4.1. Metoda Lowry’ego
5.4.2. Metoda Bradforda
WĘGLOWODANY
1. Wprowadzenie
2. Podział węglowodanów
3. Funkcje węglowodanów i ich występowanie
4. Właściwości funkcjonalne i znaczenie technologiczne węglowodanów
5. Struktura węglowodanów
5.1. Monosacharydy

2
 5.2. Disacharydy i inne ważniejsze oligosacharydy
5.3. Polisacharydy
5.4. Pochodne węglowodanów i polisacharydy kwaśne
6. Właściwości fizyczne i chemiczne węglowodanów
6.1. Czynność optyczna i zjawisko mutarotacji
6.2. Właściwości redukujące
6.3. Właściwości węglowodanów w środowisku kwaśnym
7. Metody wykrywania i ilościowego oznaczania węglowodanów
7.1. Metody fizyczne
7.2. Metody chemiczne
7.3. Metody enzymatyczne
7.4. Metody chromatograficzne
8. Zagadnienia
9. Część eksperymentalna
9.1. Wykrywanie węglowodanów z wykorzystaniem ich właściwości
redukujących
9.1.1. Próba Fehlinga
9.1.2. Redukcja błękitu metylenowego
9.1.3. Próba Barfoeda
9.2. Metody oparte na reakcjach barwnych w środowisku kwaśnym
9.2.1. Próba Molischa
9.2.2. Próba Biala
9.2.3. Próba Seliwanowa
9.3. Wykrywanie glukozy przy użyciu oksydazy glukozowej
9.4. Wykrywanie skrobi
9.5. Rozdział mono- i disacharydów metodą chromatografii cienkowarstwowej
na żelu krzemionkowym
LIPIDY
1. Wprowadzenie
2. Klasyfikacja lipidów
3. Kwasy tłuszczowe
3.1. Kwasy tłuszczowe nasycone
3.2. Kwasy tłuszczowe nienasycone
3.2.1. Kwasy tłuszczowe jednonienasycone

3
 3.2.2. Kwasy tłuszczowe wielonienasycone
4. Charakterystyka lipidów
4.1. Lipidy proste
4.1.1. Lipidy właściwe
4.1.2. Woski
4.2. Lipidy złożone
4.2.1. Fosfolipidy
4.2.2. Glikolipidy
5. Właściwości fizykochemiczne tłuszczów
6. Metody badania lipidów
7. Zagadnienia
8. Część eksperymentalna
8.1. Wykrywanie składników tłuszczów właściwych
8.1.1. Zmydlanie tłuszczu
8.1.2. Wysalanie mydeł
8.1.3. Wytrącanie kwasów tłuszczowych z mydeł
8.1.4. Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych
8.1.5. Wykrywanie glicerolu
8.2. Wykrywanie składników glicerofosfolipidów
8.2.1. Wykrywanie glicerolu
8.2.2. Zmydlanie glicerofosfolipidów
8.2.3. Wykrywanie choliny
8.3. Rozdział lipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej
KWASY NUKLEINOWE
1. Wprowadzenie
2. Nukleotydy – jednostki strukturalne kwasów nukleinowych
3. Struktura i funkcje DNA
4. Struktura, rodzaje i funkcje RNA
5. Badanie kwasów nukleinowych
5.1. Izolacja DNA
5.2. Izolacja RNA
5.3. Metody spektrofotometryczne w analizie nukleotydów i kwasów
nukleinowych
5.4. Elektroforeza w badaniu kwasów nukleinowych

4
 5.5. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)
5.6. Wykrywanie pentoz wchodzących w skład kwasów nukleinowych
6. Zagadnienia
7. Część eksperymentalna
7.1. Izolacja DNA
7.1.1. Izolacja DNA z komórek bakterii
7.1.2. Izolacja DNA z tkanek zwierzęcych z wysalaniem białek
7.2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
7.3. Oznaczanie czystości i obliczanie stężenia DNA i RNA metodą
spektrofotometryczną
7.4. Identyfikacja i ilościowe oznaczanie nukleotydów metodą
spektrofotometryczną
7.5. Wykrywanie kwasów nukleinowych na podstawie obecności pentozy
7.5.1. Wykrywanie RNA na podstawie obecności rybozy
7.5.2. Wykrywanie DNA na podstawie obecności deoksyrybozy
WITAMINY
1. Wprowadzenie
2. Witaminy, zapotrzebowanie i objawy niedoboru
3. Źródła witamin w diecie i straty podczas obróbki żywności
4. Oznaczanie zawartości witamin w żywności
5. Witaminy i prowitaminy, aktywność biologiczna i sposoby jej wyrażania
6. Biologiczne funkcje witamin
6.1. Koenzymatyczne funkcje witamin
6.2. Witaminy jako przeciwutleniacze
7. Podział witamin
7.1. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach
7.1.1. Witamina A
7.1.2. Witamina D
7.1.3. Witamina E
7.1.4. Witamina K
7.2. Witaminy rozpuszczalne w wodzie
7.2.1. Witamina C
7.2.2. Witamina B1
7.2.3. Witamina B2

5
 7.2.4. Witamina PP
7.2.5. Kwas pantotenowy
7.2.6. Witamina B6
7.2.7. Kwas foliowy
7.2.8. Witamina B12
7.2.9. Biotyna
8. Zagadnienia
9. Część eksperymentalna
9.1. Rozdział karotenoidów metodą chromatografii adsorpcyjnej na tlenku glinu
i oznaczanie ilościowe β-karotenu i likopenu
9.2. Oznaczanie ilościowe witaminy C
9.2.1. Oznaczanie kwasu L-askorbinowego metodą miareczkowania roztworem
2,6 dichlorofenoloindofenolu
9.2.2. Oznaczanie sumy kwasów L-askorbinowego i dehydro-L-askorbinowego
metodą Pijanowskiego
9.3. Oznaczanie zawartości witaminy B2 w mleku na podstawie fluorescencji
ryboflawiny
ENZYMY
1. Wprowadzenie
2. Proces katalizy enzymatycznej
3. Klasyfikacja enzymów
4. Aktywność enzymatyczna
5. Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej
5.1. Temperatura
5.2. pH
5.3. Stężenie enzymu
5.4. Stężenie substratu
5.5. Aktywatory i inhibitory
6. Zagadnienia
7. Część eksperymentalna
7.1. Oksydoreduktazy. Oznaczanie aktywności katalazy i peroksydazy
7.1.1. Charakterystyka enzymów katalizujących procesy utleniania i
redukcji
7.1.2. Oznaczanie aktywności peroksydazy w materiale roślinnym

6
 7.1.3. Oznaczanie aktywności katalazy w mące
7.2. Scukrzanie skrobi przy udziale hydrolaz glikozydów
7.2.1. Charakterystyka enzymów katalizujących rozkład węglowodanów
7.2.2. Hydroliza skrobi przy użyciu glukoamylazy
7.2.3. Oznaczanie zawartości cukrów redukujących
8. Przegląd podstawowych procesów metabolicznych
8.1. Metabolizm węglowodanów
8.2. Metabolizm białek
8.3. Metabolizm lipidów
9. Zagadnienia
WYBRANE METODY STOSOWANE W ANALIZIE BIOCHEMICZNEJ
1. Wprowadzenie
2. Metody spektrofotometryczne
2.1. Spektrofotometria absorpcyjna UV-VIS
2.2. Spektrofluorymetria
3. Metody chromatograficzne
3.1. Charakterystyka wybranych metod chromatograficznych
3.1.1. Technika wykonania rozdziału
3.1.2. Charakter oddziaływań pomiędzy fazą stacjonarną i ruchomą
3.1.3. Stan skupienia fazy ruchomej
4. Elektroforeza
LITERATURA

7
8
 BIAŁKA

1. Wprowadzenie
Białka stanowią podstawowy składnik suchej masy komórki (do 70%). Pod względem
chemicznym stanowią wielkocząsteczkowe polimery złożone z aminokwasów, o masie od
około 10 000 do kilku milionów Daltonów.
W komórkach białka stanowią materiał budulcowy struktur komórkowych
oraz pełnią szereg funkcji katalitycznych i regulatorowych. Białka wiążą wodę niezbędną
do procesów życiowych, biorą udział w regulacji ciśnienia wewnątrzustrojowego
i utrzymaniu stałego pH. Są odpowiedzialne za transport innych molekuł wewnątrz
komórki i przez błony komórkowe. Struktury złożone z białek pełnią podstawową rolę
w przekazie i obiegu sygnałów nerwowych. Wyspecjalizowane białka są składnikami
komórek mięśni, skóry i włosów. Pełniąc rolę przeciwciał i hormonów wpływają na układ
odpornościowy i hormonalny organizmu.

2. Aminokwasy – jednostki strukturalne białek

Podstawowymi elementami strukturalnymi peptydów i białek są aminokwasy.
Występują również w stanie wolnym, pełniąc inne funkcje biologiczne. Mogą stanowić
m.in. substraty w utlenianiu komórkowym czy też syntezie związków ważnych
biologicznie jak np. zasady azotowe. Aminokwasy bądź ich pochodne mogą pełnić rolę
neuroprzekaźników, neurohormonów lub hormonów.
Są to proste związki organiczne zawierające w swojej cząsteczce przynajmniej jedną
grupę aminową NH2 i jedną karboksylową COOH.
Wszystkie aminokwasy występujące w białkach ludzkich i zwierzęcych to
α-aminokwasy co oznacza, że grupa aminowa jest połączona z atomem węgla α czyli
związanym z grupą karboksylową. W zależności od wzajemnego usytuowania grup
funkcyjnych możemy rozróżnić jeszcze β-aminokwasy, w których grupy NH2
i COOH leżą przy sąsiednich atomach węgla, aminokwasy γ (grupy NH2 i COOH
oddalone o trzy atomy węgla) itd. Pojęciem -aminokwas określa się takie aminokwasy,
w których grupy aminowa i karboksylowa są od siebie maksymalnie oddalone.
W cząsteczce α-aminokwasu z atomem węgla α połączone są także atom wodoru i łańcuch
boczny R. Wszystkie te wiązania mają charakter wiązań kowalencyjnych. Wzór
strukturalny α-aminokwasu przedstawiono na rys. 1.

9
 COO H

H2N C H

Rys. 1. Wzór strukturalny α-aminokwasu

Układ podstawników tworzy tetraedr, w środku którego znajduje się węgiel

α, a wokół leżą cztery podstawniki. Obecność asymetrycznego atomu węgla jest powodem
chiralności i aktywności optycznej aminokwasów. Rys. 2 przedstawia dwie możliwe formy
strukturalne – dwa izomery optyczne aminokwasów. Forma strukturalna,
w której grupa karboksylowa, łańcuch boczny i grupa aminowa są rozmieszczone zgodnie
z ruchem wskazówek zegara nosi nazwę konfiguracji L. Konfiguracja D stanowi jej
lustrzane odbicie. Obie konfiguracje mają identyczne właściwości chemiczne i fizyczne
za wyjątkiem kierunku skręcalności światła spolaryzowanego. Pomimo obecności dwóch
izomerów aminokwasy wchodzące w skład białek występujących w naturze mają
konfigurację L. We wzorze Fischera konfigurację L przedstawia się w taki sposób,
że grupa karboksylowa znajduje się na górnym końcu łańcucha węglowego, a grupa
aminowa po lewej stronie (rys. 2).

COO H COO H

H2N C* H H C* NH2

R R

L-aminokwas D-aminokwas

Rys. 2. Konfiguracja L i D aminokwasu. Gwiazdką (*) oznaczono centrum asymetrii

2.1. Klasyfikacja aminokwasów

Ze względu na znaczne zróżnicowanie budowy i właściwości aminokwasów stosuje się
różne kryteria podziału tych związków.

2.1.1. Aminokwasy białkowe i niebiałkowe

Ze względu na występowanie w białkach dzieli się aminokwasy na białkowe
i niebiałkowe.

10
Aminokwasy białkowe
Aminokwasy białkowe obejmują grupę około 20 związków, z których zbudowane
są białka wszystkich organizmów żywych (rys. 3). Jak wspomniano wcześniej wszystkie
są α, L-aminokwasami. Poniżej krótko scharakteryzowano poszczególne aminokwasy
białkowe:
 glicyna – występuje w dużych ilościach w kolagenie, w małych w kazeinie. Można ją
znaleźć w elementach białka łączących typowe podstruktury białka. Bierze udział
w procesach utleniania i dostarczania energii.
 alanina – występuje w dużych ilościach w fibrynie i żelatynie. Stanowi 7%
aminokwasów tworzących białka mięśni. Jest niezbędna w prawidłowym działaniu
systemu nerwowego, bierze udział w procesie metabolizowania cukrów i kwasów
organicznych, wspomaga też produkcję przeciwciał.
 walina – występuje w białkach zbóż, mięsa, mleka i jaj. Jej niedobór może spowodować
zaburzenia w koordynacji ruchów, brak łaknienia i spadek masy ciała.
 leucyna – aminokwas obecny niemal we wszystkich białkach. Jest niezbędna
w procesach wzrostowych i w zwalczaniu stresu.
 izoleucyna – występuje w białkach zbóż, mięsa, mleka i jaj. Duże ilości izoleucyny
znajdują się w hemoglobinie, kazeinie, białkach osocza krwi.
 seryna – występuje w fosfoproteinach. Jako fosfoseryna jest nośnikiem kwasu
fosforowego, obok treoniny. Odgrywa ważną rolę w trawieniu białek jako składnik
proteaz serynowych, bierze udział w syntezie puryn i pirymidyn. Wpływa na czynności
mózgu, głównie na procesy zapamiętywania i odtwarzania informacji.
 treonina – aminokwas obecny w białkach zbóż, mięsa, mleka i jaj. Niedobór treoniny
może spowodować zahamowanie wzrostu. W białkach o małej wartości stanowi
aminokwas ograniczający czyli taki, którego zawartość w białku jest najmniejsza.
 cysteina – aminokwas zawierający grupę tiolową, dzięki czemu tworzy mostki
disiarczkowe, które biorą udział w stabilizacji struktury II-rzędowej białek. Cysteina
wchodzi w skład centrów aktywnych wielu enzymów. Z dwóch cząsteczek cysteiny
powstaje cystyna, co ma duże znaczenie w kształtowaniu i stabilizacji struktury białek.
Ponieważ wiąże wiele substancji szkodliwych dla organizmu, odgrywa ważną rolę
w jego odtruwaniu.

11
 cystyna – występuje w skleroproteinach i w mniejszej ilości w innych białkach.
Odgrywa ważną rolę w syntezie insuliny, białek osocza krwi, a także jako dostarczyciel
siarki w procesach metabolicznych.
 metionina – jest to aminokwas siarkowy, obecny w białkach roślinnych
i zwierzęcych. Jest niezbędna w procesie translacji, czyli biosyntezy białek, ponieważ
jest pierwszym aminokwasem włączanym w łańcuch polipeptydowy. Metionina
uczestniczy w detoksykacji – odtruwaniu organizmu, usuwa szkodliwe nadtlenki
i metale ciężkie. Reguluje też proces keratynizacji naskórka, włosów i paznokci.
Metionina jest potrzebna do syntezy kwasów nukleinowych, zwiększa syntezę
glutationu.
 fenyloalanina – stanowi element większości naturalnie występujących białek.
W organizmie utlenia się do tyrozyny i ulega przemianie do hormonów tarczycy
oraz nadnercza. Zablokowanie tego procesu prowadzi do fenyloketonurii – choroby
wynikającej z niezdolności organizmu do właściwego metabolizowania fenyloalaniny.
 tyrozyna – jest prekursorem hormonów: tyroksyny i trójjodotyroniny oraz związków
biologicznie czynnych jak adrenalina i noradrenalina oraz dopaminy. Jest ważnym
składnikiem w produkcji kolagenu. Niedobór tyrozyny wiąże się z niedoczynnością
tarczycy.
 tryptofan – jest największym aminokwasem, jednym z trzech aminokwasów
posiadających pierścień aromatyczny. Tryptofan w znaczący sposób absorbuje światło
o długości fali 280 nm, co jest wykorzystywane w oznaczeniach ilościowych białka.
Występuje w białkach zwierzęcych i białkach zbóż. Jest przekształcany
w serotoninę, której niedobór może wywołać depresję.
 prolina – jest w rzeczywistości iminokwasem, ponieważ zawiera niearomatyczny,
sztywny pierścień, do którego należy węgiel α. Pierścień ten jest trudny do upakowania,
dlatego prolina często występuje na końcu lub w miejscach zakrzywienia struktur
drugorzędowych białka.
 kwas asparaginowy – jest rozpowszechniony w białkach roślinnych i zwierzęcych.
Bierze udział w syntezie puryn, pirymidyn i argininy.
 kwas glutaminowy – podobnie jak kwas asparaginowy występuje powszechnie
w białkach roślinnych i zwierzęcych, często jako glutamina. Wspomaga działanie
mózgu, układu odpornościowego, przewodu pokarmowego i mięśni. W postaci soli
sodowej stosowany jest jako przyprawa poprawiająca smak.

12
 lizyna – występuje w białkach histonowych i prolaminach. Jest potrzebna do
prawidłowego wzrostu, odnowy tkanek, produkcji przeciwciał, hormonów
i enzymów. Poprawia koncentrację. Pod wpływem działania enzymów bakteryjnych
z lizyny powstaje bardzo toksyczna kadaweryna („jad trupi”).
 arginina – występuje we wszystkich białkach. W przemianach biochemicznych jest
produktem pośrednim w syntezie mocznika i kreatyny.
 histydyna – jest aminokwasem zasadowym, zawierającym grupę imidazolową, która
może być obojętna lub naładowana dodatnio w zależności od pH środowiska i lokalnego
otoczenia. Cecha ta jest wykorzystana w centrach aktywnych, gdzie histydyna zmienia
stany naładowania, katalizując powstawanie i zrywanie wiązań. Jest to aminokwas
niezbędny w okresie wzrostu i rozwoju.
Do aminokwasów białkowych zalicza się też związki niekodowane w DNA, ale
powstające w wyniku modyfikacji potranslacyjnej i rzadko występujące. Należą do nich
5-hydroksylizyna i 5-hydroksyprolina, oraz allizyna i poliaminokwasy, których
występowanie ogranicza się wyłącznie do białek tkanki łącznej typu kolagen i elastyna.
Hydroksyprolina jest iminokwasem, który powstaje w wyniku hydroksylacji czyli
przyłączenia grupy hydroksylowej (OH) do proliny wbudowanej w peptyd.

COO- COO- COO- COO-

+ + +
+ H3N C H H3N C H
H3N C H H3N C H

H CH3 CH CH2
H3C CH3 CH
H3C CH3

glicyna alanina walina leucyna

COO- COO- COO-

COO-
+ + +
H3N C H H3N C H H3N C H +
H2N H
H C CH3 H C OH H C OH

CH2 H CH3

CH3

izoleucyna seryna treonina prolina

13
 COO- COO- COO- COO-
+ + + +
H3N C H H3N C H H3N C H H3N C H

CH2 CH2 CH2 CH2

SH

N
H
OH

fenyloalanina tyrozyna tryptofan cysteina

COO-
COO- COO-
COO- +
+ + H3N C H
H3N C H +H H3N C H
3N C H
CH2
CH2 CH2 CH2
CH2
CH2 C CH CH2
CH2
S + HN NH CH2
N H
CH3 CH CH2 +
+ C NH2
NH3
NH2

metionina histydyna lizyna arginina

COO-
COO- COO- COO-
+ +
+ +
H3N C H H3N C H
H3N C H H3N C H
CH2 CH2
CH2 CH2
CH2
COO- CH2 C
O NH2
COO- C
O NH2

kwas asparaginowy kwas glutaminowy asparagina glutamina

Rys. 3. Wzory aminokwasów białkowych

Aminokwasy niebiałkowe
Aminokwasy niebiałkowe występują w postaci peptydów lub w stanie wolnym.
Stanowią one liczną i różnorodną grupę związków pełniących ważne biologicznie funkcje.
Mogą pełnić rolę metabolitów pośrednich w przemianach biologicznych jak np. ornityna
i cytrulina, uczestniczące w biosyntezie mocznika, czy też homocysteina będąca
metabolitem pośrednim w biosyntezie metioniny. Niektóre aminokwasy niebiałkowe

14
są antybiotykami wytwarzanymi przez mikroorganizmy, jak chloramfenikol, cykloseryna
i azaseryna.

2.1.2. Zdolność organizmu do syntezy aminokwasów

Rośliny i wiele mikroorganizmów jest w stanie wytwarzać wszystkie aminokwasy
potrzebne do budowy białek. Organizm ludzki i zwierzęcy potrafi zsyntetyzować
dwanaście z dwudziestu aminokwasów wchodzących w skład białek, pozostałe natomiast
muszą być dostarczone z pożywieniem lub wytworzone przez symbiotyczną mikroflorę
jelitową.
Aminokwasy, które organizm wytwarza sam nazywane są endogennymi, natomiast
pobierane z pożywienia noszą nazwę egzogennych. Liczba i rodzaj aminokwasów
egzogennych zależy od stopnia rozwoju i stanu organizmu. Niektóre aminokwasy muszą
być dostarczane do organizmu w gotowej postaci tylko w okresie jego wzrostu, natomiast
u osób dorosłych bilans azotowy może być utrzymany bez ich udziału, co oznacza, że
obecność w diecie osób dorosłych tych aminokwasów nie jest już niezbędna. Przykładem
takich aminokwasów jest histydyna, określana w niektórych podręcznikach jako
aminokwas względnie egzogenny. U przeżuwaczy wszystkie aminokwasy egzogenne są
dostarczane przez mikroorganizmy bytujące w przewodzie pokarmowym.
W przypadku organizmu ludzkiego grupa aminokwasów egzogennych obejmuje
następujące aminokwasy: walina, lizyna, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, metionina,
treonina, tryptofan, a u noworodków również histydyna. Niekiedy do grupy tej zalicza się
też argininę. Aminokwas ten powstaje w cyklu mocznikowym, ale na skutek odszczepienia
od niej cząsteczki mocznika jest przekształcany w ornitynę, która z kolei nie jest
wykorzystywana do syntezy białek. Ludziom dorosłym z reguły wystarcza ilość argininy
powstająca w cyklu mocznikowym, jednak w przypadku dzieci arginina powinna być
dostarczona z zewnątrz dla zapewnienia prawidłowego wzrostu. W przypadku braku nawet
jednego aminokwasu w organizmie dochodzi do przewagi procesów rozkładu białek nad
ich syntezą, co powoduje ujemny bilans azotu.

2.1.3. Budowa łańcucha bocznego

Łańcuchy boczne aminokwasów determinują ich właściwości fizykochemiczne,
dlatego podział uwzględniający różnice w ich budowie, a zarazem ich reaktywność wydaje
się najbardziej istotny z biochemicznego punktu widzenia. Najogólniej można rozróżnić

15
trzy grupy aminokwasów w oparciu o ilość grup aminowych i karboksylowych, przy czym
w obrębie pierwszej z nich można dokonać dalszych podziałów:
 obojętne (monoaminomonokarboksylowe) – zawierające jedną grupę aminową
i jedną karboksylową. Grupa ta jest najliczniejsza, obejmuje 15 aminokwasów
białkowych, które można podzielić na:
 aminokwasy alifatyczne – z alifatycznym łańcuchem bocznym. Do grupy tej zalicza
się glicynę, alaninę, walinę, leucynę i izoleucynę.
 aminokwasy aromatyczne – zawierające pierścień aromatyczny. Są to tyrozyna,
tryptofan i fenyloalanina
 aminokwasy heterocykliczne – posiadające zamknięty łańcuch, są to prolina
i hydroksyprolina
 aminokwasy zawierające siarkę – cysteina i metionina
 aminokwasy zawierające grupę hydroksylową – seryna, treonina. Do grupy tej
zalicza się też tyrozyna ze względu na obecność grupy OH dołączonej do
pierścienia aromatycznego.
 kwaśne (monoaminodikarboksylowe) – zawierające jedną grupę aminową i dwie
karboksylowe. Należą tu kwas glutaminowy i kwas asparaginowy i ich amidy, czyli
glutamina i asparagina.
 zasadowe (diaminomonokarboksylowe) – zawierające dwie grupy aminowe i jedną
karboksylową. Do grupy tej zalicza się lizyna, arginina i histydyna.

2.1.4. Powinowactwo aminokwasów do wody

Biorąc pod uwagę powinowactwo aminokwasów do wody można je podzielić na
aminokwasy hydrofobowe i hydrofilowe (tabela 1).
Aminokwasy hydrofobowe i niepolarne to aminokwasy, które unikają wody, wykazują
natomiast tendencję do oddziaływania pomiędzy sobą. Zalicza się do nich aminokwasy
posiadające alifatyczne niereaktywne łańcuchy boczne, jak alanina, walina, leucyna,
izoleucyna, metionina i prolina. W przypadku proliny łańcuch jest zamknięty przez grupę
α-aminową. Alifatyczny łańcuch boczny posiada także cysteina, jednak w jej cząsteczce
znajduje się bardzo reaktywna grupa tiolowa SH. Dwie grupy tiolowe łatwo łączą się ze
sobą tworząc cystynę. Hydrofobowe są także aminokwasy z aromatycznymi łańcuchami
bocznymi. Charakter silnie hydrofobowy mają fenyloalanina i tryptofan, w mniejszym
stopniu tyrozyna, ponieważ zawiera reaktywną grupę hydroksylową.

16
 Aminokwasy hydrofilowe i polarne to takie, które wykazują powinowactwo do wody
czyli chętnie wiążą się z cząsteczką wody za pomocą wiązań wodorowych. Aminokwasy
polarne można podzielić na obdarzone ładunkiem i pozbawione ładunku. Do pierwszej
grupy zaliczają się aminokwasy zawierające dodatkowe grupy kwasowe lub aminowe.
Aminokwasy polarne pozbawione ładunku to treonina i seryna, zawierające grupę
hydroksylową w łańcuchu bocznym. Dzięki obecności tych grup mogą uczestniczyć
w tworzeniu wiązań wodorowych lub ulegać fosfoestryfikacji. Do grupy tej zalicza się
również asparaginę i glutaminę, posiadające grupy amidowe, zdolne do tworzenia wiązań
wodorowych.

Tabela 1. Podział aminokwasów ze względu na budowę łańcucha bocznego

symbol nazwa punkt izoelektryczny (pI)
HYDROFOBOWE (NIEPOLARNE)
A l i f a t y c z n e
G glicyna 5,97
A alanina 6,00
P prolina 6,30
V walina 5,96
L leucyna 5,98
I izoleucyna 5,94
M metionina 5,74
C cysteina 5,02
A r o m a t y c z n e
F fenyloalanina 5,48
W tryptofan 5,89
Y tyrozyna 5,66
HYDROFILOWE (POLARNE) nienaładowane
S seryna 5,68
T treonina 5,64
N asparagina 5,41
Q glutamina 5,65
HYDROFILOWE (POLARNE) naładowane
K w a s o w e (-)
D kwas asparaginowy 2,77
E kwas glutaminowy 3,22
Z a s a d o w e (+)
K lizyna 9,59
H histydyna 7,47
R arginina 11,15

2.2. Właściwości aminokwasów

Właściwości aminokwasów wynikają z obecności grup funkcyjnych, przede wszystkim
grupy aminowej i karboksylowej. Reakcje tych grup wykorzystuje się do wykrywania

17
i ilościowego oznaczania aminokwasów, ich rozdziału oraz badania ich sekwencji
w białkach.

2.2.1. Właściwości amfoteryczne aminokwasów

Jednoczesne występowanie w cząsteczce aminokwasów grupy aminowej
i karboksylowej powoduje, że aminokwasy są związkami amfoterycznymi. Oznacza to, że
w zależności od środowiska aminokwasy mogą występować jako aniony, kationy lub jony
obojnacze, ponieważ zmienia się stan zjonizowania grup funkcyjnych.
W środowisku kwaśnym (pH < 7) grupa karboksylowa pozostaje niezjonizowana,
następuje natomiast protonacja grupy aminowej i aminokwas występuje w postaci jonu
dodatniego – kationu. W środowisku zasadowym (pH > 7) powstaje jon ujemny
– anion, ponieważ grupa aminowa pozostaje niezjonizowana, zachodzi natomiast
dysocjacja jonu wodoru z grupy karboksylowej. W środowisku o określonym pH
najczęściej bliskim obojętnemu (około pH 7) aminokwasy występują w formie jonów
obojnaczych. W tej postaci grupa aminowa ulega protonacji, czyli przyłącza dodatkowy
jon wodoru tworząc grupę NH3+, a grupa karboksylowa oddysocjowuje jon wodoru
i powstaje grupa COO (rys. 4).
COOH COO COO
+
+ +H + -H +
H3N C H H3N C H H2N C H
- H+ + H+
R R R

kation jon obojnaczy anion

Rys. 4. Amfoteryczny charakter aminokwasów

Wartość pH, przy której wypadkowy ładunek aminokwasu jest równy zero określa się
jako punkt izoelektryczny (pI lub pHi). Przy pI stężenie jonów obojnaczych jest największe,
ustala się także równowaga pomiędzy formami kationowymi i anionowymi. Współczynnik
pI odbiega na ogół od wartości 7 (tabela 1), odpowiadającej roztworowi o odczynie
obojętnym.
Dzięki grupom aminowej i karboksylowej aminokwasy zachowują się jak amfolity,
czyli w obecności zasad reagują jak aniony, a w obecności kwasów jak kationy. Jednak
grupy te mogą reagować w ten sposób tylko w wolnych aminokwasach, ponieważ
w peptydach i białkach biorą udział w tworzeniu wiązań peptydowych i nie mają wpływu

18
na stan jonizacji cząsteczki. Zdolne do jonizacji są jednak również grupy obecne
w łańcuchach bocznych aminokwasów. Grupy te mają wpływ na stan jonizacji zarówno
aminokwasu wolnego jak i związanego w cząsteczce białka.W warunkach fizjologicznych
(pH7,4) 15 z 20 aminokwasów białkowych jest obojętnych elektrycznie tzn. nie mają
wypadkowego ładunku elektrycznego, pozostałe 5 posiada ładunek. Dwa to kwasy
posiadające ładunek ujemny, a trzy to zasady posiadające ładunek dodatni.

2.2.2. Reakcje charakterystyczne aminokwasów

Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów można podzielić na takie, które są
reakcjami wspólnymi i wynikają z obecności grup: karboksylowej i aminowej oraz reakcje
specyficzne, które wiążą się z występowaniem w cząsteczce charakterystycznych grup
w łańcuchu bocznym.
Do reakcji pierwszego typu należy barwna reakcja grup aminowych z ninhydryną,
służąca do wykrywania aminokwasów na chromatogramach oraz jako metoda oznaczania
ilościowego. Reakcje, jakie dają dodatkowe ugrupowania w aminokwasach, np. grupa
–SH, ugrupowanie guanidylowe oraz układ indolowy, pozwalają na ich wykrywanie,
odróżnienie, mogą też służyć do oznaczeń ilościowych. W badaniach aminokwasów
najczęściej przeprowadza się wykrywanie grup sulfhydrylowych (tiolowych), a także
argininy oraz tryptofanu. Do wykrywania grup tiolowych służy między innymi reakcja
z odczynnikiem Ellmana (kwasem 5,5’-ditiobis[2-nitrobenzoesowym – DTNB), którą
wykorzystuje się w standardowej metodzie ilościowego oznaczania reaktywnych grup –SH
w białkach. Guanidylową grupę argininy wykrywa się na podstawie reakcji Sakaguchi
z α-naftolem i podchlorynem lub podbrominem w środowisku zasadowym.
Wiele aldehydów w obecności kwasu siarkowego lub solnego (odczynniki
odwadniające) daje charakterystyczne reakcje ze związkami zawierającymi układ
indolowy. Reakcje z aldehydem glioksalowym, mrówkowym albo
p-dimetyloaminobenzoesowym stosuje się do wykrywania i ilościowego oznaczania
tryptofanu w białkach oraz do jego wykrywania po rozdziale na chromatogramach
bibułowych lub cienkowarstwowych.

2.3. Metody rozdziału i identyfikacji aminokwasów

Do najczęściej stosowanych metod rozdzielania aminokwasów i ich identyfikacji
należą metody chromatograficzne. Rozdział i identyfikację aminokwasów prowadzi się
najczęściej w celu poznania składu aminokwasowego białek lub przynajmniej określenia

19
procentowego udziału poszczególnych aminokwasów w białku. Znajomość sekwencji
aminokwasowej jest niezbędna w poznaniu struktury, właściwości biologicznych, a także
funkcji badanego białka.

2.3.1. Chromatografia jonowymienna

Amfoteryczny charakter aminokwasów pozwala na wykorzystanie chromatografii
jonowymiennej do ich rozdziału i określenia składu aminokwasowego badanego białka.
Można w tym celu wykorzystać kationit polistyrenowy posiadający grupy sulfonowe.
Przemycie kolumny buforem zawierającym kation sodowy doprowadza do zobojętnienia
grup sulfonowych kationami sodu. Na kolumnę wprowadza się zhydrolizowane białko lub
mieszaninę aminokwasów w kwaśnym roztworze buforowym. W takim środowisku
aminokwasy mają ładunek dodatni i wiążą się z anionowymi grupami sulfonowymi żywicy
jonowymiennej. Elucję przeprowadza się przemywając kolumnę roztworami buforowymi
o wzrastających wartościach pH i wzrastającym stężeniu NaCl lub wzrastającej
temperaturze. Powoduje to odrywanie aminokwasów w postaci jonów obojnaczych
i wymywanie ich z kolumny. Aminokwasy wypływają w określonej kolejności.
Z dwudziestu aminokwasów białkowych z kolumny pierwszy wypływa asparaginian,
a ostatnia arginina. Stężenie poszczególnych aminokwasów oznacza się np. metodą
ninhydrynową (punkt 5.1.1).
Dzięki tej metodzie można scharakteryzować skład aminokwasowy białka, porównując
obraz elucji aminokwasów z badanego roztworu z obrazem elucji standardowej mieszaniny
aminokwasów.

2.3.2. Chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa

Aminokwasy można rozdzielać także metodą chromatografii bibułowej lub
cienkowarstwowej. W przypadku chromatografii bibułowej fazę stacjonarną stanowi woda
jako rozpuszczalnik bardziej polarny, a fazę ruchomą mniej polarny rozpuszczalnik
organiczny lub mieszanina rozpuszczalników. W miarę przepływu przez bibułę układu
rozwijającego, substancje naniesione na bibułę w punkcie startu przemieszczają się
z różnymi szybkościami. Aminokwasy, które wykazują większe powinowactwo do fazy
stacjonarnej poruszają się wolniej niż te o dużym powinowactwie do fazy ruchomej. Jest to
zależne od współczynników podziału między organiczną fazę ruchomą a wodną fazę
stacjonarną nasycającą bibułę. Aminokwasy dikarboksylowe, diaminowe i zawierające
grupy wodorotlenowe mają większe powinowactwo wobec wodnej fazy stacjonarnej

20
i odznaczają się mniejszą ruchliwością chromatograficzną. Aminokwasy
z niepodstawionym łańcuchem hydrofobowym posiadają natomiast większe
powinowactwo wobec organicznej fazy ruchomej. Wśród aminokwasów
z niepodstawionymi łańcuchami powinowactwo wzrasta wraz ze wzrostem
hydrofobowości i np. ruchliwość chromatograficzna waliny czy leucyny jest większa niż
glicyny lub alaniny.
Chromatografię cienkowarstwową przeprowadza się na płytkach pokrytych warstwą
celulozy lub żelu krzemionkowego. W porównaniu z chromatografią bibułową uzyskuje
się krótszy czas rozdziału i bardziej zwarte plamy na chromatogramie. Do rozwijania
aminokwasów na płytkach pokrytych warstwą celulozy stosuje się różne układy
rozpuszczalników. Chromatogramy rozwija się techniką wstępującą jedno- lub
dwukierunkową. W przypadku techniki dwukierunkowej chromatogram rozwija się
najpierw w jednym kierunku, następnie suszy, obraca o 90 i ponownie rozwija.
Zazwyczaj rozwijanie w dwóch kierunkach przeprowadza się stosując dwa różne układy
rozpuszczalników. Na chromatogramach dwukierunkowych uzyskuje się „mapę”
rozdzielanych aminokwasów.
Aminokwasy rozdzielone na chromatogramach bibułowych oraz cienkowarstwowych
najczęściej wywołuje się przez spryskiwanie roztworem ninhydryny bądź izatyny.
Aminokwasy identyfikuje się przez porównanie położenia plam z położeniem
aminokwasów wzorcowych i obliczenie wartości Rf (rozdział „Wybrane metody…”, punkt
3.1.2).

3. Struktura i właściwości białek

Peptydy i białka są związkami utworzonymi w wyniku łączenia się aminokwasów za
pomocą wiązań peptydowych. W zależności od ilości reszt aminokwasowych możemy
rozróżnić dipeptydy, tripeptydy, tetrapeptydy, aż do polipeptydów. Przyjmuje się, że białka
to związki złożone z co najmniej 100 aminokwasów.
Białka są związkami o niezwykle różnorodnej i skomplikowanej budowie, mają jednak
podobny skład chemiczny. Składają się przede wszystkim z węgla (50-55%), tlenu (20-
30%), azotu (14-18%), wodoru (6-7%) i siarki (do 2%). Niektóre białka zawierają także
bardzo małe ilości innych pierwiastków takich jak fosfor, wapń, żelazo, miedź, cynk,
mangan, molibden i magnez.

21
 Rola białka w procesach biologicznych jest określona przede wszystkim przez jego
strukturę w stanie zwiniętym, zwanym też stanem natywnym. Można wyróżnić następujące
funkcje tych makrocząsteczek:
 strukturalna i motoryczna. We wnętrzu komórek białka tworzą sieć włókien białkowych
– tzw. filamentów białkowych, które składają się na cytoszkielet komórki. Cytoszkielet
odgrywa szczególną rolę w komórkach zwierzęcych, które nie posiadają sztywnej ściany
komórkowej jak ma to miejsce w komórkach roślinnych. Białka takie jak kolagen
i elastyna zapewniają elastyczność mięśniom i tkance kostnej. W komórce występują też
białka motoryczne, takie jak kinezyna i dyneina oraz mikrotubule, wykorzystywane przy
przemieszczaniu niektórych składników komórkowych takich jak pęcherzyki czy
organelle. Mikrotubule zbudowane są z podjednostek tubuliny, z których każda stanowi
dimer złożony z dwóch białek globularnych: α-tubuliny i β-tubuliny, połączonych ze
sobą wiązaniami niekowalencyjnymi. Inne białka tworzą filamenty aktynowe będące
polimerami białka aktyny. Odgrywają one zasadniczą rolę podczas wykonywania
ruchów przez komórkę. W komórkach mięśni włókna aktynowe łączą się w kompleksy
z białkiem motorycznym, miozyną, tworząc struktury kurczliwe. Białka mogą
występować też na zewnątrz komórki. Do białek znajdujących się w przestrzeni
międzykomórkowej należą kolagen i elastyna. Tworzą one także włókna w więzadłach
i ścięgnach.
 enzymatyczna. Prawie 50% wszystkich białek w komórkach to enzymy, katalizujące
określone reakcje. Dotychczas scharakteryzowano kilka tysięcy enzymów, przy czym
niemal wszystkie są białkami.
 transportująca. Niektóre białka przenoszą małe cząsteczki lub jony. Należą do nich
m.in.: albumina przenosząca lipidy, gromadząca i przenosząca żelazo transferyna oraz
hemoglobina będąca podstawowym nośnikiem tlenu. Wiele wyspecjalizowanych białek
tworzy w błonach selektywne kanały transportowe dla różnych jonów takich jak H +,
Na+, K+ czy Ca2+. W błonach komórek mięśni znajdują się białka transportujące jony
wapnia, niezbędne do wyzwolenia skurczu. Ponieważ transport Ca2+ wymaga
dodatkowej energii, która jest dostarczana w wyniku hydrolizy ATP
(adenozynotrifosforan), dlatego białko tworzące kanał dla jonów wapnia pełni
jednocześnie rolę enzymatyczną katalizując hydrolizę ATP. Białka mogą tworzyć kanały
również dla większych cząsteczek np. cukrów, jak maltoporyna – białko uczestniczące
w transporcie maltodekstryn.

22
 immunologiczna. Przeciwciała wytwarzane przez organizm jako mechanizm obronny są
białkami o dużej swoistości. Rozróżniają substancje obce dla ustroju i łączą się
z nimi w celu zniszczenia.
 regulacja genowa. Białka wiążą się z cząsteczką DNA w celu regulacji procesów
transkrypcji i ekspresji genów. Białka, które uruchamiają geny nazywają się
aktywatorami, a wyłączające geny represorami. Białka te łączą się z określonymi
fragmentami DNA za pomocą wiązań wodorowych, jonowych i hydrofobowych.
 sygnałowa. Wiele wyspecjalizowanych białek uczestniczy w przenoszeniu sygnałów
z komórki do komórki. Należą do nich niektóre białka – hormony i tzw. czynniki
wzrostu, koordynujące różne funkcje fizjologiczne. Przykładem jest insulina
kontrolująca poziom glukozy.

3.1. Struktura białek

Zasadniczy szkielet struktury białka stanowi łańcuch polipeptydowy złożony
z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Wiązanie powstaje pomiędzy
zjonizowaną grupą karboksylową jednego aminokwasu a zjonizowaną grupą aminową
drugiego. Tworzy się charakterystyczne ugrupowanie –CONH–. Dodatkowym efektem jest
utrudniona rotacja wokół tego wiązania i stabilizacja płaskiej struktury trans
(rys. 5). Brak możliwości rotacji powoduje, że atomy uczestniczące w tworzeniu
sąsiednich wiązań peptydowych leżą w jednej płaszczyźnie. W naturalnych peptydach
występuje wyłącznie forma trans wiązania peptydowego. Forma cis występuje jedynie
w nielicznych peptydach cyklicznych, gdzie tego typu struktura jest wymuszona.

O
R1 C N R2
H

Rys. 5. Forma trans wiązania peptydowego

Procesowi powstawania wiązania peptydowego towarzyszy wydzielanie jednej

cząsteczki wody. Jest to reakcja kondensacji, której równowaga jest przesunięta raczej
w kierunku hydrolizy niż syntezy. Dlatego biosynteza białka, podczas której przyłączanie
kolejnych aminokwasów powoduje wydłużenie łańcucha peptydowego, wymaga
dodatkowej energii.

23
3.1.1. Wiązania odpowiedzialne za strukturę białek
W budowie białek wyróżnia się kilka poziomów organizacji ich struktury: pierwszo-,
drugo-, trzecio- i czwartorzędową. Każdą z nich stabilizują określone wiązania pomiędzy
aminokwasami w łańcuchu polipeptydowym:
 wiązania wodorowe to oddziaływania atomu wodoru w grupie OH, SH lub NH
z grupą elektrodonorową, którą stanowić może atom tlenu czy azotu. Najczęściej
wiązania wodorowe w białkach tworzą się pomiędzy grupami CO i NH, należącymi
do różnych wiązań peptydowych znajdujących się dostatecznie blisko siebie.
W peptydach i białkach wiązania wodorowe mogą występować zarówno wewnątrz
cząsteczki stabilizując strukturę drugorzędową białka lub między podjednostkami
utrzymując strukturę czwartorzędową. Energia tych wiązań jest średnio 20 razy mniejsza
od energii wiązań peptydowych.
 wiązania disiarczkowe (disulfidowe) mają charakter wiązań kowalencyjnych podobnie
jak wiązania peptydowe. Powstają w wyniku utlenienia grup tiolowych SH, kiedy
blisko siebie znajdą się dwie cząsteczki cysteiny. Grupy tiolowe SH łączą się ze sobą
tworząc mostek disiarczkowy. Rozróżniamy wewnątrzłańcuchowe wiązania
disiarczkowe pomiędzy cząsteczkami cysteiny w obrębie jednego łańcucha
peptydowego oraz wiązania międzyłańcuchowe. Obecność mostków disiarczkowych
z reguły wspomaga zwijanie się białek.
 oddziaływania hydrofobowe to oddziaływania pomiędzy niepolarnymi resztami
aminokwasów alifatycznych. Pomimo niewielkiej mocy odgrywają dużą rolę
w stabilizacji struktury wielu białek.
 wiązania jonowe wynikają z oddziaływania elektrostatycznego zjonizowanych reszt
aminowych i karboksylowych. Mogą mieć charakter przyciągający pomiędzy
różnoimiennie naładowanymi aminokwasami lub odpychający pomiędzy grupami
naładowanymi równoimiennie. Najczęściej powstają pomiędzy dodatnio naładowanymi
grupami NH3 lizyny, guanidylowymi argininy a naładowanymi ujemnie grupami
COO - kwasu asparaginowego i glutaminowego. Wiązania te mogą się tworzyć
w obrębie pojedynczego łańcucha, a także między łańcuchami polipeptydowymi.
 oddziaływania elektrostatyczne między grupami, które posiadają ładunki cząstkowe,
będące efektem polaryzacji wiązań. Pomimo niewielkiej siły mogą odgrywać pewną rolę
w determinowaniu struktury białek.

24
3.1.2. Struktura pierwszorzędowa i wtórna białek
Cząsteczki białka mają określoną strukturę przestrzenną, przy czym tradycyjnie
utrzymuje się podział na strukturę pierwotną, czyli pierwszorzędową, i wtórną, czyli
drugo-, trzecio- i czwartorzędową.
Struktura pierwszorzędowa jest określona poprzez liczbę i kolejność aminokwasów
połączonych wiązaniami peptydowymi. Sekwencja aminokwasów w łańcuchu
polipeptydowym jest zgodna z zapisem genetycznym. Wszystkie polipeptydy, za
wyjątkiem cyklicznych, posiadają koniec N i C (rys. 6). Początkiem każdego polipeptydu
jest koniec N posiadający wolną grupę aminową, natomiast koniec C, na którym znajduje
się wolna grupa karboksylowa stanowi koniec peptydu. Sekwencję aminokwasów
przedstawia się zawsze zaczynając od końca N.
R1 H O R3 H O
N N
koniec N H N N koniec C
3

O R2 H O R4

Rys. 6. Fragment łańcucha polipeptydowego

Skład aminokwasowy jest czynnikiem decydującym o odmienności białek

i determinuje ich strukturę przestrzenną (wtórną) będącą efektem oddziaływania reszt
aminokwasowych w cząsteczce białka. Przestrzenne ułożenie łańcucha w przestrzeni
(konformacja) decyduje w znacznej mierze o funkcji białka. Zmiana konformacji może
spowodować zmianę właściwości białek, co może być przyczyną licznych chorób.
Struktura drugorzędowa określa sposób i stopień pofałdowania łańcucha
polipeptydowego w przestrzeni. W zależności od środowiska oraz wiązań
niekowalencyjnych łańcuch może przybierać strukturę α-helisy lub β-harmonijki,
a niekiedy też postać całkowicie nieuporządkowaną. Białka zazwyczaj zawierają
w cząsteczce zarówno α-helisy jak i struktury β.
 W strukturze α-helisy (rys. 7) łańcuch główny przyjmuje strukturę śrubową, natomiast
łańcuchy boczne aminokwasów wystają na zewnątrz od centrum helisy. Na jeden skok
helisy, wynoszący 0,54 nm, przypada 3,6 reszty aminokwasowej. Strukturę α-helisy
stabilizują wiązania wodorowe pomiędzy grupami NH wiązania peptydowego jednego
aminokwasu a grupą CO aminokwasu oddalonego o cztery reszty w łańcuchu. Każde
wiązanie peptydowe uczestniczy w tworzeniu wiązań wodorowych. Helisa formuje się

25
 spontanicznie, ponieważ stanowi najkorzystniejszą energetycznie i najbardziej stabilną
konformację łańcucha polipeptydowego.

Rys. 7. Struktura α-helisy

 Struktura β (rys. 8), nazywana również β-harmonijką lub strukturą pofałdowanej kartki,
jest drugim typem struktury drugorzędowej. W konformacji tej łańcuchy pozostają
niemal całkowicie rozprostowane, a odległość pomiędzy sąsiednimi atomami węgla α
wynosi 0,35 nm. Są to odległości zbyt duże, aby mogły się utworzyć wiązania
wodorowe. Dlatego tworzą się one pomiędzy różnymi regionami tego samego łańcucha
polipeptydowego, które do siebie przylegają lub między odrębnymi peptydami. Jeśli
dwa łańcuchy biegną równolegle względem siebie, struktura β nosi nazwę równoległej,
a kiedy łańcuchy biegną w kierunkach przeciwnych, mówimy o antyrównoległej
strukturze β. Ostre zmiany kierunku łańcucha peptydowego są możliwe dzięki
strukturom określanym jako zwrot β, zakręt β lub spinka do włosów. Są to ciasne pętle
powstające pomiędzy tlenem grupy karbonylowej jednego aminokwasu a protonem
amidowym aminokwasu oddalonego o trzy reszty w przód. W zwrotach β często
występuje prolina i glicyna.

Rys. 8. Struktura β-harmonijki

26
 Struktura trzeciorzędowa oznacza ułożenie w przestrzeni łańcucha polipeptydowego
uformowanego już w α-helisy i struktury β. Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana za
pomocą mostków disiarczkowych, oddziaływań hydrofobowych, wiązań jonowych
(rys. 9). Dzięki tym oddziaływaniom szkielet polipeptydowy fałduje się zbliżając do siebie
odległe liniowo sekwencje. Środowisko, w którym znajduje się białko, sprzyja
określonemu fałdowaniu łańcucha. W środowisku wodnym aminokwasy hydrofobowe
chowają się do wnętrza cząsteczki, natomiast większość aminokwasów polarnych
obdarzonych ładunkami pozostaje na powierzchni. Taki układ jest korzystny
energetycznie. Utrzymywanie na powierzchni sekwencji hydrofobowych byłoby
niekorzystne, ponieważ woda wypycha ze swego otoczenia niepolarne łańcuchy boczne
aminokwasów. Odwrotna sytuacja może mieć miejsce w przypadku integralnego białka
błonowego, które jest zwrócone do dwuwarstwy lipidowej stroną hydrofobową, a jego
wnętrze jest hydrofilowe. Ostateczny kształt polipeptydu może być globularny lub
fibrylarny.

OH (e)
CHCH3

(CH2)4
CH2
NH + (b)
3

Rys. 9. Oddziaływania O Hstrukturę

stabilizujące O O trzeciorzędową białek (a - oddziaływania
COO
jonowe, b - wiązania wodorowe, c – Cwiązania disiarczkowe,
(a) - (d) d – oddziaływania
(CH2)2 CH2 z wodą) CH
hydrofobowe, e – oddziaływania grup polarnych 2

Struktura czwartorzędowaCHdotyczy białek oligomerycznych, (CH

czyli
2)4
zbudowanych
NH3
+
CH3
CH2 CH3 CH2 (d) (a)
z podjednostek zwanych także
CH3 monomerami lub protomerami. Poszczególne podjednostki
S CH3 -
O
(d) S (c) C O
C H3
CH3 C H2 CH2
CH 27

(e) CH2COOH (e) CH2OH

stanowią niezależnie sfałdowane łańcuchy polipeptydowe. Jeśli podjednostki mają taką
samą strukturę pierwszorzędową mówimy o homogennej strukturze czwartorzędowej,
w przypadku różnic pomiędzy podjednostkami, mówimy o strukturze heterogennej.
Struktura czwartorzędowa jest stabilizowana za pomocą wiązań niekowalencyjnych, w tym
oddziaływań elektrostatycznych, wiązań wodorowych i wiązań jonowych oraz
kowalencyjnych (mostki disiarczkowe). Najmniejsze białka oligomeryczne zawierają dwie
podjednostki, jak np. laktoglobulina będąca dimerem, z kolei największe po kilka tysięcy
monomerów, jak np. kapsyd wirusa mozaiki tytoniowej zawierający 2130 podjednostek.

3.2. Klasyfikacja białek

3.2.1. Budowa białek
Ogólnie białka można podzielić na dwie grupy: białka proste zwane holoproteinami
i białka złożone nazywane heteroproteinami.
Białka proste – to grupa związków zbudowanych wyłącznie z aminokwasów, które
dzieli się na kolejne uwzględniając ich rozpuszczalność. Podział ten należy do najstarszych
prób klasyfikacji białek i jest niekiedy wykorzystywany w biochemii klinicznej, jednak
różnice pomiędzy poszczególnymi grupami nie są zbyt wyraźne.
 albuminy – białka o niewielkich masach cząsteczkowych, łatwo krystalizujące,
rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli. W ich skład wchodzą prawie
wszystkie aminokwasy z przewagą kwaśnych. Są rozpowszechnione
w płynach ustrojowych i białkach zbóż. Zalicza się tu albuminę surowicy,
laktoalbuminę, owoalbuminę jaja i albuminy roślinne. Charakteryzują się dużą wartością
odżywczą ze względu na korzystny skład aminokwasów egzogennych.
 globuliny – to największa i najbardziej rozpowszechniona grupa białek, obejmująca
większość enzymów. Występują w płynach ustrojowych oraz w białkach zapasowych
nasion. Są to białka słabo rozpuszczalne w wodzie, ale dobrze rozpuszczalne
w roztworach soli, o masie cząsteczkowej większej od albumin. Wytrącają się
z roztworów o stężeniu bliskim pełnego wysycenia i łatwo ulegają denaturacji. Zalicza
się tu białka osocza, enzymy, przeciwciała, białka mleka, roślinne białka zapasowe.
 prolaminy – białka rozpuszczalne w niższych alkoholach alifatycznych (m.in. w 70-80%
etanolu) i niektórych aromatycznych, ale nierozpuszczalne w wodzie. Zawierają duże
ilości kwasu glutaminowego, glutaminy i proliny, natomiast niewiele lub wcale lizyny
i tryptofanu, stąd też mała wartość żywieniowa tych białek. Występują
w ziarniakach zbóż, wchodzą w skład glutenu. Przykładem są gliadyna i hordeina.

28
 histony – to białka zasadowe o małych masach cząsteczkowych, rozpuszczalne
w wodzie, rozcieńczonych roztworach soli i kwasów organicznych. Występują
w komórkach eukariotycznych, są białkami charakterystycznymi jąder komórkowych,
stanowiąc element chromatyny. Zawierają mało aminokwasów siarkowych, za to dużo
histydyny, lizyny i argininy, nie ma w nich natomiast tryptofanu.
 protaminy – są to białka o małych masach cząsteczkowych, rozpuszczalne w wodzie
i kwasach. Są silnie zasadowe, co wynika z obecności aminokwasów zasadowych:
argininy i lizyny. Białka te występują w dużych ilościach w płynie nasiennym,
w plemnikach i krwinkach.
 gluteliny – są białkami nierozpuszczalnymi w wodzie, alkoholu i roztworach soli,
rozpuszczają się natomiast w roztworach kwasów i zasad. W skład glutelin wchodzą
znaczne ilości kwasu glutaminowego, glutaminy i proliny. Występują w nasionach zbóż
i roślin strączkowych. Wchodzą w skład tzw. glutenu pszennego, który wpływa na
właściwości wypiekowe mąki.
 skleroproteiny – to białka nierozpuszczalne w wodzie, roztworach soli, kwasów
i zasad. Są odporne na działanie enzymów. Stanowią dużą grupę białek fibrylarnych,
występujących w białkach zwierzęcych jako składniki tkanki łącznej i strukturalnej.
Należą do nich kolagen, elastyna, kreatyna, fibroina. Kolagen i elastyna charakteryzują
się dużą zawartością proliny i hydroksyproliny. Kolagen występuje w tkankach
łącznych, natomiast elastyna w ścianach tętnic i ścięgnach. Keratyna jest białkiem
o dużej zawartości cysteiny i aminokwasów zasadowych, występującym we włosach,
rogach i naskórku. Fibroina z kolei jest białkiem jedwabiu naturalnego.
Białka złożone obejmują związki, które oprócz łańcucha polipeptydowego zawierają
w cząsteczce dodatkowe substancje lub grupy niebiałkowe. Jeżeli grupa niebiałkowa jest
mocno związana z częścią białkową nazywana jest prostetyczną, a jeśli łatwo
oddysocjowuje od części białkowej – koenzymem. Ze względu na dużą różnorodność
białka złożone dzielimy na kolejne grupy:
 fosfoproteiny – białka zawierające resztę kwasu fosforowego, połączoną zwykle
wiązaniem estrowym z grupą OH seryny lub, rzadziej, treoniny. Do grupy tej zalicza
się m.in. kazeina z mleka oraz witelina i foswityna, obecne w żółtku jaja,
a także białka nasion soi.
 chromoproteiny – białka zawierające chromofor, czyli barwną grupę prostetyczną. Część
barwna może mieć zróżnicowaną strukturę np. karotenoidową, flawonoidową czy

29
 porfirynową. Na ogół białka te są dobrze rozpuszczalne w wodzie
i rozcieńczonych roztworach soli, w roztworach stężonych ulegają koagulacji. Jednymi
z ważniejszych białek z tej grupy są hemoproteiny, zawierające kompleksy żelaza, jak
hemoglobina czy mioglobina. Wiele chromoprotein, jak cytochromy, pełni ważne
funkcje w łańcuchu oddechowym.
 lipoproteiny – to kompleksy białek z lipidami. Grupę prostetyczną mogą stanowić
triacyloglicerole, wolne kwasy tłuszczowe, fosfatydy i sterole. Występują
w tłuszczach zwierzęcych, w osoczu krwi i limfie, są składnikiem błon
cytoplazmatycznych. Związki te pełnią ważne funkcje biologiczne związane
z transportem lipidów, sterydów i witamin lipofilnych.
 glikoproteiny – to pochodne białek, zawierające fragmenty oligosacharydowe połączone
wiązaniami glikozydowymi z łańcuchami bocznymi aminokwasów. Fragmenty
węglowodanowe zawierają głównie heksozy, heksozoaminy i kwas sjalowy. Łańcuchy
węglowodanowe są zwykle krótkie, zawierają 8-10 reszt cukrowych. Glikoproteiny
mogą zawierać jeden fragment węglowodanowy (np. owoalbumina) lub więcej.
Glikoproteiny są składnikami błon cytoplazmatycznych, enzymami, przeciwciałami,
czynnikami grupowymi krwi, hormonami. Często są odpowiedzialne za transport
aktywny.
 nukleoproteiny – to kompleksy kwasów nukleinowych i białek, w których składnik
białkowy ma często charakter silnie zasadowy. Nukleoproteiny występują we
wszystkich komórkach roślinnych i zwierzęcych, zarówno w jądrach komórkowych, jak
i w cytoplazmie. Odgrywają istotną rolę w replikacji DNA i kontroli genetycznej.
 metaloproteiny – to kompleksy metali z białkami. Najczęściej wiązanymi metalami są
żelazo, miedź, chrom, mangan, molibden, cynk i wapń. Wiązanie jonów niektórych
metali z białkami jest efektem oddziaływań z grupami aminowymi, karboksylowymi,
tiolowymi i imidazolowymi. Metaloproteiny różnią się od chromoprotein tym, że
wiązanie metalu zachodzi bezpośrednio z białkiem, a w cząsteczce chromoprotein jon
metalu jest związany z niebiałkowym ligandem. Przykładem może być ferrytyna,
występująca w wątrobie i śledzionie oraz hemocyjanina, zawierająca miedź, która pełni
rolę barwnika oddechowego w osoczu bezkręgowców.

3.2.2. Kształt cząsteczki

Na podstawie stosunku osiowego cząsteczki białka, czyli stosunku długości do
szerokości można wyodrębnić dwie grupy białek: fibrylarne i globularne.

30
 Białka fibrylarne (włókniste lub włókienkowe) to białka, dla których wartość stosunku
obu osi jest większa od 10. Są trudno rozpuszczalne w wodzie, charakteryzujące się dużą
wytrzymałością mechaniczną. Zalicza się tu m.in. kolagen i keratynę. Kolageny zawierają
znaczne ilości aminokwasów nietypowych takich jak hydroksyprolina, dlatego łańcuch
polipeptydowy nie tworzy α-helisy, ale tworzy inny rodzaj lewostronnej helisy o dużym
skoku. Trzy takie łańcuchy splatają się ze sobą tworząc jednostkę kolagenu
przypominającą linę. Łańcuchy polipeptydowe łączą się ze sobą za pomocą wiązań
wodorowych. W przypadku keratyn możemy wyróżnić formę nierozciągniętą – α-keratynę
i formę rozciągniętą – β-keratynę. α-Keratyna jako zasadniczy element strukturalny
posiada długą śrubową α-helisę, co sprawia, że pojedynczy łańcuch jest podwójnie
zwinięty. Pojedyncze włókno białkowe powstaje w ten sposób, iż wokół jednej prostej
helisy owija się sześć śrubowych łańcuchów, tworząc jakby splecioną linę. Podczas
rozciągania włókna α-keratyny prostują się, formując strukturę pofałdowaną i przechodzą
w postać β-keratyny.
Białka globularne to białka, dla których wartość stosunku obu osi jest mniejsza od 10,
a zazwyczaj nie przekracza 3-4. Należą do nich albuminy, globuliny osocza, insulina
i wiele enzymów. Ich struktura jest bardziej złożona niż białek fibrylarnych.
W białkach globularnych łańcuchy peptydowe są z reguły pofałdowane w sposób
nieregularny, przez co białko przybiera kształt kulisty. W cząsteczce występują zarówno
α-helisy jak i struktury β. Udział α-helisy może się wahać w różnych białkach od 0 do
80%. Odcinki łańcucha o budowie uporządkowanej są poprzedzielane fragmentami nie
posiadającymi regularnej budowy, dzięki czemu białka mogą tworzyć zwiniętą strukturę.

3.2.3. Wartość odżywcza białek

Wartość odżywczą białek determinuje skład aminokwasowy, a w szczególności
zawartość aminokwasów egzogennych, a także właściwy stosunek sumy aminokwasów
egzogennych do sumy aminokwasów endogennych. Możemy wyróżnić białka
pełnowartościowe i niepełnowartościowe.
Białka pełnowartościowe to białka, które zawierają wystarczającą ilość aminokwasów
egzogennych (niezbędnych) we właściwych proporcjach. Ponieważ zapotrzebowanie na
aminokwasy egzogenne zmienia się wraz z wiekiem, uważa się, że w diecie dla dorosłych
powinno się znaleźć 15-17% aminokwasów egzogennych, podczas gdy dla dzieci ilość ta
powinna wynosić do 30%, a dla niemowląt 40-50%. Przykładem takich białek są białka
jaja kurzego, mleka, serów twarogowych i podpuszczkowych oraz mięsa.

31
 Białka niepełnowartościowe zawierają wszystkie aminokwasy niezbędne, ale jeden
bądź kilka występuje w ilości niedostatecznej. Do grupy tej zaliczyć można wiele białek
roślinnych, m.in. zbóż czy kukurydzy. W zbożach niewystarczające są ilości lizyny,
treoniny, a w kukurydzy tryptofanu. Białka nasion wielu gatunków roślin takich jak soja,
groch czy łubin zawierają niemal wszystkie aminokwasy egzogenne w ilości zbliżonej do
ich zawartości w białkach pełnowartościowych, za wyjątkiem aminokwasów siarkowych,
a niekiedy tryptofanu. Dobry efekt żywieniowy można jednak uzyskać stosując w diecie
mieszaninę różnych białek niepełnowartościowych.

3.3. Właściwości białek

3.3.1. Właściwości amfoteryczne białek
Podobnie jak aminokwasy, białka są związkami amfoterycznymi. Wynika to
z obecności w cząsteczce grup zdolnych do jonizacji. Należy pamiętać, że białko jest
łańcuchem polipeptydowym złożonym z aminokwasów połączonych wiązaniami
peptydowymi pomiędzy grupą NH2 jednego aminokwasu i grupą COOH drugiego
aminokwasu. Dlatego zdolne do jonizacji są tylko grupy NH2 aminokwasów zasadowych,
grupy COOH aminokwasów kwaśnych, grupy aminowe i kwasowe na końcu cząsteczki
oraz grupy OH, SH, reszta imidazolowa histydyny, guanidylowa argininy. Obecność
wymienionych grup nadaje cząsteczce białka charakter wielowartościowego jonu.
Amfoteryczny charakter białek sprawia, że w zależności od pH środowiska może ono
przyjmować charakter kationowy lub anionowy, natomiast w punkcie izoelektrycznym
ładunek cząsteczki białka jest zerowy. W punkcie tym cząsteczka staje się dipolem
o bardzo dużym momencie dipolowym z powodu nierównomiernego rozmieszczenia grup
anionowych i kationowych. Taka struktura ma duże znaczenie dla wzajemnego
oddziaływania pomiędzy cząsteczkami białek, a innymi związkami i jonami.
W środowisku o pH poniżej punktu izoelektrycznego cząsteczka białka przyłączając jony
H+ nabiera charakteru kwasu wielokationowego. Dysocjacja grup karboksylowych jest
cofnięta, a grupy aminowe występują w postaci jonów amoniowych NH3+. Natomiast
w środowisku o pH powyżej pI cząsteczka białka oddaje jony wodorowe stając się
zjonizowaną zasadą wieloanionową. Wszystkie grupy karboksylowe są wówczas
zdysocjowane a grupy aminowe nienaładowane.
Wypadkowy ładunek cząsteczki białka zależy od stężenia jonów wodorowych
i wraz ze zmianą pH środowiska zmienia się zarówno jego wartość jak i znak. Białka

32
znajdujące się w środowisku o pH różnym od ich punktu izoelektrycznego mają tym
większy ładunek elektryczny, im większa jest różnica pomiędzy wartościami pH i pI.
Dlatego, jeżeli w roztworze o określonym pH znajduje się wiele białek różniących się
wartościa punktu izoelektrycznego, to ich ładunki będą się również od siebie różnić, co
umożliwi ich rozdział i oczyszczanie. Masy cząsteczkowe i punkty izoelektryczne
wybranych białek przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Masy cząsteczkowe i punkty izoelektryczne wybranych białek

Białko masa cząsteczkowa (Da) punkt izoelektryczny (pI)

Pepsyna 35 500 1,0
albumina jaja 44 000 4,6
Kazeina 19 000 4,7
globulina mleka 35 400 5,2
Fibrynogen 350 000 5,4
Insulina 12 000 5,3
Hemoglobina 68 000 6,8
Mioglobina 16 900 7,0
Rybonukleaza 12 700 9,45
cytochrom c 12 400 10,6
Trypsyna 24 000 10,5

3.3.2. Rozpuszczalność białek

Białka wykazują dużą zmienność rozpuszczalności w zależności od pH roztworu, jego
siły jonowej oraz temperatury. Większość białek rozpuszcza się bardzo dobrze
w wodzie (białka o charakterze hydrofilowym), niektóre rozpuszczają się tylko
w rozcieńczonych roztworach soli, kwasów i zasad (białka hydrofobowe).
W środowisku wodnym białka wykazują zdolność do hydratacji, czyli otaczania się
płaszczem wodnym. Zjawisko to zachodzi na skutek wiązania się dipoli wody
z grupami polarnymi łańcuchów bocznych aminokwasów w cząsteczce białka oraz
atomami N i O wiązania peptydowego. Woda hydratacyjna stanowi nieodłączną część
cząsteczki białkowej wpływając na jej właściwości funkcjonalne i strukturalne.
Uwodnienie białek nie jest równomierne, o czym decyduje układ grup funkcyjnych na
powierzchni i wewnątrz cząsteczki. Na powierzchni mogą się znajdować zarówno grupy

33
o charakterze hydrofobowym, jak i grupy hydrofilowe o zróżnicowanym powinowactwie
do wody. Powinowactwo grup hydrofilowych można uporządkować w następujący sposób:
COOH > OH > NH2 > NH > SH
Układ grup na powierzchni zależy od środowiska, w jakim znajduje się białko.
W środowisku wodnym układem bardziej korzystnym energetycznie jest utrzymywanie
grup hydrofilowych na powierzchni, natomiast białka błonowe mają często hydrofobową
powierzchnię, a hydrofilowe wnętrze. W rezultacie woda wpływa zarówno na wymiary
cząsteczki i jej kształt, jak też na dostępność poszczególnych grup funkcyjnych.
Większość białek wykazuje najmniejszą rozpuszczalność w roztworze o pH zbliżonym
do ich punktu izoelektrycznego. Ze względu na wypadkowy zerowy ładunek na cząsteczki
nie działają żadne odpychające siły elektrostatyczne, co sprzyja ich agregacji. W pH
różnym od pI cząsteczki białka są obdarzone ładunkiem i odpychają się.

3.3.3. Koagulacja
Koagulacja jest procesem polegającym na łączeniu się cząsteczek białka w większe
agregaty czego efektem jest wytrącenie białka z roztworu. Koagulacja zachodzi inaczej dla
białek hydrofilowych niż hydrofobowych.
Białka hydrofilowe wytrąca się z roztworu poprzez usunięcie warstwy hydratacyjnej,
otaczającej cząsteczkę. Najczęściej proces ten przeprowadza się poprzez dodawanie
znacznych stężeń soli lub substancji odwadniających. Niewielkie stężenie soli
nieorganicznych wpływa dodatnio na rozpuszczalność białek, jednak wraz ze wzrostem
stężenia soli wpływ ten się zmienia. Jony soli wiążą się z dipolami wody odciągając je od
cząsteczki białka, a tym samym pozbawiając je płaszcza hydratacyjnego. Powoduje to
zmniejszenie rozpuszczalności białka i wypadanie z roztworu. Proces ten nazywamy
wysalaniem. Do wysalania stosuje się sole, których jony łatwo tworzą wodziany.
Najczęściej stosuje się siarczan amonu, sodu lub magnezu. Stężenie soli potrzebne do
wysolenia białka zależy od jego właściwości i pH środowiska. Najłatwiej jest wysolić
białko w punkcie izoelektrycznym, ze względu na brak ładunku i skłonność do agregacji,
co sprzyja wypadaniu z roztworu.
Wysalanie jest procesem odwracalnym. Stężenie soli w wysolonym białku można
zmniejszyć np. poprzez dializę lub chromatografię żelową, a po ponownym rozpuszczeniu
białka wykazuje ono swoje niezmienione właściwości. Z tego względu proces wysalania
jest często stosowany w procesie izolacji białek.

34
 Dodanie do wodnego roztworu białka mniej polarnego rozpuszczalnika np. etanolu,
acetonu działa podobnie jak duże stężenie soli tzn. powoduje obniżenie stopnia hydratacji
i rozpuszczalności białek. Dodanie większej ilości takiego rozpuszczalnika powoduje
wytrącenie białka z roztworu. Warunkiem jest jednak krótkie działanie rozpuszczalnika
i niska temperatura procesu. Długotrwałe działanie rozpuszczalników organicznych
w temperaturze pokojowej spowodowałoby denaturację białka.
W przypadku białek hydrofobowych doprowadzenie do koagulacji wymaga
zobojętnienia ładunku elektrycznego, dzięki któremu utrzymuje się ono w roztworze.
Osiąga się to poprzez dodanie odpowiedniego elektrolitu.

3.3.4. Denaturacja
Denaturacja oznacza takie zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego, na skutek
których białko traci swoje właściwości. Denaturacja zachodzi pod wpływem czynników
fizycznych lub chemicznych. Do czynników fizycznych zaliczyć należy: ogrzewanie,
ultradźwięki, promieniowanie. Z kolei czynniki chemiczne to kwasy, zasady, jony metali
ciężkich, chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty, chloroform, fenol, alkohole,
aceton.
W wyniku denaturacji następuje zmiana bądź zniszczenie struktury IV, III lub II-
rzędowej. Czynniki denaturujące działają przede wszystkim na wiązania stabilizujące
strukturę przestrzenną, takie jak wiązania wodorowe, jonowe, disiarczkowe, oddziaływania
hydrofobowe, nie powodują natomiast hydrolitycznej degradacji łańcucha
polipeptydowego. Denaturacja wiąże się ze zmianą bądź całkowitą utratą właściwości
biologicznych, zmianie mogą ulegać również właściwości fizykochemiczne białka.
Białko można wytrącić z roztworu nie powodując jego denaturacji, jak ma to miejsce
przy wysalaniu, i odwrotnie, denaturacja nie musi oznaczać wypadania białka z roztworu.
Białko zdenaturowane może się utrzymywać w roztworze o pH różnym od pI, ponieważ
stabilizuje je ładunek elektryczny. Do koagulacji dochodzi, jeśli białko zostanie
zdenaturowane w pI lub, kiedy dodamy elektrolitu, który spowoduje wytrącenie białka
w postaci kłaczków. Stężone roztwory kwasów solnego, siarkowego i azotowego
powodują denaturację białek, ale tylko w przypadku kwasu azotowego dochodzi
jednocześnie do koagulacji. Wodorotlenek sodowy w środowisku alkalicznym denaturuje
białko, ale nie powoduje jego wytrącania. Dopiero zmiana pH roztworu na pH bliskie
wartości punktu izoelektrycznego powoduje koagulację.

35
 Białczany powstające w reakcji białek z wodorotlenkami oraz kompleksy powstające
w reakcjach z kwasami są często trudno rozpuszczalne, co wykorzystuje się, jeśli zajdzie
potrzeba usunięcia białek z roztworu. Takie kompleksy powstają między innymi w reakcji
białek z kwasem trichlorooctowym lub sulfosalicylowym. Z kolei trudno rozpuszczalne
białczany tworzą się w reakcjach z solami kationów metali ciężkich, takich jak jony żelaza,
miedzi, ołowiu, rtęci lub srebra.
Proces denaturacji jest na ogół nieodwracalny, chociaż w pewnych przypadkach może
ulec cofnięciu, np. kiedy czynnik denaturujący działał krótko i zmiany w białku nie były
zbyt daleko posunięte. Mówimy wtedy o renaturacji.

3.3.5. Oddziaływania pomiędzy białkami

Pomiędzy białkami tego samego rodzaju mogą występować oddziaływania,
prowadzące do ich agregacji. Proces ten może mieć wiele aspektów negatywnych.
Agregacja pewnych białek jest obserwowana m.in. w przypadku niektórych chorób takich
jak choroby Alzheimera czy Parkinsona. Proces agregacji białek ma też duże znaczenie
podczas wytwarzania, przechowywania i dystrybucji leków białkowych. Agregacja często
towarzyszy procesom oczyszczania, zatężania czy liofilizacji.

3.4. Izolacja i oczyszczanie białek

Poznanie struktury, właściwości, aktywności biologicznej czy mechanizmu działania
określonego białka wymaga wyizolowania go z materiału biologicznego i oddzielenia od
innych białek oraz różnych związków towarzyszących. W licznych procedurach rozdziału
i oczyszczania białek wykorzystuje się różnice ich właściwości, takich jak
rozpuszczalność, zdolność do koagulacji, wielkość cząsteczek, ładunek, a także zdolność
tworzenia specyficznych połączeń kompleksowych i krystalizacji. Dobór metodyki zależy
także od celu, w jakim białko ma być wykorzystane, tzn. czy zależy nam na zachowaniu
jego struktury natywnej i pełnej aktywności biologicznej, czy też zależy nam wyłącznie na
homogenności białka.
Dla każdego białka powinno się zastosować indywidualny proces oczyszczania,
opracowany w oparciu o jego właściwości fizykochemiczne, jednak można wyróżnić kilka
zasadniczych etapów:
 wyodrębnienie białka z materiału biologicznego, jakim są np. komórki
mikroorganizmów, tkanki roślinne. Wydzielenie białka z komórki wymaga
rozdrobnienia materiału i rozbicia komórek poprzez np. homogenizację czy rozbijanie

36
 ultradźwiękami.
 ekstrakcja białka do roztworu wodnego i usunięcie pozostałości komórek poprzez
odwirowanie.
 izolacja białka z roztworu. W tym celu przeprowadza się wytrącanie białka stosując
jedną z omówionych wcześniej technik. W zależności od potrzeby możemy zastosować
wysalanie bądź wytrącanie rozpuszczalnikami organicznymi. W przypadku
zastosowania wysalania mieszaninę białek i soli poddaje się dializie w celu usunięcia
czynnika wytrącającego. Opcjonalnie można zastosować filtrację żelową.
 oczyszczanie białka. Ten etap polega na oddzieleniu poszukiwanego białka od innych
białek obecnych w próbie poprzez zastosowanie technik chromatograficznych. Dla
uzyskania homogennego białka przeprowadza się proces oczyszczania składający się
zwykle z wielu etapów.
 analiza czystości białka i oznaczenia ilościowe. Podczas całego procesu izolacji
i oczyszczania istnieje potrzeba monitorowania jego przebiegu i efektów, uzyskiwanych
w kolejnych etapach, które przeprowadza się najczęściej za pomocą technik
elektroforetycznych. W celu oznaczenia stężenia stosuje się najczęściej jedną z metod
spektrofotometrycznych omówionych w rozdziale „Wybrane metody…”, punkt 2.1.
Poniżej omówiono poszczególne metody stosowane do oczyszczania i rozdziału białek,
które można pogrupować ze względu na kryterium, jakie bierzemy pod uwagę dobierając
metodę (tabela 3).

Tabela 3. Metody stosowane w procesie oczyszczania i rozdziału białek

Kryterium rozdziału
masa cząsteczkowa
wypadkowy ładunek
cząsteczki
hydrofobowość
specyficzność biologiczna
metoda rozdziału lub oczyszczania
dializa
ultrawirowanie
chromatografia żelowa
elektroforeza
chromatografia jonowymienna
elektroforeza
chromatografia oddziaływań hydrofobowych
chromatografia powinowactwa

3.4.1. Dializa

37
 Podczas oczyszczania białek często zachodzi potrzeba usunięcia z roztworu związków
niskocząsteczkowych takich jak cząsteczki soli. Dializa często jest stosowana do odsalania
po uprzednim wytrąceniu białka nadmiarem soli, ale także do pozbycia się związków
organicznych takich jak aminokwasy, cukry proste czy nukleotydy.
Dializa polega na przechodzeniu przez błonę półprzepuszczalną związków o masie
cząsteczkowej, a co za tym idzie, rozmiarach mniejszych niż średnica porów w błonie
i zatrzymywaniu cząsteczek większych. Dializę prowadzi się w woreczkach dializacyjnych
np. celulozowych w środowisku wodnym. Rezultatem prowadzonego procesu jest
wyrównywanie stężeń po obu stronach błony, co stwarza konieczność częstego
wymieniania roztworu w celu pełnego odsolenia białka. Proces dializy jest długotrwały
i często wspomaga się go dodatkowo poprzez mieszanie roztworu. Znaczne przyspieszenie
dializy można uzyskać wprowadzając do płynu dializacyjnego elektrody połączone ze
źródłem prądu stałego. Proces taki nazywamy elektrodializą.

3.4.2. Ultrawirowanie
Wirowanie jest skuteczną i powszechnie stosowaną metodą do rozdzielania cząsteczek
różniących się wielkością. Ultrawirowanie prowadzi się w szybkoobrotowych wirówkach
przy wysokich obrotach rzędu kilkudziesięciu tysięcy obrotów na minutę. Szybkość
opadania czyli sedymentacji białka podczas ultrawirowania zależy od jego masy, ponieważ
cząsteczki o większej masie zawsze sedymentują szybciej niż cząstki o takim samym
kształcie i gęstości, ale mniejszej masie. Szybkość sedymentacji zależy też od stężenia
białka i stężenia roztworu poddawanego ultrawirowaniu.
Miarą szybkości sedymentacji jest współczynnik sedymentacji s, określający stosunek
szybkości wirowania do przyspieszenia odśrodkowego (wyrażany w svedbergach).
Białka różniące się współczynnikiem sedymentacji można rozdzielić wykorzystując
tzw. wirowanie w gradiencie gęstości. Pierwszym etapem jest uformowanie gradientu
gęstości w probówce wirówkowej poprzez zmieszanie w różnych proporcjach roztworów
różniących się gęstością, np. 5% i 20% sacharoza. Następnie na powierzchnię
uformowanego gradientu nakłada się ostrożnie mieszaninę badanych białek i poddaje
wirowaniu. W trakcie wirowania białka przemieszczają się i rozdzielają zależnie od ich
współczynnika sedymentacji. W ten sposób można rozdzielić białka różniące się
przynajmniej dwukrotnie współczynnikiem sedymentacji.

3.4.3. Chromatografia

38
 Do rozdziału białek stosuje się różne metody chromatograficzne: chromatografię
żelową, jonowymienną, powinowactwa, adsorpcyjną.

Chromatografia żelowa
W metodzie chromatografii żelowej nazywanej także sączeniem molekularnym
rozdział mieszaniny białek zachodzi w oparciu o różnicę wielkości ich cząsteczek.
Wykorzystuje się tutaj technikę kolumnową, stosując jako wypełnienie kolumny żele
różniące się wielkością ziaren i porów w ziarnach. Od wielkości porów zależy możliwość
frakcjonowania białek. Do rozdziału białek powszechnie stosowane są żele dekstranowe
o nazwie Sephadex. Fazą stacjonarną może być roztwór wypełniający pory ziaren żelu,
natomiast fazą ruchomą roztwór wypełniający przestrzeń między ziarnami. W metodzie tej
stosuje się różne rozpuszczalniki, ale w przypadku rozdziału białek są to najczęściej
roztwory buforowe o określonym pH i sile jonowej.
Odpowiednio uwodniony żel, zawieszony w rozpuszczalniku, wprowadza się do
kolumny. Na wierzch nanosi się mieszaninę białek o różnych masach cząsteczkowych.
Podczas przepływu przez kolumnę białka zaczynają się rozdzielać pomiędzy fazę
stacjonarną i ruchomą. Białka o cząsteczkach większych od średnicy porów nie wchodzą
w ziarna żelu, lecz przepływają pomiędzy nimi i pojawiają się w eluacie z kolumny jako
pierwsze. Z kolei cząsteczki o średnicy mniejszej od porów ziaren, przedostają się do
wnętrza ziaren żelu i w rezultacie wydostają się z kolumny później. Tak więc szybkość
i kolejność wypływu białek zależy przede wszystkim od wielkości rozdzielanych
cząsteczek.
Chromatografię żelową można zastosować zarówno do rozdziału mieszaniny białek
o różnych masach cząsteczkowych, jak również do oddzielenia białek od innych
związków, zwykle niskocząsteczkowych, jak np. sól.

Chromatografia jonowymienna
W metodzie chromatografii jonowymiennej rozdział białek polega na reakcji wymiany
pomiędzy jonami związanymi z jonitem, czyli fazą stacjonarną, a jonami białek
w rozdzielanej mieszaninie. Jest to możliwe, ponieważ białka są polielektrolitami
amfoterycznymi, dzięki czemu mogą być wiązane zarówno przez kationity jak
i anionity. Białka wiążą się z wymieniaczem jonowym poprzez liczne wiązania jonowe
pomiędzy obdarzonymi ładunkiem ugrupowaniami na powierzchni cząsteczki

39
a ugrupowaniami jonitu o przeciwnym znaku. Fazę ruchomą w chromatografii
jonowymiennej najczęściej stanowią roztwory buforowe.
Dobór jonitu zależy od wielu czynników, ale przede wszystkim od właściwości
fizykochemicznych danego białka. Zasadniczo, jeśli białko jest aktywne w zakresie pH
poniżej pI, czyli kiedy przyjmuje wypadkowy ładunek dodatni, może być oczyszczane na
kationicie. I odwrotnie, jeśli białko jest aktywne w środowisku o pH powyżej pI, czyli
kiedy ma wypadkowy ładunek ujemny, można zastosować anionit. W praktyce często
stosuje się oczyszczanie tych samych białek raz na kationicie, raz na anionicie, jednak
należy pamiętać, że zbyt duże zmiany pH mogą negatywnie wpłynąć na aktywność białka.
Do rozdziału substancji białkowych wykorzystuje się z reguły jonity polisacharydowe
– celulozowe lub dekstranowe, wyposażone w odpowiednie grupy funkcyjne.
Półsyntetyczne kationity polisacharydowe najczęściej zawierają następujące grupy czynne:
karboksymetylowe (CM-celuloza, CM-Sephadex), sulfoetylowe (SE), sulfopropylowe
(SP), fosforanowe (P); anionity: aminoetylowe (AE-celuloza, AE-Sephadex),
dietyloaminoetylowe (DEAE-celuloza, DEAE-Sephadex). Właściwości jonitu zależą od
rodzaju grup funkcyjnych, co determinuje typ i rodzaj wiązania oraz od ich ilości
i dostępności, co wpływa na jego pojemność.
W procesie rozdziału białek metodą chromatografii jonowymiennej można wyróżnić
dwa etapy. W pierwszym mieszaninę białek nanosi się na kolumnę w buforze, którym
uprzednio zrównoważono jonit (tzw. bufor startowy). Białka, które posiadają ładunek tego
samego znaku, co jonit, przepływają swobodnie przez kolumnę, natomiast białka
o znaku przeciwnym są na niej zatrzymywane. Siła wiązania białka na jonicie zależy od
wielkości cząsteczek i ich ładunku. Drugi etap polega na wymywaniu czyli elucji
związanych białek. Na kolumnę wprowadza się roztwór elektrolitów, które konkurują ze
związanymi białkami o miejsce na powierzchni cząstek wymieniacza jonowego. Jako
eluenty stosuje się roztwory o różnej sile jonowej lub wartości pH w postaci gradientu
liniowego lub skokowego (rozdział „Wybrane metody…”, punkt 3.1.2). Siłę jonową
buforu zmienia się poprzez dodatek soli nieorganicznej np. chlorku sodu. Wprowadzenie
na kolumnę jonów soli powoduje zastępowanie nimi białek począwszy od tych najsłabiej
związanych z jonitem. Rezultatem jest wymywanie z kolumny kolejnych białek różniących
się ładunkiem i siłą wiązania z wymieniaczem jonowym.
W przypadku zmian pH najczęściej stosuje się roztwory o gradientowo rosnącej lub
malejącej wartości pH. Zastosowanie buforu o innym pH niż buforu startowego powoduje
zmianę ładunku białek związanych z wymieniaczem, przez co osłabia się siła wiązania

40
z grupami czynnymi jonitu. Utrata zdolności wiązania białka z grupami czynnymi jonitu
oznacza oderwanie go od jonitu i wymycie z kolumny.

Chromatografia adsorpcyjna
Białka można rozdzielać wykorzystując ich zróżnicowane powinowactwo do
adsorbenta umieszczonego w kolumnie. Zależnie od siły oddziaływania pomiędzy
adsorbentem a białkami w mieszaninie, białka są wiązane do nośnika słabiej lub mocniej.
Te o większym powinowactwie do adsorbenta będą się z nim silniej wiązały,
a zarazem wolniej wędrowały wzdłuż kolumny. Dodatkowym efektem rozdziału jest
zagęszczenie białek w fazie stacjonarnej. Wynika to nie tylko z oddziaływań pomiędzy
białkiem a adsorbentem, ale także ze wzajemnych oddziaływań pomiędzy cząsteczkami
białka. Rozdział białek jest uwarunkowany głównie ich polarnością. Aby wymyć je
z kolumny, czyli spowodować ich desorpcję, stosuje się albo określony eluent albo
rozpuszczalniki o rosnącej mocy elucyjnej, czyli w przypadku białek, o rosnącej
polarności. W ten sposób eluent będzie zastępował białka adsorbując się na powierzchni
nośnika w miejsce białek. Białka wypływają z kolumny w kolejności uwarunkowanej siłą
ich oddziaływania z adsorbentem. Najszybciej u wylotu kolumny pojawiają się białka
związane najsłabiej. Do rozdziału białek metodą chromatografii adsorpcyjnej stosuje się
zwykle krótkie kolumny.
Można zastosować także technikę cienkowarstwową, jednak stosuje się ją raczej do
celów analitycznych, a nie do rozdzielenia białek w mieszaninie.

Chromatografia powinowactwa
Metoda ta stanowi w zasadzie odmianę chromatografii podziałowej, omówionej
w rozdziale „Wybrane metody…”, punkt 3.1.2. Wykorzystuje się w niej powinowactwo
białek do specyficznych grup chemicznych (ligandów). Najczęściej stosowane połączenia
typu ligand-oczyszczane białko to: enzym-substrat, enzym-inhibitor, hormon-receptor,
przeciwciało-antygen. Proces prowadzi się zwykle techniką kolumnową. Specyficzne
ligandy, wiążące białko podczas procesu oczyszczania, są zazwyczaj unieruchomione na
nierozpuszczalnym nośniku, stanowiącym wypełnienie kolumny. Kiedy mieszanina białek,
naniesiona na wierzch kolumny, przechodzi przez złoże, zachodzi wiązanie przez ligand
właściwego białka. Pozostałe białka, które nie mają zdolności do specyficznego wiązania
się z ligandem, przepływają swobodnie przez kolumnę. Rezultatem procesu jest związanie
na kolumnie białka, które następnie odzyskuje się poprzez zmianę siły jonowej eluentu lub

41
jego pH albo przez przemycie kolumny roztworem zawierającym wolną postać liganda.
Można też zastosować inne specyficzne związki, które spowodują oderwanie białka od
nośnika w kolumnie.
Chromatografia powinowactwa jest często wykorzystywana do oczyszczania
przeciwciał, enzymów i receptorów. Charakteryzuje się wysoką zdolnością rozdzielczą
i dobrą wydajnością. Jednak jej zastosowanie wymaga wiedzy na temat specyficznych
oddziaływań białka, które poddajemy oczyszczaniu.

3.4.4. Elektroforeza
Elektroforezę wykorzystuje się najczęściej podczas procesu oczyszczania białek
w celu oceny czystości preparatu oraz do ustalania masy cząsteczkowej białka. Szybkość
wędrowania białek w polu elektrycznym zależy od ładunku białka, jego wielkości
i kształtu, a także od możliwości adsorpcji do powierzchni podłoża. Na rozdział białek
wpływa także roztwór buforowy, w którym białka występują w postaci zjonizowanej. Musi
on być odpowiednio dobrany pod względem siły jonowej. Zwiększenie siły jonowej może
dać lepszy rozdział, ale jednocześnie zmniejszyć ruchliwość cząsteczek białka na skutek
zwiększania się średnicy ich cząsteczek w wyniku adsorpcji jonów z buforu.
Elektroforezę białek prowadzi się na bibule (elektroforeza pasmowa) lub na żelu
(elektroforeza dyskowa). Żele mogą być skrobiowe, agarowe, agarozowe lub
poliakrylamidowe. Wymienione podłoża różnią się między sobą porowatością,
możliwością adsorpcji białek, grubością i składem jakościowym.
Rozdział białek zależy także od warunków prowadzenia elektroforezy, takich jak
napięcie pomiędzy elektrodami czyli gradient potencjału (można zastosować elektroforezę
nisko- lub wysokonapięciową), natężenie prądu i temperatura procesu.
Ze względu na dużą rozdzielczość i łatwość wystandaryzowania warunków do
najczęściej stosowanych metod należy elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Żel
poliakrylamidowy stanowi jednocześnie sito molekularne, w którym ruchliwość białek
zależy zarówno od ładunku jak i od wielkości cząsteczek. Elektroforeza na żelu może
przebiegać w warunkach denaturujących lub niedenaturujących, czyli zachowując natywną
postać białka (rozdział „Wybrane metody…”, punkt 4). Ograniczeniem elektroforezy
natywnej jest jednak mała rozdzielczość, dlatego stosuje się ją tylko dla niektórych białek
np. enzymów.
Powszechnie stosowane są techniki elektroforetyczne, w których białko jest w trakcie
elektroforezy poddane działaniu czynników denaturujących, takich jak SDS – siarczan

42
dodecylosodowy czy mocznik. Najbardziej znanym wariantem tej techniki jest SDS-PAGE
(SDS poliacrylamide gel electophoresis) czyli elektroforeza w obecności SDS, będącego
czynnikiem denaturującym. Białka są rozpuszczane w buforze zawierającym SDS oraz
czynnik redukujący, 2-merkaptoetanol. SDS będący anionowym detergentem niszczy
wszystkie wiązania niekowalencyjne w białku, a 2-merkaptoetanol wiązania disiarczkowe.
Aniony SDS łączą się z łańcuchem głównym, co nadaje całemu kompleksowi wypadkowy
ładunek ujemny. Kompleksy SDS-białko wędrują w ten sposób do anody, a ich ruchliwość
w żelu zależy od masy cząsteczkowej białka. Po zakończeniu rozdziału konieczne jest
wybarwienie białek w celu ich uwidocznienia. Do detekcji białek stosuje się barwniki
wykazujące powinowactwo do nich, m.in. barwnik Coomassie brillant blue, czerń
amidową lub azotan srebra. Barwniki te tworzą kompleksy z białkiem, przy czym
połączenie to jest odwracalne. Najczęściej stosuje się metodę barwienia Coomassie brillant
blue, która jest czulsza od barwienia czernią amidową. Jeszcze większą czułością cechuje
się barwienie metodą srebrową (około 100 razy czulsza).
Elektroforeza w obecności SDS stwarza także możliwość rozdziału białek w zależności
od punktu izoelektrycznego. Metodę tę określa się mianem ogniskowania
izoelektrycznego. Proces odbywa się w żelu poliakrylamidowym w gradiencie pH
utworzonym przez mieszaninę poliamfolitów czyli małych polimerów z wieloma
ładunkami, które mają dużo różnych wartości pI. Po wprowadzeniu do żelu z amfolitami
białek, wędrują one podczas elektroforezy do miejsc w żelu o pH, które odpowiada pI
białka.

3.5. Ilościowe oznaczanie białek

Do oznaczania stężenia białek w roztworach stosuje się różne metody. Są to
bezpośrednie metody spektrofotometryczne, pośrednie metody kolorymetryczne, jak
również metody immunometryczne.

3.5.1. Bezpośrednia metoda pomiaru absorbancji w nadfiolecie

W skład większości białek wchodzą aminokwasy aromatyczne takie jak tyrozyna
i tryptofan, które absorbują światło o długości fali 280 nm. Przyjmuje się, że ilość
zaabsorbowanego światła jest proporcjonalna do stężenia białka w roztworze. Główną
zaletą tej metody jest szybkość i prostota wykonania, dlatego często jest wykorzystywana
w automatycznych zestawach służących do rozdziału białek w celu stałego monitorowania
procesu. Jest ona jednak obarczona pewnymi błędami. Przede wszystkim wynik zależy od

43
rodzaju białka, a właściwie od zawartości tyrozyny i tryptofanu. Niektóre białka, jak
histony, niezawierające tyrozyny, nie mogą być oznaczane tą metodą. Ponadto niektóre
związki zarówno wielko- jak i niskocząsteczkowe mogą wpływać na wartość absorbancji,
absorbując promieniowanie w zbliżonym zakresie. Należą do nich kwasy nukleinowe,
puryny, pirymidyny, fenole. Kwasy nukleinowe, które mogą towarzyszyć białkom podczas
ich izolacji z komórek, charakteryzują się maksimum pochłaniania światła o długości fali
260 nm, wykazują też silną absorpcję przy 280 nm. Aby wyeliminować wpływ kwasów
nukleinowych, mierzy się absorbancję badanego roztworu przy długości fali 260 i 280 nm,
a następnie stężenie białka oblicza się stosując wzory, np. zmodyfikowany wzór Kalckara:
x  1,55  A280 - 0,76  A260
gdzie:
x – stężenie białka, mg/cm3.

3.5.2. Pośrednie metody kolorymetryczne

Do metod pośrednich należą m.in. reakcja biuretowa, metoda Lowry’ego i metoda
Bradforda. Wykorzystuje się w nich powstawanie barwnych kompleksów o określonym
maksimum absorbancji.
Reakcja biuretowa pozwala na wykrycie wiązań peptydowych. Prowadzona jest
w środowisku zasadowym, w którym tworzą się kompleksy białka z jonami miedzi
o maksimum absorbancji przy długości fali 546 nm.
Reakcja Lowry’ego stanowi kombinację reakcji biuretowej oraz reakcji tyrozyny
z odczynnikiem Folina-Ciocalteau. W rezultacie powstaje niebieskofioletowy produkt
o maksimum absorbancji przy długości fali 750 nm. Jest to bardzo czuła metoda,
stosowana do oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach
tkankowych. Jej ograniczeniem jest zróżnicowanie natężenia barwy w zależności od
składu aminokwasowego białka, a przede wszystkim od zawartości tyrozyny.
Metoda Bradforda opiera się na wykorzystaniu barwnika Coomassie brillant blue, który
wiąże się z białkami, czego rezultatem jest powstanie kompleksu o maksimum absorbancji
przy długości fali 595 nm. Jest to metoda czuła i prosta pod względem wykonania, wadą są
natomiast różnice w wiązaniu barwnika przez różne białka.

44
3.6. Test immunoenzymatyczny ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
– wykrywanie i ilościowe oznaczanie białek
Jest to powszechnie stosowany test biomedyczny służący do wykrywania białka
w małych stężeniach (nawet w ilości nanograma). Wykorzystuje się go zarówno
w badaniach naukowych jak i w diagnostyce, ale także m.in. w analizie żywności.
W ogólnym ujęciu zasada testu polega na rozpoznaniu białkowego antygenu przez
przeciwciało związane kowalencyjnie z określonym enzymem. W obecności antygenu
kompleks przeciwciało-enzym wiąże się z nim, a po wprowadzeniu do mieszaniny
reakcyjnej substratu enzym katalizuje powstanie barwnego produktu. Wykrycie produktu
świadczy o obecności badanego białka w próbie. Można również zastosować test ELISA
do oznaczeń ilościowych. Test przeprowadza się w 96-dołkowych płytkach, gdzie każda
studzienka (dołek) służy jako mikroprobówka. Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA,
z których szerzej omówione zostaną test warstwowy bezpośredni i test pośredni.
Test warstwowy – „sandwicz test” jest testem stosowanym najczęściej do wykrywania
i ilościowego oznaczania białkowego antygenu. Angielska nazwa tej metody „sandwich
ELISA”, czyli „kanapkowa ELISA” oznacza, że antygen wiązany jest pomiędzy dwiema
„warstwami” przeciwciał. W metodzie tej pierwszy etap stanowi unieruchomienie
przeciwciała na płytce. Po odpłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, dodaje
się badany materiał. Jeśli w próbce znajduje się poszukiwane białko, połączy się
z unieruchomionym przeciwciałem, które jest specyficzne dla danego antygenu. Płytkę
ponownie się przepłukuje w celu pozostawienia wyłącznie związanego białka. Kolejnym
etapem jest dodanie następnego przeciwciała wyznakowanego enzymem, które również
rozpoznaje białko, ale w innym regionie cząsteczki. Tworzy się więc struktura warstwowa
z antygenem znajdującym się pomiędzy dwoma przeciwciałami. Po przepłukaniu płytki
dodaje się substrat, który w reakcji katalizowanej przez enzym związany z przeciwciałem
przechodzi w barwny produkt. Na podstawie natężenia barwy można określić
spektrofotometrycznie stężenie antygenu.
W omówionej metodzie antygen był wykrywany bezpośrednio przez jedno
przeciwciało po uprzednim związaniu białka z przeciwciałem unieruchomionym na płytce.
Taką metodę określa się jako bezpośredni test ELISA. Jego zaletą jest szybkość
wykonania, jednak konieczne jest zastosowanie specyficznego przeciwciała, co niekiedy
jest kosztowne.
Innym rodzajem testu jest test pośredni ELISA, który stosuje się często do wykrywania
przeciwciał w badaniach diagnostycznych, m.in. do wykrywania wirusa HIV. W tej

45
metodzie na podłożu stałym adsorbowany jest antygen, rozpoznawany przez pierwsze
przeciwciało, które nie jest znakowane. W kolejnym etapie dodawane jest drugie
przeciwciało, swoiste dla pierwszego. Dopiero drugie przeciwciało jest znakowane
enzymatycznie, dzięki czemu po wprowadzeniu substratu i powstaniu produktu możliwe
jest wykrycie antygenu. Zaletą tej metody jest fakt, iż nie trzeba znakować przeciwciał
specyficznych względem antygenu.

4. Zagadnienia
1. Budowa aminokwasów.
2. Klasyfikacja aminokwasów z uwzględnieniem różnych kryteriów podziału.
3. Wzory aminokwasów białkowych.
4. Właściwości aminokwasów.
5. Budowa białek z uwzględnieniem poszczególnych poziomów organizacji ich struktury.
6. Klasyfikacja białek ze względu na budowę, kształt cząsteczki i wartość odżywczą.
7. Właściwości amfoteryczne białek.
8. Metody wytrącania białek z roztworu. Koagulacja a denaturacja.
9. Metody izolacji i oczyszczania białek.
10. Metody ilościowego oznaczania białek.

46
5. Część eksperymentalna
5.1. Reakcje barwne aminokwasów i białek
5.1.1. Reakcja z ninhydryną

Zasada oznaczenia
Metoda opierająca się na reakcji aminokwasów z ninhydryną, ze względu na dużą
czułość jest stosowana do spektrofotometrycznego oznaczania aminokwasów oraz do ich
szybkiego wykrywania. Nie jest to jednak reakcja specyficzna, ponieważ ulegają jej
również peptydy, białka i inne związki zawierające I-rzędowe grupy aminowe (alifatyczne
i aromatyczne), a także sole amonowe. Testy z ninhydryną służą do wykrywania nie tylko
wyżej wymienionych związków, ale również takich, jak aminocukry, pewne lipidy,
hormony i antybiotyki
Podczas ogrzewania pod wpływem ninhydryny zachodzi deaminacja i dekarboksylacja
aminokwasów, a w wyniku reakcji powstaje amoniak, dwutlenek węgla, aldehyd
zawierający o jeden atom węgla w cząsteczce mniej niż reagujący aminokwas oraz
zredukowana ninhydryna. Następnie niezredukowana cząsteczka ninhydryny reaguje
z dwiema cząsteczkami amoniaku uwolnionymi z aminokwasów i ze zredukowaną
wcześniej cząsteczką ninhydryny, tworząc barwny związek. Intensywność zabarwienia jest
zależna od ilości azotu grup aminowych. Większość aminokwasów daje z ninhydryną
zabarwienie niebieskofioletowe z maksimum absorbancji przypadającym przy długości fali
570 nm. Wyjątek stanowią prolina i hydroksyprolina, które tworzą z ninhydryną
kompleksy o barwie żółtej z maksimum absorbancji przy długości fali 440 nm.

Wykonanie
Do trzech probówek odmierzyć po 2 cm3 badanej próby. Do trzeciej probówki, która
stanowi próbę ślepą, wlać 2 cm3 wody destylowanej. Następnie do wszystkich probówek
dodać po 0,4 cm3 roztworu ninhydryny w izopropanolu. Probówki umieścić we wrzącej
łaźni wodnej na 15 minut, a następnie wyjąć i schłodzić w strumieniu bieżącej wody.
Pomiar absorbancji przeprowadzić przy 570 nm. Odnośnikiem w pomiarach jest próba
ślepa. Na podstawie oznaczonej wartości absorbancji przy 570 nm odczytać z krzywej
wzorcowej stężenie aminokwasu w μg/cm3.

47
Sporządzanie krzywej wzorcowej
Używając wyjściowy roztwór aminokwasu sporządzić rozcieńczenia według podanego
poniżej schematu. Następnie przeprowadzić oznaczenia każdej próby w sposób opisany
powyżej. Krzywą wykreślić odkładając na osi x stężenia aminokwasów w μg/cm 3, a na osi
y odpowiadające im wartości absorbancji.

objętość roztworu objętość wody stężenie

aminokwasu, cm3 destylowanej, cm3 aminokwasu, μg/cm3
1,0 9,0 2,5
1,5 8,5 3,75
2,0 8,0 5,0
3,0 7,0 7,5
4,0 6,0 10,0
5,0 5,0 12,5
6,0 4,0 15,0
7,0 3,0 17,5
8,0 2,0 20,0
9,0 1,0 22,5

Odczynniki
1) 2% roztwór ninhydryny w izopropanolu,
2) próba badana (roztwór aminokwasu o stężeniu 2,5g/100 cm3).

5.1.2. Reakcja Adamkiewicza – Hopkinsa (wykrywanie tryptofanu)

Zasada oznaczenia
Związki zawierające układ indolowy (np. tryptofan) w środowisku kwaśnym ulegają
sprzęganiu z aldehydami lub ich pochodnymi, dając barwny produkt kondensacji. Reakcje
te wykorzystuje się do ilościowego oznaczania tryptofanu w postaci wolnej lub
związanego w cząsteczce białka. W reakcji Adamkiewicza–Hopkinsa tryptofan
kondensując z kwasem glioksalowym tworzy produkty o zabarwieniu fioletowym.

Wykonanie
Do 1 cm3 próby badanej, potencjalnie zawierającej tryptofan, dodać 1 cm 3 1% kwasu
glioksalowego, wymieszać, a następnie podwarstwić 2 cm3 stężonego kwasu siarkowego.
W przypadku obecności tryptofanu w próbie, na granicy warstw tworzy się fioletowy
pierścień.

48
Odczynniki,
1) 1% kwas glioksalowy,
2) stężony H2SO4,
3) próba badana.

5.1.3. Reakcja Sakaguchi (wykrywanie argininy)

Zasada oznaczenia
Związki zawierające resztę guanidylową, w tym arginina, pod wpływem podbrominu
sodu utleniają się i ulegają sprzężeniu z α-naftolem, tworząc pomarańczowo-czerwony
barwnik. Reakcja ta jest bardzo czuła, dlatego można ją wykorzystać do ilościowego
oznaczania argininy w białkach. Dalsze utlenianie produktu prowadzi do odbarwienia
roztworu na skutek rozpadu układu amidynowego.

Wykonanie
Do 1 cm3 próby badanej dodać 1 cm3 20% roztworu NaOH oraz 2-3 krople 2%
alkoholowego roztworu α-naftolu. Zawartość probówki należy wymieszać, a następnie
dodać kilka kropli wody bromowej i ponownie zamieszać. W wyniku reakcji tworzy się
związek o barwie pomarańczowo-czerwonej. Dla stabilizacji zabarwienia dodać 1 cm3
40% roztworu mocznika.

Odczynniki
1) 20% NaOH,
2) 2% alkoholowy roztwór α-naftolu,
3) 40% roztwór mocznika,
4) próba badana

5.1.4. Reakcja Pauliego (wykrywanie histydyny)

Zasada oznaczenia
Związki imidazolowe, w tym także histydyna, w wyniku reakcji sprzęgania z kwasem
p-diazobenzenosulfanilowym w środowisku zasadowym dają czerwone produkty.

49
Wykonanie
Do 1 cm3 próby badanej dodać 1 cm3 kwasu p-diazobenzenosulfanilowego. Wynikiem
dodatnim, czyli świadczącym o obecności histydyny, jest powstanie czerwonego
zabarwienia.

Odczynniki
1) kwas p-diazobenzenosulfanilowy – należy go sporządzić bezpośrednio przed wykonaniem oznaczenia
w następujący sposób: do zlewki schłodzonej zimną wodą wlać 10 cm 3 0,5% roztworu kwasu
sulfanilowego; następnie dodać 4 krople 0,5% roztworu NaNO 3; roztwór należy zalkalizować węglanem
wapnia,
2) próba badana

5.1.5. Reakcje aminokwasów siarkowych

Zasada oznaczenia
Cysteina i cystyna obecne w białkach lub w postaci wolnej ogrzewane w środowisku
zasadowym ulegają deaminacji i następuje wydzielenie jonów siarczkowych z grupy
tiolowej lub disiarczkowej. Jony siarczkowe reagują z jonami Pb 2+ dając siarczek
ołowiawy w postaci osadu o barwie czarnej. Próba daje wynik ujemny w przypadku
metioniny.

Wykonanie
Do 1 cm3 próby badanej dodać 2 cm3 30% roztworu NaOH oraz kilka kropel roztworu
octanu ołowiawego. Zawartość probówki ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Po dłuższym
ogrzewaniu mieszanina reakcyjna przybiera barwę brunatną, a na dnie probówki osadza się
czarny osad.

Odczynniki
1) 2% roztwór octanu ołowiawego,
2) 30% roztwór NaOH,
3) próba badana.

50
5.1.6. Reakcja biuretowa – wykrywanie wiązań peptydowych

Zasada oznaczenia
W środowisku zasadowym układy wiązań peptydowych dają barwne kompleksy
z jonami miedziowymi, dodawanymi w postaci siarczanu miedziowego. Wiązania
peptydowe ulegają enolizacji, w powstałej formie enolowej grupa hydroksylowa jest
zdolna do dysocjacji.
Jony miedziowe reagują z dwoma sąsiadującymi wiązaniami tworząc wiązania jonowe
z grupami enolowymi i wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstały kompleks ma
barwę niebieskofioletową o maksimum absorbancji przy długości fali 546 nm. Peptydy
dają w tej reakcji barwę różową. Nasilenie barwy zależy od ilości wiązań peptydowych,
czyli od długości łańcucha peptydowego i jest proporcjonalne do stężenia białka
w roztworze.
Jest to jedna z najczęściej stosowanych reakcji w analizie białek, pozwalająca na ich
wykrycie i oznaczenie ilościowe w materiale biologicznym, a nawet w niektórych
produktach spożywczych. Można ją także wykorzystać do odróżnienia aminokwasów od
białek. Reakcję biuretową dają związki zawierające co najmniej dwa ugrupowania
–CO–NH–. Nie dają jej wolne aminokwasy (z wyjątkiem histydyny) i dipeptydy. Nazwa
reakcji pochodzi od biuretu, czyli związku powstającego z mocznika po ogrzaniu
w temp. 180C.

Wykonanie

Do probówki wlać ok. 2 cm3 próby badanej, następnie dodać ok. 2 cm3 roztworu
NaOH, a po wymieszaniu kilka kropli 0,5% roztworu CuSO4. W obecności peptydów lub
białek pojawi się zabarwienie różowe albo niebieskofioletowe. Należy unikać dodawania
nadmiaru siarczanu miedziowego, ponieważ jego niebieskie zabarwienie może
spowodować, że barwa charakterystyczna dla powstałego kompleksu nie będzie wyraźnie
widoczna.

Odczynniki
1) 0,5% wodny roztwór CuSO4,
2) 10% roztwór NaOH,
3) próba badana.

51
5.2. Metody wytrącania białek z roztworu
5.2.1. Wysalanie białek siarczanem amonowym

Zasada oznaczenia
Siarczan amonowy, użyty w odpowiednio dużym stężeniu, powoduje wytrącenie
białka. Wysolone białko ponownie rozpuszcza się w wodzie po obniżeniu stężenia soli.

Wykonanie
Do dwóch probówek wlać po ok. 2 cm3 próby badanej. Do jednej dodać taką samą
objętość 1% roztworu siarczanu amonowego, a do drugiej krystaliczny siarczan amonowy
aż do nasycenia roztworu – po wymieszaniu na dnie probówki nieznaczna część soli
powinna pozostać nierozpuszczona. Po wytrąceniu się białek płyn należy zdekantować
i rozpuścić osad białka w nadmiarze wody.

Odczynniki
1) 1% roztwór siarczanu amonowego,
2) krystaliczny siarczan amonowy,
3) próba badana (białko jaja kurze).

5.2.2. Wytrącanie białka etanolem

Zasada oznaczenia
Rozpuszczalniki organiczne takie jak alkohol etylowy czy aceton odwadniając białko
powodują jego wytrącenie. Jeżeli czas działania jest krótki i wytrącenie następuje
w obniżonej temperaturze (ok. 0C), białko nie ulega denaturacji. Jeżeli wytrącanie
przebiega w temperaturze pokojowej, a rozpuszczalnik organiczny oddziałuje przez
dłuższy czas, wówczas białko ulega denaturacji spowodowanej osłabieniem oddziaływań
hydrofobowych.
70% alkohol etylowy stosuje się do dezynfekcji, ponieważ penetrując w głąb komórek
bakteryjnych zmienia właściwości białek komórkowych.

Wykonanie
Do dwóch probówek wlać po 2 cm 3 próby badanej i po 4 cm 3 95% etanolu. Wytrąca się
osad odwodnionego białka. Z jednej probówki zlać płyn znad osadu i dodać wodę

52
destylowaną – osad rozpuszcza się. Drugą probówkę pozostawić na 30-60 minut. Po
zdekantowaniu płynu i dodaniu wody osad zdenaturowanego białka nie rozpuszcza się.

Odczynniki
1) 95% alkohol etylowy,
2) próba badana (roztwór białka jaja kurzego).

5.2.3. Wytrącanie białka za pomocą kationów

Zasada oznaczenia
W środowisku o pH większym od punktu izoelektrycznego białka stają się anionami
i reagują z kationami, tworząc z nimi połączenia jonowe lub kompleksy. Powstające sole
dysocjują w różnym stopniu, w zależności od jonu. Kationy metali alkalicznych dają sole
bardzo dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast kationy metali ciężkich
tworzą sole słabo dysocjujące i trudno rozpuszczalne. Do wytrącania białek stosuje się
jony Zn2+, Hg2+, Fe3+, Cu2+, Pb2+. Reakcje te są wykorzystywane do wykrywania białek
w roztworach oraz do usuwania ich, jeżeli przeszkadzają w oznaczeniach innych substancji
(np. odbiałczanie roztworów przed oznaczaniem cukrów w produktach spożywczych).

Wykonanie
Do trzech probówek wlać po ok. 2 cm 3próby badanej. Do pierwszej dodać kroplami
roztwór CuSO4. Pod wpływem CuSO4 tworzy się osad białczanu miedziowego, który
rozpuszcza się w roztworze wodorotlenku sodowego.
Do drugiej probówki dodać kroplami roztwór chlorku żelazowego. Początkowo
wytrąca się brunatny osad, który w miarę dodawania odczynnika ulega rozpuszczeniu.
Do trzeciej probówki dodać kilka kropli roztworu azotanu srebra. Osad nie rozpuszcza
się w wodzie ani w nadmiarze odczynnika.

Odczynniki
1) 5% roztwór CuSO4,
2) 2% roztwór AgNO3,
3) 2% roztwór FeCl3,
4) 10% roztwór NaOH,
5) próba badana (roztwór białka jaja kurzego).

53
5.2.4. Wytrącanie białka za pomocą anionów

Zasada oznaczenia
W środowisku o pH poniżej punktu izoelektrycznego białka zdysocjowane w formie
kationów wykazują zdolność do wiązania się z anionami. Do wytrącania białek stosuje się
kwasy nieorganiczne i organiczne lub ich sole, jak kwas fosforowolframowy,
fosforomolibdenowy, trójchlorooctowy, sulfosalicylowy, pikrynowy, garbnikowy
(należący do tanin), żelazocyjanek potasowy i inne. Niektóre kwasy organiczne tworzą
trwałe nierozpuszczalne połączenia z białkami i są stosowane do odbiałczania płynów
biologicznych, przerywania reakcji enzymatycznych itp. Związki te dodane w większym
stężeniu denaturują białko. Reakcje z żelazocyjankiem potasowym i taniną są czułymi
reakcjami pozwalającymi na wykrywanie białka w bardzo małych stężeniach.

Wykonanie
Do trzech probówek odmierzyć po ok. 2 cm3 próby badanej. Do pierwszej dodać
roztwór kwasu trójchlorooctowego, który wytrąca białko w postaci nierozpuszczalnego
białego osadu i powoduje jego denaturację.
Do drugiej probówki dodać kilka kropli roztworu taniny. Pod wpływem odczynnika
białko wytrąca się w postaci zbitego osadu.
Roztwór znajdujący się w trzeciej probówce zakwasić za pomocą 10% kwasu
octowego (2-3 krople) i dodać kilka kropli roztworu żelazocyjanku potasowego. Białko
wytrąca się jako biały osad.

Odczynniki
1) 20% roztwór kwasu trójchlorooctowego,
2) 10% roztwór taniny w 0,1 M roztworze kwasu octowego,
3) 5% roztwór żelazocyjanku potasowego,
4) 10% roztwór kwasu octowego,
5) próba badana (roztwór białka jaja kurzego).

5.2.5. Denaturacja białka przez ogrzewanie

Zasada oznaczenia
W podwyższonej temperaturze następuje rozerwanie wiązań wodorowych, co prowadzi
do nieodwracalnej denaturacji białka. Proces denaturacji przebiega w różnych

54
temperaturach w zależności od rodzaju białka. Niektóre ulegają denaturacji już podczas
ogrzewania w 40C, inne dopiero po ogrzaniu do 100C. Tylko nieliczne białka
wytrzymują krótkie gotowanie, np. żelatyna, czy rybonukleaza. Zdenaturowane termicznie
białka wytrącają się w punkcie izoelektrycznym.

Wykonanie
Do dwóch probówek odmierzyć po 2 cm3 próby badanej. Do jednej z nich dodać 0,2
cm3 0,01 M roztworu NaOH, a do drugiej 0,2 cm3 0,01 M buforu octanowego o pH 4,7.
Obie probówki ogrzewać do wrzenia.
Po oziębieniu porównać obie próbki. W probówce z buforem octanowym białko jest
zdenaturowane i skoagulowane.
Następnie do probówki z odczynem alkalicznym dodać 2 cm 3 0,01 M buforu
octanowego o pH 4,7. Wytrąca się w niej osad zdenaturowanego białka.

Odczynniki
1) 0,01 M roztwór NaOH,
2) 0,01 M bufor octanowy o pH 4,7,
3) próba badana (oztwór białka jaja kurzego).

5.3. Chromatografia aminokwasów i białek

5.3.1. Rozdział aminokwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej

Zasada oznaczenia
Rozdział aminokwasów prowadzi się na gotowych płytkach pokrytych celulozą.
Aminokwasy rozdzielają się w oparciu o zróżnicowane powinowactwo do fazy
stacjonarnej i fazy ruchomej. Aminokwasy kwaśne, zasadowe i zawierające grupy OH
mają większe powinowactwo wobec wodnej fazy stacjonarnej, a aminokwasy
hydrofobowe do organicznej fazy ruchomej.

Wykonanie
Nanoszenie prób na płytkę
Na płytce celulozowej zaznaczyć ołówkiem linię startu w odległości 2-2,5 cm od
brzegu. Na linii zaznaczyć punkty, w których będą nanoszone roztwory. Odległość między
punktami powinna wynosić co najmniej 1-2 cm. W punktach nanosić po 5 μl roztworu
wzorcowego i prób badanych. Roztwory nanosić w postaci małych plamek, o średnicy

55
nieprzekraczającej 2-3 mm. Każdą naniesioną kroplę roztworu suszyć strumieniem
ciepłego powietrza, a po wysuszeniu w tym samym miejscu nanosić następną itd., aż do
wyczerpania całej objętości roztworu znajdującego się w mikropipecie. Na górnym brzegu
płytki należy zapisać numery nanoszonych prób.

Rozwijanie chromatogramu
Płytki wstawić pionowo do komory chromatograficznej z mieszaniną rozwijającą.
Rozwijanie chromatogramu prowadzić przez 60 minut w zamkniętej komorze. Po tym
czasie płytkę należy wyjąć z komory i zaznaczyć ołówkiem linię frontu, a następnie
wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza.

Wywoływanie chromatogramu
Chromatogramy wywołać przez spryskanie mieszaniną wywołującą zawierającą
ninhydrynę, a następnie ogrzewać w temperaturze 80-100C przez 10-15 minut.

Interpretacja wyniku
Uwidocznione plamki należy obrysować ołówkiem, wyznaczyć odległość od linii startu
do środka plamki oraz zmierzyć odległość od linii startu do frontu rozpuszczalnika.
Następnie obliczyć wartość Rf aminokwasów wzorcowych oraz aminokwasu z próby
badanej.

Odczynniki
1) płytki powlekane celulozą,
2) mieszanina rozwijająca: II-rzędowy alkohol butylowy – 3% amoniak w stosunku 3:1,
3) mieszanina wywołująca: 0,1% roztwór ninhydryny w acetonie, zakwaszony kwasem octowym
(5 cm3 kwasu na 100 cm3 roztworu ninhydryny),
4) roztwór wzorcowy aminokwasów,
5) próby badane (roztwory aminokwasów w 10% izopropanolu o stężeniu 0,5 –0,8 mg/cm3).

5.3.2. Odsalanie białka metodą chromatografii żelowej na kolumnie z żelem Sephadex

G-25

Zasada oznaczenia
W celu oddzielenia soli obojętnych, użytych do wytrącania białka, sączenie na żelu
stosuje się często zamiast długotrwałego procesu dializy. Do odsalania stosuje się zwykle

56
żele gruboziarniste, krótsze i grubsze kolumny oraz większe szybkości przepływu eluentu.
Objętość nanoszonej próby może wówczas wynosić 25-30% objętości złoża. Dobiera się
przy tym taki rodzaj żelu (zwykle Sephadex G-25), aby białko eluowało się w objętości
zerowej. Związki o małych cząsteczkach, takie jak sól amonowa, wykazujące
współczynniki podziału zbliżone do 1, pojawiają się w eluacie z kolumny po przepływie
objętości rozpuszczalnika zbliżonej do całkowitej objętości złoża.
Białko rozpuszcza się w roztworze NaCl, wytrąca za pomocą siarczanu amonowego,
rozpuszcza otrzymany osad również w roztworze NaCl i roztwór nanosi na kolumnę
z żelem Sephadex G-25. W eluatach z kolumny oznacza się stężenie białka stosując jedną
z metod kolorymetrycznych, a obecność soli amonowej wykrywa na podstawie reakcji
z wodorotlenkiem baru.

Wykonanie
Rozdział na kolumnie
Próbę badaną zawierającą wytrącone białko i sól amonową użytą do wysalania nanieść
w ilości 1,0 cm3 na kolumienkę PD-10 (Sephadex G-25), zrównoważoną 0,9% roztworem
NaCl. Kiedy naniesiony roztwór wejdzie w kolumnę, na powierzchnię żelu należy szybko
wprowadzić 1 cm3 roztworu NaCl w celu usunięcia resztek badanej próby z pianki
i ścianek kolumny. Następnie dodać większą objętość roztworu NaCl i eluować tym
roztworem białko oraz siarczan amonowy. Podczas nanoszenia roztworów na kolumnę nie
można dopuścić do zapowietrzenia pianki i górnej warstwy żelu.
Od momentu naniesienia próby badanej należy rozpocząć zbieranie frakcji eluatu do 10
małych probówek z zaznaczoną objętością 1 cm3, umieszczonych w statywie. Następnie
zbieranie frakcji należy przerwać i przemywać kolumnę przy użyciu około 25 cm3
0,9% roztworu NaCl.

Oznaczanie stężenia białka i obecności soli

W zebranych frakcjach oznaczyć zawartość białka metodą Lowry’ego lub Bradforda
według procedur opisanych w punkcie 5.4. Należy także sprawdzić obecność siarczanu
amonowego. W tym celu na małe szkiełka zegarkowe nanieść po 2 krople nasyconego
roztworu wodorotlenku baru i po 1 kropli kwasu octowego lodowatego, a następnie
wymieszać roztwory bagietką. Na szkiełka nanieść po 1 kropli eluatów z kolejnych frakcji.
O obecności jonów siarczanowych świadczy białe zmętnienie spowodowane

57
powstawaniem nierozpuszczalnego siarczanu baru. Zmętnienie jest najlepiej widoczne na
czarnym tle.

Interpretacja wyniku
Na podstawie uzyskanych wyników ilościowych wykreślić profil elucji białka.
W tym celu sporządzić wykres, gdzie na osi odciętych nanosi się numery frakcji, a na osi
rzędnych odpowiadające im stężenia białka w μg/cm 3. Po połączeniu naniesionych na
wykres punktów otrzymuje się wykres elucji białka. Na wykresie zaznaczyć również
numery probówek, w których stwierdzono obecność soli.

Odczynniki
1) 0,9 % roztwór NaCl,
2) próba badana (roztwór białka: kazeiny lub albuminy jaja kurzego – 200 mg/100 cm3),
3) odczynniki do oznaczania białka metodą kolorymetryczną,
4) nasycony roztwór wodorotlenku baru,
5) kwas octowy lodowaty.

5.4. Ilościowe oznaczanie białek

5.4.1. Metoda Lowry’ego

Zasada oznaczenia
Kolorymetryczna metoda Lowry’ego opiera się na dwóch reakcjach:
- reakcja białka z jonami miedziowymi w środowisku zasadowym,
- redukcja odczynnika Folina-Ciocalteau.
Obie reakcje zachodzą w środowisku zasadowym. Pierwsza jest reakcją biuretową,
dzięki której następuje intensyfikacja barwy roztworu, powstającej po dodaniu odczynnika
Folina-Ciocalteau. Jest to odczynnik fosforomolibdeno-fosforowolframowy, który pod
wpływem aminokwasów aromatycznych: tyrozyny i tryptofanu ulega redukcji do błękitu
molibdenowego.
Na intensywność zabarwienia wpływa przede wszystkim rodzaj oznaczanego białka, co
wynika z różnej zawartości aminokwasów aromatycznych. Np. intensywność barwy, jaką
daje trypsyna, jest trzy razy większa niż żelatyny o tym samym stężeniu. Jednakże
żelatyna, którą otrzymuje się z kolagenu, nie zawiera tryptofanu, a tyrozyna znajduje się
w niej w małych ilościach. Dlatego powinno się stosować odpowiednie wzorce. Pomimo to
metoda Lowry’ego jest uważana za bardzo czułą, pozwala na oznaczenie białka już

58
w stężeniu 1 μg/cm3. Jest często wykorzystywana w oznaczeniach ilościowych białek
w procesie ich rozdziału i frakcjonowania do kontroli przebiegu przeprowadzanego
procesu.
Pomiar barwy przeprowadza się przy długości fali 750 nm, o ile stężenie białka
w badanym roztworze nie przekracza 200 μg/cm3. Jeżeli stężenie białka jest wyższe (do
ok. 600 μg/cm3), pomiar przeprowadza się przy długości fali 500 nm.
Stężenie białka odczytuje się na podstawie wielkości absorbancji z odpowiedniej
krzywej wzorcowej. Ze względu na różnorodność białek i brak prostoliniowej zależności
między stężeniem a absorbancją, sporządza się krzywą wzorcową przy użyciu badanego
białka albo białka wzorcowego, którym najczęściej jest krystaliczna albumina surowicy
wołowej.

Wykonanie
0,4 cm3 próby badanej odmierzyć do probówki, dodać 2 cm 3 odczynnika miedziowego
(mieszanina roztworów A i B), wymieszać i odstawić na 10 minut w temperaturze
pokojowej. Po 10 minutach dodać 0,2 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteau i natychmiast
wymieszać energicznie zawartość probówki. Sekundowe opóźnienia w mieszaniu
zawartości probówki mogą powodować błędne oznaczenia na skutek rozkładu odczynnika
w środowisku zasadowym, zanim zdąży on ulec redukcji z wytworzeniem barwnego
związku. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej zmierzyć absorbancję przy długości
fali 750 nm.

Sporządzanie krzywej wzorcowej

Roztwór podstawowy albuminy bydlęcej rozcieńczyć w następujący sposób. Do 10
ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno 1, 2, 3 itd. aż do 10 cm 3 roztworu
podstawowego białka. Następnie do każdej probówki dodać wodę destylowaną w takiej
ilości, aby końcowa objętość roztworu wynosiła 10 cm 3. Przygotowane w ten sposób
roztwory wzorcowe zawierają 20, 40, 60 aż do 200 µg białka w 1 cm3.
Do drugiej serii 11 ponumerowanych probówek odmierzyć dokładnie po 0,4 cm 3
kolejnych roztworów wzorcowych białka, a do ostatniej, jedenastej probówki 0,4 cm 3
wody destylowanej (próba ślepa). Następnie przeprowadzić pomiar w sposób opisany
powyżej. Do wszystkich probówek dodać odczynnik miedziowy. Odstawić na 10 minut
w temperaturze pokojowej, a następnie dodać odczynnik Folina-Ciocalteau. Wszystkie

59
probówki wraz z próbą ślepą zostawić w temperaturze pokojowej przez 30 minut,
a następnie zmierzyć absorbancję przy długości fali 750 nm.
Krzywą wzorcową wykreślić, nanosząc na osi rzędnych oznaczone wielkości
absorbancji, a na osi odciętych odpowiadające im stężenia białka (od 20 do 200 µg/cm3).

Odczynniki
1) albumina bydlęca – roztwór podstawowy (stężenie 200 μg/cm3),
2) odczynnik miedziowy:
roztwór A – 2 g bezwodnego węglanu sodowego w 100 cm3 0,1 M roztworu NaOH;
roztwór B – 0,5 g CuSO4  5H2O w 100 cm3 1% roztworu cytrynianu sodowego;
przed użyciem miesza się 50 cm3 roztworu A i 1 cm3 roztworu B,
3) odczynnik Folina-Ciocalteau,
4) próba badana.

5.4.2. Metoda Bradforda

Zasada oznaczenia
W metodzie tej wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika Coomassie Brillant Blue
G-250 z białkiem poprzez wiązania jonowe i oddziaływania hydrofobowe.
Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, w minimalnym stopniu reszty histydyny,
lizyny, tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny. Barwnik, który w środowisku kwaśnym ma
barwę brunatną, po dodaniu do roztworu białka tworzy kompleks o intensywnie niebieskim
zabarwieniu. Maksimum absorbancji otrzymanej barwy przypada na długość fali 595 nm.
Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia białka w roztworze.
Do zalet tej metody należy prostota wykonania, duża szybkość i czułość. Wadą metody
mogą być różnice w wiązaniu barwnika przez różne białka. Przy pomiarach mogą również
przeszkadzać niektóre detergenty, takie jak SDS – siarczan dodecylu sodu czy Triton
X-100, które dają dodatkowy interferujący kolor i zawyżają wyniki.

Wykonanie
Do probówki odmierzyć 100 μl próby badanej i dodać 5 cm 3 roztworu barwnika
Coomassie Brillant Blue G-250. Po 5 minutach, ale przed upływem 60 minut, dokonać
pomiaru absorbancji przy długości fali 595 nm. Stężenie białka odczytać z krzywej
wzorcowej.

60
Sporządzanie krzywej wzorcowej
Z roztworu podstawowego albuminy bydlęcej sporządzić kolejne rozcieńczenia
w 10 probówkach w sposób następujący. Do kolejnych probówek odmierzyć po 0,05; 0,1;
0,2; do 0,5 cm3 i uzupełnić 0,9% NaCl do 1 cm3. Przygotowane w ten sposób roztwory
wzorcowe zawierają 50, 100, 200, 300 itd. aż do 500 μg białka w 1 cm 3. Do drugiej serii
probówek odmierzyć po 100 μl kolejnych rozcieńczeń albuminy, a jako próbę ślepą 100 μl
0,9% NaCl. Następnie postępować w sposób opisany powyżej. Po dokonaniu pomiaru
absorbancji wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi oznaczone wielkości
absorbancji, a na osi odciętych odpowiadające im stężenia białka.

Odczynniki
1) roztwór macierzysty barwnika: 100 mg Coomassie Brillant Blue G-250 rozpuszcza się w 50 cm 3 96%
etanolu, dodaje 100 cm3 85% kwasu ortofosforowego (V) i uzupełnia wodą do 200 cm 3; roztwór
macierzysty zachowuje trwałość jeśli jest przechowywany w ciemnej butelce w temperaturze 4ºC,
2) roztwór roboczy barwnika: 1 objętość roztworu roboczego rozcieńcza się 4 objętościami wody
destylowanej; trwałość roztworu roboczego przechowywanego jak wyżej wynosi 2 tygodnie; przed
wykonaniem oznaczenia roztwór roboczy należy przesączyć,
3) roztwór podstawowy albuminy bydlęcej o stężeniu 0,5 mg/cm3,
4) 0,9% roztwór NaCl,
5) próba badana.

Zadania do wykonania
1. W roztworze otrzymanym do badania oznaczyć zawartość wolnych aminokwasów na
postawie reakcji z ninhydryną.
2. Przeprowadzić wykrywanie aminokwasów siarkowych: cysteiny i cystyny.
3. Przeprowadzić rozdział aminokwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej. Na
podstawie wartości Rf zidentyfikować aminokwasy w roztworach otrzymanych do
badania.
4. Przeprowadzić reakcję biuretową w celu sprawdzenia obecności białek
w otrzymanym roztworze.
5. Przeprowadzić wytrącanie białka za pomocą wybranego kationu i anionu.
6. Przeprowadzić denaturację białka etanolem.
7. Przeprowadzić odsalanie wytrąconego białka od soli amonowej na kolumnie PD-10
wypełnionej żelem Sephadex G-25.

61
 WĘGLOWODANY

1. Wprowadzenie
Węglowodany, zwane też cukrami, bądź sacharydami (od greckiego słowa saccharum
– cukier), stanowią obok białek, lipidów i kwasów nukleinowych jedną z czterech
najważniejszych grup cząsteczek biologicznych. Są to związki chemiczne zbudowane
z trzech podstawowych pierwiastków: węgla, stanowiącego szkielet, wodoru oraz tlenu.
Pod względem chemicznym cukry należą do aldehydów lub ketonów
wielowodorotlenowych, ponieważ w swojej cząsteczce zawierają kilka grup
hydroksylowych (–OH) i jedną grupę karbonylową (aldehydową –CHO lub ketonową
–CO). Mają zatem dwie różne grupy funkcyjne, których obecność warunkuje
charakterystyczne dla tych związków właściwości.
Ważną grupę, ze względu na rolę pełnioną w świecie organizmów żywych jak
i w technologii, stanowią pochodne węglowodanów, takie jak: aminocukry, polisacharydy
kwaśne, estry fosforanowe, glikozydy, a także związki powstające w wyniku połączenia
sacharydów z białkami czy lipidami, a mianowicie glikoproteiny i glikolipidy.
Węglowodany są najbardziej rozpowszechnioną grupą związków organicznych na
Ziemi. Znaleźć je można we wszystkich formach organizmów żywych, a największa
obfitość i różnorodność tych związków występuje w świecie roślin. Jest to związane ze
zdolnością roślin do wytwarzania węglowodanów z wody i dwutlenku węgla w procesie
fotosyntezy. Organizmy ludzkie i zwierzęce takich możliwości nie posiadają i stąd są one
znacznie uboższe pod względem zawartości cukrów.

2. Podział węglowodanów
Ze względu na zróżnicowaną budowę, węglowodany możemy podzielić na dwie grupy:
1. Cukry proste, tak zwane monosacharydy (jednocukry). Występują one samodzielnie lub
stanowią część składową innych cukrów (jako tzw. monomery lub jednostki cukrowe).
Monosacharydy można podzielić w zależności od:
 ilości atomów węgla w cząsteczce na: triozy (3 C), tetrozy (4 C), pentozy (5 C), heksozy
(6 C), heptozy (7 C),
 posiadanej grupy funkcyjnej (karbonylowej) na aldozy (posiadają grupę aldehydową)
i ketozy (posiadają grupę ketonową).
2. Cukry złożone – związki powstające w wyniku kondensacji różnej liczby cząsteczek

61
cukrów prostych, które łączą się ze sobą wiązaniami glikozydowymi (-C-O-C-), a ze
względu na stopień polimeryzacji cząsteczek dzieli się je na dwie podgrupy :
 oligosacharydy – zbudowane z dwóch do dziesięciu cząsteczek cukrów prostych;
i w zależności od ilości tworzących je monomerów wyróżniamy disacharydy
(dwucukry), trisacharydy (trójcukry) itd.,
 polisacharydy (wielocukry) – mają cząsteczki składające się z bardzo dużej liczby
jednostek cukrowych i w wyniku ich hydrolitycznego rozkładu uwalnia się powyżej
dziesięciu cząsteczek cukrów prostych, aż do kilku czy kilkudziesięciu tysięcy; mogą
być zbudowane z cząsteczek tego samego cukru prostego (homoglikany), bądź
powstawać w wyniku połączenia dwóch lub więcej rodzajów monosacharydów
i wówczas określane są mianem heteroglikanów.

3. Funkcje węglowodanów i ich występowanie

Węglowodany w organizmach żywych pełnią wielorakie funkcje. Przede wszystkim,
takie sacharydy złożone jak: skrobia, glikogen, sacharoza czy inulina stanowią materiał
zapasowy i pełnią rolę rezerwy energetycznej, czyli biorą czynny udział w magazynowaniu
i uruchamianiu energii w zależności od potrzeb organizmu. Różne cukry proste,
a zwłaszcza glukoza i fruktoza oraz ich pochodne fosforanowe, są ważnymi metabolitami
w procesach biochemicznych, takich jak oddychanie czy fotosynteza. Wiele spośród
polisacharydów oraz pochodnych cukrów pełni rolę strukturalną i stanowi składniki
budulcowe ścian komórkowych roślin, grzybów oraz bakterii. Celuloza, hemicelulozy
i lignina to podstawowe elementy strukturalne ścian komórek roślinnych. W komórkach
grzybów oraz w pancerzykach owadów i skorupiaków znajduje się chityna. U bakterii
głównym składnikiem ściany komórkowej jest peptydoglikan, zawierający długie łańcuchy
N-acetyloglukozoaminy. Substancje pektynowe odgrywają rolę tak zwanego „lepiszcza”
łączącego komórki roślinne oraz utrzymują tkankę w stanie uwodnienia. Różne inne
polisacharydy kwaśne, występujące głównie w algach morskich, pełnią funkcję
regulatorów stopnia nawodnienia tkanek. Ponadto, węglowodany wchodzą w skład wielu
związków biologicznie czynnych. Pentozy D-ryboza i 2-deoksy-D-ryboza są składnikami
kwasów nukleinowych oraz nukleotydów. Pochodne aminowe cukrów stanowią składniki
substancji odpornościowych krwi. W połączeniu z białkami jako glikoproteiny wchodzą
w skład niektórych białek enzymatycznych oraz białek membranowych. W połączeniu
z białkami, zwanymi lektynami, pełnią rolę pośredników w oddziaływaniach pomiędzy
komórkami, jak i pomiędzy komórką a środowiskiem zewnętrznym. Cukry mogą również

62
tworzyć połączenia z tłuszczami, tzw. lipopolisacharydy lub stanowić element składowy
lipidów złożonych nazywanych glikolipidami. Związki takie występują w ścianie
komórkowej bakterii, jak również znajdują się w błonach cytoplazmatycznych komórek.
Ważnymi pochodnymi cukrów są także glikozydy o przeróżnych właściwościach np.
barwniki antocyjanowe, powierzchniowo czynne saponiny, toksyczne glikoalkaloidy takie
jak solanina czy też związki pobudzające pracę serca, a więc o charakterze leczniczym.
W przyrodzie najbardziej rozpowszechniona jest glukoza, gdyż to ona powstaje jako
bezpośredni produkt fotosyntezy, ponadto jest składnikiem wielu oligosacharydów (m.in.
sacharozy, maltozy, laktozy) i polisacharydów (m.in. skrobi, celulozy). Naturalnymi
źródłami glukozy, jak również fruktozy i dwucukru sacharozy są owoce oraz warzywa.
W większych ilościach występują one także w miodach. Szczególnie zasobnymi
w sacharozę źródłami, wykorzystywanymi na skalę przemysłową, są buraki cukrowe
i trzcina cukrowa. Wiele warzyw bulwiastych, zbożowych, strączkowych oraz kłączy
różnych roślin dostarcza przyswajalnych przez organizm ludzki polisacharydów takich jak
skrobia (bulwy ziemniaka, ziarno zbóż, groch, fasola) oraz inulina (kłącza topinamburu,
dalii, irysa, cykorii). Produkty pochodzenia roślinnego są również źródłem węglowodanów
częściowo przyswajalnych (rafinoza, stachioza, pektyny, hemicelulozy) oraz
nieprzyswajalnych (celuloza, lignina), stanowiących składnik tak zwanego błonnika
pokarmowego, który odgrywa niebagatelną rolę w procesie prawidłowego trawienia.
Ważnym źródłem polisacharydów kwaśnych (agar-agar, karagen, kwas alginowy) są glony
i wodorosty morskie. W świecie roślinnym bardzo rozpowszechnionymi substancjami są
różnego rodzaju glikozydy. Występują one w takich organach roślin jak: kwiaty, liście,
nasiona i korzenie, a ze względu na dobrą rozpuszczalność są zawarte głównie w soku
roślinnym. Spośród produktów pochodzenia zwierzęcego jedynym znaczącym źródłem
węglowodanów jest mleko ssaków, które zawiera laktozę.

4. Właściwości funkcjonalne i znaczenie technologiczne węglowodanów

Z budową chemiczną cukrów ściśle związane są właściwości fizyczne i funkcjonalne
tych związków. Za najbardziej charakterystyczne dla mono- i disacharydów uznaje się
rozpuszczalność w wodzie, zdolność jej wiązania (tzw. higroskopijność) oraz słodki smak.
Wszystkie te cukry rozpuszczają się w zimnej wodzie i tworzą roztwory rzeczywiste, przy
czym stopień rozpuszczalności jest zróżnicowany. Zdolności higroskopijne także zależą od
rodzaju cukru, a nawet jego formy izomerycznej. Szczególną cechą, wyróżniającą te
związki oraz niektóre ich pochodne, jest ich słodkość. Słodkość, tak jak i wcześniej

63
omówione cechy, zależy nie tylko od rodzaju cukru, ale i od formy izomerycznej. Wpływ
na to ma także stopień uwodnienia, co oznacza, że inną słodkość wykazują formy
bezwodne, a inną uwodnione kryształy. Właściwość tę najczęściej określa się
w procentach przez porównanie do sacharozy (100% słodkości), która jest
najpopularniejszym środkiem słodzącym. I tak, najsłodszym cukrem jest fruktoza
(>100%), a dopiero na drugim miejscu znajduje się sacharoza. Glukoza, ksyloza i mannitol
charakteryzują się mniej słodkim smakiem niż sacharoza (ok. 75%). Natomiast takie
disacharydy jak maltoza i laktoza są nawet kilkakrotnie mniej słodkie od sacharozy
(znacznie <50%).
W przypadku polisacharydów, cechami wyróżniającymi je są: zdolność pęcznienia
i żelowania, możliwość wymiany kationów oraz zdolność do adsorbowania różnych
substancji. Większość polisacharydów nie rozpuszcza się w zimnej wodzie, natomiast
w gorącej pęcznieją i żelują lub tworzą roztwory o dużej lepkości. Takimi właściwościami
charakteryzują się szczególnie pochodne celulozy, pektyny, agar-agar i karagen.
Zdolnością wymiany kationów wyróżniają się hemicelulozy, zaś możliwością
adsorbowania, np. soli żółciowych czy metali ciężkich, cechują się substancje pektynowe.
Omówione powyżej właściwości funkcjonalne węglowodanów decydują o ich
przydatności technologicznej. Sacharoza, laktoza, cukry proste (glukoza i fruktoza) oraz
niektóre pochodne cukrów (sorbitol, mannitol, ksylitol) wykorzystywane są jako środki
słodzące. Stosowane w większych stężeniach powodują wzrost ciśnienia osmotycznego
środowiska i w związku z tym mają znaczenie jako środki zapobiegające rozwojowi
drobnoustrojów. Skrobia wykorzystywana jest do produkcji syropów charakteryzujących
się różnym stopniem scukrzenia (tzw. syropy nisko- i wysokoscukrzone), które służą jako
surowce w produkcji różnych wyrobów cukierniczych. Celuloza i lignina stanowią główny
surowiec w przemyśle celulozowo-papierniczym. Różne polisacharydy kwaśne (agar-agar,
karageny, kwas alginowy, pektyny) stosowane są jako czynniki żelujące, stabilizujące,
zagęszczające i emulgujące, zwłaszcza w przemyśle piekarsko-cukierniczym, owocowo-
warzywnym, mleczarskim oraz w wielu innych gałęziach przemysłu spożywczego.
Ponadto należy zaznaczyć, że zarówno ilość jak i rodzaj dostarczanych organizmowi
węglowodanów mają ścisły związek ze stanem zdrowotnym oraz zapadalnością na
schorzenia, które określa się mianem chorób cywilizacyjnych, takich jak: cukrzyca,
otyłość, próchnica zębów czy miażdżyca. Dlatego też charakterystyka profilu cukrowego
oraz analiza ilościowa węglowodanów zawartych w różnych produktach ma ogromne
znaczenie w analizie towaroznawczej, służącej ocenie jakości żywności oraz

64
prawidłowości stosowanych zabiegów technologicznych.

5. Struktura węglowodanów
5.1. Monosacharydy
Monosacharydy (cukry proste) są związkami niskocząsteczkowymi, które można
opisać wzorem ogólnym (CH2O)n, gdzie n ≥ 3. Jak wynika z przedstawionego wzoru
sumarycznego, stosunek wodoru do tlenu wynosi w nich 2:1, a więc jest taki jak w wodzie
i stąd pochodzi nazwa węglowodany. Cząsteczki ich są zbudowane z trzech (triozy) do
siedmiu (heptozy) atomów węgla, do których przyłączonych jest kilka grup
wodorotlenowych (–OH) i jedna grupa karbonylowa (aldehydowa –CHO lub ketonowa
–CO). Cukry proste zawierające grupę aldehydową nazywane są aldozami, a posiadające
grupę ketonową ketozami.
Najprostszymi monosacharydami są triozy: aldehyd D- i L-glicerynowy oraz
dihydroksyaceton (rys. 10).

H O H O
C CH2OH
C

H C* OH HO C* H C O

CH2OH CH2OH
CH2OH

aldehyd D-glicerynowy aldehyd L-glicerynowy dihydroksyaceton

(aldoza, aldotrioza) (aldoza, aldotrioza) (ketoza, ketotrioza)

Rys. 10. Wzory rzutowe Fischera trioz. Gwiazdką (*) oznaczono centrum asymetrii

Jak wynika z przedstawionych wzorów strukturalnych, aldehyd glicerynowy jest

aldozą, natomiast dihydroksyaceton jest ketozą. Ze względu na obecność w cząsteczce
aldehydu glicerynowego jednego atomu węgla asymetrycznego (atom węgla połączony
z czterema różnymi podstawnikami) istnieje możliwość wystąpienia dwóch izomerów
przestrzennych, które mają się do siebie jak odbicia lustrzane (aldehyd D-glicerynowy
i aldehyd L-glicerynowy). Takie stereoizomery nazywają się enancjomerami. W formie D
grupa wodorotlenowa znajduje się po prawej stronie, a w formie L po lewej stronie
asymetrycznego centrum węglowego. Z obecnością centrów asymetrii w cząsteczce wiąże
się właściwość skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Takie ustawienie grup
–OH w obydwu formach aldehydu glicerynowego decyduje o tym, że forma o konfiguracji

65
D skręca ją w prawo (stąd D od łac. dexter – prawy), a o konfiguracji L– w lewo
(łac. laevus – lewy).
Monosacharydy o dłuższych łańcuchach węglowych (tetrozy, pentozy, heksozy
i heptozy) mają więcej asymetrycznych atomów węgla, których liczba decyduje
o możliwości wystąpienia wielu stereoizomerów. Teoretycznie można przyjąć, że ilość
możliwych izomerów przestrzennych wynosi 2n, gdzie n oznacza liczbę chiralnych
atomów węgla. Cukry te również tworzą dwa szeregi konfiguracyjne D i L (np. D-glukoza
i L-glukoza, rys. 11).

H O H O
C C
* *
H C OH HO C H
* *
HO C H H C OH
* *
H C OH HO C H
* *
H C OH HO C H
CH2OH CH2OH
D-glukoza L-glukoza

Rys. 11. Wzory rzutowe Fischera D-glukozy i L-glukozy (tzw. enancjomery, czyli
lustrzane odbicia)

O przynależności cukru do jednego lub drugiego szeregu decyduje położenie grupy

–OH przy asymetrycznym atomie węgla najbardziej oddalonym od grupy aldehydowej lub
ketonowej. Zatem, monosacharydy należące do szeregu D mają ułożenie podstawników
przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla takie jak w aldehydzie D- glicerynowym,
a szeregu L – jak w formie L tego aldehydu. Jednakże w przeciwieństwie do aldehydu
glicerynowego umowne formy D i L tych cukrów nie wskazują kierunku skręcenia
płaszczyzny światła spolaryzowanego. Czynność optyczną każdego cukru oznacza się
doświadczalnie, a kierunek skręcalności określa się znakiem () jeśli jest w prawo lub (-)
jeśli w lewo (np. D()-glukoza, D(-)-ryboza, L()-arabinoza, D(-)-fruktoza). W przyrodzie
o wiele bardziej rozpowszechnione są cukry szeregu D.
Rys. 12 przedstawia wzory rzutowe Fischera najpopularniejszych monosacharydów
o różnej długości szkieletu węglowego, należące do aldoz i ketoz szeregu D.

66
 tetrozy
H O
C CH2OH

H C OH C O

H C OH H C OH

CH2OH CH2OH

D-erytroza D-erytruloza
(aldoza) (ketoza)

pentozy

H O H O
C C CH2OH
H C OH HO C H C O
H C OH H C OH H C OH
H C OH H C OH H C OH
CH2OH CH2OH CH2OH
D-
ryboza D-arabinoza D-rybuloza
(aldoza) (aldoza) (ketoza)

heksozy

H O H O H O
C CH2OH
C C
H C OH C O
H C OH HO C H
HO C H HO C H
HO C H HO C H
H C OH H C OH
HO C H H C OH
H C OH H C OH
H C OH H C OH
CH2OH CH2OH
CH2OH CH2OH

D-glukoza D-mannoza D-galaktoza D-fruktoza

(aldoza) (aldoza) (aldoza) (ketoza)

Rys. 12. Wzory rzutowe Fischera przedstawicieli: tetroz, pentoz, heksoz szeregu D (aldozy
i ketozy). Ramką zaznaczono atom węgla, przy którym występuje konfiguracja decydująca
o przynależności do szeregu D (taka jak w aldehydzie D-glicerynowym)

67
 Największe znaczenie spośród monosacharydów mają heksozy, które w przyrodzie
występują w największych ilościach. Mniej rozpowszechnione, ale mające ogromne
znaczenie biologiczne, są pentozy. Cukry o innej długości łańcucha węglowego spotykane
są rzadziej i to głównie w drobnoustrojach oraz wydzielinach roślinnych.
Pentozami mającymi ogromne znaczenie w przyrodzie są D-ryboza i jej pochodna
2-deoksy-D-ryboza, które stanowią składniki kwasów nukleinowych RNA i DNA oraz
różnych nukleotydów np. adenozynotrifosforanu (ATP). Ze względu na posiadaną grupę
aldehydową zaliczają się do aldoz. Wzór łańcuchowy D-rybozy pokazano na rysunku 12.
Aldoheksozy posiadają aż cztery centra asymetrii, więc teoretycznie możliwe jest
utworzenie 16 stereoizomerów (24), natomiast ketoheksozy posiadające o jeden węgiel
asymetryczny mniej mogą tworzyć ich 8 (23). W przyrodzie jednak tylko trzy aldoheksozy
występują pospolicie. Najbardziej rozpowszechniona jest D(+)-glukoza, nieco mniej
D(+)-galaktoza oraz D(+)-mannoza. Natomiast najpopularniejszą heksozą z grupą
ketonową jest D(-)-fruktoza (rys. 12). Należy zwrócić uwagę na to, że D(+)-glukoza
i D(+)-mannoza różnią się jedynie konfiguracją przy węglu C-2, a D(+)-glukoza
i D(+)-galaktoza tylko przy węglu C-4. Takie cukry, które różnią się konfiguracją wokół
jednego węgla asymetrycznego nazywają się epimerami.
Przedstawione na rysunku 12, za pomocą rzutowych wzorów Fischera, otwarte formy
łańcuchowe pentoz i heksoz nie są formami dominującymi. Jedynie triozy i tetrozy
występują w przyrodzie w postaci łańcuchowej. Pentozy i heksozy w stanie krystalicznym
ulegają cyklizacji, tworząc stabilne formy pierścieniowe. Również w roztworach wodnych
cykliczne formy dominują i nieznaczna tylko część cząsteczek występuje w formie
liniowej.
Proces cyklizacji, czyli przechodzenia otwartej formy liniowej w zamkniętą formę
pierścieniową, jest możliwy dzięki odwracalnej reakcji grupy aldehydowej lub ketonowej
z grupą alkoholową tej samej cząsteczki cukru. Wynikiem tej reakcji jest powstanie
wewnątrzcząsteczkowego hemiacetalu (półacetalu) lub wewnątrzcząsteczkowego
hemiketalu (półketalu). Tworzenie wewnątrzcząsteczkowego hemiacetalu można wyjaśnić
na przykładzie D-glukozy, która jest aldoheksozą (rys. 13).

68
 H O
C1
CH2OH 6 CH2OH
H C2 OH OH H 5 O
H H H
H H
HO C3 H = C 4 1
OH H O HO OH H
HO OH
H C4 OH 3
2

H C5 OH H OH H OH

H C6 OH
H

forma łańcuchowa forma pierścieniowa

D-glukozy D-glukopiranozy

Rys. 13. Tworzenie formy pierścieniowej (piranozowej) D-glukozy

W przypadku aldoheksoz grupa aldehydowa przy węglu C-1 w formie łańcuchowej

reaguje z grupą hydroksylową przy węglu C-5 i następuje zamknięcie cząsteczki w postaci
sześcioczłonowego pierścienia, zwanego piranozowym z powodu podobieństwa do
związku o nazwie piran.
W bardzo podobny sposób przebiega cyklizacja ketoheksoz, choć w tym przypadku
możliwe jest tworzenie dwóch rodzajów form pierścieniowych (rys. 14).

CH2OH CH2OH
OH CH2OH
6
O
H CH2OH
1

HO C O 5 2
H H HO
H C1 OH H H OH
4 3
C2 O OH H OH H
HO C3 H
forma pierścieniowa
H C4 OH
D-fruktofuranozy
H C5 OH H H
OH CH2OH
6 O
H C6 OH H H 1 CH2OH
H H
C 5 2
H H HO O H HO
HO HO OH
4
3
OH H OH H

forma łańcuchowa forma pierścieniowa

D-fruktozy D-fruktopiranozy

Rys. 14. Tworzenie form pierścieniowych (furanozowej i piranozowej) D-fruktozy

Proces cyklizacji D-fruktozy możemy opisać w następujący sposób: grupa ketonowa

przy C-2 w otwartej formie łańcuchowej reaguje albo z grupą hydroksylową przy węglu
C-6 i wówczas powstaje sześcioczłonowy pierścień hemiketalu (forma piranozowa) albo

69
z grupą hydroksylową przy węglu C-5, co prowadzi do powstania pięcioczłonowego
pierścienia hemiketalu, zwanego furanozowym z powodu podobieństwa do furanu.
W naturze formy piranozowe przeważają w roztworach wolnej fruktozy, natomiast
w postaci furanozowej występuje większość jej pochodnych.
Pięcioczłonowe formy pierścieniowe, czyli furanozowe, tworzą także pentozy.
Do przedstawiania cukrów w formach pierścieniowych stosowane są tak zwane wzory
taflowe Hawortha, które pozwalają na przestrzenne przedstawienie cząsteczek cukrów.
W wyniku procesu cyklizacji, prowadzącego do utworzenia formy pierścieniowej,
w cząsteczce cukru powstaje kolejne centrum asymetrii. Nowym węglem asymetrycznym
staje się węgiel grupy karbonylowej, czyli C-1 w przypadku aldoz lub C-2 w przypadku
ketoz. Węgiel ten nazywany jest anomerycznym, chiralnym lub glikozydowym, natomiast
przyłączoną do niego grupę –OH określa się mianem anomerycznej lub glikozydowej
grupy wodorotlenowej.
W związku z tym, że ta nowa, anomeryczna grupa hydroksylowa może być
przyłączona do węgla glikozydowego w dwóch różnych położeniach, istnieje możliwość
tworzenia dwóch stereoizomerów, określanych jako anomery α i β. I tak, w wyniku
cyklizacji, np. glukozy powstają dwie formy anomeryczne: α-D-glukopiranoza
i β-D-glukopiranoza. Znaki α i β, przy przedstawianiu cukru za pomocą wzoru Hawortha,
określają położenie anomerycznej grupy wodorotlenowej względem płaszczyzny
pierścienia cząsteczki. Symbol α oznacza, że grupa ta jest położona pod płaszczyzną
pierścienia, a β znaczy, że znajduje się ona nad tą płaszczyzną. Anomery α i β mogą
wzajemnie przekształcać się poprzez otwartą formę łańcuchową, towarzyszy temu zmiana
kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego, a zjawisko to nosi nazwę mutarotacji
(łac. mutare - zmieniać). W roztworach cukrów prostych ustala się z czasem stan
równowagi pomiędzy formami pierścieniowymi α i β oraz formą łańcuchową (rys. 15).
H O
C
CH2OH CH2OH
H C OH
O O
H H H OH
H HO C H H
HO OH H HO OH H
OH H C OH H

H OH H C OH H OH

CH2OH

α-D-glukopiranoza D-glukoza β-D-glukopiranoza

forma łańcuchowa
Rys. 15. Stan równowagi pomiędzy anomerami α i β oraz formą łańcuchową glukozy

70
 Formy pierścieniowe, zarówno piranozowe jak i furanozowe, nie są płaskie (planarne)
i przyjmują w przestrzeni różne kształty, czyli konformacje. W przypadku pierścieni
piranozowych mogą występować dwa rodzaje konformacji: krzesełkowa albo łódkowa,
nazwane tak z racji podobieństwa do tych przedmiotów. Dominującą konformacją jest
jednak forma krzesełkowa, która jest korzystniejsza ze względu na swobodniejszy układ
podstawników –OH i –CH2OH, a w związku z tym jest też formą trwalszą. Furanozowe
struktury pierścieniowe występują w tak zwanej konformacji kopertowej, ponieważ
przypominają otwartą kopertę z uniesionym daszkiem. Struktura taka powstaje w wyniku
pofałdowania cząsteczki w taki sposób, że cztery atomy pierścienia leżą prawie w jednej
płaszczyźnie, natomiast piąty jest od niej nieco oddalony. Na rysunku 16 przedstawiono
przykłady form konformacyjnych piranozy i furanozy.

H H HO H
CH2OH CH2OH CH2OH
HO HO H HO
O O O
HO H H HO H H H H OH
H OH OH H OH HO H
H

forma krzesełkowa forma łódkowa forma kopertowa

β-D-glukopiranozy β-D-glukopiranozy β-D-rybofuranozy

Rys. 16. Przykłady form konformacyjnych β-D-glukopiranozy i β-D-rybofuranozy

Podsumowując, trzeba powiedzieć, że monosacharydy występują w naturze jako

mieszanina wszystkich form izomerycznych i konformacyjnych, a w roztworach wodnych
ustala się pomiędzy nimi równowaga.

5.2. Disacharydy i inne ważniejsze oligosacharydy

Oligosacharydy to grupa cukrów złożonych, zbudowanych z dwóch do dziesięciu
cząsteczek monosacharydów (monomerów) połączonych ze sobą wiązaniem
glikozydowym (O-glikozydowym).
Najważniejszą grupę, ze względu na znaczenie w odżywianiu człowieka, stanowią
disacharydy. Najpowszechniejszymi spośród nich są: sacharoza, maltoza i laktoza.
Disacharydy to węglowodany o sumarycznym wzorze C 12H22O11, które powstają
w wyniku reakcji kondensacji dwóch cząsteczek cukrów prostych, czego efektem jest
powstanie wiązania O-glikozydowego o charakterze acetalu i wydzielenie cząsteczki

71
wody. W tworzeniu wiązania glikozydowego bierze udział anomeryczna (glikozydowa)
grupa wodorotlenowa jednej cząsteczki cukru (przy C-1 aldozy lub C-2 ketozy) oraz
hydroksylowa grupa drugiej cząsteczki cukru. Obecność wielu grup wodorotlenowych
w monosacharydach oznacza możliwość tworzenia różnych wiązań glikozydowych.
A zatem, jeżeli wiązanie to powstaje w wyniku reakcji anomerycznej grupy
wodorotlenowej przy C-1 w przypadku aldoz (lub C-2 w przypadku ketoz) z dowolną
grupą hydroksylową drugiej cząsteczki cukru to w efekcie powstanie disacharyd z jedną
wolną glikozydową grupą wodorotlenową. Ze względu na możliwość decyklizacji
pierścienia z wolną anomeryczną grupą wodorotlenową formy anomeryczne α i β takiego
disacharydu mogą swobodnie przechodzić jedna w drugą, czyli cząsteczka podlega
zjawisku mutarotacji. Disacharydy zbudowane w ten sposób, wykazujące zjawisko
mutarotacji posiadają właściwości redukujące i zaliczane są do cukrów zwanych
redukującymi. Przykładami tego rodzaju disacharydów są: maltoza (α-D-glukopiranozylo-
(1→4)-α-D-glukopiranoza) oraz laktoza (β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-α-D-
glukopiranoza). Nazwy w nawiasach podają informację, które formy anomeryczne
monosacharydów biorą udział w tworzeniu dwucukru, natomiast cyfry oznaczają pozycję
wiązania glikozydowego. Końcówka „-oza” wskazuje na to, że jest to disacharyd
redukujący. Wzory Hawortha maltozy i laktozy przedstawiono na rys. 17.

CH2OH CH2OH
O O
H H H H
H H
α 1 4 α
HO OH H OH H
O OH
H OH H OH

maltoza
α-D-glukopiranozylo-(1→4)-α-D-glukopiranoza

CH2OH CH2OH
O O
HO H H
H H
β 1 O 4 α
OH H OH H
H H OH

H OH H OH

laktoza
β-D-galaktopiranozylo-(1→4)-α-D-glukopiranoza

Rys. 17. Wzory przestrzenne Hawortha maltozy i laktozy

72
 Jak wynika z przedstawionych wzorów, maltoza jest dwucukrem powstającym z dwóch
cząsteczek tego samego monosacharydu, a mianowicie z α-D-glukopiranozy (glukozy).
Wiązanie glikozydowe powstaje pomiędzy atomem anomerycznego węgla C-1 jednej
cząsteczki cukru, a atomem węgla C-4 drugiej i jest to wiązanie typu
α-(1→4)-glikozydowe. Natomiast laktoza zbudowana jest z cząsteczek dwóch różnych
cukrów: β-D-galaktopiranozy (galaktozy) i α-D-glukopiranozy (glukozy). W tym
dwucukrze wiązanie glikozydowe również powstaje pomiędzy atomem anomerycznego
węgla C-1 jednej cząsteczki cukru, a atomem węgla C-4 drugiej, ale jest to wiązanie typu
β-(1→4)-glikozydowe.
Zupełnie innego rodzaju disacharydy powstają, gdy w tworzenie wiązania
glikozydowego zaangażowane są dwie anomeryczne grupy wodorotlenowe obydwu
cząsteczek cukrów prostych. W takim przypadku powstały dwucukier nie posiada żadnej
wolnej glikozydowej grupy wodorotlenowej, ponieważ obydwie są zablokowane
w wiązaniu i nie może przechodzić w formę łańcuchową. Niemożliwe jest więc
przekształcanie anomeru α w β, czyli nie wykazuje on mutarotacji po rozpuszczeniu
w wodzie. Ze względu na blokadę anomerycznych grup wodorotlenowych disacharydy
tego typu nie posiadają właściwości redukujących i należą do cukrów nieredukujących.
Przykładem disacharydu nieredukującego jest popularny cukier sacharoza, czyli
β-D-fruktofuranozylo-(2→1)-α-D-glukopiranozyd. Jak widać jest ona zbudowana
z cząsteczki fruktozy (anomeru β-fruktofuranozy) oraz czasteczki glukozy (anomeru
α-glukopiranozy). Strukturę przestrzenną tego cukru ilustruje rysunek 18.

CH2OH
CH2OH
O O
H H
H
β 2 O 1 α
H HO H HO
H CH2OH OH
OH H OH H

sacharoza
β-D-fruktofuranozylo-(2→1)-α-D-glukopiranozyd

Rys. 18. Wzór przestrzenny Hawortha sacharozy

Zastosowane w nazwie tego cukru końcówki „-ozylo-(2→1)-ozyd” wskazują, że

wiązanie glikozydowe powstało pomiędzy anomerycznymi węglami fruktozy (C-2)
i glukozy (C-1), jak również, że jest to disacharyd nieredukujący (końcówka „-ozyd”).

73
Warto zaznaczyć, że glukoza w połączeniach występuje zawsze w formie piranozowej,
natomiast fruktoza zawsze w formie furanozowej.
Z innych oligosacharydów, odgrywających znaczącą rolę ze względu na występowanie
w większych ilościach w pewnych naturalnych produktach żywnościowych, należy
wymienić:
 rafinozę, czyli α-D-galaktopiranozylo-(1→6)-α-D-glukopiranozylo-(1→2)-β-D-
fruktofuranozyd, która jest trisacharydem nieredukującym, zbudowanym z trzech
cząsteczek różnych monosacharydów, a mianowicie z galaktozy, glukozy i fruktozy,
 melezytozę, czyli α-D-glukopiranozylo-(1→3)-β-D-fruktofuranozylo-(1→2)-α-D-
glukopiranozyd, również trisacharyd nieredukujący, składający się z trzech cząsteczek
dwóch różnych cukrów – 2 cząsteczek glukozy i jednej fruktozy,
 stachiozę, czyli α-D-galaktopiranozylo-(1→6)-α-D-galaktopiranozylo-(1→6)-α-D-
glukopiranozylo-(1→2)-β-D-fruktofuranozyd, która należy do tetrasacharydów
nieredukujących i zawiera w swoim składzie dwie cząsteczki galaktozy oraz po jednej
cząsteczce glukozy i fruktozy.

5.3. Polisacharydy
Polisacharydy to wielkocząsteczkowe cukry złożone, powstające w wyniku
kondensacji dużej ilości cząsteczek (>10) monosacharydów jednego rodzaju
(homoglikany) bądź różnych rodzajów (heteroglikany). Najczęściej zbudowane są
z heksoz i określa się je mianem heksozanów, ale znane są też polisacharydy składające się
z pentoz, tak zwane pentozany. Mogą występować w postaci długich łańcuchów liniowych
lub posiadać rozgałęzienia.
Przykładem heksozanu, będącego homoglikanem, jest znany roślinny materiał
zapasowy – skrobia. Występuje ona w postaci ziaren, które składają się z dwóch jednostek
strukturalnych – amylozy (15-25%) i amylopektyny (75-85%). Monosacharydem
stanowiącym podstawowy składnik budulcowy, zarówno amylozy jak i amylopektyny, jest
α-D-glukoza (tzw. reszta glukozowa). Zasadniczą cechą różniącą te dwa składniki skrobi
od siebie jest ich struktura przestrzenna. Różnicę tę pokazano na rys. 19.

74
 CH2OH CH2OH CH2OH
O O O
H H H H H H
H H H
O OH H OH H OH H
O O O
H OH H OH H OH

fragment łańcucha amylozy

CH2OH CH2OH
O O
H H H H
H H Wiązanie
O OH H
O OH H α-(1→6)-glikozydowe
O
H OH H OH
CH2OH CH2 CH2OH
O O O
H H H H H H
H H H
O OH H OH H OH H
O O O
H OH H OH H OH

fragment cząsteczki amylopektyny

Rys. 19. Schemat budowy fragmentu cząsteczki amylozy i amylopektyny

Jak wynika z przedstawionego powyżej schematu, amyloza występuje w postaci

długich, nierozgałęzionych łańcuchów, w których cząsteczki glukozy połączone są
wyłącznie wiązaniami α-(1→4)-glikozydowymi. Łańcuchy te z reguły zbudowane są
z kilkuset reszt glukozowych i ulegają zwinięciu w spirale (tzw. helisy). Na jeden skręt tej
helisy przypada od 6 do 8 reszt glukozy. W zwojach tych spiralnie skręconych łańcuchów
mogą być wiązane różne atomy, między innymi jod (kompleksy jodu z amylozą dają
barwę ciemnoniebieską). Ważnymi cechami amylozy są: rozpuszczalność w wodzie i tak
zwane kleikowanie w podwyższonej temperaturze. Stąd też nazywana jest skrobią
rozpuszczalną.
Amylopektyna ma cząsteczkę silnie rozgałęzioną, co nadaje jej kształt sferyczny,
przypominający kłębek. Składa się z kilkuset do miliona reszt glukozowych połączonych,
w łańcuchach głównych jak i bocznych, wiązaniami α-(1→4)-glikozydowymi. Natomiast
w miejscach przyłączenia łańcuchów bocznych występują wiązania α-(1→6)-glikozydowe.
Łańcuchy rozgałęzień składają się z kilkunastu do 25 reszt glukozowych i występują co
20-25 jednostek cukrowych łańcucha głównego. Podobnie jak w amylozie, są one zwinięte

75
spiralnie i dają kompleksy z jodem o barwie czerwonej. Amylopektyna nie jest
rozpuszczalna w wodzie, natomiast pęcznieje i po podgrzaniu kleikuje.
Bardzo zbliżoną do amylopektyny budowę ma zwierzęcy i drożdżowy materiał
zapasowy – glikogen (tzw.”skrobia zwierzęca”). Jego cząsteczki są jednak tworzone
z większej liczby jednostek cukrowych i jeszcze silniej rozgałęzione. Łańcuchy boczne są
krótsze (12-18 reszt glukozowych) i występują co 10 jednostek cukrowych łańcucha
głównego. Glikogen także reaguje z jodem, dając czerwonobrunatne zabarwienie.
W wodzie jest nieco lepiej rozpuszczalny niż amylopektyna.
Pomimo że skrobia i glikogen są związkami wielkocząsteczkowymi, to mogą być
przyswajane przez człowieka dzięki wytwarzanym przez ludzki organizm enzymom
amylolitycznym, które katalizują w przewodzie pokarmowym hydrolityczny rozkład tych
polisacharydów do cukrów prostych.
Najbardziej rozpowszechnionym w całej biosferze polisacharydem, będącym również
heksozanem, jest składnik ścian komórkowych roślin i grzybów – celuloza. Celuloza
zbudowana jest z glukozy, ale w odróżnieniu od skrobi w jej skład wchodzą cząsteczki
β glukozy połączone wiązaniami β-(1→4)-glikozydowymi. Cząsteczki mają postać długich
nierozgałęzionych łańcuchów, składających się z kilkuset do kilkunastu tysięcy
monomerów. Wiele takich łańcuchów ułożonych równolegle łączy się ze sobą wiązaniami
wodorowymi, tworząc włókienka zwane micellami. Celuloza nie jest trawiona przez
organizm ludzki, który nie wytwarza enzymów celulolitycznych.
Skrobię, glikogen i celulozę, ze względu na to, że są zbudowane z glukozy nazywa się
D-glukanami.
Przykładem heksozanu zbudowanego z cząsteczek D-fruktozy jest wielocukier
zapasowy – inulina. Polisacharyd ten składa się z prostych łańcuchów utworzonych
z 30-90 jednostek β-D-fruktozy, połączonych wiązaniami β-D-(2→1)-glikozydowymi. Ze
względu na monosacharyd, z którego jest zbudowana, inulina należy do D-fruktanów.
Z pentozanów godnymi uwagi są D-ksylan i L-araban. D-ksylan tworzy łańcuchy
proste, w których strukturalną jednostką cukrową jest pentoza - D-ksyloza. Cząsteczki
pentoz połączone są wiązaniami β-(1→4)-glikozydowymi. L-araban jest polisacharydem
mającym strukturę rozgałęzioną i zbudowany jest z cząsteczek innej pentozy, L-arabinozy
połączonej wiązaniami α-(1→3)-glikozydowymi. Obydwa te polisacharydy wchodzą obok
różnych pochodnych cukrowych w skład hemiceluloz, a tym samym, wraz z celulozą
i substancjami pektynowymi, stanowią składnik błonnika pokarmowego.

76
5.4. Pochodne węglowodanów i polisacharydy kwaśne
Do związków o charakterze węglowodanów zaliczane są także różne pochodne
sacharydów i związki powstałe w wyniku połączenia cukrów z innymi cząsteczkami
biologicznymi.
Wśród pochodnych cukrów ważną rolę odgrywają produkty utleniania
monosacharydów, takie jak kwasy onowe (np. kwas glukonowy), które powstają w wyniku
utlenienia grupy aldehydowej (–CHO) do grupy karboksylowej (–COOH); kwasy uronowe
(np. kwas glukuronowy, kwas galakturonowy), w których utlenieniu do grupy
karboksylowej (–COOH) ulega grupa alkoholowa przy ostatnim atomie węgla (–CH2OH)
oraz kwasy cukrowe (np. kwas glukarowy), posiadające dwie grupy karboksylowe,
powstałe w wyniku utlenienia grupy aldehydowej oraz alkoholowej przy ostatnim atomie
węgla w łańcuchu. Szczególną rolę odgrywają kwasy uronowe, które wchodzą w skład tak
zwanych polisacharydów kwaśnych.
Na skutek redukcji grupy karbonylowej (–CHO lub –CO) do grupy alkoholowej
(–CH2OH lub –CHOH) cukry proste przekształcane są do alkoholi wielowodorotlenowych
(polioli, alkoholocukrów) – np. z D-glukozy powstaje D-sorbitol, z D-mannozy
- D-mannitol, z D-fruktozy może powstać D-sorbitol lub D-mannitol, a z D-ksylozy tworzy
się D-ksylitol. Poliole te charakteryzują się podobnie jak cukry słodkim smakiem i dlatego
stosowane są jako środki słodzące.
Obecność grup alkoholowych (–OH) w cząsteczkach cukrów determinuje możliwość
reagowania tych związków z kwasami, czyli ulegania reakcji estryfikacji. Zwłaszcza
ogromne znaczenie mają estry fosforowe. Najczęściej estryfikacji ulega grupa –OH przy
ostatnim atomie węgla w cząsteczce cukru, tak jak w przypadku glukozo-6-fosforanu,
fruktozo-6-fosforanu, rybozo-5-fosforanu. Może także reagować z kwasem fosforowym
glikozydowa (anomeryczna) grupa hydroksylowa i wówczas powstaje np. glukozo-1-
fosforan, jak również mogą być zestryfikowane dwie grupy hydroksylowe i wtedy mamy
do czynienia z difosforanami, np. fruktozo-1,6-difosforan, czy deoksyrybozo-3,5-
difosforan w kwasach nukleinowych. Fosforanowe pochodne cukrów biorą udział
w biochemicznych przemianach węglowodanów.
Istotną grupę pochodnych cukrów stanowią glikozydy, powstające w wyniku reakcji
cząsteczki cukru z cząsteczką związku nie należącego do węglowodanów. Cząsteczka
glikozydu składa się zawsze z dwóch części – reszty cukrowej i tzw. aglikonu.
W związkach tych, tak samo jak w polisacharydach, występuje wiązanie glikozydowe
utworzone pomiędzy anomeryczną grupą hydroksylową reszty cukrowej i odpowiednią

77
grupą funkcyjną drugiego związku, będącego aglikonem. Może to być wiązanie
O-glikozydowe (czyli –C–O–C–), tak samo jak w cukrach złożonych, np. gdy reagentem
jest cząsteczka alkoholu, fenolu lub kwasu karboksylowego i wiązanie następuje poprzez
mostek tlenowy. Na przykład w reakcji α-D-glukozy z metanolem powstaje metylo-α-D-
glukozyd. Najbardziej rozpowszechnionymi glikozydami fenolowymi są flawonoidy,
a wśród nich barwniki antocyjanowe. Anomeryczna grupa wodorotlenowa może także
reagować z grupą –NH2 lub -NH i wówczas połączenie następuje poprzez atom azotu
grupy aminowej. Takie połączenie przez mostek azotowy określane jest mianem wiązania
N-glikozydowego (–C–N–C–). Przykładami związków, w których występuje tego typu
wiązanie, są nukleozydy, nukleotydy i kwasy nukleinowe, gdzie cząsteczka pentozy
(D-rybozy lub deoksy-D-rybozy) połączona jest z zasadą azotową za pomocą wiązania
N-glikozydowego.
W przyrodzie występują także takie pochodne monosacharydów jak aminocukry,
w których przy atomie węgla C-2 zamiast grupy hydroksylowej (–OH) znajduje się grupa
aminowa (–NH2) – np. β-D-glukozamina, β-D-galaktozamina lub zostaje w tym miejscu
przyłączony podstawnik z grupą aminową – β-D-acetyloglukozamina,
β-D-acetylogalaktozamina. Pochodne te odgrywają ważną rolę jako składniki glikoprotein,
np. peptydoglikanu bakteryjnego.
Dużą grupę pochodnych węglowodanów tworzą związki, które określane są nazwą
polisacharydów kwaśnych. Są to bardzo złożone związki, zawierające jako podstawowy
składnik budulcowy kwasy uronowe, a w szczególności kwas glukuronowy
i galakturonowy. Ze względu na szczególne właściwości żelujące i wiążące wodę, wiele z
tych związków ma szerokie zastosowanie w technologii żywności oraz w mikrobiologii,
np. pektyny, agar-agar, karageniny i kwas alginowy.
W przemyśle spożywczym ogromne zastosowanie mają szczególnie pektyny.
Podstawowym elementem strukturalnym pektyn jest kwas α-D-galakturonowy.
Poszczególne reszty tego kwasu połączone są ze sobą wiązaniami
α-(1→4)-glikozydowymi, tworząc długie proste łańcuchy kwasu α-poligalakturonowego.
Część grup karboksylowych przy atomie węgla C-6 jest zestryfikowana metanolem.
W zależności od ilości zestryfikowanych grup –COOH, pektyny możemy podzielić na
niskometylowane (<50% grup –COOH zmetylowanych) i wysokometylowane (> 50%
grup –COOH zmetylowanych).

78
6. Właściwości fizyczne i chemiczne węglowodanów
Właściwości chemiczne węglowodanów wynikają przede wszystkim z obecności
dwóch rodzajów grup funkcyjnych, a mianowicie grupy karbonylowej (aldehydowej lub
ketonowej) oraz wielu grup alkoholowych. Najważniejszą właściwością związaną
z obecnością grupy karbonylowej jest zdolność cukrów do tworzenia wiązań
glikozydowych, które są podstawą do formowania oligo- i polisacharydów oraz ważnych
pochodnych cukrów tzw. glikozydów. Zagadnienie to zostało już omówione w punktach
5.2, 5.3 oraz 5.4. Inne ważne właściwości węglowodanów to czynność optyczna, zdolności
redukujące, a także tworzenie pochodnych furfuralowych w reakcji z silnymi kwasami.
Furfurale dają reakcje barwne ze związkami aromatycznymi, co między innymi jest
wykorzystywane podczas identyfikacji i analizy ilościowej cukrów.

6.1. Czynność optyczna i zjawisko mutarotacji

Czynność optyczna, czyli inaczej chiralność związku jest wynikiem asymetrii
cząsteczki i polega na skręcaniu płaszczyzny światła spolaryzowanego o pewien kąt zwany
α. Jak wspomniano przy omawianiu budowy węglowodanów, wszystkie mono-, oligo-
oraz polisacharydy są związkami optycznie czynnymi, ponieważ zawierają jedno lub
więcej centrów asymetrii. W zależności od stężenia wodnego roztworu sacharydu oraz od
grubości warstwy tego roztworu i temperatury otoczenia kąt skręcenia płaszczyzny światła
spolaryzowanego (α) jest różny. Dla każdego rodzaju cukru można wyznaczyć tak zwaną
skręcalność właściwą [α]D, czyli skręcalność roztworu, którego stężenie jest wyrażone
w gramach cukru na 100 cm3 roztworu, co opisuje poniższa zależność:


[ ] D 
lc
gdzie:
[α]D – skręcalność właściwa roztworu cukru
α – kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego
l – grubość warstwy wodnego roztworu cukru [cm]
c – stężenie roztworu cukru w g/100 cm3

Parametr ten ma znaczenie diagnostyczne i jest wykorzystywany do oznaczeń

ilościowych cukrów metodą polarymetryczną. W przypadku niektórych cukrów
obserwowana jest zmiana kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego w miarę
upływu czasu, czyli zmiana wyjściowej skręcalności właściwej. Dotyczy to
monosacharydów oraz oligosacharydów redukujących. Przyczyną tego jest zjawisko
mutarotacji, czyli proces wzajemnego przekształcania się anomerów α i β. Dla

79
poszczególnych form anomerycznych cukrów skręcalność właściwa jest różna i stanowi
ich cechę charakterystyczną. Na przykład [α]D wyznaczona dla 1 M roztworu α-D-glukozy
ma wartość +112o, a dla roztworu β-D-glukozy o takim samym stężeniu +19 o. W miarę
upływu czasu wartości te dla obydwu roztworów zmieniają się spontanicznie, aż do
momentu, w którym skręcalność właściwa w obu przypadkach osiągnie taką samą wartość
końcową +52o. Ustalenie się stałej wartości [α]D świadczy o osiągnięciu w roztworze stanu
równowagi pomiędzy formami anomerycznymi (pierścieniowymi) oraz formą łańcuchową
(ostatecznie niezależnie od sytuacji wyjściowej około 1/3 (38%) cząsteczek stanowią
anomery α-D-glukozy, około 2/3 (62%) cząsteczek to anomery β-D-glukozy, a znacznie
poniżej 1% cząsteczek występuje w formie łańcuchowej).
W przypadku oligosacharydów nieredukujących, które nie podlegają zjawisku
mutarotacji, wartość skręcalności właściwej jest stała i nie ulega zmianom w czasie.
Czynność optyczna polisacharydów, pomimo obecności wielu asymetrycznych atomów
węgla jest nieco słabsza niż mono- i oligosacharydów. Zjawisko mutarotacji też
praktycznie nie zachodzi, ponieważ większość anomerycznych grup wodorotlenowych jest
zablokowana w wiązaniach glikozydowych łączących poszczególne monomery i tylko
końcowe jednostki cukrowe (tzw. terminalne) zawierają zdolne do mutarotacji
anomeryczne atomy węgla z wolnymi glikozydowymi grupami wodorotlenowymi.

6.2. Właściwości redukujące

Występowanie wolnej grupy aldehydowej lub ketonowej w bezpośrednim sąsiedztwie
grup hydroksylowych decyduje o właściwościach redukujących cukrów. Zdolności takie
wykazują wszystkie monosacharydy oraz te oligosacharydy, które posiadają wolną
glikozydową grupę wodorotlenową (np. maltoza, laktoza).
Zdolność do redukowania metali ciężkich, jodu lub pewnych barwników (tzw.
wskaźników redoks) cukry przejawiają w środowisku zasadowym. W podwyższonej
temperaturze odczyn alkaliczny środowiska działa jak katalizator na cykliczne formy
cukrów posiadających wolną anomeryczną grupę wodorotlenową i ulegają one
przekształceniu w formy liniowe. Po procesie decyklizacji cząsteczki następuje kolejne
wewnątrzcząsteczkowe przegrupowanie podstawników – enolizacja, co prowadzi do
powstania tak zwanego endiolu. Formy endiolowe cukrów charakteryzują się silnymi
H O H OH
właściwościami redukującymi. Proces decyklizacji
C i enolizacji na przykładzieCα-D-glukozy
1
CH2na
przedstawiono OHrysunku 20.
H C OH H C2 OH
O
H H
H środowisko HO C H enolizacja HO C H
H zasadowe
HO OH OH H C OH H C OH
H OH H C OH H C OH 80
CH2OH CH2OH
 α-D-glukopiranoza D-glukoza 1,2-endiol

Rys. 20. Proces decyklizacji i enolizacji α-D-glukozy

Formy 1,2-endiolu tworzą się zarówno z aldoz jak i z ketoz. Możliwość tworzenia
przejściowej formy endiolowej tłumaczy, dlaczego niektóre monosacharydy stanowią
formy epimeryczne, o których była mowa w punkcie 4.1. D-glukoza, D-mannoza oraz
D-fruktoza są epimerami wspólnego 1,2-endiolu, który posiada identyczną konfigurację
przy wszystkich atomach węgla od C-3 do C-6. W odczynie zasadowym monosacharydy te
pozostają ze sobą w równowadze właśnie za pośrednictwem formy endiolowej (rys. 21).

H O
C

H C OH

HO C H

H C OH
H OH
H C OH C CH2OH
CH2OH H C OH C O
D-glukoza HO C H
HO C H

H C OH H C OH
H O
C H C OH H C OH
HO C H CH2OH CH2OH
HO C H 1,2 - endiol D-fruktoza
H C OH

H C OH

CH2OH

D-mannoza

Rys. 21. Schemat epimeryzacji cukrów

81
 Powstawaniem formy endiolowej można także wyjaśnić właściwości redukujące
niektórych oligosacharydów. Jeżeli wielocukier posiada wolną anomeryczną grupę
wodorotlenową to istnieje możliwość decyklizacji reszty cukrowej z taką grupą
i utworzenie endiolu o właściwościach redukujących. Dlatego maltoza i laktoza należą do
disacharydów redukujących. Te dwucukry powstają w wyniku utworzenia wiązania
glikozydowego w pozycji (1→4) i posiadają jedną wolną glikozydową grupę
wodorotlenową. Disacharydy, w których obie anomeryczne grupy wodorotlenowe są
zablokowane w wyniku utworzenia wiązania glikozydowego, nie mają możliwości
przekształcenia w formę łańcuchową w środowisku zasadowym, czyli nie mogą ulec
enolizacji i stąd nie wykazują właściwości redukujących. Tego typu dwucukrem jest
sacharoza i dlatego określana jest mianem disacharydu nieredukującego.
W wyniku reakcji cukrów z jonami metali takimi jak Ag +, Bi2+, Cu2+, [Fe(CN)6]3-, czy
też aromatycznymi związkami azotowymi w środowisku zasadowym, cukry jako czynniki
redukujące same ulegają utlenieniu, a wymienione reagenty zostają zredukowane.
Na wykorzystaniu właściwości redukujących opartych jest wiele prób jakościowych jak

i metod ilościowego oznaczania cukrów, a odróżnianie cukrów redukujących od

nieredukujących stanowi jedno z podstawowych badań w analityce węglowodanów.

6.3. Właściwości węglowodanów w środowisku kwaśnym

W środowisku kwaśnym i w podwyższonej temperaturze monosacharydy ulegają
dehydratacji (odwodnieniu), a efektem tego procesu jest powstanie tak zwanych
pochodnych furfuralowych. W wyniku reakcji pentoz z silnymi kwasami (np. HCl, H 2SO4)
jednym z produktów dehydratacji jest furfural, natomiast w przypadku heksoz jest to
5-hydroksymetylofurfural (5-HMF). Wzory tych pochodnych przedstawiono na rys. 22.

pentoza  7,
pH wys.
temp.
  O
C
O H
furfural

heksoza  7,
pH wys.
temp.
 
O
HOH2C O C
H
5-hydroksymetylofurfural (5-HMF)

Rys. 22. Produkty dehydratacji monosacharydów: pentoz – furfural i heksoz – 5

82
hydroksymetylofurfural
Proces dehydratacji cukrów prostych przebiega stopniowo i w międzyczasie powstaje
wiele związków pośrednich. Furfural i 5-hydroksymetylofurfural są produktami
powstałymi w wyniku odłączenia 3 cząsteczek wody. Czasami jednak 5-HMF może ulegać
dalszej degradacji do kwasu lewulinowego i mrówkowego. Generalnie, rodzaj pochodnych
powstających w efekcie dehydratacji cukrów oraz szybkość ich powstawania zależą od
rodzaju poddanego temu procesowi cukru i warunków w jakich ten proces przebiega
(rodzaj i stężenie kwasu, temperatura i czas trwania reakcji).
Istotną właściwością pochodnych furfuralowych jest ich zdolność do kondensowania
z fenolami, chinonami, aminami aromatycznymi i różnymi innymi związkami
organicznymi, czego efektem jest powstanie barwnych produktów reakcji kondensacji.
Ponieważ szybkość tych reakcji i produkty końcowe zależą, jak wspomniano wyżej, od
rodzaju cukru oraz warunków procesu, wykorzystuje się ten fakt do odróżniania pentoz od
heksoz lub aldoz od ketoz. Ponadto reakcje te stosowane są do oznaczania ilościowego
oraz do wykrywania cukrów w materiałach biologicznych (np. pentoz w kwasach
nukleinowych) i rozdzielanych na chromatogramach cienkowarstwowych.

7. Metody wykrywania i ilościowego oznaczania węglowodanów

Analiza węglowodanów oraz ich pochodnych, znajdujących się w produktach
spożywczych, ma na celu:
 zbadanie wartości odżywczej,
 wykrycie zafałszowań,
 ocenę prawidłowości stosowanych procesów technologicznych.
W analityce węglowodanów stosuje się wiele metod, które można podzielić na kilka
grup, w zależności od zasady, na jakiej się one opierają. Są to:
 metody fizyczne,
 metody chemiczne,
 metody enzymatyczne,
 metody chromatograficzne.

7.1. Metody fizyczne

Metody fizyczne oznaczania węglowodanów opierają się na wykorzystaniu takich
właściwości fizycznych cukrów jak: rozpuszczalność w wodzie i tworzenie roztworów
rzeczywistych, charakteryzujących się określoną gęstością, refrakcja światła czy też

83
czynność optyczna. Metody te możemy podzielić na: densytometryczne, refraktometryczne
i polarymetryczne.
Metody densytometryczne opierają się na pomiarze gęstości wodnych roztworów
węglowodanów za pomocą areometru, wagi hydrostatycznej lub piknometru i stąd mogą
być stosowane jedynie do oznaczania cukrów rozpuszczalnych w wodzie. W metodach
tych wykorzystuje się zależność pomiędzy gęstością a stężeniem roztworów cukru
i w przypadku czystych roztworów poszczególnych węglowodanów zostały opracowane
tabele przedstawiające liczbowe wartości takich zależności. W praktyce jednak mamy do
czynienia z mieszaninami cukrów i wyniki uzyskiwane tymi metodami nie są dokładne,
choć stosunkowo nieznacznie zniekształcone, gdyż różnice gęstości najważniejszych
sacharydów występujących w żywności są niewielkie (np. gęstość sacharozy 1,588 g/cm 3,
glukozy 1,560 g/cm3, fruktozy 1,670 g/cm3). W przypadku, gdy w roztworze znajdują się
inne związki rozpuszczalne wynik nie dotyczy jedynie cukrów, ale określa zawartość tak
zwanego ekstraktu ogólnego. Dlatego też metody te są jedynie orientacyjne i można je
określić mianem półilościowych. Stosowane są chętnie ze względu na nieskomplikowaną
technikę pomiarową.
Metody refraktometryczne opierają się na wykorzystaniu zjawiska załamania (refrakcji)
światła przepuszczonego przez wodny roztwór węglowodanów i polegają na pomiarze
współczynnika refrakcji badanego roztworu za pomocą refraktometru. Współczynnik
refrakcji zależy od rodzaju i stężenia rozpuszczonego w wodzie cukru oraz od temperatury
otoczenia, w którym dokonywany jest pomiar. Ze względu na fakt, że produkty
żywnościowe stanowią roztwory wieloskładnikowe, mierzona wartość odnosi się do
refrakcji wypadkowej wszystkich składników rozpuszczalnych, a zatem podobnie jak
w metodach densytometrycznych uzyskany wynik dotyczy zawartości ekstraktu ogólnego,
a nie konkretnego cukru. W związku z tym i te metody mogą być stosowane jedynie do
oznaczeń orientacyjnych i półilościowych.
Metody polarymetryczne wykorzystują zdolność węglowodanów, jako związków
chiralnych, do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo, czyli drgającego
tylko w jednej płaszczyźnie. Jak wiadomo, kąt skręcenia płaszczyzny światła
spolaryzowanego zależy od rodzaju związku chiralnego, jego stężenia i grubości warstwy
roztworu. Do pomiaru skręcalności płaszczyzny światła spolaryzowanego służy
polarymetr. Przyrząd ten składa się ze źródła światła monochromatycznego żółtego (lampy
sodowej), dwóch filtrów: polaryzatora i analizatora, naczynia pomiarowego (szklanej rurki
o ściśle określonej długości, zamykanej z obu stron szkiełkami), okularu i skali do odczytu

84
kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego. Skala może być wycechowana
w stopniach kątowych lub w procentach wagowych określających zawartość cukru.
Pomiary skręcalności optycznej cukrów za pomocą polarymetru stanowią jedną
z podstawowych metod analitycznych w chemii węglowodanów. Na przykład nieznane
cukry można identyfikować przez pomiar ich początkowej skręcalności właściwej [α] D.
Dla większości cukrów wartości [α]D są określone i stabelaryzowane. Ponieważ jednak
różne cukry mogą posiadać zbliżone wartości skręcalności właściwej dla określonych
anomerów, konieczne jest dokonywanie dodatkowych pomiarów skręcalności optycznej,
aż do momentu ustalenia się stanu równowagi w badanym roztworze. Pomiary
polarymetryczne cechują się dużą prostotą, gdyż wymagają jedynie sporządzenia
roztworów o określonych stężeniach, umieszczeniu ich kolejno w naczyniu pomiarowym
i odczytaniu kąta skręcalności ze skali. Ważną rzeczą jest szybkie wykonanie pierwszego
pomiaru dla konkretnego anomeru. Z powodu bardzo wolnego tempa mutarotacji, w celu
przyspieszenia ustalenia się stanu równowagi, dodaje się kroplę zasady zmieniając odczyn
środowiska lub lekko podgrzewa się badany roztwór. Skręcalność właściwą określa się
z zależności, którą przedstawiono w punkcie 5.1.
Metodę polarymetryczną stosuje się także do oznaczeń ilościowych, na przykład do
określania procentowego stężenia sacharozy w burakach cukrowych oraz syropach. Do
obliczenia zawartości sacharozy w badanym roztworze wykorzystuje się przekształcony
wzór na zależność skręcalności właściwej od stężenia roztworu i grubości jego warstwy:

1000  
C
l  [ ]D
gdzie:
C – stężenie cukru, g/cm3
α – mierzony kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego
l – długość rurki polarymetrycznej, cm
[α]D – skręcalność właściwa sacharozy dla określonej długości fali

Należy pamiętać, że roztwór przeznaczony do badań polarymetrycznych musi być

klarowny, bez zawiesin koloidalnych i możliwie bezbarwny. Roztwory nieklarowne muszą
być przed pomiarami sklarowane.

7.2. Metody chemiczne

Szerokie zastosowanie w analizie żywności znalazły metody chemiczne opierające się
na właściwościach redukujących cukrów w środowisku zasadowym. Stosowane są
zarówno do wykrywania, jak i ilościowego oznaczania tych związków.

85
 Istnieje wiele metod wykrywania obecności cukrów redukujących. Wykorzystują one
zdolność tych związków do redukcji jonów metali, czy też barwników aromatycznych.
Najpopularniejszą z tych metod jest próba Fehlinga opierająca się na redukcji jonów
miedzi (Cu2+), pochodzących z siarczanu (VI) miedzi (II) (CuSO4), do jonów miedzi (Cu+),
wytrącających się w postaci czerwonego osadu Cu2O. Reakcja ta zachodzi
w środowisku alkalicznym i w podwyższonej temperaturze.
Przebieg reakcji mających miejsce w próbie Fehlinga można w uproszczony sposób
zilustrować za pomocą schematu:

cukry redukujące pH

7,0
 endiole + Cu2+

OH- + Cu+

CuOH Cu2O ↓
(czerwony osad)

Aby zapobiec wytrącaniu się jonów miedzi (II) w postaci wodorotlenku, w próbie
Fehlinga stosowany jest zasadowy roztwór siarczanu (VI) miedzi (II), zawierający winian
sodowo-potasowy, który tworzy z jonami miedzi (Cu2+) łatwo dysocjujące kompleksy.
Na redukcji jonów miedzi (II) opiera się również próba Benedicta oraz Trommera,
które różnią się od próby Fehlinga jedynie składem stosowanych odczynników.
W próbie Tollensa wykorzystuje się redukcję jonów srebra Ag +, pochodzących
z amoniakalnego roztworu tlenku srebra. Reakcja ta prowadzi do wydzielenia się srebra
metalicznego (tzw. reakcja lustra srebrowego).
Do wykrywania, ale również i ilościowego oznaczania aldoz stosowana jest metoda
heksacyjanożelazianowa. Aldozy w środowisku alkalicznym redukują heksacyjanożelazian
(III) ([Fe(CN)6]3-) do heksacyjanożelazianu (II) ([Fe(CN)6]4-), który następnie tworzy
z jonami żelaza (Fe3+) związek zwany błękitem pruskim. Reakcję tę można przedstawić
w następujący sposób:

3[Fe(CN6)]4- + 4Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3 ↓

błękit pruski

Błękit pruski jest związkiem barwnym, którego powstanie świadczy o obecności aldoz.

86
Intensywność zabarwienia tego związku zależy od ilości zredukowanego
heksacyjanożelazianu (III), a tym samym od ilości cukru, który uczestniczył w tej reakcji.
Cukry mogą także redukować niektóre barwniki, stosowane jako wskaźniki redoks, np.
błękit metylenowy. Związki takie, działając jako przenośniki atomów wodoru pobranych
z cukrów, w wyniku redukcji przechodzą w leukozwiązki (formy bezbarwne) (rys. 23)
i dlatego można je również wykorzystywać do wykrywania obecności cukrów
redukujących.
H
Cl Cl
N N
+ 2H
(CH3)2N S N(CH3)2 - 2H (CH3)2N S N(CH3)2
H

błękit metylenowy leukozwiązek (biel metylenowa)

Rys. 23. Utleniona i zredukowana forma błękitu metylenowego

Na podstawie właściwości redukujących cukrów, a w szczególności na redukcji soli

miedzi (II), opartych jest kilka metod ilościowego oznaczania cukrów. Jedną z nich jest
metoda Fehlinga, która polega na miareczkowym oznaczaniu ilości cukru redukującego
w roztworze, potrzebnej do całkowitej redukcji miedzi zawartej w roztworze odczynników
Fehlinga I i II (zawierających siarczan (VI) miedzi (II) i winian sodowo-potasowy oraz
NaOH) o znanym mianie. Znajdujący się w roztworze winian sodowo-potasowy tworzy
z jonami Cu2+ kompleks o niebieskim zabarwieniu. Koniec miareczkowania wyznacza
moment zaniku barwy niebieskiej. Następnie oblicza się miano odczynników Fehlinga na
podstawie objętości roztworu cukru o znanym stężeniu, która jest potrzebna do całkowitej
redukcji 20 cm3 odczynników Fehlinga I i II. Zmodyfikowaną wersją tej metody jest
powszechnie stosowana metoda Lane-Eynona.
Istnieje także szereg metod pośrednich, w których redukcja jonów miedzi (II) jest tylko
pierwszym etapem oznaczenia. Do takich metod zaliczamy na przykład metodę Luffa-
Schoorla czy Bertranda.
Do wykrywania cukrów i ich wstępnej identyfikacji wykorzystywane są również
reakcje barwne, którym cukry ulegają w środowisku kwaśnym. Podstawą tych reakcji jest
przekształcenie cukrów w ich pochodne furfuralowe w wyniku odwodnienia pod wpływem
silnych kwasów i podwyższonej temperatury, a następnie przeprowadzenie reakcji
kondensacji z odpowiednimi związkami fenolowymi. Jak wiadomo, rodzaj tych

87
pochodnych zależy od warunków reakcji i stąd istnieje możliwość odróżnienia pentoz od
heksoz, czy aldoz od ketoz. Na tych reakcjach oparte są takie próby, jak: Biala,
Seliwanowa oraz Molischa.
Próba Molischa jest próbą ogólną na wykrywanie obecności cukrów, czyli
charakterystyczną dla wszystkich sacharydów i stosuje się ją do wykrywania zarówno
cukrów prostych, jak i złożonych. Polega ona na reakcji powstałych pochodnych
furfuralowych z α-naftolem, w wyniku czego tworzy się niebiesko lub czerwonofioletowo
zabarwiony produkt kondensacji. Pamiętać jednak należy, że reakcja ta nie jest specyficzna
tylko dla cukrów. Dodatni wynik dają również aldehydy, aceton, niektóre kwasy
organiczne (np. mrówkowy, mlekowy) i dlatego wynik należy potwierdzić,
przeprowadzając dodatkowe próby jakościowe.
Próba Biala stosowana jest do wykrywania obecności pentoz, zarówno wolnych jak
i związanych w estrach fosforanowych lub ich pochodnych metylowych (np. służy do
wykrywania rybozy związanej w nukleotydach i kwasach nukleinowych). Odpowiednio
dobrane warunki reakcji sprawiają, że powstający z pentoz furfural reaguje z orcyną i daje
zielono lub niebieskozielono zabarwiony produkt końcowy. Próba ta jest również
wykorzystywana do ilościowego oznaczania pentoz. Intensywność zabarwienia zależy od
ilości powstałego produktu kondensacji, a tym samym od ilości reagującego cukru.
Mierząc spektrofotometrycznie (przy długości fali λ = 665 nm) ilość zaabsorbowanego
światła można oznaczyć zawartość badanych pentoz. Zasada pomiarów
spektrofotometrycznych omówiona została w rozdziale „Wybrane metody…”, punkt 2.
Próba Seliwanowa jest stosowana do odróżniania ketoz od aldoz oraz do ilościowego
oznaczania fruktozy. Pozytywny wynik próby daje fruktoza wolna jak i związana
w sacharozie oraz inulinie. W wyniku odwodnienia cukrów, pod wpływem kwasów
i wysokiej temperatury, powstaje 5-hydroksymetylofurfural (5-HMF). Tworzy się on
zarówno z aldoz, jak i z ketoz, ale w określonych warunkach tworzy się z o wiele większą
wydajnością z ketoz. Jeżeli cukier rozpuści się w 3-krotnie rozcieńczonym kwasie solnym
i ogrzewa krótko (30 sekund) w temp. 100C, wówczas 5-HMF powstaje przede
wszystkim z fruktozy. Glukoza mająca bardziej stabilną strukturę pierścieniową trudniej
ulega odwodnieniu. Przedłużenie czasu ogrzewania i podwyższenie stężenia kwasu
prowadzi jednak do powstania 5-HMF także z glukozy. Powstający 5-HMF w reakcji
kondensacji z rezorcyną daje produkt o wiśniowoczerwonym zabarwieniu. Powstały
kompleks barwny absorbuje światło z maksimum absorpcji przy długości fali λ = 520 nm,
co pozwala na spektrofotometryczne oznaczenie fruktozy.

88
 Do oznaczeń ilościowych cukrów stosowana jest w laboratoriach analitycznych także
metoda antronowa. Pozwala ona na łączne oznaczenie większości cukrów występujących
w badanej próbce. Polega na przeprowadzeniu wszystkich cukrów w pochodne
furfuralowe przez ogrzewanie ze stężonymi kwasami (octowym, siarkowym, solnym).
Najłatwiej odwodnieniu ulegają pentozy, nieco wolniej heksozy. Oligo- i polisacharydy
reagują znacznie wolniej, gdyż reakcja odwodnienia poprzedzona jest procesem hydrolizy
wiązań glikozydowych. Powstałe pochodne (furfural i 5-hydroksymetylofurfural)
kondensują następnie z antronem, tworząc barwne roztwory. Oznaczanie cukrów dokonuje
się metodami spektrofotometrycznymi przy długości fali λ = 620 nm. Metoda ta daje
dokładne wyniki pod warunkiem, że zachowane zostają identyczne parametry pomiarowe
analizowanych roztworów (temperatura, czas wywoływania reakcji, ilość odczynnika).

7.3. Metody enzymatyczne

W analizie węglowodanów wykorzystuje się również metody enzymatyczne. Metody te
odznaczają się wysoką specyficznością, czułością i dokładnością. Szczególnie duże
zastosowanie znalazły metody enzymatycznego oznaczania glukozy w mieszaninach
różnych cukrów. Są one wykorzystywane zarówno do oznaczeń identyfikacyjnych, jak
i ilościowych. Między innymi stosuje się je do oznaczania zawartości glukozy we krwi,
moczu i innych płynach ustrojowych oraz w niektórych produktach spożywczych (np.
w miodach). Do oznaczania glukozy wykorzystywane mogą być takie enzymy jak:
oksydaza glukozowa, dehydrogenaza glukozowa lub zespół enzymów heksokinaza
i dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu w obecności ATP oraz NADP.
Enzym oksydaza glukozowa (oksydoreduktaza β-D-glukoza:O 2), należący do klasy
oksydoreduktaz, katalizuje reakcję utleniania β-D-glukozy w obecności tlenu do
D-glukono-δ-laktonu, będącego bezwodnikiem kwasu glukonowego. Koenzymem
uczestniczącym w reakcji katalizowanej przez oksydazę glukozową jest FAD (dinukleotyd
flawinoadeninowy), który w procesie utleniania glukozy przejmuje atomy wodoru od
cukru redukując się do FADH2. Następnym etapem jest utlenienie zredukowanego
koenzymu ponownie do postaci FAD przez przeniesienie pobranych atomów wodoru na
tlen cząsteczkowy. W wyniku tej reakcji jako drugi produkt końcowy powstaje nadtlenek
wodoru (H2O2). Powstający H2O2 może być następnie rozłożony przez kolejny enzym
peroksydazę w obecności związku będącego donorem (dawcą) atomów wodoru. Jako
donor atomów wodoru stosowany jest bezbarwny związek (tzw. chromogen), który po
odwodorowaniu staje się produktem barwnym. Intensywność zabarwienia tego związku

89
jest zależna od ilości wytworzonego H2O2, a tym samym od ilości utlenionej glukozy. Jako
związki chromogenowe wykorzystywane mogą być di-o-anizydyna, o-toluidyna,
2’,2-azyno-di-(3-etylo-benzotiazolinosulfonian-6)-diamonowy i wiele innych związków.
Do szybkich orientacyjnych, ale i ilościowych oznaczeń glukozy we krwi oraz moczu
stosuje się gotowe, łatwe w użyciu testy w postaci papierowych pasków nasyconych
roztworami enzymów i chromogenu. Odcień barwy powstałej po zanurzeniu testu
w badanej cieczy porównuje się ze skalą barw określającą poziom glukozy. Testy takie
dostępne w handlu są szczególnie przydatne diabetykom.
Oprócz glukozy, metodami enzymatycznymi można oznaczać inne monosacharydy
oraz ich pochodne (np. L-arabinozę, D-ksylozę, D-fruktozę, D-galaktozę, kwas
D-galakturonowy) i niektóre oligosacharydy (np. laktozę, maltozę, sacharozę, stachiozę).
Niektóre firmy (np. Sigma, Boehringer, Megazym) oferują gotowe zestawy
odczynników do enzymatycznego oznaczania cukrów. Wśród gotowych testów są też
takie, które umożliwiają oznaczanie kilku cukrów jednocześnie. Na przykład test firmy
Boehringer o nazwie UV-test D-Glucose/D-Fructose pozwala na oznaczenie ilościowe
glukozy i fruktozy. Oznaczenie to polega na przeprowadzeniu kilku reakcji
enzymatycznych. W pierwszej kolejności glukoza i fruktoza poddawane są fosforylacji
przy pH 7,6, katalizowanej przez enzym heksokinazę w obecności ATP, i przekształcają
się w pochodne 6-fosforanowe (glukozo-6-fosforan i fruktozo-6-fosforan). W obecności
dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej pochodna glukozy utleniana jest do 6-
fosforanowej pochodnej kwasu glukonowego z równoczesną redukcją koenzymu NADP +
do NADPH + H+. Ilość wytworzonego zredukowanego koenzymu NADPH + H +
odpowiada ilości D-glukozy i oznaczana jest spektrofotometrycznie na podstawie
absorbancji mierzonej przy długości fali λ = 340 nm. Kolejnym etapem jest
przekształcenie fruktozo-6-fosforanu do glukozo-6-fosforanu pod wpływem działania
izomerazy glukozo-6-fosforanowej. Nowo powstały glukozo-6-fosforan ponownie jest
utleniany w obecności NADP+ do glukoniano-6-fosforanu. Ilość wytworzonego NADPH
+ H+ w tej reakcji odpowiada ilości D-fruktozy. Metoda ta znalazła zastosowanie, m. in. do
oznaczania fruktozy i glukozy, głównych monosacharydów występujących w miodach.

7.4. Metody chromatograficzne

Metody chromatograficzne wykorzystywane są do identyfikacji węglowodanów,
badania składu mieszanin oraz do oznaczeń ilościowych. Najczęściej stosowane metody
to: chromatografia cienkowarstwowa (TLC), gazowa (GC) i wysokosprawna

90
chromatografia cieczowa (HPLC).
Do wykrywania i identyfikacji cukrów najczęściej wykorzystywana jest metoda
chromatografii cienkowarstwowej omówiona w rozdziale „Wybrane metody…”, punkt
3.1.1. Rozdział cukrów prowadzi się najczęściej na polarnych nośnikach z żelu
krzemionkowego lub celulozy. Zatem o możliwości rozdzielenia cukrów na tego rodzaju
adsorbentach decyduje hydrofilowy charakter tych związków (duża liczba grup –OH).
W przypadku żelu krzemionkowego mamy do czynienia z chromatografią adsorpcyjną,
a w przypadku celulozy – z klasyczną chromatografią podziałową. Rozdział cukrów na
żelu krzemionkowym uzależniony jest od zdolności adsorbowania się ich cząsteczek na
powierzchni nośnika, a to związane jest z ich polarnością. Wielkość adsorpcji rośnie wraz
ze wzrostem liczby polarnych grup funkcyjnych. Im jest tych grup więcej, tym bardziej
zwiększa się powinowactwo adsorpcyjne. Dlatego o szybkości migracji cząsteczek cukrów
w fazie ruchomej decyduje wielkość cząsteczki i zawartość grup –OH, ale pewien wpływ
mają także: rodzaj formy izomerycznej, cyklicznej i konformacyjnej. Generalnie można
jednak przyjąć, że prędkość migracji maleje w następujący sposób: pentozy → heksozy →
disacharydy → trisacharydy, itd. O rozdziale cukrów na złożach celulozowych decyduje
współczynnik podziału (k), a zatem stopień powinowactwa składników rozdzielanych do
fazy stacjonarnej lub ruchomej (eluentu). Cząsteczki cukrów wykazujące większe
powinowactwo do fazy stacjonarnej (o większych współczynnikach podziału k) poruszają
się wolniej niż te, które mają większe powinowactwo do fazy ruchomej (o mniejszych
współczynnikach podziału k). Fazę stacjonarną stanowi najczęściej woda. Jako fazy
ruchomej używa się dwu- lub wieloskładnikowe mieszaniny polarnych rozpuszczalników
organicznych. W skład tych mieszanin mogą wchodzić między innymi: propanol-2, aceton,
butanol-1 i butanol-2, keton metylo-etylowy, octan etylu, pirydyna, metanol, kwas octowy.
O zdolności rozdzielczej przygotowanej wieloskładnikowej fazy ruchomej decyduje
stosunek głównego rozpuszczalnika do wody. W literaturze można znaleźć wiele
propozycji dotyczących składu różnych faz ruchomych. O wyborze fazy ruchomej
decyduje w pewnym stopniu rodzaj stosowanego adsorbentu. Generalnie można
powiedzieć, że przy odpowiednim doborze fazy ruchomej możliwe jest rozdzielenie mono,
di- i wyższych oligosacharydów oraz pentoz, heksoz, aminocukrów, kwasów uronowych
i alkoholowych pochodnych cukrów.
W celu rozdzielenia cukrów, przygotowany do badania roztwór oraz roztwór cukrów
wzorcowych nanosi się mikropipetą na zaznaczoną na płytce linię startu. Próbkę nanosi się
w postaci małych kropli (średnica plamki do 2 mm), w objętości 5 μl. Następnie umieszcza

91
się płytkę w komorze chromatograficznej. Mogą być stosowane komory pionowe lub
poziome. Zastosowanie tych drugich skraca czas elucji oraz pozwala na stosowanie
mniejszych objętości fazy ruchomej. Chromatogramy cienkowarstwowe rozwija się jedno-
lub dwukierunkowo, a dokładność rozdziału zależy od ilości poszczególnych cukrów
nanoszonych na płytkę. W zasadzie nie powinna ona przekraczać 5 μg (przy większych
stężeniach plamy niektórych cukrów mogą się zlewać).
Po rozwinięciu chromatogramu suszy się go w strumieniu ciepłego powietrza,
a następnie wywołuje. W tym celu wykorzystuje się najczęściej właściwości redukujące
cukrów i reakcje barwne pochodnych furfuralowych w środowisku kwaśnym. Do
wywoływania, czyli wizualizacji chromatogramów stosuje się różne mieszaniny, których
skład można znaleźć w literaturze (np. naftorezorcyna – kwas siarkowy, w skrócie NR,
difenyloamina – anilina – kwas fosforowy, w skrócie DAP). Barwa plam jest zależna od
warunków wywoływania, a zwłaszcza od dokładnego odparowania rozpuszczalników
z płytki, stężenia kwasu w odczynniku, temperatury i czasu wywoływania.
Rozdzielone cukry identyfikuje się na podstawie barwy plam oraz obliczania wartości
tzw. współczynnika opóźnienia Rf (ang. retardation factor) i porównania jej z wartością R f
cukrów wzorcowych. Współczynnik Rf oblicza się na podstawie wzoru, który został
podany w rozdziale „Wybrane metody…”, punkt 3.1.2.
Metodę chromatografii cienkowarstwowej można również stosować w analizie
ilościowej węglowodanów. Pomiary ilościowe rozdzielonych sacharydów przeprowadza
się mierząc intensywność zabarwienia plam bezpośrednio na płytce przy użyciu
densytometru lub roztworów uzyskanych po wyeluowaniu z nośnika.
W analizie jakościowej i ilościowej cukrowców z powodzeniem stosowana jest także
chromatografia gazowa („Wybrane metody…”, 3.1.3). Ze względu na fakt, że
chromatografia gazowa służy do analizy związków lotnych, cukry jako nielotne muszą być
poddane procesowi derywatyzacji, czyli przekształceniu w odpowiednie pochodne
o zwiększonej lotności. Proces ten polega na podstawieniu wodoru w polarnych grupach
–OH cukrów rodnikami organicznymi, a najczęściej grupą trimetylosililową –Si(CH 3)3.
Przygotowaną próbkę wprowadza się strzykawką do dozownika chromatografu gazowego,
dozującego ją następnie na kolumnę, w której następuje rozdzielenie składników.
O rozdziale składników cukrowych decydują różnice w lotności poszczególnych
pochodnych trimetylosililowych. Po przejściu rozdzielonych składników przez kolumnę
trafiają one do detektora, generując w nim sygnał elektryczny przekazywany do
rejestratora. Wynik analizy rejestrowany jest w postaci pików na wykresie. Współczesne

92
chromatografy gazowe są urządzeniami sterowanymi komputerowo, stąd możliwe jest
szybkie opracowanie wyników. Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików
odpowiadających poszczególnym cukrom przez porównanie ich czasów retencji z czasami
retencji cukrów wzorcowych. Ilościową zawartość badanych węglowodanów oblicza się
wykorzystując fakt, że powierzchnia lub wysokość piku jest proporcjonalna do ilości
danego cukru w próbce. Do obliczeń wykorzystuje się porównanie wysokości lub
powierzchni piku badanego z wysokością lub powierzchnią piku cukru wzorcowego.
Korzysta się przy tym z procedur opartych na metodzie wzorca wewnętrznego lub
kalibracji bezwzględnej, zwanej także metodą wzorca zewnętrznego.
Dzięki zainstalowaniu tak zwanego autosamplera możliwe jest też automatyczne
działanie przyrządu, polegające na samoczynnym pobieraniu i dozowaniu próbek oraz
gromadzeniu wyników analizy w pamięci komputera.
Bardzo dobre rozdziały cukrów uzyskuje się za pomocą wysokosprawnej
chromatografii cieczowej („Wybrane metody…”, 3.1.3). Metoda ta jest stosowana
zarówno do identyfikacji węglowodanów, jak i w analizie ilościowej. Fazę stacjonarną
najczęściej stanowi żywica jonowymienna o bardzo małych cząstkach (3-10 μm) lub
porowaty polimer (np. żel silikonowy z funkcyjnymi grupami aminowymi). W zależności
od rodzaju wypełnienia kolumny stosowane są różne fazy ruchome (np. acetonitryl:woda,
woda:octan etylu:2-propanol, dichlorometan, woda). Typ wypełnienia kolumny decyduje
też o szybkości przepływu fazy ruchomej podczas analizy. Rodzaj fazy ruchomej oraz
szybkość przepływu przez kolumnę podawane są przez producenta kolumny. Elucję można
prowadzić w temperaturze otoczenia lub w podwyższonej i wówczas kolumna musi być
podgrzewana. Rozdział cukrów może następować na zasadzie różnic współczynników
podziału (chromatografia podziałowa), adsorpcji (chromatografia adsorpcyjna), sączenia
molekularnego (chromatografia żelowa), bądź wymiany jonów (chromatografia
jonowymienna). Wszystkie te metody są scharakteryzowane w rozdziale „Wybrane
metody…”, punkt 3.1.2. Detekcja najczęściej odbywa się dzięki zastosowaniu detektora
refraktometrycznego i polega na ciągłym pomiarze różnicy współczynników refrakcji
pomiędzy fazą ruchomą, a rozdzielanymi węglowodanami. Na skuteczność rozdziału
cukrów wpływa właściwy dobór faz (stacjonarnej i ruchomej) oraz temperatura. Wyniki
analizy, tak jak w chromatografii gazowej, rejestrowane są w postaci pików tworzących
wykres elucji.
Chromatografy do HPLC, tak jak chromatografy gazowe, są sterowane komputerowo,
więc opracowanie wyników następuje w sposób szybki i dokładny. Analiza jakościowa

93
i ilościowa dokonywana jest w oparciu o te same zasady, co w chromatografii gazowej.
Metoda HPLC odznacza się dużą precyzją, łatwością i szybkością wykonywania analizy
(kilka do kilkudziesięciu minut). Ważną rzeczą jest też proste przygotowanie próbek do
badania. W przypadku wyciągów lub soków roślinnych próbki można nanosić na kolumnę
bez specjalnej obróbki wstępnej, pamiętać należy jedynie o tym, aby próbki były klarowne.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa znalazła zastosowanie w przemyśle
spożywczym, na przykład do badania składu cukrów w hydrolizatach skrobiowych, do
oznaczania glukozy, fruktozy, sacharozy i laktozy w czekoladach, a także do oznaczania
składu cukrowego miodów.

8. Zagadnienia
1. Podział węglowodanów, charakterystyka poszczególnych grup, przykłady.
2. Budowa cukrów prostych. Formy w jakich występują. Izomery. Mutarotacja cukrów.
Reakcje charakterystyczne.
3. Struktura disacharydów, tworzenie wiązań glikozydowych, dwucukry redukujące
i nieredukujące.
4. Reakcje i pochodne cukrów w środowisku kwaśnym i zasadowym. Zastosowanie
analityczne.
5. Zasada rozdziału cukrów metodą chromatografii cienkowarstwowej.

9. Część eksperymentalna
9.1. Wykrywanie węglowodanów z wykorzystaniem ich właściwości redukujących

94
9.1.1. Próba Fehlinga

Zasada oznaczenia
Węglowodany redukujące po przekształceniu w formę endiolową (w środowisku
zasadowym) oddają elektrony jonom miedzi (Cu2+) redukując je do jonów miedzi (Cu+),
a same ulegają utlenieniu. Jony miedzi (Cu +) łącząc się z jonami wodorotlenowymi tworzą
żółtozielony wodorotlenek miedzi (I), który w podwyższonej temperaturze przechodzi
natychmiast w tlenek miedzi (I), wytrącający się w postaci czerwonego osadu (Cu2O↓).

Wykonanie
Do probówki wlać po 1 cm3 roztworów Fehlinga I i II, dokładnie wymieszać,
a następnie dodać 1 cm3 próby badanej i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Obserwować
zabarwienie roztworu i dno probówki.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z dowolnym roztworem cukru wzorcowego.

Interpretacja wyniku
Wytrącenie się czerwonego osadu Cu2O stanowi wynik dodatni próby, świadczący
o obecności cukru redukującego. Ilość produktu jest uzależniona od stężenia sacharydów
redukujących w badanym roztworze. W przypadku rozcieńczonych roztworów
węglowodanów wytrącanie się osadu Cu2O jest opóźnione, a roztwór zachowuje pierwotną
barwę niebieską. Jeżeli roztwór cukru jest zbyt stężony redukcja jonów miedzi (II)
następuje bardzo szybko i zabarwienie roztworu Fehlinga zmienia się z niebieskiego do
żółtopomarańczowego lub żółtozielonego.

Odczynniki
1) roztwór Fehlinga I – 68,28 g CuSO45H2O rozpuszczone w wodzie destylowanej, w kolbie miarowej
o pojemności 1 dm3 (dla utrwalenia dodaje się 1 cm3 kwasu siarkowego),
2) roztwór Fehlinga II – 346 g winianu sodowo-potasowego rozpuszczone w wodzie destylowanej, osobno
rozpuszczone 300 g NaOH w 250 cm3 wody destylowanej, oba roztwory zmieszane i uzupełnione
w kolbie miarowej do objętości 1 dm3,
3) 2% roztwory cukrów wzorcowych: glukozy i sacharozy,
4) próba badana.
9.1.2. Redukcja błękitu metylenowego

95
Zasada oznaczenia
Błękit metylenowy, należący do grupy tzw. wskaźników redoksowych, pod wpływem
cukrów redukujących ulega w środowisku zasadowym redukcji i przechodzi w formę
bezbarwną – biel metylenową. Forma ta bardzo łatwo oddaje przyłączone wodory innemu
akceptorowi, np. tlenowi powietrza i dlatego powraca pierwotne zabarwienie tego
związku.

Wykonanie
Do probówki wlać 3-5 kropli próby badanej, kroplę 1% wodnego roztworu błękitu
metylenowego i 4-5 kropli 5% roztworu NaOH. Probówkę umieścić we wrzącej łaźni
wodnej. Obserwować zabarwienie badanej próbki.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworem cukru wzorcowego.

Interpretacja wyniku
Zanik niebieskiego zabarwienia po ogrzaniu zawartości probówki świadczy o redukcji
błękitu metylenowego, a tym samym o obecności cukru redukującego. Wstrząśnięcie
bezbarwnego roztworu po jego ostygnięciu powinno spowodować przywrócenie
niebieskiej barwy w wyniku utlenienia leukozwiązku do błękitu metylenowego tlenem
z powietrza.

Odczynniki
1) 1% wodny roztwór błękitu metylenowego,
2) 5% roztwór NaOH,
3) 0,2% roztwór cukru wzorcowego: glukozy,
4) próba badana.

9.1.3. Próba Barfoeda

Zasada oznaczenia
Próba ta służy do odróżniania monosacharydów od disacharydów redukujących.
Podstawą do udziału sacharydów w reakcjach redoks jest ich enolizacja, której ulegają
jedynie formy liniowe węglowodanów, a szybkość tworzenia się endioli zależy od odczynu
środowiska oraz temperatury roztworu. Reakcje enolizacji i wzajemnych przekształceń
cukrów redukujących zachodzą szybko w środowisku zasadowym. Natomiast

96
w środowisku lekko kwaśnym lub obojętnym (pH 3-7) oraz w temperaturze pokojowej
ustala się jedynie równowaga między formami anomerycznymi (pierścieniowymi)
monosacharydu a formą liniową. Ilość formy liniowej w tych warunkach zależy przede
wszystkim od trwałości struktur cyklicznych. Jednak w podwyższonych temperaturach
monosacharydy ulegają enolizacji nawet w środowisku obojętnym lub lekko kwaśnym
i wykazują właściwości redukujące szybciej (redukcja jonów Cu 2+ po ok. 3 min.) aniżeli
redukujące disacharydy, których pierścienie mające wolną anomeryczną grupę
wodorotlenową są prawdopodobnie trwalsze i ich enolizacja zachodzi znacznie wolniej
(redukcja jonów Cu2+ po kilkunastu do 20 min). Dlatego też stosowany w tej reakcji
odczynnik Barfoeda to roztwór octanu miedzi (II) o odczynie lekko kwaśnym (pH ok. 5)
i w warunkach próby monosacharydy redukują jony miedzi (Cu2+) uwolnione z octanu,
natomiast disacharydy redukujące zdolności tej nie wykazują.

Wykonanie
Do probówki odmierzyć po ok. 3 cm3 odczynnika Barfoeda oraz 1 cm3 próby badanej.
Następnie wstawić probówkę do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez
3 minuty, po czym schłodzić w strumieniu zimnej wody. Obserwować zabarwienie
roztworu oraz dno probówki.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworami sacharydów wzorcowych.

Interpretacja wyniku
Pojawienie się na dnie probówki czerwonego osadu Cu2O świadczy o obecności
monosacharydu. W przypadku disacharydu redukującego (np. maltozy) osad wytrąca się
dopiero po 15-20 minutach ogrzewania.

Odczynniki
1) odczynnik Barfoeda – 13,3 g octanu miedzi (II) (Cu(CH3COO)22H2O) rozpuszczonego w 200 cm3 wody
destylowanej z dodatkiem 1,8 cm3 lodowatego kwasu octowego,
2) 1% roztwory cukrów wzorcowych: glukozy i maltozy,
3) próba badana.

9.2. Metody oparte na reakcjach barwnych w środowisku kwaśnym

9.2.1. Próba Molischa

97
Zasada oznaczenia
Pochodne pentoz, metylopentoz i heksoz, powstające w wyniku odwodnienia pod
wpływem stężonego H2SO4 i podwyższonej temperatury, mianowicie: furfural,
metylofurfural i hydroksymetylofurfural, dają w reakcji kondensacji z α-naftolem produkty
o barwie niebieskiej lub czerwonofioletowej.

Wykonanie
Do probówki wlać 2 cm3 próby badanej i dodać 2 krople roztworu α-naftolu. Po
dokładnym wymieszaniu roztwór podwarstwić 2 cm3 stężonego H2SO4, wlewając go
ostrożnie po ściance nachylonej probówki. Odstawić probówkę do statywu i obserwować
wynik.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworem cukru wzorcowego.

Interpretacja wyniku
Wynik dodatni stanowi pojawienie się na granicy warstw czerwonofioletowego
pierścienia, który świadczy o ewentualnej obecności sacharydu w próbie. Pojawienie się
w próbie dodatkowego zielonego pierścienia świadczy o zanieczyszczeniu α-naftolu.

Odczynniki
1) 5% alkoholowy roztwór α-naftolu,
2) stężony H2SO4,
3) 1% roztwór cukru wzorcowego: glukozy,
4) próba badana.

9.2.2. Próba Biala

Zasada oznaczenia
W wyniku odwodnienia pentoz, w środowisku kwaśnym i w podwyższonej
temperaturze, powstaje z nich furfural, który kondensuje w obecności soli żelaza (III)
z orcyną, tworząc związek o zielonym lub niebieskozielonym zabarwieniu.

Wykonanie
2 cm3 2% roztworu orcyny wlać do probówki, dodać kroplę 1% roztworu FeCl 3

98
i 0,5 cm3 próby badanej. Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez ok.
5 minut. Obserwować barwę roztworu.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworem cukru wzorcowego.

Interpretacja wyniku
Dodatni wynik reakcji stanowi pojawienie się zielonego (zielononiebieskiego)
zabarwienia, które świadczy o obecności pentozy.

Odczynniki
1) 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl,
2) 1% roztwór FeCl3,
3) 2% roztwór cukru wzorcowego: pentozy,
4) próba badana.

9.2.3. Próba Seliwanowa

Zasada oznaczenia
W warunkach oznaczenia, czyli przy zastosowaniu 3-krotnie rozcieńczonego kwasu
solnego i krótkiego czasu ogrzewania (30 sekund) w temp. 100C,
5-hydroksymetylofurfural powstaje przede wszystkim z fruktozy. Utworzony 5-HMF
poddany reakcji kondensacji z rezorcyną daje produkt o wiśniowoczerwonym zabarwieniu.

Wykonanie
Do probówki wlać 1 cm3 próby badanej, dodać 0,5 cm3 stężonego HCl i wrzucić
kryształek rezorcyny. Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Ogrzewać próbę
30 sekund i obserwować zabarwienie.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworami cukrów wzorcowych.

Interpretacja wyniku
Wynikiem pozytywnym reakcji jest pojawienie się wiśniowoczerwonej barwy, która
świadczy o obecności fruktozy. Przy większych ilościach tego cukru zabarwienie
przechodzi w brunatne i wytrąca się osad, który po rozpuszczeniu w alkoholu amylowym
daje roztwór o barwie czerwonej.

99
 Glukoza w tych warunkach daje lekko różowe zabarwienie.

Odczynniki
1) stężony HCl,
2) krystaliczna rezorcyna,
3) 2% roztwory cukrów wzorcowych: fruktozy i glukozy,
4) próba badana.

9.3. Wykrywanie glukozy przy użyciu oksydazy glukozowej

Zasada oznaczenia
Metoda ta stosowana jest zarówno do wykrywania obecności glukozy jak i w analizie
ilościowej. Opiera się ona na kilku reakcjach, z czego pierwszą jest utlenianie β-D-glukozy
do D-glukono-δ-laktonu, katalizowane przez oksydazę glukozową (oksydoreduktaza β-D-
glukoza:O2) w obecności tlenu. Drugim produktem końcowym tego utleniania jest H 2O2,
który następnie rozkładany jest przez kolejny enzym peroksydazę w obecności di-o-
anizydyny, związku będącego donorem wodoru (tzw. chromogenu). Donor wodoru (di-o-
anizydyna) po odwodornieniu przechodzi w formę o zabarwieniu żółtopomarańczowym.
Intensywność barwy zależy od ilości rozłożonego H 2O2, a tym samym od ilości utlenionej
glukozy.

Wykonanie
Do probówki odmierzyć 3,3 cm3 próby badanej, a następnie kolejno 0,1 cm3 roztworu
di-o-anizydyny, 0,1 cm3 roztworu peroksydazy i 0,1 cm3 roztworu oksydazy glukozowej.
Probówkę wstawić do statywu i po 15 minutach przerwać reakcję przez dodanie 1 kropli
stężonego HCl. Obserwować zabarwienie mieszaniny reakcyjnej.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworem cukru wzorcowego (glukozy).

Interpretacja wyniku
Pojawienie się żółtego (żółtopomarańczowego) zabarwienia w wyniku utlenienia
di-o-anizydyny świadczy o obecności glukozy i jej utlenieniu przez oksydazę glukozową.

Odczynniki
1) bufor fosforanowy o pH 6,0,
2) ok. 0,3 M roztwór glukozy,

100
3) roztwór peroksydazy,
4) alkoholowy roztwór di-o-anizydyny,
5) roztwór oksydazy glukozowej,
6) stężony HCl,
7) roztwór wzorcowy glukozy,
8) próba badana.

9.4. Wykrywanie skrobi

Zasada oznaczenia
Do wykrywania obecności skrobi wykorzystuje się charakterystyczną reakcję z jodem,
która jest bardzo czuła. Intensywne zabarwienie powstaje nawet, gdy w badanej próbie
znajdują się bardzo małe ilości tego polisacharydu. W wyniku wprowadzenia cząsteczek
jodu do środowiska, w którym znajdują się zwinięte spiralnie łańcuchy amylozy oraz
boczne łańcuchy amylopektyny, następuje kompleksowanie cząsteczek jodu w skrętach
helis amylozy i amylopektyny, czego efektem jest powstanie niebieskofioletowej barwy.
Trzeba pamiętać, że reakcja ta nie zachodzi w środowisku zasadowym, ponieważ jod
reaguje z zasadą i nie powstaje barwny kompleks ze skrobią.

Wykonanie
Do probówki wlać 2 cm3 próby badanej i dodać 1-2 krople roztworu jodu (płynu
Lugola). Powinna pojawić się niebieskofioletowa barwa. Następnie probówkę z próbą
należy ogrzać i obserwować zabarwienie. Jeżeli barwa zniknie, probówkę należy ostudzić
pod bieżącą wodą. Efektem schłodzenia próby powinno być ponowne pojawienie się
niebieskofioletowej barwy.
W razie wątpliwości przy interpretacji wyniku przeprowadzić analogiczną próbę
z roztworem wzorcowym skrobi.

Interpretacja wyniku
Wynik dodatni stanowi pojawienie się niebieskofioletowego zabarwienia w rezultacie
powstania kompleksów jodu ze skrobią. Wysoka temperatura powoduje zanik zabarwienia
z powodu rozwijania się spiralnie skręconych łańcuchów amylozy i amylopektyny.
Obniżenie temperatury umożliwia ponowne zwinięcie się łańcuchów w helisy i utworzenie
barwnych kompleksów z jodem.

101
Odczynniki
1) 0,01 N roztwór J2 w KJ (płyn Lugola),
2) roztwór wzorcowy: 0,1% roztwór skrobi o odczynie obojętnym lub lekko kwaśnym,
3) próba badana.

9.5. Rozdział mono- i disacharydów metodą chromatografii cienkowarstwowej

na żelu krzemionkowym

Wykonanie
Nanoszenie roztworów na płytkę chromatograficzną
W odległości 2-2,5 cm od brzegu płytki należy zaznaczyć ołówkiem na linii startu
punkty, w których będą nanoszone roztwory: mieszanina cukrów wzorcowych (MW)
i próba badana. Odległość między punktami powinna wynosić 1-2 cm. W jednym
z zaznaczonych punktów nanosi się 5 μl roztworu mieszaniny cukrów wzorcowych,
a w drugim 5 l próby badanej. Roztwory te nanosi się w postaci małych kropel (średnica
plamki do 2 mm), a każdą z nich przed naniesieniem następnej suszy w strumieniu
ciepłego powietrza. Mikropipetę przed rozpoczęciem nanoszenia i przed pobraniem
kolejnego roztworu należy dokładnie przemyć wodą, izopropanolem i wysuszyć. Po
naniesieniu roztworów zaznacza się ołówkiem symbole prób w górnej części płytki.

Rozwijanie chromatogramu
Komorę chromatograficzną napełnia się jedną z podanych mieszanin rozwijających.
Aby cukry nie uległy wymyciu, powierzchnia cieczy na dnie komory powinna się
znajdować poniżej linii startu na płytkach chromatograficznych. Płytkę wstawia się
pionowo i rozwija techniką wstępującą. Po dojściu układu rozwijającego do wysokości
12-15 cm od linii startu płytkę wyjmuje się, zaznacza linię frontu i suszy w strumieniu
ciepłego powietrza.

Wywoływanie chromatogramu
Wysuszoną płytkę spryskuje się mieszaniną wywołującą – roztworem difenyloaminy
i aniliny (DAP). Spryskany chromatogram ogrzewa się w temperaturze 100C przez
5-10 minut. Na płytce ukazują się charakterystycznie zabarwione plamki.
Interpretacja wyniku
Po wywołaniu plam oblicza się wartości Rf cukrów wzorcowych oraz cukru z próby
badanej (rozdział „Wybrane metody…”, punkt 3.1.2).

102
 Kolejność rozdziału przykładowych cukrów wzorcowych według odległości od linii
startu: laktoza, sacharoza, fruktoza, glukoza, pentoza.

Odczynniki
1) płytki chromatograficzne pokryte warstwą żelu krzemionkowego,
2) roztwór mieszaniny cukrów wzorcowych,
3) układy rozwijające: układ I – keton metyloetylowy-kwas octowy-metanol w stosunku 3:1:1 lub układ II –
n-butanol-izopropanol-woda-kwas octowy lodowaty w stosunku 30:50:10:2,
4) mieszanina wywołująca: difenyloamina-anilina-kwas fosforowy zmieszane w stosunku 5:5:1 (tzw. DAP),
5) próba badana.

Zadania do wykonania
1. W otrzymanych do badania roztworach przeprowadzić następujące reakcje jakościowe:
a) próbę Fehlinga; b) redukcję błękitu metylenowego; c) próbę Barfoeda; d) próbę
Molischa; e) próbę Biala; f) próbę Seliwanowa.
Na podstawie wyników przeprowadzonych prób określić czy:
─ w badanym roztworze znajdowały się cukry,
─ były to cukry redukujące lub nieredukujące,
─ były to pentozy, czy heksozy,
─ były to aldozy, czy ketozy.
2. Na podstawie badania enzymatycznego stwierdzić, czy aldoza w badanym roztworze
jest glukozą.
W ocenie wyników tych badań oraz wnioskowaniu może być pomocny schemat
zamieszczony na rysunku 24.
3. Przeprowadzić rozdział mono- i disacharydów metodą chromatografii
cienkowarstwowej. Na podstawie barwy plamy i obliczonej wartości współczynnika Rf
zidentyfikować cukier w roztworze badanym.

wynik ujemny - nie ma cukru

Próba Molischa
wynik dodatni - obecność cukru

103
 wynik ujemny - cukier nieredukujący
Próba Fehlinga
wynik dodatni - cukier redukujący

wynik ujemny - dwucukier redukujący

Próba Barfoeda
wynik dodatni - cukier prosty

Próba Seliwanowa Próba Biala

wynik ujemny wynik dodatni wynik ujemny wynik dodatni

aldoza ketoza heksoza pentoza

Potwierdzenie obecności glukozy metodą enzymatyczną

Rys. 24. Schemat wykrywania i identyfikacji węglowodanów przy pomocy prób

jakościowych. Ostatni etap identyfikacji zaznaczono linia przerywaną.

104
 LIPIDY

1. Wprowadzenie
Lipidy to heterogenna grupa związków, zróżnicowana pod względem składu
chemicznego, struktury i funkcji. Obok białek i węglowodanów należą do głównych
składników pokarmowych człowieka. Zazwyczaj są to estry kwasów tłuszczowych i jedno-
lub wielowodorotlenowych alkoholi. Niektóre lipidy są amidami wyższych kwasów
tłuszczowych z aminoalkoholami. Charakterystyczną cechą lipidów jest brak
rozpuszczalności w wodzie, co wynika z ich niepolarnej, hydrofobowej struktury.
Rozpuszczają się natomiast w rozpuszczalnikach organicznych takich jak eter naftowy,
chloroform, benzen, aceton itp.
Lipidy właściwe stanowią najbardziej skoncentrowane źródło energii. Utlenienie 1 g
tłuszczu uwalania około 38 kJ, co jest dwukrotnie większą ilością, niż uzyskuje się
z węglowodanów. W diecie osoby dorosłej lipidy pokrywają około 25-35%
zapotrzebowania na energię. Znaczna część lipidów stanowi materiał zapasowy,
gromadzony w tkankach roślin i zwierząt. W wyniku utlenienia stają się one źródłem
energii oraz metabolitów niezbędnych do syntezy wielu różnych związków. Rośliny
gromadzą tłuszcze przede wszystkim w nasionach i owocach. Ich ilość jest jednak
mniejsza niż u zwierząt, np. nasiona rzepaku zawierają do 48% lipidów, słonecznika do
45%, a soi do 25%. W organizmach zwierząt lipidy znajdują się w tkance tłuszczowej,
która może zawierać nawet do 80% tłuszczów. Lipidy zgromadzone
w tkance tłuszczowej stanowią przede wszystkim rezerwuar energii. Dla porównania,
tłuszcz zawarty we krwi pokrywa zapotrzebowanie energetyczne organizmu przez 10
minut, natomiast tłuszcz zapasowy może wystarczyć na 2 miesiące. Tkanka tłuszczowa
pełni również inne ważne funkcje, m.in. stanowi warstwę izolacyjną, ułatwiając regulację
ciepła w organizmie. Fizjologiczna rola tłuszczów polega również na ochronie narządów
przed urazami poprzez otaczanie ich tzw. tłuszczem okołonarządowym. Z kolei
w przewodzie pokarmowym tłuszcz chroni błonę śluzową przed nadmiarem soku
żołądkowego.
Obok funkcji energetycznej lipidy pełnią także rolę strukturalną. Dotyczy to przede
wszystkim lipidów złożonych, które występują w komórkach wszystkich organizmów.
Szczególne znaczenie mają pod tym względem fosfolipidy, związki
o charakterze amfipatycznym, które razem z białkami tworzą strukturę

105
półprzepuszczalnych błon komórkowych i cytoplazmatycznych. Lipidy wchodzą
w skład lipoprotein, będących ważnym składnikiem osocza krwi i uczestniczących
w transporcie różnych związków, takich jak witaminy A, D, E i K ułatwiając przy tym ich
wchłanianie. Ponadto stanowią dla organizmu źródło NNKT – niezbędnych nienasyconych
kwasów tłuszczowych, które są substratem do syntezy eikozanoidów
– hormonów tkankowych, prostaglandyn, tromboksanów i innych związków.
Ważną funkcją lipidów jest również dostarczanie organizmowi wody, co wynika
z faktu, iż podczas ich rozpadu powstaje niemal dwukrotnie więcej wody niż przy
utlenianiu węglowodanów. Woda ta jest następnie wykorzystana przez organizm.
Obecność tłuszczu w pożywieniu zwiększa jego walory smakowe, a zarazem wpływa
na trawienie i wchłanianie składników odżywczych. Tłuszcz wpływa na właściwości
sensoryczne gotowego produktu: temperaturę, barwę, smak, zapach
i teksturę. Związki takie jak lecytyna, mono- i diacyloglicerole są emulgatorami,
odgrywającymi ważną rolę w technologii żywności.

2. Klasyfikacja lipidów
Złożoność budowy i różne funkcje, jakie pełnią lipidy sprawiają, że klasyfikacja tej
grupy związków jest często niejednorodna i brak jest jednolitych kryteriów ich podziału.
Ogólnie lipidy dzieli się na proste i złożone, a w obrębie tych dwóch grup wyróżnia się
kolejne podgrupy (rys. 25):

LIPIDY

LIPIDY PROSTE LIPIDY ZŁOŻONE

Lipidy właściwe Woski Fosfolipidy Glikolipidy Inne lipidy złożone

Rys. 25. Podział lipidów

Glicerofosfolipidy Glikoglicerolipidy Sulfolipidy

106
Sfingofosfolipidy Glikosfingolipidy Aminolipidy
 Lipidy naturalne to mieszanina złożona z różnych lipidów, w których przeważają
tłuszcze właściwe. Niekiedy do lipidów zaliczane są też tzw. substancje towarzyszące,
takie jak karotenoidy, sterole, terpeny, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, których
zawartość w tłuszczach wynosi około 1-2%. Pod względem chemicznym są to pochodne
izopentenolu i stanowią tzw. frakcję niezmydlającą się, nie powinny więc być zaliczane do
lipidów.
Oprócz klasyfikacji opartej na budowie lipidów stosuje się też bardziej praktyczne
podziały. Biorąc pod uwagę ich konsystencję, dzieli się lipidy na stałe (tłuszcze) i ciekłe
(oleje). W zależności od źródła otrzymywania, rozróżnia się lipidy roślinne i zwierzęce,
przy czym drugą grupę dzieli się jeszcze na tłuszcze zwierząt lądowych i morskich.
Stosowany jest także podział uwzględniający właściwości lipidów, który wyodrębnia:
 tłuszcze mleka,
 tłuszcze z dużą zawartością: kwasu laurynowego, kwasu erukowego, kwasu
linolenowego, kwasów polienowych lub hydroksykwasów,
 tłuszcze zawierające kwasy acykliczne,
 masła roślinne,
 tłuszcze zwierząt domowych,
 tłuszcze zwierząt morskich.

3. Kwasy tłuszczowe
Kwasy tłuszczowe są monokarboksylowymi, alifatycznymi kwasami o prostym
łańcuchu i parzystej liczbie atomów węgla w cząsteczce. Najczęściej zawierają od 4 do 26
atomów węgla. W zależności od długości łańcucha można wyróżnić kwasy
krótkołańcuchowe, zawierające do 6 atomów węgla, średniołańcuchowe – do 10 atomów
i długołańcuchowe, w których liczba atomów węgla przekracza 12. Kwasy
o dłuższych łańcuchach występują w woskach. Kwasy tłuszczowe dzieli się również ze
względu na występowanie wiązań podwójnych w cząsteczce na nasycone i nienasycone.
Nazwy kwasów tłuszczowych tworzy się od nazwy węglowodoru o takiej samej liczbie
atomów węgla dodając końcówkę –owy, np. kwas butanowy.

4 3 2 1

CH3 CH2 CH2 COOH

kwas butanowy

107
 Należy przy tym uwzględnić stopień ich nienasycenia dodając numer atomu węgla,
przy którym występuje wiązanie podwójne licząc od grupy karboksylowej, np. kwas
4-heksenowy.
6 5 4 3 2 1

CH3 CH CH CH2 CH2COOH

kwas 4-heksenowy

Oprócz nazw systematycznych powszechnie stosowane są nazwy zwyczajowe kwasów

tłuszczowych (tabela 4 i 5). Często też można spotkać nomenklaturę skrótową w postaci
liczb rozdzielonych dwukropkiem, np. 18:3. Pierwsza liczba oznacza ilość atomów węgla,
druga liczbę wiązań podwójnych. Podaje się również pozycję wiązań podwójnych poprzez
umieszczenie numeru atomu węgla, przy którym występuje oraz konfigurację wiązania cis
(c) lub trans (t). Przykładowo dla kwasu linolenowego mamy 18:3 (9c, 12c, 15c).
Jednakże, ze względu na zróżnicowane właściwości kwasów nienasyconych, spotyka się
jeszcze podział tych związków na kwasy z serii n-3, n-6 i n-9, gdzie liczna n oznacza
położenie wiązania podwójnego licząc od grupy metylowej. W takim zapisie kwas
linolenowy oznacza się jako 18:3, n-3 czyli oktadekatrienowy n-3,6,9.

3.1. Kwasy tłuszczowe nasycone

Kwasy nasycone tworzą szereg homologiczny o ogólnym wzorze C nH2nO2 (tabela 4).
Z wyjątkiem kwasów krótkołańcuchowych, pozostałe mają w temperaturze pokojowej
konsystencję stałą. Wraz ze wzrostem długości łańcucha maleje lotność
i rozpuszczalność kwasów nasyconych, a wzrasta temperatura topnienia. Najbardziej
rozpowszechnione z tej grupy są kwasy: palmitynowy i stearynowy, występujące
w tłuszczach zwierzęcych jak i roślinnych. Ilość kwasu palmitynowego w tłuszczach
zwierzęcych sięga 30%, a w tłuszczach roślinnych nawet do 45%, np. w oleju palmowym.
Kwas stearynowy występuje w największych ilościach w tłuszczu zapasowym
przeżuwaczy (około 30%) i w maśle kakaowym (około 35%). Oleje roślinne jak palmowy
czy kokosowy są dobrymi źródłami kwasu laurynowego i mirystynowego. Z kolei
w tłuszczu mleka występują w dużej ilości kwasy krótkołańcuchowe.

108
Tabela 4. Szereg homologiczny kwasów tłuszczowych nasyconych
liczba
nazwa wzór
nazwa zwyczajowa atomów występowanie
sytematyczna chemiczny
węgla
butanowy Masłowy 4 C4H8O2 masło
heksanowy Kapronowy 6 C6H12O2
oktanowy Kaprylowy 8 C8H16O2 masło, olej kokosowy
dekanowy Kaprynowy 10 C10H20O2
dodekanowy Laurynowy 12 C12H24O2 olej laurowy, olej kokosowy
tetradekanowy mirystynowy 14 C14H28O2 masło kokosowe
heksadekanowy palmitynowy 16 C16H32O2
tłuszcze zwierzęce i roślinne
oktadenowy Stearynowy 18 C18H36O2
(e)ikozanowy Arachidowy 20 C20H40O2
dokozanowy Behenowy 22 C22H44O2 olej z orzechów ziemnych
tetrakozanowy lignocerynowy 24 C24H48O2
heksakozanowy cerotynowy 26 C26H52O2 lanolina

3.2. Kwasy tłuszczowe nienasycone

Kwasy tłuszczowe nienasycone zawierają jedno lub kilka wiązań podwójnych typu
etylenowego –CH=CH–. Z obecnością wiązań podwójnych wiąże się niższa temperatura
topnienia w porównaniu z kwasami tłuszczowymi nasyconymi, która spada wraz z rosnącą
liczbą wiązań podwójnych. Tłuszcze zawierające dużą ilość kwasów tłuszczowych
nienasyconych mają płynną konsystencję i nazywa się je olejami. Nienasycone kwasy
tłuszczowe wchodzące w skład tłuszczów naturalnych mają od 1 do 6 wiązań podwójnych.
Ich zawartość w tłuszczach jest zróżnicowana. Tłuszcze zwierząt morskich zawierają
30-60% kwasów tłuszczowych nienasyconych, głównie kwasy arachidonowy i erukowy.
Z kolei w tłuszczach zwierząt słodkowodnych kwasy nienasycone stanowią około 80%
ogólnej ilości kwasów i są to głównie kwasy: oleinowy i palmitooleinowy. W tłuszczach
ptaków kwasy tłuszczowe nienasycone stanowią około 60-70% ogólnej ilości kwasów
tłuszczowych, a u ssaków 45-60%.
Obecność wiązania podwójnego w cząsteczce stwarza możliwość izomerii cis
i trans (rys. 26) oraz izomerii położenia wiązania. Naturalne lipidy zawierają kwasy
tłuszczowe w konfiguracji cis, tzn. że reszty kwasów tłuszczowych są rozmieszczone po
tej samej stronie wiązania podwójnego. Powoduje to zgięcie łańcucha w miejscu wiązania
podwójnego. W izomerach trans reszty te znajdują się po przeciwnych stronach wiązania
nienasyconego.

O
C
OH

109
 Kwas oleinowy
O
C
OH

Kwas elaidynowy

Rys. 26. Kwas tłuszczowy w formie cis (oleinowy) i trans (elaidynowy)

Izomery trans powstają pod wpływem działania różnych czynników fizycznych lub
chemicznych, m.in. podczas procesów modyfikacyjnych w przemyśle spożywczym.
Przykładem jest reakcja katalitycznego uwodornienia olejów roślinnych, podczas której
zachodzi również konwersja izomeru cis w trans. Izomery trans nie posiadają właściwości
biologicznych typowych dla izomerów cis, mogą jedynie stanowić źródło energii.
W warunkach naturalnych izomery trans powstają w przedżołądku przeżuwaczy, gdzie
enzym trans-izomeraza przekształca formy cis kwasów tłuszczowych do formy trans.
W naturalnych, świeżych tłuszczach roślinnych kwasy tłuszczowe występują w formie cis,
natomiast izomery trans pojawiają się pod wpływem temperatury, różnych czynników
fizycznych i chemicznych w procesach przemysłowego oczyszczania, a także podczas
uwodornienia – utwardzania margaryn. Izomery trans mają niekorzystny wpływ na nasz
organizm. Podobnie jak kwasy nasycone, zwiększają we krwi stężenie cholesterolu
całkowitego oraz cholesterolu w lipoproteinach o małej gęstości czyli frakcji LDL (ang.,
Low Density Lipoproteins). Jednocześnie zmniejszają stężenie cholesterolu
w lipoproteinach o dużej gęstości - HDL (ang., High Density Lipoproteins). Prowadzą
zatem do zmian arterogennych w naczyniach wieńcowych, przyspieszając rozwój
miażdżycy. Izomery trans mogą również przyczyniać się do niskiej masy urodzeniowej
niemowląt, podnosić stężenie insuliny we krwi, zaburzać funkcjonowanie układu
immunologicznego, a nawet wykazywać działanie kancerogenne. W związku
z negatywnym wpływem izomerów trans na zdrowie człowieka, zaleca się ograniczać
spożywanie margaryn przez niemowlęta i dzieci oraz reguluje ich dopuszczalną zawartość
w produktach. W maśle ich zawartość może wynosić 2-6%, a w tłuszczach roślinnych
poddanych utwardzeniu do 50%.
Oprócz izomerii cis i trans w kwasach nienasyconych obserwuje się też izomerię
położenia. Izomery powstają w wyniku zmian w rozmieszczeniu wiązań podwójnych
w łańcuchu. Na przykład kwas linolenowy i -linolenowy zawierają tyle samo atomów

110
węgla w cząsteczce i tyle samo wiązań podwójnych, ale w innym położeniu.
W przypadku kwasu linolenowego znajdują się one przy 9, 12 i 15 atomie węgla,
a w kwasie -linolenowym przy 6, 9 i 12 atomie węgla.
W zależności od liczby wiązań podwójnych w cząsteczce można wyróżnić kwasy
tłuszczowe jednonienasycone i wielonienasycone. W tabeli 5 zestawiono ważniejsze
nienasycone kwasy tłuszczowe.

Tabela 5. Ważniejsze nienasycone kwasy tłuszczowe

liczba
wzór
nazwa systematyczna nazwa zwyczajowa atomów występowanie
chemiczny
węgla
jednonienasycone kwasy tłuszczowe
tłuszcz zwierząt
cis-9-tetradecenowy mirystooleinowy 14 C14H26O2 lądowych
i morskich
tłuszcze roślinne
cis-9-heksadecenowy palmitooleinowy 16 C16H30O2
i zwierzęce
tłuszcze roślinne
cis-9-oktadecenowy oleinowy 18 C12H34O2
i zwierzęce
tłuszcze
trans-9-oktadecenowy elaidynowy 18 C18H34O2
przeżuwaczy
olej rzepakowy,
cis-13-dokozenowy erukowy 22 C22H40O2
tran
cis-11-dokozenowy cetolowy 22 C22H40O2 tran
tran, tkanka
cis-15-tetrakozenowy nerwonowy 24 C24H46O2
nerwowa
wielonienasycone kwasy tłuszczowe
cis, cis-9,12-oktadecadienowy linolowy 18 C18H32O2 oleje roślinne
cis,cis,cis-9,12,15- olej lniany, inne
-linolenowy 18 C18H30O2
oktadecatrienowy tłuszcze roślinne
cis,cis,cis-6,9,12- tłuszcze i tkanki
-linolenowy 18 C18H30O2
oktadecatrienowy zwierzęce
cis,cis,cis,cis-5,8,11,14- tłuszcze i tkanki
arachidonowy 20 C20H32O2
eikozatetraenowy zwierzęce
cis,cis,cis,cis,cis-5,8,11,14,17- tłuszcze i tkanki
eikozapentaenowy 20 C20H30O2
eikozapentaenowy zwierzęce

3.2.1. Kwasy tłuszczowe jednonienasycone

Kwasy jednonienasycone, nazywane monoenowymi ze względu na charakter wiązań,
występują we wszystkich tłuszczach naturalnych, podobnie jak nasycone kwasy
tłuszczowe. Ogólny wzór jednonienasyconych kwasów tłuszczowych można zapisać
następująco: CnH2n-2O2. Najbardziej rozpowszechnionym z tej grupy kwasów tłuszczowych
jest kwas oleinowy (18:1, 9c), stanowiący około 40% wszystkich kwasów tłuszczowych w
przyrodzie. Szczególnie bogata w ten kwas jest oliwa z oliwek (około 75%). Inne

111
popularne kwasy jednonienasycone to kwas palmitooleinowy (16:1, 9c)
i mirystooleinowy (14:1, 9c), występujące głównie w tłuszczach zwierząt morskich
i lądowych. Kwas erukowy (22:1, 13c) jest z kolei głównym kwasem obecnym
w nasionach roślin z rodziny kapustnych.

3.2.2. Kwasy tłuszczowe wielonienasycone

Kwasy wielonienasycone (polienowe) mogą zawierać w cząsteczce od 2 do 6 wiązań
podwójnych. Ogólny wzór kwasów tłuszczowych wielonienasyconych można przedstawić
następująco: CnH2n-xO2, gdzie x oznacza 4, 6 lub 9. Poszczególne kwasy tłuszczowe różnią
się pomiędzy sobą długością łańcucha, liczbą i położeniem wiązań podwójnych oraz
konformacją cząsteczki. Wiązania podwójne rozmieszczone są w charakterystyczny
sposób tworząc układ izolowany, czyli niesprzężony (–CH=CH–CH2–CH=CH–). Ma to
duże znaczenie w procesie utleniania kwasów tłuszczowych, ponieważ grupa metylowa
występująca pomiędzy wiązaniami podwójnymi wykazuje szczególną reaktywność
w stosunku do tlenu. Przyłączanie tlenu powoduje powstanie nadtlenków, a następnie
epoksydów i pochodnych hydroksylowych. Powoduje to w rezultacie powstawanie
specyficznego smaku i zapachu powstających w trakcie przechowywania tłuszczów.
Kwasy wielonienasycone występują w większości tłuszczów naturalnych. Najbardziej
rozpowszechnione są kwasy dienowe, szczególnie kwas linolowy (18:2, 9c, 12c), który
znajduje się zarówno w tłuszczach zwierzęcych jak i roślinnych. Bogatym źródłem tego
kwasu są jednak przede wszystkim oleje roślinne, takie jak słonecznikowy czy sojowy,
w których jego udział może wynosić do 80%. Spośród kwasów trienowych największe
znaczenie ma kwas linolenowy (18:3, 9c, 12c, 15c). Jego zawartość jest duża tylko
w nielicznych tłuszczach, m.in. w oleju lnianym (50-60%). Ze względu na dużą podatność
na autooksydację kwas linolenowy stanowi z reguły czynnik niepożądany, szczególnie
w tłuszczach długo przechowywanych. Do kwasów tetraenowych o dużej aktywności
biologicznej należy kwas arachidonowy (20:4, all-cis, 5, 8, 11, 14), który występuje
w tłuszczach zwierzęcych i wchodzi w skład fosfolipidów błon komórkowych. Inne kwasy
polienowe, takie jak eikozapentaenowy i dokozaheksaenowy występują w większej ilości
w tłuszczach i olejach rybich.
Szczególną grupę tłuszczów wielonienasyconych stanowią tzw. niezbędne nienasycone
kwasy tłuszczowe NNKT. W grupie tej wyróżnia się rodziny omega-3 i omega-6. Różnica
pomiędzy nimi, wyrażona tzw. liczbą omega, oznacza miejsce występowania pierwszego
wiązania podwójnego w łańcuchu licząc od ostatniego atomu węgla. Do kwasów omega-3

112
zalicza się kwas α-linolenowy, kwas eikozapentaenowy (EPA) i dokozaheksaenowy
(DHA). Do rodziny omega-6 należą kwas linolowy, -linolenowy i kwas arachidonowy.
Spośród wszystkich NNKT najwyższą aktywność biologiczną wykazuje kwas
arachidonowy, a najniższą α-linolenowy. Kwas linolowy i linolenowy muszą być
dostarczane z pożywieniem, ponieważ organizm ludzki nie potrafi sobie ich syntetyzować.
Kwas arachidonowy powstaje w wyniku konwersji z kwasu linolowego, który jest jego
prekursorem. Jest więc kwasem względnie egzogennym, pod warunkiem, że w diecie
znajduje się wystarczająca ilość kwasu linolowego.
Obecność w diecie NNKT wpływa na prawidłowe funkcjonowanie układu
hormonalnego i nerwowego. Kwasy tłuszczowe z rodziny omega-3 mają duże znaczenie
w procesie krzepnięcia krwi. Powodują ponadto obniżenie poziomu cholesterolu,
lipoprotein LDL i triacylogliceroli we krwi, poprawiają pracę serca i przepływ krwi przez
naczynia wieńcowe. EPA warunkuje prawidłową syntezę eikozanoidów, które są
odpowiedzialne za działanie przeciwzakrzepowe i przeciwzapalne, powstrzymują rozwój
guzów nowotworowych i ograniczają kurczliwość naczyń krwionośnych. DHA jest
ważnym składnikiem fosfolipidów, odgrywa dużą rolę w prawidłowym funkcjonowaniu
mózgu i całego układu nerwowego. Uważa się, że zaburzenia emocjonalne i depresja mają
związek z niskim poziomem DHA. Kwasy tłuszczowe z rodziny omega-6 zapobiegają
zakrzepom tętniczym, wspomagają leczenie nadciśnienia tętniczego, choroby wrzodowej
żołądka i dwunastnicy, a także otyłości i cukrzycy. Jednak nadmiar tych kwasów może
mieć niekorzystny wpływ na funkcjonowanie organizmu. W określonych warunkach mogą
one wpływać na rozwój procesów nowotworowych. Negatywny aspekt dużej ilości
kwasów z rodziny n-6 w diecie wiąże się też z ich podatnością na procesy oksydacyjne, co
prowadzi do powstania wodorotlenków, nadtlenków, epoksyzwiązków i wolnych
rodników. Związki te mogą wpływać na rozwój miażdżycy, wykazują działanie
cytotoksyczne, mutagenne i kancerogenne.
W codziennym pożywieniu powinno się znaleźć co najmniej 8-12 g NNKT, co
odpowiada 3-4% energetycznego zapotrzebowania organizmu ludzkiego.

4. Charakterystyka lipidów
4.1. Lipidy proste
Lipidy proste zwane homolipidami obejmują dwie grupy związków, tj. lipidy właściwe
i woski.

113
4.1.1. Lipidy właściwe
Lipidy właściwe, nazywane acyloglicerolami, to estry jednokarboksylowych kwasów
tłuszczowych, zarówno nasyconych jak i nienasyconych, i glicerolu. W cząsteczce
glicerolu zestryfikowane mogą być jedna, dwie lub wszystkie trzy grupy hydroksylowe,
stąd możemy wyróżnić mono-, di- i triacyloglicerole (rys. 27, 28). Największą grupę
stanowią triacyloglicerole, które są frakcją dominującą w tłuszczach.

O O O
H2C O C R1 H2C O C R1 H2C O C R1

O
H C OH H C OH H C O C R2

O O
H2C OH H2C O C R2 H2C O C R3

Rys. 27. Wzory ogólne mono-, di- i triacyloglicerolu

O
H2C O C

O
H C O C

O
H2C O C

Rys. 28. Przykład triacyloglicerolu – tristearynian glicerolu

Reszty acylowe przyłączane do cząsteczki glicerolu są często różne, bo pochodzą od

różnych kwasów tłuszczowych. Możliwa jest przy tym znaczna liczba izomerów
w zależności od ułożenia podstawników acylowych. W glicerolu kwasy tłuszczowe mogą
się znajdować w pozycji zewnętrznej przy węglu 1 i 3, albo w pozycji wewnętrznej przy
węglu 2. W przypadku triacylogliceroli możemy wyróżnić proste, kiedy we wszystkich
trzech pozycjach glicerolu występuje jeden rodzaj kwasu, np. tripalmitoiloglicerol oraz
mieszane, zawierające dwa lub trzy różne kwasy tłuszczowe.
Acyloglicerole są związkami stereospecyficznymi. Pomimo, iż glicerol jest optycznie
nieczynny, to po podstawieniu grup hydroksylowych różnymi kwasami tłuszczowymi,
środkowy – drugi atom węgla staje się asymetryczny. W nazewnictwie stosuje się system
numeracji stereospecyficznej umieszczając przedrostek sn- (ang., stereospecific

114
numbering) przed nazwą reszty glicerolowej, który mówi o konfiguracji przestrzennej
związku.
Różnice w budowie mają wpływ na właściwości acylogliceroli. Triacyloglicerole są
hydrofobowe, nie rozpuszczają się w wodzie, są natomiast rozpuszczalne w chloroformie,
benzenie, etanolu i gorącym eterze. Mono- i diacyloglicerole ze względu na obecność
polarnych grup hydroksylowych, mają zdolność do tworzenia miceli. Micele są tworami
o kształcie kulistym, w których lipidy układają się w określony sposób tzn. niepolarne
łańcuchy są skierowane do wewnątrz miceli a grupy polarne skierowane na zewnątrz
miceli ulegają solwatacji, która pomaga w stabilizacji. O trwałości miceli decyduje ujemny
ładunek powierzchni (zdysocjowane grupy karboksylowe). Triacyloglicerole, które
zawierają długołańcuchowe nasycone kwasy tłuszczowe mają konsystencję stałą,
natomiast te, które zawierają kwasy tłuszczowe nienasycone są cieczami. Także
stereospecyficzność wpływa na właściwości lipidów sprawiając, że tłuszcze zawierające
takie same kwasy tłuszczowe, ale różniące się budową, różnią się również właściwościami
fizykochemicznymi. Ma to duże znaczenie m.in. w procesach trawienia i wchłaniania
tłuszczów pokarmowych ze względu na stereospecyficzne właściwości enzymów.
Przykładem może być lipaza trzustkowa, która hydrolizuje wiązania estrowe tylko
w pozycji sn-1 i sn-3.

4.1.2. Woski
Woski są estrami wyższych kwasów tłuszczowych, nasyconych i nienasyconych oraz
długołańcuchowych alkoholi, jak np. alkohol cetylowy, cerylowy, mirycylowy.
Są to związki o stałej konsystencji, nierozpuszczalne w wodzie i odporne na działanie
różnych czynników chemicznych, mikrobiologicznych i enzymatycznych.
Woski są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, zarówno w świecie zwierzęcym jak
i roślinnym. Najbardziej znany jest wosk pszczeli i lanolina, czyli tzw. tłuszcz
z wełny owczej. U ptaków i ssaków woski są wytwarzane przez gruczoły łojowe skóry.
Przykładem jest wydzielina gruczołów kuprowych u ptaków czy woskowina zewnętrznego
przewodu słuchowego u ssaków. Woski mogą stanowić materiał zapasowy, z którego
zwierzęta czerpią energię w okresach sezonowego głodu, jak ma to miejsce u organizmów
morskich takich jak skorupiaki czy koralowce. W świecie roślin woski występują przede
wszystkim na powierzchniach liści, łodyg, owoców i nasion. Woski nie posiadają wartości
odżywczej, ale stanowią dobry materiał izolacyjny i ochronny. Zgromadzone na
zewnętrznych powierzchniach chronią organizm m.in. przed dostępem drobnoustrojów.

115
4.2. Lipidy złożone
Tłuszcze złożone, inaczej heterolipidy, obejmują trzy grupy związków: fosfolipidy,
glikolipidy i inne związki złożone, których pod względem budowy i właściwości
fizykochemicznych nie można zaklasyfikować do pierwszych dwóch grup.

4.2.1. Fosfolipidy
Fosfolipidy są estrami glicerolu lub innego alkoholu – sfingozyny i kwasów
tłuszczowych oraz kwasu ortofosforowego. Są najbardziej rozpowszechnionymi lipidami
z grupy lipidów złożonych, ponieważ stanowią główny składnik błon komórkowych, błon
jądrowych, występują też w mitochondrium i siateczce śródplazmatycznej. Odgrywają
ważną rolę w zjawisku selektywnej przepuszczalności błon. Ich udział jest szczególnie
duży w komórkach zwierzęcych, natomiast w świecie roślin występują w znacznie
mniejszym stężeniu. Pod względem budowy chemicznej wyróżnia się pochodne kwasu
glicerofosforowego, czyli glicerofosfolipidy i pochodne fosfoceramidu – sfingofosfolipidy.

Glicerofosfolipidy
Glicerofosfolipidy są estrami glicerolu i wyższych kwasów tłuszczowych oraz kwasu
ortofosforowego. Dwie reszty kwasów tłuszczowych łączą się wiązaniem estrowym
z grupami hydroksylowymi przy pierwszym i drugim atomie węgla glicerolu. Zwykle
w pozycji środkowej znajduje się reszta nienasyconego kwasu tłuszczowego,
a przy węglu pierwszym reszta nasyconego kwasu tłuszczowego. Ortofosforan łączy się
wiązaniem estrowym z trzecim atomem węgla glicerolu.
Najprostszym glicerofosfolipidem jest kwas fosfatydowy (3-sn-fosfodiacyloglicerol),
który stanowi jednocześnie podstawowy składnik strukturalny wszystkich
glicerofosfolipidów. W stanie wolnym kwas ten występuje rzadko, w małych ilościach jest
spotykany u zwierząt, w większych stężeniach w roślinach. Odgrywa natomiast bardzo
ważną rolę jako związek wyjściowy do syntezy innych glicerofosfolipidów. W reakcjach
ze związkami zawierającymi grupę hydroksylową kwas fosfatydowy tworzy estry
fosfatydylowe. Należą do nich:
 fosfatydylocholina (rys. 29), znana pod nazwą lecytyna, zawiera cholinę, przyłączoną
wiązaniem estrowym do atomu fosforu. Lecytyna wchodzi w skład tłuszczów
komórkowych zwierząt stanowiąc znaczną część frakcji fosfolipidowej w błonach
biologicznych. Fosfatydylocholina zawierająca dwie reszty kwasu palmitynowego jest

116
 dobrym surfaktantem, czyli związkiem obniżającym napięcie powierzchniowe na
granicy faz między tkanką płucną a gazami oddechowymi i zapobiega sklejaniu się
pęcherzyków płucnych. Lecytyna, której z reguły towarzyszą kefaliny, tworzą razem
składniki komórek i płynów ustrojowych. Występują w większej ilości w substancji
szarej mózgu i we krwi.
 fosfatydyloetanoloamina, zwana kefaliną, zawiera w cząsteczce etanoloaminę. Jest
głównym fosfolipidem występującym w komórkach bakterii, natomiast w komórkach
roślin i zwierząt jej udział jest znacznie mniejszy.
 fosfatydyloseryna zawierająca serynę stanowi około 10% fosfolipidów zwierzęcych.
Bierze udział w aktywacji kinazy proteinowej C i w koagulacji komórek krwi.
 fosfatydyloinozytol posiada w cząsteczce inozytol przyłączony do grupy fosforanowej
poprzez grupę hydroksylową związaną z węglem C-1 cyklitolu.
 fosfatydyloglicerol posiada dwie reszty glicerolu przyłączone do jednej grupy
fosforanowej. Występuje dość powszechnie u bakterii, w roślinach stanowi około 20%
frakcji fosfolipidowej, natomiast w tkankach zwierzęcych występuje w małych
ilościach.
 difosfatydyloglicerol zwany jest kardiolipiną. Zawiera w cząsteczce dwie reszty kwasu
fosfatydowego przyłączone do glicerolu. Stanowi istotny składnik błon komórkowych
bakterii i błon mitochondrialnych.

O
H2C O C

O
H C O C

O
H2C O P O
N+(CH3)3
OH

Rys. 29. Fosfatydylocholina

Glicerofosfolipidy są białymi substancjami stałymi o konsystencji woskowej. Mają

właściwości amfipatyczne, co oznacza, że wykazują jednocześnie właściwości
hydrofobowe od strony łańcuchów kwasów tłuszczowych i właściwości hydrofilowe od
strony polarnych grup reszt kwasu fosforowego i połączonych z nim podstawników.

117
Właściwości te sprawiają, że glicerofosfolipidy rozpuszczają się w rozpuszczalnikach
organicznych, ale mogą też rozpuszczać się w wodzie, tworząc pęczniejące żele.

Sfingofosfolipidy
Pod względem chemicznym sfingofosfolipidy są amidami długołańcuchowych kwasów
tłuszczowych i sfingozyny, zawierające ortofosforan i cholinę. Sfingozyna jest
jednonienasyconym dihydroksylowym aminoalkoholem. N-acylopochodną sfingozyny jest
ceramid, w którym grupa NH2 sfingozyny jest połączona wiązaniem peptydowym
z kwasem tłuszczowym. Ceramid, który jest zestryfikowany fosfocholiną nazywa się
sfingomieliną. Sfingomieliny mogą się różnić pomiędzy sobą rodzajem reszt kwasu
tłuszczowego związanego ze sfingozyną. Może to być kwas stearynowy, palmitynowy,
lignocerynowy lub nerwonowy. Sfingomieliny występują w wątrobie, śledzionie, nerkach,
płucach, osłonce mielinowej włókien nerwowych, substancji białej mózgu. Mniej
rozpowszechnione są sfingofosfolipidy u roślin, gdzie występuje analog sfingozyny
nazywany fitosfingozyną.

4.2.2. Glikolipidy
Glikolipidy zawierają co najmniej jedną cząsteczkę cukru połączoną wiązaniem
glikozydowym z częścią lipidową. Resztę cukrową najczęściej stanowi galaktoza, rzadziej
glukoza. W zależności od rodzaju alkoholu, jaki zawierają w cząsteczce, wyróżnia się
glikoglicerolipidy i glikosfingolipidy.

Glikoglicerolipidy
Glikoglicerolipidy są najprostszymi glikolipidami, występującymi głównie
w tkankach roślin wyższych i mikroorganizmów. Reszta cukrowa może być mono- lub
oligosacharydowa, przy czym najczęściej jest to galaktoza. Grupa cukrowa może być
sulfonowana lub mieć charakter aminocukru. Resztę lipidową stanowi zwykle kwas
tłuszczowy wysokonienasycony. Związki te występują głównie u organizmów
fotosyntetyzujących jak rośliny wyższe, glony czy bakterie i wchodzą w skład błon
chloroplastów.
Glikosfingolipidy
Glikosfingolipidy mają największe znaczenie spośród glikolipidów. Zalicza się do nich
cerebrozydy i gangliozydy.

118
 Cerebrozydy zbudowane są z ceramidu i reszty monocukrowej, którą może być
galaktoza albo glukoza. Poszczególne cerebrozydy różnią się rodzajem kwasu
tłuszczowego, który zawierają. Może nim być kwas lignocerynowy, cerebronowy,
nerwonowy, oksynerwonowy. Cerebrozydy występują w dużych ilościach w mózgu
i komórkach nerwowych, w szczególności w otoczkach mielinowych.
Gangliozydy zamiast reszty monocukrowej zawierają w cząsteczce oligosacharyd,
w którym zawsze występuje kwas sjalowy. Z kwasów tłuszczowych najbardziej typowy
jest kwas stearynowy, rzadziej nerwonowy i lignocerynowy. Gangliozydy występują
przede wszystkim w substancji szarej mózgu, a w mniejszych ilościach w substancji białej
– w aksonach.

5. Właściwości fizykochemiczne lipidów

Lipidy będące składnikiem surowców zwierzęcych i roślinnych są produktami
nietrwałymi i ulegają przemianom pod wpływem światła, tlenu atmosferycznego, wilgoci,
a także w wyniku działalności mikroorganizmów.
Zmiany zachodzące pod wpływem czynników chemicznych i biochemicznych określa
się ogólnie jako jełczenie tłuszczów, którego efektem jest zmiana właściwości
sensorycznych i odżywczych tłuszczów. Ponadto, niektóre produkty powstające
w wyniku jełczenia mogą w sposób szkodliwy działać na organizm człowieka. Ogólnie
wyróżnia się procesy związane z hydrolizą wiązań estrowych i utlenianiem kwasów
tłuszczowych. Można przy tym wyróżnić kilka typów jełczenia: kwasowe,
hydroksykwasowe, aldehydowe, ketonowe i lecytynowe. Typ jełczenia jest związany
z obecnością w tłuszczu jednego z produktów reakcji.
Hydrolityczny rozkład triacylogliceroli zachodzi pod wpływem zawartej w tłuszczu
wody i z udziałem enzymów zwanych lipazami triacyloglicerolowymi. Produktami są
kwasy tłuszczowe i glicerol. Zwiększenie zawartości wolnych kwasów tłuszczowych
pogarsza jakość sensoryczną lipidów. Ten typ jełczenia określa się jako hydrolityczny lub
kwasowy. Zachodzi głównie w lipidach zawierających krótkołańcuchowe kwasy
tłuszczowe takie jak masłowy, kapronowy, kaprylowy i kaprynowy, które są przyczyną
powstawania nieprzyjemnego zapachu i smaku. Pojawienie się długołańcuchowych
kwasów tłuszczowych może natomiast być przyczyną „mydlanego” smaku. Wolne kwasy
tłuszczowe znacznie łatwiej ulegają utlenieniu niż te związane w lipidach, co prowadzi do
dalszego pogorszenia cech sensorycznych.

119
 Utlenianie kwasów tłuszczowych to złożone przemiany, prowadzące do rozerwania
wiązań w łańcuchu węglowym kwasu tłuszczowego. Procesy utleniania zachodzą pod
wpływem enzymu lipooksygenazy, a szybkość procesu zależy od składu chemicznego
tłuszczów i wzrasta wraz ze wzrostem ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych.
Przyspieszająco działa duży dostęp tlenu i energii świetlnej. Reakcja kwasu tłuszczowego
z tlenem wymaga uprzedniego wzbudzenia jednego z substratów i może zachodzić na
drodze autooksydacji lub utleniania fotosensybilizowanego.
Autooksydacja lipidów jest rodnikową reakcją łańcuchową, przebiegającą
kilkuetapowo. W pierwszym etapie, określanym jako okres indukcyjny lub inicjacja
oksydacji, powstają rodniki alkilowe w wyniku stopniowego pochłaniania tlenu.
Do zapoczątkowania reakcji konieczna jest obecność inicjatora zdolnego do odszczepienia
protonu z cząsteczki kwasu tłuszczowego i utworzenia wolnego rodnika. W żywności
powstają one zwykle pod wpływem energii cieplnej, promieniowania lub jonów metali.
W kolejnym etapie, określanym mianem propagacji, rodniki alkilowe reagują dalej
z tlenem tworząc rodniki nadtlenkowe. Powstałe rodniki nadtlenkowe reagują następnie
z cząsteczką nienasyconego kwasu tłuszczowego tworząc wodoronadtlenek i nowy rodnik
lipidowy. Proces się powtarza i w efekcie następuje gwałtowne pochłanianie tlenu oraz
powstawanie dużych ilości nadtlenków, wodorotlenków, epoksyzwiązków
i ozonidków. W tej fazie nie pojawiają się zmiany smaku ani zapachu. Dopiero
w kolejnym etapie wodoronadtlenki ulegają rozpadowi, dając wolne rodniki zdolne
do inicjacji procesu autooksydacji oraz wtórne produkty autooksydacji, takie jak nasycone
lub nienasycone węglowodory, aldehydy, ketony, estry, etery, laktony. Związki te nadają
tłuszczom nieprzyjemny zapach i charakter zjełczały (jełczenie aldehydowe).
Autooksydacja przebiega do momentu wyczerpania tlenu w otoczeniu lub pojawienia się
specyficznego inhibitora – przeciwutleniacza, zdolnego do przerwania reakcji. Powstające
w wyniku utleniania nadtlenki, wodoronadtlenki i epoksydy mogą uszkadzać błony
komórkowe lub struktury wewnątrzkomórkowe.
W procesach autooksydacji wyróżnia się typ autooksydacji fotosensybilizowanej, która
zachodzi w obecności światła i fotouczulacza – sensybilizatora (np. chlorofil). Reakcja
zaczyna się od pochłonięcia fotonu światła przez sensybilizator, który przechodzi w stan
wzbudzony, a następnie w stan tripletowy. Wzbudzony sensybilizator przenosi energię na
tlen, następuje przejście cząsteczki tlenu w stan singletowy i przyłączenie do podwójnego
wiązania w kwasie tłuszczowym. Prowadzi to do przemieszczenia wiązania podwójnego
i zmiany konfiguracji cis w trans. W rezultacie powstaje wodoronadtlenek alkilowy.

120
Przypuszczalnie ten typ samoutleniania może inicjować procesy autooksydacji naturalnych
tłuszczów.
W niektórych lipidach złożonych można również zaobserwować tzw. typ jełczenia
lecytynowego, które polega na enzymatycznym rozszczepieniu lecytyn obecnych
w tłuszczach. Uwolniona cholina ulega rozkładowi do trimetyloaminy, która
charakteryzuje się nieprzyjemnym zapachem.
W wyniku ogrzewania nienasycone kwasy tłuszczowe obecne w tłuszczach mogą
ulegać polimeryzacji, która jest procesem kilkuetapowym przebiegającym z udziałem
wolnych rodników. Długotrwałe ogrzewanie prowadzi do powstania form takich jak
dimery czy trimery kwasów tłuszczowych, ale także polimerów cyklicznych. W efekcie
tworzenia się polimerów wzrasta masa cząsteczkowa kwasów tłuszczowych, zwiększa się
lepkość i wartość współczynnika załamania światła. Produkty polimeryzacji mogą
spowodować zaburzenia w przewodzie pokarmowym. Z kolei produkty cykliczne mają
działanie mutagenne i kancerogenne.

6. Metody badania lipidów

Tłuszcze pokarmowe stanowią złożoną i zróżnicowaną grupę związków, dlatego
w analizie jakościowej i ilościowej stosowane są różnorodne metody analityczne. Ogólnie
można je podzielić na klasyczne i instrumentalne, które wykorzystuje się w zależności od
tego, jakiej wiedzy na temat tłuszczów potrzebujemy, tzn. czy chcemy uzyskać
np. informację o składzie tłuszczu, o jego walorach sensorycznych czy okresie
przydatności do spożycia.
W ocenie jakości tłuszczu duże znaczenie mają tzw. liczby charakterystyczne, m.in.:
 liczba zmydlenia – oznacza ilość wodorotlenku potasu (mg), potrzebną do zmydlenia
estrów i zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych w 1 g tłuszczu,
 liczba jodowa – określa ilość jodu (g) związanego przez 100 g tłuszczu podczas
jodowania. Biorąc pod uwagę, że jod przyłącza się w miejsce wiązań podwójnych,
liczba ta określa stopień nienasycenia kwasów tłuszczowych,
 liczba nadtlenkowa – określa stopień utlenienia kwasów tłuszczowych. Jest to liczba cm 3
tiosiarczanu sodowego (0,002 M) zużyta do miareczkowania jodu wydzielonego z jodku
potasowego w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 g tłuszczu,
 stopień kwasowości – określa ilość wodorotlenku potasu (cm3) potrzebną do
zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 100 g tłuszczu,

121
 liczba kwasowości – wyraża ilość wodorotlenku potasu (mg) potrzebną do zobojętnienia
wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g tłuszczu,
 temperatura topnienia – oznacza temperaturę, w jakiej tłuszcze przechodzą ze stanu
stałego w stan ciekły.
Obecnie do dokładnej analizy składu i zawartości kwasów tłuszczowych stosuje się
przede wszystkim metody spektrofotometryczne i chromatograficzne. Należy tu wymienić
metodę chromatografii gazowej, której wprowadzenie spowodowało przełom w analizie
tłuszczów. W połączeniu ze spektrometrią masową pozwala na określenie pełnego składu
kwasów tłuszczowych, a także izomerów cis – trans i izomerii położenia. Metodę
chromatografii gazowej łączy się również z wysokosprawną chromatografią cieczową
(HPLC), a także z metodami spektroskopii w podczerwieni (IR) i ultrafiolecie (UV).

7. Zagadnienia
1. Budowa, znaczenie lipidów.
2. Klasyfikacja lipidów.
3. Kwasy tłuszczowe – nomenklatura i podział.
4. Nasycone kwasy tłuszczowe – charakterystyka, przykłady, znaczenie.
5. Nienasycone kwasy tłuszczowe – podział, przykłady.
6. Rola NNKT.
7. Lipidy właściwe – budowa, właściwości, znaczenie.
8. Lipidy złożone – podział, charakterystyka.
9. Właściwości fizykochemiczne lipidów.
10. Metody analizy lipidów – liczby charakterystyczne.

8. Część eksperymentalna
8.1. Wykrywanie składników tłuszczów właściwych

122
 Tłuszcze naturalne są mieszaniną różnych lipidów, wśród których dominującą frakcję
stanowią triacyloglicerole. Wstępną identyfikację tej grupy tłuszczów przeprowadza się na
podstawie reakcji zmydlania i wykrywania poszczególnych składników budowy,
tj. kwasów tłuszczowych i glicerolu.

8.1.1. Zmydlanie tłuszczu

Zasada oznaczenia
W środowisku zasadowym zachodzi rozpad wiązań estrowych, który nosi nazwę
zmydlania tłuszczu (rys. 30). W wyniku zmydlania powstają sole kwasów tłuszczowych,
czyli mydła. Niektóre z nich, jak sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych są dobrze
rozpuszczalne w wodzie, tworzą micelarne roztwory koloidowe i są związkami
powierzchniowo czynnymi. Inne natomiast, jak sole kwasów tłuszczowych i metali
dwuwartościowych, np. ołowiu, wapnia, baru są nierozpuszczalne w wodzie, nie
zmniejszają napięcia powierzchniowego i nie mają właściwości piorących.
Reakcję zmydlania wykorzystuje się w celu określenia struktury tłuszczu, a także
w analizie jakościowej tłuszczów jadalnych. Na reakcji zmydlania opiera się wyznaczanie
tzw. liczby zmydlenia.

O
H2C O C C17H35 H2C OH

O O
H C O C C17H35 + 3 NaOH H C OH + 3 C17H35 C ONa

O
H2C O C C17H35 H2C OH

tristearynian glicerolu glicerol stearynian sodu

Rys. 30. Reakcja zmydlania

Wykonanie
Do trzech probówek wlać po 2-3 krople próby badanej i około 3 cm 3 alkoholowego
roztworu KOH, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Do
ogrzanego roztworu dodać po 5 cm3 wody i dalej ogrzewać do rozpuszczenia mydeł.

123
Powstałe mydła powodują opalizację roztworu i silne pienienie się zawartości probówki
przy wstrząsaniu.
W jednej z probówek przeprowadzić wytrącanie mydeł nierozpuszczalnych
w wodzie poprzez dodanie roztworu CaCl2 lub Pb(CH3COO)2. W drugiej probówce
przeprowadzić wysalanie mydeł, a w trzeciej wytrącanie kwasów tłuszczowych.

Odczynniki
1) 10% alkoholowy roztwór KOH,
2) 5% roztwór CaCl2 lub Pb(CH3COO)2,
3) próba badana.

8.1.2. Wysalanie mydeł

Zasada oznaczenia
Dodanie w nadmiarze silnych elektrolitów (np. NaCl) do roztworu mydła powoduje
jego koagulację i wytrącenie z roztworu. Jest to proces fizyczny, który polega na
odciągnięciu wody z powierzchni miceli mydła przez elektrolit, tak jak przy wysalaniu
białek. Wytrącone mydło ponownie rozpuszcza się w wodzie.

Wykonanie
Do probówki ze zmydlonym tłuszczem dodać krystaliczny NaCl aż do wysycenia
roztworu. Wytrąca się kłaczkowaty osad. Płyn usunąć i rozpuścić wytrącone mydło
w kilku cm3 wody destylowanej.

Odczynniki
krystaliczny NaCl

8.1.3. Wytrącanie kwasów tłuszczowych z mydeł

Zasada oznaczenia
W wyniku działania na mydła silnych kwasów mineralnych powstają niezdysocjowane
wolne kwasy tłuszczowe. Kwas mineralny wypiera słabszy kwas organiczny z jego soli
i wytrącają się kwasy tłuszczowe nierozpuszczalne w wodzie.
Identyfikację osadu można przeprowadzić na podstawie reakcji z mocznikiem. Kwasy
tłuszczowe zawierające powyżej 5 atomów węgla w cząsteczce tworzą z mocznikiem

124
krystaliczne połączenia kompleksowe. Kryształy różnią się kształtem w zależności od
rodzaju kwasu.

Wykonanie
Do probówki ze zmydlonym tłuszczem dodać kilka cm 3 10% roztworu kwasu
siarkowego. W obecności tłuszczu wydzielają się wyższe kwasy tłuszczowe.

Odczynniki
10% roztwór kwasu siarkowego

8.1.4. Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych

Zasada oznaczenia
Nienasycone kwasy tłuszczowe, zarówno w postaci wolnej jak i związanej, łatwo
przyłączają wodór i chlorowce (chlor, brom i jod) w miejscach wiązań podwójnych.
Uwodornienie powoduje zmianę liczby i położenia wiązań podwójnych, co pociąga za
sobą zmiany właściwości fizycznych i chemicznych tłuszczów. Reakcję uwodornienia
wykorzystuje się w przemyśle w celu przekształcenia olejów w tłuszcze plastyczne,
przydatne do wyrobu margaryn i innych tłuszczów spożywczych.
W analizie tłuszczów stosuje się najczęściej reakcję jodowania, na której opiera się
wyznaczanie tzw. liczby jodowej. W reakcji jodowania wykrywanie nienasyconych
kwasów tłuszczowych następuje w wyniku addycji jodu w miejscu wiązań podwójnych
(rys. 31). Reakcja jest katalizowana przez chlorek rtęci HgCl2. Roztwór jodu ma barwę
żółtobrunatną, natomiast po addycji do wiązań podwójnych następuje odbarwienie
roztworu, ponieważ jod cząsteczkowy przechodzi w bezbarwny jon jodkowy związany
organicznie.

J J
+ HgCl2
R C C R + J2 R C C R
H H H H

Rys. 31. Reakcja jodowania

125
Wykonanie
Do probówki przenieść 2 cm3 próby badanej i dodać parę kropli roztworu jodu do
powstania żółtego zabarwienia. Następnie wkroplić roztwór HgCl2. W obecności
nienasyconych kwasów tłuszczowych roztwór odbarwia się.

Odczynniki
1) 5% roztwór jodu w alkoholu etylowym,
2) 5% roztwór HgCl2,
3) 5% roztwory alkoholowe kwasu olejowego i kwasu stearynowego,
4) próba badana.

8.1.5. Wykrywanie glicerolu

Zasada oznaczenia
Wykrywanie glicerolu przeprowadza się na podstawie tzw. próby akroleinowej
(rys. 32). Glicerol, będący głównym składnikiem glicerolipidów, w obecności substancji
odwadniających przechodzi w akroleinę. Akroleina charakteryzuje się przenikliwym
ostrym zapachem i jako nienasycony aldehyd ma właściwości redukujące.

H2C OH HC O
_
2 H2O
HC OH CH
KHSO4
H2C OH CH2

glicerol akroleina
Rys. 32. Próba akroleinowa

Wykonanie
Do probówki wlać kilka kropli próby badanej, a następnie dodać ok. 1 g KHSO 4.
Zawartość probówki ogrzewać, a następnie do jej wylotu przyłożyć pasek bibuły
zanurzony w amoniakalnym roztworze AgNO3. Ponieważ pod wpływem akroleiny
wydziela się metaliczne srebro, pasek ulega zbrunatnieniu.

Odczynniki
1) krystaliczny KHSO4,
2) amoniakalny roztwór AgNO3 (kilka kropli 0,1 N roztworu AgNO3 i 1-2 cm3 stężonego roztworu
amoniaku),
3) próba badana.

126
8.2. Wykrywanie składników glicerofosfolipidów
Zawartość fosfolipidów w tłuszczach roślinnych i zwierzęcych jest zróżnicowana.
W przypadku roślin można je znaleźć przede wszystkim w nasionach, a ich ilość zależy od
gatunku i odmiany roślin. Zapasowe tłuszcze zwierzęce są ubogie w fosfolipidy
(np. smalec zawiera tylko 0,05% fosfolipidów), natomiast w żółtku jaja znajdują się one
w ilości około 20%. Wśród fosfolipidów dominują fosfatydylocholiny, czyli lecytyny, przy
czym w niektórych tłuszczach stanowią one ponad połowę ogólnej zawartości
fosfolipidów. Lecytyny wykrywa się na podstawie podobnych reakcji, jak w przypadku
tłuszczów właściwych, włączając w to wykrywanie choliny i fosforu. Inne fosfolipidy
(kefaliny, fosfatydyloseryny) identyfikuje się przez wykrywanie grupy aminowej
na podstawie reakcji z ninhydryną oraz obecności fosforu. Przeprowadza się w tym celu
reakcje jakościowe, bezpośrednio lub po rozdziale badanego tłuszczu
na chromatogramie cienkowarstwowym.

8.2.1. Wykrywanie glicerolu

Badanie przeprowadza się w sposób opisany dla lipidów właściwych (punkt 8.1.5).

8.2.2. Zmydlanie glicerofosfolipidów

Niewielką ilość próby badanej ogrzewa się w probówce z kilkoma cm3 10% roztworu
KOH aż do całkowitego rozpuszczenia. Zawartość probówki ochładza się, a następnie
postępuje w sposób opisany dla tłuszczów właściwych (punkt 8.1.1).

8.2.3. Wykrywanie choliny

Metoda chemiczna

Zasada oznaczenia
Podczas hydrolizy zasadowej lecytyn uwalniają się zarówno kwasy tłuszczowe jak
i cholina (rys. 33). W podwyższonej temperaturze cholina rozkłada się do trimetyloaminy
charakteryzującej się przykrym śledziowym zapachem.

H2C OH
+
HO CH2 CH2 N (CH3)3
-
+
N (CH3)3 +
OH H2C OH

trimetyloamina
Rys. 33. Wykrywanie choliny

127
Wykonanie
Niewielką ilość próby badanej przenieść do probówki, dodać kilka cm 3 10% roztworu
KOH lub NaOH, a następnie ogrzewać w łaźni wodnej. Podczas ogrzewania zbadać
zapach wydzielający się z probówki oraz odczyn par. W obecności trimetyloaminy
papierek lakmusowy przyłożony do wylotu probówki wskazuje odczyn zasadowy.

Odczynniki
1) próba badana (roztwór w mieszaninie chloroform – metanol (19:1)),
2) 10% roztwór KOH lub NaOH.

Metoda chromatografii cienkowarstwowej

Zasada oznaczenia
Cholinę jako składnik lecytyn można wykryć na chromatogramie cienkowarstwowym
przy użyciu odczynnika Dragendorffa. Tłuszcze zawierające cholinę pojawiają się jako
pomarańczowe lub pomarańczowoczerwone plamy na żółtym tle.

Wykonanie
Na płytkę pokrytą warstwą celulozy nanieść kilka (2-5) kropli proby badanej
w postaci okrągłej plamy lub pasma. Chromatogram wywołać bez rozwijania. W tym celu
odczynnik Dragendorffa wlać do małej kuwety i przeciągnąć w nim chromatogram.
Następnie chromatogram wysuszyć w temperaturze pokojowej i ogrzewać w temp. 60C
przez około 2 min.

Odczynniki
1) odczynnik Dragendorffa,
2) próba badana (roztwór w mieszaninie chloroform – metanol (19:1)).

8.3. Rozdział lipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej

Zasada oznaczenia
Do rozdziału lipidów stosuje się płytki pokryte żelem krzemionkowym
i mieszaniny rozwijające, w skład których wchodzą: eter etylowy, eter naftowy i kwas
octowy. Technika ta pozwala rozdzielić i uwidocznić na chromatogramie frakcję wolnych
kwasów tłuszczowych, triacylogliceroli, cholesterolu i jego estrów.
Wykonanie

128
Nanoszenie prób
Na płytkę z żelu krzemionkowego z gipsem, w odległości 1,5-2 cm od brzegu, nanieść
za pomocą mikropipety po 30 µl próby badanej i próby wzorcowej w postaci pasm. W tym
celu około 5 kropli roztworu nanosić na linię startu jedną obok drugiej tak, aby utworzyło
się pasmo o długości około 1 cm.

Rozwijanie chromatogramu
Na dno komory wlać mieszaninę rozwijającą na wysokość około 1 cm, aby miejsca
z naniesioną na płytkę próbą badaną znajdowały się nad powierzchnią płynu.
Chromatogram wstawić do komory i rozwijać techniką wstępującą do chwili, aż front
rozpuszczalnika przesunie się w pobliże górnego brzegu płytki. Rozwiniętą płytkę wyjąć
i wysuszyć pod wyciągiem.

Wywoływanie chromatogramu
Chromatogram spryskać mieszaniną wywołującą, a następnie ogrzewać w temperaturze
120-130C do pojawienia się plam o szaroniebieskim zabarwieniu.

Odczynniki
1) próba badana (50 mg badanego tłuszczu rozpuszcza się w 5 cm3 mieszaniny chloroform-metanol w
stosunku 2:1)
2) próba wzorcowa (po 30 mg kwasu stearynowego i trójpalmitynianu glicerolu oraz 1 mg cholesterolu
rozpuszcza się w 1 cm3 mieszaniny chloroform-metanol w stosunku 2:1),
3) mieszanina rozwijająca: eter naftowy-eter etylowy-kwas octowy (90:10:1),
4) mieszanina wywołująca: 1g molibdenianu amonowego rozpuszcza się w 8 cm3 wody, dodaje 3 cm3
stężonego kwasu solnego, 2 cm3 12 M kwasu nadchlorowego i 86 cm3 acetonu.

Zadania do wykonania
1. Przeprowadzić próby jakościowe charakterystyczne dla lipidów właściwych.
2. Sprawdzić obecność nienasyconych kwasów tłuszczowych w badanym tłuszczu.
3. Przeprowadzić wykrywanie choliny w fosfolipidach.
4. Przeprowadzić rozdział lipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej.

129
 KWASY NUKLEINOWE

1. Wprowadzenie
Kwasy nukleinowe obok białek są podstawowymi związkami azotowymi komórek.
Biorą one udział w tak ważnych procesach, jak synteza białek, podział komórek, czy
przenoszenie cech dziedzicznych. Nazwy kwasów nukleinowych pochodzą od cukru
– pentozy, która wchodzi w ich skład (rys.34). Na tej podstawie wyróżnia się dwa rodzaje
kwasów: kwas rybonukleinowy (RNA), w którym występuje D-ryboza i kwas
deoksyrybonukleinowy (DNA), zawierający 2-deoksy-D-rybozę (brak tlenu przy C-2).
HO CH2 OH HO CH2 OH
O O

OH OH OH H
Rys. 34. Ryboza i deoksyryboza

2. Nukleotydy – jednostki strukturalne kwasów nukleinowych

Podstawowymi elementami strukturalnymi kwasów nukleinowych są nukleotydy
zbudowane z:
 zasady azotowej (adenina, guanina, tymina, cytozyna, uracyl),
 pentozy (ryboza lub deoksyryboza),
 grup fosforanowych (jednej, dwóch lub trzech).
Zasady azotowe występujące w nukleotydach to pochodne puryny: adenina (A)
i guanina (G) oraz pochodne pirymidyny: cytozyna (C), tymina
NH2 O
(T) i uracyl (U) (rys. 35).
N H N
N N N
N1 6
5 7
8
2 4
3
9
N H2N N N
N N N
H H

puryna adenina guanina

NH2 O O
H CH3 H
N1 6
5 N N N
2 4
3
N O N O N O N
H H H
pirymidyna
cytozyna tymina uracyl

130
Rys. 35. Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych
Połączenie zasady azotowej z cząsteczką pentozy poprzez wiązanie N-glikozydowe
pomiędzy C-1 pentozy a N-1 zasady pirymidynowej lub N-9 zasady purynowej prowadzi
do powstania nukleozydu. Po dołączeniu do nukleozydu reszt fosforanowych powstaje
nukleotyd. Przykładowe wzory chemiczne nukleozydu i nukleotydu przedstawiono na
rys. 36.
NH2 NH2
N N
N N

N N N N
O O O
HO CH2 O P O P O P O CH2
O O- O- O- O

OH H OH H

nukleozyd nukleotyd
(deoksyadenozyna) (deoksyadenozyno-5’-trifosforan)
Rys. 36. Budowa nukleozydu i nukleotydu na przykładzie pochodnych adeniny

Najczęściej w nukleotydach reszta kwasu fosforowego reaguje z grupą wodorotlenową

przy C-5 pentozy, a związek taki nazywa się nukleozydo-5’-fosforanem. Nazwy i skróty
nukleozydów oraz nukleotydów monofosforanowych podano w tabeli 6. Monofosforany
mogą ulegać dalszej fosforylacji do di- i trifosforanów. Dla przykładu pochodne
fosforanowe adenozyny to: AMP (adenozynomonofosforan), ADP (adenozynodifosforan)
i ATP (adenozynotrifosforan).

Tabela 6. Zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy wchodzące w skład DNA i RNA

131
 kwas zasada nukleozyd nukleotyd
adenina (A) deoksyadenozyna dAMP: deoksyadenozyno-5’- monofosforan
guanina (G) deoksyguanozyna dGMP: deoksyguanozyno-5’- monofosforan
DNA
cytozyna (C) deoksycytydyna dCMP: deoksycytydyno-5’- monofosforan
tymina (T) deoksytymidyna dTMP: deoksytymidyno-5’- monofosforan
adenina (A) adenozyna AMP: adenozyno-5’-monofosforan
guanina (G) guanozyna GMP: guanozyno-5’-monofosforan
RNA
cytozyna (C) cytydyna CMP: cytydyno-5’-monofosforan
uracyl (U) urydyna UMP: urydyno-5’-monofosforan
Nukleotydy są monomerami, z których zbudowane są kwasy nukleinowe, a poza tym
pełnią również inne ważne funkcje, są np. składnikami koenzymów takich jak NAD,
NADP, FAD i koenzymu A, natomiast w postaci trifosforanów pełnią funkcję związków
makroergicznych. Uniwersalnym związkiem makroergicznym jest adenozyno-5’-
trifosforan, czyli ATP. Oznacza to, że w ATP jest wiązana energia, która powstaje podczas
utleniania składników pokarmowych. Energia ta jest następnie transportowana i uwalniana
podczas hydrolizy ATP. Organizm wykorzystuje ją niemal we wszystkich procesach
komórkowych, w tym tak istotnych jak utrzymanie temperatury ciała, ruch (skurcze
mięśni), transport cząsteczek, czy reakcje biosyntezy potrzebnych związków. ATP
powstaje z udziałem enzymu – syntazy ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej poprzez
połączenie ADP i Pi (grupa fosforanowa). Miejscem tej syntezy są centra energetyczne
komórek, czyli mitochondria. Tam podczas transportu elektronów przez łańcuch
oddechowy tworzy się tzw. gradient protonowy, NH
czyli
2
różnica stężenia protonów
po obu stronach błony mitochondrialnej. Następnie
N protony dążąc do
N
wyrównania stężenia wracają do wnętrza mitochondrium, jednak
N N
mogą one O O przechodzić
O jedynie przez specjalne kanały (błony
-O P
biologiczne nie są przepuszczalne
O P dlaO protonów),
P O CHktóre
2 są też częścią syntazy ATP.
O- O- O- O
Podczas przepływu trzech elektronów przez taki kanał powstaje jedna cząsteczka ATP.
Natomiast w ciągu 1 sekundy syntaza ATP może wytworzyć aż 100 takich cząsteczek. W
OH H
ten stosunkowo prosty sposób energia, która wydziela się podczas przepływu protonów
ATP

Pi + E ADP

PPi + E AMP

132
jest magazynowana w wysokoenergetycznych wiązaniach fosforanowych w ATP. Wzór
chemiczny ATP pokazano na rys. 37.

Rys. 37. Rozpad wysokoenergetycznych wiązań fosforanowych podczas hydrolizy ATP;

E oznacza wydzielającą się energię, Pi to reszta fosforanowa, PPi – reszta difosforanowa
Na rysunku 37 zaznaczono również wiązania fosforanowe, które ulegają rozpadowi
podczas uwalniania energii swobodnej (ΔGo’) w trakcie hydrolizy ATP odpowiednio do
adenozynodifosforanu (ADP) i ortofosforanu (Pi) lub do adenozynomonofosforanu (AMP)
i pirofosforanu (PPi). Ilość wydzielanej energii (ΔGo’) zależy od środowiska reakcji
i przyjmuje się, że dla obu wymienionych powyżej reakcji hydrolizy wynosi średnio – 30,6
kJ/mol. Pozostałe trifosforany  UTP, CTP, GTP są również związkami makroergicznymi,
ale w porównaniu z ATP pełnią bardziej specyficzne funkcje uczestnicząc tylko w
wybranych reakcjach biosyntezy.

3. Struktura i funkcje DNA

DNA jest zbudowany z nukleotydów zawierających deoksyrybozę oraz zasady
azotowe: adeninę, guaninę, cytozynę i tyminę. Nukleotydy połączone są wiązaniami
3’,5’-fosfodiestrowymi, w których deoksyryboza jednego nukleotydu w pozycji C-3 łączy
się poprzez grupę fosforanową z deoksyrybozą kolejnego nukleotydu w pozycji C-5. Tak
powstaje tzw. szkielet cukrowo-fosforanowy DNA, który posiada na jednym końcu wolną
resztę fosforanową (tzw. koniec 5’), a na drugim wolną grupę –OH przy C-3 pentozy (tzw.
koniec 3’). Uproszczony schemat budowy dwuniciowego DNA oraz przestrzenną strukturę
helisy pokazano na rys. 38. Kolejność nukleotydów w łańcuchu DNA (lub RNA) zapisuje

133
się zawsze zaczynając od końca 5’ i oznacza się ją skrótami zasad azotowych budujących
nukleotydy, gdyż tylko zasady są elementem zmiennym budowy nukleotydów.

koniec 3'

koniec 5' c mały

P
T A rowek
P
c c
P
G C duży
P rowek
c c
P
A T
P
c koniec 5'

koniec 3'

Rys. 38. Uproszczony schemat budowy dwuniciowego DNA oraz struktura helisy B-DNA
Polinukleotydowe łańcuchy DNA są bardzo długie, jedna cząsteczka może zawierać od
setek tysięcy do kilkuset miliardów par zasad (genom człowieka występujący w każdej
komórce organizmu zawiera ok. 3 x 109 par zasad, a jego długość po rozpleceniu
wynosiłaby ponad 2,5 m). Cząsteczka DNA ma charakterystyczną, bardzo regularną
strukturę przestrzenną. Jest to postać tzw. dwuniciowej helisy, która jest zbudowana
z dwóch łańcuchów polinukleotydowych skręconych wokół wspólnej osi. Te dwa łańcuchy
biegną w przeciwnych kierunkach (tzn. że na jednym z końców cząsteczki DNA znajduje
się koniec 5’ jednego łańcucha i koniec 3’ drugiego, rys. 38). Na zewnątrz helisy znajduje
się szkielet cukrowo-fosforanowy każdego łańcucha, natomiast struktura helisy jest
utrzymywana przez wiązania wodorowe pomiędzy zasadami, które występują w jej
wnętrzu. W wiązaniach wodorowych uczestniczy zawsze jedna zasada purynowa i jedna
zasada pirymidynowa, przy czym adenina jednego łańcucha wiąże się z tyminą drugiego
łańcucha za pomocą dwóch wiązań wodorowych, natomiast guanina łączy się z cytozyną
za pomocą trzech wiązań wodorowych. Wiązania wodorowe tworzą więc tzw.
komplementarne pary zasad azotowych. Sprawia to, że w cząsteczce DNA suma zasad
purynowych jest równa sumie zasad pirymidynowych, a stosunki ilościowe adeniny do
tyminy oraz guaniny do cytozyny są bliskie jedności. Możliwość tworzenia wiązań

134
wodorowych tylko pomiędzy określonymi zasadami pozwala na zachowanie regularnego
kształtu helisy oraz decyduje o tym, że połączone wiązaniami wodorowymi mogą być
tylko dwa komplementarne wobec siebie łańcuchy DNA. W najbardziej typowej postaci,
tzw. helisie B-DNA (rys. 38), płaszczyzny zasad są prawie prostopadłe do osi helisy,
odległość między zasadami wynosi 3,4 nm, a na jeden skręt helisy przypada 10
nukleotydów. Na powierzchni helisy B można wyróżnić dwa zagłębienia, zwane dużym
i małym rowkiem. W miejscach tych dochodzi często do specyficznych oddziaływań
różnych związków z DNA (np. mogą tam się wiązać białka, leki).
Kwas deoksyrybonukleinowy jest nośnikiem informacji genetycznej. Informacja ta jest
przenoszona przez zasady azotowe wchodzące w skład nukleotydów, których pozostałe
składowe, czyli grupy fosforanowe i cząsteczki pentoz pełnią rolę strukturalną.
Charakterystyczna kolejność ułożenia nukleotydów w nici DNA jest powielana podczas
podziału komórek i przekazywana komórkom potomnym, co jest podstawą przekazywania
informacji genetycznej. Podwajanie cząsteczek DNA zachodzi podczas procesu zwanego
replikacją, którego efektem jest synteza nowych nici DNA identycznych w stosunku do
wyjściowych. Przed replikacją, w określonym miejscu łańcucha DNA, tzw. miejscu ori,
następuje rozerwanie wiązań wodorowych i dochodzi do rozplecenia dwuniciowej
struktury helisy. Tworzą się tzw. widełki replikacyjne, w których wiąże się cała grupa
białek zaangażowanych w syntezę nowych nici DNA. Wśród nich znajduje się polimeraza
DNA, enzym, który włącza kolejne nukleotydy do powstającej nici DNA, przy czym
wiązany jest tylko taki nukleotyd, który jest komplementarny do nukleotydu znajdującego
się na nici macierzystej (tzw. matrycy). Polimeraza DNA wymaga do rozpoczęcia procesu
replikacji tzw. starterów. Są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA (zawierające ok. 30
nukleotydów), które są komplementarne do matrycy w miejscu, gdzie rozpoczyna się
replikacja. Dopiero po ich związaniu z matrycą polimeraza może przyłączać kolejne
nukleotydy i budować nowy łańcuch DNA. Rozplecenie helisy postępuje wraz
z przesuwaniem się polimerazy i w ten sposób dochodzi do wydłużania syntetyzowanego
łańcucha DNA. Obydwa łańcuchy rodzicielskie stanowią matrycę dla syntezy nowych,
komplementarnych nici zgodnie z regułą komplementarności par zasad. W ten sposób
w potomnej cząsteczce DNA znajduje się jeden łańcuch rodzicielski i jeden
nowozsyntetyzowany (rys. 39).

135
Rys. 39. Schemat replikacji DNA

Polimeraza DNA pełni też funkcję kontrolną, przed dołączeniem kolejnego nukleotydu
sprawdza, czy poprzedni nukleotyd jest prawidłowy. Jeżeli został popełniony błąd to
zostaje on natychmiast naprawiony (nieprawidłowy nukleotyd jest wycinany). Czasem
jednak polimeraza się „myli” i jest to jedną z przyczyn powstawania tzw. mutacji. Mutacje
wynikające ze zmiany jednego nukleotydu powstają też często w wyniku oksydacyjnych
uszkodzeń zasad azotowych, przy czym najbardziej podatna na takie uszkodzenia jest
guanina. Przyczyną tego typu uszkodzeń DNA są najczęściej reaktywne formy tlenu
– RFT (w ciągu jednej doby powstaje w organizmie człowieka około 10 4 uszkodzeń DNA
wywoływanych przez endogenne RFT, stąd komórki muszą posiadać bardzo wydajny
system naprawy takich uszkodzeń, szersze informacje na temat RFT zawarte są
w rozdziale „Witaminy”, punkt 6.2). Powstałe zmiany w strukturze zasad azotowych mogą
zmieniać specyficzność ich parowania się, np. uszkodzona guanina zamiast łączyć się
z cytozyną może tworzyć parę z tyminą lub nawet adeniną. Zmiana taka może zostać
utrwalona podczas replikacji zmienionej nici DNA i przekazywana komórkom potomnym.
Mutacje mogą prowadzić do poważnych zaburzeń funkcjonowania organizmu
(np. pojawienie się anemii sierpowatej w wyniku zmiany jednego nukleotydu w genie
β-globiny, czy rozwój chorób nowotworowych jako rezultat nagromadzenia się większej
liczby mutacji). Z drugiej strony zmiany w materiale genetycznym komórek, pod
warunkiem, że nie są śmiertelne i nie wywołują chorób, są podstawą zmienności

136
genetycznej. Dzięki temu organizmy mogą się przystosowywać do zmieniających się
warunków środowiska.
Wszystkie cząsteczki DNA określonej komórki tworzą jej genom. Na całym świecie
trwają prace badawcze, których celem jest odczytanie struktury genomu wybranych
organizmów (obiektem szczególnie intensywnych badań prowadzonych w ostatnim czasie
jest genom człowieka, który obecnie jest już prawie w pełni poznany). Rozszyfrowanie
genomu może być niezmiernie przydatne dla wyjaśnienia mechanizmów ekspresji
informacji genetycznej, czy zrozumienia przyczyn nieprawidłowości w funkcjonowaniu
określonych genów, które prowadzą do rozwoju chorób. Genom jądrowy organizmów
wyższych składa się z różnej liczby cząsteczek DNA, które są zwane chromosomami.
Na chromosomach zlokalizowane są geny. Gen to taki odcinek genomu, który w procesie
zwanym transkrypcją jest przepisywany na jedną cząsteczkę RNA. Transkrypcja jest
pierwszym etapem odczytywania (inaczej ekspresji) informacji genetycznej. Część
z genów koduje tylko cząsteczki RNA i na etapie transkrypcji kończy się ich ekspresja.
Jednak większość genów zawiera informację dotyczącą struktury białek, w przenoszeniu
której pośredniczą cząsteczki RNA. Są one wykorzystywane jako matryce w procesie
syntezy białek, zwanym translacją. Schematycznie przepływ informacji genetycznej od
DNA (kolejność nukleotydów) poprzez RNA (kolejność nukleotydów) do białka
(kolejność aminokwasów) przedstawiono na rys. 40.

transkrypcja translacja
DNA RNA białko

Rys. 40. Schemat ekspresji informacji genetycznej

Sposób zapisania informacji o budowie określonego białka (sekwencja aminokwasów)

w postaci kolejności nukleotydów w genie tego białka nosi nazwę kodu genetycznego.
W odczytanie kodu genetycznego zaangażowane są m.in. różne rodzaje RNA, co zostanie
przedstawione w kolejnym punkcie dotyczącym budowy i funkcji RNA.

4. Struktura, rodzaje i funkcje RNA

RNA, podobnie jak DNA, jest zbudowany z nukleotydów połączonych wiązaniami
3’,5’-fosfodiestrowymi. RNA różni się od DNA rodzajem cukru, tj. zamiast deoksyrybozy
zawiera rybozę i jedną zasadą pirymidynową, tj. zamiast tyminy występuje uracyl. Liczba
nukleotydów w łańcuchach RNA jest mniejsza i waha się od 75 do wielu tysięcy. RNA ma

137
również inną strukturę przestrzenną niż DNA. Najczęściej cząsteczki RNA są
jednoniciowe, ale mogą w nich występować też regiony dwuniciowe tworzące się
w wyniku łączenia komplementarnych zasad z różnych odcinków tego samego łańcucha
(w tym przypadku uracyl tworzy pary z adeniną). Prowadzi to do powstawania odcinków
o strukturze helisy w jednoniciowej cząsteczce RNA (przykładem jest tRNA posiadający
w cząsteczce kilka regionów helikalnych, które stabilizują jego skomplikowaną strukturę
przestrzenną, przypominającą kształtem liść koniczyny).
Cząsteczki RNA są syntetyzowane na matrycy DNA w procesie zwanym transkrypcją.
Jak już zaznaczono wcześniej część z powstających cząsteczek RNA uczestniczy
w procesie syntezy białek, czyli translacji. Należą do nich 3 rodzaje RNA: informacyjny,
zwany też matrycowym (mRNA), rybosomalny (rRNA) i transportujący (tRNA).
Umożliwiają one odczytanie informacji dotyczącej budowy białka zapisanej w genie
kodującym to białko. Informacja ta zawarta jest w jądrze komórkowym, natomiast białka
powstają w cytoplazmie. Łącznikiem przenoszącym informację genetyczną o strukturze
konkretnego białka jest mRNA (ang. messanger), stąd jego nazwa informacyjny kwas
rybonukleinowy. Można stwierdzić, że funkcja RNA w procesie biosyntezy białka polega
na przetłumaczeniu informacji genetycznej z języka nukleotydów na język aminokwasów.
Cząsteczki mRNA, które powstają w jądrze komórki są kopią genu kodującego jeden
łańcuch polipetydowy. Po przedostaniu się do cytoplazmy stanowią matrycę dla syntezy
białka (stąd druga nazwa tego kwasu to matrycowy RNA). Informacja w matrycy RNA jest
zakodowana w postaci kolejnych trójek nukleotydów. Każda taka trójka stanowi tzw.
kodon, który koduje odpowiedni aminokwas. Każdy z dwudziestu aminokwasów
budujących białka posiada swój kodon na matrycy (często jeden aminokwas jest kodowany
przez kilka różnych kodonów). Aby na podstawie informacji zawartej w mRNA mogło
powstać określone białko muszą w tym uczestniczyć też dwa kolejne wymienione
poprzednio rodzaje kwasów RNA. Cząsteczki rRNA są podstawowym składnikiem
rybosomów, czyli organelli komórkowych, na których odbywa się proces translacji.
Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, które w momencie rozpoczęcia translacji
(tzw. inicjacja) obejmują nić mRNA. Kolejne zawarte na matrycy RNA trójki zasad
stanowią kodony dla określonych aminokwasów. Do kodonów przyłączają się określone
cząsteczki tRNA, które zawierają tzw. antykodony, czyli trójki nukleotydów
komplementarne do kodonów. Do jednego z końców mają one dołączone aminokwasy
(cząsteczki tRNA, posiadające określone antykodony wiążą tylko konkretne aminokwasy).
W ten sposób cząsteczki tRNA przenoszą w miejsce syntezy białka odpowiednie

138
aminokwasy kodowane przez kolejne kodony. Następnie dochodzi do powstania wiązania
peptydowego pomiędzy dwoma dostarczonymi aminokwasami, uczestniczą w tym
cząsteczki rRNA budujące rybosom. Po utworzeniu wiązania peptydowego rybosom
przesuwa się o kolejny kodon, a cząsteczka tRNA z komplementarnym antykodonem
transportuje następny aminokwas, który jest przyłączany do wydłużającego się łańcucha
polipeptydowego (tzw. etap elongacji). Gdy białko zostanie w pełni zsyntetyzowane
rybosom odłącza się i proces translacji ulega zakończeniu (tzw. terminacja). W ten sposób,
dzięki cząsteczkom RNA informacja genetyczna dotycząca struktury określonego białka
z języka nukleotydów zostaje przetłumaczona na język aminokwasów.
Oprócz wymienionych rodzajów RNA w komórkach występują też inne, które
w ostatnim okresie wzbudzają bardzo duże zainteresowanie. Na podstawie wyników
najnowszych badań szacuje się, że ponad trzy czwarte cząsteczek RNA w komórce nie
bierze bezpośrednio udziału w syntezie białek, ale spełnia funkcje regulujące aktywność
całego genomu. Wśród nich bardzo interesujące są krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA
tzw. siRNA, które zawierają przeważnie 21 nukleotydów. Uczestniczą one w stosunkowo
niedawno odkrytym zjawisku interferencji RNA (RNAi). Cząsteczki siRNA potrafią
precyzyjnie odnaleźć określone fragmenty DNA lub RNA i zablokować ekspresję wielu
genów poprzez tzw. „wyciszenie” (ang. silencing). Zablokowanie genu poprzez zjawisko
interferencji RNA trwa na ogół przez 2–3 dni, po czym gen odzyskuje swą aktywność.
Można w związku z tym w sposób celowy, poprzez podanie odpowiednich cząsteczek
siRNA wywoływać „wyciszanie” określonych genów. Stanowi to przełom w badaniach
funkcji genów, gdyż możliwe jest wyłączenie określonych genów i obserwowanie
uzyskanych efektów na dorosłych osobnikach, w tym i na ludziach. Ze zjawiskiem
interferencji RNA wiąże się duże nadzieje w rozwoju badań nad przyczynami rozwoju
chorób nowotworowych oraz nowymi możliwościami ich leczenia.
W komórkach występują też cząsteczki RNA, zwane rybozymami, które zachowują się
podobnie jak enzymy. Wykazują one właściwości katalityczne, biorą udział w rozcinaniu
cząsteczek RNA. Przypuszcza się, że to właśnie cząsteczki RNA były pierwotnymi
katalizatorami reakcji biochemicznych, a dopiero później zostały prawie całkowicie
zastąpione przez białka.
Co ciekawe, duża grupa wirusów, w tym również atakujących człowieka, posiada
informację genetyczną zapisaną nie w formie DNA, a w postaci jedno- lub dwuniciowych
cząsteczek RNA. Tak jest w przypadku wirusa opryszczki, HIV, całej gamy onkogennych
retrowirusów, czy popularnego wirusa grypy. Ten ostatni zawiera w swoim wirionie

139
8 pojedynczych nici RNA, które często rekombinują (wymieniają się fragmentami). Jest to
jedną z przyczyn dużej zmienności właściwości immunologicznych tego wirusa
i związanych z tym trudności z opracowaniem skutecznej szczepionki.

5. Badanie kwasów nukleinowych

Analiza kwasów nukleinowych zyskuje coraz większe zainteresowanie w wielu
dziedzinach badawczych. Największe możliwości stwarzają metody analizy, których celem
jest wykrycie określonych fragmentów, inaczej specyficznych sekwencji kwasów
nukleinowych. Metody takie mogą mieć zastosowanie w badaniu jakości żywności, w tym
do wykrywania zanieczyszczeń mikrobiologicznych, modyfikacji genetycznych, czy
określania autentyczności produktów spożywczych.
W celu wykrycia określonych fragmentów DNA można wykorzystać metody
hybrydyzacyjne (np. hybrydyzacja Southern-blot). Wykorzystuje się w nich sondy
genetyczne, czyli krótkie jednoniciowe fragmenty DNA komplementarne do
poszukiwanych sekwencji. Jeżeli w próbie badanej występuje poszukiwany fragment DNA
to sonda wiąże się z nim za pomocą wiązań wodorowych na zasadzie komplementarności
zasad azotowych, czyli dochodzi do reakcji hybrydyzacji pomiędzy tymi odcinkami DNA.
Aby można było sprawdzić, czy doszło do hybrydyzacji stosuje się specjalne znakowanie
sond. Obecnie najczęściej do sondy wiąże się znaczniki fluorescencyjne (próbka świeci)
lub enzymy, które katalizują reakcje powstania barwnego produktu (po zalaniu roztworem
zawierającym substrat dla enzymu dochodzi do pojawienia się określonej barwy).
Największy rozwój w ostatnim czasie mają techniki oparte o tzw. reakcję PCR
(łańcuchowa reakcja polimerazy, ang. polimerase chain reaction). W porównaniu do
technik hybrydyzacyjnych charakteryzują się znacznie krótszym czasem analizy (kilka
godzin). Stosuje się je w szybkich testach analitycznych, które mają obecnie zastosowanie
głównie w diagnostyce medycznej, medycynie sądowej czy ochronie środowiska. Jednak
coraz powszechniej metody PCR są wykorzystywane w badaniu jakości żywności, gdzie są
m.in. podstawowym narzędziem umożliwiającym wykrycie genetycznych modyfikacji.
Materiał genetyczny, który ma być analizowany z wykorzystaniem różnorodnych
technik (PCR, hybrydyzacja, elektroforeza, itp.) musi zostać na wstępie wyizolowany
z badanego materiału biologicznego, a następnie powinien zostać oczyszczony.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono podstawowe zasady izolacji oraz badania
czystości i ilości wyizolowanych kwasów nukleinowych. Poza tym zamieszczono

140
charakterystykę wybranych technik badania kwasów nukleinowych, takich jak
elektroforeza i reakcja PCR, mających największe zastosowanie w badaniu żywności.

5.1. Izolacja DNA

W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy kwasów nukleinowych należy je
wyizolować z badanego materiału biologicznego (może to być np. próbka żywności).
Celem tego etapu jest uzyskanie stosunkowo znacznych ilości czystego preparatu DNA,
który dodatkowo zawiera długie łańcuchy, czyli nie uległ degradacji.
Ogólnie można przyjąć, że w pierwszym etapie izolacji należy zniszczyć struktury
otaczające komórki, aby doszło do wydostania się ich zawartości, w tym kwasów
nukleinowych na zewnątrz. Prowadząc izolację DNA z różnych materiałów biologicznych
(bakterie, tkanki roślinne lub zwierzęce), zależnie od budowy „osłon komórkowych”,
stosuje się nieco odmienne zabiegi. Podczas izolacji DNA z bakterii wykorzystuje się
lizozym, który niszczy strukturę bakteryjnej ściany komórkowej. Natomiast izolację DNA
z tkanek zwierzęcych lub roślinnych z reguły przeprowadza się wykonując dokładne
rozcieranie próby (homogenizację) w odpowiednim roztworze, tzw. buforze do lizy. Bufor
ten często zawiera detergent – siarczan dodecylu sodu (SDS) ułatwiający lizę komórek.
Musi też zawierać czynniki hamujące aktywność nukleaz, czyli enzymów degradujących
DNA (najczęściej stosowany jest EDTA, związek chelatujący jony metali, które są
niezbędne dla aktywności katalitycznej nukleaz).
DNA występuje w komórkach w ścisłym połączeniu z białkami, dlatego, aby uzyskać
czyste preparaty kwasów nukleinowych należy oddzielić je od białek. Ten proces ułatwia
również SDS, który niszcząc oddziaływania jonowe powoduje dysocjację kompleksów
DNA z białkami. Podobny efekt daje zastosowanie roztworów soli o wysokim stężeniu
(np. 5-6 M NaCl), które dodatkowo wytrącają białka. Lizat często traktuje się też enzymem
proteolitycznym – proteinazą K. Najczęściej jednak ostatecznym etapem oczyszczania
DNA jest ekstrakcja białek z użyciem fenolu i chloroformu (tzw. fenoliza),
rozpuszczalników które wytrącają białko. Należy podkreślić, że izolacja DNA
z zastosowaniem fenolu i chloroformu jest jak dotychczas najbardziej wydajną procedurą
oczyszczania kwasów nukleinowych. Użycie tych rozpuszczalników jest konieczne
zwłaszcza wtedy, gdy badany materiał biologiczny zawiera znaczne ilości białka
(np. hodowla bakterii). Czasami podczas fenolizy stosuje się niewielki dodatek alkoholu
izoamylowego, co redukuje pienienie i stabilizuje granicę faz, na której gromadzi się
wytrącone białko. Stosując metodę fenolizy uzyskuje się preparaty DNA o wysokim

141
stopniu czystości, a jednocześnie o dobrej jakości (długie fragmenty). Jeżeli wykonujemy
izolację DNA z tkanek o dużej zawartości RNA (np. z kiełkujących nasion) lub chcemy
uzyskać całkowite usunięcie RNA, wtedy prowadzi się trawienie lizatu przy pomocy
enzymu rybonukleazy.
Ostatnim etapem izolacji jest wytrącenie DNA. Celem jest uzyskanie preparatu
o wysokim stężeniu, pozbawionego możliwie w jak największym stopniu zanieczyszczeń
(w tym soli, detergentów, innych niskocząsteczkowych związków). DNA wytrąca się
z roztworów o dużym stężeniu soli (3 M octan sodu, 5 M NaCl) za pomocą etanolu lub
izopropanolu (izopropanol nie wytrąca RNA oraz krótkich fragmentów DNA,
otrzymywane preparaty są czyste, ale dochodzi do większych strat DNA). Pojawiają się
wtedy białe „niteczki” strątu, które można oddzielić przez wirowanie lub, gdy jest ich
znaczna ilość, nawinąć na bagietkę. Wytrącony DNA oczyszcza się jeszcze poprzez
kilkukrotne przemycie etanolem, a następnie można go analizować lub przechowywać
w stanie zamrożenia.
Na rynku są obecnie dostępne różne zestawy służące do izolacji DNA. Wykorzystuje
się w nich specjalne nośniki umieszczone najczęściej na filtrach, które mają zdolność
wiązania DNA. Związany na nośniku preparat przepłukuje się w celu oczyszczenia.
Następnie można go uwolnić poprzez zastosowanie specjalnych odczynników
wymywających. W ten sposób uzyskuje się preparaty charakteryzujące się dużym
stopniem czystości, jednak podczas kolejnych zabiegów izolacji dochodzi do znacznych
strat DNA.
Ocenę ilości oraz czystości wyizolowanych prób DNA prowadzi się z wykorzystaniem
metod spektrofotometrycznych. Do określenia długości fragmentów, czyli sprawdzenia,
czy nie nastąpiła degradacja kwasów nukleinowych, najbardziej przydatna jest
elektroforeza.

5.2. Izolacja RNA

Procedura postępowania podczas izolacji RNA jest zbliżona do opisanej procedury
izolacji DNA. Jednak ze względu na powszechność występowania rybonukleaz (enzymów
degradujących RNA) należy stosować środki zabezpieczające RNA przed zniszczeniem.
W tym celu szkło oraz odczynniki przeznaczone do izolacji RNA powinny być myte
i przygotowywane z dodatkiem dietylopirowęglanu (DEPC). Związek ten hamuje działanie
rybonukleaz, ale jest też silnym mutagenem. Całą procedurę izolacji RNA powinno się
wykonywać w rękawiczkach, gdyż rybonukleazy są obecne na dłoniach (w zasadzie

142
powinno się też mieć nałożoną maseczkę, aby wydychane powietrze nie było źródłem
zanieczyszczeń). Do wytrącenia wyizolowanego RNA stosuje się 8 M roztwór chlorku litu.
Ocenę ilości oraz czystości wyizolowanych prób RNA prowadzi się z wykorzystaniem
metod spektrofotometrycznych.

5.3. Metody spektrofotometryczne w analizie nukleotydów i kwasów nukleinowych

Zasady purynowe i pirymidynowe, zarówno w postaci wolnej jak i związanej w formie
nukleozydów, nukleotydów oraz kwasów nukleinowych pochłaniają światło w zakresie fal
o długości 210-300 nm. W związku z tym pomiary absorbcji światła są często
wykorzystywane w analizie tych związków.
Metody spektrofotometryczne są bardzo przydatne podczas oznaczania czystości oraz
stężenia wyizolowanego materiału genetycznego. Stopień czystości DNA lub RNA określa
się poprzez wykonanie pomiarów stopnia pochłaniania światła o długościach fal 230, 260
i 280 nm. Maksimum absorpcji światła przez kwasy nukleinowe przypada dla λ = 260 nm,
natomiast podstawowe zanieczyszczenia – białka, pochłaniają najintensywniej fale
o długości 280 nm. Zbyt duża wartość współczynnika absorpcji przy długości fal 280 nm
(A280) wskazuje na możliwość występowania białek. Przy 230 nm światło absorbują
zanieczyszczenia takie jak fenole, węglowodory i inne związki aromatyczne, w mniejszym
stopniu białka. Po wykonaniu pomiarów spektrofotometrycznych wylicza się wartości
stosunków: A230/A260 oraz A260/A280 i na tej podstawie określa czystość prób kwasów
nukleinowych. Dla czystych preparatów wartość A230/A260 nie może przekraczać 0,5,
a wartość A260/A280 dla DNA powinna wynosić powyżej 1,7 (dla RNA powyżej 1,8). Jeżeli
badana próba jest czysta, tzn. spełnia powyższe wymagania to na podstawie pomiaru przy
długości fali 260 nm można obliczyć stężenie kwasów nukleinowych. Wykorzystuje się
wtedy zależność, że w kuwecie o grubości warstwy 1 cm wartość współczynnika
absorbancji przy λ = 260 nm wynosi 1 (A260 = 1) dla roztworów o stężeniu:
50 μg/cm3 dla dwuniciowego DNA (dsDNA)
37 μg/cm3 dla jednoniciowego DNA (ssDNA)
40 μg/cm3 dla RNA
30 μg/cm3 dla oligonukleotydów.

Często ilość kwasów nukleinowych jest określana z użyciem jednostek OD

(wyrażających tzw. gęstość optyczną), przy czym 1 OD to stężenie odpowiadające

143
wymienionym powyżej wartościom (np. 1 OD oznacza stężenie dsDNA równe 50 μg/cm 3,
a np. 0,5 OD to odpowiednio 25 μg/cm3, itp.).
Natomiast w celu obliczenia stężenia molowego [μmol/cm3] można wykorzystać
wzory:
dla dsDNA c = A260 / 0,020
dla ssDNA c = A260 / 0,027
dla ssRNA c = A260 / 0,025
dla oligonukletydów c = A260 x 100 / 1,5 x nA + 0,71 x nC + 1,2 x nG + 0,84 x nT

gdzie:
A260 - absorbancja mierzona przy długości fali 260 nm
nA, nC, nG, nT odpowiadają liczbie poszczególnych nukleotydów (A, C, G, T) wchodzących w skład
badanego oligonukleotydu

Pomiary absorbancji mogą również służyć do identyfikacji nukleotydów na podstawie

wykrycia odpowiednich zasad azotowych wchodzących w ich skład. Widma absorpcji
w UV poszczególnych zasad purynowych i pirymidynowych w małym stopniu różnią się
położeniem maksimów, natomiast wyraźnie intensywnością pochłaniania, czyli
wysokością krzywych absorpcji. W celu identyfikacji nukleotydów pomiary absorbancji
przeprowadza się przy różnych długościach fal i wyraża jako stosunki: A 250/A260, A280/A260,
A290/A260. Każdą z zasad azotowych wchodzących w skład kwasów nukleinowych
charakteryzuje inna kombinacja wyliczonych wartości. Analizę spektralną można stosować
tylko wówczas, gdy w roztworze znajduje się tylko jedna zasada lub nukleotyd. Przed
badaniem mieszaninę związków rozdziela się chromatograficznie. Stężenie
zidentyfikowanego nukleotydu można obliczyć na podstawie wartości współczynnika
absorbancji - A260 wykorzystując prawo Lamberta–Beera.

5.4. Elektroforeza w badaniu kwasów nukleinowych

Elektroforeza umożliwia rozdział fragmentów kwasów nukleinowych różniących się
długością łańcucha oraz precyzyjne oznaczenie ich masy cząsteczkowej wyrażonej jako
ilość par zasad (pz). Rozdział elektroforetyczny prowadzi się w nośnikach stałych. Małe
fragmenty kwasów nukleinowych rozdziela się na żelach poliakrylamidowych. Do analizy
większych cząsteczek wykorzystuje się żele agarozowe o różnym stopniu usieciowania
w zależności od stężenia agarozy. Najczęściej stosuje się żele zawierające od 0,5 do 3%
agarozy. Mają one postać prostokątów o długości kilkunastu centymetrów i grubości
warstwy agarozy wynoszącej od 0,5 do 1 cm. Badane próby nanosi się do specjalnie

144
przygotowanych zagłębień w żelu. Po obu stronach naczynia do elektroforezy
umieszczone są elektrody podłączone do źródła prądu stałego. Łącznikiem, który
przewodzi prąd jest odpowiedni bufor, w którym umieszcza się żel. Stosowane bufory
mają pH ok. 8, gdyż w tych warunkach cząsteczki kwasów nukleinowych mają ładunek
ujemny i poruszają się w kierunku dodatnio naładowanej anody. Usieciowany żel stanowi
przeszkodę dla poruszających się cząsteczek, które w zależności od wielkości wędrują
w nim z różną szybkością. Mniejsze fragmenty migrują w żelu szybciej, natomiast większe
przechodzą przez żel z trudem i w związku z tym poruszają się powoli. Żel stanowi tzw.
sito molekularne, przez co umożliwia dokonanie rozdziału cząsteczek różniących się
wielkością. Po zakończeniu elektroforezy żel z rozdzielonymi fragmentami umieszcza się
w roztworze zawierającym barwnik łączący się z DNA, najczęściej bromek etydyny
i następnie obserwuje w świetle UV (często barwnik dodaje się już podczas
przygotowywania żelu, wtedy nie trzeba wykonywać oddzielnego etapu wybarwiania).
Dzięki temu, że barwnik ten emituje światło, rozdzielone fragmenty DNA różniące się
długością (ilością nukleotydów w łańcuchu) są widoczne w żelu w postaci prążków. Każdy
prążek to zestaw fragmentów kwasów nukleinowych o identycznej długości.
Cząsteczki kwasów nukleinowych wędrują w żelu z szybkością odwrotnie
proporcjonalną do logarytmów ich mas cząsteczkowych. W celu wyznaczenia masy
cząsteczkowej (ilości par zasad) fragmentów kwasów nukleinowych stosuje się tzw.
markery wielkości. Są to wzorce zawierające mieszaninę fragmentów DNA o znanej
długości. Jeżeli taki wzorzec zostanie naniesiony obok próby badanej, to po elektroforezie
poprzez porównanie położenia prążków można precyzyjnie ustalić wielkość fragmentów
DNA w analizowanej próbie (rys. 41).

1 2 3 4 5

3 kpz
2 kpz 2165

1 kpz 1012
889

500 pz 536

378
300 pz

Rys. 41. Schemat obrazu żelu agarozowego po rozdziale elektroforetycznym fragmentów

kwasów nukleinowych różniących się długością (masą cząsteczkową). Ścieżki 1 i 5
zawierają wzorzec masy cząsteczkowej (strzałkami wskazano fragmenty DNA we wzorcu

145
i podano ich długość, czyli ilość par zasad (pz); kpz oznacza kilo par zasad, czyli 1000 pz).
Ścieżki 2, 3 i 4 zawierają analizowane fragmenty DNA różniące się ilością par zasad

Cząsteczki dwuniciowego DNA wędrują w żelu z różną szybkością w zależności od ich

konformacji. W roztworach mają one najczęściej postać superskręconej zamkniętej formy
kolistej, formy liniowej i przeciętej formy kolistej. Najszybciej porusza się forma kolista,
natomiast najwolniej migruje postać kolista przecięta.
Metodą elektroforezy można oznaczyć też jakość oraz stężenie wyizolowanego
materiału genetycznego. Jeżeli badane próby DNA mają powyżej 30 000 par zasad,
w skrócie 30 kpz (ustalone po porównaniu z markerem wielkości) oraz migrują w żelu
w postaci zwartych prążków bez widocznych smug to można sądzić, że preparat jest dobrej
jakości, czyli jest czysty i nie uległ fragmentacji podczas stosowanych zabiegów.
Dodatkowo na podstawie intensywności uzyskanych prążków można ustalić stężenie
kwasów nukleinowych w badanych próbach. W tym celu obok próby badanej nanosi się
wzorce ilości DNA, czyli próbki o znanym stężeniu. Ilość DNA w próbie badanej ocenia
się po porównaniu intensywności świecenia (lub barwy) prążka próby z prążkami
wzorcowymi. Z żelu można również wyciąć określone prążki, wyizolować z nich kwasy
nukleinowe i poddać je dalszej analizie, np. z wykorzystaniem PCR.

5.5. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

Łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. polimerase chain reaction, PCR) została
opracowana w 1987 r. Sześć lat później główny autor tej metody, K. Mullis, otrzymał za
swoje odkrycie nagrodę Nobla. Metoda ta okazała się być przełomem w analizie kwasów
nukleinowych. Umożliwia ona wykrycie określonych fragmentów (specyficznych
sekwencji) kwasów nukleinowych w ciągu kilku godzin. Jest to niezmiernie istotne
w wielu dziedzinach badawczych, szczególnie w diagnostyce medycznej. Metoda ta jest
również przydatna w analizie żywności, gdzie może być wykorzystywana do wykrywania
zanieczyszczeń mikrobiologicznych oraz genetycznych modyfikacji (GM). Podstawą
wykrycia GM jest stwierdzenie w próbie DNA wyizolowanego z żywności fragmentów,
które są wprowadzane podczas modyfikacji genetycznych. Obecnie techniki PCR są
w zasadzie jedynymi metodami, które są wykorzystywane do oznaczania zawartości
genetycznie zmodyfikowanych składników w próbach żywności.

146
 Podstawą technik PCR jest specyficzna amplifikacja (powielenie) określonych
odcinków DNA przy użyciu polimerazy DNA. Podczas reakcji stosuje się startery dla
polimerazy (porównaj, opis procesu replikacji DNA, punkt 3) oraz komplet nukleotydów
niezbędnych do syntezy nici DNA. Używając starterów, czyli jednoniciowych odcinków
DNA zawierających przeważnie 18 – 28 nukletydów o określonej sekwencji,
komplementarnej do matrycy można z użyciem reakcji PCR powielać konkretne fragmenty
DNA. Jeżeli w badanej próbie będzie się znajdował poszukiwany fragment, to po
zastosowaniu dwóch starterów (z których jeden jest komplementarny do jednego końca
tego fragmentu, a drugi do końca przeciwległego) po reakcji PCR uzyskamy powielony
w dużej ilości przez polimerazę poszukiwany fragment DNA (trzeba oczywiście znać
sekwencję nukleotydów przynajmniej na końcach poszukiwanych odcinków DNA).
Każdy cykl trwa zaledwie kilka minut i zawiera trzy kolejne etapy (rys. 42). Na
początku jest to denaturacja matrycy (badanego DNA), następnie do jednoniciowych
fragmentów DNA przyłączają się startery (ang. anealing) oraz ostatecznie polimeraza
prowadzi syntezę nowych nici na matrycy (tzw. elongacja). Jest to schemat zbliżony do
replikacji, z tym że powiela się nie cała cząsteczka DNA tylko określony jej fragment
(zawarty pomiędzy starterami). Całym procesem steruje nie system komórkowy
zaangażowany w replikację, a prosty zabieg, którym jest cyklicznie zmieniająca się
temperatura reakcji (w związku z tym aparat, w którym wykonuje się reakcję PCR jest
zwany termocyklerem). Denaturacja jest prowadzona w temperaturze ok. 90–95oC,
wiązanie starterów w temp. 50-65oC, a synteza fragmentu DNA w temp. 68-72 oC. Te
wysokie temperatury wymagają stosowania termostabilnych polimeraz DNA.

denaturacja DNA przy³¹czenie synteza nowych

(rozdzielenie nici) starterów nici DNA
dwuniciowy DNA
(matryca)

ETAP 1 ETAP 2 ETAP 3

Rys. 42. Etapy łańcuchowej reakcji polimerazy

147
 Reakcja PCR obejmuje przeważnie 30 powtarzających się cykli (w każdym cyklu
dochodzi do podwojenia się matrycy (rys. 43), czyli po 30-stu cyklach ich liczba będzie
wynosiła 230 = 107 374 824).

itd...

pierwszy cykl drugi cykl trzeci cykl trzydziesty cykl

2 1 =2 2 2 =4 2 3 =8 2 30
= 107 374 824
cz¹steczki DNA cz¹steczki DNA cz¹steczek DNA cz¹steczek DNA

Rys. 43. Wykładniczy wzrost ilości fragmentów DNA amplifikowanych w trakcie

łańcuchowej reakcji polimerazy

Po wykonaniu reakcji PCR można sprawdzić poprzez wykonanie elektroforezy, czy

w analizowanej próbie były obecne poszukiwane fragmenty DNA. Jeżeli startery odnalazły
komplementarną matrycę, to podczas PCR doszło do jej amplifikacji i po wykonaniu
elektroforezy będą widoczne wyraźne prążki na żelu. Wielkość uzyskanych fragmentów
można określić po porównaniu położenia prążków w próbie badanej do ścieżki, w której
naniesiono marker wielkości DNA (punkt 5.4). Jeżeli znamy wielkość poszukiwanych
fragmentów, to łatwo można w ten sposób stwierdzić ich obecność w próbie badanego
materiału biologicznego.
W zależności od oczekiwanych rezultatów analitycznych istnieją bardzo różne
modyfikacje reakcji PCR. Największe zastosowanie w analizie żywności ma tzw. reakcja
PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR), która umożliwia precyzyjną ocenę
ilości poszukiwanych fragmentów DNA.
Teoretycznie wystarczy jedna kopia DNA, aby mogło dojść do jej powielenia
i uwidocznienia na żelu po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego. Ta niesamowita
czułość metody PCR może być przyczyną fałszywie dodatnich wyników, dlatego obok
próby badanej wykonuje się też analizy dodatkowe, których celem jest wykluczenie

148
wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Te ostatnie mogą być spowodowane
zanieczyszczeniami, które hamują aktywność polimerazy DNA.
Metoda PCR może też być przydatna do powielenia bardzo niewielkich ilości materiału
genetycznego, np. znajdującego się w ślinie na niedopałku papierosa, który znaleziono na
miejscu zbrodni. „Namnożony” po wykonaniu łańcuchowej reakcji polimerazy materiał
genetyczny może być następnie poddany szczegółowej analizie kryminalistycznej.

5.6. Wykrywanie pentoz wchodzących w skład kwasów nukleinowych

Wykrywanie kwasów nukleinowych lub nukletydów można też prowadzić na
podstawie występowania odpowiedniej pentozy (rybozy lub deoksyrybozy). Do
wykrywania i ilościowego oznaczania RNA można wykorzystać próbę Biala, czyli reakcję
rybozy z orcyną, w której powstaje zielony kompleks o maksimum absorpcji przy długości
fali 665 nm. Natomiast oznaczanie deoksyrybozy w DNA prowadzi się na podstawie
reakcji z difenyloaminą, w której tworzy się ciemnoniebieski produkt z maksimum
absorpcji przy długości fali 595 nm.

6. Zagadnienia
1. Budowa nukleotydów. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe nukleotydów.
2. Budowa i funkcje DNA. Replikacja DNA.
3. Budowa, rodzaje i funkcje RNA. Ekspresja informacji genetycznej.
4. Izolacja kwasów nukleinowych. Badanie czystości i oznaczanie ilości DNA i RNA.
5. Wykorzystanie elektroforezy w analizie kwasów nukleinowych.
6. Metody spektrofotometryczne w badaniu nukleotydów i kwasów nukleinowych.
7. Zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w badaniu kwasów nukleinowych.
7. Część eksperymentalna
7.1. Izolacja DNA
7.1.1. Izolacja DNA z komórek bakterii

Zasada metody
Podczas izolacji DNA z bakterii stosuje się lizozym. Jest to enzym, który prowadzi
hydrolizę wiązań glikozydowych w polisacharydach ściany komórkowej bakterii.
Uzyskanie czystych preparatów DNA z hodowli bakteryjnych, ze względu na dużą
zawartość białka, wymaga stosowania mieszaniny fenolu i chloroformu podczas

149
odbiałczania lizatów. W opisanej poniżej procedurze DNA wytrąca się za pomocą etanolu
schłodzonego do temp. –20°C.

Wykonanie
Z płynnej hodowli bakterii (np. Escherichia coli) należy pobrać 1 cm3 i przenieść do
probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 cm3. Osad bakterii odwirować przez 3 minuty
przy szybkości 5000 obr./min. Supernatant (roztwór znad osadu) należy odrzucić, a osad
zawiesić w 200 μl buforu do lizy (100 mM EDTA z dodatkiem 150 mM NaCl, pH 8,0),
dodać 10 μl lizozymu, wymieszać i inkubować w temp. 37°C przez 15 minut.
Następnie dodać 20 μl 10% SDS i 1 μl proteinazy K, wymieszać i inkubować w temp.
56°C przez 15 minut. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 100 μl fenolu i 100
μl chloroformu. Całość wytrząsać przez ok. 30 sekund do uzyskania emulsji. Poprzez
wirowanie (5 minut przy 12000 obr./min.) oddzielić fazę wodną zawierającą kwasy
nukleinowe (faza górna). Ostrożnie ją zebrać (starając się by nie pobrać białego strątu
białek) i przenieść do nowej probówki (uwaga: jeżeli strąt białek jest znaczny to należy
powtórzyć fenolizę, czyli ponownie dodać do fazy wodnej 100 μl fenolu i 100 μl
chloroformu, wytrząsać, odwirować jak poprzednio i zebrać do nowej probówki fazę
górną). Następnie dodać do zebranej fazy wodnej dwie objętości 95% etanolu
schłodzonego do temp. -20°C. Całość delikatnie wymieszać przez odwracanie i odwirować
(5 minut przy 12000 obr./min.). Supernatant zlać, a osad kwasów nukleinowych przemyć
70% etanolem i odwirować przez 1 minutę przy 12000 obr./min. Supernatant zlać, osad
delikatnie osuszyć (np. w eksykatorze próżniowym przez 3 minuty lub pozostawiając
otwartą probówkę pod wyciągiem do zaniku zapachu etanolu). W zależności od ilości
osadu rozpuszcza się go w odpowiedniej objętości sterylnej wody dejonizowanej lub
buforu TE, pH 7,4. Jeżeli osad jest praktycznie niewidoczny to zawiesza się go w objętości
50-100 μl, jeżeli jest wyraźnie widoczny – to w objętości 1 cm 3. Preparat DNA można
przechowywać w warunkach chłodniczych (+4°C) lub w stanie zamrożenia (-20°C).

Interpretacja wyniku
W celu analizy wyizolowanego DNA stosuje się metodę elektroforezy (zgodnie
z punktem 7.2), natomiast badanie czystości i stężenia wykonuje się metodą
spektrofotometryczną (zgodnie z punktem 7.3).

Odczynniki

150
1) bufor do lizy (100 mM EDTA z dodatkiem 150 mM NaCl, pH 8,0),
2) lizozym (10 mg/cm3),
3) 10% siarczan dodecylu sodu (SDS),
4) proteinaza K (1 mg proteinazy rozpuścić w 1 cm3 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 z dodatkiem 1 mM
CaCl2), roztwór enzymu należy przechowywać w temp. 4oC,
5) fenol, wysycony 1 M Tris-HCl, pH 8,0,
6) chloroform,
7) etanol (95% i 70%),
8) bufor TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA).
Uwaga: Przygotowując bufory Tris-HCl różniące się stężeniem molowym, należy odpowiednią naważkę Tris
rozpuścić w niecałym litrze dejonizowanej wody, następnie doprowadzić do odpowiedniego pH za pomocą
1 M HCl i uzupełnić wodą do objętości 1 litra.

7.1.2. Izolacja DNA z tkanek zwierzęcych z wysalaniem białek

Zasada metody
Tkankę zwierzęcą (np. wątrobę) poddaje się homogenizacji i lizie za pomocą siarczanu
dodecylu sodu (SDS). Podczas lizy stosuje się też enzymatyczne trawienie białek
(z użyciem proteinazy K). Białka usuwa się po ich wytrąceniu za pomocą nasyconego
roztworu NaCl i odwirowaniu osadu. DNA wytrąca się z zebranego supernatantu za
pomocą schłodzonego etanolu.

Wykonanie
Odważyć ok. 250 mg tkanki wątrobowej. Dokładnie zhomogenizować w moździerzu,
dodać 3 cm3 buforu do lizy i nadal homogenizować (czynność powtórzyć). Zawartość
moździerza przenieść do probówki typu Falcon o obj. 15 cm3, resztki homogenizatu
spłukać 1 cm3 buforu do lizy. Dodać 10 μl proteinazy K i zamknięte probówki inkubować
1 godzinę w 60°C. Po tym czasie probówki przenieść do lodu, schłodzić i nadal trzymając
w lodzie dodać 2,5 cm3 5 M NaCl. Dokładnie wymieszać aż do wytrącenia białka.
Następnie osad odwirować w temp. 4°C przez 10 minut przy 5000 obr./min. Supernatant
(ciecz znad osadu) przenieść ostrożnie do zlewki o obj. 50 cm 3 umieszczonej w lodzie
i powoli dodawać 20 cm3 95% etanolu o temp. -20°C. Delikatnie mieszać ciecz poprzez
obracanie zlewki. DNA wytrąca się w postaci białego kłębka, który pobiera się na bagietkę
i przenosi na ściankę probówki typu Eppendorf (obj. 1,5 cm 3). Resztki cieczy spływające
na dno probówki usuwa się pipetą. Preparat DNA można przemyć 70% etanolem. Po
odparowaniu etanolu DNA rozpuszcza się w odpowiedniej objętości (1–1,5 cm3) sterylnej

151
dejonizowanej wody lub buforu TE, pH 7,4. Tak przygotowany preparat DNA można
przechowywać w warunkach chłodniczych (+4°C) lub w stanie zamrożenia (-20°C).

Interpretacja wyniku
W celu analizy wyizolowanego DNA stosuje się metodę elektroforezy (zgodnie
z punktem 7.2), natomiast badanie jego czystości i stężenia wykonuje się metodą
spektrofotometryczną (zgodnie z punktem 7.3).

Odczynniki
1) bufor do lizy (2% SDS, 65 mM Tris, 20 mM EDTA z dodatkiem 5 mM CaCl2),
2) proteinaza K (1 mg proteinazy rozpuścić w 1 cm 3 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 z dodatkiem 1 mM
CaCl2), roztwór enzymu należy przechowywać w temp. 4°C,
3) 5 M NaCl,
4) etanol (95% i 70%),
5) bufor TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA).

7.2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Zasada metody
Elektroforeza w żelu agarozowym jest prostą i szybką techniką stosowaną do rozdziału,
wykrywania i oczyszczania fragmentów DNA. Stosuje się ją zarówno do celów
analitycznych jak też preparatywnych. Jest to istotne w wielu technikach badawczych,
gdzie na różnych etapach wykonuje się elektroforezę.
Elektroforeza w żelu agarozowym jest też podstawową metodą służącą do analizy
wyizolowanych preparatów DNA (umożliwia m.in. ocenę, czy preparat DNA nie uległ
fragmentacji podczas izolacji). Stosowane w tym celu żele zawierają najczęściej 0,8%
agarozy i mają wymiary 5 x 7,5 x 0,5 cm (są to tzw. miniżele). Podczas sporządzania żelu
dodaje się do niego bromek etydyny, fluorescencyjny barwnik, który łączy się z DNA,
przez co po elektroforezie rozdzielone fragmenty DNA są widoczne pod lampą UV jako
świecące prążki. Próbki DNA nanosi się na żel łącznie z barwnikiem, który umożliwia
zatrzymanie rozdziału w odpowiednim czasie. Elektroforezę prowadzi się w roztworach
o pH 8,0 (najczęściej jest to bufor TBE) przy napięciu równym 4-5 V/cm drogi pomiędzy
elektrodami. Jeżeli podczas obserwacji żelu pod lampą UV wyizolowane próby DNA
widoczne są jako zwarte prążki bez widocznych smug oznacza to, że preparat DNA jest
dobrej jakości (nie uległ fragmentacji) oraz został dobrze oczyszczony.

152
Wykonanie
Do suchej kolby o objętości 100 cm3 należy odważyć 0,4 g agarozy. Do agarozy dodać
50 cm3 buforu TBE, wymieszać i zagotować. Roztwór agarozy powinien być jednorodny,
bez widocznych grudek. Przygotowany zol agarozowy należy ostudzić do temp. około
50°C i dodać do niego 2,5 μl bromku etydyny, wymieszać i wylać do dobrze
wypoziomowanej i zabezpieczonej przed wyciekiem poziomej formy. Do formy, zaraz po
wylaniu agarozy, włożyć grzebień na głębokość ok. 1 mm ponad dno formy (w odległości
ok. 1 cm od jednego z jej brzegów). Po zastygnięciu żel umieścić w aparacie do
elektroforezy horyzontalnej i zalać buforem do elektroforezy (1 x TBE), tak aby pokrywała
go cienka warstwa buforu (1-2 mm). Delikatnie wyjąć grzebień.
W probówce Eppendorfa umieścić 2 do 5 μl wyizolowanego DNA i 2 μl buforu do
próbek. Wymieszać przez pipetowanie i nałożyć na żel. Jeżeli celem badania jest też
ustalenie wielkości badanych fragmentów DNA, to należy jednocześnie nanieść wzorzec
wielkości zawierający fragmenty DNA o pożądanej długości. Podłączyć napięcie równe
4-5 V/cm i prowadzić elektroforezę tak długo, aż błękit bromofenolowy osiągnie 2/3
długości żelu. Żel wyjąć z aparatu, umieścić na podświetlarce emitującej światło UV
o długości fali 302-312 nm (podczas obserwacji należy stosować osłonę lub filtr).

Interpretacja wyniku
Jeżeli próby wyizolowanego DNA migrują w żelu w postaci zwartych prążków bez
widocznych smug to można sądzić, że preparat jest dobrej jakości, czyli jest czysty i nie
uległ fragmentacji podczas stosowanych zabiegów.
Odczynniki
1) agaroza,
2) bromek etydyny o stężeniu 10 mg/cm3 wody,
3) bufor 1 x TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 1 mM Edta, pH 8,0),
4) bufor do próbek (50% glicerol; 0,025% cyjanoksylen; 0,025% błękit bromofenolowy; 1 mM EDTA,
pH 8,0).

7.3. Oznaczanie czystości i obliczanie stężenia DNA i RNA metodą spektrofoto-

metryczną

Zasada oznaczenia

153
 Kwasy nukleinowe wykazują maksimum absorpcji światła o długości fali 260 nm.
Preparaty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone białkami, które absorbują fale
świetlne z maksimum przy około 280 nm lub innymi związkami (w tym odczynnikami
stosowanymi podczas izolacji), które pochłaniają najintensywniej światło o krótszych
falach. W celu oznaczenia czystości preparatów DNA i RNA najczęściej wykonuje się
pomiary absorbancji przy 230, 260 i 280 nm. Następnie oblicza się wartości stosunków
absorbancji A230/A260 i A260/A280. Wartości współczynników A230/A260 poniżej 0,5 oraz
A260/A280 wynoszące powyżej 1,7 dla DNA oraz powyżej 1,8 dla RNA świadczą
o czystości badanego preparatu. Jeżeli badana próba jest czysta to wartość absorbancji przy
260 nm można wykorzystać do obliczenia stężenia kwasów nukleinowych.

Wykonanie
Dla prób badanych zawierających DNA lub RNA należy wykonać pomiary absorbancji
światła przy długościach fal 230, 260 i 280 nm.

Obliczanie i interpretacja wyników

Na podstawie uzyskanych wartości współczynników absorbancji należy obliczyć
stosunki A230/A260 oraz A260/A280. Jeżeli obliczone wartości świadczą o czystości preparatów
to należy obliczyć stężenie DNA lub RNA w badanej próbie. W tym celu wykorzystuje się
zależność, że w kuwecie o grubości warstwy 1 cm wartość współczynnika absorbancji
przy 260 nm jest równa 1 dla dwuniciowego DNA (dsDNA)
o stężeniu 50 μg/ cm3 oraz dla RNA o stężeniu 40 μg/ cm3. W celu wyrażenia stężenia
w postaci często stosowanych jednostek gęstości optycznej (oznaczanych skrótem OD)
można skorzystać ze wzoru:
A260  r
OD 
v
gdzie:
A260 – odczytana wartość absorbancji przy 260 nm
r – rozcieńczenie badanego roztworu w kuwecie (mierzone wartości absorbancji nie powinny być niższe
niż 0,02 i wyższe niż 1-1,5, ponieważ wtedy uzyskiwane wyniki nie są dokładne; w przypadku
uzyskania wartości A260 nie mieszczącej się w tych granicach należy wykonać rozcieńczenie)
v – objętość roztworu w kuwecie, cm3

Na podstawie odczytanej wartości współczynnika absorbancji przy 260 nm można też

obliczyć stężenie molowe [μmol/cm3] korzystając ze wzorów:
stężenie molowe dla dsDNA: c = A260 / 0,020
stężenie molowe dla RNA: c = A260 / 0,025

154
gdzie: A260 – absorbancja mierzona przy długości fali 260 nm

Odczynniki
próbka badana (roztwór DNA lub RNA, którego stężenie powinno wynosić 50–100 μg/cm3)

7.4. Identyfikacja i ilościowe oznaczanie nukleotydów metodą spektrofotometryczną

Zasada oznaczenia
Zasady azotowe wchodzące w skład nukleotydów oraz kwasów nukleinowych ze
względu na aromatyczne pierścienie pochłaniają światło w zakresie UV. Może to zostać
wykorzystane podczas identyfikacji i oznaczania ilościowego wolnych zasad purynowych
i pirymidynowych oraz związanych w nukleotydach. Ze względu na to, że poszczególne
zasady azotowe charakteryzuje inna intensywność pochłaniania światła może to być
wykorzystane podczas ich identyfikacji. Identyfikację nukleotydów przeprowadza się
przez pomiar absorbancji i obliczenie wartości stosunków absorbancji przy różnych
długościach fal. Pomiary wykonuje się w roztworach o pH 7,0. Warunkiem koniecznym
jest zawartość w badanej próbie tylko jednego nukleotydu. Jeżeli celem badania jest
oznaczenie ilości poszczególnych nukleotydów w cząsteczce kwasu nukleinowego to
wstępnie należy wykonać hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w celu rozłożenia
polinukleotydu. Mieszaninę nukleotydów rozdziela się następnie chromatograficznie
i wykonuje pomiary absorbancji dla frakcji zawierających pojedyncze nukleotydy.
Oznaczenie stężenia nukleotydu wykonuje się korzystając z prawa Lamberta–Beera.
Wykonanie
Dla próbek badanych wykonać pomiary absorbancji przy długościach fal 250, 260, 280
i 290 nm wobec buforu fosforanowego (pH 7,0).

Obliczanie i interpretacja wyników

Na podstawie uzyskanych wyników absorbancji obliczyć wartości stosunków A 290/A260,
A280/A260 i A250/A260. Obliczone wartości stosunków absorbancji porównać
z danymi zawartymi w tabeli 7 i dokonać identyfikacji nukleotydu.

Tabela 7. Spektralna charakterystyka nukleotydów RNA

nukleotyd max 260 A290/A260 A280/A260 A250/A260
AMP 259 14900 0,03 0,15 0,79
CMP 271 7400 0,30 0,98 0,83

155
 GMP 253 11800 0,27 0,68 1,15
UMP 262 9900 0,03 0,38 0,74
max  długość fali światła odpowiadająca maksimum absorpji
 260  molowy współczynnik absorpcji przy długości fali 260 nm

Stężenie zidentyfikowanego nukleotydu oblicza się z następującego wzoru:

A260
c
 260  b
gdzie:
c – stężenie molowe nukleotydu
A260  wartość absorbancji przy długości fali 260 nm
 260  molowy współczynnik absorpcji przy długości fali 260 nm
b  grubość warstwy roztworu (1cm)

Odczynniki
1) 0,02 M bufor fosforanowy, pH 7,0,
2) próbki badane (roztwory nukleotydów w buforze fosforanowym o stężeniu około 2 mg/100 cm3).

7.5. Wykrywanie kwasów nukleinowych na podstawie obecności pentozy

7.5.1. Wykrywanie RNA na podstawie obecności rybozy

Zasada oznaczenia
Do wykrywania i ilościowego oznaczania rybozy w RNA stosuje się specyficzną
reakcję Biala, opisaną w rozdziale „Węglowodany” (punkt 9.2.2). Barwny kompleks
z orcyną dają nie tylko wolne pentozy, ale również związane w nukleozydach. Zabarwienie
z deoksyrybozą jest około 10-krotnie słabsze niż w obecności rybozy, bo jej odwadnianie
w środowisku kwaśnym następuje znacznie wolniej. Z tego względu przyjmuje się, że
deoksyryboza nie przeszkadza w oznaczeniach ilościowych rybozy. Barwny kompleks
powstający w wyniku reakcji z rybozą posiada maksimum absorpcji przy λ = 665 nm.

Wykonanie
Do probówki odmierzyć 1 cm3 próby badanej, a następnie dodać równą objętość
odczynnika Biala. Probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Dodatnim
wynikiem próby jest powstanie zielonego zabarwienia roztworu. Dla porównania reakcję
można przeprowadzić również z wzorcowym roztworem rybozy.

Odczynniki
1)0,2% roztwór orcyny w 20% kwasie solnym,

156
2)1% roztwór FeCl3,
3)2% roztwór cukru wzorcowego: rybozy,
4)próba badana

7.5.2. Wykrywanie DNA na podstawie obecności deoksyrybozy

Zasada oznaczenia
Traktowanie DNA silnym kwasem powoduje rozrywanie wiązań N-glikozydowych
pomiędzy zasadą azotową i cukrem oraz odwodnienie 2-deoksyrybozy do aldehydu
-hydroksylewulinowego. Aldehyd ten kondensuje z difenyloaminą, a powstały produkt
ma barwę niebieską z maksimum absorpcji światła przy długości fali 595 nm. Ryboza
w warunkach tej reakcji nie daje zabarwienia.

Wykonanie
Do probówki odmierzyć 1 cm3 próby badanej i dodać 2 cm3 roztworu difenyloaminy.
Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej, ogrzewać przez około 10 minut
i obserwować, czy powstaje niebieskie zabarwienie. Dla porównania reakcję należy
przeprowadzić również z wzorcowym roztworem deoksyrybozy.

Odczynniki
1) 1% roztwór difenyloaminy,
2) 2% roztwór cukru wzorcowego: deoksyrybozy,
3) próba badana

Zadania do wykonania
1. Wykonać izolację DNA z komórek bakterii Escherichia coli.
2. Wykonać izolację DNA z tkanki zwierzęcej (np. wątroby) z wysalaniem białek.
3. Wykonać rozdział elektroforetyczny wyizolowanego DNA, oznaczyć jego czystość
i ustalić wielkość (liczbę par zasad) rozdzielanych fragmentów DNA.
4. Metodą spektrofotometryczną oznaczyć czystość badanych prób kwasów nukleinowych
i ustalić stężenie DNA lub RNA:
 podać stężenie w postaci jednostek gęstości optycznej (OD),
 obliczyć stężenie molowe.
5. Przeprowadzić identyfikację nukleotydu metodą spektrofotometryczną i oznaczyć
stężenie molowe badanego nukleotydu.

157
6. Przeprowadzić próby jakościowe na wykrywanie pentoz (rybozy i deoksyrybozy) oraz
na podstawie uzyskanych wyników stwierdzić, czy w badanej próbie znajduje się kwas
RNA czy DNA.

158
 WITAMINY

1. Wprowadzenie
Do witamin należy grupa związków organicznych o zróżnicowanej budowie
chemicznej. Są one pobierane i wykorzystywane przez organizm w niewielkich ilościach.
Witaminy spełniają niemal taką samą rolę we wszystkich organizmach żywych. Nie
stanowią materiału budulcowego ani nie są źródłem energii. Pełnią natomiast bardzo
ważne funkcje związane z ich udziałem w licznych przemianach metabolicznych, co jest
niezbędne dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania każdej komórki i tkanki.
Pierwszą z odkrytych witamin była tiamina, która jako pochodna pirymidyny zawiera
azot, dlatego też jej odkrywca Kazimierz Funk nadał jej nazwę „witamina”, w której
występuje człon „amina” oraz „vita” (z łac. życie). W trakcie dalszych badań okazało się,
że nie każda z witamin zawiera w swym składzie azot, a tym bardziej nie jest aminą.
Jednak nazwa nadana przez polskiego badacza przyjęła się dla całej grupy kolejno
odkrywanych związków.

2. Witaminy, zapotrzebowanie i objawy niedoboru

Konieczność dostarczania witamin z pożywieniem wynika z niezdolności danego
gatunku do ich samodzielnego wytwarzania w organizmie. Przyczyną tego jest brak
jednego lub kilku enzymów niezbędnych do przeprowadzenia syntezy danej witaminy
z substancji pokarmowych lub metabolitów. Z wymienionych powyżej powodów pojęcie
witamin wykazuje dużą specyficzność gatunkową, dany związek może być witaminą dla
jednego gatunku, a nie dla innego. Przykładem może być kwas askorbinowy, który jest
witaminą dla organizmu człowieka, małpy i świnki morskiej, natomiast inne gatunki
zwierząt wytwarzają go w wystarczającej ilości samodzielnie i nie stanowi on wtedy dla
nich niezbędnej substancji egzogennej. W organizmie człowieka, głównie przy udziale
bakterii jelitowych, powstaje znaczna część witamin (na przykład większość witamin z
grupy B, witamina K), jednak przeważnie są one wytwarzane w ilościach nie
pokrywających ich zapotrzebowania i muszą być uzupełniane z pożywienia. Pierwszą
odkrytą witaminą była rozpuszczalna w wodzie tiamina, a następną rozpuszczalna w
tłuszczach witamina A. Ta właściwość (rozpuszczalność w tłuszczach lub wodzie) stała się
podstawą klasyfikacji witamin. Kolejno odkrywane związki zaliczano do jednej lub drugiej

159
kategorii. Obecnie przyjmuje się, że dla organizmu człowieka niezbędnych jest 13 witamin
(tabele 8 i 9).

160
Tabela 8. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Zapotrzebowanie, występowanie w żywności, znaczenie dla organizmu oraz objawy niedoboru

Witamina Dzienne zapotrzebowanie (dla Występowanie w żywności Znaczenie dla organizmu Objawy niedoboru
dorosłego człowieka)

tran (olej z wątroby ryb), bierze udział w procesie widzenia, kurza ślepota, wysychanie rogówki
wątroba, masło, jaja, mleko stymuluje wzrost i prawidłowe (kseroftalmia), zahamowanie wzrostu,
A
prowitaminy – żółte i zielone funkcjonowanie błon śluzowych, suchość i rogowacenie skóry, łamliwość
retinol 0,5 – 1 mg
owoce i warzywa, np. marchew, wspomaga produkcję hormonów, paznokci, zmniejszona odporność
natka, szpinak, oleje roślinne jako antyoksydant chroni przed
nowotworami i poprawia wygląd skóry
tran (olej z wątroby ryb), żółtka jaj, reguluje gospodarkę wapniowo- krzywica, demineralizacja kości (kruchość
D wątroba, masło, pełnotłuste fosforanową, przez co wpływa na i podatność na urazy), osłabienie mięśni
5 – 10 μg
kalcyferol produkty mleczne prawidłowy rozwój kości, mineralizację
zębów oraz przeciwdziała krzywicy

E oleje roślinne, kiełki zbóż, soja, jest antyoksydantem, przeciwdziała choroby metaboliczne o niespecyficznych
tokoferol jaja, orzechy, sałata, szpinak, procesom starzenia, wygładza skórę, objawach,
ok. 10 – 30 mg
kapusta, masło ułatwia gojenie ran, u zwierząt obserwowano zanik płodu,
chroni przed nowotworami dystrofię mięśni

zielone części roślin, np. brokuły, zapewnia prawidłową krzepliwość krwotoki (np. z nosa, układu pokarmowego
K
kapusta, szpinak, sałata, mniejsze krwi, uczestniczy w formowaniu i moczowego, skazy krwotoczne),
filochinon,
0,1 – 1 μg / kg masy ciała ilości w mięsie, mleku i zbożach tkanki kostnej, działa przeciwzapalnie obniżona krzepliwość
menachinon
i przeciwbólowo, ma aktywność
przeciwgrzybiczą i antybakteryjną
Źródło: Tabele opracowano na podstawie: Chemia żywności. Praca zbiorowa pod red. Z.E. Sikorskiego (2007); Gertig H., Przysławski J. Bromatologia. Zarys nauki o
żywności i żywieniu (2006); Witaminy. Praca zbiorowa pod red. J. Gawęckiego (2002).

161
 Witamina Dzienne zapotrzebowanie Występowanie w żywności Znaczenie dla organizmu Objawy niedoboru
(dla dorosłego człowieka)

C owoce: dzika róża, czarna porzeczka, jest antyoksydantem, wzmacnia odporność: szkorbut (owrzodzenie dziąseł,
kwas agrest, cytrusy, aronia, truskawki, zapobiega infekcjom i rozwojowi nowotworów, krwawienie, rozchwianie zębów),
60 – 70 mg
askorbinowy maliny; warzywa: papryka, kalafior, bierze udział we wchłanianiu żelaza, stymuluje obniżenie odporności na infekcje,
kapusta, natka, ziemniaki syntezę kolagenu i niektórych hormonów powolne gojenie ran, zmęczenie

B1 ziarna zbóż (głównie osłonki), kiełki, bierze udział w metabolizmie glukozy, zaburzenia układu nerwowego
tiamina pieczywo pełnoziarniste, drożdże, produkcji czerwonych krwinek, wspomaga (zaburzenia czucia, mrowienie,
1 – 2 mg wątroba, mięso funkcjonowanie układu nerwowego, osłabienie pamięci), zaburzenia
mięśni i serca czynności serca, zanik mięśni

B2 wątroba, mięso, jaja, ser, drożdże, wpływa na funkcjonowanie skóry, błon zajady, pękanie warg, zapalenie
ryboflawina 1,5 – 3 mg zielone warzywa liściaste, mąka, śluzowych, paznokci i włosów, bierze śluzówki jamy ustnej, pieczenie oczu,
mleko udział w produkcji czerwonych krwinek nadwrażliwość na światło

PP
kwas nikotynowy kawa palona, wątroba, mięso, ryby, wpływa na regulację poziomu cukru pelagra (szorstkość i zaczerwienienie
(dawniej B3) 10 – 25 mg ziarno zbóż (zwłaszcza otręby), i cholesterolu, poprawia przepływ krwi skóry), biegunka, demencja
drożdże, szpinak, kapusta w naczyniach krwionośnych
kwas
pantotenowy wątroba, jaja, groch, mięso, wpływa na stan skóry i włosów, piekące stopy, drażliwość, osłabienie
(lub rzadziej B5) ok. 5 mg ziarna zbóż z osłonkami chroni przed infekcjami refleksu, utrata wagi, obniżenie
odporności

B6 drożdże, wątroba, ryby, mięso, wspomaga funkcjonowanie układu nerwowego, niedokrwistość, zapalenie języka i
pirydoksyna warzywa, przetwory zbożowe z produkcję czerwonych i białych krwinek, jest śluzówek, łojotokowe zmiany skóry,
ok. 2 mg pełnego ziarna stosowana przy zapaleniu korzonków kącików ust, zaburzenia czucia,
i skurczach mięśni osłabienie odporności

zielone części roślin, drożdże, jest niezbędna podczas powstawania krwinek anemia, zaburzenia rozwojowe płodu,
kwas foliowy wątroba, groch, nać buraków, czerwonych w szpiku kostnym, zapobiega obniżone wchłanianie w jelitach
ok. 0,4 mg
(lub rzadziej B9) produkty mleczne, kasza jęczmienna powstawaniu wad wrodzonych, nadaje skórze (biegunka), bezsenność,
zdrowy wygląd, opóźnia siwienie włosów nadpobudliwość nerwowa

162
 B12 wątroba, nerki, mięso, ryby, mleko uczestniczy w tworzeniu czerwonych krwinek, anemia megaloblastyczna (dawniej
kobalamina prawdopodobnie ok. 2 (w roślinach nie występuje lub wpływa na funkcjonowanie układu nerwowego zwana złośliwą), zaburzenia układu
μg występuje w ilościach śladowych) (poprawia pamięć i koncentrację) nerwowego (zanik czucia w
kończynach), kłopoty z pamięcią

H prawdopodobnie ok. wątroba, drożdże, żółtko jaja, groch, wspomaga funkcjonowanie tarczycy, łuszczycowe zmiany skóry, bóle
biotyna 150 - 300 μg wiele innych produktów wpływa na stan skóry i włosów mięśni, osłabienie, depresja, lęk
Tabela 9. Witaminy rozpuszczalne w wodzie. Zapotrzebowanie, występowanie w żywności, znaczenie dla organizmu oraz objawy niedoboru
Źródło: Tabele opracowano na podstawie: Chemia żywności. Praca zbiorowa pod red. Z.E. Sikorskiego (2007); Gertig H., Przysławski J. Bromatologia. Zarys nauki o
żywności i żywieniu (2006) Witaminy. Praca zbiorowa pod red. J. Gawęckiego (2002).

163
 Przewlekły niedobór określonej witaminy (hipowitaminoza) lub jej całkowity brak
(awitaminoza) prowadzi do zaburzeń chorobowych. Mogą to być różnego rodzaju lżejsze
lub cięższe schorzenia, prowadzące do wyniszczenia, a nawet śmierci organizmu. Dla
przykładu niedobór tiaminy (witaminy B1) wywołuje chorobę zwaną beri-beri, która
objawia się m.in. porażeniem i zanikiem mięśni, co powoduje niedowłady, osłabienie serca
i zaburzenia czynności układu pokarmowego, często ze skutkiem śmiertelnym.

164
 Zdecydowana większość z wymienionych w tabelach objawów niedoborów witamin
ma często bardziej złożony charakter, związany z jednoczesnym niedoborem lub
nadmiarem w diecie innych składników pokarmowych (przeważnie innych witamin,
makro- lub mikroelementów) oraz zaburzeniami fizjologicznymi organizmu
(np. upośledzone wchłanianie tłuszczów). Często trudno jest również ustalić dzienne
zapotrzebowanie na określone witaminy, co dotyczy zwłaszcza tych witamin, które
powstają z udziałem mikroflory jelitowej człowieka. Organizm nie zawsze otrzymuje
niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania ilości witamin. Szczególnie dotyczy to osób
prowadzących aktywny tryb życia, w tym sportowców, ale też osób starszych, czy kobiet
w okresie ciąży i karmienia niemowląt. Na rynku dostępna jest cała gama preparatów
witaminowych, które mogą uzupełniać te niedobory (suplementy witamin). Dosyć długo
sądzono, że nadmiar witamin (poza witaminą D) nie jest szkodliwy dla organizmu. Jednak
obecnie w literaturze naukowej można znaleźć coraz więcej doniesień na temat
niekorzystnych skutków przedawkowania witamin (tzw. hiperwitaminozy), dlatego zaleca
się raczej, by dłuższą suplementację witaminami stosować w razie realnego zagrożenia
niedoborem oraz w porozumieniu z lekarzem. Natomiast bez większych obaw można
przez krótki czas stosować kuracje witaminowe w okresach większego zapotrzebowania
organizmu, np. w czasie osłabienia po leczeniu antybiotykami lub podczas intensywnej
pracy fizycznej czy umysłowej.

3. Źródła witamin w diecie i straty podczas obróbki żywności

165
 Źródłem witamin w przyrodzie są rośliny. W mniejszym stopniu dostarczają ich
mikroorganizmy. Odgrywają one jednak bardzo ważną rolę przy wytwarzaniu witamin
w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. W spożywanym przez człowieka
pożywieniu również produkty pochodzenia zwierzęcego, zwłaszcza narządy (wątroba)
i tkanki (tłuszcz, mięśnie), w których akumulują się niektóre witaminy, są ich bogatym
źródłem. Podstawowe źródła witamin w diecie człowieka zawarte zostały w tabelach 8 i 9.
Zawartość witamin w spożywanej żywności zależy w dużej mierze od sposobu jej
przygotowania. Ustalono, że największą wrażliwość na procesy związane z obróbką
kulinarną żywności wykazuje witamina C oraz witaminy z grupy B. Przykładowo straty
witaminy C i kwasu foliowego podczas duszenia bigosu sięgają 80%. W przypadku innych
witamin obróbka termiczna żywności powoduje ich ubytki zawierające się w przedziale od
10 do 75%, przeważnie 30 – 40%. Znaczne straty witamin z tej grupy wynikają też z ich
dobrej rozpuszczalności w wodzie (straty podczas płukania, rozdrabniania, gotowania
z wylaniem wywaru). Straty witamin rozpuszczalnych w tłuszczach podczas obróbki
technologicznej żywności są mniejsze niż w przypadku witamin rozpuszczalnych
w wodzie i dla witamin A, E i K podczas typowych zabiegów kulinarnych (gotowanie,
smażenie, pieczenie) wynoszą około 20%. Procesy przetwarzania przemysłowego są
kolejną istotną przyczyną znacznych strat witamin. Przykładowo podczas produkcji białej
mąki, ziarna przed mieleniem zostają pozbawione najbogatszych w witaminy z grupy B
ciemnych otoczek (mąki najjaśniejsze zawierają najmniej tych witamin). Najczęściej
dostępne na rynku mąki zawierają w stosunku do zawartości w ziarnie pszenicy
odpowiednio 50% ryboflawiny, 35% tiaminy i kwasu foliowego oraz 20% witaminy PP
i B6. Znaczne straty witamin wrażliwych na temperaturę związane są z obecnie często
stosowanym zabiegiem sterylizacji produktów (dotyczy to głównie warzyw, owoców,
mleka). Należy też wspomnieć o dietetycznych produktach mlecznych z obniżoną
zawartością tłuszczu, które jednocześnie zawierają mniejsze ilości witamin w nich
rozpuszczalnych (obecnie często produkty takie wzbogaca się w witaminy A i D).
Znajomość wrażliwości witamin na określone czynniki jest bardzo ważna przy
opracowywaniu technologii wytwarzania danego produktu. Parametry stosowane podczas
poszczególnych procesów należy dobrać w taki sposób, aby w jak największym stopniu
zostały zachowane w finalnym produkcie te witaminy, których jest on głównym źródłem
w diecie. Z tego punktu widzenia najbardziej odpowiednie byłoby np. stosowanie mąki
ciemniejszej do produkcji pieczywa, co podwyższa jego wartość odżywczą.

166
4. Oznaczanie zawartości witamin w żywności

167
 Dla ustalenia zawartości witamin w żywności stosuje się różnorodne metody
analityczne. Ze względu na bardzo duże zróżnicowanie strukturalne witamin, w ich
analizie mają zastosowanie bardzo różne metody. Mogą to być metody fizykochemiczne,
takie jak reakcje ze specyficznymi odczynnikami, pomiary spektrofotometryczne,
fluorymetryczne, wszelkiego rodzaju metody chromatograficzne oraz mikrobiologiczne.
Czasami w ocenie zawartości witamin w żywności zastosowanie mają też testy biologiczne
(prowadzone na zwierzętach). Metody oznaczania ilościowego służą do ustalenia wartości
witaminowej produktów spożywczych lub preparatów farmaceutycznych albo zgodności
z deklarowaną zawartością (np. produkty witaminizowane), są one też przydatne do oceny
strat witamin w czasie zabiegów technologicznych i przechowywania żywności.

5. Witaminy i prowitaminy, aktywność biologiczna i sposoby jej wyrażania

Witaminy są dostarczane do organizmu w postaci związków, które w większym lub
mniejszym stopniu mają właściwości określonej witaminy. Różnice w ich budowie mogą
dotyczyć np. obecności wiązań podwójnych, istnienia lub braku określonych grup
funkcyjnych, często występowania danego związku w postaci jego soli.
Niektóre z witamin występują w pożywieniu w postaci prowitamin. Prowitaminy są
związkami, które uzyskują aktywność biologiczną właściwych witamin dopiero po
odpowiednim przekształceniu w wyniku przemian biochemicznych zachodzących
w organizmie (np. β-karoten jest prowitaminą witaminy A).

168
 Różnice w budowie związków pełniących funkcje witamin, a dostarczanych
z pożywieniem wpływają głównie na ich rozpuszczalność, wrażliwość, wchłanialność
w przewodzie pokarmowym oraz efektywność działania w organizmie. Charakteryzując
pod tym względem poszczególne związki określa się ich aktywność biologiczną, czyli
stopień, w jakim określony związek jest przyswajany z pożywienia, przekształcany
w postać aktywną i zapobiega objawom niedoboru danej witaminy. Istnieje też nieco
węższe pojęcie – biodostępność witamin, które informuje o stopniu uwalniania związku
w przewodzie pokarmowym z połączeń występujących w żywności, jego wchłaniania
w jelitach i rozprowadzania do komórek. Na aktywność biologiczną związków mających
funkcje witamin wpływa wiele różnych czynników, często są one związane ze specyfiką
danego organizmu (np. niedobór określonych enzymów trawiennych, białek
transportujących, występowanie zaburzeń metabolicznych związanych z określonymi
chorobami lub stosowaniem leków). Bardzo ważną rolę odgrywa też rodzaj żywności,
w jakiej dany związek występuje. Może on występować w postaci trudno przyswajalnych
połączeń (np. kwas nikotynowy związany z glukozą w kukurydzy lub biotyna
zablokowana przez białko – awidynę w jajku kurzym). Określony rodzaj żywności może
też być źródłem enzymów rozkładających witaminy, np. oksydaza askorbinianowa
rozkładająca witaminę C obecna w warzywach (enzym ten jest prawie nieaktywny
w temperaturze pokojowej, wykazuje natomiast największą aktywność w temp. 45ºC,
dlatego też nie zaleca się gotowania warzyw poprzez zalewanie ich zimną wodą, należy
wkładać je do wrzątku, aby szybko zdenaturować enzym).
W żywności mogą się również znajdować tzw. antywitaminy. Są to związki
o strukturze chemicznej zbliżonej do witamin (tzw. analogi witamin), jednak nie
posiadające aktywności biologicznej. Antywitaminy mogą pełnić funkcje antagonistyczne
w stosunku do witamin, np. mogą wchodzić w połączenia z enzymami i prowadzić do ich
inaktywacji. Jako antywitaminy określa się też związki blokujące witaminy poprzez
tworzenie z nimi trwałych połączeń.
Dla wyrażenia aktywności witaminowej danego związku stosuje się tzw. równoważniki
(ekwiwalenty), które określają ilość danego związku równoważną formie o największej
aktywności biologicznej danej witaminy. Dla przykładu dla związków pełniących funkcje
witaminy A lub jej prowitamin stosuje się w tym celu równoważnik retinolu – RR (ang.,
RE – Retinol Equivalent). I tak:

1 μg RR = 1 μg retinolu = 6 μg β-karotenu = 12 μg innych karotenoidów

169
 Na podstawie powyższego równania dla obliczenia rzeczywistej zawartości witaminy
A w pożywieniu trzeba oznaczyć w nim ilość retinolu, β-karotenu i innych karotenoidów
oraz podstawić je do wzoru na zawartość witaminy A:

ilość μg RR = ilość μg retinolu + 0,167 x ilość μg β-karotenu

+ 0,084 x ilość μg innych karotenoidów

6. Biologiczne funkcje witamin

Witaminy w organizmie uczestniczą niemal we wszystkich przemianach
metabolicznych. Większość witamin rozpuszczalnych w wodzie wchodzi w skład
koenzymów będących zasadniczymi składnikami enzymów. Znaczna grupa witamin,
głównie rozpuszczalnych w tłuszczach (A wraz z jej prowitaminami, E) oraz witamina C
stanowi system naturalnych przeciwutleniaczy. Należy podkreślić, że prawidłowy przebieg
procesów fizjologicznych, np. procesu widzenia, wzrostu, sekrecji hormonów, czy
odpowiedniego funkcjonowania poszczególnych układów (nerwowego, krążenia, kostnego
itd.) w żywych organizmach wymaga najczęściej współdziałania kilku witamin.
Przykładem może być synteza tyminy, składnika kwasów nukleinowych, w której
uczestniczą kwas foliowy i kobalamina. Brak tych witamin zakłóca m.in. replikację DNA,
co uniemożliwia podziały komórkowe. Jest to zwłaszcza odczuwane wszędzie tam, gdzie
najintensywniej przebiega podział komórek, np. w komórkach szpiku kostnego, czy
podczas rozwoju płodu. W związku z tym niedobór tych witamin powoduje anemię oraz
wady rozwojowe płodu. Z drugiej strony w terapii chorób nowotworowych bardzo ważne
jest zahamowanie szybkiej proliferacji komórek nowotworowych, dlatego też w niektórych
metodach leczenia próbuje się wykorzystać zaburzenia w przemianach tych witamin
prowadzące do zahamowania podziału komórek.
Bardzo ważny w diecie jest odpowiedni stosunek ilościowy poszczególnych związków
pełniących funkcje koenzymatyczne. Należy tu uwzględnić zarówno zawartość witamin,
jak i mikroelementów. Często wzbogacanie diety w nadmierną ilość określonej witaminy,
bądź minerału może wywołać poważne zaburzenia metaboliczne, np. leczenie chorych na
anemię za pomocą zwiększenia w diecie zawartości kwasu foliowego, bez jednoczesnej
suplementacji w witaminę B12 może pogłębiać niedokrwistość.

6.1. Koenzymatyczne funkcje witamin

Witaminy z grupy B uczestniczą w przemianach metabolicznych węglowodanów,
białek, kwasów nukleinowych i tłuszczów. Wchodzą one w skład niebiałkowej części

170
enzymu, zwanej koenzymem, która ściśle współdziała z białkiem enzymatycznym (tabela
10). Bez tej niewielkiej cząsteczki enzym nie może pełnić funkcji katalitycznej, przez co
w przypadku niedoboru witaminy określony proces metaboliczny nie przebiega
prawidłowo lub zostaje całkowicie zatrzymany.

Tabela 10. Witaminy wchodzące w skład koenzymów (podano tylko przykłady enzymów, z którymi współdziałają wymienione
koenzymy)

witamina koenzym Enzymy

tiamina difosforan tiaminy Dekarboksylazy
ryboflawina mononukleotyd flawinowy (FMN)
Dehydrogenazy
dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)
kwas dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)
Dehydrogenazy
nikotynowy i jego fosforan (NADP)
kwas koenzym A (CoA)
Dehydrogenazy
pantotenowy
pirydoksyna fosforan pirydoksalu, pirydoksyny i pirydoksaminy transaminazy
kwas tetrahydrofolian
Metylotransferazy
foliowy
kobalamina metylokobalamina, 5’-deoksyadenozylokobalamina transmetylazy
biotyna biotyna Karboksylazy

Witaminy, które pełnią funkcje koenzymów przeważnie występują w pożywieniu

w postaci związków, które muszą ulec w organizmie odpowiednim przemianom
(np. przyłączenie grup fosforanowych, cząsteczek adeniny, rybozy), aby uzyskać swą
aktywność katalityczną. Koenzymy znajdują się w centrum aktywnym enzymów
katalizujących reakcje utlenienia i redukcji, przenoszenia grup, izomeryzacji oraz
tworzenia wiązań kowalencyjnych. Spośród licznych enzymów, jedynie hydrolazy i liazy,
które katalizują rozpad cząsteczek nie zawierają w swej budowie koenzymów.

6.2. Witaminy jako przeciwutleniacze

Witaminy C, E i A oraz karotenoidy, wśród nich również te, które nie posiadają
właściwości prowitaminowych, uczestniczą w neutralizacji wolnych rodników. Źródłem
tych ostatnich są przebiegające intensywnie w naszym organizmie przemiany
metaboliczne, szczególnie znaczne ilości wolnych rodników powstają podczas
zwiększonego wysiłku fizycznego, gdyż wzrasta wtedy zapotrzebowanie na tlen. Rodniki
mogą się tworzyć także pod wpływem działania czynników zewnętrznych. Należą do nich

171
zwłaszcza zanieczyszczenia chemiczne powietrza, infekcje, promieniowanie UV, czy też
dym papierosowy.
Wśród wolnych rodników, które czynią największe spustoszenie w organizmie
człowieka wymienić należy anionorodnik ponadtlenkowy O2•−, rodnik wodorotlenowy OH•
i rodnik wodoronadtlenkowy HO2•. Są to tzw. reaktywne formy tlenu (określane skrótem
RFT). Należą do nich także m.in. rodnik ponadtlenkowy RO 2•, tlenek azotu NO•,
dwutlenek azotu NO2•, dwutlenek siarki SO2•. Nagromadzenie wolnych rodników może
powodować tzw. stres oksydacyjny. Dochodzi do niego wtedy, gdy organizm nie radzi
sobie z unieszkodliwianiem zbyt dużej ilości tych reaktywnych cząsteczek, które powodują
uszkodzenie komórek. Szczególnie wrażliwe na atak wolnych rodników są nienasycone
kwasy tłuszczowe, które są m.in. składnikami fosfolipidów tworzących błony komórkowe.
W procesie wolnorodnikowego utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych lub
innych lipidów powstają nadtlenki tych związków. Zjawisko to, będące reakcją
łańcuchową o bardzo rozbudowanym charakterze i bardzo dużej szybkości, nosi nazwę
peroksydacji lipidów. Efektem uszkodzeń będących następstwem peroksydacji lipidów są
zaburzenia w strukturze błon komórkowych, prowadzące głównie do zmian ich
przepuszczalności i utraty integralności przedziałów wewnątrzkomórkowych (powoduje to
np. zaburzenia w funkcjonowaniu łańcucha oddechowego, którego podstawowym
zadaniem jest dostarczanie komórkom energii). Innym efektem o istotnym znaczeniu są
wolnorodnikowe uszkodzenia zasad azotowych wchodzących w skład kwasów
nukleinowych.
7. Podział witamin
Witaminy dzieli się na dwie grupy w zależności od ich rozpuszczalności, odpowiednio
na witaminy rozpuszczalne w tłuszczach oraz witaminy rozpuszczalne w wodzie. Podział
ten ma znaczenie praktyczne, ponieważ wskazuje na to, w jakich produktach może być
obecna dana witamina.

7.1. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

Zalicza się tu witaminy A, D, E i K. Nazwy związków chemicznych wykazujących
aktywność poszczególnych witamin oraz ich oznaczenia literowe podano w tabeli 11.

Tabela 11. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i ich wrażliwość na warunki środowiska

witamina
związki chemiczne wrażliwość na warunki zewnętrzne
(oznaczenie literowe)

172
 wrażliwa (zwłaszcza w środowisku
A1 all-trans-retinol
kwaśnym) na działanie tlenu,
A 4-cis-A1 4-cis-retinal wysokiej temperatury,
promieniowanie UV,
A2 all-trans-3-dehydroretinol
jony metali ciężkich
D2 ergokalcyferol odporna na działanie tlenu,
D podwyższoną temperaturę,
D3 cholekalcyferol światło
wrażliwa na tlen, zwłaszcza w
α-, β-, γ- i δ-tokoferol środowisku zasadowym przy
E jednoczesnym działaniu wysokiej
α-, β-, γ- i δ-tokotrienol temperatury, światła, obecności
jonów żelaza i miedzi
K1 filochinon wrażliwa na działanie światła,
zwłaszcza w środowisku kwaśnym
K K2 menachinon
i zasadowym
K3 menadion

Dostępność witamin z tej grupy jest w dużej mierze uzależniona od zawartości

tłuszczów w żywności, zarówno pochodzenia roślinnego jak i zwierzęcego oraz ich
prawidłowego wchłaniania. Wrażliwość na czynniki środowiskowe poszczególnych
witamin z tej grupy podano w tabeli 11. Największą trwałość wykazuje witamina D.
Witaminy z tej grupy mogą się akumulować w organizmie, głównie w wątrobie,
dlatego też nie muszą być dostarczane codziennie. Organizm wykorzystuje zgromadzone
zapasy i dopiero po ich wyczerpaniu zaczynają się pojawiać zaburzenia w jego
funkcjonowaniu. Przy nadmiernym spożyciu tych witamin, zwłaszcza A i D, może
dochodzić do objawów zatrucia (hiperwitaminoza).

7.1.1. Witamina A
Witamina A, czyli retinol zawiera w swym układzie pierścień β-jononu, do którego
dołączony jest łańcuch boczny – nienasycony węglowodór zbudowany z czterech
jednostek izoprenoidowych, który jest zakończony grupą alkoholową. Grupa alkoholowa
może reagować z grupą karboksylową kwasów organicznych tworząc estry takie jak
np. palmitynian czy stearynian retinylu, które są związkami znacznie trwalszymi
w porównaniu do retinolu. Pochodną retinolu jest retinal, aldehyd powstały w wyniku
utlenienia grupy –OH.

173
 CH2OH CH2OH

retinol 3-dehydroretinol

Rys. 44. Witamina A1 (retinol) i witamina A2 (3-dehydroretinol)

Rysunek 44 przedstawia retinol określany jako witamina A1 oraz 3-dehydroretinol

(witamina A2) zawierający podwójne wiązanie pomiędzy trzecim a czwartym atomem
węgla w pierścieniu β-jononu. Witamina A 2 występuje w wątrobie ryb słodkowodnych.
Witamina A powstaje w organizmie w wyniku hydrolizy prowitamin, którymi są
beztlenowe karoteny i ich pochodne tlenowe, zawierające w swej budowie układ β-jononu
(rys. 45). Największe właściwości prowitaminowe ma β-karoten, który posiada 2 układy
β-jononu, konfigurację typu trans wokół wszystkich wiązań podwójnych, czyli all-trans
oraz należy do karotenów beztlenowych. Teoretycznie z β-karotenu po enzymatycznym
rozpadzie i utlenieniu do alkoholu mogą powstać 2 cząsteczki witaminy A. Jednak
wydajność tej przemiany w organizmie jest znacznie mniejsza i przyjmuje się, że 1 μg
β-karotenu zawartego w pożywieniu wykazuje aktywność biologiczną równą 0,167 μg
retinolu.

β – jonon α – jonon
α - karoten

174
 β – jonon β – jonon
β – karoten

β – jonon γ – jonon
γ - karoten

Rys. 45. Prowitaminy witaminy A: α -, β- i γ-karoten

Inne beztlenowe karoteny o właściwościach prowitaminowych to α- i γ-karoten.

Zawierają one w cząsteczkach po jednym układzie β-jononu i w związku z tym mają
o około 50% mniejszą aktywność prowitaminową. Obecność tlenu w łańcuchu bocznym
również znacznie obniża funkcje prowitaminowe karotenoidów, gdyż wtedy tylko połowa
cząsteczki (nie zawierająca tlenu) może ulec w organizmie przekształceniu w witaminę A.
Przykładem takiej prowitaminy jest kryptoksantyna (barwnik jagód) należąca do
pochodnych tlenowych karotenoidów, tzw. ksantofili. Posiada ona aktywność
prowitaminową o połowę mniejszą niż β-karoten.
Z występowaniem dużej ilości sprzężonych wiązań podwójnych w cząsteczkach
karotenoidów wiąże się ich charakterystyczne zabarwienie, od żółtego poprzez
pomarańczowe do czerwonego. Występując w znacznej ilości w określonych częściach
roślin nadają im odpowiedni kolor, np. owoce pomidora zawdzięczają barwę czerwonemu
likopenowi, a korzeń marchwi jest żółto-pomarańczowy dzięki znacznej zawartości
β-karotenu. Obecność wiązań podwójnych w bocznym łańcuchu węglowodorowym jest
również podstawą występowania izomerii geometrycznej typu cis-trans, wynikającej
z różnego położenia podstawników wokół wiązania podwójnego. Właściwości
prowitaminowe posiadają przede wszystkim karotenoidy typu all-trans. Izomery cis
określane są jako neokaroteny. Ich przykładem jest 4-cis-retinal, określany jako 4-cis
witamina A1, który wykazuje o około 20% mniejszą aktywność niż all-trans-retinol.

175
 Witamina A jest składnikiem barwnika rodopsyny (tzw. purpury wzrokowej), która
występuje w siatkówce oka na zakończeniach nerwu wzrokowego i uczestniczy w procesie
widzenia w przyćmionym świetle (objawem niedoboru witaminy A jest tzw. „kurza
ślepota”). Rodopsyna zawiera w swym składzie aldehydową pochodną retinolu, izomer
11-12 cis-retinal, który jest połączony z białkiem opsyną. Pod wpływem kwantów energii
świetlnej cis-retinal przekształca się w trans-retinal, co powoduje przesłanie
odpowiedniego bodźca biochemicznego do nerwu wzrokowego, wyzwalając w ten sposób
proces widzenia. W ciemności następuje ponowne przekształcenie izomeru trans w cis
i w ten sposób oko jest gotowe do odebrania kolejnych impulsów światła.
Spośród innych funkcji witaminy A należy wymienić jej właściwości
przeciwutleniające. Wykazują je zarówno karotenoidy o właściwościach prowitaminowych
jak i te, które nie są prekursorami witaminy A. Zdolność inaktywacji wolnych rodników
wynika z występowania licznych wiązań nienasyconych w strukturze karotenoidów, przy
czym, im większa ich ilość tym dany związek wykazuje większą aktywność w tym
kierunku. Bardzo znaczącym przeciwutleniaczem jest likopen (rys. 46), który zawiera aż
13 wiązań podwójnych (nie posiada β-jononu, czyli nie jest prowitaminą).

γ – jonon γ – jonon
likopen

Rys. 46. Likopen

Witamina A należy do witamin, których zażywanie w dużych ilościach i przez dłuższy

czas może być niebezpieczne. Uszkodzenia mogą dotyczyć oczu, kości, krwi, skóry,
ośrodkowego układu nerwowego, czy wątroby (zwłaszcza u dzieci). Objawy to głównie
nadmierna pobudliwość, zmęczenie, nudności, bóle głowy, wypadanie włosów, suchość
i swędzenie skóry, biegunki, powiększenie śledziony i wątroby. W cięższych zatruciach
dochodzi do ślepoty i zaburzeń psychicznych. U kobiet w ciąży wzrasta ryzyko
wystąpienia wad wrodzonych płodu. Należy wspomnieć, że β-karoten i inne prowitaminy
nie są toksyczne nawet w nadmiarze i można je przyjmować bez ograniczeń, ponieważ
organizm produkuje z nich tylko taką ilość witaminy A, jaka jest potrzebna.

176
 Zawartość retinolu można oznaczyć za pomocą metod spektrofotometrycznych poprzez
pomiar absorbancji światła w zakresie UV (λ = 325 nm). Jednak metoda ta może być
stosowana jedynie do analizy prób o dużym stężeniu (np. środków farmaceutycznych).
Zastosowanie mają też metody kolorymetryczne, które opierają się na reakcjach barwnych
z takimi związkami jak np. kwas trójchlorooctowy lub trójfluorooctowy, etylen, chlorek
metylenu lub trójchlorek antymonu. Z ostatnim spośród wymienionych odczynników
retinol tworzy kompleks o niebieskim zabarwieniu. Najbardziej rozpowszechniona
metoda, w której wykorzystywany jest do oznaczeń ilościowych retinolu trójchlorek
antymonu nosi nazwę metody Carra-Price’a. Przed wykonaniem reakcji barwnej należy
wyizolować z badanej próby czystą frakcję zawierającą retinol. W tym celu wykonuje się
reakcję zmydlenia próby i z użyciem eteru naftowego wydziela się frakcję niezmydlającą
się, którą następnie oczyszcza się metodami chromatograficznymi (np. chromatografia
adsorpcyjna na tlenku glinu). Po zebraniu frakcji zawierającej retinol przeprowadza się
reakcję barwną i dokonuje pomiaru absorbancji w zakresie światła widzialnego (λ = 620
nm). Bardzo powszechne w ostatnim czasie są też metody wykorzystujące HPLC.
W celu ilościowego oznaczenia karotenoidów, podobnie jak w przypadku retinolu,
wykonuje się wstępnie ich ekstrakcję z wykorzystaniem rozpuszczalników niepolarnych
(przeważnie jest ona poprzedzona zmydlaniem). Następnie, najczęściej z wykorzystaniem
chromatografii adsorpcyjnej na tlenku glinu, można przeprowadzić rozdział karotenoidów
zawartych w ekstrakcie. Ilość karotenoidów w zebranych frakcjach oznacza się na
podstawie wykonania pomiarów absorbancji światła widzialnego o długościach fal
odpowiadających maksimom absorpcji poszczególnych związków (np. dla β-karotenu
analityczna długość fali wynosi 451 nm, ewentualnie 426 nm). Na podstawie uzyskanych
wyników pomiarów absorbancji stężenie danych karotenoidów w analizowanych próbach
odczytuje się z odpowiednich krzywych wzorcowych.

7.1.2. Witamina D
Obecnie znanych jest około dwunastu związków o aktywności witaminy D. Wszystkie
są pochodnymi steroli, zawierają w swej budowie tzw. skondensowane pierścienie
steroidowe, do których dołączony jest łańcuch boczny.

CH3 R
CH3 R

CH3 CH2
światło UV
177
HO
HO
 7-dehydrocholesterol R= cholekalcyferol (wit. D3)

ergosterol R= ergokalcyferol (wit. D2)

Rys. 47. Prowitaminy witaminy D (7-dehydrocholesterol i ergosterol) oraz witamina D 3

(cholekalcyferol) i witamina D2 (ergokalcyferol)

Witaminy D biorą udział w metabolizmie wapnia i fosforu. W organizmie gromadzone

są w wątrobie, a zgromadzone zapasy wystarczają na pokrycie jej zapotrzebowania przez
okres od kilku do kilkunastu tygodni. Z punktu widzenia aktywności biologicznej
najważniejszą rolę odgrywa cholekalcyferol, czyli witamina D3 oraz ergokalcyferol
– witamina D2 (rys. 47). Przemysłowo produkuje się też tylko te dwie witaminy, ponieważ
inne kalcyferole mają bardzo niewielką aktywność biologiczną. Aktywne cząsteczki
witamin powstają z odpowiednich prowitamin w wyniku przemian zachodzących pod
wpływem światła UV. W organizmie zwierząt cholekalcyferol tworzy się po
fotochemicznym rozszczepieniu 7-dehydrocholesterolu (pęknięciu ulega wiązanie
pomiędzy C-9 i C-10). Ta prowitamina powstaje w wyniku utlenienia cholesterolu
i gromadzi się w powierzchniowych warstwach skóry, gdzie dociera światło słoneczne.
Prowitaminą witaminy D2 jest ergosterol, zaliczany pierwotnie do mykosteroli, ponieważ
występuje w znacznych ilościach w komórkach pleśni i drożdży. Poza grzybami wykryto
go również u ślimaków i pierścienic. Co ciekawe, niektóre artykuły spożywcze
zawierające znaczne ilości ergosterolu, wzbogaca się w witaminę D poprzez ich
naświetlanie.
Witamina D występuje tylko w nielicznych produktach żywnościowych. W związku
z tym istnieje, zwłaszcza w zimniejszych rejonach naszego globu, ryzyko niedoboru tej
witaminy. Jest to szczególnie niebezpieczne u dzieci ze względu na możliwość
wystąpienia krzywicy. Zatem uzasadnione jest wzbogacanie niektórych artykułów

178
spożywczych w witaminę D. Jednak należy zachować ostrożność w przyjmowaniu
znacznych ilości tej witaminy, szczególnie w postaci preparatów farmaceutycznych, gdyż
jest ona w nadmiarze wyjątkowo toksyczna. Do przedawkowania dochodzi przy
zażywaniu witaminy D w dawkach dobowych przekraczających 25–75 μg/kg masy ciała
(m.c.) dla dorosłych oraz 75–100 μg/kg m.c. dla niemowląt. Przy długotrwałym zażywaniu
większych dawek dochodzi do uwalniania wapnia z kości i związanego z tym zwapnienia
tkanek miękkich, w tym szczególnie nerek, naczyń krwionośnych, mięśnia sercowego.
U dzieci dodatkowo pojawiają się zaburzenia wzrostu.
Oznaczanie witaminy D w produktach spożywczych jest dosyć skomplikowane. Należy
uwzględnić fakt, że witamina D występuje w większości artykułów spożywczych
w niewielkich ilościach. Jedynie nieliczne produkty takie jak ryby, grzyby i wzbogacane
margaryny zawierają ilość witaminy D możliwą do wykrycia metodami chemicznymi
(bardzo bogatym jej źródłem jest węgorz: 100 g tej ryby zawiera aż 80 μg witaminy D).
W celu wykonania oznaczeń ilościowych na wstępie prowadzi się reakcję zmydlania,
a następnie chromatograficznie oczyszczoną frakcję niezmydlającą się poddaje analizie
z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Rzadziej w analizie
ilościowej witaminy D stosuje się reakcje barwne z chlorkiem antymonu lub
z chlorowodorkiem aniliny.

7.1.3. Witamina E
Aktywność witaminy E wykazuje około jedenastu związków. Są one dosyć szeroko
rozpowszechnione w przyrodzie. Posiadają układ chromanu, do którego dołączony jest
łańcuch boczny zawierający 13 atomów węgla. W przypadku pochodnych tokoferolu nie
zawiera on wiązań podwójnych, natomiast pochodne tokotrienolu posiadają cztery
wiązania nienasycone (rys. 48). Obie te grupy związków zaliczane są do witamin E.
Związki będące witaminą E są wrażliwe na promieniowanie UV i środki utleniające
(znacznie trwalsze są ich pochodne takie jak octany czy bursztyniany).
R1
HO

R2 O

R3 tokoferol R1 R2 R3
α-tokoferol CH3 CH3 CH3
β-tokoferol CH3 H CH3
R1
γ-tokoferol H CH3 CH3
HO
δ-tokoferol H H CH3
179
R2 O

R3
 R1 R2 R3
tokotrienol α-tokotrienol CH3 CH3 CH3
β-tokotrienol CH3 H CH3

γ-tokotrienol H CH3 CH3

δ-tokotrienol H H CH3

Rys. 48. Tokoferole i tokotrienole

Największą aktywność biologiczną wykazuje α-tokoferol, jego homolog β posiada

30–50% tej aktywności, a pozostałe tokoferole i tokotrienole od maksymalnie 20 do 1%.
Należy jednak zwrócić uwagę na to, że wszystkie tokoferole i tokotrienole mają aktywność
przeciwutleniającą, która rośnie w kierunku od α- do δ-, czyli odwrotnie niż aktywność
biologiczna (decydujące znaczenie ma tu znacznie szybsze wydalanie z organizmu
homologów β- i γ- niż α-tokoferolu, co wpływa na ich obniżoną aktywność biologiczną).
Pomimo tego, że w organizmie człowieka występuje rozbudowany system
antyoksydacyjny, witamina E jest jednym z ważniejszych „wyłapywaczy” tlenu
singletowego i rodników nadtlenkowych. Przerywa też łańcuchową reakcję peroksydacji
lipidów.
Niedobór tokoferoli jest przyczyną wielu chorób metabolicznych, których genezę
wiąże się z brakiem zdolności przeciwutleniających określonych tkanek. Zapotrzebowanie
na witaminę E jest trudne do ustalenia. Wiadomo jednak, że wzrasta wraz ze zwiększaniem
się w diecie nienasyconych kwasów tłuszczowych, które w dużej ilości występują
w olejach ryb. Przyjmuje się, że na 1 g wielonienasyconych kwasów tłuszczowych
zawartych w spożywanych produktach powinno przypadać ok. 0,6 mg α-tokoferolu.
Oznaczanie tokoferoli prowadzi się najczęściej z wykorzystaniem chromatografii
gazowej (GC) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Wstępnie należy
wykonać zmydlenie analizowanej próby i wydzielić frakcję niezmydlającą się, w której
identyfikuje się i oznacza zawartość tokoferoli na podstawie czasów retencji i wysokości
pików. Można też wykorzystać do analizy ilościowej metody kolorymetryczne oparte
najczęściej na reakcji Emmerie-Engla, gdzie dochodzi do przekształcenia tokoferoli
w tokoferylochinony. Pochodne te mogą dawać barwne produkty z α,α’-bipirydylem

180
(pomiar absorbancji przy λ = 520 nm) lub z 4,7-difenylo-1,10-fenantroliną (pomiar
absorbancji przy λ = 534 nm).

7.1.4. Witamina K
Związki należące do tej grupy są pochodnymi nie występującego naturalnie menadionu
(witamina K3) wywodzącego się z naftochinonu. W przyrodzie spotyka się natomiast jego
pochodne zawierające łańcuch boczny, w którym może być obecne jedno wiązanie
podwójne (witaminy szeregu K1) lub więcej (witaminy szeregu K2). Najważniejszym
przedstawicielem witamin K1 jest dostarczany z pożywieniem filochinon, który zawiera
20 atomów węgla w łańcuchu bocznym. Witaminy K 2 są wytwarzane przez florę jelitową
człowieka. Zaliczamy do nich np. menachinon-6 i menachinon-7, które mają odpowiednio
30 i 35 atomów węgla w łańcuchu bocznym i są oznaczane jako K 2(30) i K2(35). Wzory
chemiczne menadionu i menachinonu-n pokazano na rys. 49.

O O

O O n

menadion menachinon-n (n = 6, 7 lub 10)

Rys. 49. Witamina K3 (menadion) i witamina K2 (menachinon-n)

Wolne witaminy K są wrażliwe na światło, czynniki utleniające oraz silne kwasy

i zasady. Trwalsze są ich pochodne estrowe (octany, fosforany). Witamina K jest jednym
z czynników odpowiedzialnych za prawidłowy przebieg procesu krzepnięcia krwi. Trudno
jest ustalić niezbędne dzienne spożycie tej witaminy ze względu na to, że w dużej mierze
jest ona produkowana przez mikroflorę bytującą w jelitach. Jej niedobór prowadzi do
krwawień, niebezpiecznych zwłaszcza u noworodków (skaza krwotoczna), ponieważ w ich
organizmach flora jelitowa nie wytwarza jeszcze witamin K2. Terapeutycznie podaje się
syntetycznie otrzymywaną witaminę K3. Jednak jej nadmiar może być przyczyną
niedokrwistości.
Witamina K występuje w produktach spożywczych w niewielkiej ilości. Potrzebne dla
organizmu ilości tej witaminy są wytwarzane przez florę jelitową i w normalnych
warunkach nie obserwuje się jej niedoboru. Problemy związane z niedoborem witaminy K

181
mogą się pojawiać np. po długotrwałych terapiach antybiotykowych (podczas takich
kuracji należy przyjmować preparaty uzupełniające florę jelitową).

7.2 Witaminy rozpuszczalne w wodzie

Do witamin rozpuszczalnych w wodzie zalicza się witaminy z grupy B (tiamina,
ryboflawina, kwas nikotynowy, kwas pantotenowy, witamina B6, kwas foliowy, witamina
B12 i biotyna) oraz witaminę C, którą traktuje się oddzielnie ze względu na specyficzne
funkcje przeciwutleniające. Witaminy należące do grupy B są bardzo szeroko
rozpowszechnione w przyrodzie. Są one koenzymami kluczowych enzymów
zaangażowanych w takie procesy metaboliczne jak oddychanie komórkowe, przemiany
cukrów, tłuszczów, aminokwasów i białek oraz synteza kwasów nukleinowych, które są
podstawą funkcjonowania wszystkich organizmów. Ich bardzo różnorodne funkcje
biologiczne wiążą się ze zróżnicowaną i specyficzną strukturą chemiczną. Niekiedy
niewielkie zmiany w budowie tych cząsteczek powodują utratę ich aktywności lub czasami
prowadzą do powstania tzw. antywitamin, czyli związków o przeciwstawnej aktywności.
Szczególną wrażliwość witaminy tej grupy wykazują na podwyższoną temperaturę, ale
często tracą też aktywność pod wpływem światła i tlenu (wrażliwość poszczególnych
witamin na czynniki środowiskowe zestawiono w tabeli 12).
Nadmiar witamin rozpuszczalnych w wodzie jest wydalany z moczem, chociaż
w niektórych przypadkach są one również magazynowane w organizmie (kwas foliowy,
witamina B12). Spożycie tych witamin w większych ilościach jest na ogół dobrze
tolerowane, z wyjątkiem witamin PP i B6, których nadmiar może wywoływać działania
niepożądane (szkodliwość nadmiaru witaminy C jest ciągle kwestią sporną).
Nazwy podstawowych związków chemicznych wykazujących aktywność
poszczególnych witamin z tej grupy zestawiono w tabeli 12.
Tabela 12. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i ich wrażliwość na warunki środowiska
witamina wrażliwość
związki chemiczne
(oznaczenie literowe) na warunki zewnętrzne
bardzo wrażliwa na działanie tlenu
kwas L-askorbinowy
i wysokiej temperatury, zwłaszcza
C kwas dehydro-L-askorbinowy w środowisku obojętnym i zasadowym
bardzo wrażliwa na działanie tlenu
chlorek tiaminy i wysokiej temperatury w środowisku
B1 difosforan tiaminy zasadowym, trwała w środowisku
kwaśnym
ryboflawina wrażliwa na światło zwłaszcza w
B2 środowisku zasadowym, w środowisku

182
 kwaśnym termostabilna
kwas nikotynowy odporna na tlen, światło,
PP termostabilna,
amid kwasu nikotynowego
kwas pantotenowy kwas pantotenowy wrażliwy na
podwyższoną temperaturę w
pantotenian sodu
B5 środowisku kwaśnym i zasadowym,
pantotenian wapnia termostabilny w pH obojętnym,
pantotenol sole sodowe i wapniowe są trwalsze
pirydoksyna
wrażliwa na światło zwłaszcza w
fosforan pirydoksalu
B6 środowisku zasadowym
fosforan pirydoksaminy
kwas foliowy
bardzo wrażliwa na tlen, światło i
kwas 5,6,7,8-tetrahydrofoliowy podwyższoną temperaturę
B9
kwas 7,8-dihydrofoliowy
cyjanokobalamina
5’-deoksyadenozylokobalamina wrażliwa na światło i tlen, najbardziej
B12 metylokobalamina trwała cyjanokobalamina
hydroksykobalamina

biotyna i jej sole zasadowe wrażliwa na podwyższoną temperaturę

H

7.2.1. Witamina C
Witamina C to kwas L-askorbinowy oraz jego utleniona forma – kwas dehydro-L-
askorbinowy (rys. 50). Są to pochodne kwasu 2,3-dehydro-L-gulonowego wywodzącego
się z heksoz, w których występuje ugrupowanie endiolowe warunkujące właściwości
redukujące tych związków. Aktywność biologiczną wykazują również analogi kwasu
L-askorbinowego, które zawierają pierścień furanozowy ze strukturą endiolową. Ich
przykładem jest lakton kwasu 2-keto-L-gulonowego oraz sole (askorbiniany sodu, potasu,
wapnia) i estry (np. palmityniany). Związki te mają szerokie zastosowanie jako
przeciwutleniacze dodawane do żywności. Jednak przede wszystkim układ
oksydoredukcyjny witaminy C odgrywa niezmiernie ważną rolę w organizmach żywych,
gdyż jest jednym z bardzo istotnych czynników chroniących komórki przed stresem
oksydacyjnym. Funkcje koenzymatyczne witaminy C nie zostały do tej pory dokładnie
zbadane. Wiadomo jednak, że kwas L-askorbinowy uczestniczy w różnych reakcjach
enzymatycznej hydroksylacji, takich jak hydroksylacja proliny, tryptofanu czy DOPA-
aminy, procesów o dużym znaczeniu dla funkcjonowania organizmów. Hydroksylacja
proliny w kolagenie ma istotny wpływ na utrzymanie właściwego stanu włókien
kolagenowych. Wszystkie funkcje biologiczne witaminy C wynikają z właściwości
oksydacyjno-redukujących układu kwas L-askorbinowy/kwas dehydro-L-askorbinowy

183
(rys. 50). Umożliwia to pobieranie niesparowanych elektronów (neutralizacja wolnych
rodników) i przekazywanie ich w miejsca, gdzie potrzebne jest dostarczanie siły
redukcyjnej, np. dla zachowania zredukowanej formy metali obecnych w grupach
prostetycznych niektórych enzymów lub w procesie reaktywacji tokoferoli (witamina E)
poprzez zredukowanie rodników tokoferylowych. Niedobór witaminy C wywołuje m.in.
niedostateczną hydroksylację kolagenu, co objawia się patologicznymi zmianami skóry
i kruchością naczyń krwionośnych obserwowaną w szkorbucie. Witamina C jest ważnym
stymulatorem układu odpornościowego. Odgrywa też inne bardzo istotne funkcje, m.in.
zwiększa wchłanianie żelaza (redukuje jony Fe3+ do Fe2+, gdyż w tej postaci żelazo lepiej
wchłania się w przewodzie pokarmowym), a poprzez zapewnienie odpowiedniego
potencjału oksydacyjno-redukcyjnego w komórce umożliwia zachowanie odpowiedniego
stopnia utlenienia metali występujących w centrach aktywnych licznych enzymów.

kwas L-askorbinowy kwas dehydro-L-

O O
Rys. 50. Kwas L- C C
askorbinowy i kwas dehydro-L-askorbinowy
C OH - 2H+ - 2e C O
O O
C OH + 2H+ + 2e C O

H C H C
Poziom dziennego zapotrzebowania na witaminę C jest nadal dyskusyjny. Przyjmuje
HO C H HO C H
się, że minimalnie powinien on wynosić 10 mg na dobę. Zapobiega to powstaniu
CH OH CH OH
szkorbutu. Średnio powinno 2się przyjmować około 60 mg witaminy
2
C, przy czym pełne
wysycenie organizmu występuje przy dawce dobowej 200 mg, a przyjmowanie większych
dawek powoduje wydalanie kwasu askorbinowego. Należy zaznaczyć, że zapotrzebowanie
na witaminę C jest większe w przypadku niektórych grup ludności, zwiększa się ono np.
pod wpływem stresu, czy u osób palących tytoń.

Kwas askorbinowy jest najmniej trwałą witaminą. Przyjmuje się, że podczas

przygotowywania potraw dochodzi do ubytku ok. połowy tej witaminy. Jej straty mogą

184
zachodzić zarówno pod wpływem czynników zewnętrznych, jak i obecnych w produktach
spożywczych. Degradacja witaminy C w żywności może być wynikiem przemian
tlenowych (katalizowanych przez enzymy lub niekatalizowanych) oraz beztlenowych.
Kwas L-askorbinowy jest wrażliwy na utlenianie, zwłaszcza pod wpływem podwyższonej
temperatury i promieniowania UV oraz w obecności jonów miedzi (II) i żelaza (III), przez
co podczas obróbki żywności należy ograniczać jej kontakt z wymienionymi metalami
i zwracać uwagę na możliwe zanieczyszczenia. Również procesy technologiczne i niektóre
środki konserwujące (benzoesan sodu, salicylany) powodują jego rozkład. Czynnikami
zawartymi w produktach prowadzącymi do znacznej degradacji tej witaminy są przede
wszystkim enzymy z klasy oksydoreduktaz, wśród nich zwłaszcza oksydaza
askorbinianowa oraz peroksydaza (enzymy te występują w niewielkiej ilości
w ziemniakach, dlatego też, pomimo strat witaminy C podczas gotowania, są one jednym
z jej podstawowych źródeł, szczególnie w polskiej diecie). Witamina C jest najbardziej
trwała w środowisku kwaśnym. W środowisku obojętnym, a zwłaszcza zasadowym kwas
dehydro-L-askorbinowy łatwo ulega decyklizacji do kwasu 2,3-diketogulonowego, który
nie ma właściwości witaminowych, a jego dalsze utlenianie prowadzi do powstania kwasu
szczawiowego i L-treonowego.
Badanie witaminy C może obejmować określenie zawartości formy zredukowanej
(kwasu askorbinowego) lub sumy obu form witaminy (łącznie z kwasem dehydro-L-
askorbinowym). Najpowszechniej do oznaczania witaminy C stosuje się metody
miareczkowe opierające się na właściwościach redukujących kwasu L-askorbinowego.
Klasyczną metodą jest metoda Tillmansa, w której kwaśne roztwory kwasu
L-askorbinowego miareczkuje się roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu – substancji
barwnej, która w wyniku redukcji przechodzi w pozbawiony barwy leukozwiązek. Jest to
metoda bardzo prosta, jednak czasami obarczona dużym błędem związanym
z występowaniem w niektórych produktach substancji przeszkadzających, które mogą
powodować podwyższenie wyników. W przypadku niektórych tkanek roślinnych zaleca
się wstępne usuwanie związków przeszkadzających przez traktowanie próby np. acetonem.
W celu oznaczenia obu biologicznie czynnych form witaminy C, kwas dehydro-L-
askorbinowy należy zredukować do kwasu askorbinowego i oznaczyć sumę obu kwasów.
W tym celu stosuje się najczęściej siarczek sodowy (metoda Pijanowskiego),
homocysteinę, czy glutation. Metody miareczkowe są trudne do wykonania podczas
analizy prób o intensywnej barwie.

185
 Do innych, powszechnie stosowanych metod oznaczania witaminy C należą metody
kolorymetryczne. Wykorzystuje się w nich reakcje witaminy C z różnymi związkami, np.
2,4-dinitrofenylohydrazyną, prowadzące do powstania barwnych połączeń. Zastosowanie
ma też metoda f1uorymetryczna, która pozwala na oznaczenie sumy kwasów tworzących
witaminę C. W trakcie procedury kwas L-askorbinowy utlenia się do kwasu dehydro-L-
askorbinowego. Kwas dehydro-L-askorbinowy kondensuje z o-fenylenodiaminą tworząc
pochodną chinoksalinową wykazującą niebieską fluorescencję. Metoda fluorymetryczna
daje wyniki porównywalne z metodą miareczkową i nadaje się do oznaczania witaminy C
także w produktach silnie zabarwionych, np. w sokach owocowych.
Poza wyżej wymienionymi sposobami oznaczanie witaminy C można prowadzić
z użyciem metod chromatograficznych (HPLC), elektrochemicznych i enzymatycznych.
We wszystkich metodach oznaczania witaminy C bardzo ważnym etapem jest
ekstrakcja. Do ekstrakcji tej witaminy z materiału roślinnego lub produktów spożywczych
stosuje się roztwory różnych kwasów, np. szczawiowego, metafosforowego, mieszaninę
kwasu metafosforowego i octowego. Użycie rozcieńczonych kwasów ma na celu
stabilizację witaminy C i zahamowanie działania oksydaz.

7.2.2. Witamina B1
Witamina B1 (tiamina) jest zbudowana z pierścienia pirymidynowego połączonego
poprzez grupę metylenową z pierścieniem tiazolowym (rys. 51). W przyrodzie występuje
najczęściej w postaci estrów fosforanowych (jako mono-, di- i trifosforan tiaminy).
Funkcje koenzymatyczne pełni difosforan (inaczej pirofosforan) tiaminy (rys. 51), który
współdziała z enzymami zaangażowanymi głównie w przemiany węglowodanów.
NH2 NH2
- -
Cl Cl
+ +
N N N N
O O
N S OH
t N S O P O P O-
iamina difosforan tiaminy O- O-

Rys. 51. Tiamina i difosforan tiaminy

Tiamina może też tworzyć sole, np. chlorowodorki lub azotany, w tej postaci jest
dostępna w handlu. W środowisku zasadowym powstaje forma tiolowa, która
w obecności czynników utleniających kondensuje, tworząc disiarczki mające aktywność
wolnej tiaminy. Zastąpienie grupy aminowej w pierścieniu pirymidynowym grupą –OH

186
prowadzi do powstania antywitaminy zwanej oksytiaminą. Podobne antagonistyczne
właściwości wobec tiaminy wykazuje pirytiamina, która zamiast siarki w pierścieniu
tiazolowym zawiera ugrupowanie –CH=CH–.
Tiamina w środowisku kwaśnym jest termostabilna. W pH obojętnym lub zasadowym
następuje jej rozkład, do którego przyczynia się dostęp tlenu i np. obecność SO 2 (podczas
gotowania wydziela się charakterystyczny zapach, który jest m.in. spowodowany
termicznym rozpadem tiaminy). Również alkohol etylowy rozkłada w znacznym stopniu
witaminę B1.
Szczególnie niebezpieczne przy niedoborze tiaminy jest spożywanie dużej ilości cukru,
ponieważ dochodzi wtedy do gromadzenia się kwasu pirogronowego i mlekowego, co
z kolei prowadzi ostatecznie do zaniku otoczki mielinowej i zaburzeń układu nerwowego.
W zaawansowanej postaci dochodzi do porażenia wielonerwowego i rozwoju tzw. choroby
beri-beri. Hipowitaminoza (niedobór) prowadzi też do zaburzeń płodności u kobiet. Nie
zauważono objawów hiperwitaminozy, gdyż zwiększone ilości tiaminy wydalane są wraz
z moczem. Z reguły jej zapotrzebowanie jest podawane w odniesieniu do ilości
spożywanych kalorii i wynosi średnio 0,4 mg/1000 kcal. Zapotrzebowanie zwiększa się
u osób palących, nadużywających alkoholu, kawy i herbaty oraz w stanach stresu.

7.2.3. Witamina B2
Witamina B2, czyli ryboflawina to układ 7,8-dimetyloizoalloksazyny połączony
z rybitolem. Układ izoalloksazynowy służy jako akceptor protonów i elektronów. Stanowi
on podstawową część koenzymów FMN i FAD, wchodzących w skład enzymów
flawinowych należących do klasy oksydoreduktaz. FMN, czyli mononukleotyd flawinowy,
jest fosforanową pochodną ryboflawiny, powstającą w wyniku estryfikacji grupy
hydroksylowej przy C-5 rybitolu. Przyłączenie do FMN kwasu adenilowego prowadzi do
powstania FAD – dinukleotydu flawinoadeninowego. Wzory chemiczne ryboflawiny oraz
jej pochodnych pełniących funkcje koenzymów pokazano na rys. 52.

H O
H C OH H2C O P OH
H C OH H C OH O -
H C OH H C OH
H C OH H C OH
CH2 CH2
H3C N N O H3C N N O

NH 187
NH
H3C N H3C N
O O
 ryboflawina mononukleotyd flawinowy
7,8-dimetylo-10-rybityloizoalloksazyna (FMN)

NH2
N
N
O O N N
H2C O P O P O CH2
- O- O
H C OH O
H C OH
H C OH OH OH
CH2
H3C N N O

NH
H3C N
O
dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

Rys. 52. Ryboflawina, mononukleotyd flawinowy i dinukleotyd flawinoadeninowy

FMN i FAD są koenzymami enzymów katalizujących reakcje utleniania i redukcji.

Forma utleniona – FAD – po przyjęciu dwóch atomów wodoru oddawanych przez substrat
przechodzi w formę zredukowaną, oznaczaną skrótem FADH2 (rys. 53).
R R H
H3C N N O H3C N N O
+
+ 2H + 2e
NH + NH
H3C N - 2H - 2e H3C N
O H O
forma utleniona forma zredukowana
(np. FAD) (np. FADH2)

Rys. 53. Forma utleniona i zredukowana pierścienia izoalloksazynowego

Większość enzymów flawinowych współdziała z dinukleotydem flawinoadeninowym
(FAD). Katalizują one wiele reakcji utleniania i redukcji związanych z transportem
protonów i elektronów. Największe znaczenie dla organizmu ma transport protonów
i elektronów poprzez kolejne przenośniki w łańcuchu oddechowym zlokalizowanym

188
w błonie mitochondrialnej, w którym uczestniczą m.in. enzymy flawinowe. W typowym
łańcuchu oddechowym NADH + H+ (zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy,
pochodna witaminy PP) przenosi wodór na enzymy flawinowe, które stanowią drugi etap
łańcucha oddechowego. Te z kolei przekazują protony i elektrony na kolejny przenośnik,
którym jest koenzym Q. Ostatecznie transportowane protony i elektrony trafiają na tlen
cząsteczkowy i powstaje woda. Efektem takich reakcji jest pozyskiwanie przez komórki
energii, gromadzonej w postaci makroergicznego związku jakim jest ATP
(adenozynotrifosforan). Poza występowaniem w łańcuchu oddechowym enzymy
flawinowe pełnią też inne istotne funkcje, dostarczają siły redukcyjnej, bądź biorą udział
w reakcjach odwodorowania, np. nasyconych kwasów tłuszczowych.
Ryboflawina słabo rozpuszcza się w wodzie, dobrze w rozcieńczonych kwasach
i zasadach. W roztworach wodnych wykazuje żółtozieloną fluorescencję. Ryboflawina jest
stosunkowo trwała w temperaturze pokojowej, a gotowanie lub pieczenie powoduje straty
w granicach 15–20% wyjściowej zawartości. Bardzo wrażliwa jest natomiast na działanie
promieniowania ultrafioletowego. Pozostawienie mleka w butelce z jasnego szkła na
2 godziny na świetle dziennym może spowodować straty witaminy B 2 wynoszące 40–70%.
Pod wpływem promieniowania UV ryboflawina ulega fotolizie (odłączenie cząsteczki
rybitolu) do związków pozbawionych aktywności. Zależnie od odczynu środowiska po
naświetleniu ryboflawiny powstaje lumiflawina (w środowisku zasadowym) lub
lumichrom (w środowisku kwaśnym).
Dzienne zapotrzebowanie ryboflawiny podaje się przeważnie w stosunku do ilości
spożywanych kalorii i powinno ono wynosić 0,55 mg/1000 kcal. Niedobór ryboflawiny
w organizmie może spowodować zmiany w jamie ustnej, łojotokowe zapalenie skóry, czy
zmiany w oku takie jak odczucie obecności piasku pod powiekami, zapalenie spojówek
oraz zapalenie nerwu wzrokowego.
Oznaczanie ilościowe witaminy B2 przeprowadza się przy użyciu metod
fizykochemicznych, mikrobiologicznych lub chromatograficznych, przy czym
powszechnie stosuje się metody fizykochemiczne. Ze względu na dużą wrażliwość
ryboflawiny na działanie światła, oznaczenia powinno prowadzić się przy jak
najmniejszym jego dostępie. Charakterystyczną cechą ryboflawiny i koenzymów FMN
i FAD oraz lumichromu i lumiflawiny jest zdolność fluorescencji. Metody ilościowego
oznaczania opierają się najczęściej na pomiarze fluorescencji ryboflawiny lub fluorescencji
lumiflawiny. Wstępnym etapem oznaczania ryboflawiny na podstawie jej fluorescencji jest
hydroliza koenzymów do wolnej ryboflawiny, gdyż FAD wykazuje ok. 10–15%

189
fluorescencji ryboflawiny. Następnie wykonuje się pomiary fluorescencji (intensywność
fluorescencji flawin jest proporcjonalna do absorpcji promieniowania w zakresie 210-550
nm). Oznaczoną w ten sposób sumę flawin określa się jako zawartość ryboflawiny.
W metodzie lumiflawinowej wykorzystuje się różnice w rozpuszczalności ryboflawiny
i lumiflawiny. Ryboflawina i jej pochodne są nierozpuszczalne w chloroformie, w którym
bardzo dobrze rozpuszcza się lumiflawina. Po naświetleniu w środowisku zasadowym
następuje przekształcenie ryboflawiny w lumiflawinę, którą ekstrahuje się chloroformem
i mierzy jej fluorescencję.

7.2.4. Witamina PP
Witamina PP, inaczej niacyna, to kwas nikotynowy i jego amid. Są to pochodne
pirydyny. Należą do najbardziej trwałych witamin. Amid kwasu nikotynowego jest
składnikiem koenzymów: dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) oraz jego
fosforanu (NADP). Wzory chemiczne witaminy PP oraz koenzymów NAD + oraz NADP+
przedstawiono na rys. 54.
O
O C NH2
C OH O

HO P O CH2 N
N O

kwas nikotynowy
O OH OH
NH2
O
C NH2 N
N
HO P O CH2
N N
N O O
amid kwasu
nikotynowego R = H (NAD +)
Rys. 54. Kwas nikotynowy, jego amid i dinukleotyd OH OR R = PO32- (NADP +)
nikotynamidoadeninowy (NAD+)
+
oraz jego fosforan (NADP )
Koenzymy NAD i NADP są składnikami dehydrogenaz, enzymów należących do klasy
oksydoreduktaz. Biorą one (podobnie jak koenzymy FMN i FAD, pochodne witaminy B 2)
udział w transporcie protonów i elektronów, co jest niezmiernie istotne w procesie
pozyskiwania energii w łańcuchu oddechowym. Enzymy te uczestniczą również
w przemianach białek, tłuszczów i węglowodanów oraz w syntezie hormonów (takich jak
np. insulina, tyroksyna). Ze względu na udział koenzymów NAD i NADP w licznych

190
szlakach metabolicznych może dochodzić do różnych objawów niedoboru niacyny.
Najbardziej typową awitaminozą jest pelagra, której objawy określa się jako 3 x D
(dermatosis – zapalenie skóry, diarrhoea – biegunka, depressio – depresja). Należy
zaznaczyć, że znaczna ilość niacyny pochodzenia roślinnego występuje w postaci
nieprzyswajalnych połączeń z białkami, które rozpadają się w środowisku zasadowym
(w niektórych krajach, gdzie podstawą wyżywienia jest kukurydza, aby zapobiec pelagrze
kolby moczy się w wodzie wapiennej). W organizmie człowieka witamina PP może
powstawać z tryptofanu przy udziale innych witamin grupy B. Dzienne zapotrzebowanie
podaje się w odniesieniu do ilości spożywanych kalorii i powinno ono wynosić 6,6
mg/1000 kcal.
Metody oznaczania witaminy PP opierają się głównie na reakcjach barwnych pirydyny
z takimi związkami jak cyjanek bromu i kwas sulfanilowy (tzw. reakcja Königa). Przed
wykonaniem oznaczeń ilościowych należy uwolnić związaną niacynę poprzez
przeprowadzenie hydrolizy kwasowej lub zasadowej.

7.2.5. Kwas pantotenowy

Kwas pantotenowy, czyli N-(2,4-dihydroksy-3,3-dimetylo-1-oksobutylo)-β-alanina,
określany także jako witamina B5, składa się z kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-
dimetylomasłowego i β-alaniny, które połączone są ze sobą wiązaniem peptydowym
(rys. 55).

CH3 H H O
HO CH2 C C C N CH2 CH2 C
CH3 OH O O-

kwas 2,4-dihydroksy- β-alanina

-3,3-dimetylomasłowy

Rys. 55. Kwas pantotenowy

Kwas pantotenowy w wolnej postaci jest żółtą oleistą cieczą. Dobrze rozpuszcza się
w wodzie, kwasie octowym, etanolu i acetonie. Jest on nietrwały i łatwo ulega rozpadowi
w środowisku zarówno kwaśnym jak i zasadowym. Większą trwałość wykazuje w postaci
soli wapniowych i sodowych lub w formie alkoholowej jako pantenol.
Fosforan kwasu pantotenowego, obok 3,5-difosforanu adenozyny i cysteaminy, jest
składnikiem koenzymu A, w którym czynne ugrupowanie koenzymu stanowi grupa

191
sulfhydrylowa (–SH). Do niej mogą przyłączać się grupy acylowe bądź acetylowe.
Powstaje wtedy acylokoenzym A lub acetylokoenzym A, związki niezmiernie ważne jako
przenośniki aktywowanych grup acylowych bądź acetylowych. Acetylokoenzym A
dostarcza m.in. jednostek dwuwęglowych potrzebnych np. do syntezy kwasów
tłuszczowych, fosfolipidów, cholesterolu lub uczestniczy w przemianach związanych
z gospodarką energetyczną. Podstawowym materiałem energetycznym komórek są
węglowodany. Energia, która wydziela się w wyniku rozkładu ich cząsteczek jest
magazynowana w postaci ATP. Aby mogło dojść do powstania jak największych jego
ilości cząsteczki cukrów muszą ulec odpowiednim przemianom. Jednym ze związków,
które powstają w wyniku tych przemian jest acetylokoenzym A. Powstaje on też w wyniku
przemian innych związków, które mogą stanowić materiał energetyczny (tłuszcze, w razie
potrzeby również białka). Związki te po przekształceniu do acetylokoenzymu A ulegają
dalszym przemianom w cyklu Krebsa i łańcuchu oddechowym, których najważniejszym
efektem jest uzyskanie energii. Podczas spożywania nadmiernych ilości glukozy, poprzez
powstający z niej acetylokoenzym A, dochodzi do syntezy znacznych ilości kwasów
tłuszczowych (gromadzenie zapasowego materiału energetycznego). Acetylokoenzym A
łączy wiele różnych szlaków metabolicznych i w zależności od potrzeb organizmu
umożliwia wzajemne przemiany jednych związków w inne.
Pomimo tego, że kwas pantotenowy odgrywa tak istotną rolę w przemianach
metabolicznych, skutki jego niedoboru nie zostały jak dotychczas w pełni zbadane. Wiąże
się to głównie z tym, że występuje on dosyć powszechnie w żywności oraz dodatkowo jest
produkowany przez mikroflorę jelitową. W związku z tym trudno jest też określić dzienne
jego zapotrzebowanie, szacuje się je na poziomie 5–10 mg. Do oznaczeń ilościowych
kwasu pantotenowego stosuje się metody enzymatyczne i mikrobiologiczne.

7.2.6. Witamina B6

192
 Witamina B6, czyli pirydoksyna jest pochodną pirydyny. Pirydoksyna to 2-metylo-3-
hydroksy-4,5-dihydroksymetylopirydyna. Grupa alkoholowa pirydoksyny może być
zastąpiona przez grupę aldehydową lub aminową, a powstałe związki określane są
odpowiednio jako pirydoksal i pirydoksamina. Po dołączeniu do nich grupy fosforanowej
powstają związki wykazujące aktywność koenzymatyczną, czyli fosforan pirydoksalu
i OH
H O NH2
CH2 C CH2
HO 4 HO
3 5 CH2 OH CH2 OH HO
2
CH2 OH
6
1
H3C N H3C N H3C N
fosforan pirydoksaminy. Na rys. 56 przedstawione zostały
wzory chemiczne pirydoksyny i jej pochodnych.

pirydoksyna pirydoksal pirydoksamina

H O NH2
C CH2
O O
HO HO
CH2 O P OH CH2 O P OH
OH OH
H3C N H3C N
fosforan
pirydoksalu fosforan pirydoksaminy

Rys. 56. Związki o aktywności witaminy B6 (pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina) oraz

koenzymy: fosforan pirydoksalu i fosforan pirydoksaminy

Wszystkie grupy hydroksylowe obecne w cząsteczce pirydoksyny mogą wiązać kwasy

tłuszczowe i tworzyć estry. Zanik aktywności witaminy B6 następuje w wyniku utraty
podstawników dołączonych do węgla C-4 (tzn. grupy hydroksymetylowej, aldehydowej,
aminoetylowej) lub ich utlenienia do grupy karboksylowej. Natomiast ich redukcja do
grupy CH3 prowadzi do powstania antywitamin.
Jako koenzym wchodzący w skład enzymów witamina B6 bierze udział w przemianach
aminokwasów (np. uczestniczy w reakcjach powstawania hormonów: noradrenaliny

193
i adrenaliny z tyrozyny i fenyloalaniny), uczestniczy w metabolizmie polisacharydów,
kwasów tłuszczowych i steroli. Odgrywa istotną rolę w procesie powstawania kluczowych
związków związanych z syntezą hemu, jej niedobór może prowadzić do niedokrwistości.
Inne objawy niedoboru tej witaminy występują rzadko, gdyż jest ona produkowana przez
mikroflorę jelitową. Wielkość zapotrzebowania na witaminę B6 wyraża się w stosunku do
ilości spożywanego białka i powinna ona wynosić 0,02 mg/g białka. Witamina B 6 ulega
rozkładowi pod wpływem światła, zwłaszcza w środowisku zasadowym.
Oznaczanie ilościowe witaminy B6 w żywności prowadzi się głównie z użyciem metod
spektrofotometrycznych. Wykorzystuje się tu reakcje barwne z chlorkiem diazoniowym
kwasu p-benzenosulfonowego lub z 2,6-dichlorochinonochloroimidem.

7.2.7. Kwas foliowy

Kwas foliowy określany czasami jako witamina B9, to kwas pteroilomonoglutaminowy
(4’-N-[(2-amino-4-hydroksy-6-pterydylo)metylo]-aminobenzoilo-L-glutaminowy).
W cząsteczce tej witaminy 2-amino-4-hydroksy-6-metylopterydyna połączona jest
z kwasem p-aminobenzoesowym i kwasem glutaminowym (rys. 57). Do kwasu
glutaminowego mogą być dołączone kolejne jego cząsteczki, a powstałe związki zwane są
folianami (im więcej cząsteczek kwasu glutaminowego tym mniejsza aktywność).

OH O COOH
N CH2 NH C NH CH
N
CH2
H2N N N CH2
COOH

2-amino-4-hydroksy- kwas kwas

-6-metylopterydyna p-aminobenzoesowy glutaminowy

Rys. 57. Kwas foliowy

Biologicznie czynną formą kwasu foliowego jest jego postać zredukowana, czyli kwas
5,6,7,8,-tetrahydrofoliowy (inaczej folacyna) lub 7,8-dihydrofoliowy. Aktywność
biologiczną posiadają również inne pochodne kwasu tetrahydrofoliowego, np. tzw.
aktywny mrówczan (kwas N10-formylotetrahydrofoliowy). Zastąpienie grupy –OH przy
węglu C-4 kwasu foliowego grupą –NH 2 prowadzi do powstania antywitaminy PP.
Natomiast utrata aktywności następuje po odłączeniu cząsteczki kwasu glutaminowego.

194
Kwas foliowy słabo rozpuszcza się w wodzie, dobrze w kwasie octowym. Jest wrażliwy na
środki utleniające, podwyższoną temperaturę i światło.
W przemianach kwasu tetrahydrofoliowego uczestniczy kobalamina (witamina B12).
Kwas tetrahydrofoliowy łącznie z kobalaminą bierze udział w procesie produkcji krwinek
czerwonych w szpiku kostnym. Powstający z tetrahydrofolianu kwas
metylenotetrahydrofoliowy uczestniczy w reakcjach transmetylacji związanych m.in.
z syntezą nukleotydów wchodzących w skład kwasów nukleinowych (DNA i RNA), co
jest niezbędnym warunkiem wzrostu i podziału komórek. Objawy niedoboru to zaburzenia
syntezy kwasów nukleinowych, prowadzące ostatecznie do anemii megaloblastycznej
(dawniej zwanej złośliwą). Foliany występują powszechnie w żywności, jednak
wchłonięciu w przewodzie pokarmowym ulegają tylko te, które występują w postaci
wolnej (stanowią one 25-30% wszystkich folianów). Jest to przyczyną ich niedoborów.
Oznaczanie kwasu foliowego w żywności można prowadzić z wykorzystaniem metod
kolorymetrycznych po przeprowadzeniu reakcji barwnej z N-1-naftylofenylodiaminą. Jest
to jednak dosyć skomplikowane, ponieważ przed wykonaniem reakcji należy wszystkie
formy kwasu foliowego przeprowadzić do kwasu p-amino-benzoiloglutaminowego.
Możliwe jest też stosowanie metod fluorymetrycznych w zakresie UV po utlenieniu kwasu
foliowego do kwasu 2-amino-6-hydroksypterydyno-9-karboksylowego.

7.2.8. Witamina B12

Podstawą skomplikowanej struktury witaminy B12 (kobalaminy), należącej do
R
tzw. korynoidów, jest układ pseudoporfirynowy (inaczej korynowy)
H2N O
zbudowany
H2N z czterech
O zredukowanych pierścieni pirolowych z
kompleksowo przyłączonym atomem kobaltu (rys. 58).
O NH2

H2N R = CN – cyjanokobalamina
O
N N R = OH – hydroksykobalamina
Co
R = H2O– akwakobalamina
N N
O R = ONO – nitritokobalamina

R = CH3 – metylokobalamina
NH2
NH2
N
N
NH O O NH2
R= CH2
O N N
N O
O P O OH

OH N
OH H
195
O
HO 5’deoksyadenozylokobalamina
Rys. 58. Witamina B12 (kobalamina)
Centralnie umieszczony w strukturze pierścienia korynowego atom kobaltu jest
związany kompleksowo z nukleotydem 5,6-dimetylobenzimidazolowym przyłączonym za
pomocą bocznego łańcucha (1-amino-2-propanol) do jednego z pierścieni pirolowych
koryny. Aktywność kobalaminy zależy od obecności tego nukleotydu (w przypadku, gdy
zamiast 5,6-dimetylobenzimidazolu występuje w tym układzie adenina dochodzi do utraty
aktywności biologicznej). Dodatkowo cząsteczka ta może zawierać dołączone w położeniu
R (rys. 58) grupy takie jak np.: cyjanowa (–CN), metylowa (–CH3), hydroksylowa (–OH),
nitritowa (–ONO) lub wodę. W zależności od obecności określonych grup wyróżnia się
różne formy kobalaminy wywodzące się od nazw podstawników (cyjanokobalamina,
metylokobalamina, hydroksykobalamina, nitritokobalamina i akwakobalamina). Jako
ugrupowanie R może też występować 5’-deoksyadenozyna, a powstały związek nosi
nazwę 5’-deoksyadenozylokobalaminy. Przyjmuje się, że wszystkie formy kobalaminy
wykazują aktywność biologiczną i mogą w organizmie człowieka przechodzić jedna
w drugą. Najbardziej trwałą postacią witaminy B 12 jest cyjanokobalamina, która jest
stosowana w lecznictwie. Jako składniki koenzymów ważną rolę odgrywają pochodne
5’adenozylowa oraz metylowa kobalaminy. Uczestniczą one w reakcjach
wewnątrzcząsteczkowych przegrupowań (izomeryzacja) oraz przenoszenia grupy
metylowej. Są to reakcje niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania komórek, w tym
szczególnie szpiku kostnego (układ krwiotwórczy) i komórek nerwowych. Witamina ta
pełni bardzo istotne funkcje związane z przemianami kwasu foliowego, który z kolei
uczestniczy w syntezie nukleotydów purynowych i pirymidynowych budujących kwasy
nukleinowe. Niedobory tej witaminy mogą być przyczyną zaburzeń neurologicznych.
Kobalaminy są podobnie jak większość witamin z grupy B syntetyzowane
w przewodzie pokarmowym człowieka, jednak co ciekawe nie zawsze mogą być z tego
źródła pozyskiwane, gdyż wchłanianie kobalaminy następuje w środowisku kwaśnym

196
i w obecności enzymów proteolitycznych. Kobalaminy, które powstają w jelicie grubym są
zatem wydalane.
Kobalamina występuje w dość znacznej ilości w produktach pochodzenia zwierzęcego,
jest jednak bardzo wrażliwa na procesy związane z obróbką technologiczną i zabiegi
kulinarne, jej straty mogą dochodzić aż do 70%.
Do ilościowego oznaczania witaminy B12 w żywności najczęściej stosuje się metody
spektrofotometryczne. Należy jednak z dużą starannością oczyścić analizowane próby
ze związków towarzyszących.

7.2.9. Biotyna
Biotyna (zwana też witaminą H) jest to kwas cis-tetrahydro-2-oksotieno-(3,4)-
imidazolo-walerianowy. W swej cząsteczce zawiera dwa skondensowane układy
pierścieniowe: imidazolowy i tetrahydrotiofenowy, do którego w pozycji C-2 dołączony
jest kwas walerianowy (rys. 59).

HN NH

O
S C
OH
Rys. 59. Biotyna

Biotyna może występować w formie ośmiu optycznie czynnych izomerów oraz

czterech mieszanin racemicznych. Spośród nich aktywność biologiczną wykazuje tylko
D-biotyna. Wolna biotyna może tworzyć sole z zasadami lub reagować z alkoholami dając
estry. Wszystkie te pochodne posiadają nadal aktywność. Jest ona termostabilna, odporna
na działanie kwasów i zasad, ulega rozkładowi pod wpływem czynników utleniających.
Biotyna jako koenzym jest głównie składnikiem karboksylaz i uczestniczy w reakcjach
przenoszenia grupy karboksylowej. Przykładem takiego enzymu jest karboksylaza
acetylokoenzymu A, która bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych.
W produktach spożywczych biotyna występuje w ilościach, które powinny zaspokajać
jej zapotrzebowanie, ponadto dodatkowym jej źródłem jest mikroflora jelitowa.
Ewentualne niedobory biotyny mogą występować wtedy, gdy spożywa się surowe jaja.
Występująca w białku jaja awidyna wiąże się z biotyną, co prowadzi do powstania
nieprzyswajalnego kompleksu. Reakcja awidyny z biotyną charakteryzuje się bardzo dużą

197
specyficznością, dzięki temu ma szerokie zastosowanie analityczne, np. jest przydatna
w metodach badania kwasów nukleinowych. Stosowanie awidyny może też być przydatne
do oznaczania ilościowego biotyny w produktach spożywczych.

8. Zagadnienia
1. Witaminy, definicja i podział.
2. Koenzymatyczne funkcje witamin.
3. Przeciwutleniające właściwości niektórych witamin i prowitamin.
4. Karotenoidy – podział i występowanie, funkcje prowitaminowe i przeciwutleniające,
struktura, właściwości, wartość biologiczna.
5. Witamina A. Występowanie, struktura, właściwości, znaczenie fizjologiczne.
6. Witamina D, prowitaminy. Budowa, najważniejsze funkcje, występowanie.
7. Witamina E. Związki określane mianem witaminy E. Właściwości, funkcje,
występowanie.
8. Witamina K. Budowa, najważniejsze funkcje, występowanie.
9. Witamina C. Związki określane mianem witaminy C. Struktura, właściwości,
znaczenie fizjologiczne, występowanie.
10. Witamina B1. Struktura, właściwości, funkcje koenzymatyczne, występowanie.
11. Witamina B2. Struktura, właściwości, funkcje koenzymatyczne, występowanie.
12. Witamina B6, struktura, funkcje koenzymatyczne.
13. Witamina PP (niacyna), struktura, funkcje koenzymatyczne.
14. Biotyna (witamina H), struktura, funkcje koenzymatyczne.
15. Kwas pantotenowy, struktura, funkcje koenzymatyczne.
16. Kwas foliowy i witamina B12. Właściwości, najważniejsze funkcje, występowanie.
17. Wrażliwość witamin na różne czynniki środowiskowe. Straty w żywności.
18. Oznaczanie zawartości witamin w żywności.

198
9. Część eksperymentalna
9.1. Rozdział karotenoidów metodą chromatografii adsorpcyjnej na tlenku glinu
i oznaczanie ilościowe β-karotenu i likopenu

Zasada oznaczenia
Oznaczanie ilościowe karotenoidów obejmuje ich ekstrakcję, rozdział
chromatograficzny oraz pomiar intensywności zabarwienia metodą spektrofotometryczną.
Źródłem karotenów może być koncentrat pomidorowy (lub pomidory), a ekstrakcja
może być wykonana przy użyciu eteru naftowego. Uzyskany roztwór zagęszcza się przez
destylację w atmosferze azotu i nanosi na kolumnę wypełnioną Al 2O3. Powinowactwo
adsorpcyjne karotenoidów zależy od konfiguracji przestrzennej i polarności ich cząsteczek,
ksantofile posiadające grupy –OH są silniej adsorbowane od węglowodorów
beztlenowych, takich jak β-karoten czy likopen (spośród tych ostatnich silniej adsorbuje
się likopen, który ma więcej wiązań podwójnych). Karotenoidy o konfiguracji all-trans
adsorbują się słabiej niż izomery cis. Biorąc pod uwagę wymienione zależności
w kolumnie jako dolna żółta warstwa (o najmniejszym powinowactwie adsorpcyjnym)
będzie widoczny β-karoten, nieco wyżej będzie znajdował się czerwony likopen. Na samej
górze kolumny będą adsorbowały się ksantofile. Przy ostrożnym zwiększaniu polarności
eluentu widoczne będą pasma izomerów all-trans i cis zarówno β-karotenu jak i likopenu.
Karotenoidy najsilniej adsorbują się z rozpuszczalników niepolarnych (np. eter
naftowy). Po rozdziale na poszczególne warstwy elucję z kolumny przyspiesza się poprzez
zwiększanie polarności rozpuszczalnika przemywającego kolumnę (najczęściej stosuje się
w tym celu aceton). Stopniowo zwiększając ilość acetonu (od np. 0,5 do 5–10%) można
ilościowo wyeluować β-karoten, likopen i inne karoteny. Ksantofile wymywają się dopiero
przy znacznie większych stężeniach acetonu (około 50%).

199
 Po zebraniu frakcji zawierających odpowiednio β-karoten i likopen wykonuje się
pomiary absorbancji. W przypadku β-karotenu pomiaru dokonuje się najczęściej przy
długości fali 451 nm, natomiast dla likopenu stosuje się długość fali równą 472 nm. Na
podstawie wielkości absorbancji określa się stężenie karotenu i likopenu posługując się
1%
odpowiednią krzywą wzorcową lub wykorzystując współczynnik A1cm (absorbancja 1%
roztworu zmierzona w kuwecie o grubości warstwy 1 cm). W przypadku sporządzania
krzywej wzorcowej do oznaczeń β-karotenu można posłużyć się krzywą wykreśloną dla
wodnych roztworów dwuchromianu potasowego (roztwór dwuchromianu potasowego
o stężeniu 360 μg/cm3 odpowiada stężeniu β-karotenu równemu 2,08 μg/cm3).

Wykonanie
Ekstrakcja karotenoidów z koncentratu pomidorowego
W zlewce o pojemności 100–250 cm3 odważyć 1–5 g koncentratu pomidorowego lub
10 g rozdrobnionych pomidorów (naważka powinna zawierać 20–80 μg β-karotenu). Próbę
zalać metanolem lub acetonem (około 10 cm3/g próby) i odstawić na 15 minut, od czasu do
czasu mieszając bagietką. Roztwór znad osadu przelać na sączek piankowy G3
umieszczony w kolbie ssawkowej, a pozostałość w zlewce zalać mieszaniną eter naftowy:
aceton w stosunku 1:1 w ilości 25–30 cm 3 i przenieść na sączek. Ekstrakt odsączyć pod
zmniejszonym ciśnieniem do tej samej kolby, co metanol lub aceton (nad osadem na
sączku pozostawia się cienką warstwę rozpuszczalników, aby uniknąć strat karotenów).
Ekstrakcję prowadzić do odbarwienia próby lub do czasu, gdy kolejne dwie warstwy
przesączu będą bezbarwne. Zwykle do ekstrakcji potrzeba łącznie około 100–150 cm 3
mieszaniny rozpuszczalników. Ostatnią porcję rozpuszczalników odsączyć całkowicie.
Połączone wyciągi przenieść do rozdzielacza o pojemności 500–750 cm3.

Oczyszczanie, suszenie i zagęszczanie ekstraktu

Ekstrakt w rozdzielaczu przemyć wodą w celu usunięcia acetonu i metanolu. Zawartość
rozdzielacza łagodnie wytrząsać przez 30 s (gdy powstanie emulsja, do rozdzielacza
należy dodać kilka kropel etanolu). Po rozdzieleniu faz, dolną warstwę zlać do drugiego
rozdzielacza. Górną warstwę przemyć kilkoma porcjami wody i po oddzieleniu przesączyć
przez sączek z bezwodnym siarczanem sodu do kolby miarowej o objętości 200–250 cm 3.
Połączone warstwy wodne zebrane w drugim rozdzielaczu wytrząsać z dwiema porcjami
eteru naftowego dla uzyskania reekstrakcji karotenów. Wyciąg eterowy przesączyć do tej

200
samej kolby, w której zebrano główną warstwę eterową. Ekstrakt zagęścić oddestylowując
eter pod zmniejszonym ciśnieniem w atmosferze azotu do objętości około 1 cm3.
W uzyskanym ekstrakcie można ustalić łączne stężenie wszystkich karotenów
w próbie. W tym celu przed dokonaniem ekstrakcji należy zawartość kolby miarowej
uzupełnić do kreski eterem naftowym i dokonać pomiaru absorbancji. Jeżeli ekstrakt nie
jest klarowny dodać przed pomiarem bezwodnego siarczanu sodowego.

Rozdział chromatograficzny
Rozdział chromatograficzny prowadzić w kolumnie, którą stanowi szklana rurka
o średnicy 1 cm i wysokości ok. 30 cm z kapilarnym wypływem. Na jej dnie należy
umieścić mały zwitek waty i delikatnie ubić go bagietką. Następnie do kolumny
wprowadza się Al2O3 w eterze naftowym do osadzenia warstwy o wysokości ok. 10 cm.
Złoże należy przemyć eterem (ok. 20-50 cm 3) i na powierzchni umieścić warstwę
bezwodnego siarczanu sodowego o wysokości ok. 1 cm. W czasie upakowywania kolumny
i późniejszego rozdziału karotenów nie można dopuścić do jej zapowietrzenia.
Na przygotowaną kolumnę nanieść 1 cm3 ekstraktu. Po zaadsorbowaniu karotenów
kolumnę przemywać eterem naftowym do uzyskania rozdzielonych barwnych warstw.
Następnie prowadzić elucję kolejnych karotenów zwiększając stopniowo polarność
rozpuszczalnika, którym przemywa się złoże (w tym celu do 10 cm 3 eteru naftowego
dodawać po jednej kropli acetonu). Ostrożnie i stopniowo zwiększając ilość acetonu
obserwować zachowanie warstw barwników. Jeżeli przemieszcza się najszybciej dolna
warstwa, natomiast inne zdecydowanie wolniej, oznacza to, że polarność rozpuszczalnika
jest odpowiednia. Jeżeli zaobserwuje się zbyt szybkie przemieszczanie się wszystkich
barwników należy obniżyć polarność rozpuszczalnika (przemyć kolumnę czystym eterem).
Gdy warstwa β-karotenu przesunie się do dolnej części kolumny należy zmienić
odbieralnik i zbierać eluat do momentu, aż z kolumny będzie wyciekał bezbarwny
rozpuszczalnik. Podobnie należy zebrać frakcję likopenu. Zebrane frakcje przenieść do
kolbek miarowych o objętości dobranej w zależności od intensywności ich barwy
i rozcieńczyć eterem naftowym (β-karoten występuje w pomidorach w stosunkowo
niewielkiej ilości, dlatego najczęściej wykonuje się pomiar absorbancji bez rozcieńczania
zebranej frakcji; likopen wymaga rozcieńczenia do objętości 50–100 cm3).

Pomiar absorbancji

201
 Pomiar absorbancji dla β-karotenu należy wykonać wobec eteru naftowego przy
długości fali 451 nm, a dla likopenu przy 472 nm.

Sporządzenie krzywej wzorcowej dla oznaczeń ilościowych β-karotenu

Krzywą wzorcową dla β-karotenu można wykreślić na podstawie pomiarów
absorbancji wykonanych dla wodnych roztworów dwuchromianu potasowego. W tym celu
należy przygotować roztwór dwuchromianu potasu o stężeniu 360 mg na 1000 cm 3 wody
destylowanej. Kolejno należy przygotować szereg rozcieńczeń pobierając 20, 40, 60 i 80
cm3 roztworu dwuchromianu do kolbek miarowych o pojemności 100 cm 3 i uzupełniając
do kreski wodą. Następnie zmierzyć absorbancję kolejno przygotowanych roztworów
wobec wody przy długości fali 451 nm. Krzywą wzorcową wykreślić odkładając na osi Y
odczytane wartości absorbancji, a na osi X odpowiadające poszczególnym rozcieńczeniom
dwuchromianu stężenia β-karotenu, wynoszące: 0,416; 0,832; 1,248; 1,666 i 2,08 μg/cm3.

Obliczanie i interpretacja wyników

Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji stężenie β-karotenu lub likopenu
w zebranych frakcjach można odczytać z odpowiednich krzywych wzorcowych.
Uwzględniając objętość frakcji oraz biorąc pod uwagę, że na kolumnę nanoszono 1 cm 3
ekstraktu przygotowanego z określonej naważki próby, można obliczyć zawartość tych
karotenów w badanej próbie. Do obliczenia ilości mg β-karotenu lub likopenu zawartych
w 100 g produktu można wykorzystać wzór:

a  V  100
x
m  1000
gdzie:
a – stężenie β-karotenu lub likopenu odczytane z odpowiednich krzywych wzorcowych (w przypadku
β-karotenu krzywą wzorcową można sporządzić dla dwuchromianu potasu), μg/cm3
V – objętość eluatu (frakcji zebranej z kolumny), cm3
m – masa badanej próby, g

Zawartość β-karotenu i likopenu w mg na 100 g badanego produktu można również

1%
obliczyć wykorzystując współczynnik A1cm . W tym celu należy zastosować wzór:

A  1000  V
x
m  A11cm
%

gdzie:
A – absorbancja β-karotenu (λ = 451 nm), likopenu (λ = 472 nm) mierzona w kuwecie o grubości 1 cm
1%
A1cm = 2500 dla β-karotenu lub = 3450 dla likopenu
V – objętość eluatu (frakcji zebranej z kolumny), cm3
m – masa badanej próby, g

202
Odczynniki
1) eter naftowy lub heksan,
2) metanol cz.d.a.,
3) aceton cz.d.a.,
4) bezwodny siarczan sodu,
5) tlenek glinu do chromatografii (przed użyciem adsorbent suszy się w temp. 105°C przez ok. 30 minut
i przed naniesieniem na kolumnę studzi w eksykatorze),
6) dwuchromian potasu.
Zadania do wykonania
1. Przeprowadzić ekstrakcję karotenoidów z koncentratu pomidorowego lub z pomidorów.
2. Wykonać rozdział karotenoidów metodą chromatografii adsorpcyjnej na tlenku glinu.
3. Zebrać frakcję β-karotenu oraz likopenu.
4. Obliczyć zawartość β-karotenu i likopenu w 100 g badanego produktu.

9.2. Oznaczanie ilościowe witaminy C

9.2.1. Oznaczanie kwasu L-askorbinowego metodą miareczkowania roztworem
2,6-dichlorofenoloindofenolu

Zasada oznaczenia
Oznaczanie kwasu L-askorbinowego przez miareczkowanie roztworem
2,6-dichlorofenoloindofenolu nosi nazwę metody Tillmansa (metoda ta umożliwia
oznaczenie tylko tej jednej z form witaminy C). 2,6-dichlorofenoloindofenol w roztworach
obojętnych i zasadowych ma barwę niebieską, a w środowisku kwaśnym – różową.
Utleniając kwas L-askorbinowy do dehydro-L-askorbinowego 2,6-dichlorofenoloindofenol
ulega redukcji połączonej z odbarwieniem. Miareczkowanie należy prowadzić szybko,
ponieważ 2,6-dichlorofenoloindofenol może się ponownie utleniać tlenem z powietrza.
Pojawienie się różowego zabarwienia w miareczkowanym roztworze świadczy o
zakończeniu miareczkowania. Jeżeli badany roztwór nie zawiera substancji
przeszkadzających to ilość barwnika zużyta do miareczkowania jest proporcjonalna do
ilości kwasu L-askorbinowego.
W przypadku badania roztworów barwnych, zmiana zabarwienia w trakcie
miareczkowania może nie być widoczna i dlatego do próby dodaje się znaną ilość
2,6-dichlorofenoloindofenolu, a nadmiar niezredukowanego barwnika ekstrahuje się

203
rozpuszczalnikiem organicznym, np. ksylenem. Na podstawie zabarwienia warstwy
ksylenowej określa się ilość barwnika, który nie przereagował z kwasem askorbinowym.

Wykonanie
Sporządzanie roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu
W kolbie stożkowej w około 600 cm3 gorącej wody redestylowanej należy rozpuścić
0,21 mg kwaśnego węglanu sodu. Roztwór przelać do kolby miarowej o pojemności 1 dm 3,
wsypać 0,25 g 2,6-dichlorofenoloindofenolu, energicznie wymieszać zawartość i po
ostudzeniu do temperatury pokojowej dopełnić wodą do kreski. Przygotowany odczynnik
pozostawić na 24 godziny w ciemnym pomieszczeniu, przesączyć przez karbowany sączek
z bibuły do butelki z ciemnego szkła i przechowywać w temperaturze 4C.

Oznaczanie miana przygotowanego roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu

88 mg kwasu L-askorbinowego (odważone z dokładnością do 0,0001 g) rozpuścić
w 2% kwasie szczawiowym w kolbie miarowej o pojemności 100 cm3 i dopełnić kwasem
do kreski.
Rzeczywistą zawartość kwasu L-askorbinowego w 1 cm3 roztworu wzorcowego ustalić
w następujący sposób: 10 cm3 przygotowanego roztworu kwasu askorbinowego odmierzyć
do kolby stożkowej o pojemności 100 cm3 i miareczkować 0,01 N roztworem jodu wobec
skrobi jako wskaźnika. Stężenie kwasu askorbinowego w mg/cm3 obliczyć według wzoru:

a  n  88
Y 
10
gdzie:
a – objętość roztworu jodu zużyta do miareczkowania, cm3
n – miano roztworu jodu
88 – ilość mg kwasu L-askorbinowego

W celu oznaczenia miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu, 5 cm3 wzorcowego roztworu

kwasu askorbinowego przenieść do kolby miarowej i rozcieńczyć 2% roztworem kwasu
szczawiowego do objętości 100 cm3. Z tego pobrać 10 cm3 i miareczkować roztworem
2,6-dichlorofenoloindofenolu do pojawienia się jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego
się przez 10 sekund (pierwsze miareczkowanie traktuje się jako orientacyjne). Następnie
należy wykonać 3-4 miareczkowania, dodając z biurety niemal całą potrzebną ilość
barwnika i szybko domiareczkowując do jasnoróżowego zabarwienia (różnice między
miareczkowaniami nie powinny przekraczać 0,05 cm3).

204
Miano roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu obliczyć ze wzoru:

0,5  Y
m
d
gdzie:
0,5 – ilość cm3 roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego w 10 cm3 miareczkowanej próby, cm3
Y – rzeczywista ilość mg kwasu askorbinowego w 1 cm3 r-ru wzorcowego (oznaczona jodometrycznie)
d – objętość roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu zużyta do miareczkowania, cm3

Przygotowanie wyciągu (próby badanej)

Podczas analizy produktów o konsystencji płynnej (np. soki owocowe, przeciery)
w małej zlewce odważyć 10 g, naważkę przenieść ilościowo do kolby miarowej
o pojemności 100 cm3 i uzupełnić 2% kwasem szczawiowym do kreski.
Produkty o konsystencji stałej lub takie, w których części stałe znajdują się w zalewie
(np. kompoty) rozdrobnić w moździerzu lub homogenizować z określoną ilością 2% kwasu
szczawiowego (przed homogenizacją należy dokładnie zważyć masę próby). Z uzyskanej
zawiesiny odważyć 10-40 g, przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 cm 3
i dopełnić do kreski 2% kwasem szczawiowym.
Zawartość kolby miarowej po wymieszaniu pozostawić na 15 minut, a następnie sączyć
przez karbowany sączek, odrzucając pierwszą porcję przesączu (1–2 cm3). Otrzymany
wyciąg miareczkować za pomocą roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu.
Objętość wyciągu, jaką pobiera się do miareczkowania, jest zależna od zawartości
kwasu L-askorbinowego w próbie (powinna ona wynosić od 0,2 do 0,6 mg). Jeżeli jest ona
niższa od 30 mg/100 g, to do miareczkowania bierze się 10 cm 3 wyciągu, jeżeli kształtuje
się w granicach 30-40 mg/100 g to pobiera się 5 cm 3, a powyżej tych wartości należy
miareczkować odpowiednio mniejsze objętości wyciągu.

Miareczkowanie wyciągów bezbarwnych lub słabo zabarwionych

Od 2 do 10 cm3 wyciągu z badanego produktu (w zależności od zawartości kwasu
L-askorbinowego w produkcie) przenieść pipetą do kolby stożkowej o pojemności 50 cm3
i miareczkować mianowanym roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu do powstania
jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego się przez 10 sekund. Miareczkowanie powtarza
się 3 razy i do obliczenia wyniku bierze średnią arytmetyczną (porównaj: oznaczanie miana
roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu).

205
Miareczkowanie wyciągów silnie zabarwionych - metoda ksylenowa
5 cm3 wyciągu przenieść do kolby stożkowej o pojemności 100 cm 3, dodać 20 cm3
wody redestylowanej, 1 cm3 lodowatego kwasu octowego, 2 cm3 nasyconego roztworu
kwasu szczawiowego i dokładnie wymieszać zawartość. Z biurety odmierzyć do kolby,
w małym nadmiarze, roztwór 2,6-dichlorofenoloindofenolu, wymieszać i po 10 sekundach
dodać 25 cm3 ksylenu. Zawartość kolbki energicznie wstrząsać, a po rozdzieleniu warstw,
górną warstwę ksylenu przenieść do probówki. Zabarwienie ksylenu powinno być
jasnoróżowe. Jeżeli ksylen jest bezbarwny, badanie powtarza się z większą objętością
dodanego roztworu barwnika, a z mniejszą, gdy zabarwienie ksylenu jest zbyt silne.
Intensywność zabarwienia ksylenu porównać wizualnie z barwą wzorców. Wzorce
przygotować w następujący sposób: do 5 kolb stożkowych ze szlifem wlać po 5 cm 3 2%
kwasu szczawiowego, 20 cm3 wody redestylowanej, 1 cm3 lodowatego kwasu octowego
i 2 cm3 nasyconego roztworu kwasu szczawiowego. Zawartość kolb wymieszać i do
4 z nich dodać kolejno 0,05; 0,10; 0,15 i 0,20 cm 3 roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu.
Po 10 s do wszystkich kolb dodać po 25 cm3 ksylenu (kolba bez dodatku barwnika stanowi
odnośnik). Po wymieszaniu zawartości warstwę ksylenową przenieść do probówek.
Od liczby cm3 roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu dodanych do badanego wyciągu
należy odjąć liczbę cm3 barwnika we wzorcu o zabarwieniu odpowiadającym próbie.
Różnica ta odpowiada liczbie cm3 roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu potrzebnego do
utlenienia kwasu askorbinowego w próbie badanej.

Obliczanie i interpretacja wyników

Zawartość kwasu L-askorbinowego w mg/100 g produktu oblicza się według wzoru:
a  b  m  100
x
cd
gdzie:
a - objętość roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu użyta do miareczkowania,
(lub różnica obliczona w badaniu wyciągów zabarwionych), cm3
b - całkowita objętość wyciągu (wg przepisu - 100 cm3)
m - miano roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu
c - wielkość naważki produktu, g
d - objętość wyciągu wzięta do miareczkowania (2–10 cm3)

Odczynniki
1) 2% roztwór kwasu szczawiowego,
2) nasycony roztwór kwasu szczawiowego,
3) kwaśny węglan sodu,

206
 4) 2,6-dichlorofenoloindofenol lub jego sól sodowa,
5) kwas L-askorbinowy krystaliczny,
6) 0,01 N roztwór jodu,
7) jodek potasu krystaliczny,
8) 1% roztwór skrobi,
9) kwas octowy lodowaty,
10) ksylen,
11) woda redestylowana,
12) próba badana.
9.2.2. Oznaczanie sumy kwasów L-askorbinowego i dehydro-L-askorbinowego
metodą Pijanowskiego

Zasada oznaczenia
W celu oznaczenia obu biologicznie czynnych form witaminy C, kwas dehydro-L-
askorbinowy redukuje się przed miareczkowaniem do kwasu L-askorbinowego.
W metodzie Pijanowskiego do redukcji wykorzystuje się siarczek sodowy. Wyciąg
z badanego produktu zakwasza się rozcieńczonym kwasem mineralnym i dodaje roztwór
siarczku sodowego. Wydzielający się siarkowodór redukuje obecny w roztworze kwas
dehydro-L-askorbinowy do kwasu L-askorbinowego. Nadmiar siarkowodoru usuwa się
przez dodanie chlorku rtęci (II), a w przesączu oznacza kwas L-askorbinowy przez
miareczkowanie roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu zgodnie z procedurą opisaną
w poprzednim doświadczeniu.
Wykonanie oznaczenia
Redukcja kwasu dehydro-L-askorbinowego
10 cm3 wyciągu z badanej próby (otrzymanego jak opisano przy oznaczaniu kwasu
L-askorbinowego) odmierzyć do kolby miarowej o pojemności 50 cm3. W całej objętości
roztworu po redukcji nie powinno być więcej niż 3,8 mg kwasu askorbinowego. Do kolby
dodać kolejno 3,5 cm3 1 N kwasu siarkowego i 1,75 cm 3 roztworu siarczku sodowego.
Kolbę po wymieszaniu zawartości odstawić na 10-15 minut, po czym dodać 2,5 cm 3
roztworu chlorku rtęci (II) i dopełnić wodą do kreski. Po kilkusekundowym wytrząsaniu
zawartość kolby przesączyć przez karbowany sączek, odrzucając pierwszą porcję
przesączu (1-2 cm3). 5-10 cm3 przesączu miareczkować roztworem
2,6-dichlorofenoloindofenolu.

Obliczanie i interpretacja wyników

207
 Zawartość sumy kwasów L-askorbinowego i dehydro-L-askorbinowego w mg/100 g
produktu obliczyć ze wzoru:

a  b  m  50  100
x
cd e
gdzie:
a - objętość roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu użyta do miareczkowania, cm3
b - ogólna objętość wyciągu z badanego produktu (wg przepisu – 100 cm3)
m - miano roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu
c - wielkość naważki produktu, g
d - objętość wyciągu wzięta do redukcji (wg przepisu – 10 cm3)
e - objętość roztworu po redukcji wzięta do miareczkowania (5–10 cm3)

Odczynniki
1) 2,6-dichlorofenoloindofenol lub jego sól sodowa,
2) ok. 1 M roztwór siarczku sodowego,
3) 1 M roztwór chlorku rtęci (II) w alkoholu etylowym,
4) 1 N roztwór kwasu siarkowego,
5) próba badana.

Zadania do wykonania
1. Przeprowadzić oznaczenie kwasu L-askorbinowego w roztworze wzorcowym.
2. Ustalić miano przygotowanego roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu.
3. Wykonać oznaczenie ilościowe kwasu L-askorbinowego w badanej próbie.
4. Wykonać oznaczenie zawartości witaminy C (sumy kwasów L-askorbinowego
i dehydro-L-askorbinowego w badanej próbie, którą stanowi produkt spożywczy np.
sok z kapusty).
5. Na podstawie wyników uzyskanych w zadaniach 3 (lub 4) obliczyć ilość produktu,
która zaspokaja dzienne zapotrzebowanie na witaminę C (dorosły człowiek powinien
spożywać około 60 mg witaminy C na dobę). Uzyskane wyniki zebrać w tabeli.

L.p. badany produkt ilość produktu zaspakajająca dzienne

zapotrzebowanie na witaminę C [g]
1.
2.

9.3. Oznaczanie zawartości witaminy B2 w mleku na podstawie fluorescencji

ryboflawiny

Zasada oznaczenia

208
 Opisana metoda pozwala na oznaczenie sumy flawin wyrażonej jako ilość ryboflawiny.
Ryboflawinę uwalnia się z połączeń przez kwaśną hydrolizę. Witamina B2 jest bardzo
wrażliwa na światło, dlatego w celu ograniczenia strat spowodowanych fotolizą roztwory
w trakcie analizy trzeba chronić przed działaniem światła słonecznego. Ekstrakt oczyszcza
się metodą chemiczną z użyciem KMnO4 i mierzy fluorescencję ryboflawiny.
Podstawowym celem hydrolizy jest uwolnienie ryboflawiny związanej w postaci
koenzymów (FAD, FMN) w białkach enzymatycznych. W tej postaci ryboflawina
występuje w większości produktów, przy czym FAD jest formą dominującą. Intensywność
fluorescencji ryboflawiny i FMN jest zbliżona, natomiast FAD wykazuje tylko 10-15%
fluorescencji ryboflawiny. Z tego względu w produktach spożywczych oznacza się sumę
biologicznie czynnych flawin po przeprowadzeniu hydrolizy form związanych
(koenzymów) do wolnej ryboflawiny. Oznaczoną w ten sposób sumę flawin określa się
jako zawartość ryboflawiny.
Ryboflawina, FMN i FAD bardzo dobrze rozpuszczają się w rozcieńczonych kwasach
i w środowisku o pH 2-5 są odporne na podwyższoną temperaturę (nawet do 120°C).
W celu wydzielenia flawin z badanego materiału najczęściej stosuje się hydrolizę za
pomocą 0,1 N kwasu solnego lub siarkowego, ogrzewając próbę przez określony czas (np.
45 minut) we wrzącej łaźni wodnej. W tych warunkach następuje hydroliza FAD do FMN
i częściowo FMN do wolnej ryboflawiny. Środowisko kwaśne i podwyższona temperatura
powodują również denaturację białek produktu, inaktywację enzymów i częściową
hydrolizę skrobi, co umożliwia wydzielenie oznaczanych flawin.
W celu wytrącenia zdenaturowanych białek przed sączeniem hydrolizatu, podnosi się
jego pH do wartości ok. 4,5, gdyż odpowiada to punktowi izoelektrycznemu większości
białek (zdenaturowane białka w niskim pH występują często w postaci rozpuszczalnej,
natomiast w większości ulegają wytrąceniu w środowisku o pH odpowiadającym ich
punktowi izoelektrycznemu). W stosowanej metodzie pH do wartości 4,5 podnosi się za
pomocą 2,5 M octanu sodu.
W metodach opartych na pomiarze fluorescencji ryboflawiny, hydrolizat przed dalszą
analizą poddaje się oczyszczaniu chemicznemu lub chromatograficznemu. Ma ono na celu
usunięcie związków wygaszających lub podwyższających fluorescencję ryboflawiny.
Powszechnie stosuje się chemiczne oczyszczanie hydrolizatu przez utlenianie takich
związków roztworem nadmanganianu potasu (KMnO4). Oczyszczanie hydrolizatów przez
utlenianie za pomocą KMnO4, przy zachowaniu odpowiednich warunków, jest skutecznym
sposobem usuwania związków towarzyszących. Nadmiar KMnO4 rozkłada się za pomocą

209
H2O2. W roztworach o pH 4-5 i w temperaturze pokojowej ryboflawina jest odporna na
działanie rozcieńczonego roztworu KMnO4. Należy jednak zaznaczyć, że wyższe stężenie
KMnO4 i dłuższe oddziaływanie H2O2 może spowodować rozkład flawin.
Pomiar fluorescencji jest końcowym etapem analizy. Intensywność fluorescencji
flawin jest proporcjonalna do absorpcji promieniowania w zakresie 210-550 nm. Dla
wzbudzenia fluorescencji w pomiarach ilościowych ryboflawiny stosuje się
promieniowanie o długości fali 430-460 nm, pokrywające się z maksimum absorpcji.
Ponadto fale świetlne z tego zakresu wzbudzają fluorescencję tylko nielicznych związków
fluoryzujących, które mogą towarzyszyć ryboflawinie. Do pomiarów fluorescencji stosuje
się filtry przepuszczające światło o długościach fal powyżej 510-520 nm (maksimum
emisji ryboflawiny wynosi 520-530 nm). Na podstawie zmierzonej fluorescencji
z krzywej wzorcowej odczytuje się stężenie ryboflawiny i oblicza jej zawartość w próbie.
W celu sprawdzenia, czy próba nie zawiera poza ryboflawiną dodatkowych związków
fluoryzujących wykonuje się pomiary po wygaszeniu fluorescencji ryboflawiny przez
dodanie ditionianu sodowego (Na2S2O4). Fluorescencję zmierzoną niezwłocznie po
dodaniu ditionianu sodowego traktuje się jako próbę ślepą i odejmuje się jej wartość od
fluorescencji próby badanej.

Wykonanie
Hydroliza
Wielkość naważki oraz rozcieńczenie próby są zależne od zawartości ryboflawiny
i czułości użytego fluorymetru. Do badania należy odważyć próbę o masie 1-10 g lub
pobrać 50 cm3 mleka. Zawartość ryboflawiny w próbie powinna wynosić od 5 do 30 μg.
Podczas analizy mleka, do 50 cm3 próby badanej dodać około 25 cm3 wody
destylowanej i po wymieszaniu zakwasić do pH ok. 1 za pomocą stężonego kwasu
siarkowego (ok. 0,85 cm3). Odczyn próby sprawdzić papierkiem wskaźnikowym.
Zawartość kolby stożkowej ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut (często
mieszać bagietką). Po zakończeniu hydrolizy kolbę ochłodzić w strumieniu bieżącej wody
i doprowadzić roztwór do pH 4,5 przez wkraplanie 2,5 M roztworu octanu sodowego.
Kolbę stożkową odstawić na 15 minut, a następnie przenieść zawartość do kolby miarowej
o objętości 100 cm3 i dopełnić wodą. Po wymieszaniu zawartość kolby przesączyć przez
karbowany sączek z bibuły (np. Whatman nr 2 lub 4) odrzucając pierwszą porcję
przesączu (1-2 cm3). Zamiast sączenia osad można oddzielić przez wirowanie.

210
Oczyszczanie hydrolizatu poprzez utlenianie nadmanganianem potasu
10 cm3 klarownego przesączu odmierzyć w małym cylinderku miarowym (uwaga:
stężenie ryboflawiny w roztworze nie może przekraczać 1 μg/cm 3, często konieczne jest
jednoczesne wykonanie dalszej analizy z użyciem prób odpowiednio rozcieńczonych).
Do przesączu (w celu utrzymania odpowiedniego pH) dodać przed oczyszczaniem
hydrolizatu 0,1 cm3 lodowatego kwasu octowego, a następnie po wymieszaniu wlać 1 cm 3
3% roztworu KMnO4. Zawartość cylindra wstrząsnąć i pozostawić w ciemnym miejscu
dokładnie na 2 minuty. Następnie dodać 1 cm 3 3% roztworu H2O2 i ponownie wstrząsnąć.
Roztwór powinien się odbarwić. Jeżeli wstrząsanie nie usunie pęcherzyków tlenu lub
powstanie zmętnienie, roztwory należy odwirować. Powinny one być klarowne.
Pomiary fluorescencji
Pomiary fluorescencji wykonać we fluorymetrze lub absorpcjometrze z przystawką
fluorymetryczną. Dla witaminy B2 pomiar fluorescencji przeprowadzić przy długości fali
światła wzbudzającego wynoszącej około 436 nm, w obecności żółtopomarańczowego
filtra przepuszczającego fale o długości 520–530 nm (maksimum emisji ryboflawiny).
Dla roztworu wzorcowego ryboflawiny o stężeniu 1 μg/cm 3 ustawić 100%
intensywności fluorescencji. Następnie zmierzyć fluorescencję roztworu badanego.
Jednocześnie wykonać pomiar fluorescencji próby ślepej, w której wygaszono
fluorescencję ryboflawiny. W tym celu po pomiarze fluorescencji próby do kuwety należy
wsypać około 20 mg ditionianu sodowego, szybko wymieszać i niezwłocznie ponownie
zmierzyć fluorescencję. Odczytaną wielkość przyjąć jako wartość próby ślepej. Na
podstawie fluorescencji badanego roztworu pomniejszonej o fluorescencję próby ślepej
obliczyć stężenie witaminy B2 w μg/100 cm3 mleka.

Obliczanie i interpretacja wyników

Dla obliczenia zawartości ryboflawiny w μg na 1 cm3 mleka można wykorzystać wzór:
c  v  v2
x   A  B 
 a  b   d  v1
gdzie:
A - fluorescencja badanego roztworu
B - fluorescencja próby ślepej badanego roztworu
a - fluorescencja wzorcowego roztworu ryboflawiny (1 μg/cm3)
b - fluorescencja próby ślepej wzorcowego roztworu ryboflawiny (jeżeli przeprowadzono próbę ślepą)
c - stężenie ryboflawiny w roztworze wzorcowym (1 μg/cm3)
v - objętość, do której rozcieńczono próbę po hydrolizie (wg przepisu 100 cm3)
v1 - objętość roztworu wzięta do utleniania (10 cm3 lub mniej w przypadku wykonywania rozcieńczeń)
v2 - objętość roztworu po utlenianiu (wg przepisu 12,1 cm3)
d - masa badanej próby w gramach (lub objętość w cm3)

211
Odczynniki
1) 0,1 N kwas solny lub siarkowy,
2) 2,5 M roztwór octanu sodowego,
3) 3% roztwór KMnO4,
4) 3% roztwór H2O2,
5) ditionian sodu krystaliczny,
6) kwas octowy lodowaty,
7) podstawowy roztwór ryboflawiny (10 μg/cm3), wzorcowy roztwór ryboflawiny (1 μg/cm3),
8) próba badana (mleko)
Zadania do wykonania
1. Oznaczyć zawartość witaminy B2 w 100 cm3 mleka.
ENZYMY

1. Wprowadzenie
Enzymy są to białka o specyficznych właściwościach katalitycznych. Jak każde białko
są zbudowane z łańcuchów polipeptydowych o określonych układach przestrzennych
(struktura drugo-, trzecio- i czwartorzędowa). Obok części białkowej enzym zawiera
zwykle również część niebiałkową, czyli niskocząsteczkowy związek organiczny lub jon
metalu. Cały aktywny enzym składający się z części białkowej i niebiałkowej nazywa się
holoenzymem, część białkową apoenzymem, a część niebiałkową koenzymem, kofaktorem
lub grupą prostetyczną. Obie części enzymu są istotne dla jego funkcji katalitycznej.
Enzymy są wytwarzane wyłącznie przez żywe komórki, ale w odpowiednich warunkach
(pH, temperatura itd.) mogą działać również poza nimi.

2. Proces katalizy enzymatycznej

Enzymy katalizują przebieg reakcji chemicznych. Większość reakcji zachodzących
w układach biologicznych wymaga udziału katalizatorów enzymatycznych. Enzymy nie
zmieniają stanu równowagi reakcji, a jedynie przyśpieszają jego osiągnięcie.
Przyśpieszenie to jest znaczne. Jeżeli na przykład reakcja w obecności enzymu osiąga stan
równowagi w ciągu 1 sekundy, to bez enzymu taki stan zostałby osiągnięty po około
3 latach. Zwiększenie szybkości reakcji spowodowane udziałem enzymu zachodzi poprzez
obniżenie energii aktywacji niezbędnej dla zajścia reakcji. Kataliza enzymatyczna polega
na rozłożeniu katalizowanej reakcji na kilka reakcji cząstkowych, etapów,
charakteryzujących się niską energią aktywacji, przez co obniżeniu ulega również energia

212
aktywacji całego procesu. W reakcji enzymatycznej enzym łączy się z substratem tworząc
kompleks zdolny do przekształcenia się w produkt i zregenerowany enzym według
schematu:
E + S ES E + P
gdzie:
E - enzym
S - substrat
ES - kompleks enzym-substrat
P - produkt

Przedstawiony skrótowo schemat katalizy jest analogiczny zarówno w przypadku

katalizatora enzymatycznego jak i katalizatora nieorganicznego. Istnieją jednak różnice
w działaniu obu typów katalizatorów. O tych różnicach stanowi przede wszystkim fakt, że
enzym to białko, a więc jest wrażliwy na warunki środowiska, takie jak temperatura czy
pH. Istotną różnicą jest specyficzność katalizatora enzymatycznego, który działa na ściśle
określony substrat (specyficzność substratowa), czy też katalizuje ściśle określoną reakcję
(specyficzność kierunku działania). Specyficzność substratowa to np. specyficzność
absolutna polegająca na tym, że enzym działa tylko na jeden substrat. Przez wiele lat
uważano, że mocznik jest jedynym substratem ureazy, a kwas bursztynowy jedynym
substratem dehydrogenezy bursztynianowej. Dzisiaj wiadomo, że wymienione enzymy
katalizują przemianę jeszcze jednego lub dwóch innych związków o podobnej strukturze.
Częściej mamy do czynienia ze specyficznością grupową, kiedy enzym katalizuje
przemiany kilku pokrewnych związków. Oprócz specyficzności chemicznej enzymy
wykazują również specyficzność w stosunku do konfiguracji przestrzennej, czyli
stereospecyficzność. Dotyczy to wybiórczego działania na izomery cis lub trans, formy D
lub L, czy α lub β. Ten rodzaj specyficzności ma z reguły charakter absolutny, nawet jeżeli
specyficzność chemiczna jest szeroka. Przykładem może być oksydaza L-aminokwasowa
katalizująca przemianę tylko form L aminokwasów, a nie form D.
Przykładem specyficzności kierunku działania są przemiany L-asparaginianu. Może on
ulec przekształceniu w obecności enzymu – aminotransferazy asparaginianowej do
szczawiooctanu, w obecności innego enzymu – amoniakoliazy asparaginianowej do
fumaranu, wreszcie może on ulec reakcji dekarboksylacji do β-alaniny lub L-alaniny pod
wpływem 1- lub 4-dekarboksylazy. Cztery enzymy działające na ten sam substrat
katalizują jego przemiany do czterech różnych produktów.

3. Klasyfikacja enzymów

213
 W miarę wykrywania i identyfikowania enzymów nazywano je w różny sposób,
najczęściej przez dodanie końcówki "-aza" do nazwy substratu lub produktu reakcji, bądź
też określenie rodzaju katalizowanej reakcji. Przykładowo nazwa ureaza oznacza, że
enzym działa na mocznik, natomiast nazwa inwertaza pochodzi od cukru inwertowanego
powstającego po działaniu enzymu na sacharozę, wreszcie izomeraza oznacza, że enzym
katalizuje proces izomeryzacji. Aby zapobiec przypadkowemu nazewnictwu wprowadzono
systematyczną klasyfikację, według której enzymy dzieli się na sześć klas. Podstawę
podziału stanowi typ katalizowanej reakcji. Są to następujące klasy:
1) oksydoreduktazy – katalizują procesy utleniania i redukcji, czyli przemiany związane
z przeniesieniem elektronów i protonów,
2) transferazy – katalizują przeniesienie grup chemicznych (np. –NH 2, –COOH, –OH)
z jednej cząsteczki na drugą,
3) hydrolazy – katalizują hydrolityczny (tzn. z udziałem cząsteczki wody) rozpad wiązań,
4) liazy – katalizują niehydrolityczny rozpad wiązań,
5) izomerazy – katalizują wewnątrzcząsteczkowe przekształcenia, reakcje izomeryzacji,
tj. przekształcenia nie zmieniające wzoru sumarycznego substratu,
6) ligazy (syntetazy) – katalizują reakcje syntezy wiązań.
Każdy enzym może być nazwany w trojaki sposób: systematycznie, zwyczajowo
(potocznie) i za pomocą kodu enzymatycznego. Nazwa systematyczna enzymów składa się
z dwóch części: część pierwsza, mająca końcówkę "-aza" wskazuje na rodzaj
katalizowanej reakcji, np. izomeraza, oksydoreduktaza, a część druga pochodzi od nazwy
substratu lub substratów, na które enzym działa. Częściej niż nazwy systematyczne stosuje
się nazwy zwyczajowe, potoczne, takie jak np. trypsyna czy glukoamylaza.
Numer kodowy enzymu (kod enzymatyczny) wynika bezpośrednio z klasyfikacji
enzymów i składa się z czterech elementów. Na przykład enzym o nazwie zwyczajowej
oksydaza glukozowa ma nazwę systematyczną: oksydoreduktaza β-D-glukoza:tlen i kod
enzymatyczny 1.1.3.4. oznaczający, że:
- enzym należy do klasy oksydoreduktaz,
- działa na grupę –CH2OH donora,
- akceptorem jest tlen cząsteczkowy,
- numer kolejny enzymu.

4. Aktywność enzymatyczna

214
 O obecności enzymu i jego działaniu wnioskuje się na podstawie reakcji, którą ten
enzym katalizuje. Zdolność enzymu do przeprowadzenia określonej reakcji wyrażana jest
aktywnością enzymatyczną. Miarą aktywności enzymu jest szybkość reakcji, którą ten
enzym katalizuje, a więc szybkość powstawania produktu (-ów) lub szybkość ubytku
substratu (-ów). Pomiaru szybkości reakcji enzymatycznej dokonuje się mierząc zmiany
pewnych eksperymentalnych parametrów związanych z przekształceniem substratu
w produkt w jednostce czasu i w standardowych warunkach. Mogą to być takie parametry,
jak absorbancja, współczynnik załamania światła, temperatura itd. Zmiany tych
parametrów są wyrazem spadku stężenia substratu lub wzrostu stężenia produktu
w jednostce czasu (sekunda, minuta, godzina). Ubytek substratu może być liniową lub
nieliniową funkcją czasu.
Dla określenia aktywności nawet tego samego enzymu w literaturze spotyka się szereg
różnych jednostek, dla uzyskania porównywalnych wyników zaleca się stosowanie
uniwersalnej jednostki międzynarodowej. Jedna jednostka międzynarodowa (oznaczenie
w języku polskim "J", w nomenklaturze międzynarodowej "U", czyli unit) jest to taka ilość
enzymu, która katalizuje przemianę jednego mikromola substratu w ciągu jednej minuty
w ściśle określonych warunkach; obejmują one przede wszystkim pH roztworu, stężenie
substratu i temperaturę (zaleca się stosowanie temperatury 30°C). Inne warunki reakcji
powinny być optymalne dla działania danego enzymu.
Stężenie enzymu w roztworze wyraża się zwykle w jednostkach na cm3.
Rozróżnia się również pojęcia aktywności właściwej i aktywności molekularnej.
Aktywność właściwa jest to liczba jednostek enzymu w przeliczeniu na miligram białka.
Aktywność molekularna jest to liczba cząsteczek substratu (lub równoważników
określonych grup) przekształconych w ciągu jednej minuty przez jedną cząsteczkę enzymu
przy optymalnym stężeniu substratu lub liczba jednostek aktywności na mikromol enzymu.

5. Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej

5.1. Temperatura
Zgodnie z regułą van't Hoffa wzrost temperatury o 10°C powoduje dwu lub trzykrotne
zwiększenie szybkości reakcji chemicznej. Również w przypadku reakcji enzymatycznej
temperatura wpływa na podwyższenie szybkości reakcji, jednak w ograniczonym zakresie,
tj. w stosunkowo wąskim przedziale temperatur. Niektóre enzymy już przy temperaturze
40-50°C ulegają denaturacji, a tylko nieliczne pozostają aktywne powyżej 60°C. Wynika
to z białkowego charakteru enzymów. Inaktywacja enzymów w rezultacie ogrzewania ma

215
zwykle charakter nieodwracalny. Natomiast bardzo niskie temperatury (np. tak niskie jak
–191°C) nie powodują trwałych zmian większości enzymów. Po doprowadzeniu enzymów
zamrożonych do temperatur dodatnich odzyskują one zwykle pełną aktywność. Dla
każdego enzymu istnieje taki zakres temperatur, w którym działa on z największą
aktywnością. Jest to optimum temperaturowe.

5.2. pH
Dla każdego enzymu istnieje optymalny zakres pH, w którym wykazuje on
maksymalną aktywność katalityczną. Krzywe ilustrujące zależność szybkości reakcji od
pH są wypadkową różnych oddziaływań. Odczyn środowiska wpływa na jonizację białka
enzymatycznego, przede wszystkim grup dysocjujących w obrębie centrum aktywnego na
stan zjonizowania kompleksu enzym-substrat czy wreszcie samego substratu. Większe
zmiany stężenia jonów wodorowych w stosunku do optymalnych dla zachowania rodzimej
konformacji mogą powodować nieodwracalną inaktywację w wyniku denaturacji białka
enzymatycznego. Różne zjawiska mogą przy tym występować łącznie, ale w różnym
stopniu wpływać na wypadkowy wykres zależności między szybkością katalizowanej
reakcji a pH środowiska: np. spadek aktywności po jednej stronie optimum pH może być
uwarunkowany obniżeniem powinowactwa enzym-substrat, a po drugiej – inaktywacją
enzymu.

5.3. Stężenie enzymu

W warunkach zapewniających nasycenie substratem (przy nadmiarze substratu)
szybkość reakcji katalizowanej przez enzym jest wprost proporcjonalna do jego stężenia,
np. trzykrotny wzrost stężenia enzymu powoduje trzykrotne zwiększenie szybkości reakcji.

5.4. Stężenie substratu

Przy stałym stężeniu enzymu zależność pomiędzy stężeniem substratu a szybkością
reakcji ma najczęściej kształt przedstawiony na wykresie (rys. 60.)
szybkość reakcji (V)

Vmax

Vmax
2

Km 216

stężenie substratu [S]

Rys. 60. Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

Przy niskich stężeniach substratu szybkość reakcji wzrasta wprost proporcjonalnie do

wzrostu stężenia substratu; taka zależność odpowiada kinetyce pierwszego rzędu. Przy
wysokich stężeniach substratu, dalsze jego zwiększanie nie powoduje wzrostu szybkości
reakcji; taka zależność odpowiada kinetyce rzędu zerowego. Szybkość reakcji osiąga
wówczas wartość maksymalną (Vmax). Występuje ona w obecności znacznego nadmiaru
substratu, kiedy wszystkie centra aktywne enzymu są wysycone cząsteczkami substratu
i dlatego wprowadzanie do mieszaniny reakcyjnej dalszych porcji substratu nie przynosi
żadnego efektu. Jak wiadomo (punkt 2 niniejszego rozdziału), reakcja enzymatyczna
przebiega zawsze poprzez stadium tworzenia kompleksu enzym-substrat. Przy założeniu,
że ilość enzymu w mieszaninie reakcyjnej jest stała, maksymalna szybkość reakcji
enzymatycznej (Vmax) określona jest wyłącznie przez szybkość katalitycznej przemiany
kompleksu enzym-substrat (ES).
Wyznaczenie maksymalnej szybkości reakcji w procesach enzymatycznych jest dość
kłopotliwe i niejednoznaczne, dlatego wprowadzono pojęcie połowy szybkości
maksymalnej. Z pojęciem tym związana jest charakterystyczna dla każdego enzymu
wartość, tzw. stała Michaelisa (Km). Jest to takie stężenie substratu w molach na dm3, przy
którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej.
Wartości Km oraz Vmax są to dwa podstawowe parametry określające kinetykę reakcji
enzymatycznej, a zarazem dwa podstawowe parametry charakteryzujące enzym.
Wyznaczanie wartości Km i Vmax wykorzystuje się w różnym celu, między innymi dla:
 projektowania warunków oznaczania aktywności enzymu; aktywność enzymu powinno
się oznaczać w warunkach nadmiaru substratu, czyli kiedy wszystkie centra aktywne
enzymu są wysycone substratem; w takich warunkach stężenie substratu powinno być co
najmniej 10-krotnie wyższe od wartości Km,
 określenia wpływu różnych czynników na przebieg reakcji enzymatycznej.
Odwrotność stałej Michaelisa (1/Km) wyraża powinowactwo enzymu wobec substratu.
Niska wartość stałej Michaelisa oznacza, że niewielkie stężenie substratu jest potrzebne,
aby szybkość reakcji enzymatycznej osiągnęła wartość połowy szybkości maksymalnej.
Wskazuje to na wysokie powinowactwo enzymu do substratu. Odwrotnie, powinowactwo
enzymu do substratu jest niskie, jeżeli wartość stałej Michaelisa jest wysoka.

217
5.5. Aktywatory i inhibitory
Aktywatorami nazywa się substancje, które przyspieszają lub w ogóle umożliwiają
działanie enzymów, nie biorąc bezpośredniego udziału w reakcji enzymatycznej. Można
wśród nich wydzielić 3 grupy:
1. Czynniki powodujące przekształcenie nieaktywnej formy enzymu, zwanej
proenzymem, w aktywny enzym przez odblokowanie centrum aktywnego. Aktywacja
trawiennych enzymów proteolitycznych, takich jak pepsyna czy trypsyna następuje
poprzez usunięcie maskujących peptydów.
2. Kofaktory przeprowadzające enzym w stan aktywny, takie jak jony metali czy pewne
aniony nieorganiczne. Działanie aktywujące wykazuje albo tylko jeden określony
kation, np. Mg(II), albo w różnym stopniu dwa lub trzy kationy, np. Mn(II), Co(II),
Zn(II).
3. Związki organiczne o małych cząsteczkach usuwające wpływ czynników hamujących
(np. EDTA – wiążący niepożądane jony) lub substancje regulujące potencjał
oksydacyjno-redukcyjny środowiska, dodawane w celu ochrony grup –SH
(np. 2-merkaptoetanol).
Inhibitory są to substancje chemiczne hamujące aktywność enzymatyczną. Istnieją
różne sposoby klasyfikacji inhibitorów. Na podstawie charakteru działania dzieli się je na
odwracalne i nieodwracalne. W przypadku hamowania nieodwracalnego inhibitor tworzy
z enzymem trwały kompleks, który praktycznie nie ulega dysocjacji. Przykładem inhibicji
nieodwracalnej jest działanie cyjanku na oksydazę ksantynową. Hamowanie odwracalne
może być konkurencyjne lub niekonkurencyjne (inaczej współzawodnicze lub
niewspółzawodnicze). Inhibitor konkurencyjny łączy się z enzymem w tym samym
miejscu co substrat, ograniczając możliwość powstawania kompleksu ES przez
blokowanie części centrów aktywnych. Stopień hamowania reakcji enzymatycznej
w przypadku inhibicji współzawodniczej zależy od stężenia inhibitora, stężenia substratu
oraz stosunku powinowactwa enzym-substrat:enzym-inhibitor. Zwiększenie stężenia
substratu powoduje cofnięcie inhibicji i odwrotnie, zwiększenie stężenia inhibitora
wywołuje wzrost inhibicji. Inhibitory konkurencyjne często wykazują podobieństwo
strukturalne do substratu. Kwas malonowy, będący homologiem kwasu bursztynowego jest
inhibitorem dehydrogenazy bursztynianowej. Inhibitory niekonkurencyjne przyłączają się
w centrum katalitycznym (ale nie w miejscach przyłączenia substratu, tak jak to ma
miejsce w przypadku inhibicji konkurencyjnej) lub poza tym centrum, wywołując zmianę

218
jego konformacji. Jako przykład może służyć działanie cyjanków lub azydków tworzących
kompleksy z metalami wchodzącymi w skład centrów katalitycznych enzymów.
Szczególnym przypadkiem inhibicji jest tzw. inhibicja substratowa. Ma ona miejsce wtedy,
gdy substrat użyty w wyższych stężeniach hamuje aktywność enzymu; przykładem może
być hamowanie β-fruktofuranozydazy pod wpływem sacharozy.

6. Zagadnienia
1. Kataliza enzymatyczna.
2. Swoistość (specyficzność) działania enzymów.
3. Podstawowe grupy (klasy) enzymów i katalizowane przez nie typy reakcji.
4. Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych. Stała Michaelisa (Km).
7. Część eksperymentalna
7.1. Oksydoreduktazy. Oznaczanie aktywności katalazy i peroksydazy
7.1.1. Charakterystyka enzymów katalizujących procesy utleniania i redukcji

Oksydoreduktazy stanowiące w klasyfikacji enzymów klasę pierwszą, katalizują

procesy utleniania lub redukcji substratu. Utlenianie polega na oderwaniu elektronów od
substratu (substancja utleniana, donor elektronów), a redukcja na przyłączeniu ich do
substancji redukowanej (akceptor elektronów). Procesy te mogą przebiegać różnymi
drogami, najczęściej jest to redukcja typu:

AH2 + B A + BH2 (1)

kiedy następuje utlenienie substratu przez przeniesienie atomów wodoru lub elektronów na
akceptor B będący koenzymem (np. NAD+, NADP+).
Inny typ reakcji utleniania i redukcji polega na przeniesieniu atomów wodoru lub
elektronów z donora na tlen cząsteczkowy:

AH2 + O2 A + H 2O2 (2)

2AH2 + O2 A + 2H 2O (3)

W obu tych reakcjach bierze również udział niezaznaczony tutaj koenzym.

Pozostałe typy reakcji utleniania i redukcji polegają na utlenianiu substratu przez
włączenie w jego cząsteczkę atomów tlenu, przy czym poszczególne rodzaje reakcji różnią
się źródłem tlenu. Źródłem tlenu może być:

219
woda
A + H 2O + B AO + BH2 (4)

nadtlenek wodoru
A + H2O2 AO + H2O (5)

tlen cząsteczkowy
A + O2 AO2 (6)

AH + BH2+ O2 AOH + B + H2O (7)

Jak widać z reakcji (6) i (7), do cząsteczki utlenianego substratu mogą być
wprowadzone oba atomy tlenu (reakcja (6)) lub tylko jeden (reakcja (7)). Reakcje
utleniania i redukcji to ważne przemiany zachodzące w organizmach żywych. Proces,
w wyniku którego elektrony są przenoszone z organicznego substratu na tlen
cząsteczkowy, nosi nazwę oddychania. W czasie tego procesu następuje znaczny spadek
energii swobodnej, co prowadzi do wydzielenia energii chemicznej w postaci związków
makroergicznych (np. ATP). W komórce przekazanie energii następuje w sekwencji
przemian, w których elektrony są przenoszone z substratu na przenośnik A, z przenośnika
A na przenośnik B itd. aż do momentu, kiedy zostaną one przeniesione na tlen. Każde
przeniesienie elektronów w łańcuchu oddechowym jest katalizowane przez odrębną
oksydoreduktazę. Ze względu na mechanizm działania oksydoreduktazy dzieli się na
następujące grupy: dehydrogenazy, oksydazy, oksygenazy, hydroksylazy, peroksydazy.
Dehydrogenazy katalizują reakcje przenoszenia atomów wodoru z substratu na
koenzymy lub inne akceptory (reakcja (1)). Enzymy te współdziałają z koenzymami
nikotynamidoadeninowymi (NAD i NADP) oraz flawinowymi (FAD i FMN).
Do współdziałających z NAD należy np. dehydrogenaza mleczanowa, z NADP
dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, zaś typowa dehydrogenaza flawinowa to
np. dehydrogenaza bursztynianowa.
Oksydazy aktywują cząsteczkę tlenu dwoma lub czterema elektronami i katalizują
przyłączenie protonów do powstałych jonów tlenkowych, przy czym powstaje woda lub
nadtlenek wodoru (reakcje (2) i (3)).
Oksygenazy katalizują bezpośrednie włączenie tlenu cząsteczkowego do związków
organicznych (reakcja (6)). Przykładem tych enzymów może być lipooksygenaza,

220
katalizująca utlenienie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Oksygenazy odgrywają
ważną rolę w metabolizmie związków aromatycznych.
Hydroksylazy kształtują bezpośrednie włączenie połowy cząsteczki tlenu (atomu tlenu)
do związków organicznych, przy czym wymagają obecności dodatkowo donora atomów
wodoru (reakcja (7)). Drugi atom tlenu jest wiązany z udziałem czynnika redukującego
(zredukowane NAD lub NADP) w cząsteczkę wody. Przykładem hydroksylaz jest
4-hydroksylaza fenyloalaninowa katalizująca utlenienie fenyloalaniny do tyrozyny.
Peroksydazy katalizują reakcje rozkładu nadtlenku wodoru. H 2O2 jest silnym
inhibitorem enzymów i dlatego komórki wyposażone są w mechanizmy, dzięki którym
związek ten jest rozkładany. Rozkład nadtlenku wodoru katalizują: peroksydaza i katalaza.
Peroksydaza (oksydoreduktaza donor:H2O2) jest enzymem występującym głównie
w roślinach, choć spotyka się go także w niektórych organizmach zwierzęcych. Istnieje
kilka peroksydaz, większość z nich jest niespecyficzna, ale są też peroksydazy specyficzne
w stosunku do donora wodoru, np. peroksydaza cytochromowa czy peroksydaza
glutationowa. Do peroksydaz niespecyficznych należy m. in. peroksydaza z chrzanu.
Katalaza (oksydoreduktaza H2O2:H2O2) jest enzymem rozpowszechnionym w świecie
zwierzęcym (wątroba, nerki), występuje jednak również w niektórych roślinach oraz we
wszystkich bakteriach tlenowych. Katalaza, podobnie jak peroksydaza, jest hemoproteiną.
Cząsteczka katalazy składa się z czterech podjednostek, z których każda zawiera jedną
cząsteczkę protohemu.
Oba wymienione enzymy wchodzą w skład systemów ochronnych zabezpieczających
komórkę przed szkodliwym działaniem nadtlenku wodoru.
Mechanizm rozkładu nadtlenku wodoru katalizowanego przez oba enzymy jest różny.
Peroksydaza katalizuje reakcję typu:

2AH2 + H2O2 2A + 2H2O (8)

Jest to przeniesienie atomów wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru.

Substratem, a więc donorem wodoru mogą być fenole i aminy aromatyczne,
np. o-toluidyna, gwajakol, pirogalol, di-o-anizydyna, a także polifenole, np. kwas
ferulowy.
Katalaza katalizuje reakcję typu:

H2O2 + H2O2 O2 + 2H2O (9)

221
 Jest to rozkład nadtlenku wodoru bez udziału dodatkowego substratu, polegający na
przeniesieniu atomów wodoru z jednej cząsteczki H2O2 na drugą. W pewnych warunkach
(niskie stężenie nadtlenku wodoru, duże stężenie odpowiednich donorów wodoru) katalaza
może ujawniać aktywność peroksydazową, tzn. katalizować przeniesienie atomów wodoru
z donorów wodoru, takich jak np, alkohol etylowy, fenole.
Oba omawiane enzymy katalizujące rozkład nadtlenku wodoru odgrywają dużą rolę
w przemyśle spożywczym. W mleczarstwie oznaczanie aktywności peroksydazy jest
wskaźnikiem skuteczności pasteryzacji mleka. Podobnie w procesie blanszowania owoców
i warzyw na podstawie aktywności peroksydazy można sądzić o prawidłowości tego
procesu. W analityce peroksydaza wraz z oksydazą glukozową ma zastosowanie do
oznaczania glukozy w produktach spożywczych, np. w napojach. Katalaza (również
z oksydazą glukozową) jest stosowana do usuwania glukozy lub tlenu z produktów
spożywczych w celu zapobieżenia ich ciemnieniu i procesom oksydacyjnym. W krajach,
w których dozwolona jest tzw. zimna pasteryzacja mleka (pasteryzacja przy pomocy
H2O2), katalaza jest stosowana do rozkładu nadtlenku wodoru w mleku. Poza tym
stwierdzenie obecności katalazy w mleku jest wskaźnikiem jego zakażenia.

7.1.2. Oznaczanie aktywności peroksydazy w materiale roślinnym

Zasada oznaczenia
Aktywność peroksydazy oznacza się przez pomiar spadku stężenia nadtlenku wodoru
lub donora atomów wodoru, względnie pomiar wzrostu stężenia utlenionej formy donora
(reakcja (8) w poprzednim punkcie). Najczęściej stosuje się tę ostatnią metodę przy użyciu
różnych donorów, między innymi gwajakolu, o-toluidyny, pirogalolu, di-o-anizydyny.
W opisanej niżej metodzie aktywność peroksydazy oznacza się przy użyciu di-o-
anizydyny, która po odwodorowaniu w obecności nadtlenku wodoru i peroksydazy
przechodzi w formę barwną. Intensywność powstałego zabarwienia jest proporcjonalna do
aktywności enzymu. Di-o-anizydyna, z uwagi na wysoką czułość jest najczęściej
stosowanym substratem dla peroksydazy, ale można ją zastąpić innymi, wyżej
wymienionymi związkami, a także kwasem 2,2’-azyno-bis(3-etylobenzylotiazolino-6-
sulfonowym) produkowanym w postaci wygodnych do użycia tabletek, jednak wówczas
czułość reakcji jest czterokrotnie niższa niż przy zastosowaniu di-o-anizydyny.
Mieszanina reakcyjna zawiera nadtlenek wodoru i di-o-anizydynę. Po dodaniu wyciągu
peroksydazy z roślin reakcję prowadzi się przez określony czas, po czym hamuje działanie

222
enzymu przez dodanie kwasu solnego. Intensywność powstałego żółtego zabarwienia
roztworu mierzy się poprzez pomiar absorbancji przy długości fali  = 400 nm.

Wykonanie
Sporządzanie krzywej wzorcowej
Krzywą wzorcową dla ilościowego oznaczania nadtlenku wodoru sporządza się na
podstawie pomiaru zabarwienia roztworów nadtlenku wodoru o różnych stężeniach po
reakcji z di-o-anizydyną w obecności peroksydazy. Roztwór podstawowy powinien
zawierać 1 mg H2O2 w 1cm3 buforu fosforanowego o pH 6,1. Z tego roztworu sporządza
się rozcieńczenia. W tym celu do kolb miarowych o pojemności 100 cm 3 należy pobrać
0,35; 0,70; 1,05; 1,75; 2,20; 2,45; 2,80; 3,15; 3,50 i 3,85 cm 3 roztworu podstawowego
i uzupełnić buforem fosforanowym o pH 6,1 do kreski. Przy zastosowaniu do pomiarów
tak przygotowanych roztworów wzorcowych, stężenie nadtlenku wodoru w 1 cm 3
mieszaniny reakcyjnej sporządzonej według zamieszczonego niżej opisu wynosi
odpowiednio: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 i 5,5 μg/cm3.
Do 11 probówek odmierzyć pipetą po 2,8 cm 3 buforu fosforanowego (pH 6,1), 0,1 cm3
roztworu handlowego preparatu peroksydazy, 0,1 cm3 roztworu di-o-anizydyny oraz po 0,5
cm3 przygotowanych roztworów H2O2. W dwunastej probówce sporządzić próbę ślepą
zawierającą 3,3 cm3 buforu oraz po 0,1 cm3 roztworów di-o-anizydyny i preparatu
peroksydazy. Probówki wstawić na 15 minut do termostatu o temperaturze 30°C, po czym
do każdej dodać po 1 kropli stężonego kwasu solnego w celu przerwania reakcji. Po
upływie 15 minut zmierzyć absorbancję prób wobec próby ślepej przy λ = 400 nm.
Krzywą wzorcową wykreślić, odkładając na osi odciętych stężenie H 2O2 w badanych
roztworach w μg/cm3, a na osi rzędnych odpowiadające im odczyty absorbancji.

Próba badana
5g chrzanu lub pietruszki rozcierać przez 5 minut z 50 cm3 wody destylowanej. Po
spłukaniu ścianek moździerza małą ilością wody rozcierać próbę przez dalsze 5 minut,
a następnie wyciąg przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100 cm 3
i dopełnić do kreski wodą. Po dokładnym wymieszaniu zawartości kolby wyciąg sączyć
przez bibułę odrzucając początkową porcję przesączu. Uzyskany wyciąg służy jako źródło
peroksydazy, przy czym stosuje się go bezpośrednio lub po rozcieńczeniu wodą (wyciąg
należy rozcieńczyć wodą np. w stosunku 1:50 lub 1:100, jeżeli w wyniku pomiaru
z udziałem wyciągu nierozcieńczonego uzyskano absorbancję przekraczającą wartość 2,0).

223
 Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 0,5 cm3 0,1% roztworu nadtlenku wodoru,
2,8 cm3 buforu fosforanowego (pH 6,1), 0,1 cm3 roztworu di-o-anizydyny i 0,1 cm3
wyciągu zawierającego peroksydazę. Probówki umieścić w termostacie i utrzymywać
w temperaturze 30°C dokładnie przez 15 minut. Po upływie tego czasu do probówek dodać
po jednej kropli stężonego kwasu solnego w celu przerwania reakcji. Probówki pozostawić
na około 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym zmierzyć absorbancję przy
długości fali  = 400 nm. Jako odnośnik służy próba ślepa wykonana jak właściwa z tą
różnicą, że zamiast 0,1 cm3 wyciągu enzymatycznego odmierza się do niej 0,1 cm3 wody.
Aktywność peroksydazy obliczyć w jednostkach międzynarodowych (J) na gram produktu.
Na podstawie średniej z pomiarów absorbancji badanych prób z krzywej wzorcowej
odczytuje się ilość mikrogramów nadtlenku wodoru, jaka została rozłożona w 1 cm 3
mieszaniny reakcyjnej w wyniku działania peroksydazy.

Obliczanie i interpretacja wyniku

Odczytane z krzywej wzorcowej dane należy podstawić do wzoru i obliczyć aktywność
peroksydazy w 1 g próby badanej (pietruszka lub chrzan).
x  3,5  1000
aktywność (J/g) =
15  34  5
gdzie:
x - ilość g H2O2/cm3 mieszaniny reakcyjnej odczytana z krzywej wzorcowej
3,5 - objętość mieszaniny reakcyjnej
1000 - przeliczenie mg na g
15 - czas inkubacji w minutach
34 - mol H2O2
5 - ilość miligramów badanego produktu (np. pietruszki), jakiej odpowiada 0,1 cm 3 wyciągu dodanego
do mieszaniny reakcyjnej (w przypadku wyciągu nierozcieńczonego)

Odczynniki
1) bufor fosforanowy (pH 6,1),
2) 0,1% roztwór nadtlenku wodoru,
3) roztwór di-o-anizydyny: 35 mg di-o-anizydyny w 10 cm3 alkoholu etylowego,
4) próba badana (chrzan lub pietruszka),
5) preparat handlowy peroksydazy.

7.1.3. Oznaczanie aktywności katalazy w mące

Zasada oznaczenia
Aktywność katalazy można oznaczać poprzez pomiar szybkości spadku stężenia
nadtlenku wodoru lub wzrostu stężenia tlenu (reakcja (9) w punkcie 6.1.1). Najczęściej

224
stosowaną metodą jest pomiar szybkości spadku stężenia nadtlenku wodoru rejestrowany
jako spadek absorbancji przy długości fali  = 240 nm. Metodę tę można jednak stosować
tylko wtedy, kiedy badany roztwór jest przezroczysty i bezbarwny. Jeżeli nie, to stosuje się
metody miareczkowe, najczęściej miareczkowanie manganometryczne.
Ilość powstającego w reakcji tlenu można określić manometrycznie, polarograficznie,
a obecnie najczęściej za pomocą elektrody tlenowej Clarka. W opisanej niżej metodzie
aktywność katalazy mierzy się na podstawie ilości H 2O2 rozłożonego w ciągu 15 minut
działania enzymu. Ilość H2O2 oznacza się manganometrycznie. Źródłem katalazy jest
wyciąg z mąki.
Wykonanie
Próbę badaną (mąkę) o masie 2 g rozetrzeć w moździerzu z piaskiem i 30 cm 3 wody
z dodatkiem węglanu wapnia. Otrzymaną zawiesinę sączyć przez bibułę, spłukując
moździerz dwoma porcjami po 10 cm3 wody z dodatkiem węglanu wapnia. Ogólna
objętość wody użyta do rozcierania próby i przepłukania moździerza powinna wynosić
dokładnie 50 cm3.
20 cm3 przesączonego wyciągu odmierzyć do kolby stożkowej o pojemności 200 cm 3,
dodać 5 cm3 0,1 N roztworu nadtlenku wodoru i pozostawić dokładnie na 15 minut
w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 5 cm3 2 N roztworu kwasu siarkowego
i odmiareczkować nierozłożony H2O2 przy pomocy 0,1 N roztworu nadmanganianu
potasowego (próba właściwa). Równocześnie wykonać próbę ślepą, w której 20 cm 3
wyciągu z próby badanej ogrzewać na płycie grzejnej do momentu zagotowania w celu
inaktywacji enzymu. Dalej, po dokładnym ostudzeniu roztworu, należy postępować
identycznie jak z próbą właściwą.

Obliczanie i interpretacja wyniku

W zastosowanej metodzie aktywność katalazy wyraża się jako różnicę ilości cm 3 0,1 N
roztworu nadmanganianu potasowego zużytych w próbie ślepej i właściwej oraz wagowo
jako ilość mg nadtlenku wodoru rozłożonego pod wpływem katalazy, przyjmując że 1 cm 3
0,1 N roztworu nadmanganianu odpowiada 1,7 mg nadtlenku wodoru.

Odczynniki
1) woda destylowana z dodatkiem węglanu wapnia,
2) 0,1 N roztwór nadtlenku wodoru,
3) 0,1 N roztwór nadmanganianu potasowego,

225
4) 2 N roztwór kwasu siarkowego,
5) próba badana (mąka).

Zadania do wykonania

1. Sporządzić krzywą wzorcową dla ilościowego oznaczania nadtlenku wodoru w celu

pomiaru aktywności peroksydazy.
2. Oznaczyć aktywność peroksydazy w materiale roślinnym (pietruszka, chrzan).
3. Oznaczyć aktywność katalazy w mące.

7.2. Scukrzanie skrobi przy udziale hydrolaz glikozydów

7.2.1. Charakterystyka enzymów katalizujących rozkład węglowodanów

Hydrolazy glikozydów (glikozydazy) należą do trzeciej klasy enzymów – hydrolaz.

Katalizują one hydrolityczny rozkład wiązań glikozydowych. Glikozydazy działają na
cukrowce złożone, zarówno polisacharydy, jak i oligosacharydy. Wykazują wysoką
specyficzność wobec konfiguracji przestrzennej wiązania glikozydowego (α lub β), formy
pierścienia (piranozowy lub furanozowy) oraz konfiguracji przestrzennej przy ostatnim
atomie węgla asymetrycznego (L lub D). Polisacharydy są hydrolizowane przez amylazy,
celulazy, hemicelulazy i enzymy pektynolityczne. Glikozydazy działające na
oligosacharydy nazywa się oligoglikozydazami. Katalizują one rozkład wiązań α- lub
β-glikozydowych.
Maltoza jest rozkładana przez α-glukozydazę (glukohydrolaza α-D-glukozydów),
enzym ten katalizuje również, choć w mniejszym stopniu, rozkład sacharozy.
Sacharoza jest rozkładana przez β-fruktofuranozydazę (fruktohydrolaza β-D-
fruktofuranozydów) zwaną też inwertazą.
Laktoza, czyli β-D-galaktozydo-4-D-glukoza, ulega hydrolizie do galaktozy i glukozy
pod wpływem β-galaktozydazy (galaktohydrolaza β-D-galaktozydów).
Amylazy (enzymy amylolityczne) są to enzymy katalizujace hydrolizę skrobi
i pokrewnych polisacharydów poprzez rozkład wiązań α-glikozydowych. Można je
podzielić na 3 grupy:
- α-amylazy
- β-amylazy
- glukoamylazy

226
 α-amylaza (4-glukanohydrolaza α-1,4-glukanu) katalizuje hydrolizę wiązań wewnątrz
cząsteczki substratu w sposób przypadkowy, działa wyłącznie na wiązania α-1,4.
W wyniku działania -amylazy skrobia lub glikogen rozkładane są do dekstryn.
Występujące w miejscach rozgałęzień łańcucha polisacharydowego amylopektyny
wiązania α-1,6-glikozydowe nie stanowią przeszkody dla α-amylazy, są po prostu omijane
i pozostają nierozłożone. W organizmie człowieka α-amylaza znajduje się w ślinie
i trzustce, skąd jest wydzielana do jelit. W przewodzie pokarmowym hydrolizuje skrobię
zawartą w pożywieniu do oligosacharydów, które dalej ulegają rozkładowi do glukozy pod
wpływem oligoglikozydaz.
β-amylaza (maltohydrolaza α-1,4-glukanu), podobnie jak α-amylaza, katalizuje rozkład
hydrolityczny wiązań α-1,4-glikozydowych, ale w sposób uporządkowany, atakując co
drugie wiązanie począwszy od nieredukującego końca łańcucha polisacharydowego.
Enzym ten, w odróżnieniu do α-amylazy, zatrzymuje się po dotarciu do punktów
rozgałęzień (wiązań α-1,6-glikozydowych) występujących w amylopektynie i glikogenie.
Dlatego też produktami hydrolizy tych polisacharydów katalizowanej przez β-amylazę są
cząsteczki maltozy oraz nierozłożona wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna.
Hydrolizując wiązanie α-1,4-glikozydowe, α-amylaza powoduje zmianę konfiguracji przy
węglu 1 z α na β (stąd nazwa β-amylaza).
Glukoamylaza (glukohydrolaza α-1,4-glukanu) katalizuje odszczepianie kolejnych
cząsteczek glukozy od nieredukującego końca łańcucha oligo- lub polisacharydu. Działa
na wiązania α-1,4, ale rozkłada również, chociaż ze znacznie mniejszą szybkością,
wiązania α-1,6- i α-1,3-glikozydowe. Jeżeli względną szybkość hydrolizy wiązań α-1,4-
glikozydowych przyjmie się za 100, to szybkość hydrolizy wiązań α-1,3 wynosi 6,6,
a wiązań α-1,6-glikozydowych 3,6. Jako jedyna z amylaz, glukoamylaza może całkowicie
rozłożyć skrobię do glukozy. W czasie hydrolizy katalizowanej przez glukoamylazę
następuje również zmiana konfiguracji przy węglu 1 i powstaje β-glukoza.
Schemat działania enzymów amylolitycznych na skrobię, a dokładniej na frakcję
amylopektyny przedstawia rys. 61.

227
Rys. 61. Rozkład skrobi (amylopektyny) z udziałem enzymów amylolitycznych

W wyniku działania amylaz na skrobię obserwuje się zanik charakterystycznej barwy

z jodem, spadek lepkości roztworu substratu i wzrost jego redukcyjności. W obecności
α-amylazy barwa z jodem oraz lepkość zanikają szybko, a redukcyjność wzrasta powoli.
W przypadku β-amylazy i glukoamylazy następuje zjawisko odwrotne – barwa z jodem
i lepkość zanikają powoli, a redukcyjność wzrasta szybko.
Enzymy celulolityczne, zwane również celulazami, katalizują rozkład wiązań β-1,4-
glikozydowych, a także β-1,3-glikozydowych. Określenie "enzymy celulolityczne"
obejmuje kilka enzymów (np. celulaza, egzo-celobiohydrolaza, egzo- β-1,4-glukozydaza,
β-glukozydaza), które rozkładają celulozę z powstaniem pośrednich produktów hydrolizy
aż do glukozy. Są one wytwarzane tylko przez niektóre organizmy: bakterie, pleśnie,
termity, korniki i ślimaki.
Enzymy pektynolityczne także są niejednolitą grupą enzymów. Katalizują one rozkład
substancji pektynowych do prostych związków, które mogą ulegać dalszym przemianom
pod wpływem innych enzymów.
Enzymy katalizujące hydrolityczny rozkład cukrowców, zarówno polisacharydów, jak
i oligosacharydów, znajdują szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym. Preparaty
amylolityczne wykorzystuje się do produkcji syropów skrobiowych i krystalicznej
glukozy, a także w gorzelnictwie i browarnictwie. Preparaty amylolityczne znajdują
zastosowanie również w piekarnictwie, w procesie przygotowania ciasta. Poza tym

228
oznaczanie aktywności amylaz jest wykorzystywane w analizie jakości niektórych
produktów spożywczych, takich jak mąka, miód, mleko.
β-fruktofuranozydaza (inwertaza) jest wykorzystywana w przemyśle cukierniczym do
otrzymywania i utrzymywania świeżości półpłynnych nadzień oraz do zapobiegania
w nich krystalizacji sacharozy.
Preparaty β-galaktozydazy stosuje się do zapobiegania krystalizacji laktozy przy
produkcji czekolady mlecznej, lodów, koncentratów mlecznych i serwatkowych. Możliwe
jest ich wykorzystanie do hydrolizy laktozy w mleku w celu polepszenia przyswajalności
tego produktu przez ludzi dorosłych pozbawionych β-galaktozydazy. Dużą przyszłość
mają przed sobą preparaty celulolityczne. Celuloza stanowi dużą rezerwę cukru dla celów
paszowych i żywieniowych, bowiem ok. 50% organicznego węgla na Ziemi występuje
w postaci celulozy.

7.2.2. Hydroliza skrobi przy użyciu glukoamylazy

Zasada metody
Produkcja syropów skrobiowych z zastosowaniem preparatów enzymatycznych
obejmuje 2 etapy:
1. Wstępne upłynnianie skrobi pod wpływem α-amylazy.
2. Scukrzanie produktów wstępnej hydrolizy w wyniku działania glukoamylazy.
Zależnie od czasu i warunków prowadzenia hydrolizy skrobi oraz stężenia enzymów
otrzymuje się syropy o różnym stopniu scukrzenia (nisko- i wysokoscukrzone) i możliwe
jest regulowanie wzajemnego stosunku glukozy i maltozy (syropy glukozowe, syropy
maltozowe). Głównymi składnikami syropów niskoscukrzonych są dekstryny o różnych
masach cząsteczkowych, niższe oligosacharydy, wśród nich maltoza i glukoza, która
występuje w małych ilościach (4-15%). W procesie dalszego scukrzania następuje
uwalnianie glukozy i wzrost zawartości tego cukru przy obniżaniu się ilości dekstryn.
W syropach wysokoscukrzonych zawartość glukozy kształtuje się powyżej 50%
(do 92,5%). Miarą stopnia hydrolizy skrobi jest zawartość cukrów redukujących.
W przemyśle syropy skrobiowe charakteryzuje się przy pomocy wartości DE, czyli
równoważnika glukozowego (dextrose equivalent). Jest to ilość cukrów redukujących,
w przeliczeniu na glukozę w 100 g suchej masy hydrolizatu. Przyjmuje się, że dla skrobi

229
wartość DE wynosi 0, zaś po pełnej hydrolizie do glukozy DE = 100. W opisanej metodzie
hydrolizie enzymatycznej przy użyciu glukoamylazy poddaje się produkt częściowej
hydrolizy skrobi – maltodekstrynę, której wartość DE wynosi około 20. Stopień hydrolizy
maltodekstryny po działaniu glukoamylazy mierzy się poprzez oznaczenie zawartości
cukrów redukujących i na tej podstawie oblicza się wartość DE.

Wykonanie
Glukoamylaza wykazuje optymalne działanie w środowisku o pH w granicach 4–5,
dlatego roztwór maltodekstryny należy sporządzić w 0,01 M buforze octanowym o pH 4,6.
W celu scukrzenia maltodekstryny 20 cm3 20% roztworu maltodekstryny należy
odmierzyć pipetą do kolbki stożkowej, dodać 0,5 cm3 roztworu preparatu glukoamylazy
i dokładnie wymieszać zawartość. Kolbę stożkową wstawić do termostatu o temperaturze
30°C i prowadzić hydrolizę dokładnie przez 30 minut. Po wyjęciu kolbki z termostatu
roztwór szybko ogrzać na płytce do stanu wrzenia, aby zahamować działanie
glukoamylazy. Następnie otrzymany hydrolizat ochłodzić w strumieniu bieżącej wody.
Odczynniki
1) 0,01 M bufor octanowy o pH 4,6,
2) 20% roztwór maltodekstryny w 0,01 M buforze octanowym,
3) roztwór glukoamylazy w 0,01 M buforze octanowym.

7.2.3. Oznaczanie zawartości cukrów redukujących

Zasada metody
Ilość cukrów redukujących występujących w hydrolizatach skrobiowych oznacza się
metodą jodometryczną. W metodzie tej roztwór CuSO4 dodaje się w nadmiarze w stosunku
do ilości cukrów redukujacych. Nadmiar jonów Cu2+, które nie uległy redukcji do Cu+,
oznacza się na podstawie ilości jodu wydzielonego z jodku potasowego. Wydzielony jod
odmiareczkowuje się roztworem tiosiarczanu sodowego.
2+ - +
2Cu + 2J 2Cu + J2

J2 + 2Na2S2O3 NaJ + Na2S4O6

Zawartość cukrów redukujących w hydrolizatach podaje się jako wartość DE.

Wykonanie

230
 2,5 g hydrolizatu otrzymanego po działaniu glukoamylazy na maltodekstrynę odważyć
na wadze technicznej w zlewce o pojemności 50 cm 3. Do zlewki wlać małą ilość wody,
zamieszać roztwór bagietką i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 250
cm3 (zlewkę przemywać jeszcze kilka razy małymi porcjami wody destylowanej i całość
przenosić do kolby miarowej). Następnie uzupełnić objętość kolby wodą do kreski
i dokładnie wymieszać zawartość kolby.
Do 2 kolb stożkowych o pojemności 300 cm 3 odmierzyć roztwory w ilościach
podanych w tabeli:

Próba właściwa Próba ślepa

10 cm3 badanego hydrolizatu 10 cm3 wody destylowanej
10 cm3 roztworu A 10 cm3 roztworu A
10 cm3 roztworu B 10 cm3 roztworu B
20 cm3 wody destylowanej 20 cm3 wody destylowanej

Zawartość kolb ogrzać na płytce grzejnej tak, aby w ciągu 3 minut doprowadzić do
wrzenia. Ciecz utrzymać w stanie wrzenia dokładnie przez 2 minuty, a następnie ochłodzić
w strumieniu bieżącej wody do temperatury pokojowej. Po ochłodzeniu do obu kolb dodać
po 10 cm3 30% roztworu KJ oraz po 10 cm 3 kwasu siarkowego i miareczkować 0,1 N
roztworem tiosiarczanu sodowego do jasnożółtego zabarwienia. Następnie dodać pipetą
5 cm3 1% roztworu skrobi i miareczkować do zaniku powstałej barwy granatowej.

Ob1iczanie i interpretacja wyników

Objętość roztworu tiosiarczanu sodowego zużytą do miareczkowania próby właściwej
odejmuje się od objętości zużytej do miareczkowania próby ślepej i z tabeli odczytuje ilość
cukrów redukujących (w przeliczeniu na glukozę).
Procentową zawartość cukrów redukujących oblicza się według następującego wzoru:

a  b  100
X=
cd
gdzie:
a - ilość glukozy odczytana z tabeli
b - objętość roztworu po rozpuszczeniu naważki, cm3
c - objętość hydrolizatu w próbie do miareczkowania, cm3
d - naważka hydrolizatu, g

Równoważnik glukozowy (DE) oblicza się stosując wzór:

231
 X  100
DE =
S
gdzie:
S - zawartość suchej masy maltodekstryny (20%)

Odczynniki
1) roztwór A: 34,6 g krystalicznego siarczanu miedzi (II) (CuS045H2O) w 500 cm3 wody destylowanej,
2) roztwór B: 173 g winianu sodowo-potasowego i 50 g NaOH w 500 cm3 wody destylowanej,
3) 25% roztwór kwasu siarkowego,
4) 0,1 N roztwór tiosiarczanu sodowego,
5) 30% roztwór jodku potasowego,
6) 1% roztwór skrobi.

Zadania do wykonania
1. Przeprowadzić scukrzanie maltodekstryny przy użyciu glukoamylazy.
2. Oznaczyć zawartość cukrów redukujących w hydrolizacie i obliczyć wartość DE.
3. Na podstawie wartości DE określić stopień scukrzenia hydrolizatu.
8. Przegląd podstawowych procesów metabolicznych

Enzymy są odpowiedzialne za przemiany biochemiczne zachodzące w żywym

organizmie. Całokształt tych przemian i towarzyszące im przemiany energii to
metabolizm, na który składa się tysiące reakcji chemicznych. Procesy życiowe wymagają
ciągłego dostarczania energii, jednak organizmy żywe, zarówno roślinne jak i zwierzęce,
są w stanie przyswajać tylko pewne formy energii, co oznacza na przykład, że ogrzanie
rośliny w płomieniu ogniska nie zapewni jej energii potrzebnej do życia. Z drugiej strony
rośliny zielone mają unikalną właściwość korzystania z najbogatszego na Ziemi źródła
energii, jakim jest energia słoneczna, którą roślina jest w stanie przekształcać w energię
chemiczną pozwalającą na wytwarzanie tak złożonych związków chemicznych jakimi są
węglowodany. Inne, niezbędne do życia rośliny substancje, takie jak białka, czy tłuszcze
organizm roślinny potrafi wytwarzać z węglowodanów. Zwierzęta, w tym człowiek takich
zdolności nie posiadają, zdobywają więc energię potrzebną im do życia w inny sposób,
a mianowicie wykorzystując do tego celu składniki żywności, takie jak węglowodany, ale
także tłuszcze i białka. Składniki te, czyli składniki pokarmowe są dla zwierząt surowcami
energetycznymi i budulcowymi. Podczas trawienia zostają one przekształcone w związki
proste, przydatne przy odbudowie własnych komórek oraz takie, które wytwarzają duże
ilości energii niezbędnej do życia. Energia wyzwalana w trakcie procesów trawienia takich

232
składników jak tłuszcze czy węglowodany ma postać w pełni przyswajalną przez
organizm, tj. występuje w formie związków makroergicznych, opisanych już w rozdziale
„Kwasy nukleinowe”, punkt 2. Najbardziej znanym przedstawicielem tej grupy związków
jest adenozynotrifosforan (ATP). Hydroliza jednego wiązania fosforanowego w ATP
przynosi zysk energetyczny w postaci 30,6 kJ/mol, czyli 7,3 kcal/mol. W wyniku
hydrolizy ATP powstaje adenozynodifosforan ADP, który nadal spełnia funkcje
energetyczne, gdyż hydroliza kolejnego wiązania fosforanowego w ADP daje 25,2 kJ/mol.
Wydzielenie energii podczas rozkładu związków daje możliwość zajścia reakcji w
przeciwnym kierunku, tj. reakcji syntezy wymagającej dostarczenia energii, czyli reakcji
endoergicznej. Synteza sacharozy z glukozy i fruktozy w organizmie jest reakcją
endoergiczną i wymaga dostarczenia energii w ilości 29,2 kJ/mol. Reakcja taka jest
możliwa tylko wtedy, jeżeli będzie ona sprzężona z reakcją egzoergiczną, np. hydrolizą
ATP.
glukoza + fruktoza  sacharoza ΔG = + 29,2 kJ/mol
ATP + H2O  ADP + Pi ΔG = - 30,6 kJ/mol
W przyrodzie istnieją dwa zasadnicze procesy przemiany energii – fotosynteza
i oddychanie komórkowe. Procesy te są komplementarne.
W procesie fotosyntezy rośliny wykorzystują energię światła słonecznego do
wytwarzania biocząsteczek, takich jak węglowodany. Z kolei w procesie oddychania
komórkowego składniki pożywienia przekształcane są przez organizmy zwierzęce do
związków prostych, takich jak dwutlenek węgla czy woda, przy czym wytwarza się
energia potrzebna im do życia.
Metabolizm polega na przekształcaniu jednego związku chemicznego (substratu)
w inny związek w wyniku jednej lub wielu kolejnych reakcji chemicznych.
Celem przekształceń metabolicznych może być:
1. Zdobywanie energii niezbędnej dla przebiegu procesów życiowych.
2. Biosynteza związków.
3. Usuwanie produktów przemian.
Przemiany metaboliczne zapewniają więc organizmowi wzrost, ruch, rozmnażanie,
transport cząsteczek, syntezę makrocząsteczek i wszystkie inne funkcje życiowe.
Przemiany metaboliczne dzielą się na dwa zasadnicze rodzaje – przemiany anaboliczne
i kataboliczne.

233
 Przemiany anaboliczne wymagają dostarczania energii, a więc mają charakter
endoergiczny i prowadzą do syntezy związków wielkocząsteczkowych (np. białek
z aminokwasów, polisacharydów – skrobi, glikogenu z cukrów prostych).
Przemiany kataboliczne przebiegają w kierunku odwrotnym, czyli polegają na
rozkładzie związków wielkocząsteczkowych do związków prostych, czemu towarzyszy
wydzielenie energii, a więc są to procesy egzoergiczne.
Typowym przykładem procesu katabolicznego jest rozkład glukozy do dwutlenku
węgla i wody przebiegający z udziałem tlenu:

glukoza + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O

Jeżeli organizm potrzebuje dodatkowej porcji energii, np. w trakcie ćwiczeń

fizycznych, glukoza jest utleniana i rozkładana według powyższej reakcji, a procesowi
temu towarzyszy wytworzenie energii w ilości około 17 kJ z 1 grama glukozy.
Glukoza w naszym organizmie jest wytwarzana z polisacharydów, takich jak skrobia
czy glikogen będących składnikami żywności, bądź też pochodzi z glikogenu
przechowywanego w wątrobie, a będącego magazynem energii. Jeżeli w danym momencie
nasz organizm nie potrzebuje dodatkowych ilości energii, węglowodany dostarczane
z pożywieniem są przekształcane w wątrobie do glikogenu i tam odkładane. Część
glikogenu jest przechowywana także w mięśniach, mózgu i krwi i jest gotowa do
natychmiastowego użycia, tj. rozkładu do glukozy i dalej do dwutlenku węgla i wody
dostarczając organizmowi energii. Proces rozkładu węglowodanów do glukozy i dalej
rozkład glukozy do związków prostych ma miejsce także w innych organizmach, np.
drobnoustrojów, przy czym może on też przebiegać w warunkach beztlenowych.
Przemiany beztlenowe glukozy dostarczają organizmowi bardzo niewielkich ilości energii,
jednak są one konieczne dla utrzymania procesów życiowych w warunkach beztlenowych
(np. są konieczne dla skurczu mięśnia w warunkach niedoboru tlenu, do którego dochodzi
podczas intensywnego wysiłku fizycznego). Niektóre przemiany węglowodanów
zachodzące bez dostępu tlenu są znane i wykorzystywane od wieków, na przykład
fermentacja alkoholowa katalizowana przez drożdże czy fermentacja mlekowa typowa dla
niektórych bakterii. W wyniku procesów fermentacyjnych powstaje wiele cennych
metabolitów, które przedłużają trwałość żywności oraz wpływają na jej cechy
sensoryczne.

234
 Enzymatyczny rozkład cukrów w warunkach tlenowych jest głównym źródłem energii
dla organizmu zwierzęcego, choć nie jedynym. Źródłem energii są też lipidy, wreszcie na
cele energetyczne mogą być przeznaczone także aminokwasy pochodzące z rozkładu
białek. Największy udział w dostarczaniu energii naszemu organizmowi mają
węglowodany (50–55%), w nieco mniejszym stopniu lipidy (30%), a w niewielkim stopniu
także aminokwasy (15–20%).
Proces wytwarzania energii, choć mający podstawowe znaczenie dla każdego
organizmu żywego, nie jest jedynym szlakiem metabolicznym. Inne składniki naszego
pożywienia po wprowadzeniu ich do organizmu ulegają różnym przekształceniom,
w większości katalizowanym przez enzymy i prowadzącym do powstania różnych
związków prostych wykorzystywanych przez organizm do różnych celów.
Główne składniki naszego pożywienia, węglowodany, lipidy i białka w procesie
trawienia ulegają rozkładowi najpierw do związków prostych, tj. odpowiednio cukrów
prostych, kwasów tłuszczowych i glicerolu oraz aminokwasów (rys. 62). Krótki opis
typowych dróg metabolicznych przekształceń trzech najważniejszych składników
żywności przedstawiono w następnych podrozdziałach.

żywność

białko węglowodany lipidy

trawienie

aminokwasy glukoza glicerol

i inne cukry proste kwasy tłuszczowe

Rys. 62. Początkowy etap przemian składników żywności podczas procesu trawienia

Znajomość mechanizmu przemian metabolicznych podstawowych związków

chemicznych pozwala przewidywać drogi ich wykorzystania przez organizm, a przez to

235
właściwie dobierać składniki pożywienia. Pozwala również przewidywać kierunki zmian
składników żywności, jakie mogą zachodzić w trakcie jej przetwórstwa i przechowywania.

8.1. Metabolizm węglowodanów

W wyniku enzymatycznego rozkładu polisacharydów powstają w pierwszym etapie
cukry proste. W dalszych przemianach udział bierze tylko glukoza i fruktoza, a inne cukry
proste powstałe z rozkładu polisacharydów ulegają przekształceniu do glukozy. Rozkład
polisacharydów zachodzi głównie drogą hydrolizy z udziałem hydrolaz glikozydów, które
są omówione w punkcie 7.2.1.
Glukoza jest metabolizowana do kwasu pirogronowego w procesie określanym nazwą
glikolizy. Ten etap katabolicznych przemian węglowodanów przynosi zysk energetyczny
w postaci dwóch cząsteczek ATP i to niezależnie od tego, czy proces zachodzi
w warunkach tlenowych czy beztlenowych (rys. 63). Kierunek dalszych przemian jest
ściśle uzależniony od obecności tlenu. Powstały w procesie glikolizy kwas pirogronowy
w obecności tlenu ulega przekształceniu do acetylokoenzymu A (tzw. aktywny octan,
o którym szerzej wspomniano w rozdziale „Witaminy”, punkt 7.2.5). Acetylokoenzym A
wchodzi w cykl przemian zwanych cyklem kwasów trikarboksylowych lub cyklem
cytrynianowym, czy wreszcie cyklem Krebsa.

236
Rys. 63. Schemat metabolicznego rozkładu węglowodanów

Główną funkcją cyklu cytrynianowego jest utlenianie acetylokoenzymu A do

dwutlenku węgla z jednoczesnym wytworzeniem dużych ilości energii, przy czym
bezpośrednio w cyklu Krebsa z jednej cząsteczki kwasu pirogronowego powstaje tylko
jedna cząsteczka GTP – związku makroergicznego równoważnego ATP (rozdział „Kwasy
nukleinowe”, punkt 2). Dominująca ilość energii jest wyzwalana w tzw. łańcuchu
oddechowym, gdzie w wyniku procesu fosforylacji oksydacyjnej elektrony pochodzące
z utlenienia zredukowanych przenośników elektronów (NADH + H+ i FADH2) powstałych
w procesie glikolizy i cyklu Krebsa są przenoszone na tlen i powstaje woda. Procesowi
temu towarzyszy synteza cząsteczek ATP w ilości 2,5 cząsteczki ATP z utlenienia jednej
cząsteczki NADH + H+, a 1,5 cząsteczki ATP z utlenienia jednej cząsteczki FADH 2.
Łączny efekt energetyczny całkowitego utlenienia glukozy wyraża się powstaniem około
30 cząsteczek ATP.
Cykl Krebsa zajmuje szczególne miejsce w procesach metabolicznych, gdyż jest
zasadniczym fragmentem procesu rozkładu składników pożywienia, łączy więc szlaki
metaboliczne zarówno węglowodanów, lipidów jak i białek.
Przemiany kwasu pirogronowego w ramach cyklu Kresa i łańcucha oddechowego
prowadzące do wytworzenia znacznych ilości energii mają miejsce tylko przy
wystarczającym dostępie tlenu. Przy braku tlenu dalsze przemiany kwasu pirogronowego
nie dają żadnego zysku energetycznego, a kierunek tych przemian zależy od obecności
w środowisku odpowiednich drobnoustrojów (rys. 64).

237
Rys. 64. Kierunki przemian kwasu pirogronowego w przemianach metabolicznych
węglowodanów

W obecności enzymu – dehydrogenazy mleczanowej wytwarzanej na przykład przez

bakterie z rodzaju Lactobacillus ma miejsce fermentacja mlekowa, czyli z kwasu
pirogronowego powstaje kwas mlekowy.
W obecności drożdży zachodzi fermentacja alkoholowa, w której kwas pirogronowy
ulega najpierw przekształceniu w aldehyd octowy i dalej w alkohol etylowy (rys. 65).

CH3 CO COOH CH3 CHO + CO2

(1) (2)

+
CH3 CHO + NADH + H CH3 CH2 OH
(2) (3)

Rys. 65. Schemat reakcji zachodzących podczas fermentacji alkoholowej

1 – kwas pirogronowy, 2 – aldehyd octowy, 3 – alkohol etylowy

8.2. Metabolizm białek

Enzymatyczny rozkład białek polega na hydrolizie wiązania peptydowego zarówno
wewnątrz łańcucha białkowego jak i na jego skraju (rys. 66). Enzymy proteolityczne
katalizujące rozkład wiązania peptydowego wewnątrz łańcucha, tzw. endopeptydazy, to
znane enzymy

238
trawienne takie jak np. pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna funkcjonujące
w naszym układzie pokarmowym. Są to enzymy pozakomórkowe, czyli takie, które
produkowane są przez komórki organizmu w celu rozkładu białek dostarczonych do
organizmu z zewnątrz, np. z pożywienia. Obok nich komórki wytwarzają także enzymy
proteolityczne wewnątrzkomórkowe, których zadaniem jest utrzymywanie odpowiedniej
równowagi wewnątrz komórki pomiędzy białkiem a produktami jego rozkładu, czyli
peptydami i aminokwasami.

Rys. 66. Schemat działania enzymów proteolitycznych na łańcuch białkowy

Obok endopeptydaz istnieją także enzymy proteolityczne, które oddzielają od łańcucha

białkowego pojedyncze aminokwasy znajdujące się na jego skraju. Są to aminopeptydazy
i karboksypeptydazy (rys. 66). Aminopeptydazy katalizują proces hydrolizy wiązania
peptydowego znajdującego się na N-końcu łańcucha białkowego (czyli na końcu z wolną
grupą aminową), a karboksypeptydazy hydrolizują wiązanie peptydowe na przeciwległym
końcu tego łańcucha, czyli końcu C (zakończonym wolną grupą karboksylową).
W wyniku działania endopeptydaz na białko powstają krótsze łańcuchy peptydowe,
które w dalszej kolejności mogą zostać rozłożone do wolnych aminokwasów poprzez
działanie egzopeptydaz. Powstałe w obecności enzymów proteolitycznych aminokwasy są
wykorzystywane przez organizm do wytwarzania własnych białek lub ulegają

239
przekształceniom. W każdym organizmie zachodzi ustawiczne odnawianie składników,
w tym składników białkowych i takie jest podstawowe przeznaczenie aminokwasów
powstałych z białek pożywienia. Poza tym aminokwasy mogą ulegać przemianom tworząc
inne, potrzebne organizmowi aminokwasy lub tak ważne związki jak hormony czy aminy
biogenne. Podstawowe przemiany aminokwasów to:
1. Transaminacja, czyli przeniesienie grupy aminowej z aminokwasu na ketokwas:

R1 CH(COOH) NH2 + R2 CO COOH R1 CO COOH + R2 CH(COOH) NH2

2.
Deaminacja, czyli odłączenie grupy aminowej od cząsteczki aminokwasu. Może ona
przebiegać dwoma drogami, tj. jako deaminacja oksydacyjna:

R CH(COOH) NH2 R CO COOH + NH3

lub deaminacja nieoksydacyjna:

R CH(COOH) NH2 R CH CH COOH + NH3

3. Dekarboksylacja, czyli odłączenie grupy karboksylowej od cząsteczki aminokwasu:

R CH(COOH) NH2 R CH2 NH2 + CO2

Przemiany aminokwasów mają podstawowe znaczenie dla funkcjonowania organizmu.

Przemiany te, w połączeniu z hydrolitycznym rozkładem białek mają też miejsce w trakcie
przetwórstwa żywności i mogą zachodzić także podczas jej przechowywania.

8.3. Metabolizm lipidów

Lipidy to związki o funkcjach zróżnicowanych, lipidy właściwe są źródłem energii
(rozdział „Lipidy”, punkt 1), 1 g tłuszczu przynosi organizmowi zysk energetyczny
w ilości ponad 37,6 kJ. Jest to energia, którą organizm potrafi skonsumować, czyli
w wyniku rozkładu lipidów właściwych powstają związki makroergiczne w postaci
adenozynotrifosforanu (ATP). Pierwszym etapem metabolizmu lipidów jest enzymatyczny
rozkład tłuszczów właściwych do glicerolu i kwasów tłuszczowych katalizowany przez
lipazy. Z glicerolu w wyniku dalszych przekształceń powstaje aldehyd
3-fosfoglicerynowy, który zostaje włączony do szlaku metabolicznego węglowodanów, co

240
w ostatecznym efekcie przynosi zysk energetyczny. Kwasy tłuszczowe pod wpływem
odpowiednich enzymów ulegają stopniowej degradacji enzymatycznej,
w trakcie której następuje stopniowe odłączanie jednostek dwuwęglowych
(acetylokoenzym A), a łańcuch staje się krótszy o 2 atomy węgla (rys. 67). Dzieje się tak
aż do całkowitej degradacji łańcucha do acetylokoenzymu A, który zostaje włączony do
szlaku przemian węglowodanów (rys. 63) i w warunkach tlenowych ulega przekształceniu
do dwutlenku węgla i wody wytwarzając przy tym energię.

Rys. 67. Schemat enzymatycznej degradacji kwasów tłuszczowych z uwolnieniem

dwuwęglowych jednostek acetylokoenzymu A

W trakcie przechowywania żywności lipidy są bardzo podatne na przemiany

wywoływane przez enzymy drobnoustrojów, chociaż rozkład lipidów może też zachodzić
bez udziału enzymów. Powstałe w wyniku rozkładu lipidów kwasy tłuszczowe ulegają
dalszym przemianom enzymatycznym do acetylokoenzymu A oraz chemicznym, często
o bardzo złożonym mechanizmie. Przedstawiono je krótko w rozdziale „Lipidy”, punkt 5.

9. Zagadnienia
1. Oksydoreduktazy – charakterystyka, podział, przykłady, oznaczanie aktywności.
2. Hydrolazy glikozydów; ogólna charakterystyka. Działanie enzymów amylolitycznych
(α- i β-amylazy oraz glukoamylazy), hydrolizaty skrobiowe, wartość DE.
3. Enzymatyczny rozkład cukrów w warunkach tlenowych i beztlenowych.
4. Metabolizm białek.
5. Metabolizm lipidów.

WYBRANE METODY STOSOWANE W ANALIZIE BIOCHEMICZNEJ

1.Wprowadzenie

241
 W niniejszym rozdziale zamieszczono opisy wybranych metod najczęściej
stosowanych w analizie biochemicznej. Są to metody spektrofotometryczne
i chromatograficzne.
Opisy uwzględniają podstawy teoretyczne, stosowaną aparaturę i przykłady
praktycznego wykorzystania poszczególnych metod. Szczegółowe procedury wykonania
eksperymentów z zastosowaniem tych metod przedstawiono w poprzednich rozdziałach.

2. Metody spektrofotometryczne
Spośród metod spektrofotometrycznych największe zastosowanie w analizie
biochemicznej ma spektrofotometria absorpcyjna. Technika ta opiera się na pomiarze
absorpcji (pochłaniania) światła przechodzącego przez analizowaną próbę. Pomiary
absorbancji1 (A) mogą być dokonywane w różnych obszarach widma w zależności od
stosowanej analitycznej długości fali. Szczególne zastosowanie w badaniach cząsteczek
biologicznych mają dwa zakresy promieniowania elektromagnetycznego, tj. ultrafiolet
- UV (długość fali: od 180 do 400 nm) oraz światło widzialne - VIS (długość fali: od 400
do 800 nm). Pomiary prowadzone w zakresie światła widzialnego określa się też jako
metody kolorymetryczne. Niektóre cząsteczki po zaabsorbowaniu kwantów energii
świetlnej wykazują zjawisko emisji światła. Proces ten nosi nazwę fluorescencji, a pomiary
tego zjawiska są podstawą spektrofluorymetrii.

2.1. Spektrofotometria absorpcyjna UV-VIS

Pomiary absorpcji światła wykonywane są w spektrofotometrach UV-VIS
i kolorymetrach (tylko VIS). Aparaty te pracują na prostej zasadzie: na próbę badaną pada
wiązka światła o znanej długości fali, część światła zostaje zaabsorbowana przez próbę,
a reszta przechodzi i pada na fotokomórkę (detektor). Ta ostatnia wzmacnia zmierzony
sygnał świetlny, przekształca go w elektryczny i przesyła do rejestratora.

Termin absorbancja określa wielkość mierzoną przez spektrofotometr, w odróżnieniu do terminu absorpcja,
który określa zjawisko pochłaniania światła.

242
 szczeliny

0.36

system próba fotokomórka

Ÿród³o œwiat³a monochromator
optyczny badana i rejestrator
Rys. 68. Schemat spektrofotometru do pomiaru absorpcji światła

Schemat budowy i zasady działania spektrofotometru pokazano na rys. 68. Źródło

światła w zakresie UV stanowi wysokociśnieniowa lampa wodorowa lub deuterowa,
natomiast w zakresie VIS jest to lampa wolframowa. Lampy te emitują światło o szerokim
zakresie (np. lampa deuterowa ma zakres emisji fal o długości od 180 do 320 nm). W celu
wydzielenia światła monochromatycznego w najprostszych kolorymetrach stosuje się
odpowiednie filtry, nowoczesne spektrofotometry posiadają wbudowane pryzmaty lub
siatki dyfrakcyjne. Zanim światło dotrze do próby przechodzi przez system optyczny
(zestaw soczewek, filtrów, luster) oraz odpowiednie szczeliny o różnej szerokości. Układy
optyczne koncentrują światło, zwiększają jego czystość spektralną i ogniskują je
w kierunku próbki. Zastosowana szerokość szczeliny decyduje o intensywności oraz
czystości spektralnej światła padającego na próbę (im węższa szczelina tym światło
„lepszej jakości”, ale mniej intensywne).
Próby badane umieszcza się w komorze pomiarowej w kuwetach szklanych,
kwarcowych lub z tworzywa sztucznego. Do pomiarów w zakresie ultrafioletu stosuje się
kuwety kwarcowe lub wykonane ze specjalnego tworzywa sztucznego przepuszczalnego
dla światła UV. W nowoczesnych spektrofotometrach można jednocześnie dokonywać
pomiaru absorbancji dla kilku prób badanych.
Pomiary spektrofotometryczne prób badanych wykonywane są w stosunku do
odnośnika, tzw. próby ślepej lub zerowej. Próba ślepa jest to próba zawierająca wszystkie
stosowane odczynniki oprócz substancji oznaczanej i wykonana w tych samych
warunkach, co próba badana, np. trzymana przez określony czas w podwyższonej
temperaturze. Odpowiednie przygotowanie próby ślepej ma na celu wykluczenie wpływu
substancji dodatkowych oraz stosowanych zabiegów na uzyskany wynik pomiaru
absorbancji, który powinien być uzależniony tylko od substancji oznaczanej.
Badania absorbancji mogą być przydatne zarówno do identyfikacji określonych
związków, jak również do oznaczenia ich ilości. Praktycznie wszystkie cząsteczki
absorbują kwanty energii świetlnej o specyficznej długości fali, przy czym energia

243
zaabsorbowanego fotonu musi odpowiadać różnicy energii pomiędzy stanem
podstawowym i wzbudzonym cząsteczki. Dla każdej cząsteczki można wyznaczyć widmo
UV-VIS, wyrażające zależność absorpcji światła od stosowanej długości fali (często
stosuje się wykreślanie widma w zawężonych obszarach, jest to uzależnione od rodzaju
analizowanych cząsteczek). Przykładowe widmo zostało przedstawione na rys. 69.

Rys. 69. Widmo absorpcji światła badanego związku z zaznaczeniem λmax

Na podstawie analizy widma UV-VIS można ustalić położenie charakterystycznych dla

określonego związku maksimów pasm absorpcyjnych (identyfikacja związku), czyli
wyznaczyć te długości fal, które są pochłaniane przez ten związek z największą
intensywnością, tzw. λmax. Następnie dla tych wyznaczonych długości fal określa się
stopień absorpcji światła przez badany związek, czyli tzw. współczynnik ekstynkcji (ε).
Jest to parametr charakterystyczny dla danego związku, zdefiniowany w prawie
Lamberta-Beera:
A   l c
gdzie:
A - absorbancja, czyli log I/I0 (I – intensywność światła padającego na próbę, I0 - intensywność światła
przechodzącego)
ε - współczynnik ekstynkcji substancji absorbującej
l - długość drogi światła przez próbę (grubość warstwy roztworu w kuwecie)
c - stężenie substancji absorbującego w próbie

Wyznaczenie współczynnika ekstynkcji dla określonego związku umożliwia jego

oznaczenie ilościowe. Najczęściej stosuje się tzw. molowy współczynnik absorpcji światła.
Jest to absorbancja roztworu substancji absorbującej o stężeniu 1 mola mierzona
w kuwecie o grubości warstwy 1 cm, przy określonej długości fali i w określonym
rozpuszczalniku. W niektórych oznaczeniach ilościowych używa się pojęcia tzw.

244
procentowego współczynnika absorpcji A 1%
1 cm , który oznacza wartość absorbancji A dla

roztworu o stężeniu 1 % w warstwie o grubości 1 cm.

Spektrofotometria absorpcyjna jest techniką prostą w wykonaniu i posiada szerokie
możliwości zastosowania w badaniach biochemicznych. Jednak, aby uzyskane wyniki
pomiarów absorpcji światła były dokładne (adekwatne do stężenia substancji oznaczanej)
należy zwracać uwagę na kilka podstawowych zasad prawidłowego postępowania podczas
badania absorbancji:
 próba badana powinna być idealnie klarowna; wszelkie zmętnienia lub pęcherzyki gazu
muszą być usunięte np. przez wirowanie lub sączenie,
 kuwety pomiarowe powinny być bardzo czyste, zwłaszcza te ich ścianki, przez które
biegnie strumień światła; częstym błędem jest chwytanie kuwet za przezroczyste
ścianki (kuwety do pomiarów absorbancji posiadają przeważnie dwie matowe ścianki,
które służą do ich trzymania),
 kuwet pomiarowych nie powinno się napełniać zbyt dużą ilością roztworu, tak aby nie
wylewał się on z kuwety,
 wszelkie zanieczyszczenia, w tym koniecznie krople roztworu należy zetrzeć ze ścianek
kuwety przed jej wstawieniem do komory pomiarowej,
 przy oznaczeniach ilościowych należy zwracać uwagę na to, że wiele biocząsteczek
spełnia prawo Lamberta-Beera tylko w określonym zakresie stężeń.

Wykorzystanie spektrofotometrii absorpcyjnej

Pomiary absorpcji światła są często wykorzystywane w badaniach biochemicznych do
oznaczeń ilościowych. W proponowanych w podręczniku eksperymentach pomiary
absorpcji światła są stosowane zarówno do badania roztworów bezbarwnych,
pochłaniających światło w zakresie UV oraz barwnych, które dodatkowo wykazują
absorpcję promieniowania widzialnego. Badania w nadfiolecie są bardzo często
wykorzystywane podczas analizy bezbarwnych roztworów białek i kwasów nukleinowych
wyizolowanych z materiału biologicznego, którym mogą też być próby żywności. Jest to
bardzo przydatna metoda oceny zarówno czystości jak i stężenia tych biocząsteczek, które
są m.in. podstawowym przedmiotem badań intensywnie rozwijającej się biologii
molekularnej. Do badania czystości wyizolowanych prób kwasów nukleinowych
wykorzystuje się najczęściej wartości absorbancji przy długościach fal równych: 230, 260
i 280 nm, przy czym wartość współczynnika A 260 jest stosowana w analizie ilościowej

245
DNA i RNA. Do oznaczeń ilościowych białek wykorzystuje się pomiary absorbancji przy
λ = 280 nm.
Zjawisko pochłaniania światła przez roztwory barwne wykorzystywane jest najczęściej
podczas oznaczania stężenia substancji absorbującej światło o określonej długości fali.
Podstawą charakterystycznego zabarwienia określonych substancji jest zjawisko
pochłaniania części widma światła białego. Pozostała część widma, dopełniająca do barwy
promieniowania zaabsorbowanego przez substancję, jest odbierana przez obserwatora (lub
odpowiedni detektor). Jeżeli dana substancja posiada barwę żółtą to oznacza, że absorbuje
promieniowanie o barwie fioletowo-niebieskiej (te dwie barwy są w stosunku do siebie
dopełniającymi). Im większe stężenie badanego roztworu, tym większa obserwowana
intensywność jego zabarwienia i jednocześnie silniejsza absorpcja części widma o barwie
dopełniającej. Pomiary kolorymetryczne są stosowane zarówno podczas badania substancji
posiadających własną barwę (np. żółty β-karoten oznaczany przy λ = 451 nm), jak
i substancji bezbarwnych, które w wyniku odpowiednich reakcji tworzą związki barwne
(np. niebiesko-fioletowy produkt reakcji aminokwasów z ninhydryną oznaczany przy
λ = 570 nm). Metody kolorymetryczne są często stosowane do oznaczania ilościowego
białek, np. metoda Lowry’ego lub Bradforda. Mogą też być przydatne do oznaczeń
ilościowych węglowodanów na podstawie reakcji, w których powstają barwne produkty.

Widmo ciągłe UV-VIS (wykreślone przy ciągłej zmianie długości fali światła
padającego na próbę) może dostarczyć informacji o strukturze analizowanych cząsteczek.
Na podstawie porównania widma analizowanej struktury z odpowiednimi wzorcami
można dokonywać identyfikacji związków, ponieważ widmo ciągłe pozwala na odczytanie
długości fali λmax oraz wartości współczynnika ekstynkcji (ε) substancji absorbującej.

Pomiary spektrofotometryczne umożliwiają też badanie szybkości reakcji

enzymatycznych, w których uczestniczą cząsteczki pochłaniające światło. Szybkość takich
reakcji może być monitorowana w sposób ciągły w trakcie trwania reakcji na podstawie
badania ubytku stężenia substratu (spadek absorbancji przy λmax dla substratu) lub wzrostu
stężenia produktu (wzrost absorbancji przy λmax dla produktu). Przykładem zastosowania
pomiarów spektrofotometrycznych do badania szybkości reakcji enzymatycznych jest
oznaczanie aktywności katalazy w mące na podstawie spadku stężenia nadtlenku wodoru,
co jest obserwowane jako spadek absorbancji przy długości fali λ = 240 nm.

Sposoby obliczania stężenia substancji oznaczanej

246
 Do obliczania stężenia substancji oznaczanej można zastosować opisane wyżej prawo
Lamberta-Beera, wykorzystując doświadczalnie wyznaczoną wartość współczynnika
ekstynkcji substancji absorbującej (ε). Częściej wyznaczenie stężenia badanego związku
opiera się na porównaniu absorbancji próby badanej z absorbancją roztworu wzorca
(metoda jednego wzorca) lub kilku wzorców (metoda krzywej wzorcowej).
Metoda jednego wzorca może być stosowana pod warunkiem, że badana substancja
spełnia prawo Lamberta-Beera, czyli zależność absorbancji od stężenia jest linią prostą
przechodzącą przez początek układu współrzędnych. Wówczas do wyznaczenia stężenia
roztworu badanego (cx) można wykorzystać prostą zależność (posługując się tzw. metodą
krzyżową):
c wz
c x  Ax
Awz
gdzie:
Awz - absorbancja roztworu wzorcowego
cwz - stężenie roztworu wzorcowego
Ax - absorbancja roztworu badanego

Jeżeli oznaczane substancje spełniają prawo Lamberta-Beera tylko w określonym

zakresie stężeń, to podczas oznaczeń ilościowych stosuje się metodę krzywej wzorcowej.
Należy zwrócić uwagę na to, że wyniki pomiarów są najbardziej wiarygodne w zakresie
stężeń substancji badanej spełniających prawo Lamberta-Beera, tj. wykazujących
zależność prostoliniową pomiędzy stężeniem a zmierzoną wartością absorbancji. Metoda
krzywej wzorcowej jest wykorzystywana najczęściej i może służyć m.in. przy ilościowym
oznaczaniu aminokwasów, białek, karotenoidów, czy węglowodanów.

A x

cx c

Rys. 70. Krzywa wzorcowa wyrażająca zależność absorbancji od stężenia substancji

badanej

Krzywą wzorcową wykreśla się na podstawie pomiarów absorbancji (A) uzyskanych

dla kilku roztworów wzorcowych o znanym stężeniu (c). Następnie uzyskane wartości
absorbancji A odkłada się na osi rzędnych, a stężenie na osi odciętych i wykreśla się linię

247
łączącą wyznaczone punkty. Na podstawie wartości absorbancji uzyskanej dla próby
badanej (Ax) z krzywej wzorcowej pokazanej na rys. 70 można odczytać jej stężenie (c x).
Pomiary absorbancji roztworów wzorcowych i próby badanej powinny być wykonywane
przy jednakowej długości fali wobec tej samej próby ślepej i w kuwetach o tej samej
grubości.

2.2. Spektrofluorymetria
Zaabsorbowanie kwantów energii świetlnej powoduje przejście cząsteczek w stan
wzbudzony, czyli taki, w którym elektrony walencyjne z orbitali stanu podstawowego
przechodzą do orbitali stanu wzbudzonego o wyższym poziomie energetycznym. Stan
wzbudzony nie jest stanem stabilnym, wobec czego wzbudzone elektrony dążą do tego,
aby jak najszybciej powrócić do stabilnego stanu podstawowego. Pobudzona cząsteczka
najczęściej traci energię w wyniku zderzeń z innymi cząsteczkami znajdującymi się
w roztworze. Jednak czasami część energii zostaje wydzielona w postaci światła, czyli
określone cząsteczki wykazują zjawisko fluorescencji. Światło emitowane składa się
z widma fluorescencyjnego obejmującego fale o różnej długości, przy czym zawsze mają
one większą długość (mniejszą energię) w porównaniu do światła wzbudzającego (część
zaabsorbowanej energii zostaje rozproszona). Podobnie jak w przypadku widma absorpcji
światła, każda substancja fluoryzująca posiada widmo fluorescencji z charakterystycznymi
maksimami obejmującymi fale świetlne najintensywniej emitowane (rys. 71).

długość fali - λ

Rys. 71. Widmo absorpcji światła i emisji fluorescencji badanego związku

248
 Pomiary fluorescencji wykonywane są w spektrofluorymetrze (schemat budowy
takiego aparatu przedstawiono na rys. 72). Spektrofluorymetry zawierają, podobnie jak
spektrofotometry, źródło światła, monochromator (filtr, pryzmat lub siatka dyfrakcyjna),
system optyczny, komorę próbki i detektor (fotokomórka). Aparaty do pomiaru
fluorescencji posiadają detektor umieszczony pod kątem, najczęściej prostym, w stosunku
do drogi promieni światła wzbudzającego. Przed detektorem umieszczony jest dodatkowy
monochromator przepuszczający promienie o długościach fal odpowiadających
maksimum emisji światła dla substancji oznaczanej.

próba
badana

monochromator system
Ÿród³o œwiat³a
wzbudzenia optyczny
monochromator
emisji

65

fotokomórka
Rys. 72. Schemat budowy spektrofluorymetru i rejestrator

Źródło światła w aparatach do pomiaru fluorescencji stanowi najczęściej lampa

ksenonowa (wysyła fale w zakresie 200 – 1400 nm), następnie z całego zakresu widma
monochromator wzbudzenia wydziela fale o długości odpowiadającej maksimum absorpcji
dla substancji oznaczanej. System optyczny, podobnie jak w spektrofotometrach wzmacnia
intensywność światła i ogniskuje je w kierunku próby. Badana substancja po
zaabsorbowaniu fal o określonej długości, emituje promieniowanie o niższej energii, czyli
o większej długości fal. Po wzbudzeniu próby, fluorescencja jest emitowana we
wszystkich kierunkach. Dzięki temu, że detektor mierzący intensywność fluorescencji
znajduje się pod kątem prostym, pomiar emisji światła nie jest zakłócany przez światło
wzbudzające (przechodzące przez próbę). Monochromator emisji kieruje do detektora
jedynie światło o zadanej długości fali, charakterystycznej dla oznaczanej substancji
fluoryzującej. Kuwety do pomiarów fluorescencji posiadają wszystkie ścianki
przezroczyste. Ze względu na to, że pomiary fluorescencji charakteryzują się bardzo dużą

249
czułością należy zachować szczególną ostrożność podczas ich wykonywania. Należy
pamiętać, że:
 nawet niewielkie zanieczyszczenia, zwłaszcza jeżeli są wśród nich substancje
fluoryzujące, mogą być przyczyną błędów pomiaru; często podczas oznaczania
ilościowego określonego związku przed wykonaniem pomiaru wykonuje się
oczyszczanie próby ze związków, które mogą podwyższać lub obniżać (wygaszanie
fluorescencji) wyniki pomiaru,
 szczególną uwagę należy zwracać na czystość kuwet, których wszystkie ścianki muszą
być przepuszczalne dla światła,
 pomiary fluorescencji są ściśle uzależnione od temperatury, dlatego powinny być
w wykonywane w tej samej temperaturze (np. nie można w oznaczeniach ilościowych
korzystać z krzywej wzorcowej, która została wyznaczona na podstawie pomiarów
prowadzonych w innej temperaturze niż próba badana w danym momencie).

Wykorzystanie spektrofluorymetrii w badaniach biochemicznych

Spektrofluorymetria w porównaniu do absorpcjometrii jest metodą zdecydowanie
czulszą oraz bardziej selektywną, gdyż stosunkowo niewiele substancji wykazuje
zjawisko fluorescencji (absorbuje znacznie większa ilość związków). Zjawisko
fluorescencji znalazło zastosowanie zarówno w analizie jakościowej (identyfikacja
związków na podstawie widm emisyjnych), jak i ilościowej (oznaczanie stężenia
substancji fluoryzujących). Każdy fluoryzujący związek charakteryzuje się specyficzną
dla siebie barwą światła fluorescencji (długością fali światła emitowanego). Podczas
oznaczania stężenia danej substancji na podstawie intensywności fluorescencji stosuje się
próbę zerową (ślepą), dla której ustawia się wartość „0” aparatu oraz wzorzec o znanym
stężeniu, dla którego ustawia się wartość 100% fluorescencji. Po wstawieniu próby
badanej do komory pomiarowej można dokonać odczytu intensywności fluorescencji i na
tej podstawie obliczyć zawartość substancji oznaczanej. W ten sposób oznacza się m.in.
stężenie ryboflawiny, której cząsteczki wykazują zjawisko fluorescencji emitując
promieniowanie żółtozielone o długości fali powyżej 520 nm po wzbudzeniu
promieniowaniem o długości fali około 440 nm (barwa niebieska).
Intensywność fluorescencji oznaczanych substancji zmienia się wraz ze zmianami pH,
siły jonowej, polarności rozpuszczalnika lub po dodaniu określonych czynników
chemicznych. Badania polegające na zmianie warunków środowiska, w którym znajduje
się substancja fluoryzująca mogą mieć różne ciekawe zastosowania analityczne. Mogą być

250
wykorzystywane np. do badania wpływu różnych czynników na aktywność białek
enzymatycznych (białka ze względu na zawartość fluorogennych aminokwasów
aromatycznych mają zdolność fluorescencji), badania ich zmian konformacyjnych lub
lokalizacji centrów aktywnych. Wiele informacji można też uzyskać stosując
tzw. fluorogeny zewnętrzne (substancje fluoryzujące, które są dodawane do roztworu
badanego). Niektóre z takich substancji wiążą się specyficznie z określonymi białkami,
dzięki czemu można wykrywać nawet bardzo niewielkie ilości tych białek. Fluorogeny
wiążące się w ściśle określonych miejscach białek są pomocne w lokalizacji miejsc
wiązania substratu w centrum aktywnym enzymu. Pomiary fluorescencji
z wykorzystaniem syntetycznych substratów, które pod wpływem działania enzymu
zostają przekształcone we fluoryzujące produkty mogą służyć do oznaczania stężenia
i aktywności określonych enzymów oraz badania szybkości reakcji enzymatycznych.
Niektóre fluorogeny wiążą się z kwasami nukleinowymi, np. bromek etydyny jest
powszechnie stosowany do wykrywania i oznaczania ilościowego fragmentów DNA
rozdzielonych metodą elektroforezy. Dodatek związków fluorogennych, które wnikają
tylko pomiędzy zasady azotowe w nieuszkodzonej podwójnej helisie DNA umożliwia
lokalizację pęknięć nici lub innych uszkodzeń struktury DNA. Również tzw. sondy
genetyczne służące do detekcji określonych fragmentów kwasów nukleinowych mogą
zawierać dołączone cząsteczki emitujące światło (można je zastosować np. do
wykrywania genetycznych modyfikacji). Mierząc intensywność fluorescencji po
wykonaniu danego typu testu i naświetleniu próby promieniowaniem o danej długości fali
można oznaczyć ilość określonych białek lub fragmentów DNA. Związki, które emitują
światło są też stosowane do znakowania przeciwciał w testach immunoenzymatycznych
przeznaczonych do wykrywania określonych antygenów (np. białek alergennych
w żywności).

3. Metody chromatograficzne
Metody chromatograficzne służą do frakcjonowania mieszanin biologicznych
i identyfikacji poszczególnych składników. Ogólnie chromatografia jest metodą rozdziału
składników mieszaniny pomiędzy dwie fazy: nieruchomą (stacjonarną) i ruchomą. Fazę
nieruchomą może stanowić ciało stałe (np. adsorbent, jonit, sito molekularne), ciecz na
nośniku stałym bądź żele (najczęściej zmodyfikowane polisacharydy). Fazą ruchomą może
być ciecz lub gaz. Metody chromatograficzne klasyfikuje się według różnych kryteriów
(tabela 13).

251
Tabela 13. Rodzaje metod chromatograficznych

kryterium podziału metody chromatograficzne

technika wykonania rozdziału
charakter oddziaływań pomiędzy fazą
stacjonarną i ruchomą
stan skupienia fazy ruchomej
chromatografia bibułowa
chromatografia cienkowarstwowa
chromatografia kolumnowa
chromatografia adsorpcyjna
chromatografia jonowymienna
chromatografia podziałowa
chromatografia powinowactwa
chromatografia żelowa (sączenie molekularne)
chromatografia cieczowa
chromatografia gazowa

3.1. Charakterystyka wybranych metod chromatograficznych

Uwzględniając klasyfikację metod chromatograficznych przedstawioną w tabeli 13
poniżej przedstawiono ich charakterystykę w oparciu o wymienione kryteria.

3.1.1. Technika wykonania rozdziału

Biorąc pod uwagę technikę wykonania chromatografii możemy prowadzić proces
metodą chromatografii planarnej bądź kolumnowej. Do metod planarnych należą
chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa.

Chromatografia bibułowa
W metodzie tej rozdział substancji prowadzi się na bibule, która musi mieć
odpowiednią grubość, porowatość i wysoki stopień czystości. Dobór bibuły
uwarunkowany jest rodzajem i ilością materiału przeznaczonego do analizy.
W chromatografii bibułowej fazę stacjonarną stanowi ciecz utrzymywana przez bibułę,
a fazę ruchomą określone rozpuszczalniki. Rozwijanie chromatogramów bibułowych
prowadzi się w specjalnych komorach chromatograficznych, które powinny być przede
wszystkim szczelne w celu wysycenia atmosfery parami rozpuszczalnika i utrzymania
stałej temperatury. Niedotrzymanie tych warunków może spowodować zaburzenie
rozdziału przez przerwanie jednorodności fazy ruchomej. Po zakończeniu procesu
substancje barwne można zlokalizować od razu na chromatogramie, ale w przypadku
substancji bezbarwnych konieczne jest wywołanie chromatogramu. Wywołanie polega na
spryskaniu substancją, która tworzy barwne połączenia z rozdzielanymi związkami.

252
Chromatografia cienkowarstwowa
Rozdział badanej mieszaniny prowadzi się na cienkich warstwach adsorbenta,
wymieniacza jonowego lub żelu, pokrywającego plastikową bądź szklaną płytkę. Do
najczęściej stosowanych związków należą żel krzemionkowy, ziemia okrzemkowa,
celuloza w postaci czystej lub acetylowanej i żele dekstranowe lub poliakrylamidowe.
Wykorzystuje się również żele agarozowe lub mieszane: dekstranowo-poliakrylamidowe,
względnie poliakrylamidowo-agarozowe. Podobnie jak w przypadku chromatografii
bibułowej rozwijanie chromatogramów prowadzi się w komorach. Układy rozwijające
dobiera się uwzględniając siłę eluującą rozpuszczalników. Po zakończeniu procesu należy
wywołać chromatogram, aby zlokalizować rozdzielane substancje. Wywoływaczami mogą
być wszystkie substancje używane w chromatografii bibułowej. Można też stosować
substancje o bardzo silnym działaniu, jak stężone kwasy czy mieszaninę chromową.
Chromatografia cienkowarstwowa stosowana jest najczęściej jako technika analityczna, do
sprawdzania czystości związków, kontroli reakcji bądź analizy wycieku z kolumny
chromatograficznej.

Chromatografia kolumnowa
W tej metodzie rozdział prowadzi się w kolumnach, czyli szklanych rurkach
wypełnionych nośnikiem, odpowiednim dla określonego typu chromatografii. Długość
i średnica kolumny są dobrane do rodzaju badanej substancji i typu nośnika. Właściwą
kolumnę stanowi złoże nośnika, na którym zachodzi rozdział mieszaniny. Może to być
adsorbent, wymieniacz jonowy lub żel. Na powierzchni złoża wygodnie jest umieścić
krążek bibuły filtracyjnej tak, by przy nanoszeniu próby nie naruszyć górnej warstwy
złoża. Kolumny zazwyczaj połączone z aparaturą umożliwiającą automatyczne zbieranie
frakcji, czyli kolektor frakcji, a także detektor i rejestrator. Po wprowadzeniu do kolumny
odpowiedniego wypełnienia, kolumnę równoważy się przez przemywanie jej buforem
startowym. Proces rozdziału przeprowadza się metodą elucji, czyli wymywania. Polega
ona na przemywaniu kolumny rozpuszczalnikiem lub serią rozpuszczalników dobranych
odpowiednio do stosowanej metody i rozdzielanej mieszaniny. Składniki mieszaniny
rozdzielają się i w określonej kolejności wypływają z kolumny.

3.1.2. Charakter oddziaływań pomiędzy fazą stacjonarną i ruchomą

Uwzględniając rodzaj oddziaływań pomiędzy fazami wyróżniono pięć rodzajów metod
chromatograficznych.

253
Chromatografia adsorpcyjna
W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko adsorpcji, które prowadzi do nagromadzenia
substancji rozpuszczonej na powierzchni ciała stałego będącego adsorbentem. Wielkość
adsorpcji określa stosunek ilości substancji zaadsorbowanej (adsorbatu) przypadającej na
jednostkę masy adsorbenta. Wielkość adsorpcji zależy od temperatury oraz od rodzaju
adsorbenta i adsorbatu. Adsorbenty można sklasyfikować w oparciu o kilka kryteriów
(tabela 14).

Tabela 14. Rodzaje adsorbentów

grupy
kryterium podziału Przykłady
adsorbentów
charakter chemiczny nieorganiczne tlenek glinu, tlenek magnezu, krzemiany
organiczne węgiel aktywny, sacharoza
mieszane węglan wapnia i talk
specyficzne kolumny mocznikowe
właściwości chemiczne kwasowe SiO2
zasadowe tlenek wapnia
amfoteryczny tlenek glinu
obojętny zaktywowany węgiel
zdolność silne aktywowany tlenek glinu, aktywowany węgiel
i pojemność adsorpcyjna średnie węglan wapnia, fosforan wapnia
słabe sacharoza, skrobia, talk
polarność silnie polarne SiO2, tlenek glinu
słabo polarne tlenek magnezu, węglan wapnia
niepolarne węgiel aktywowany, talk

Adsorbenty powinny charakteryzować się odpowiednią selektywnością

i specyficznością oddziaływania, a także pojemnością adsorpcyjną. Struktura adsorbenta
powinna być porowata o niezbyt drobnych ziarnach. Związki te nie powinny natomiast
reagować ani z adsorbatem ani z solwentem i nie mogą się rozpuszczać w solwencie.
Najbardziej zbliżony do idealnego adsorbenta jest tlenek glinu. Fazą ruchomą
w chromatografii adsorpcyjnej są zwykle ciekłe związki organiczne o zróżnicowanym
stopniu polarności: węglowodory, alkohole, etery, kwasy organiczne, estry.
Rozdział mieszaniny zachodzi w oparciu o różnice w adsorbowaniu poszczególnych
składników przez adsorbent. Zdolność adsorbowania się zależy od wielkości i budowy
przestrzennej cząsteczki oraz od liczby i położenia wiązań podwójnych, podstawników
niepolarnych i polarnych. W przypadku podstawników polarnych na adsorpcję wpływa też
rodzaj polarności. Związki, które są słabiej adsorbowane przez adsorbent, są wymywane

254
wcześniej przez rozpuszczalnik, natomiast te adsorbowane silniej pozostają związane
z adsorbentem. Do ich wymycia należy zastosować rozpuszczalniki o rosnącej sile
eluowania.
Do zalet chromatografii adsorpcyjnej wymienić należy:
 specyficzność, czyli możliwość rozdzielania składników o zbliżonym składzie
chemicznym,
 uniwersalność, ponieważ można tę metodę wykorzystać do rozdziału różnych związków
od węglowodorów po zasady organiczne i polarne kwasy,
 czułość,
 możliwość zmian warunków rozdziału chromatograficznego w dużym zakresie.
Metodę tę można stosować do rozdziału substancji, które różnią się powinowactwem
adsorpcyjnym, przy czym składniki rozdzielanej mieszaniny nie mogą reagować ani
z adsorbentem ani z eluentem i nie mogą być adsorbowane nieodwracalnie przez
adsorbent.

Chromatografia żelowa
Jest to chromatografia na sitach molekularnych, nazywana również sączeniem
molekularnym, w której rozdział substancji odbywa się na podstawie różnicy w wielkości
cząsteczek.
Nośniki fazy ruchomej, czyli sito molekularne, stanowią żele będące poprzecznie
usieciowanymi, nierozpuszczalnymi polimerami węglowodanowymi. Wyróżnia się żele
dekstranowe (Sephadex), agarozowe (Sepharose), poliakrylamidowe (Bio-Gel), żele
mieszane dekstranowo-poliakrylamidowe (Sephacryl). Wszystkie są wysoce uwodnionymi
ziarnami o porowatej strukturze, różniącymi się rozmiarami porów. Żele dekstranowe
wytwarzane są z dekstranu, czyli polisacharydu złożonego z cząsteczek glukozy
połączonych wiązaniami α-1,6-glikozydowymi. Dodatkowo wprowadzane są wiązania
α-1,3- i α-1,4-glikozydowe, które tworzą kolejne wiązania, czego rezultatem jest
powstawanie porów w obrębie ziaren żelu. Wielkość porów w ziarnach żelu zależy od
masy cząsteczkowej dekstranu i ilości wiązań poprzecznych. Im więcej wiązań
poprzecznych tym mniejsze są pory, a to z kolei określa zdolności rozdzielcze danego żelu
(np. Sephadex G-10 ma najmniejsze pory i jest stosowany do rozdziału peptydów i małych
białek, a G-200 największe i wykorzystuje się go do rozdziału białek o masach
cząsteczkowych w zakresie 5-800 kDa). Żele poliakrylamidowe powstają w wyniku

255
reakcji polimeryzacji akrylamidu z N,N’-metylenobisakrylamidem. Są odporne na
działanie elektrolitów i związków denaturujących. Mogą być stosowane do rozdziału
aminokwasów, białek, związków aromatycznych. Żele agarozowe stosuje się do
frakcjonowania związków o dużej masie cząsteczkowej (jak niektóre białka
i kwasy nukleinowe). Charakteryzują się mniejszą rozdzielczością niż żele dekstranowe
i poliakrylamidowe, a także mniejszą odpornością chemiczną.
Sączenie molekularne można przeprowadzać techniką kolumnową lub
cienkowarstwową. Częściej stosowana jest chromatografia kolumnowa, której używa się
m.in. do odsalania białek, rozdziału białek, peptydów, kwasów nukleinowych i innych
związków.
Nośniki żelowe są dostępne w postaci suchego proszku, nierozpuszczalnego w wodzie.
Dzięki obecności znacznej liczby grup wodorotlenowych żele mają silnie hydrofilowy
charakter. Po umieszczeniu w wodzie lub roztworze elektrolitu (np. w roztworze NaCl
albo w odpowiednim buforze) cząstki żelu wchłaniają wodę, pęcznieją i przybierają postać
kulistych ziarenek. Zdolność wchłaniania wody i pęcznienia jest uwarunkowana ilością
wolnych grup wodorotlenowych w usieciowanym polimerze. Im wyższy stopień
usieciowania, tym niższa jest zdolność wchłaniania wody i tym mniejsze „oczka”
porowatej struktury przestrzennej.
Odpowiednio uwodnionym i spęczniałym żelem, zawieszonym w eluencie napełnia się
kolumnę. Na wierzch nanosi się próbkę, której ilość nie powinna przekraczać 2%
całkowitej objętości kolumny. Podczas przepływu przez kolumnę następuje rozdział
cząsteczek różniących się masą cząsteczkową (rys. 73). Duże cząsteczki, o wielkości
przekraczającej średnicę porów żelu, przepływają pomiędzy ziarnami żelu i wypływają
z kolumny jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki wnikają w ziarna żelu, co powoduje
wydłużenie drogi przejścia przez kolumnę. Czas przebywania w kolumnie rozdzielonych
składników jest tym dłuższy, im mniejsze są ich rozmiary. Oznacza to, że rozdzielane
składniki będą się pojawiać w eluacie tym później, im mniejsze są rozmiary ich
cząsteczek, a do wymycia z kolumny będą potrzebne większe objętości eluentu.
W rezultacie im mniejsze cząsteczki, tym później są wymywane z kolumny.
Do czynników wpływających na przebieg sączenia molekularnego należy prawidłowa
hydratacja żelu oraz jakość rozpuszczalnika czyli jego skład, siła jonowa i wartość pH.
Ten rodzaj chromatografii można wykorzystać do wyznaczania mas cząsteczkowych,
np. białek, jeśli sito molekularne zostanie najpierw wystandaryzowane wzorcowymi
białkami o znanej masie cząsteczkowej.

256
Rys. 73. Schemat rozdziału mieszaniny metodą chromatografii żelowej

Chromatografia jonowymienna
Chromatografia jonowymienna jest metodą, w której zachodzi wymiana wszystkich
zdolnych do wymiany jonów nośnika fazy stacjonarnej na jony zawarte w rozdzielanej
mieszaninie. Nośnikiem są wymieniacze jonowe, czyli jonity. Są to nierozpuszczalne,
z reguły wielkocząsteczkowe związki, w których można wyróżnić matrycę w postaci sieci
przestrzennej, posiadającej łatwo dysocjujące grupy chemiczne. W ściśle określonych
warunkach grupy funkcyjne mogą wiązać jony z roztworu bądź oddawać je w przypadku
zmiany warunków.
Można wyróżnić dwa rodzaje jonitów: kationity i anionity. Kationity to wymieniacze
jonowe obdarzone ładunkiem ujemnym o charakterze kwasów lub ich soli, które na
zasadzie wymiany przyłączają kationy z rozdzielanej mieszaniny, oddając atom wodoru.
Anionity to wymieniacze jonowe obdarzone ładunkiem dodatnim, o charakterze zasad lub
ich soli, które przyłączają aniony z roztworu mieszaniny poddanej rozdziałowi.
Wielkością charakteryzującą jonity jest pojemność wymienna, czyli ilość jonów, która
może być wymieniona przez jednostkę masy lub objętości jonitu. Podaje się ją w molach
na kg lub w milimolach na g wymieniacza. Pojemność wymienna jest tym większa im
więcej grup jonowymiennych wprowadzono do jonitu i zależy od pH środowiska.
Wymieniacz kationowy nie może pełnić swojej funkcji w środowisku kwaśnym, ponieważ
ma zablokowane grupy funkcyjne przez jony H+. Z kolei pojemność wymienna anionitów
spada w środowisku zasadowym.

257
 Jonity mogą być nieorganiczne lub organiczne, które dalej dzieli się na naturalne,
syntetyczne i półsyntetyczne. Niemal 90% stosowanych wymieniaczy jonowych stanowią
jonity organiczne syntetyczne i półsyntetyczne. Jonity półsyntetyczne są pochodzenia
naturalnego, jednak wprowadzono do nich dodatkowe grupy funkcyjne i usunięto
substancje, które mogłyby zakłócić przebieg procesu. Należy tu wymienić przede
wszystkim pochodne celulozy, które wykorzystuje się do rozdziału białek, polipeptydów
i nukleotydów. Przykładowym anionitem jest DEAE-celuloza, czyli
dietyloaminoetyloceluloza zawierająca grupę funkcyjną dietyloaminową stosowaną do
rozdziału białek obojętnych i kwasowych, czyli o wypadkowym ładunku ujemnym. Z kolei
przykładem kationitu jest CM-celuloza, czyli karboksymetyloceluloza z grupą funkcyjną
karboksymetylową, stosowana do białek zasadowych tj. o wypadkowym ładunku
dodatnim. Za najbardziej wartościowe wymieniacze jonowe uważane są jonity organiczne
syntetyczne. Cechuje je nierozpuszczalność w wodzie i niektórych związkach
organicznych, duża trwałość chemiczna i mechaniczna, duża i wybiórcza zdolność
wymienna oraz rozwinięta powierzchnia sorpcji. Największą grupę stanowią pochodne
polistyrenu, wykorzystywane m.in. do rozdziału aminokwasów.
W chromatografii jonowymiennej podstawą rozdziału mieszaniny cząsteczek jest ich
wypadkowy ładunek. Od tego zależy, na jakiej kolumnie zostaną rozdzielone. Cząsteczki
o ładunku całkowitym dodatnim rozdzielą się na kationicie, a cząsteczki o ładunku
ujemnym na anionicie. Rozdział na kolumnie przebiega w dwóch etapach. W pierwszym
etapie zachodzi proces sorpcji. Po naniesieniu mieszaniny na zrównoważoną kolumnę,
cząsteczki o takim samym znaku jak grupy funkcyjne jonitu przepływają przez kolumnę
i wypływają wraz z frontem rozpuszczalnika, natomiast te przeciwnego znaku są wiązane
na jonicie (rys. 74). W drugim etapie przeprowadza się elucję jonów zatrzymanych na
jonicie przemywając kolumnę roztworem elektrolitu, zawierającym zwykle jeden jon
wymienny o większym powinowactwie do złoża niż jony wyłapane z rozdzielanej
mieszaniny lub stosując roztwory o zmieniającym się pH (rys. 74). Związane z jonitem
kationy można wymyć z kolumny przez przemycie roztworem jonów dodatnich lub też
przez zwiększenie pH buforu stosowanego do elucji. Aniony można natomiast uwolnić
przemywając kolumnę roztworem zawierającym jony ujemne lub obniżając pH buforu.
Zwykle stosuje się przemywanie kolumny roztworami jonów o wzrastającym gradiencie.
Może to być gradient skokowy, czyli przemywanie kolumny kolejnymi porcjami roztworu
o zmienionym składzie. Z kolei gradient liniowy polega na stałym, stopniowym
zwiększaniu siły jonowej buforu. Dzięki takiej metodzie wymywania z kolumny

258
stopniowo wypływają cząsteczki od tych najsłabiej do tych najsilniej związanych na
jonicie.

Rys. 74. Schemat rozdziału mieszaniny metodą chromatografii jonowymiennej

Chromatografia podziałowa
Chromatografia podziałowa jest metodą rozdziału wykorzystującą różną
rozpuszczalność substancji rozdzielanych w dwóch niemieszających się fazach ciekłych.
Jedna z nich, najczęściej woda, stanowi fazę nieruchomą, osadzoną na nośniku. Druga
faza, ruchoma, to najczęściej rozpuszczalnik organiczny, który przemieszcza się względem
pierwszego. Na podstawie polarności faz można wyróżnić:
 chromatografię podziałową zwykłą – gdzie fazą nieruchomą jest zwykle woda lub inny
polarny rozpuszczalnik osadzony na nieaktywnym nośniku, a fazą ruchomą – niepolarny
rozpuszczalnik organiczny,
 chromatografię podziałową z odwróconymi fazami, w której na silnie hydrofobowym
nośniku osadzona jest niepolarna faza stacjonarna. Z kolei fazę ruchomą stanowi woda
lub roztwór wodny.
Substancje w mieszaninie poddawanej rozdziałowi dzielą się pomiędzy obie fazy
zgodnie z ich rozpuszczalnością, czyli zgodnie ze współczynnikiem ich podziału pomiędzy
dwie niemieszające się fazy ciekłe. Współczynnik podziału (k) jest to stosunek stężenia
substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej do jej stężenia w fazie stacjonarnej. W stanie
równowagi i w danej temperaturze wielkość ta jest stała.

259
 Najszybciej wędrują składniki o największym współczynniku podziału, czyli lepiej
rozpuszczające się w fazie ruchomej, natomiast te, które rozpuszczają się lepiej w fazie
stacjonarnej, migrują wolniej. Podczas chromatografii podziałowej zachodzi też często
zjawisko adsorpcji na nośniku, co hamuje ruch cząsteczek podczas procesu.
W chromatografii podziałowej najczęściej stosuje się techniki: kolumnową, bibułową
i cienkowarstwową.
Chromatografia kolumnowa ze względu na rodzaj stosowanych faz może występować
w układzie ciecz – ciecz lub ciecz – gaz. W drugim przypadku fazę ruchomą stanowi gaz.
Chromatografia ciecz – ciecz może być zastosowana do rozdziału substancji
rozpuszczających się w obydwu cieczach, a chromatografia ciecz – gaz do rozdziału
mieszaniny gazów lub par.
W chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej wyróżnia się dwie podstawowe
techniki: wstępującą i zstępującą. W chromatografii wstępującej paski bibuły lub płytki
umieszcza się w komorze, na dnie której znajduje się rozpuszczalnik. Rozpuszczalnik
wznosi się do góry głównie na skutek sił kapilarnych warstwy nośnika. W metodzie tej
ważne jest, żeby rozdzielane substancje różniły się dość znacznie prędkością wędrówki ze
względu na stosunkowo krótki czas procesu. Technika zstępująca polega na umieszczeniu
nośnika w wanience zawierającej rozpuszczalnik, która znajduje się w górnej części
komory. Rozpuszczalnik spływa w dół na skutek sił ciężkości, powodując, że substancje
w mieszaninie ulegają rozdziałowi. W przypadku, kiedy nie uzyska się całkowitego
rozdziału można zastosować chromatografię dwuwymiarową i poddać mieszaninę
kolejnemu działaniu dwóch różnych systemów rozpuszczalników w kierunkach
prostopadłych.
Po wywołaniu chromatogramu i uzyskaniu widocznych plam oblicza się wartości
współczynnika Rf według poniższego wzoru i porównuje z wartością R f poszczególnych
związków w mieszaninie wzorcowej.

odległość od linii startu do środka plamki

Rf = ———————————————————————
odległość od linii startu do frontu rozpuszczalnika

Współczynnik Rf jest to stosunek odległości przebytej przez migrującą substancję do

odległości przebytej przez front rozpuszczalnika w tym samym czasie. Wartość Rf jest
wielkością charakterystyczną dla danej substancji, określonego rozpuszczalnika i stałych
warunków procesu.

260
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa jest szczególnym rodzajem chromatografii, w której
wykorzystuje się specyficzne niekowalencyjne wiązanie pomiędzy dwoma substancjami
o wysokim powinowactwie względem siebie. Jedna z tych substancji, nazywana ligandem,
jest chemicznie związana z nierozpuszczalnym nośnikiem i w procesie rozdziału
mieszaniny adsorbuje związek, w stosunku do którego wykazuje silne powinowactwo. Do
przykładowych kombinacji specyficznych par typu ligand – oczyszczana substancja
należą: hormon – receptor, lektyny – glikoproteiny, przeciwciało – antygen,
inhibitor – enzym, komplementarne odcinki kwasów nukleinowych.
Nośnikami w chromatografii powinowactwa są złoża, które wykorzystuje się do
filtracji żelowej, jak żele dekstranowe (Sephadex), agarozowe (Sepharose) lub
poliakrylamidowe (Bio-Gel). Muszą być one wcześniej aktywowane, tak by mogły
związać ligand. Rodzaj wiązania pomiędzy nośnikiem a ligandem zależy od rodzaju
przyłączanego związku, np. ligandy białkowe wiążą się za pomocą grup karboksylowych,
hydroksylowych, sulfhydrylowych lub aminowych, kwasy nukleinowe za pośrednictwem
reszt fosforanowych lub grup enolowych zasad azotowych, a cukry przez grupy
wodorotlenowe.
Rozdział mieszaniny prowadzony metodą chromatografii powinowactwa zachodzi
w dwóch etapach (rys. 75). W pierwszym etapie mieszaninę nanosi się na kolumnę
wypełnioną nośnikiem związanym z odpowiednim ligandem, po uprzednim
zrównoważeniu buforem. Podczas przechodzenia próby przez złoże dochodzi do
specyficznej sorpcji wyłapywanego związku na unieruchomionym ligandzie. Kolumnę
przemywa się w celu odpłukania niezwiązanych substancji. W drugim etapie konieczne
jest zastosowanie rozpuszczalnika, który spowoduje rozszczepienie powstałego kompleksu
celem wymycia oczyszczanego związku z kolumny. Do wymycia można zastosować też
elucję niespecyficzną, np. za pomocą buforów o niskim lub wysokim pH, roztworów
o dużej sile jonowej albo rozrywających wiązania wodorowe (np. roztwór mocznika).
Chromatografię powinowactwa wykorzystuje się najczęściej do oczyszczania
enzymów, receptorów i przeciwciał. Metoda ta pozwala na uzyskanie preparatów
o wysokiej czystości.

261
Rys. 75. Schemat rozdziału mieszaniny metodą chromatografii powinowactwa

3.1.3. Stan skupienia fazy ruchomej

Fazą ruchomą w chromatografii może być ciecz lub gaz, stąd wyróżnić można
chromatografię cieczową i gazową.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa

W ostatnich latach dużego znaczenia nabrała wysokosprawna chromatografia cieczowa
(HPLC – High Performance Liquid Chromatography), która charakteryzuje się wysoką
rozdzielczością i powtarzalnością uzyskiwanych rozdziałów. Jest to odmiana
chromatografii kolumnowej, w której kolumna wypełniona jest nośnikiem o bardzo małej
wielkości ziaren (około 3 – 10 μm). Zmniejszenie ziaren nośnika zwiększa powierzchnię
czynną, a tym samym rozdzielczość chromatografii, jednak wymaga zastosowania pompy
tłoczącej eluent pod dużym ciśnieniem. Dlatego w skład zestawu do HPLC wchodzą
pompy wysokociśnieniowe, detektory przepływowe, integratory czyli urządzenia do
integrowania sygnałów zarejestrowanych przez detektor, zawory sterujące przepływem
eluentów i urządzenia do manualnego lub automatycznego podawania próbek.
Procesy w systemie HPLC prowadzi się zwykle metodą gradientową lub izokratyczną.
Pierwsza z nich polega na podawaniu przez pompę eluentu o składzie zmieniającym się
w czasie rozdziału mieszaniny. Metoda izokratyczna polega na stosowaniu eluentu
o ustalonym stężeniu rozpuszczalnika.

262
 Do wykrywania i ilościowego analizowania określonych związków służą różnego
rodzaju detektory: detektory spektrofotometryczne, np. detektor promieniowania
ultrafioletowego UV, detektory spektrofluorymetryczne, refraktometryczne czy
elektrochemiczne. Detektor spektrofotometryczny mierzy w sposób ciągły absorbancję,
dzięki czemu uzyskuje się obraz w postaci krzywej zależności absorbancji od stężenia
substancji oznaczanej. Rejestrator kreśli krzywą, która w momencie pojawienia się
związku wykazującego absorpcję światła przybiera kształt piku o określonej wysokości
i powierzchni. Pomiar pola powierzchni piku określa się jako integracja chromatogramu.
Charakterystyczny dla każdego związku jest również czas retencji, który pozwala go
zidentyfikować wśród innych substancji. Czas retencji to czas upływający od momentu
nastrzyknięcia próby na kolumnę do czasu pojawienia się maksimum piku. Analiza
jakościowa określonych związków polega na identyfikacji odpowiadających im pików
poprzez porównanie ich czasów retencji z czasami retencji związków wzorcowych.
Ilościowe oznaczenie jakiegoś związku wymaga zastosowania w celach porównawczych
wzorca o znanym stężeniu.
Zastosowanie różnych typów nośników w HPLC umożliwia rozdział mieszanin
związków we wszystkich poznanych postaciach chromatografii kolumnowej: adsorpcyjnej,
jonowymiennej, podziałowej czy powinowactwa. Najpopularniejszym obecnie rodzajem
chromatografii jest odmiana chromatografii podziałowej w odwróconym układzie faz,
kiedy faza ruchoma jest bardziej polarna od fazy stacjonarnej.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa charakteryzuje się dużą precyzją, łatwością
i szybkością wykonywania analizy. Metoda ta jest stosowana do rozdzielania i analizy
różnych substancji takich jak: związki biologicznie czynne (białka, aminokwasy,
witaminy, kwasy nukleinowe itp.), środki ochrony roślin, węglowodory policykliczne,
preparaty farmaceutyczne.

Chromatografia gazowa
Chromatografia gazowa jest analityczną metodą chromatograficzną, w której fazą
ruchomą jest gaz. Jest stosowana do analizy jakościowej i ilościowej, a ze względu na
czułość i skuteczność należy do najważniejszych metod analitycznych. Metodę tę można
wykorzystać do rozdziału substancji, które w warunkach procesu mają postać gazów lub
par. Gaz nośny, stosowany jako faza ruchoma, powinien być chemicznie obojętny zarówno
w stosunku do wypełnienia kolumny jak i do składników badanej mieszaniny. Najczęściej
stosuje się wodór, azot, argon lub hel. Fazą stałą może być ciało stałe – adsorbent

263
(gas-solid chromatography - GSC) lub ciecz osadzona na stałym nośniku (gas-liquid
chromatography - GLC).
W pierwszym etapie rozdziału następuje odparowanie próbki w ogrzewanej komorze
nastrzykowej, a następnie próba w strumieniu gazu obojętnego trafia na kolumnę, gdzie
zachodzi rozdzielenie składników. W miarę przepływu gazu przez kolumnę poszczególne
składniki przemieszczają się z różną prędkością. Zależy ona od stopnia oddziaływania
składników z fazą stacjonarną na kolumnie. Kolumna umieszczona jest zazwyczaj w piecu
sterowanym termostatem, ponieważ proces chromatograficzny jest zależny od
temperatury. Wykrywanie i analizę ilościową składników umożliwiają odpowiednie
detektory, m.in. detektor płomieniowo – jonizacyjny, płomieniowo – fotometryczny,
detektor wychwytu elektronów czy detektor termojonowy. Chromatografia gazowa jest
często sprzężona z innymi technikami analitycznymi, które pełnią w takim układzie rolę
detektorów, jak np. spektrometr masowy.
Metoda chromatografii gazowej znalazła zastosowanie w różnych dziedzinach. Jest
stosowana do identyfikacji i oznaczania ilościowego różnych związków, np. kwasów
tłuszczowych i aminokwasów, często też wykorzystuje się ją do kontroli procesów
technologicznych.

4. Elektroforeza
Elektroforeza jest metodą powszechnie wykorzystywaną do rozdziału białek i kwasów
nukleinowych. Jest to proces polegający na wędrówce w polu elektrycznym cząsteczek
obdarzonych ładunkiem elektrycznym. Pod wpływem pola elektrycznego kationy, czyli
cząsteczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują do elektrody ujemnej – katody,
a aniony, tj. cząsteczki obdarzone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej
– anody. Rozdział cząsteczek następuje w wyniku przemieszczania się cząsteczek na różne
odległości w jednakowym czasie. Szybkość wędrowania zależy od właściwości cząsteczek
i środowiska oraz od parametrów charakteryzujących prąd. Właściwości cząsteczek, które
wpływają na szybkość przemieszczania w polu elektrycznym to wielkość ładunku, masa
i kształt. Decydujące znaczenie ma stosunek ładunku do masy cząsteczkowej. Cząsteczki
poruszają się tym szybciej im większy jest ich ładunek, ale odwrotnie jest w przypadku ich
masy. Im większe cząsteczki tym szybkość wędrowania jest wolniejsza. Duże znaczenie
dla rozdziału elektroforetycznego ma środowisko, w którym on się odbywa, czyli rodzaj
buforu, jego pH, siła jonowa, temperatura i lepkość. Lepkość buforu zwiększa lub
zmniejsza opór środowiska, natomiast siła jonowa i pH mają wpływ na ładunek

264
rozdzielanej cząsteczki. W przypadku pH należy pamiętać, że cząsteczki takie jak
aminokwasy i białka nie poruszają się w środowisku o pH odpowiadającym ich punktowi
izoelektrycznemu, ponieważ występują w postaci jonu obojnaczego. Dlatego wartość pH
powinna być różna od pI. Na rozdział elektroforetyczny wpływają także wskaźniki
charakteryzujące przepływający prąd, czyli wielkość napięcia i natężenia.
Rozdział elektroforetyczny może być prowadzony bezpośrednio w objętości elektrolitu
(elektroforeza swobodna), co jest często stosowane w elektroforezie kapilarnej, lub
w nośniku elektroforetycznym. Nośnikiem w procesie elektroforezy może być bibuła lub
żel (najczęściej agarozowy lub poliakrylamidowy). Bibuła jest nośnikiem o dużej
oporności, a podczas procesu występuje dodatkowo zjawisko adsorpcji oraz dyfuzji
cząsteczek. Żele charakteryzują się małą opornością i niską adsorpcją cząsteczek. Ponadto
żele mają strukturę sita molekularnego, zatem rozdział na nich zachodzi również w oparciu
o masę cząsteczkową rozdzielanych związków. Dzięki temu żele charakteryzują się
większą zdolnością rozdzielczą. W praktyce w badaniach białek stosuje się zwykle
elektroforezę na żelu poliakrylamidowym, natomiast do analizy kwasów nukleinowych
wykorzystuje się zarówno elektroforezę w żelu agarozowym, jak i poliakrylamidowym.
Ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego można wyróżnić
elektroforezę kapilarną, pionową i poziomą. Pierwsza zachodzi w cienkich kapilarach,
których oba końce są zanurzone w elektrolicie. Do obu końców przykłada się wysokie
napięcie, na skutek czego wewnątrz pojawia się pole elektryczne. Ten rodzaj elektroforezy
jest stosowany najczęściej do celów analitycznych i mikropreparatywnych. Znacznie
częściej obecnie stosuje się elektroforezę pionową lub poziomą. Elektroforezę pionową
przeprowadza się zwykle w postaci płytowej, gdzie nośnik umieszcza się pomiędzy
dwiema płytami szklanymi, przy czym górna i dolna część nośnika jest zanurzona
w buforze elektrodowym (rys. 76). Z kolei elektroforeza pozioma jest przykładem
elektroforezy, w której nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie poziomej.
Elektroforezę można prowadzić w postaci natywnej lub w obecności czynników
denaturujących. Elektroforeza natywna prowadzona jest w warunkach, w których
makrocząsteczki są niezdenaturowane. Zaletą tej metody jest możliwość odzyskania
cząsteczek aktywnych biologicznie, jednak wadą jest stosunkowo słaba rozdzielczość.
Drugi rodzaj elektroforezy, z zastosowaniem SDS – siarczanu dodecylu sodowego, jest
stosowany zazwyczaj do rozdziału białek.
Po zakończeniu elektroforezy konieczne jest uwidocznienie rozdzielonych cząsteczek.
W przypadku białek stosuje się detekcję przy użyciu barwników takich jak czerń amidowa,

265
Coomassie brillant blue, stosując metodę barwienia srebrem lub barwniki fluorescencyjne.
Kwasy nukleinowe barwi się związkami fluorescencyjnymi. Do detekcji DNA stosuje się
standardowo bromek etydyny, który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary zasad.
Wybarwione żele ogląda się w świetle UV.

Rys. 76. Przebieg elektroforezy: (1) nakładanie próbek na żel, (2) wędrówka w żelu, (3)
obraz prążków na wybarwionym żelu

266
Literatura
1. Kączkowski J., Podstawy biochemii, Wydanie XV, Wydawnictwo Naukowo
Techniczne, Warszawa 2005
2. Hames B.D., Hooper N.M., Biochemia. Krótkie wykłady, Wydawnictwo Naukowe
PWN, Warszawa 2007
3. Współczesna wiedza o węglowodanach, praca zbiorowa pod redakcją
J. Gawęckiego, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań 1998
4. Witaminy, praca zbiorowa pod red. J. Gawęckiego, Wydawnictwo Akademii
Rolniczej w Poznaniu, Poznań 2002
5. Chemia żywności, Tom 2, Sacharydy, lipidy i białka, Tom 3, Odżywcze i zdrowotne
właściwości składników żywności, Praca zbiorowa pod red. Z.E. Sikorskiego,
Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa 2007
6. Stryer L., Tymoczko J. L., Berg J. M. Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN
Warszawa 2005
7. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa 2003
8. Przykłady analiz DNA, Praca zbiorowa pod redakcją Ryszarda Słomskiego,
Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań 2004
9. Ćwiczenia z biochemii, praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-
Stefanowicz, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003
10. Kulka K., Rejowski A., Biochemia, Wydawnictwo Akademii Rolniczo-Technicznej
w Olsztynie, Olsztyn 1998

267